CN114113278B - 一种基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法 - Google Patents

一种基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114113278B
CN114113278B CN202111402846.4A CN202111402846A CN114113278B CN 114113278 B CN114113278 B CN 114113278B CN 202111402846 A CN202111402846 A CN 202111402846A CN 114113278 B CN114113278 B CN 114113278B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antigen
antibody
epitope
buffer
mass spectrometry
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111402846.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114113278A (zh
Inventor
宋德伟
孙浩峰
刘健仪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute of Metrology
Original Assignee
National Institute of Metrology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute of Metrology filed Critical National Institute of Metrology
Priority to CN202111402846.4A priority Critical patent/CN114113278B/zh
Publication of CN114113278A publication Critical patent/CN114113278A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114113278B publication Critical patent/CN114113278B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法，通过表面等离子体共振对试剂盒内的多种抗体分别与被测抗原相互作用的分析，获得能与待测抗原直接发生相互作用的抗体，通过冰上孵育来制备待测抗原与抗体的免疫复合物，再通过尺寸排阻色谱确定免疫复合物的孵育时间、孵育浓度以及结合比例。最后通过在线酶切技术获得待测抗原的肽图，再使用基于质谱的氢氘交换技术对免疫复合物进行分析，通过数据处理获得试剂盒内抗体的表位图谱。本发明采用了一种全新的方法实现了体外诊断试剂盒内抗体的表位定位。该方法具有快速、灵敏、高通量、样品用量少、无分析质量上限等特点，能够应用于市面上多数试剂盒的表位定位分析。

Description

一种基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，特别是涉及一种体外诊断试剂抗体的表位定位方法。
背景技术
体外诊断(IVD)试剂是指在疾病的预测、预防、诊断、治疗监测、预后观察和健康状态评价的过程中，用于人体样本体外检测的产品。
目前，疾病预防、临床诊治基本上都需要用到体外诊断试剂，如血尿便三大常规检测，病毒或细菌感染的鉴别，心肝肾血管、免疫功能检查等。因此，提高IVD试剂的性能，是确保相关化验结果和诊断正确的重要基础。
IVD试剂往往是通过试剂盒的形式来进行待检项目的测定，国内外众多IVD试剂的生产厂商可以针对临床检验项目生产多种类的检测试剂盒，这极大地丰富了IVD试剂的选择性，但同时面临着，不同生产厂商的同一种类的试剂盒的定量结果不能互认的情况，这带来了极大的挑战。产生这种现象的原因，一方面是由于厂商的溯源过程不够规范所导致；另一方面，由于IVD试剂盒通常是基于免疫原理来设计的，因此不同品牌试剂盒所使用的抗体往往是不同的，这导致了它们与待测抗原结合位点的差异，这种差异导致了这些试剂盒定量结果的不一致性。
对于体外诊断试剂的标准化，目前国际上采用临床量值溯源国际标准ISO-17511，通过量值溯源体系将体外诊断试剂生产厂商生产的产品通过标准物质溯源到SI单位，以保证用户终端的测量数据的准确性。由于临床样本的特殊性，样品的结构性质尤其是表位信息，会对试剂盒定量结果的一致性产生一定程度的影响。因而从结构角度对试剂盒的溯源性进行考察，对于提高不同品牌试剂盒的性能具有十分重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法，该方法具有快速、灵敏、高通量的特点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
(1)抗原及试剂盒抗体的准备：收集试剂盒内的抗体及对应的抗原。
(2)抗原纯度及聚集态分析：用SDS-Page凝胶电泳法和尺寸排阻色谱法对抗原的纯度进行分析。
SDS-Page电泳法具体为，制备凝胶，固定在电泳装置中并检漏；将抗原与上样缓冲液混合，95℃加热5min；按浓缩胶80V，分离胶120V的恒定电压进行电泳，至待染料到达分离胶底部；考马斯亮蓝染色后，用脱色液洗脱至条带清晰，使用凝胶成像系统分析凝胶条带。
尺寸排阻色谱法具体为，配制缓冲溶液平衡Superdex 200 10/300GL色谱柱，UV基线调零；检测波长为280nm和254nm；流速0.75mL/min，微量进样器手动进样；上样后用缓冲液将UV基线冲洗至平衡。
(3)抗体的表面等离子体共振分析：使用EDC/NHS活化CM5芯片，并用乙醇胺(ETA)溶液封闭芯片；HBS-EP缓冲液作为流动相，流速10μL/min，将抗原用偶联缓冲液稀释至40μg/mL，设置偶联程序进行配体偶联；将抗体分别用HBS-EP缓冲溶液梯度稀释至100、50、25、12.5、6.25μg/mL 6个浓度，流速10μL/min，时间60s，分析温度和样品室温度为25℃，设置程序进行传感图采集。
(4)制备免疫复合物：按照半抗体过量的比例，将抗体稀释并与抗原混匀；置于冰上孵育；完成后，使用0.22μm水相滤膜过滤后上样；用尺寸排阻色谱对样品的组成进行分析；根据谱图，调整抗体与抗原的结合比例及孵育时间，保证抗原被充分结合；将制备的免疫复合物保存在-80℃的冰箱中，留待氢氘交换实验。
(5)表位分析：
溶液配制：样品缓冲液(20mM PBS，pH 7.0)；重水缓冲液：取平衡缓冲液冷冻干燥用重水复溶，pD 7.0；猝灭缓冲液(100mM PBS，6M盐酸胍，500mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐，pH2.2。
建立抗原酶切肽图：将抗原溶液以15000转离心5min；将5μL抗原与70μL平衡缓冲液，75μL猝灭缓冲液，和200μL 0.1％甲酸水溶液混匀，取220μL样品进样；使用WatersENZYMATE BEH PEPSIN 2.1mm×30mm柱在线酶切，使用ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard预柱3/Pk 1.7μm，2.1×5mm脱盐富集，使用ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm，1.0×100mm柱分离肽段；使用Waters G2高分辨质谱对酶解肽段进行鉴定；使用ProteinLynx Global Service3.0.2(Waters)软件进行肽段的匹配与鉴定；将肽段数据导入Dynamx软件生成抗原的在线酶切肽图。
氢氘交换-质谱分析：用Waters氢氘交换平台偶联Waters G2高分辨质谱进行表位定位；
样品以15000转离心5min；每一抗原和免疫复合物分别制备成6份样品，每瓶5μL样品，将所有液相小瓶放置在样品盘中；使用Chronos软件设置氢氘交换程序，氘交换时间为0s(对照组)，10s，1min，10min，1h和3h；在Waters超高效液相色谱系统中完成酶切，脱盐及分离；通过质谱同时采集高质量的肽段母离子信息及肽段碎片离子信息，进行肽段的鉴别和氘摄取量的计算；将实验数据导入Dynamx软件，计算每一肽段的氘摄取量；将抗体结合后导致的抗原氘吸收率下降区域，确定为可能的抗原表位区域；使用Pymol软件进行表位映射，确认表位结果。
同现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明使用表面等离子体共振法(SPR)和尺寸排阻色谱法(SEC-UV)对体外诊断试剂盒内的抗体性质以及抗体与抗原的结合比例进行详细的分析，保证了最终表位结果的准确性；采用的氢氘交换耦合质谱法，可对试剂盒内复杂的抗体组成进行快速全面的表位分析，获得溶液状态下的抗体构象表位信息，接近于试剂盒内抗体的工作状态，最大程度的模拟了待测抗原与抗体的真实结合状态。本发明建立的体外诊断试剂抗体表位定位方法，操作简便，可以应用于市面上多数试剂盒抗体的表位定位研究，指导试剂盒的设计和生产。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法作进一步说明。
附图说明
图1为本发明基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法的流程图；
图2为实施例2中C反应蛋白的SDS-Page电泳结果；
图3为实施例2中C反应蛋白的聚集状态分析；
图4为实施例2中全程C反应蛋白测定试剂盒抗体的表面等离子体共振分析；
图5为实施例2中制备的全程C反应蛋白测定试剂盒抗体与C反应蛋白的免疫复合物；
图6为实施例2中建立的C反应蛋白抗原酶切肽图；
图7为实施例2中全程C反应蛋白测定试剂盒的氢氘交换结果；
图8为实施例2中全程C反应蛋白测定试剂盒表位的映射结果。
具体实施方式
应该指出，下列实施例的实验步骤是例示性的，旨在对基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下列实施例中所涉及的主要试剂和仪器设备如下：
(1)主要试剂
乙腈(色谱纯)：Thermo Fisher公司；
水(质谱纯)：Thermo Fisher公司；
重水(99.9％)：SIGMA-阿拉丁公司；
磷酸盐缓冲片：SIGMA公司；
氘代盐酸(20wt.％)：赛默飞世尔科技有限公司；
三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)：Thermo公司；
盐酸胍(Gn-HCl)：SIGMA公司；
甲酸：赛默飞世尔科技有限公司。
(2)仪器设备
涡旋混合器：SCILOGEX的产品；
M-Class超高效液相色谱仪：沃特世产品；
高分辨飞行时间质谱(G2 HDMS)：沃特世公司；
氢氘交换平台(H/D-X)：Leap PAL公司；
蛋白纯化仪(AKTA Purifier 100)：伯乐公司；
表面等离子体共振系统(Biacore T200)：伯乐公司；
二维凝胶成像系统：伯乐公司；
pH计(PHS-25)：Mettler Toledo公司；
高精密电子天平(XP-26)：Mettler Toledo公司
移液器(20、200和1000μL)：Thermo Fisher Scientific(德国)的产品。
实施例1
如图1所示，一种基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法，具体步骤为：
1、抗原及试剂盒抗体的准备
选择待进行表位分析的试剂盒，针对该试剂盒的检测项目，准备具有90％以上纯度的抗原溶液，确定其浓度。抗原在相关实验之前保存在-80℃冰箱中。
确定试剂盒抗体的组成类型(多抗体配对或单一抗体)，按照种类分别收集选定试剂盒内的所有抗体，确定各抗体的类型(多抗/单抗)及浓度。各抗体在相关实验之前保存在-80℃冰箱中。
2、抗原纯度及聚集状态分析
2.1抗原纯度分析
基于氢氘交换质谱的表位作图方法，通常要求测试的样品具有尽可能高的纯度，以防止样品中杂质的质谱信号对实验结果带来干扰，影响实验的准确性。为此进行SDS-Page凝胶电泳实验以对待测样品的纯度进行验证。
SDS-Page具体操作方法如下：
1)固定好玻璃槽，用去离子水检漏，配制适合浓度的分离胶，混匀注入玻璃板间隙中，在分离胶上轻轻覆盖一层去离子水。
2)在室温条件下等待凝胶聚合，移除水层，配制5％浓缩胶注入分离胶上端，并插入梳子避免产生气泡。
3)在室温条件下等待浓缩胶聚合，完成凝胶制备。
4)移除凝胶上端的梳子，并固定在电泳槽中，内外槽均加入电泳缓冲液，检查是否漏液，同时将样品与上样缓冲液混合，95℃水浴变性5min后上样。
5)电泳开始后浓缩胶使用80V恒定电压，分离胶使用120V恒定电压，待染料到达分离胶底部，断开电源，取下凝胶。
6)用考马斯亮蓝染色液浸没凝胶，室温条件下摇动染色约1h。
7)换用脱色液浸泡凝胶，缓慢摇动脱色直到清晰，使用凝胶成像系统分析条带。
2.2抗原聚集状态分析
为了使表位实验中抗原的聚集状态与其在人体中的自然状态保持一致，使抗原与试剂盒抗体的相互作用更接近于试剂盒抗体工作的真实情况，在Purifier 100系统上使用Superdex 200 10/300GL色谱柱对样品进行SEC-UV实验，对抗原的聚集状态进行研究。
具体操作步骤如下：
1)配制适合于待测抗原维持天然构型的缓冲溶液，用2CV缓冲溶液平衡凝胶色谱柱，平衡后将UV基线调零。
2)设置检测波长为280nm。
3)调节流速0.75mL/min，用微量进样器吸取抗原溶液进样，用缓冲液将UV基线冲洗至平衡，获得抗原的SEC-UV谱图。
3、抗体的表面等离子体共振分析
使用Biacore表面等离子体共振分析仪进行体外诊断试剂抗体与抗原相互作用的分析，并使用稳态法测定试剂盒内每一种抗体的亲和力。
具体操作步骤如下：
1)使用EDC/NHS溶液活化芯片，随后使用乙醇胺(ETA)溶液对芯片进行封闭。
2)以HBS-EP缓冲液作为流动相，根据抗原的等电点选择适合pH值的偶联缓冲液，将抗原用偶联缓冲液稀释至40μg/mL，将稀释后的溶液以10μL/min分别注入CM5芯片表面的两个通道内，设置偶联程序进行配体的偶联。
3)将试剂盒内的抗体分别用HBS-EP缓冲溶液梯度稀释至100、50、25、12.5、6.25μg/mL6个浓度，以2M的氢氧化钠溶液作为洗液，流动相作为空白溶液，进行实验。流速10μL/min，时间60s，将分析温度和样品室温度设定为25℃，记录每一抗体与抗原相互作用的传感图。
4、制备免疫复合物
具体操作步骤如下：
1)向EP管中加入一定体积的PBS缓冲液，按照半抗体过量的比例，随后用移液枪吸取一定体积的抗体溶液加入到上述EP管中，然后按比例加入抗原，将液体轻轻地颠倒摇匀。
2)液体混匀后将该EP管至于冰上孵育一定的时间，来制备抗原与抗体的免疫复合物。
3)孵育完成以后，使用0.22μm水相滤膜对孵育后的溶液进行过滤，然后用尺寸排阻色谱对样品的组成进行分析。
4)根据色谱图，调整抗体与抗原的结合比例及孵育时间，保证体系内形成明显的可溶性复合物，并使体系内不存在游离抗原。在最佳条件下获得的免疫复合物保存在-80℃的冰箱中，留待氢氘交换实验。
5、表位分析
5.1溶液配制：
1)样品缓冲液：称取20mM PBS溶解，并用盐酸调节pH至7.0。
2)重水缓冲液：取一定体积的平衡缓冲液冷冻干燥，并用等体积重水复溶后使用氘代盐酸调节pD至7.0(pD＝pH-0.4)。
3)猝灭缓冲液：称取100mM PBS，6M盐酸胍(Gn-HCl)，500mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)，并调节pH至2.2。
5.2建立抗原酶切肽图
具体操作步骤如下：
1)从冰箱内取出一支抗原溶液，于冰上缓慢解冻。为去除样品溶液中的颗粒，将解冻后的样品以15000转离心5min。
2)取5μL抗原溶液于EP管中，使用移液枪加入70μL平衡缓冲液，随后加入75μL猝灭缓冲液，最后添加200μL 0.1％甲酸水溶液稀释并混匀，随后使用微量进样针吸取220μL样品进样。
3)将稀释后的样品注入到Waters液相系统中(由A泵(ASM)、B泵(BSM)以及氢氘交换管理器(HDX Manager)三部分组成)，进行脱盐富集(ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard预柱3/Pk 1.7μm，2.1×5mm)，在线酶切(Waters ENZYMATE BEH PEPSIN 2.1mm×30mm)和液相分离(ACQUITY UPLC BEH C18，1.7μm，1.0×100mm)。
液相条件为：分析柱及陷阱柱柱温0.5℃；酶切柱柱温15℃；ASM流速100μL/min，BSM流速50μL/min；A相H2O(含0.2％FA)；B相HCN(含0.1％FA)；富集时间4.0min，分离时间12.0min；ASM采用100％A相等度洗脱，BSM采用7min 5-45％B的二元超高压液相梯度。
4)使用Waters G2高分辨质谱对酶解肽段进行鉴定。
质谱条件为：全信息串联质谱(MSE)模式，使用亮氨酸脑啡肽(LE)进行实时校正。采用ESI源，正离子分辨率模式，扫描范围350-1600Da，低能碎裂(Trap碰撞池)电压4V，高能碎裂(Ramp Trap碰撞池)电压20-45V，扫描时间0.3s，运行时间12min。毛细管电压主要参数设置如下：毛细管电压3.0KV，源温100℃。
5)使用ProteinLynx Global Service 3.0.2(Waters)软件进行肽段的匹配与鉴定，将抗原的序列输入到软件中，再添加质谱数据。设置数据处理方法：处理参数使用Apex3D设置，设置锁定质量为556.2771Da，锁定质量允许误差为0.25Da，低能阈值130个离子计数，高能阈值30个离子计数，其他参数使用默认数值。工作表参数设置中，将肽段偏差及碎片偏差均设置为100ppm，将酶切试剂定义为非特异性，其他参数使用默认数值。结合软件打分情况，对匹配肽段进行手动核对以确定最终的抗原酶解情况。
6)将确定的肽段数据导入Dynamx软件生成抗原的在线酶切肽图。
5.3氢氘交换-质谱分析
5.3.1氢氘交换反应
具体操作步骤如下：
1)从冰箱内取出一支抗原和制备好的免疫复合物，于冰上缓慢解冻。将解冻后的样品以15000转离心5min去除样品溶液中的颗粒。
2)每一抗原和免疫复合物分别制备成6份样品，每一样品中用移液枪添加5μL抗原或免疫复合物加入带有内插管的Waters液相小瓶中，再按样品瓶数量准备2倍数量的空瓶，上述的瓶子按设定顺序放置在H/D-X PAL氢氘交换机械臂的样品盘中。
3)使用Chronos软件设置氢氘交换程序，依次向样品瓶中注入70μL的平衡缓冲溶液(对照组)或重水溶液进行平衡或氢氘交换反应。设置氘交换时间为0s(对照组)，10s，1min，10min，1h和3h。
4)到达预设的交换时间后，吸取60μL反应后的样品加入到新的液相小瓶中并与等体积的猝灭缓冲液充分混合，反应0.5min后终止氢氘交换反应并对样品进行变性和二硫键的还原。
5)最后吸取40μL猝灭后的液体转移到添加有200μL稀释溶液(0.1％甲酸水溶液)的液相小瓶中进行稀释，最后吸取230μL进样。
5.3.2液相分离
稀释后的样品流经酶切柱，被固定化的胃蛋白酶酶解。酶解的肽段流经陷阱柱进行在线脱盐及富集，这一过程持续4.0min，随后富集的肽段会被反冲进C18分析柱进行12min的二元梯度分离。以上过程全部在Waters超高效液相色谱系统中完成，液相条件同5.2。
5.3.3质谱检测
通过质谱同时采集高质量的肽段母离子信息及肽段碎片离子信息，进行肽段的鉴别和氘摄取量的计算。质谱条件同5.2。
5.4数据处理
具体操作步骤如下：
1)将氢氘交换质谱实验的数据文件导入Dynamx软件，以建立的抗原在线酶切肽图为基础，计算每一条肽段的氘摄取量。
2)经过Dynamx软件的数据处理，以“蝴蝶图”及每一条肽段的氘吸收曲线的形式展示抗原及免疫复合物的氘吸收差异。将抗体结合后导致的抗原氘吸收率下降区域，确定为可能的抗原表位区域。
3)在蛋白质结构数据库中找到抗原的三维结构代码，将代码输入Pymol软件获得抗原的结构模型，将氢氘交换的结果映射到三维模型上对表位结果进行进一步的确认。最终以序列形式和三维结构展示抗原表位识别结果。
实施例2
采用实施例1的方法对国内某公司的全程C反应蛋白测定试剂盒抗体进行表位定位，具体实验如下：
1、C-反应蛋白(CRP)及某公司全程C反应蛋白测定试剂盒抗体的准备
准备具有95％纯度的天然CRP溶液(北京德奥平生物技术有限公司)，其浓度为2.05mg/mL。九强试剂盒包含有一种多抗，其浓度为13.66mg/mL。上述样品在实验之前保存在-80℃冰箱中。
2、抗原纯度及聚集状态分析
2.1抗原纯度分析(如图2)
使用SDS-page凝胶电泳实验以对CRP的纯度进行验证。
SDS-page具体操作方法如下：
1)固定好玻璃槽，用去离子水检漏，配制适合浓度的分离胶，混匀注入玻璃板间隙中，在分离胶上轻轻覆盖一层去离子水。
2)在室温条件下等待凝胶聚合，移除水层，配制5％浓缩胶注入分离胶上端，并插入梳子避免产生气泡。
3)在室温条件下等待浓缩胶聚合，完成凝胶制备。
4)移除凝胶上端的梳子，并固定在电泳槽中，内外槽均加入电泳缓冲液，检查是否漏液，同时将CRP与上样缓冲液混合，95℃水浴变性5min后上样。
5)电泳开始后浓缩胶使用80V恒定电压，分离胶使用120V恒定电压，待染料到达分离胶底部，断开电源，取下凝胶。
6)用考马斯亮蓝染色液浸没凝胶，室温条件下摇动染色约1h。
7)换用脱色液浸泡凝胶，缓慢摇动脱色直到清晰，使用凝胶成像系统分析条带。
2.2抗原聚集状态分析(如图3)
天然CRP在人体内以五聚体形式存在，为验证其五聚体结构，在Purifier100系统上使用Superdex 200 10/300GL色谱柱对样品进行SEC-UV实验，对CRP的聚集状态进行研究。
具体操作步骤如下：
1)配制HEPES缓冲溶液(10mM HEPES，140mM氯化钠，0.5mM氯化钙，pH 7.2)，用2CVHEPES缓冲溶液平衡凝胶色谱柱，平衡后将UV基线调零。
2)设置检测波长为280nm。
3)调节流速0.75mL/min。取30μL天然CRP溶液于1.5mL EP管中加入100μL HEPES缓冲液，用微量进样器吸110μL进样，用缓冲液将UV基线冲洗至平衡，获得抗原的SEC-UV谱图。
3、抗体的表面等离子体共振分析(如图4)
使用Biacore表面等离子体共振分析仪进行某公司全程C反应蛋白测定试剂盒抗体与CRP相互作用的分析，并使用稳态法测定该抗体的亲和力。
具体操作步骤如下：
1)使用EDC/NHS溶液活化CM5芯片，随后使用乙醇胺(ETA)溶液对芯片进行封闭。
2)以HBS-EP缓冲液作为流动相，根据抗原的等电点选择适合pH值的偶联缓冲液，将C反应蛋白用偶联缓冲液稀释至40μg/mL，将稀释后的溶液以10μL/min分别注入CM5芯片表面的两个通道内，设置偶联程序进行配体的偶联。
3)将试剂盒内的抗体分别用HBS-EP缓冲溶液梯度稀释至100、50、25、12.5、6.25μg/mL 6个浓度，以2M的氢氧化钠溶液作为洗液，流动相作为空白溶液，进行实验。流速10μL/min，时间60s，将分析温度和样品室温度设定为25℃，记录该抗体与CRP相互作用的传感图。
4、制备免疫复合物(如图5)
具体操作步骤如下：
1)向EP管中加入PBS缓冲液，按照半抗体3倍过量的比例吸取抗体溶液加入到上述EP管中，然后添加10μL抗原，使最后总体积为50μL，将液体轻轻地颠倒摇匀。
2)液体混匀后将该EP管至于冰上孵育一定的时间，来制备抗原与抗体的免疫复合物。
3)将获得的免疫复合物保存在-80℃的冰箱中，留待氢氘交换实验。
5、表位分析
5.1溶液配制：
1)样品缓冲液：称取20mM PBS溶解，并用盐酸调节pH至7.0。
2)重水缓冲液：取一定体积的平衡缓冲液冷冻干燥，并用等体积重水复溶后使用氘代盐酸调节pD至7.0(pD＝pH-0.4)。
3)猝灭缓冲液：称取100mM PBS，6M盐酸胍(Gn-HCl)，500mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)，并调节pH至2.2。
5.2建立抗原酶切肽图(如图6)
具体操作步骤如下：
1)从冰箱内取出一支CRP溶液，于冰上缓慢解冻。为去除样品溶液中的颗粒，将解冻后的样品以15000转离心5min。
2)取5μL CRP溶液于EP管中，使用移液枪加入70μL平衡缓冲液，随后加入75μL猝灭缓冲液，最后添加200μL 0.1％甲酸水溶液稀释并混匀，随后使用微量进样针吸取220μL样品进样。
3)将稀释后的样品注入到Waters液相系统中进行脱盐富集(ACQUITY UPLC BEHC18 VanGuard预柱3/Pk 1.7μm，2.1×5mm)，在线酶切(Waters ENZYMATE BEH PEPSIN2.1mm×30mm)和液相分离(ACQUITY UPLC BEH C18，1.7μm，1.0×100mm)。
液相条件为：分析柱及陷阱柱柱温0.5℃；酶切柱柱温15℃；ASM流速100μL/min，BSM流速50μL/min；A相H2O(含0.2％FA)；B相HCN(含0.1％FA)；富集时间4.0min，分离时间12.0min；ASM采用100％A相等度洗脱，BSM采用7min 5-45％B的二元超高压液相梯度。
4)使用Waters G2高分辨质谱对酶解肽段进行鉴定。
质谱条件为：全信息串联质谱(MSE)模式，使用亮氨酸脑啡肽(LE)进行实时校正。采用ESI源，正离子分辨率模式，扫描范围350-1600Da，低能碎裂(Trap碰撞池)电压4V，高能碎裂(Ramp Trap碰撞池)电压20-45V，扫描时间0.3s，运行时间12min。毛细管电压主要参数设置如下：毛细管电压3.0KV，源温100℃。
5)使用ProteinLynx Global Service 3.0.2(Waters)软件进行肽段的匹配与鉴定，将CRP的序列(P02741，切除信号肽)输入到软件中，再添加质谱数据。设置数据处理方法：处理参数使用Apex 3D设置，设置锁定质量为556.2771Da，锁定质量允许误差为0.25Da，低能阈值130个离子计数，高能阈值30个离子计数，其他参数使用默认数值。工作表参数设置中，将肽段偏差及碎片偏差均设置为100ppm，将酶切试剂定义为非特异性，其他参数使用默认数值。结合软件打分情况，对匹配肽段进行手动核对以确定最终的抗原酶解情况。
6)将确定的肽段数据导入Dynamx软件生成CRP的在线酶切肽图。
5.3氢氘交换-质谱分析
5.3.1氢氘交换反应
具体操作步骤如下：
1)从冰箱内取出一支抗原和制备好的免疫复合物，于冰上缓慢解冻。将解冻后的样品以15000转离心5min去除样品溶液中的颗粒。
2)每一抗原和免疫复合物分别制备成6份样品，每一样品中用移液枪添加5μL抗原或免疫复合物加入带有内插管的Waters液相小瓶中，再按样品瓶数量准备2倍数量的空瓶，上述的瓶子按设定顺序放置在H/D-X PAL氢氘交换机械臂的样品盘中。
3)使用Chronos软件设置氢氘交换程序，依次向样品瓶中注入70μL的平衡缓冲溶液(对照组)或重水溶液进行平衡或氢氘交换反应。设置氘交换时间为0s(对照组)，10s，1min，10min，1h和3h。
4)到达预设的交换时间后，吸取60μL反应后的样品加入到新的液相小瓶中并与等体积的猝灭缓冲液充分混合，反应0.5min后终止氢氘交换反应并对样品进行变性和二硫键的还原。
5)最后吸取40μL猝灭后的液体转移到添加有200μL稀释溶液(0.1％甲酸水溶液)的液相小瓶中进行稀释，最后吸取230μL进样。
6)按照CRP在线酶切实验相同的实验条件进行液相分离和质谱检测。
5.4数据处理
具体操作步骤如下：
1)将氢氘交换质谱实验的数据文件导入Dynamx软件，以建立的CRP在线酶切肽图为基础，计算每一条肽段的氘摄取量。
2)经过Dynamx软件的数据处理，以“蝴蝶图”及每一条肽段的氘吸收曲线的形式展示CRP及免疫复合物的氘吸收差异。将抗体结合后导致的抗原氘吸收率下降区域，确定为可能的CRP表位区域(如图7)。
3)在Pymol软件中输入代码1GNH获得CRP的结构模型，将氢氘交换的结果映射到三维模型上对表位结果进行进一步的确认。最终以序列形式和三维结构展示抗原表位识别结果(如图8)。
实施例2中的抗体为多抗，目前现有技术中对于多抗的表位研究很少。而通过实施例2的结果可以看出，本发明方法可以有效的对试剂盒内的抗体进行表位定位，可以获得试剂盒抗体在溶液状态下较为全面的表位图谱，本发明方法具有快速、灵敏、高通量、样品用量小等优势。
另外，经过反复实验证实，本发明方法不仅仅适用于全程C反应蛋白测定试剂盒抗体的表位定位，而且在其他试剂盒(如超敏C反应蛋白测定试剂盒、肌钙蛋白I化学发光测定试剂盒、超敏肌钙蛋白I测定试剂盒等)均取得了良好的识别效果，这也说明了本发明方法的技术原理是通用可行的。因针对各个试剂盒的具体实验过程与实施例2基本类似，在此不一一赘述。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)抗原及试剂盒抗体的准备：收集试剂盒内的抗体及对应的抗原；
(2)抗原纯度及聚集态分析；
(3)抗体的表面等离子体共振分析：
对CM5芯片进行活化并封闭；
用HBS-EP缓冲液作为流动相，流速10μL/min，将抗原用偶联缓冲液稀释至40μg/mL，设置偶联程序进行配体偶联；
将抗体分别用流动相梯度稀释至100、50、25、12.5、6.25μg/mL的6个浓度，流速10μL/min，时间60s，温度25℃，设置程序进行传感图采集；
(4)制备免疫复合物；将抗体稀释并与抗原混匀；置于冰上孵育；用尺寸排阻色谱对复合物的组成进行分析；调整抗体与抗原的结合比例及孵育时间，保证抗原被充分结合；将制备的免疫复合物保存在-80℃下，留待氢氘交换实验；
(5)表位分析：
溶液配制：包括样品缓冲液、重水缓冲液和猝灭缓冲液；其中，样品缓冲液为20mM PBS，pH 7.0；重水缓冲液：取平衡缓冲液冷冻干燥用重水复溶，pD 7.0；猝灭缓冲液为100mMPBS、6M盐酸胍、500mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐，pH 2.2；
建立抗原酶切肽图：将5μL抗原与70μL平衡缓冲液，75μL猝灭缓冲液，和200μL0.1％V/V甲酸水溶液混匀，取220μL样品进样；使用Waters ENZYMATE BEH PEPSIN 2.1mm×30mm柱在线酶切，使用ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard预柱3/Pk 1.7μm，2.1×5mm脱盐富集，使用ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm，1.0×100mm柱分离肽段，液相条件为：分析柱及陷阱柱柱温0.5℃；酶切柱柱温15℃；ASM流速100μL/min，BSM流速50μL/min；A相H2O，其中含0.2％FA；B相HCN，其中含0.1％FA；富集时间4.0min，分离时间12.0min；ASM采用100％A相等度洗脱，BSM采用7min 5-45％B的二元超高压液相梯度；使用Waters G2高分辨质谱对酶解肽段进行鉴定；使用ProteinLynx Global Service
3.0.2Waters软件进行肽段的匹配与鉴定；将肽段数据导入Dynamx软件生成抗原的在线酶切肽图；
氢氘交换-质谱分析：基于生成的抗原肽图对样品进行氢氘交换-质谱分析，获得表位结果；
氢氘交换-质谱分析具体为，抗原及免疫复合物在分析前以15000转离心5min去除颗粒；将每一抗原和免疫复合物分别制备成6份样品，每瓶5μL样品放置在样品盘中；使用Chronos软件设置氢氘交换程序，氘交换时间为0s、10s、1min、10min、1h和3h；
在Waters超高效液相色谱系统中完成酶切，脱盐及分离；
通过质谱同时采集高质量的肽段母离子信息及肽段碎片离子信息，进行肽段的鉴别和氘摄取量的计算；
将实验数据导入Dynamx软件，计算每一肽段的氘摄取量；将抗体结合后导致的抗原氘吸收率下降区域，确定为可能的抗原表位区域；使用Pymol软件进行表位映射，确认表位结果。
2.根据权利要求1所述的基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法，其特征在于：所述步骤(2)中，用SDS-Page电泳法检测纯度，用尺寸排阻色谱法分析聚集状态。
3.根据权利要求2所述的基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法，其特征在于：所述SDS-Page电泳法具体为，制备凝胶后固定并检漏；将抗原与上样缓冲液混合，95℃加热5min；浓缩胶80V，分离胶120V进行电泳；考马斯亮蓝染色后，用脱色液洗脱至条带清晰，使用凝胶成像系统分析条带。
4.根据权利要求3所述的基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法，其特征在于：所述尺寸排阻色谱法法具体为，配制缓冲溶液平衡Superdex 200 10/300GL色谱柱，UV基线调零；检测波长为280nm和254nm；流速0.75mL/min。
5.根据权利要求1所述的基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法，其特征在于：所述步骤(5)中，氢氘交换-质谱分析用Waters氢氘交换平台偶联Waters G2高分辨质谱进行表位定位。
CN202111402846.4A 2021-11-24 2021-11-24 一种基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法 Active CN114113278B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111402846.4A CN114113278B (zh) 2021-11-24 2021-11-24 一种基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111402846.4A CN114113278B (zh) 2021-11-24 2021-11-24 一种基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114113278A CN114113278A (zh) 2022-03-01
CN114113278B true CN114113278B (zh) 2024-08-02

Family

ID=80371776

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111402846.4A Active CN114113278B (zh) 2021-11-24 2021-11-24 一种基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114113278B (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5658739A (en) * 1994-05-10 1997-08-19 The Regents Of The University Of California Method for characterization of the fine structure of protein binding sites
JO3820B1 (ar) * 2012-05-03 2021-01-31 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية لـ fel d1وطرق لاستخدامها
US20220273779A1 (en) * 2018-11-19 2022-09-01 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Tau peptide antigens and antibodies binding thereto for the treatment of tauopathies
CN110567861B (zh) * 2019-09-09 2021-12-21 浙江普罗亭健康科技有限公司 基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Epitope mapping of antibodies in C‑reactive protein assay kits by hydrogen‑deuterium exchange mass spectrometry explains differential results across kits;Haofeng Sun 等;Analytical and Bioanalytical Chemistry;20220407;第414卷;第3875–3884页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114113278A (zh) 2022-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111896651A (zh) 一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽及其应用
CN101046479B (zh) 不含目标蛋白质人血清基体物质的制备方法
CN115902007A (zh) 测定虾与蟹中原肌球蛋白的相色谱串联质谱法
Winther et al. Immuno‐capture as ultimate sample cleanup in LC‐MS/MS determination of the early stage biomarker ProGRP
CN110045053A (zh) 一种适用于血液中苯丙胺类药物分析的QuEChERS前处理方法
CN114113278B (zh) 一种基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法
CN110618270B (zh) 一种用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法
CN104749371B (zh) 人肾母细胞瘤过度表达基因编码蛋白酶联免疫试剂盒
CN109444287B (zh) 一种甲胎蛋白的lc-ms/ms定量检测方法
CN115436640B (zh) 适于可评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽的替代基质
Zhou et al. An ultrasensitive competitive chemiluminescence immunosensor coupled flow injection cell modified by oxidized graphene-chitosan for the detection of Hg2+
CN111724857B (zh) 一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法
CN116087386A (zh) 一种人胰岛素样生长因子检测方法及试剂盒
CN111239404A (zh) 一种可以同时检测尿样本和血清样本中的视黄醇结合蛋白的检测试剂盒
CN117581103A (zh) 分析抗体的方法
KR101427146B1 (ko) 생체 분자 분석 키트 및 이를 이용한 생체 분자 분석 방법
CN114280311A (zh) 一种氨基末端b型利钠肽前体的纳米磁微粒化学发光检测试剂盒制备方法及检测应用
CN113447654B (zh) 质谱技术检测尿液中psm-e分子水平在制备用于早期诊断前列腺癌产品中的应用
CN107202850B (zh) 富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法
CN117471007B (zh) 一种血浆β-淀粉样蛋白检测方法
CN109541011A (zh) 一种基于多孔材料和质谱技术检测尿液中本周蛋白的方法
CN115343402B (zh) 游离睾酮的检测方法
CN113563479B (zh) 包虫病诊断试剂盒
US20230305019A1 (en) Microprobe-capture in-emitter elution-electrospray ionization
Khadjavi et al. A high-throughput assay for the detection of Tyr-phosphorylated proteins in urine of bladder cancer patients

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant