CN111393524A - 基于金属标记的阿尔兹海默症脑组织Aβ蛋白的原位检测方法 - Google Patents

基于金属标记的阿尔兹海默症脑组织Aβ蛋白的原位检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111393524A
CN111393524A CN202010105730.3A CN202010105730A CN111393524A CN 111393524 A CN111393524 A CN 111393524A CN 202010105730 A CN202010105730 A CN 202010105730A CN 111393524 A CN111393524 A CN 111393524A
Authority
CN
China
Prior art keywords
brain tissue
antibody
solution
chelate
nhs ester
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010105730.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111393524B (zh
Inventor
高雪
罗施中
冯流星
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing University of Chemical Technology
National Institute of Metrology
Original Assignee
Beijing University of Chemical Technology
National Institute of Metrology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing University of Chemical Technology, National Institute of Metrology filed Critical Beijing University of Chemical Technology
Priority to CN202010105730.3A priority Critical patent/CN111393524B/zh
Publication of CN111393524A publication Critical patent/CN111393524A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111393524B publication Critical patent/CN111393524B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于金属标记技术的脑组织切片上Aβ蛋白的成像技术。双(2,2'‑联吡啶)‑4'‑甲基‑4‑羧基联吡啶‑钌N‑琥珀酰亚胺酯‑双‑(六氟磷酸盐)(以下简称Ru‑NHS酯)和Aβ抗体耦联形成金属螯合物，通过免疫反应，使金属间接标记在脑组织中的Aβ上。通过激光剥蚀电感耦合等离子体质谱检测大脑上的Ru的信号强度，最终绘制脑组织切片上Aβ的分布图。本方法条件温和，最大程度的保留了脑组织切片的原貌，使Aβ蛋白的分布位置及聚集程度完整精确的展现，具有精确性和溯源性。

Description

基于金属标记的阿尔兹海默症脑组织Aβ蛋白的原位检测方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，特别涉及蛋白原位分析方法的开发与应用。
背景技术
阿尔兹海默症(Alzheimer disease，AD)是一种神经退行性疾病，其主要症状有记忆力减退和认知行为困难，对患者造成极大痛苦。脑内蛋白的异常一般早于症状的出现。因此，对于阿尔兹海默症的病理研究有助于病情的发现与治疗。β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ蛋白)级联假说是公认的阿尔兹海默症的发病机理，即过量的Aβ蛋白在脑内沉积形成淀粉样斑块引发神经系统的退行性改变。
目前，针对Aβ蛋白的研究样品主要来源于脑脊液和血浆。脑脊液中Aβ水平的改变并不具有特异性；血浆样品来源于外周组织，无法对AD的病理有直观的体现。研究脑内Aβ蛋白沉积情况对于阿尔兹海默症的病理研究及药物筛选等至关重要。
成像技术使脑内蛋白水平变化可视化，提供了病理变化的时间空间信息。临床上AD的分期主要通过计算机断层扫描(CT)、放射性标记共振成像(MRI)来实现，但这些技术不足以呈现AD早期斑块的形成。通过正电子发射断层扫描(PET)可以检测微小斑块，但存在放射性标记的潜在危险。传统的免疫组化染色与免疫荧光检测也可对脑内的Aβ进行成像研究，但存在操作复杂、影响因素多等缺陷。特别是，以上成像手段都无法对脑内的Aβ进行原位定量分析。
总之，现有技术仍然缺乏快速、准确、直观的确定Aβ蛋白在脑内沉积情况的方法，从而缺乏有效的筛选阿尔茨海默病治疗药物的方法。
发明内容
本发明提供了一种基于金属标记技术的免疫质谱成像方法，具体来说，双(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌N-琥珀酰亚胺酯-双-(六氟磷酸盐)(以下简称Ru-NHS酯)和Aβ抗体耦联形成螯合物后，经过免疫反应，使Ru间接标记在脑组织中的Aβ蛋白上，然后通过激光剥蚀电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)检测脑组织切片上的Ru的信号强度，绘制脑组织切片上以及进一步绘制脑组织中Aβ蛋白的分布图，从而在不破坏脑组织的完整性的前提下，实现了Aβ蛋白的原位成像，能够完整、精确地展现脑组织中Aβ蛋白的分布位置及聚集程度，并具有溯源性，从而有利于对阿尔兹海默症的发明机理进行研究。另外，本发明还可实现对脑组织中Aβ蛋白的定量检测。本发明的方法操作简单，特异性和灵敏度高，稳定性好，重复性强。
根据本发明的一个方面，本发明提供一种螯合物，由双(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌N-琥珀酰亚胺酯-双-(六氟磷酸盐)(Ru-NHS酯)和Aβ抗体耦联形成。本领域技术人员可以理解，Ru-NHS酯将Aβ抗体氨基酸侧链氨酰化形成本发明的螯合物。优选地，螯合物中Ru-NHS酯和Aβ抗体的摩尔比为50:1-500:1，更优选为约500:1。
本领域可以理解，各种能够与Aβ蛋白结合的Aβ抗体均可用于本发明。优选地，所述抗体来自于哺乳动物，优选人、小鼠、兔、山羊等；所述抗体能够与哺乳动物，优选人、小鼠、兔、山羊等Aβ蛋白结合；所述抗体能够与β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursorprotein，APP)、Aβ1-40、Aβ1-42中的一种或多种结合，优选Aβ1-42；所述Aβ抗体为单克隆抗体。本领域技术人员可以理解，Aβ抗体可以商购获得或者通过本领域已知的方法制备得到。
根据本发明的另一个方面，本发明提供上述螯合物的制备方法，该方法包括将Ru-NHS酯和Aβ抗体反应的步骤。优选地，该方法包括以下步骤：
(1)将Ru-NHS酯溶解溶剂中；优选，溶剂选自DMSO、甲醇中的一种或两种的任意比例的混合物，最优选，溶剂为DMSO；
(2)将Aβ抗体溶解在溶剂中；优选，溶剂为PBS或PB，最优选，溶剂为PBS；
(3)将步骤(1)所得溶液和步骤(2)所得溶液混合，反应；优选，反应在避光、室温、震荡下进行；优选，反应时间为0.1-10h，最优选约1h；
(4)在步骤(3)所得溶液中加入甘氨酸以终止反应；优选，该步骤在避光、室温、震荡下进行；优选，该步骤时间为5-30min，最优选10-15min；
(5)将步骤(4)所得溶液用透析管进行透析纯化。
优选，步骤(1)所得Ru-NHS酯溶液的浓度为50-500μg/ml，最优选约100μg/ml。
优选，步骤(2)所得Aβ抗体溶液的浓度为0.5-10μg/ml，最优选约2μg/ml；优选，PB和PBS的pH值为7.8-8.0，浓度为10-12mM。
优选，步骤(3)中，步骤(1)所得溶液中Ru-NHS酯和步骤(2)所得溶液中Aβ抗体的摩尔比至少为50:1，优选至少为500:1，或者优选为50:1-1000:1，进一步优选为50:1-600:1，更优选为500:1-1000:1。
优选，步骤(4)中，甘氨酸以其水溶液的形式加入；优选，甘氨酸水溶液的浓度为1-3M，最优选约2M；优选，Ru-NHS酯和甘氨酸的摩尔比为1:400-1:1200，最优选约1:800。
本领域技术人员可以理解，步骤(5)透析是为了纯化螯合物，去除未耦合的Ru-NHS酯、甘氨酸等。优选，步骤(5)中透析管为10KD，透析液为PBS或PB，优选10-12mM、pH7.8-8.0的PBS或PB，透析液的用量以体积计至少为步骤(4)所得溶液的1000倍，更优选为4000-6000倍，最优选约5000倍，透析时间为10-60min，最优选约30min，优选透析两次。
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种试剂盒，含有上述螯合物。
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种离体脑组织中Aβ蛋白的检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)取离体脑组织进行冰冻切片、丙酮固定、破膜、灭活过氧化氢酶、并封闭；优选，脑组织切片的厚度约为10μm；
(2)将上述螯合物的溶液滴加到步骤(1)所得脑组织切片上，静置8-16h，优选约12h，使脑组织中的Aβ蛋白与上述螯合物中的Aβ抗体结合；优选，静置温度为4℃；优选，在静置过程中保持脑组织切片湿润；
(3)洗去脑组织切片中未结合的螯合物，晾干，用LA-ICP-MS检测Ru信号；优选，用PBS溶液(例如10-12mM，pH值7.0-8.0)洗去未结合的螯合物，例如3次，每次5分钟；优选，检测102Ru信号；优选，采用13C信号均一化消除脑组织切片薄厚不均的影响；
(4)根据步骤(3)得到的数据对脑组织切片上的Aβ进行成像，或者进一步根据多个脑组织切片的数据对脑组织中的Aβ进行成像。
本领域技术人员可以理解，在上述步骤(1)中，通过本领域已知的常规方法对脑组织进行冰冻切片、丙酮固定、破膜、灭活过氧化氢酶和封闭。例如：
取离体脑组织置于4％多聚甲醛中固定，隔日取出后分别在20％、30％蔗糖溶液中梯度脱水，待脑组织沉入溶液底部后取出，用OCT冰冻切片包埋剂包埋后置于恒温冰冻切片机中切片，室温放置例如30分钟，用超纯水洗去切片上的OCT包埋剂；
将切片放入4℃丙酮中固定例如10分钟，取出后用PBS(例如10-12mM，pH值7.0-8.0，优选10mM，pH 7.4)清洗，例如3次，每次5分钟；
向脑组织滴加破膜液(例如0.1％triton X-100)，时间例如5分钟，用PBS(例如10-12mM，pH值7.0-8.0，优选10mM，pH 7.4)清洗，例如3次，每次5分钟；
向脑组织滴加3％的双氧水例如100μl以灭活过氧化氢酶，时间例如30分钟，用PBS(例如10-12mM，pH值7.0-8.0，优选10mM，pH 7.4)清洗，例如3次，每次5分钟；
用10％的山羊血清或牛血清例如100μl对脑组织进行封闭，时间例如20分钟，倾去血清。
优选地，步骤(2)中，螯合物的溶液中，螯合物的浓度为0.5-10μg/ml，最优选约2μg/ml，溶剂为10-12mM、pH7.8-8.0的PBS或PB。
优选地，步骤(3)中，LA的条件为能量2.05J/cm2，激光频率为20Hz，光斑大小为100μm，扫描速度为40μm/s。
根据本发明，脑组织来自于哺乳动物，例如来自于人、小鼠、兔、山羊等。
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种离体脑组织中Aβ蛋白的定量检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)取离体脑组织，进行匀浆、冰冻切片；优选，脑组织切片的厚度约为10μm；
(2)配制不同浓度的Ru-NHS酯的标准溶液；优选，溶剂选自DMSO、甲醇中的一种或两种的任意比例的混合物；
(3)将步骤(1)得到的脑组织切片反复浸泡在步骤(2)得到的不同浓度的Ru-NHS酯的标准溶液中并晾干；优选，每浸泡5min取出晾干，重复6次；
(4)用LA-ICP-MS检测步骤(3)所得脑组织切片的Ru信号；优选，检测102Ru信号；优选，采用13C信号均一化消除脑组织切片薄厚不均的影响；
(5)将步骤(3)所得脑组织切片中的脑组织刮下，称重，用硝酸消解，用ICP-MS对所得溶液中的Ru进行测定，并根据重量得到Ru的浓度；
(6)用步骤(4)及(5)所得数据制作标准曲线，其中横坐标为步骤(5)得到的Ru的浓度，纵坐标为步骤(4)得到的Ru的信号强度；
(7)按照本发明的方法用Ru-NHS酯和Aβ抗体耦联形成的螯合物对脑组织切片上的Aβ进行成像，或者进一步根据多个脑组织切片的数据对脑组织中的Aβ进行成像；
(8)根据步骤(7)所用螯合物中Ru-NHS酯和Aβ抗体的摩尔比，以及步骤(6)标准曲线所给出Ru的浓度与信号强度之间的关系，基于步骤(7)得到的脑组织切片Aβ成像图或脑组织Aβ成像图得到相应的Aβ定量图。
根据本发明，脑组织来自于哺乳动物，例如来自于人、小鼠、兔、山羊等。
本领域技术人员可以理解，使用本发明的方法，可以筛选治疗阿尔兹海默症的药物，因此，根据本发明的另一个方面，本发明提供一种治疗阿尔兹海默症的药物筛选方法，该方法包括以下步骤：使用本发明的方法对未给予和给予待筛选药物的患有AD的哺乳动物离体脑组织中的Aβ蛋白进行检测，并比较。优选，所述哺乳动物为小鼠、兔、山羊等。
本发明的优点在于，在不破坏脑组织的完整性的前提下，实现了Aβ蛋白的原位成像，能够完整、精确地展现脑组织中Aβ蛋白的分布位置及聚集程度，并具有溯源性，从而有利于对阿尔兹海默症的发明机理进行研究。另外，本发明还可实现对脑组织中Aβ蛋白的定量检测。本发明的方法操作简单，特异性和灵敏度高，稳定性好，重复性强。
附图说明
图1.脑组织切片上的Aβ成像图，左侧为正常鼠脑，右侧为转基因阿尔兹海默模型小鼠脑
图2.脑组织切片传统免疫组化染色图，左侧a为正常鼠脑，右侧b为转基因阿尔兹海默模型小鼠脑
图3.脑组织切片上所检测到的Ru的信号强度与浓度的标准曲线
图4.脑组织切片上的原位Aβ定量图，左侧为正常鼠脑，右侧为转基因阿尔兹海默模型小鼠脑
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
实施例1.Ru-NHS酯和Aβ抗体耦联的螯合物及其制备
(1)精密天平称取Ru-NHS酯粉末，使用DMSO溶解混匀，使浓度为100μg/ml。
(2)取anti-β-Amyloid(BioLegend)，用10mM、pH 8.0的PBS溶解，使浓度为2μg/ml。
(3)将5μl步骤(1)所形成的溶液加到100μl步骤(2)所形成溶液中，涡旋混匀，避光室温震荡反应1h。
(4)在步骤(3)所形成溶液中加入2μl，2M甘氨酸水溶液终止反应，避光室温震荡15min。
(5)步骤(4)形成溶液使用10KD透析管置于500ml，10mM、pH8.0的PBS中透析两次，每次30min。
(6)透析后的溶液可置于离心管中4℃储存。经检测，所得螯合物中Ru-NHS酯和anti-β-Amyloid的摩尔比为500:1。
实施例2.离体脑组织中Aβ蛋白的检测
(1)分别取6月龄正常小鼠和转基因阿尔兹海默模型小鼠，麻醉后经生理盐水灌流后断头取脑。
(2)步骤(1)所得脑组织置于4％多聚甲醛中固定后，隔日取出后分别在20％、30％蔗糖溶液中梯度脱水，脑组织沉入溶液底部后取出。
(3)步骤(2)所得脑组织使用OCT冰冻切片包埋剂包埋后置于恒温冰冻切片机中切成10μm的薄片。
(4)步骤(3)所得脑组织切片室温放置30min。用超纯水洗去切片上的OCT包埋剂。
(5)将步骤(4)所得切片放入4℃预冷的丙酮中固定10min，取出后用10mM PBS pH7.4清洗5min*3次。
(6)向步骤(5)处理后的脑组织滴加破膜液0.1％triton X-100，5min后用10mMPBS pH 7.4清洗5min*3次。
(7)在步骤(6)所得脑组织上滴加3％的双氧水，30min以灭活过氧化氢酶，再一次用10mM PBS pH 7.4进行清洗5min*3次。
(8)用10％的山羊血清对步骤(7)所得脑组织进行封闭，室温20min后，倾去血清。
(9)向步骤(8)所得脑组织加入50μl 2μg/ml实施例1制备得到的螯合物的PBS溶液，充分覆盖。将切片置于湿盒中，保持湿润环境，4℃孵育过夜。
(10)步骤(9)中所得脑组织使用PBS溶液(10mM,pH7.4)进行清洗，洗涤5min*3次，将未结合的抗体洗去。晾干后，进行LA-ICP-MS检测。LA对切片上的组织进行剥蚀，ICP-MS选取102Ru、13C进行信号监测，其中采用13C信号均一化消除脑组织切片薄厚不均的影响。
(11)根据步骤(10)得到的数据对脑组织切片上的Aβ进行成像，见附图1。进一步根据多个脑组织切片的数据对脑组织中的Aβ进行成像。
另外，向步骤(8)所得脑组织加入50μl 2μg/ml的anti-β-Amyloid(BioLegend)的PBS溶液，充分覆盖。将切片置于湿盒中，保持湿润环境，4℃孵育过夜。隔日取出切片后，加入辣根酶标记的二抗，置于37℃恒温箱中45min，最后加入DAB显色5min，显微镜观察，见附图2。
比较附图1和2可知，或者比较正常小鼠和转基因阿尔兹海默模型小鼠脑组织切片上的Aβ成像图可知，本发明的方法可用于检测离体脑组织中的Aβ蛋白。
实施例3.离体脑组织中Aβ蛋白的定量检测
(1)取6月龄正常小鼠，麻醉后经生理盐水灌流后断头取脑，匀浆，使用OCT冰冻切片包埋剂包埋后置于恒温冰冻切片机中切成10μm的薄片；
(2)配置Ru浓度分别为0、1、2、3、4μg/ml的Ru-NHS酯的甲醇标准溶液。
(3)将步骤(1)得到的切片室温放置20min后，浸泡在步骤(2)得到的不同浓度Ru的甲醇标准溶液中，浸泡方式为每浸泡5min取出晾干，重复6次。
(4)LA对步骤(3)所得切片进行剥蚀，ICP-MS选取102Ru、13C进行信号监测，其中采用13C信号均一化消除脑组织切片薄厚不均的影响。
(5)另取步骤(3)所得切片，将脑组织刮下，称重后，置于消解罐中，加入2ml重蒸硝酸，将消解罐置于加热板上，180℃，加热3h，用ICP-MS对所得溶液中的Ru进行测定，并根据重量得到Ru的浓度。
(6)用步骤(4)及(5)所得数据制作标准曲线，其中横坐标为步骤(5)得到的Ru的浓度，纵坐标为步骤(4)得到的Ru的信号强度，见附图3，用于脑成像图中Ru的信号强度与Ru浓度的转换。
(7)根据实施例1所制备的螯合物中Ru-NHS酯和Aβ抗体的摩尔比500:1，以及步骤(6)标准曲线所给出Ru的浓度与信号强度之间的关系，基于实施例2得到的脑组织切片Aβ成像图，绘制原位Aβ定量图，见附图4。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种螯合物，其特征在于，由双(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌N-琥珀酰亚胺酯-双-(六氟磷酸盐)(Ru-NHS酯)和Aβ抗体耦联形成。
优选地，螯合物中Ru-NHS酯和Aβ抗体的摩尔比为50:1-500:1，更优选为约500:1。
2.根据权利要求1所述的螯合物，其特征在于，所述Aβ抗体来自于哺乳动物，优选人、小鼠、兔、山羊等。
所述Aβ抗体能够与哺乳动物，优选人、小鼠、兔、山羊等Aβ蛋白结合。
所述Aβ抗体能够与β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)、Aβ1-40、Aβ1-42中的一种或多种结合，优选Aβ1-42。
所述Aβ抗体为单克隆抗体。
3.根据权利要求1或2所述螯合物的制备方法，其特征在于，包括将Ru-NHS酯和Aβ抗体反应的步骤。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将Ru-NHS酯溶解溶剂中；优选，溶剂选自DMSO、甲醇中的一种或两种的任意比例的混合物；优选，Ru-NHS酯溶液的浓度为50-500μg/ml，最优选约100μg/ml。
(2)将Aβ抗体溶解在溶剂中；优选，溶剂为PBS或PB；优选，Aβ抗体溶液的浓度为0.5-10μg/ml，最优选约2μg/ml；优选，PB和PBS的pH值为7.8-8.0，浓度为10-12mM。
(3)将步骤(1)所得溶液和步骤(2)所得溶液混合，反应；优选，反应在避光、室温、震荡下进行；优选，反应时间为0.1-10h，最优选约1h；
(4)在步骤(3)所得溶液中加入甘氨酸以终止反应；优选，该步骤在避光、室温、震荡下进行；优选，该步骤时间为5-30min；优选，甘氨酸以其水溶液的形式加入；优选，甘氨酸水溶液的浓度为1-3M，最优选约2M；优选，Ru-NHS酯和甘氨酸的摩尔比为1:400-1:1200，最优选约1:800；
(5)将步骤(4)所得溶液用透析管进行透析纯化；优选，透析管为10KD，透析液为PBS或PB，优选10-12mM、pH7.8-8.0的PBS或PB，透析液的用量以体积计至少为步骤(4)所得溶液的1000倍，更优选为4000-6000倍，最优选约5000倍。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所得溶液中Ru-NHS酯和步骤(2)所得溶液中Aβ抗体的摩尔比至少为50:1，优选至少为500:1，或者优选为50:1-1000:1，进一步优选为50:1-600:1，更优选为500:1-1000:1。
6.一种离体脑组织中Aβ蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取离体脑组织进行冰冻切片、丙酮固定、破膜、灭活过氧化氢酶、并封闭；优选，脑组织切片的厚度约为10μm；
(2)将上述螯合物的溶液滴加到步骤(1)所得脑组织切片上，静置8-16h，优选约12h，使脑组织中的Aβ蛋白与上述螯合物中的Aβ抗体结合；优选，静置温度为4℃；优选，在静置过程中保持脑组织切片湿润；
(3)洗去脑组织切片中未结合的螯合物，晾干，用LA-ICP-MS检测Ru信号；优选，检测102Ru信号；优选，采用13C信号均一化消除脑组织切片薄厚不均的影响；
(4)根据步骤(3)得到的数据对脑组织切片上的Aβ进行成像，或者进一步根据多个脑组织切片的数据对脑组织中的Aβ进行成像。
优选地，脑组织来自于哺乳动物，例如来自于人、小鼠、兔、山羊等。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)螯合物的溶液中，螯合物的浓度为0.5-10μg/ml，最优选约2μg/ml；优选，溶剂为10-12mM、pH7.8-8.0的PBS或PB。
8.一种离体脑组织中Aβ蛋白的定量检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)取离体脑组织，进行匀浆、冰冻切片；优选，脑组织切片的厚度约为10μm；
(2)配制不同浓度的Ru-NHS酯的标准溶液；优选，溶剂选自DMSO、甲醇中的一种或两种的任意比例的混合物；
(3)将步骤(1)得到的脑组织切片反复浸泡在步骤(2)得到的不同浓度的Ru-NHS酯的标准溶液中并晾干；优选，每浸泡5min取出晾干，重复6次；
(4)用LA-ICP-MS检测步骤(3)所得脑组织切片的Ru信号；优选，检测102Ru信号；优选，采用13C信号均一化消除脑组织切片薄厚不均的影响；
(5)将步骤(3)所得脑组织切片中的脑组织刮下，称重，用硝酸消解，用ICP-MS对所得溶液中的Ru进行测定，并根据重量得到Ru的浓度；
(6)用步骤(4)及(5)所得数据制作标准曲线，其中横坐标为步骤(5)得到的Ru的浓度，纵坐标为步骤(4)得到的Ru的信号强度；
(7)按照本发明的方法用Ru-NHS酯和Aβ抗体耦联形成的螯合物对脑组织切片上的Aβ进行成像，或者进一步根据多个脑组织切片的数据对脑组织中的Aβ进行成像；
(8)根据步骤(7)所用螯合物中Ru-NHS酯和Aβ抗体的摩尔比，以及步骤(6)标准曲线所给出Ru的浓度与信号强度之间的关系，基于步骤(7)得到的脑组织切片Aβ成像图或脑组织Aβ成像图得到相应的Aβ定量图。
优选地，脑组织来自于哺乳动物，例如来自于人、小鼠、兔、山羊等。
9.一种治疗阿尔兹海默症的药物筛选方法，该方法包括以下步骤：使用权利要求6-8中任一项的方法对未给予和给予待筛选药物的患有AD的哺乳动物离体脑组织中的Aβ蛋白进行检测，并比较。
CN202010105730.3A 2020-02-20 2020-02-20 基于金属标记的阿尔兹海默症脑组织Aβ蛋白的原位检测方法 Active CN111393524B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010105730.3A CN111393524B (zh) 2020-02-20 2020-02-20 基于金属标记的阿尔兹海默症脑组织Aβ蛋白的原位检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010105730.3A CN111393524B (zh) 2020-02-20 2020-02-20 基于金属标记的阿尔兹海默症脑组织Aβ蛋白的原位检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111393524A true CN111393524A (zh) 2020-07-10
CN111393524B CN111393524B (zh) 2022-04-08

Family

ID=71427010

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010105730.3A Active CN111393524B (zh) 2020-02-20 2020-02-20 基于金属标记的阿尔兹海默症脑组织Aβ蛋白的原位检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111393524B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115015353A (zh) * 2022-06-02 2022-09-06 南京大学 用于肿瘤组织细胞外基质电化学发光成像的试剂盒、成像方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009016734A1 (ja) * 2007-07-31 2009-02-05 University Of Tsukuba 軽度認知機能障害の検定方法
CN104662423A (zh) * 2012-03-13 2015-05-27 杨森阿尔茨海默氏症免疫治疗公司 阿兹海默氏病的诊断、预后和监测中的寡聚体Aβ
CN107192749A (zh) * 2017-04-14 2017-09-22 上海师范大学 检测β‑淀粉样蛋白的电化学发光免疫传感器及其构建
CN107765015A (zh) * 2017-09-08 2018-03-06 中国计量科学研究院 一种定量检测脑组织中Aβ40蛋白的方法
CN110286184A (zh) * 2019-05-27 2019-09-27 中国计量科学研究院 纳米金标记与液质联用定量人血清中的转铁蛋白的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009016734A1 (ja) * 2007-07-31 2009-02-05 University Of Tsukuba 軽度認知機能障害の検定方法
CN104662423A (zh) * 2012-03-13 2015-05-27 杨森阿尔茨海默氏症免疫治疗公司 阿兹海默氏病的诊断、预后和监测中的寡聚体Aβ
CN107192749A (zh) * 2017-04-14 2017-09-22 上海师范大学 检测β‑淀粉样蛋白的电化学发光免疫传感器及其构建
CN107765015A (zh) * 2017-09-08 2018-03-06 中国计量科学研究院 一种定量检测脑组织中Aβ40蛋白的方法
CN110286184A (zh) * 2019-05-27 2019-09-27 中国计量科学研究院 纳米金标记与液质联用定量人血清中的转铁蛋白的方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEATRIZ FERNANDEZ: "Laser ablation ICP-MS for quantitative biomedical applications", 《ANAL BIOANAL CHEM》 *
MARÍA CRUZ-ALONSO ET AL.: "Laser ablation ICP-MS for simultaneous quantitative imaging of iron and ferroportin in hippocampus of human brain tissues with Alzheimer"s disease", 《TALANTA》 *
PEDRO CARNEIROA ET AL.: "Alzheimer"s disease: Development of a sensitive label-freeelectrochemical immunosensor for detection of amyloid beta peptide", 《SENSORS AND ACTUATORS B：CHEMICAL》 *
ROBERT W. HUTCHINSON ET AL.: "Imaging and spatial distribution of β-amyloid peptide and metal ions: in Alzheimer"s plaques by laser ablation–inductively coupled plasma-mass spectrometry", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 *
XUE GAO ET AL.: "Quantitative imaging of amyloid beta peptide (Aβ) in Alzheimer’s brain tissue by laser ablation ICP-MS using gold nanoparticles as labels", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》 *
李俊发等 主编: "《细胞信号转导研究技术》", 31 August 2008 *
杨昌鹏 主编: "《生物化学与分子生物学实验 第3版》", 31 August 2007, 中国农业出版社 *
潘道东 主编: "《功能性食品添加剂》", 31 January 2006, 中国轻工业出版社 *
石鑫: "新型喷射式流动注射电化学发光分析系统的建立及其免疫检测的应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库电子期刊 工程科技I辑》 *
高雪: "基于金属钌标记的阿尔兹海默症标志蛋白原位分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115015353A (zh) * 2022-06-02 2022-09-06 南京大学 用于肿瘤组织细胞外基质电化学发光成像的试剂盒、成像方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111393524B (zh) 2022-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Groveman et al. Sporadic Creutzfeldt-Jakob disease prion infection of human cerebral organoids
Fares et al. Induction of de novo α-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson’s disease
JP6075881B2 (ja) 乳癌のバイオマーカー
CN103116018B (zh) 一种免疫组化质量控制参照物及质量控制方法
KR101823697B1 (ko) 항원 복원 공정을 위한 방법 및 장치
DE102013106713A1 (de) Verfahren zur Ermittlung von Indikatoren zur Bestimmung von Krankheiten
Hinton Jr et al. A comprehensive approach to sample preparation for electron microscopy and the assessment of mitochondrial morphology in tissue and cultured cells
Khoo et al. In Vivo Immuno‐Spin Trapping: Imaging the Footprints of Oxidative Stress
Büttner et al. Widespread axonal damage in the brain of drug abusers as evidenced by accumulation of β‐amyloid precursor protein (β‐APP): an immunohistochemical investigation
US20220365081A1 (en) Sample clarification and reduction of background fluorescence for fluorescent detection of analytes
Liu et al. Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis
CN111393524A (zh) 基于金属标记的阿尔兹海默症脑组织Aβ蛋白的原位检测方法
Nishimuta et al. Copper deposition in oligodendroglial cells in an autopsied case of hepatolenticular degeneration
US20100184105A1 (en) Assessing neuronal damage from blood samples
CN109580951A (zh) 多抗体联合检测早期肝癌标志物的试剂盒及其使用方法
Vidal et al. Characterization of amyloid deposits in neurodegenerative diseases
Lu et al. A probe for NIR-II imaging and multimodal analysis of early Alzheimer’s disease by targeting CTGF
CN106198996B (zh) 微小病变型肾病的早期诊断生物标记物、试剂盒及其应用
Sisó et al. Occurrence and cellular localization of PrPd in kidneys of scrapie‐affected sheep in the absence of inflammation
JPWO2003104806A1 (ja) 検出キット、それに用いられる測定プレート、検出方法、評価方法、カエルビテロジェニンのポリクローナル抗体及びその製造方法
CN107607727B (zh) H3K23ac在胶质瘤诊断中的应用
Kummeling et al. Tubular and interstitial nephrocalcinosis
CN108387742B (zh) 用于检测转运的生物传感器及其应用
AU2018229466B2 (en) Method for determining tissue regeneration state of living body organs
Moghadam et al. Concentration of a potent calcium oxalate monohydrate crystal growth inhibitor in the urine of normal persons and kidney stone patients by ELISA‐based assay system employing monoclonal antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant