JP7076076B2 - シグナルペプチドを指標にした筋萎縮性側索硬化症の診断方法 - Google Patents
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Description
なお、本出願は2016年3月3日に出願された日本国特許出願2016-041054号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
ALSが見逃される(他の疾患と誤診される)と、ALSの治療の開始が遅れることに加えて、不要な治療(例えば手術や投薬等)が行われる虞がある。また、他の疾患(典型的には、運動機能に障害をきたすALS以外の疾患)をALSと誤診してしまうと、本来の疾患に対して適切な治療が行われる機会が奪われる虞がある。
例えば、特許文献1には、ALSのバイオマーカーとして尿中のプロスタグランジンD2の代謝物(tPGDM)を用いる方法について記されている。このように、ALSの診断に利用可能なバイオマーカーの同定およびその利用に関する研究が盛んに行われているものの、精度や信頼性等の課題から臨床でのルーチン検査として実用化されるまでに至ったものはない。
1405.71±2, 1406.49±2, 1409.40±2, 1410.97±2, 1418.70±2, 1426.68±2, 1437.62±2, 1445.77±2, 1451.61±2, 1456.44±2, 1458.88±2, 1466.24±2, 1468.86±2, 1472.12±2, 1476.87±2, 1482.60±2, 1493.58±2, 1495.42±2, 1496.52±2, 1497.16±2, 1498.88±2, 1502.40±2, 1505.52±2, 1508.76±2, 1510.50±2, 1516.64±2, 1521.93±2, 1529.32±2, 1530.37±2, 1533.52±2, 1539.36±2, 1544.22±2, 1553.72±2, 1555.72±2, 1560.24±2, 1566.20±2, 1567.20±2, 1567.74±2, 1575.70±2, 1578.07±2, 1580.91±2, 1589.58±2, 1592.55±2, 1597.25±2, 1608.53±2, 1609.36±2, 1610.62±2, 1616.12±2, 1629.15±2, 1639.39±2, 1640.36±2, 1646.58±2, 1655.72±2, 1657.97±2, 1659.24±2, 1660.46±2, 1662.16±2, 1679.09±2, 1682.54±2, 1683.12±2, 1687.34±2, 1688.14±2, 1691.08±2, 1691.75±2, 1694.76±2, 1695.74±2, 1700.65±2, 1702.19±2, 1705.53±2, 1708.77±2, 1712.10±2, 1714.63±2, 1715.56±2, 1719.51±2, 1721.61±2, 1726.31±2, 1737.85±2, 1739.71±2, 1743.69±2, 1761.79±2, 1769.93±2, 1774.13±2, 1775.70±2, 1786.39±2, 1788.03±2, 1790.80±2, 1796.23±2, 1797.49±2, 1800.34±2, 1801.79±2, 1804.45±2, 1810.72±2, 1812.31±2, 1813.77±2, 1817.26±2, 1818.66±2, 1819.34±2, 1819.93±2, 1821.71±2, 1822.73±2, 1829.48±2, 1831.81±2, 1832.41±2, 1836.18±2, 1837.33±2, 1840.84±2, 1849.81±2, 1854.68±2, 1858.34±2, 1864.19±2, 1866.06±2, 1875.28±2, 1876.50±2, 1878.25±2, 1890.21±2, 1891.32±2, 1893.00±2, 1904.69±2, 1911.46±2, 1913.68±2, 1916.02±2, 1919.35±2, 1927.13±2, 1931.84±2, 1934.86±2, 1935.52±2, 1936.83±2, 1937.87±2, 1941.22±2, 1944.97±2, 1948.39±2, 1952.47±2, 1957.80±2, 1962.82±2, 1969.82±2, 1972.54±2, 1975.58±2, 1976.51±2, 1977.70±2, 1979.29±2, 1988.46±2, 1991.91±2, 1995.37±2, 2009.91±2, 2011.18±2, 2013.86±2, 2023.97±2, 2027.73±2, 2030.95±2, 2032.69±2, 2039.29±2, 2043.12±2, 2045.68±2, 2051.76±2, 2055.50±2, 2059.05±2, 2062.98±2, 2065.57±2, 2066.09±2, 2074.03±2, 2075.32±2, 2079.80±2, 2083.74±2, 2084.36±2, 2085.85±2, 2089.53±2, 2092.25±2, 2092.80±2, 2097.03±2, 2099.42±2, 2111.39±2, 2113.10±2, 2115.77±2, 2120.37±2, 2126.55±2, 2137.63±2, 2139.15±2, 2140.48±2, 2143.42±2, 2146.46±2, 2149.85±2, 2151.02±2, 2160.22±2, 2161.68±2, 2167.09±2, 2167.78±2, 2168.75±2, 2173.75±2, 2177.51±2, 2179.25±2, 2184.93±2, 2185.65±2, 2186.28±2, 2190.18±2, 2191.02±2, 2192.84±2, 2196.47±2, 2199.82±2, 2201.22±2, 2204.02±2, 2207.10±2, 2211.58±2, 2216.77±2, 2218.45±2, 2219.30±2, 2220.56±2, 2222.74±2, 2226.96±2, 2228.22±2, 2231.60±2, 2239.71±2, 2244.01±2, 2251.78±2, 2254.83±2, 2256.53±2, 2261.91±2, 2266.45±2, 2268.58±2, 2274.97±2, 2276.04±2, 2278.67±2, 2281.09±2, 2285.01±2, 2289.43±2, 2290.85±2, 2292.35±2, 2295.92±2, 2296.92±2, 2301.71±2, 2302.50±2, 2303.21±2, 2305.43±2 2307.22±2, 2314.24±2, 2314.81±2, 2317.68±2, 2325.30±2, 2327.73±2, 2341.14±2, 2342.87±2, 2344.45±2, 2351.97±2, 2353.99±2, 2355.29±2, 2357.54±2, 2367.75±2, 2375.59±2, 2378.35±2, 2380.39±2, 2393.64±2, 2402.11±2, 2404.01±2, 2406.49±2, 2412.79±2, 2414.25±2, 2415.20±2, 2416.30±2, 2431.13±2, 2434.36±2, 2438.19±2, 2439.22±2, 2444.37±2, 2451.90±2, 2453.96±2, 2455.44±2, 2456.62±2, 2459.43±2, 2462.31±2, 2464.16±2, 2470.97±2, 2478.17±2, 2479.28±2, 2484.18±2, 2500.40±2, 2502.64±2, 2504.73±2, 2507.42±2, 2509.21±2, 2515.26±2, 2517.43±2, 2519.07±2, 2527.31±2, 2531.06±2, 2532.26±2, 2546.08±2, 2554.96±2, 2559.48±2, 2564.01±2, 2571.26±2, 2578.45±2, 2581.25±2, 2583.37±2, 2584.81±2, 2587.01±2, 2588.90±2, 2593.68±2, 2596.11±2, 2603.33±2, 2608.20±2, 2613.31±2, 2614.91±2, 2622.46±2, 2629.26±2, 2633.69±2, 2634.61±2, 2640.51±2, 2641.73±2, 2652.85±2, 2655.08±2, 2665.15±2, 2670.00±2, 2682.80±2, 2696.41±2, 2697.73±2, 2698.27±2, 2699.82±2, 3302.01±2, 3303.21±2, 3309.84±2, 3323.89±2, 3330.34±2, 3337.92±2, 3366.84±2, 3370.39±2, 3378.18±2, 3380.43±2, 3384.77±2;
のうちのいずれかにおいて前記健常検体のシグナルペプチドプロファイルと相違する場合に、被検体がALSに罹患もしくは発症していることに関連する(典型的には、被検体がALSに罹患もしくは発症していることを示唆する)ことを特徴とする。
かかるシグナルペプチドのプロファイルは、例えば、質量分析(マススペクトロメトリー)によって決定することが可能であり、マススペクトルとして表すことができる。或いはまた、上記シグナルペプチドのプロファイルは、シグナルペプチドの物理化学的性質または生化学的性質に基づいた他の分析手法によって決定してもよい。例えば、シグナルペプチドを二次元電気泳動した場合の電気泳動性の差に基づいて決定することが可能であり、該二次元電気泳動ゲルで確認される複数のスポットの状態として表すことができる。或いはまた、上記シグナルペプチドのプロファイルは、該シグナルペプチドに対する抗体を用いた免疫学的手法(同時に複数のタンパク質を分析可能なタンパク質マイクロアレイが好ましい)によって決定することも可能である。
なお、かかるシグナルペプチドのプロファイルは、特定の分子量の範囲内に存在する全てのシグナルペプチドに関するデータを含む必要はなく、比較対象の分子量のシグナルペプチドに関するデータが含まれていればよい。したがって、上記シグナルペプチドのプロファイルは、2又は3以上、または5以上、または10以上、または20以上、または30以上、または40以上、または50以上、または60以上、または70以上、または80以上、または90以上、または100以上のシグナルペプチドに関するデータを含む。
かかる方法は、被検体から採取した体液を検査対象とするインビトロの検査であるため、被検体(患者)自身が体液中のシグナルペプチドのプロファイルを入手可能な機関へ出向く必要がない。即ち、ここで開示するALSの検出を補助する方法は、多くの医療機関で実施可能である。
また、上記の方法によると、被検体がALSに罹患もしくは発症している可能性が、決定されたシグナルペプチドのプロファイルを総合的に解析した結果として示される。このため、上記の方法によると、ALSを診断するための信頼性の高い情報を提供することができる。
1405.71±2, 1406.49±2, 1409.40±2, 1410.97±2, 1418.70±2, 1426.68±2, 1437.62±2, 1445.77±2, 1451.61±2, 1456.44±2, 1458.88±2, 1466.24±2, 1468.86±2, 1472.12±2, 1476.87±2, 1482.60±2, 1493.58±2, 1495.42±2, 1496.52±2, 1498.88±2, 1502.40±2, 1505.52±2, 1508.76±2, 1510.50±2, 1516.64±2, 1521.93±2, 1529.32±2, 1530.37±2, 1533.52±2, 1539.36±2, 1544.22±2, 1553.72±2, 1555.72±2, 1560.24±2, 1566.20±2, 1567.20±2, 1575.70±2, 1578.07±2, 1580.91±2, 1589.58±2, 1592.55±2, 1597.25±2, 1608.53±2, 1609.36±2, 1610.62±2, 1616.12±2, 1629.15±2, 1639.39±2, 1640.36±2, 1646.58±2, 1655.72±2, 1657.97±2, 1659.24±2, 1660.46±2, 1662.16±2, 1679.09±2, 1682.54±2, 1683.12±2, 1687.34±2, 1688.14±2, 1691.08±2, 1691.75±2, 1694.76±2, 1695.74±2, 1700.65±2, 1702.19±2, 1708.77±2, 1712.10±2, 1714.63±2, 1715.56±2, 1719.51±2, 1721.61±2, 1726.31±2, 1737.85±2, 1739.71±2, 1743.69±2, 1761.79±2, 1769.93±2, 1774.13±2, 1775.70±2, 1786.39±2, 1788.03±2, 1790.80±2, 1796.23±2, 1797.49±2, 1800.34±2, 1801.79±2, 1804.45±2, 1810.72±2, 1812.3±21, 1813.77±2, 1817.26±2, 1818.66±2, 1819.93±2, 1821.71±2, 1822.73±2, 1829.48±2, 1832.41±2, 1836.18±2, 1837.33±2, 1840.84±2, 1849.81±2, 1854.68±2, 1858.34±2, 1864.19±2, 1866.06±2, 1875.28±2, 1876.50±2, 1878.25±2, 1890.21±2, 1891.32±2, 1893.00±2, 1904.69±2, 1911.46±2, 1913.68±2, 1916.02±2, 1919.35±2, 1927.13±2, 1931.84±2, 1934.86±2, 1936.83±2, 1937.87±2, 1941.22±2, 1944.97±2, 1948.39±2, 1952.47±2, 1957.80±2, 1962.82±2, 1969.82±2, 1972.54±2, 1975.58±2, 1976.51±2, 1977.70±2, 1979.29±2, 1988.46±2, 1991.91±2, 1995.37±2, 2009.91±2, 2011.18±2, 2013.86±2, 2023.97±2, 2027.73±2, 2030.95±2, 2032.69±2, 2039.29±2, 2043.12±2, 2045.68±2, 2051.76±2, 2059.05±2, 2062.98±2, 2066.09±2, 2074.03±2, 2075.32±2, 2079.80±2, 2083.74±2, 2085.85±2, 2089.53±2, 2092.80±2, 2097.03±2, 2099.42±2, 2111.39±2, 2113.10±2, 2115.77±2, 2120.37±2, 2126.55±2, 2137.63±2, 2139.15±2, 2143.42±2, 2146.46±2, 2149.85±2, 2151.02±2, 2160.22±2, 2161.68±2, 2167.09±2, 2168.75±2, 2173.75±2, 2177.51±2, 2179.25±2, 2185.65±2, 2186.28±2, 2190.18±2, 2191.02±2, 2192.84±2, 2196.47±2, 2199.82±2, 2201.22±2, 2204.02±2, 2207.10±2, 2211.58±2, 2216.77±2, 2218.45±2, 2219.30±2, 2220.56±2, 2222.74±2, 2226.96±2, 2228.22±2, 2231.60±2, 2239.71±2, 2244.01±2, 2251.78±2, 2254.83±2, 2256.53±2, 2261.91±2, 2266.45±2, 2268.58±2, 2274.97±2, 2276.04±2, 2278.67±2, 2281.09±2, 2285.01±2, 2289.43±2, 2290.85±2, 2292.35±2, 2295.92±2, 2296.92±2, 2301.71±2, 2302.50±2, 2303.21±2, 2305.43±2, 2307.22±2, 2314.24±2, 2317.68±2, 2325.30±2, 2341.14±2, 2342.87±2, 2344.45±2, 2351.97±2, 2353.99±2, 2355.29±2, 2357.54±2, 2367.75±2, 2375.59±2, 2378.35±2, 2380.39±2, 2393.64±2, 2402.11±2, 2404.01±2, 2406.49±2, 2412.79±2, 2414.25±2, 2415.20±2, 2416.30±2, 2431.13±2, 2434.36±2, 2438.19±2, 2439.22±2, 2444.37±2, 2451.90±2, 2453.96±2, 2455.44±2, 2456.62±2, 2459.43±2, 2462.31±2, 2464.16±2, 2470.97±2, 2478.17±2, 2479.28±2, 2484.18±2, 2500.40±2, 2502.64±2, 2504.73±2, 2507.42±2, 2509.21±2, 2515.26±2, 2517.43±2, 2519.07±2, 2527.31±2, 2531.06±2, 2532.26±2, 2546.08±2, 2554.96±2, 2559.48±2, 2564.01±2, 2571.26±2, 2578.45±2, 2581.25±2, 2583.37±2, 2584.81±2, 2587.01±2, 2588.90±2, 2593.68±2, 2596.11±2, 2603.33±2, 2608.20±2, 2613.31±2, 2614.91±2, 2622.46±2, 2629.26±2, 2633.69±2, 2634.61±2, 2640.51±2, 2641.73±2, 2652.85±2, 2655.08±2, 2665.15±2, 2670.00±2, 2682.80±2, 2696.41±2, 2698.27±2, 2699.82±2, 3302.01±2, 3303.21±2, 3323.89±2, 3330.34±2, 3337.92±2, 3366.84±2, 3370.39±2, 3378.18±2, 3380.43±2, 3384.77±2;
のうちのいずれかで特定されるシグナルペプチドの存在量が前記健常検体のシグナルペプチドプロファイルと比較して増大している場合に、被検体がALSに罹患もしくは発症していることに関連する(典型的には、被検体がALSに罹患もしくは発症していることを示唆する)ことを特徴とする。
1497.16±2, 1567.74±2, 1705.53±2, 1819.34±2, 1831.81±2, 1935.52±2, 2055.50±2, 2065.57±2, 2084.36±2, 2092.25±2, 2140.48±2, 2167.78±2, 2184.93±2, 2314.81±2, 2327.73±2, 2697.73±2, 3309.84±2;
のうちのいずれかで特定されるシグナルペプチドの存在量が前記健常検体のシグナルペプチドプロファイルと比較して減少している場合に、被検体がALSに罹患もしくは発症していることに関連する(典型的には、被検体がALSに罹患もしくは発症していることを示唆する)ことを特徴とする。
質量分析装置を用いることで、体液中のシグナルペプチドの網羅解析を容易かつ高精度に実施することができる。即ち、体液中のシグナルペプチドのプロファイルは、質量分析装置を使用することで、容易かつ高精度に決定することができる。
なお、特許文献2には、質量分析法を利用して癌を検出する方法について記載されているが、ALSの検出に関しては記載が無い。
従来は、熱可塑性樹脂に固定した試料に対してイオン化レーザーを照射して質量分析を行うと、上記試料とともに該試料が固定された熱可塑性樹脂もイオン化されてしまい、質量分析の精度が低下すると考えられていた。しかし、本発明者らの検討によると、熱可塑性樹脂上に分析対象の体液を固定した状態で質量分析を行うことで、シグナルペプチドのイオン化が促進され、質量分析を精度よく実施し得ることが確認された。
即ち、体液を熱可塑性樹脂上に固定し、MALDI-TOFMSを用いて分析することで、体液中にイオン化しづらいシグナルペプチドを含む場合であっても、該シグナルペプチドを含んだ状態のシグナルペプチドプロファイルを好適に決定することができる。
ここで、前記ALS関連シグナルペプチドは、ALS患者由来の体液中における該シグナルペプチドの存在の有無或いはその存在量の程度が、健常検体由来の体液中における該シグナルペプチドの存在の有無或いはその存在量の程度から設定した基準レベルと異なるシグナルペプチドである。そして、上記ALS関連シグナルペプチドは、その分子量が、
1405.71±2, 1406.49±2, 1409.40±2, 1410.97±2, 1418.70±2, 1426.68±2, 1437.62±2, 1445.77±2, 1451.61±2, 1456.44±2, 1458.88±2, 1466.24±2, 1468.86±2, 1472.12±2, 1476.87±2, 1482.60±2, 1493.58±2, 1495.42±2, 1496.52±2, 1497.16±2, 1498.88±2, 1502.40±2, 1505.52±2, 1508.76±2, 1510.50±2, 1516.64±2, 1521.93±2, 1529.32±2, 1530.37±2, 1533.52±2, 1539.36±2, 1544.22±2, 1553.72±2, 1555.72±2, 1560.24±2, 1566.20±2, 1567.20±2, 1567.74±2, 1575.70±2, 1578.07±2, 1580.91±2, 1589.58±2, 1592.55±2, 1597.25±2, 1608.53±2, 1609.36±2, 1610.62±2, 1616.12±2, 1629.15±2, 1639.39±2, 1640.36±2, 1646.58±2, 1655.72±2, 1657.97±2, 1659.24±2, 1660.46±2, 1662.16±2, 1679.09±2, 1682.54±2, 1683.12±2, 1687.34±2, 1688.14±2, 1691.08±2, 1691.75±2, 1694.76±2, 1695.74±2, 1700.65±2, 1702.19±2, 1705.53±2, 1708.77±2, 1712.10±2, 1714.63±2, 1715.56±2, 1719.51±2, 1721.61±2, 1726.31±2, 1737.85±2, 1739.71±2, 1743.69±2, 1761.79±2, 1769.93±2, 1774.13±2, 1775.70±2, 1786.39±2, 1788.03±2, 1790.80±2, 1796.23±2, 1797.49±2, 1800.34±2, 1801.79±2, 1804.45±2, 1810.72±2, 1812.31±2, 1813.77±2, 1817.26±2, 1818.66±2, 1819.34±2, 1819.93±2, 1821.71±2, 1822.73±2, 1829.48±2, 1831.81±2, 1832.41±2, 1836.18±2, 1837.33±2, 1840.84±2, 1849.81±2, 1854.68±2, 1858.34±2, 1864.19±2, 1866.06±2, 1875.28±2, 1876.50±2, 1878.25±2, 1890.21±2, 1891.32±2, 1893.00±2, 1904.69±2, 1911.46±2, 1913.68±2, 1916.02±2, 1919.35±2, 1927.13±2, 1931.84±2, 1934.86±2, 1935.52±2, 1936.83±2, 1937.87±2, 1941.22±2, 1944.97±2, 1948.39±2, 1952.47±2, 1957.80±2, 1962.82±2, 1969.82±2, 1972.54±2, 1975.58±2, 1976.51±2, 1977.70±2, 1979.29±2, 1988.46±2, 1991.91±2, 1995.37±2, 2009.91±2, 2011.18±2, 2013.86±2, 2023.97±2, 2027.73±2, 2030.95±2, 2032.69±2, 2039.29±2, 2043.12±2, 2045.68±2, 2051.76±2, 2055.50±2, 2059.05±2, 2062.98±2, 2065.57±2, 2066.09±2, 2074.03±2, 2075.32±2, 2079.80±2, 2083.74±2, 2084.36±2, 2085.85±2, 2089.53±2, 2092.25±2, 2092.80±2, 2097.03±2, 2099.42±2, 2111.39±2, 2113.10±2, 2115.77±2, 2120.37±2, 2126.55±2, 2137.63±2, 2139.15±2, 2140.48±2, 2143.42±2, 2146.46±2, 2149.85±2, 2151.02±2, 2160.22±2, 2161.68±2, 2167.09±2, 2167.78±2, 2168.75±2, 2173.75±2, 2177.51±2, 2179.25±2, 2184.93±2, 2185.65±2, 2186.28±2, 2190.18±2, 2191.02±2, 2192.84±2, 2196.47±2, 2199.82±2, 2201.22±2, 2204.02±2, 2207.10±2, 2211.58±2, 2216.77±2, 2218.45±2, 2219.30±2, 2220.56±2, 2222.74±2, 2226.96±2, 2228.22±2, 2231.60±2, 2239.71±2, 2244.01±2, 2251.78±2, 2254.83±2, 2256.53±2, 2261.91±2, 2266.45±2, 2268.58±2, 2274.97±2, 2276.04±2, 2278.67±2, 2281.09±2, 2285.01±2, 2289.43±2, 2290.85±2, 2292.35±2, 2295.92±2, 2296.92±2, 2301.71±2, 2302.50±2, 2303.21±2, 2305.43±2 2307.22±2, 2314.24±2, 2314.81±2, 2317.68±2, 2325.30±2, 2327.73±2, 2341.14±2, 2342.87±2, 2344.45±2, 2351.97±2, 2353.99±2, 2355.29±2, 2357.54±2, 2367.75±2, 2375.59±2, 2378.35±2, 2380.39±2, 2393.64±2, 2402.11±2, 2404.01±2, 2406.49±2, 2412.79±2, 2414.25±2, 2415.20±2, 2416.30±2, 2431.13±2, 2434.36±2, 2438.19±2, 2439.22±2, 2444.37±2, 2451.90±2, 2453.96±2, 2455.44±2, 2456.62±2, 2459.43±2, 2462.31±2, 2464.16±2, 2470.97±2, 2478.17±2, 2479.28±2, 2484.18±2, 2500.40±2, 2502.64±2, 2504.73±2, 2507.42±2, 2509.21±2, 2515.26±2, 2517.43±2, 2519.07±2, 2527.31±2, 2531.06±2, 2532.26±2, 2546.08±2, 2554.96±2, 2559.48±2, 2564.01±2, 2571.26±2, 2578.45±2, 2581.25±2, 2583.37±2, 2584.81±2, 2587.01±2, 2588.90±2, 2593.68±2, 2596.11±2, 2603.33±2, 2608.20±2, 2613.31±2, 2614.91±2, 2622.46±2, 2629.26±2, 2633.69±2, 2634.61±2, 2640.51±2, 2641.73±2, 2652.85±2, 2655.08±2, 2665.15±2, 2670.00±2, 2682.80±2, 2696.41±2, 2697.73±2, 2698.27±2, 2699.82±2, 3302.01±2, 3303.21±2, 3309.84±2, 3323.89±2, 3330.34±2, 3337.92±2, 3366.84±2, 3370.39±2, 3378.18±2, 3380.43±2、または、3384.77±2である。
上記方法によれば、被検体から採取した体液を検査対象とするインビトロの検査であるため、被検体(患者)自身が体液中のシグナルペプチドの存在の有無或いはその存在量の程度を検査可能な機関へ出向く必要がない。即ち、ここで開示するALSの検出を補助する方法は、多くの医療機関で実施可能である。
配列番号1~1580に示すアミノ酸配列のうちのいずれかからなるシグナルペプチドは、上記ALS関連シグナルペプチドの分子量に対応するシグナルペプチドの典型例である。即ち、上記配列番号1~1580に示すアミノ酸配列からなるシグナルペプチドは、上記ALS関連シグナルペプチドとして適する。
即ち、本発明は、他の側面として、ALSの診断に用いられるバイオマーカーを提供する。かかるバイオマーカーは、配列番号1~1580に示すアミノ酸配列のうちの何れかからなるシグナルペプチドである。
1405.71±2, 1406.49±2, 1409.40±2, 1410.97±2, 1418.70±2, 1426.68±2, 1437.62±2, 1445.77±2, 1451.61±2, 1456.44±2, 1458.88±2, 1466.24±2, 1468.86±2, 1472.12±2, 1476.87±2, 1482.60±2, 1493.58±2, 1495.42±2, 1496.52±2, 1498.88±2, 1502.40±2, 1505.52±2, 1508.76±2, 1510.50±2, 1516.64±2, 1521.93±2, 1529.32±2, 1530.37±2, 1533.52±2, 1539.36±2, 1544.22±2, 1553.72±2, 1555.72±2, 1560.24±2, 1566.20±2, 1567.20±2, 1575.70±2, 1578.07±2, 1580.91±2, 1589.58±2, 1592.55±2, 1597.25±2, 1608.53±2, 1609.36±2, 1610.62±2, 1616.12±2, 1629.15±2, 1639.39±2, 1640.36±2, 1646.58±2, 1655.72±2, 1657.97±2, 1659.24±2, 1660.46±2, 1662.16±2, 1679.09±2, 1682.54±2, 1683.12±2, 1687.34±2, 1688.14±2, 1691.08±2, 1691.75±2, 1694.76±2, 1695.74±2, 1700.65±2, 1702.19±2, 1708.77±2, 1712.10±2, 1714.63±2, 1715.56±2, 1719.51±2, 1721.61±2, 1726.31±2, 1737.85±2, 1739.71±2, 1743.69±2, 1761.79±2, 1769.93±2, 1774.13±2, 1775.70±2, 1786.39±2, 1788.03±2, 1790.80±2, 1796.23±2, 1797.49±2, 1800.34±2, 1801.79±2, 1804.45±2, 1810.72±2, 1812.3±21, 1813.77±2, 1817.26±2, 1818.66±2, 1819.93±2, 1821.71±2, 1822.73±2, 1829.48±2, 1832.41±2, 1836.18±2, 1837.33±2, 1840.84±2, 1849.81±2, 1854.68±2, 1858.34±2, 1864.19±2, 1866.06±2, 1875.28±2, 1876.50±2, 1878.25±2, 1890.21±2, 1891.32±2, 1893.00±2, 1904.69±2, 1911.46±2, 1913.68±2, 1916.02±2, 1919.35±2, 1927.13±2, 1931.84±2, 1934.86±2, 1936.83±2, 1937.87±2, 1941.22±2, 1944.97±2, 1948.39±2, 1952.47±2, 1957.80±2, 1962.82±2, 1969.82±2, 1972.54±2, 1975.58±2, 1976.51±2, 1977.70±2, 1979.29±2, 1988.46±2, 1991.91±2, 1995.37±2, 2009.91±2, 2011.18±2, 2013.86±2, 2023.97±2, 2027.73±2, 2030.95±2, 2032.69±2, 2039.29±2, 2043.12±2, 2045.68±2, 2051.76±2, 2059.05±2, 2062.98±2, 2066.09±2, 2074.03±2, 2075.32±2, 2079.80±2, 2083.74±2, 2085.85±2, 2089.53±2, 2092.80±2, 2097.03±2, 2099.42±2, 2111.39±2, 2113.10±2, 2115.77±2, 2120.37±2, 2126.55±2, 2137.63±2, 2139.15±2, 2143.42±2, 2146.46±2, 2149.85±2, 2151.02±2, 2160.22±2, 2161.68±2, 2167.09±2, 2168.75±2, 2173.75±2, 2177.51±2, 2179.25±2, 2185.65±2, 2186.28±2, 2190.18±2, 2191.02±2, 2192.84±2, 2196.47±2, 2199.82±2, 2201.22±2, 2204.02±2, 2207.10±2, 2211.58±2, 2216.77±2, 2218.45±2, 2219.30±2, 2220.56±2, 2222.74±2, 2226.96±2, 2228.22±2, 2231.60±2, 2239.71±2, 2244.01±2, 2251.78±2, 2254.83±2, 2256.53±2, 2261.91±2, 2266.45±2, 2268.58±2, 2274.97±2, 2276.04±2, 2278.67±2, 2281.09±2, 2285.01±2, 2289.43±2, 2290.85±2, 2292.35±2, 2295.92±2, 2296.92±2, 2301.71±2, 2302.50±2, 2303.21±2, 2305.43±2, 2307.22±2, 2314.24±2, 2317.68±2, 2325.30±2, 2341.14±2, 2342.87±2, 2344.45±2, 2351.97±2, 2353.99±2, 2355.29±2, 2357.54±2, 2367.75±2, 2375.59±2, 2378.35±2, 2380.39±2, 2393.64±2, 2402.11±2, 2404.01±2, 2406.49±2, 2412.79±2, 2414.25±2, 2415.20±2, 2416.30±2, 2431.13±2, 2434.36±2, 2438.19±2, 2439.22±2, 2444.37±2, 2451.90±2, 2453.96±2, 2455.44±2, 2456.62±2, 2459.43±2, 2462.31±2, 2464.16±2, 2470.97±2, 2478.17±2, 2479.28±2, 2484.18±2, 2500.40±2, 2502.64±2, 2504.73±2, 2507.42±2, 2509.21±2, 2515.26±2, 2517.43±2, 2519.07±2, 2527.31±2, 2531.06±2, 2532.26±2, 2546.08±2, 2554.96±2, 2559.48±2, 2564.01±2, 2571.26±2, 2578.45±2, 2581.25±2, 2583.37±2, 2584.81±2, 2587.01±2, 2588.90±2, 2593.68±2, 2596.11±2, 2603.33±2, 2608.20±2, 2613.31±2, 2614.91±2, 2622.46±2, 2629.26±2, 2633.69±2, 2634.61±2, 2640.51±2, 2641.73±2, 2652.85±2, 2655.08±2, 2665.15±2, 2670.00±2, 2682.80±2, 2696.41±2, 2698.27±2, 2699.82±2, 3302.01±2, 3303.21±2, 3323.89±2, 3330.34±2, 3337.92±2, 3366.84±2, 3370.39±2, 3378.18±2, 3380.43±2、または、3384.77±2
であるALS関連シグナルペプチドのいずれかについて、被検体由来の体液中の該シグナルペプチドの存在量の程度が、前記基準レベルと比較して大きいことを確認する。
好ましい一態様では、前記ALS関連シグナルペプチドのアミノ酸配列が、配列番号1~16, 21~27, 29~46, 53~67, 72~87, 94~108, 118~172, 179~243, 248~295, 297~304, 307~317, 320~333, 337~354, 359~422, 424, 425, 430~585, 587~593, 595~605, 607~693, 696, 699~777, 786~902, 906~914, 918~945, 947~983, 990~1029, 1042~1201, 1208~1217, 1230~1566, 1569~1571, 1574~1580に示すアミノ酸配列のうちの何れかである。
かかるALS関連シグナルペプチドは、ALS患者由来の体液中の存在量が基準レベルと比較して大きいことを発明者らが確認したシグナルペプチドである。このため、被検体由来の体液中の該ALS関連シグナルペプチドの存在量が基準レベルと比較して大きいことは、該被検体がALSに罹患もしくは発症していることに関連する(典型的には、被検体がALSに罹患若しくは発症していることを示唆する)。
1497.16±2, 1567.74±2, 1705.53±2, 1819.34±2, 1831.81±2, 1935.52±2, 2055.50±2, 2065.57±2, 2084.36±2, 2092.25±2, 2140.48±2, 2167.78±2, 2184.93±2, 2314.81±2, 2327.73±2, 2697.73±2、または、3309.84±2
であるALS関連シグナルペプチドのいずれかについて、被検体由来の体液中の該シグナルペプチドの存在量の程度が、健常検体由来の体液中における該シグナルペプチドの存在量の程度から設定した基準レベルと比較して小さいことを確認することを更に包含する。
好ましい一態様では、上記ALS関連シグナルペプチドのアミノ酸配列が、配列番号68, 69, 296, 357, 429, 903~905, 1223~1229, 1572, 1573に示すアミノ酸配列のうちの何れかである。
かかるALS関連シグナルペプチドは、ALS患者由来の体液中の存在量が基準レベルと比較して小さいことを発明者らが確認したシグナルペプチドである。このため、被検体由来の体液中の該ALS関連シグナルペプチドの存在量が基準レベルと比較して小さいことは、該被検体がALSに罹患もしくは発症していることに関連する(典型的には、被検体がALSに罹患若しくは発症していることを示唆する)。
特に好ましい一態様では、上記ALS関連シグナルペプチドを構成するアミノ酸配列が、配列番号1~180に示すアミノ酸配列のうちのいずれかである。
かかるALS関連シグナルペプチドは、ALS患者の体液中における該シグナルペプチドの存在の有無或いはその存在量の程度が、健常者由来の体液中における該シグナルペプチドの存在の有無或いはその存在量の程度(典型的には上記基準レベル)と比較して特に顕著に異なっていることが本発明者らによって確認されたシグナルペプチドである。このため、被検体由来の体液について、かかるALS関連シグナルペプチドが存在するか否か、或いは該存在する場合にはかかるALS関連シグナルペプチドの存在量の程度を検査することで、被検体がALSに罹患もしくは発症しているか否かを判断するために有用な信頼性の高い情報を入手することができる。
分子量が相互に異なる複数のALS関連シグナルペプチドについて検査することで、被検体がALSに罹患もしくは発症しているか否かを判断するための情報として、より信頼性(精度)の高い情報を入手することができる。
上記質量分析装置を用いることで、複数のALS関連シグナルペプチドの存在の有無およびその存在量の程度を効率よく検査することができる。
上記熱可塑性樹脂上に体液を固定し、該固定した体液中のALS関連シグナルペプチドをMALDI-TOFMSを用いて調べることで、イオン化しづらいシグナルペプチドの存在の有無およびその存在量の程度についても、高い精度で分析することができる。
脳脊髄液は夾雑物の混入が少ない。また、脳脊髄液は、脳内および脊髄内を絶えず循環しているため、神経系(典型的には中枢神経系)の環境の変化が反映されやすい。このため、脳脊髄液は、シグナルペプチドのプロファイルの検査対象、または、ALS関連シグナルペプチドの存在の有無或いはその存在量の程度を検査する対象として好適である。
熱可塑性樹脂製の支持体の上に合成ペプチドを固定することで、イオン化しづらいペプチドであっても、イオン化方法としてMALDI(マトリックス支援レーザー脱離イオン化法)を用いた質量分析(典型的にはMALDI-TOFMS)によって好適に分析(測定)することができる。このため、上記ALS検査キットは、上記ALSの検出を補助する方法としてイオン化方法にMALDI(マトリックス支援レーザー脱離イオン化法)を用いた質量分析(典型的にはMALDI-TOFMS)を用いた場合に特に好適に使用し得る。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
また、本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、構成アミノ酸残基数に応じてポリペプチド、オリゴペプチドと呼ばれるものを包含する用語である。典型的には全アミノ酸残基数が概ね50以下(好ましくは30以下、例えば20以下)のような比較的分子量の小さいものをいう。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のN末端アミノ酸及びC末端アミノ酸を包含する用語である。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がN末端側であり右側がC末端側である。
好ましくは、上記「健常検体」は運動機能に障害をきたす他の疾患(例えば、脊髄性筋萎縮症、多巣性ニューロパチー、ポリオ後症候群、多発性硬化症等)に罹患あるいは発症しておらず、より好ましくは、他の神経変性疾患(例えばアルツハイマー病、パーキンソン病等)にも罹患あるいは発症していない。
また、上記「健常検体」は、試験対象の被検体と比較して、人種、年齢、性別等の背景因子が類似していることが好ましい。
本発明者らは、第一に、体液中のシグナルペプチドに着目し、ALS患者由来の体液および健常検体由来の体液について、該体液中に存在するシグナルペプチドの網羅解析を鋭意検討しつつ行った。そして、ALS患者の体液中のシグナルペプチドのプロファイルが健常検体由来の体液中のシグナルペプチドのプロファイルと異なることに着目し、該シグナルペプチドのプロファイルの相違に基づいたALSの検出を補助する方法を完成するに至った。
(i)被検体由来の体液中に含まれるシグナルペプチドについて、分子量が1000~3500のシグナルペプチドのプロファイルを決定すること、および、
(ii)前記決定した被検体のシグナルペプチドプロファイルを、予め決定した健常検体由来の体液中のシグナルペプチドのプロファイルと比較すること、
を包含する。
1405.71±2, 1406.49±2, 1409.40±2, 1410.97±2, 1418.70±2, 1426.68±2, 1437.62±2, 1445.77±2, 1451.61±2, 1456.44±2, 1458.88±2, 1466.24±2, 1468.86±2, 1472.12±2, 1476.87±2, 1482.60±2, 1493.58±2, 1495.42±2, 1496.52±2, 1497.16±2, 1498.88±2, 1502.40±2, 1505.52±2, 1508.76±2, 1510.50±2, 1516.64±2, 1521.93±2, 1529.32±2, 1530.37±2, 1533.52±2, 1539.36±2, 1544.22±2, 1553.72±2, 1555.72±2, 1560.24±2, 1566.20±2, 1567.20±2, 1567.74±2, 1575.70±2, 1578.07±2, 1580.91±2, 1589.58±2, 1592.55±2, 1597.25±2, 1608.53±2, 1609.36±2, 1610.62±2, 1616.12±2, 1629.15±2, 1639.39±2, 1640.36±2, 1646.58±2, 1655.72±2, 1657.97±2, 1659.24±2, 1660.46±2, 1662.16±2, 1679.09±2, 1682.54±2, 1683.12±2, 1687.34±2, 1688.14±2, 1691.08±2, 1691.75±2, 1694.76±2, 1695.74±2, 1700.65±2, 1702.19±2, 1705.53±2, 1708.77±2, 1712.10±2, 1714.63±2, 1715.56±2, 1719.51±2, 1721.61±2, 1726.31±2, 1737.85±2, 1739.71±2, 1743.69±2, 1761.79±2, 1769.93±2, 1774.13±2, 1775.70±2, 1786.39±2, 1788.03±2, 1790.80±2, 1796.23±2, 1797.49±2, 1800.34±2, 1801.79±2, 1804.45±2, 1810.72±2, 1812.31±2, 1813.77±2, 1817.26±2, 1818.66±2, 1819.34±2, 1819.93±2, 1821.71±2, 1822.73±2, 1829.48±2, 1831.81±2, 1832.41±2, 1836.18±2, 1837.33±2, 1840.84±2, 1849.81±2, 1854.68±2, 1858.34±2, 1864.19±2, 1866.06±2, 1875.28±2, 1876.50±2, 1878.25±2, 1890.21±2, 1891.32±2, 1893.00±2, 1904.69±2, 1911.46±2, 1913.68±2, 1916.02±2, 1919.35±2, 1927.13±2, 1931.84±2, 1934.86±2, 1935.52±2, 1936.83±2, 1937.87±2, 1941.22±2, 1944.97±2, 1948.39±2, 1952.47±2, 1957.80±2, 1962.82±2, 1969.82±2, 1972.54±2, 1975.58±2, 1976.51±2, 1977.70±2, 1979.29±2, 1988.46±2, 1991.91±2, 1995.37±2, 2009.91±2, 2011.18±2, 2013.86±2, 2023.97±2, 2027.73±2, 2030.95±2, 2032.69±2, 2039.29±2, 2043.12±2, 2045.68±2, 2051.76±2, 2055.50±2, 2059.05±2, 2062.98±2, 2065.57±2, 2066.09±2, 2074.03±2, 2075.32±2, 2079.80±2, 2083.74±2, 2084.36±2, 2085.85±2, 2089.53±2, 2092.25±2, 2092.80±2, 2097.03±2, 2099.42±2, 2111.39±2, 2113.10±2, 2115.77±2, 2120.37±2, 2126.55±2, 2137.63±2, 2139.15±2, 2140.48±2, 2143.42±2, 2146.46±2, 2149.85±2, 2151.02±2, 2160.22±2, 2161.68±2, 2167.09±2, 2167.78±2, 2168.75±2, 2173.75±2, 2177.51±2, 2179.25±2, 2184.93±2, 2185.65±2, 2186.28±2, 2190.18±2, 2191.02±2, 2192.84±2, 2196.47±2, 2199.82±2, 2201.22±2, 2204.02±2, 2207.10±2, 2211.58±2, 2216.77±2, 2218.45±2, 2219.30±2, 2220.56±2, 2222.74±2, 2226.96±2, 2228.22±2, 2231.60±2, 2239.71±2, 2244.01±2, 2251.78±2, 2254.83±2, 2256.53±2, 2261.91±2, 2266.45±2, 2268.58±2, 2274.97±2, 2276.04±2, 2278.67±2, 2281.09±2, 2285.01±2, 2289.43±2, 2290.85±2, 2292.35±2, 2295.92±2, 2296.92±2, 2301.71±2, 2302.50±2, 2303.21±2, 2305.43±2 2307.22±2, 2314.24±2, 2314.81±2, 2317.68±2, 2325.30±2, 2327.73±2, 2341.14±2, 2342.87±2, 2344.45±2, 2351.97±2, 2353.99±2, 2355.29±2, 2357.54±2, 2367.75±2, 2375.59±2, 2378.35±2, 2380.39±2, 2393.64±2, 2402.11±2, 2404.01±2, 2406.49±2, 2412.79±2, 2414.25±2, 2415.20±2, 2416.30±2, 2431.13±2, 2434.36±2, 2438.19±2, 2439.22±2, 2444.37±2, 2451.90±2, 2453.96±2, 2455.44±2, 2456.62±2, 2459.43±2, 2462.31±2, 2464.16±2, 2470.97±2, 2478.17±2, 2479.28±2, 2484.18±2, 2500.40±2, 2502.64±2, 2504.73±2, 2507.42±2, 2509.21±2, 2515.26±2, 2517.43±2, 2519.07±2, 2527.31±2, 2531.06±2, 2532.26±2, 2546.08±2, 2554.96±2, 2559.48±2, 2564.01±2, 2571.26±2, 2578.45±2, 2581.25±2, 2583.37±2, 2584.81±2, 2587.01±2, 2588.90±2, 2593.68±2, 2596.11±2, 2603.33±2, 2608.20±2, 2613.31±2, 2614.91±2, 2622.46±2, 2629.26±2, 2633.69±2, 2634.61±2, 2640.51±2, 2641.73±2, 2652.85±2, 2655.08±2, 2665.15±2, 2670.00±2, 2682.80±2, 2696.41±2, 2697.73±2, 2698.27±2, 2699.82±2, 3302.01±2, 3303.21±2, 3309.84±2, 3323.89±2, 3330.34±2, 3337.92±2, 3366.84±2, 3370.39±2, 3378.18±2, 3380.43±2, 3384.77±2;
のうちのいずれかにおいて前記健常検体のシグナルペプチドプロファイルと相違する場合に、被検体がALSに罹患もしくは発症していることに関連する(典型的には、被検体がALSに罹患若しくは発症していることを示唆する)。
1405.71±2, 1406.49±2, 1409.40±2, 1410.97±2, 1418.70±2, 1426.68±2, 1437.62±2, 1445.77±2, 1451.61±2, 1456.44±2, 1458.88±2, 1466.24±2, 1468.86±2, 1472.12±2, 1476.87±2, 1482.60±2, 1493.58±2, 1495.42±2, 1496.52±2, 1498.88±2, 1502.40±2, 1505.52±2, 1508.76±2, 1510.50±2, 1516.64±2, 1521.93±2, 1529.32±2, 1530.37±2, 1533.52±2, 1539.36±2, 1544.22±2, 1553.72±2, 1555.72±2, 1560.24±2, 1566.20±2, 1567.20±2, 1575.70±2, 1578.07±2, 1580.91±2, 1589.58±2, 1592.55±2, 1597.25±2, 1608.53±2, 1609.36±2, 1610.62±2, 1616.12±2, 1629.15±2, 1639.39±2, 1640.36±2, 1646.58±2, 1655.72±2, 1657.97±2, 1659.24±2, 1660.46±2, 1662.16±2, 1679.09±2, 1682.54±2, 1683.12±2, 1687.34±2, 1688.14±2, 1691.08±2, 1691.75±2, 1694.76±2, 1695.74±2, 1700.65±2, 1702.19±2, 1708.77±2, 1712.10±2, 1714.63±2, 1715.56±2, 1719.51±2, 1721.61±2, 1726.31±2, 1737.85±2, 1739.71±2, 1743.69±2, 1761.79±2, 1769.93±2, 1774.13±2, 1775.70±2, 1786.39±2, 1788.03±2, 1790.80±2, 1796.23±2, 1797.49±2, 1800.34±2, 1801.79±2, 1804.45±2, 1810.72±2, 1812.3±21, 1813.77±2, 1817.26±2, 1818.66±2, 1819.93±2, 1821.71±2, 1822.73±2, 1829.48±2, 1832.41±2, 1836.18±2, 1837.33±2, 1840.84±2, 1849.81±2, 1854.68±2, 1858.34±2, 1864.19±2, 1866.06±2, 1875.28±2, 1876.50±2, 1878.25±2, 1890.21±2, 1891.32±2, 1893.00±2, 1904.69±2, 1911.46±2, 1913.68±2, 1916.02±2, 1919.35±2, 1927.13±2, 1931.84±2, 1934.86±2, 1936.83±2, 1937.87±2, 1941.22±2, 1944.97±2, 1948.39±2, 1952.47±2, 1957.80±2, 1962.82±2, 1969.82±2, 1972.54±2, 1975.58±2, 1976.51±2, 1977.70±2, 1979.29±2, 1988.46±2, 1991.91±2, 1995.37±2, 2009.91±2, 2011.18±2, 2013.86±2, 2023.97±2, 2027.73±2, 2030.95±2, 2032.69±2, 2039.29±2, 2043.12±2, 2045.68±2, 2051.76±2, 2059.05±2, 2062.98±2, 2066.09±2, 2074.03±2, 2075.32±2, 2079.80±2, 2083.74±2, 2085.85±2, 2089.53±2, 2092.80±2, 2097.03±2, 2099.42±2, 2111.39±2, 2113.10±2, 2115.77±2, 2120.37±2, 2126.55±2, 2137.63±2, 2139.15±2, 2143.42±2, 2146.46±2, 2149.85±2, 2151.02±2, 2160.22±2, 2161.68±2, 2167.09±2, 2168.75±2, 2173.75±2, 2177.51±2, 2179.25±2, 2185.65±2, 2186.28±2, 2190.18±2, 2191.02±2, 2192.84±2, 2196.47±2, 2199.82±2, 2201.22±2, 2204.02±2, 2207.10±2, 2211.58±2, 2216.77±2, 2218.45±2, 2219.30±2, 2220.56±2, 2222.74±2, 2226.96±2, 2228.22±2, 2231.60±2, 2239.71±2, 2244.01±2, 2251.78±2, 2254.83±2, 2256.53±2, 2261.91±2, 2266.45±2, 2268.58±2, 2274.97±2, 2276.04±2, 2278.67±2, 2281.09±2, 2285.01±2, 2289.43±2, 2290.85±2, 2292.35±2, 2295.92±2, 2296.92±2, 2301.71±2, 2302.50±2, 2303.21±2, 2305.43±2, 2307.22±2, 2314.24±2, 2317.68±2, 2325.30±2, 2341.14±2, 2342.87±2, 2344.45±2, 2351.97±2, 2353.99±2, 2355.29±2, 2357.54±2, 2367.75±2, 2375.59±2, 2378.35±2, 2380.39±2, 2393.64±2, 2402.11±2, 2404.01±2, 2406.49±2, 2412.79±2, 2414.25±2, 2415.20±2, 2416.30±2, 2431.13±2, 2434.36±2, 2438.19±2, 2439.22±2, 2444.37±2, 2451.90±2, 2453.96±2, 2455.44±2, 2456.62±2, 2459.43±2, 2462.31±2, 2464.16±2, 2470.97±2, 2478.17±2, 2479.28±2, 2484.18±2, 2500.40±2, 2502.64±2, 2504.73±2, 2507.42±2, 2509.21±2, 2515.26±2, 2517.43±2, 2519.07±2, 2527.31±2, 2531.06±2, 2532.26±2, 2546.08±2, 2554.96±2, 2559.48±2, 2564.01±2, 2571.26±2, 2578.45±2, 2581.25±2, 2583.37±2, 2584.81±2, 2587.01±2, 2588.90±2, 2593.68±2, 2596.11±2, 2603.33±2, 2608.20±2, 2613.31±2, 2614.91±2, 2622.46±2, 2629.26±2, 2633.69±2, 2634.61±2, 2640.51±2, 2641.73±2, 2652.85±2, 2655.08±2, 2665.15±2, 2670.00±2, 2682.80±2, 2696.41±2, 2698.27±2, 2699.82±2, 3302.01±2, 3303.21±2, 3323.89±2, 3330.34±2, 3337.92±2, 3366.84±2, 3370.39±2, 3378.18±2, 3380.43±2, 3384.77±2;
のうちのいずれかで特定されるシグナルペプチドの存在量が、健常検体のシグナルペプチドプロファイルと比較して増大する。
即ち、被検体のシグナルペプチドプロファイルにおいて、これらの分子量のうちのいずれかで特定されるシグナルペプチドの存在量が健常検体のシグナルペプチドと比較して増大していることは、該被検体がALSに罹患もしくは発症している可能性が高いことを好適に反映する。
1497.16±2, 1567.74±2, 1705.53±2, 1819.34±2, 1831.81±2, 1935.52±2, 2055.50±2, 2065.57±2, 2084.36±2, 2092.25±2, 2140.48±2, 2167.78±2, 2184.93±2, 2314.81±2, 2327.73±2, 2697.73±2, 3309.84±2;
のうちのいずれかで特定されるシグナルペプチドの存在量が、健常検体のシグナルペプチドプロファイルと比較して減少する。
即ち、被検体のシグナルペプチドプロファイルにおいて、これらの分子量のうちのいずれかで特定されるシグナルペプチドの存在量が健常検体のシグナルペプチドと比較して減少していることは、該被検体がALSに罹患もしくは発症している可能性が高いことを好適に反映する。
また、図2に、図1に示した検体Aのシグナルぺプチドのプロファイルとは別に検体Bのシグナルペプチドのプロファイルを決定し、これら2つのシグナルペプチドのプロファイルを重ねて表示した図を示す。かかる検体Aに係るシグナルペプチドのプロファイルと検体Bに係るシグナルペプチドのプロファイルとが図2に示す関係である場合、検体Aに係るシグナルペプチドのプロファイルは、分子量1000、1200、1400、1600、1700において検体Bに係るシグナルペプチドのプロファイルと相違する。具体的には、検体Aに係るシグナルペプチドのプロファイルは、分子量1000、1700で特定されるシグナルペプチドの存在量が、検体Bにかかるシグナルペプチドのプロファイルと比較して増大しており、また、検体Aに係るシグナルペプチドのプロファイルは、分子量1200、1400、1600で特定されるシグナルペプチドの存在量が、検体Bにかかるシグナルペプチドのプロファイルと比較して減少している。
分析対象の体液を質量分析法により分析することで、該体液中に存在するシグナルペプチドの質量スペクトルを(マススペクトル)得ることができる。かかるマススペクトルは、上記体液中に存在するシグナルペプチドを質量電荷比(m/z)に応じて分離した結果として得られるスペクトルであり、上記シグナルペプチドのプロファイルとして利用可能である。
例えば、複数回の質量分析において目的のシグナルペプチドの存在が確認される頻度(検出される頻度)を算出し、該頻度を当該シグナルペプチドの定量値とみなすことで、体液中に存在するシグナルペプチドの存在量を確認することができる。或いはまた、単回の質量分析により目的のシグナルペプチドを定量し得る場合であれば、複数回の質量分析により得られた結果(定量値)から算出される平均値、または中央値は、当該シグナルペプチドの定量値として好適に採用し得る。
質量分析を繰り返す回数が増えるほど上記定量精度が向上し得るため、例えば50回以上(好ましくは100回以上、より好ましくは200回以上、さらに好ましくは300回以上)の質量分析を繰り返すことが好ましい。
まず、対象の体液に対して複数回(例えば50回以上、好ましくは100回以上、より好ましくは200回以上、さらに好ましくは300回以上)イオン化レーザーを繰り返し照射する。このとき、各レーザー照射毎に質量分析(好ましくはTOFMS)を行い、目的の分子量の分子(即ち、目的の分子量のシグナルペプチド)が存在するか(検出されるか)否かを確認する。そして、上記複数回のMALDIMSにおいて目的の分子量の分子の存在が確認される頻度(検出される頻度)を算出し、該頻度を目的のシグナルペプチドの存在量とみなすことで、当該目的のシグナルペプチドの存在量を確認し得る。
上記抗体(一次抗体または二次抗体)の標識物質としては、ELISA等の免疫化学的手法による診断分野において当業者が通常用いる標識化合物を使用することができる。例えば、3H、14C、131I、99mTc等の放射性同位元素;β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等の酵素;フルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネート等の蛍光物質;ルシフェリン、ルミノール誘導体、イソルミノール誘導体等の発光物質;等が挙げられる。
これらの標識物質を使用した抗体の標識は、従来公知の方法で行えばよく、本発明を特徴付ける手法でもないため、詳細な説明は省略する。
これらの抗体は、従来公知の方法により作製すればよく、本発明を特徴付ける手法でもないため、詳細な説明は省略する。
なお、本発明の他の側面としては、目的のシグナルペプチドを検出可能な抗体を含む組成物、キット、或いはタンパク質アレイ(典型的にはタンパク質マイクロアレイ)等が提供される。
なお、上記健常検体由来の体液中のシグナルペプチドのプロファイルは、被検体のシグナルペプチドのプロファイルと同様の手法で決定されたものであることが好ましい。
上記健常検体のシグナルペプチドプロファイルとの相違がALSに罹患もしくは発症していることを示す上記特定の分子量であって、上記被検体のシグナルペプチドプロファイルと上記健常検体のシグナルペプチドプロファイルとの比較において比べられる分子量の個数が多いほど、被検体がALSに罹患もしくは発症している可能性(典型的には該可能性の増加あるいは減少)をより高い信頼性で(高精度で)示す情報を入手することができる。即ち、上記健常検体由来の体液中のシグナルペプチドのプロファイルとの相違がALSに罹患もしくは発症していることを示す上記特定の分子量のうちの2個または3個以上(より好ましくは10個以上、より好ましくは20個以上)について、上記被検体のシグナルペプチドプロファイルと健常検体のシグナルペプチドプロファイルとを比較することが好ましい。
即ち、被検体がALSに罹患もしくは発症している可能性(典型的には該可能性の増加)をより高い信頼性で(高精度で)示す情報を入手する観点からは、上記被検体のシグナルペプチドプロファイルと上記健常検体のシグナルペプチドプロファイルとの比較において比べられる上記特定の分子量のうちの、60%以上(好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは95%以上)において、被検体のシグナルペプチドプロファイルと健常検体のシグナルペプチドプロファイルとで相違することを確認することが好ましい。
本発明者らは、ALS患者由来の体液中に含まれるシグナルペプチドのプロファイルと、健常検体由来の体液中に含まれるシグナルペプチドのプロファイルとをより詳細に比較、検討した。そして、ALS患者由来の体液と健常検体由来の体液とでは、特定のシグナルペプチド(即ち、上記ALS関連シグナルペプチド)の存在の有無およびその存在量の程度が異なることを見出した。そして、該特定のシグナルペプチド(即ち、上記ALS関連シグナルペプチド)を指標にしたALSの検出を補助する方法を完成するに至った。
(i)被検体由来の体液中において、ALS関連シグナルペプチドが1種または2種以上存在しているか否か、或いは、該ALS関連シグナルペプチドが存在している場合にはその存在量の程度を検査すること、を包含する。
1405.71±2, 1406.49±2, 1409.40±2, 1410.97±2, 1418.70±2, 1426.68±2, 1437.62±2, 1445.77±2, 1451.61±2, 1456.44±2, 1458.88±2, 1466.24±2, 1468.86±2, 1472.12±2, 1476.87±2, 1482.60±2, 1493.58±2, 1495.42±2, 1496.52±2, 1497.16±2, 1498.88±2, 1502.40±2, 1505.52±2, 1508.76±2, 1510.50±2, 1516.64±2, 1521.93±2, 1529.32±2, 1530.37±2, 1533.52±2, 1539.36±2, 1544.22±2, 1553.72±2, 1555.72±2, 1560.24±2, 1566.20±2, 1567.20±2, 1567.74±2, 1575.70±2, 1578.07±2, 1580.91±2, 1589.58±2, 1592.55±2, 1597.25±2, 1608.53±2, 1609.36±2, 1610.62±2, 1616.12±2, 1629.15±2, 1639.39±2, 1640.36±2, 1646.58±2, 1655.72±2, 1657.97±2, 1659.24±2, 1660.46±2, 1662.16±2, 1679.09±2, 1682.54±2, 1683.12±2, 1687.34±2, 1688.14±2, 1691.08±2, 1691.75±2, 1694.76±2, 1695.74±2, 1700.65±2, 1702.19±2, 1705.53±2, 1708.77±2, 1712.10±2, 1714.63±2, 1715.56±2, 1719.51±2, 1721.61±2, 1726.31±2, 1737.85±2, 1739.71±2, 1743.69±2, 1761.79±2, 1769.93±2, 1774.13±2, 1775.70±2, 1786.39±2, 1788.03±2, 1790.80±2, 1796.23±2, 1797.49±2, 1800.34±2, 1801.79±2, 1804.45±2, 1810.72±2, 1812.31±2, 1813.77±2, 1817.26±2, 1818.66±2, 1819.34±2, 1819.93±2, 1821.71±2, 1822.73±2, 1829.48±2, 1831.81±2, 1832.41±2, 1836.18±2, 1837.33±2, 1840.84±2, 1849.81±2, 1854.68±2, 1858.34±2, 1864.19±2, 1866.06±2, 1875.28±2, 1876.50±2, 1878.25±2, 1890.21±2, 1891.32±2, 1893.00±2, 1904.69±2, 1911.46±2, 1913.68±2, 1916.02±2, 1919.35±2, 1927.13±2, 1931.84±2, 1934.86±2, 1935.52±2, 1936.83±2, 1937.87±2, 1941.22±2, 1944.97±2, 1948.39±2, 1952.47±2, 1957.80±2, 1962.82±2, 1969.82±2, 1972.54±2, 1975.58±2, 1976.51±2, 1977.70±2, 1979.29±2, 1988.46±2, 1991.91±2, 1995.37±2, 2009.91±2, 2011.18±2, 2013.86±2, 2023.97±2, 2027.73±2, 2030.95±2, 2032.69±2, 2039.29±2, 2043.12±2, 2045.68±2, 2051.76±2, 2055.50±2, 2059.05±2, 2062.98±2, 2065.57±2, 2066.09±2, 2074.03±2, 2075.32±2, 2079.80±2, 2083.74±2, 2084.36±2, 2085.85±2, 2089.53±2, 2092.25±2, 2092.80±2, 2097.03±2, 2099.42±2, 2111.39±2, 2113.10±2, 2115.77±2, 2120.37±2, 2126.55±2, 2137.63±2, 2139.15±2, 2140.48±2, 2143.42±2, 2146.46±2, 2149.85±2, 2151.02±2, 2160.22±2, 2161.68±2, 2167.09±2, 2167.78±2, 2168.75±2, 2173.75±2, 2177.51±2, 2179.25±2, 2184.93±2, 2185.65±2, 2186.28±2, 2190.18±2, 2191.02±2, 2192.84±2, 2196.47±2, 2199.82±2, 2201.22±2, 2204.02±2, 2207.10±2, 2211.58±2, 2216.77±2, 2218.45±2, 2219.30±2, 2220.56±2, 2222.74±2, 2226.96±2, 2228.22±2, 2231.60±2, 2239.71±2, 2244.01±2, 2251.78±2, 2254.83±2, 2256.53±2, 2261.91±2, 2266.45±2, 2268.58±2, 2274.97±2, 2276.04±2, 2278.67±2, 2281.09±2, 2285.01±2, 2289.43±2, 2290.85±2, 2292.35±2, 2295.92±2, 2296.92±2, 2301.71±2, 2302.50±2, 2303.21±2, 2305.43±2 2307.22±2, 2314.24±2, 2314.81±2, 2317.68±2, 2325.30±2, 2327.73±2, 2341.14±2, 2342.87±2, 2344.45±2, 2351.97±2, 2353.99±2, 2355.29±2, 2357.54±2, 2367.75±2, 2375.59±2, 2378.35±2, 2380.39±2, 2393.64±2, 2402.11±2, 2404.01±2, 2406.49±2, 2412.79±2, 2414.25±2, 2415.20±2, 2416.30±2, 2431.13±2, 2434.36±2, 2438.19±2, 2439.22±2, 2444.37±2, 2451.90±2, 2453.96±2, 2455.44±2, 2456.62±2, 2459.43±2, 2462.31±2, 2464.16±2, 2470.97±2, 2478.17±2, 2479.28±2, 2484.18±2, 2500.40±2, 2502.64±2, 2504.73±2, 2507.42±2, 2509.21±2, 2515.26±2, 2517.43±2, 2519.07±2, 2527.31±2, 2531.06±2, 2532.26±2, 2546.08±2, 2554.96±2, 2559.48±2, 2564.01±2, 2571.26±2, 2578.45±2, 2581.25±2, 2583.37±2, 2584.81±2, 2587.01±2, 2588.90±2, 2593.68±2, 2596.11±2, 2603.33±2, 2608.20±2, 2613.31±2, 2614.91±2, 2622.46±2, 2629.26±2, 2633.69±2, 2634.61±2, 2640.51±2, 2641.73±2, 2652.85±2, 2655.08±2, 2665.15±2, 2670.00±2, 2682.80±2, 2696.41±2, 2697.73±2, 2698.27±2, 2699.82±2, 3302.01±2, 3303.21±2, 3309.84±2, 3323.89±2, 3330.34±2, 3337.92±2, 3366.84±2, 3370.39±2, 3378.18±2, 3380.43±2、または、3384.77±2である。
これらの分子量で特定されるシグナルペプチドは、ALS患者由来の体液中における該シグナルペプチドの存在の有無或いはその存在量の程度が、健常検体由来の体液中における該シグナルペプチドの存在の有無あるいはその存在量の程度から設定した基準レベルと異なることが、本発明者らによって確認されたシグナルペプチドである。
なお、健常検体から採取した体液の検査方法は、被検体由来の体液についてALS関連シグナルペプチドの存在の有無或いはその存在量の程度を検査する場合と同様の方法により行うことが好ましい。
例えば、ROC曲線(Receiver Operatorating Characteristic curve、受信者動作特性曲線)を利用して設定することができる。ROC曲線は、縦軸にALSの検出感度を、横軸に擬陽性率(すなわち"1-特異度")を示すグラフである。上記カットオフ値を設定するために目的のシグナルペプチドの存在量について適宜基準値を設定し、該基準値を連続的に変化させたときの感度と擬陽性率の変化をプロットすることによって、ROC曲線を得ることができる。そして、得られたROC曲線に基づいて、所望の感度および特異度を期待できる値をカットオフ値として設定すればよい。
ここで、「感度」とは、ALS患者群において、シグナルペプチドの存在量を所定の値(上記基準値)に設定したときに該ALS患者群が陽性と判断される確率(真陽性率)をいい、上記「特異度」とは、健常者群において、シグナルペプチドの存在量を所定の値(上記基準値)に設定したときに該健常者群が陰性と判断される確率(真陰性率)をいう。
或いはまた、健常者群或いはALS患者群におけるシグナルペプチドの存在量の5パーセンタイル値(好ましくは1パーセンタイル値)あるいは95パーセンタイル値(99パーセンタイル値)をカットオフ値に設定してもよい。
即ち、ここで開示されるALSの検出を補助する方法の好適な一態様では、上記被検体由来の体液を検査した結果(即ち、被検体由来の体液中に、ALS関連シグナルペプチドが1種または2種以上存在するか否か、或いは、該ALS関連シグナルペプチドが存在する場合にはその存在量の程度)を、対応するALS関連シグナルペプチドの基準レベルと比較することをさらに含む。
即ち、被検体がALSに罹患もしくは発症している可能性(典型的には該可能性の増加)を示す信頼性の高い(精度の高い)情報を入手する観点からは、検査されたALS関連シグナルペプチドのうちの60%以上(好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは95%以上)が、該シグナルペプチドの基準レベルと異なることを確認することが好ましい。
即ち、被検体がALSに罹患もしくは発症していない可能性(典型的には、被検体がALSに罹患若しくは発症している可能性の減少)を示す信頼性の高い(精度の高い)情報を入手する観点からは、検査されたALS関連シグナルペプチドのうちの60%以上(好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは95%以上)が、該シグナルペプチドの基準レベル内であることを確認することが好ましい。
かかるALS関連シグナルペプチドは、ALS患者由来の体液中の該シグナルペプチドの存在の有無或いはその存在量の程度が、上記基準レベルと比較して特に顕著に異なることが本発明者らによって確認されたALS関連シグナルぺプチドである。従って、被検体由来の体液について、かかるALS関連シグナルペプチドのうちの少なくとも1種(好ましくは2種または3種以上、より好ましくは5種以上、さらに好ましくは10種以上)が存在するか否か、或いは存在する場合には存在量を検査することで、ここで開示されるALSの検出を補助する方法で得られる情報(即ち、被検体がALSに罹患もしくは発症していることに関連する情報、典型的には、被検体がALSに罹患若しくは発症していることを示唆する情報、例えば被検体がALSに罹患もしくは発症している可能性に関する情報)の信頼性(典型的には精度)を向上することができる。
1405.71±2, 1406.49±2, 1409.40±2, 1410.97±2, 1418.70±2, 1426.68±2, 1437.62±2, 1445.77±2, 1451.61±2, 1456.44±2, 1458.88±2, 1466.24±2, 1468.86±2, 1472.12±2, 1476.87±2, 1482.60±2, 1493.58±2, 1495.42±2, 1496.52±2, 1498.88±2, 1502.40±2, 1505.52±2, 1508.76±2, 1510.50±2, 1516.64±2, 1521.93±2, 1529.32±2, 1530.37±2, 1533.52±2, 1539.36±2, 1544.22±2, 1553.72±2, 1555.72±2, 1560.24±2, 1566.20±2, 1567.20±2, 1575.70±2, 1578.07±2, 1580.91±2, 1589.58±2, 1592.55±2, 1597.25±2, 1608.53±2, 1609.36±2, 1610.62±2, 1616.12±2, 1629.15±2, 1639.39±2, 1640.36±2, 1646.58±2, 1655.72±2, 1657.97±2, 1659.24±2, 1660.46±2, 1662.16±2, 1679.09±2, 1682.54±2, 1683.12±2, 1687.34±2, 1688.14±2, 1691.08±2, 1691.75±2, 1694.76±2, 1695.74±2, 1700.65±2, 1702.19±2, 1708.77±2, 1712.10±2, 1714.63±2, 1715.56±2, 1719.51±2, 1721.61±2, 1726.31±2, 1737.85±2, 1739.71±2, 1743.69±2, 1761.79±2, 1769.93±2, 1774.13±2, 1775.70±2, 1786.39±2, 1788.03±2, 1790.80±2, 1796.23±2, 1797.49±2, 1800.34±2, 1801.79±2, 1804.45±2, 1810.72±2, 1812.3±21, 1813.77±2, 1817.26±2, 1818.66±2, 1819.93±2, 1821.71±2, 1822.73±2, 1829.48±2, 1832.41±2, 1836.18±2, 1837.33±2, 1840.84±2, 1849.81±2, 1854.68±2, 1858.34±2, 1864.19±2, 1866.06±2, 1875.28±2, 1876.50±2, 1878.25±2, 1890.21±2, 1891.32±2, 1893.00±2, 1904.69±2, 1911.46±2, 1913.68±2, 1916.02±2, 1919.35±2, 1927.13±2, 1931.84±2, 1934.86±2, 1936.83±2, 1937.87±2, 1941.22±2, 1944.97±2, 1948.39±2, 1952.47±2, 1957.80±2, 1962.82±2, 1969.82±2, 1972.54±2, 1975.58±2, 1976.51±2, 1977.70±2, 1979.29±2, 1988.46±2, 1991.91±2, 1995.37±2, 2009.91±2, 2011.18±2, 2013.86±2, 2023.97±2, 2027.73±2, 2030.95±2, 2032.69±2, 2039.29±2, 2043.12±2, 2045.68±2, 2051.76±2, 2059.05±2, 2062.98±2, 2066.09±2, 2074.03±2, 2075.32±2, 2079.80±2, 2083.74±2, 2085.85±2, 2089.53±2, 2092.80±2, 2097.03±2, 2099.42±2, 2111.39±2, 2113.10±2, 2115.77±2, 2120.37±2, 2126.55±2, 2137.63±2, 2139.15±2, 2143.42±2, 2146.46±2, 2149.85±2, 2151.02±2, 2160.22±2, 2161.68±2, 2167.09±2, 2168.75±2, 2173.75±2, 2177.51±2, 2179.25±2, 2185.65±2, 2186.28±2, 2190.18±2, 2191.02±2, 2192.84±2, 2196.47±2, 2199.82±2, 2201.22±2, 2204.02±2, 2207.10±2, 2211.58±2, 2216.77±2, 2218.45±2, 2219.30±2, 2220.56±2, 2222.74±2, 2226.96±2, 2228.22±2, 2231.60±2, 2239.71±2, 2244.01±2, 2251.78±2, 2254.83±2, 2256.53±2, 2261.91±2, 2266.45±2, 2268.58±2, 2274.97±2, 2276.04±2, 2278.67±2, 2281.09±2, 2285.01±2, 2289.43±2, 2290.85±2, 2292.35±2, 2295.92±2, 2296.92±2, 2301.71±2, 2302.50±2, 2303.21±2, 2305.43±2, 2307.22±2, 2314.24±2, 2317.68±2, 2325.30±2, 2341.14±2, 2342.87±2, 2344.45±2, 2351.97±2, 2353.99±2, 2355.29±2, 2357.54±2, 2367.75±2, 2375.59±2, 2378.35±2, 2380.39±2, 2393.64±2, 2402.11±2, 2404.01±2, 2406.49±2, 2412.79±2, 2414.25±2, 2415.20±2, 2416.30±2, 2431.13±2, 2434.36±2, 2438.19±2, 2439.22±2, 2444.37±2, 2451.90±2, 2453.96±2, 2455.44±2, 2456.62±2, 2459.43±2, 2462.31±2, 2464.16±2, 2470.97±2, 2478.17±2, 2479.28±2, 2484.18±2, 2500.40±2, 2502.64±2, 2504.73±2, 2507.42±2, 2509.21±2, 2515.26±2, 2517.43±2, 2519.07±2, 2527.31±2, 2531.06±2, 2532.26±2, 2546.08±2, 2554.96±2, 2559.48±2, 2564.01±2, 2571.26±2, 2578.45±2, 2581.25±2, 2583.37±2, 2584.81±2, 2587.01±2, 2588.90±2, 2593.68±2, 2596.11±2, 2603.33±2, 2608.20±2, 2613.31±2, 2614.91±2, 2622.46±2, 2629.26±2, 2633.69±2, 2634.61±2, 2640.51±2, 2641.73±2, 2652.85±2, 2655.08±2, 2665.15±2, 2670.00±2, 2682.80±2, 2696.41±2, 2698.27±2, 2699.82±2, 3302.01±2, 3303.21±2, 3323.89±2, 3330.34±2, 3337.92±2, 3366.84±2, 3370.39±2, 3378.18±2, 3380.43±2、または、3384.77±2で特定されるALS関連シグナルペプチドである。
1497.16±2, 1567.74±2, 1705.53±2, 1819.34±2, 1831.81±2, 1935.52±2, 2055.50±2, 2065.57±2, 2084.36±2, 2092.25±2, 2140.48±2, 2167.78±2, 2184.93±2, 2314.81±2, 2327.73±2, 2697.73±2、または、3309.84±2で特定されるALS関連シグナルペプチドである。
一方で、上記被検体がALSに罹患もしくは発症していない可能性が高いことを確認する場合には、被検体由来の体液について、上記ALSネガティブシグナルペプチドの存在量の程度(或いは該ALSネガティブシグナルペプチドが被検体由来の体液中に存在するか否か)を検査することが好ましい。
或いはまた、上記体液は、被検体から採取した生体試料から予めシグナルペプチドを単離する(該シグナルペプチドの存在量を増大させる)前処理が施されたものであってもよい。
ALS患者由来の体液中の存在量の程度(或いは存在の有無)と健常者由来の体液中の存在量の程度(或いは存在の有無)とが有意に異なるシグナルペプチドであって、該シグナルペプチドの存在量の程度を指標にすることでALSの検出(診断)を可能にするシグナルペプチドは、ALSの診断に用いられるバイオマーカー(以下、ALSバイオマーカーともいう)として利用することができる。
ここで、本明細書において「有意に異なる」ことは、統計学的有意差検定における有意水準を5%として評価し得る。即ち、統計学的有意差検定によって得られるp値がp<0.05である場合、有意に異なると判断することができる。なお、上記統計学的有意差検定としては、t検定(例えばStudent's t-test)やU検定(Mann-Whitney's U test)といった従来公知の検定方法を特に制限なく適用し得る。
即ち、本発明によって提供されるALSバイオマーカーの典型例は、配列番号1~1580に示すアミノ酸配列のうちの何れかからなるシグナルペプチドである。
また、上記ALSネガティブシグナルペプチド(典型的には、配列番号68, 69, 296, 357, 429, 903~905, 1223~1229, 1572, 1573に示すアミノ酸配列のいずれかから成るシグナルペプチド)は、該シグナルペプチドの存在量の減少がALSに罹患もしくは発症していることに関連する(典型的には、ALSに罹患もしくは発症していることを示唆する、例えばALSに罹患若しくは発症している可能性の増大を示す)バイオマーカー(以下、ネガティブバイオマーカーともいう)として好適に利用し得る。
かかる合成マーカーペプチドは、ALSの検出を補助する方法において、比較対照(典型的には、陽性対照:ポジティブコントロール)、或いは、標準物質(典型的には、内部標準物質、または、外部標準物質)として好適に利用することができる。或いはまた、かかる合成マーカーペプチドは、ALSの検出を補助する方法において使用する機器を校正する目的にも好適に使用し得る。
なお、以下、上記ポジティブバイオマーカーを構成するアミノ酸配列のうちのいずれかからなる合成マーカーペプチドを「合成陽性マーカーペプチド」ともいう。また、上記ネガティブバイオマーカーを構成するアミノ酸配列のうちのいずれかからなる合成マーカーペプチドを「合成陰性マーカーペプチド」ともいうこととする。
かかるペプチドセットは、ALSの検出を補助する方法にとして、同時に複数のシグナルペプチドに着目する場合(或いは、シグナルペプチドのプロファイルについて、同時に複数の分子量に着目する場合)に好適に利用することができる。
また、上記ペプチドセットは、分子量が1502.40±2, 1521.93±2, 1629.15±2, 1682.54±2, 1691.75±2, 1705.53±2, 1821.71±2, 1836.18±2, 1948.39±2, 2011.18±2, 2092.80±2, 2099.42±2, 2177.51±2, 2179.25±2, 2186.28±2, 2211.58±2, 2226.96±2, 2254.83±2, 2278.67±2, 2290.85±2, 2292.35±2, 2502.64±2, 2640.51±2, 2698.27±2、または、3330.34±2であるALS関連シグナルペプチド(即ちALSバイオマーカー)に対応する合成マーカーペプチド(典型的には、配列番号1~180に示すアミノ酸配列の何れかからなる合成マーカーペプチド)から選択されるペプチドセットであり得る。
或いはまた、上記ペプチドセットは、分子量が特定の範囲内のALS関連シグナルペプチド(即ちALSバイオマーカー)に対応する合成マーカーペプチドから選択されるペプチドセットであり得る。例えば、分子量が1000以上2000未満、2000以上2500未満、2500以上3000未満、または3000以上3500未満のALS関連シグナルペプチド(即ちALSバイオマーカー)に対応する合成マーカーペプチドから選択されるペプチドセットであり得る。
ここで開示される合成マーカーペプチドは、市販のペプチド合成機(例えば、Intavis AG社、Protein Technologies社等から入手可能である。)を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾(C末端アミド化等)部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞(例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞)に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞(分泌された場合は培地中)からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的の合成マーカーペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型DNA(即ち合成マーカーペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片)を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物(ATP、RNAポリメラーゼ、アミノ酸類等)を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット(例えば、日本の(株)セルフリーサイエンスから入手可能なPROTEIOS(商標)Wheat germ cell-free protein synthesis kit)が市販されている。
こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、合成マーカーペプチド生産のための組換え遺伝子(発現カセット)を構築するための材料として使用することができる。
本発明によって提供されるALS検査組成物は、上記合成マーカーペプチドの少なくとも1つを含む。かかる組成物は、例えば、ALSの検出を補助する方法において、比較対照(典型的には、陽性対照:ポジティブコントロール)或いは、標準物質として利用することができる。換言すると、本発明によって、ALSの検出を補助する方法における比較対照用組成物(典型的には、ポジティブコントロール用組成物)或いは、標準物質用組成物が提供される。
なお、ここで開示されるALS検査組成物は、2つまたは3つ以上の上記合成マーカーペプチドを含むものであり得る。即ち、かかるALS検査組成物は、上述した合成マーカーペプチドセットを含むものであり得る。
例えば、生理食塩水や薬学的に許容できる各種の緩衝液を溶媒、即ちキャリア(担体)として含ませることができる。典型的には、水、生理学的緩衝液(例えばリン酸緩衝生理食塩水(PBS))、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール(エタノール等)水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。或いはまた各種糖質(デキストリン、乳糖等)のような賦形剤を含ませることができる。その他、従来の診断薬剤やペプチド製剤と同様、防腐剤、安定化剤、pH調整剤等の薬剤、或いは、々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等を添加してもよい。
ALS検査組成物の態様に関して特に限定はない。例えば、典型的な態様として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液(例えばPBS)等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、合成マーカーペプチド(主成分)及び種々の担体(副成分)を材料にして種々の態様の薬剤(組成物)を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修,Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
本発明によって、ALSの検出を補助する方法に用いられるALS検査キットが提供される。かかる検査キットは、上記合成マーカーペプチドの少なくとも1つを備える。
或いはまた、かかるALS検査キットは、2つまたは3つ以上の上記合成マーカーペプチドを備えるものであり得る。即ち、かかるALS検査キットは、上述した合成マーカーペプチドセットを備えるものであり得る。
例えば、合成マーカーペプチドが予め基材に固定(担持)されたものを含むキットであり得る。或いは、キットに基材と上記合成マーカーペプチドとを別個に装備しておき、使用時に該合成マーカーペプチドを当該基材に担持(固定化)させてもよい。
なお、測定対象の体液(即ち被検体由来の体液)は、上記合成マーカーペプチドが固定された基材と同一、または異なる基材のいずれに固定してもよく、検査方法に応じて選択すればよい。
上記上記合成マーカーペプチド又は体液を固定(保持)する面が熱可塑性樹脂製である基材(好ましくは、熱可塑性樹脂製の基材)を備えたキットは、MALDI MSを用いた検査方法(ALSの検出を補助する方法)に好適に使用し得る。このとき、かかる基材の形状は薄膜(フィルム、シート)、プレート、メンブレン、スティック、チップ等が好ましい。また、かかる基材へのペプチドの担持は、該熱可塑性樹脂を加熱により溶融することにより行い得る。
換言すると、本発明によって、薄膜状あるいは板状の基材上に上記合成マーカーペプチドのうちのすくなくとも1つが固定(担持)されたALS検査チップであって、上記基材の合成マーカーペプチドの担持面が熱可塑性樹脂製のALS検査チップが提供される。
健常者群およびALS患者群から得られた各体液について、該体液中に含まれるシグナルペプチドのプロファイルを決定した。本実施例では、体液中のシグナルペプチドのプロファイルは、MALDI TOFMSを用いた網羅解析により決定した。具体的な手順を以下に示す。
まず、脳脊髄液試料と、マトリックス液とを、1:1の体積比で混合した。上記マトリックス液としては、マトリックスとしてのシナピン酸(CHCA)が0.1体積%のトリフルオロ酢酸を含む50体積%のアセトニトリル水溶液(0.1%TFA/50%ACN水溶液)中に5mg/mLの濃度で含まれるものを用いた。
そして、上記マトリックス液と脳脊髄液試料とを混合したマトリックス混合脳脊髄液試料を2μL基材上に滴下し、該マトリックス混合脊髄液試料を真空乾燥した。基材としては、MALDI MSにおいて通常使用される測定用プレート上に、EVAフィルムを貼りつけたものを使用した。即ち、本実施例において体液を固定する基材は、体液が固定される面が熱可塑性樹脂製である。
質量分析装置(MALDI-TOFMS)としては、島津製作所社製のAXIMA(登録商標) Performanceを用いた。測定条件は、レーザー光源:N2封入型レーザー(λ=337.1nm)、加速電圧:+20kV、遅延引き出し:m/z2200に最適化、飛行モード:Linerモードに設定した。このとき、キャリブラント(キャリブレーション用スタンダード)としては、Antiotensin II (m/z 1046.54)、ACTH fragment 18-39 (m/z 2465.20)、Insulin (m/z5730.61)を用い、外部標準法により測定機器の校正を行った。そして、各脳脊髄液試料に対して、200回のレーザー照射を行い、単回のレーザー照射毎にマススペクトルを得た。
上記レーザー照射毎に個別に得られたマススペクトルを積算平均化して各脳脊髄液試料の代表マススペクトルとした。
また、上記200回のレーザー照射により個別に得られた各マススペクトルを比較し、かかる200個のマススペクトルにおいて各ピークが検出される回数を積算し、該積算値をピーク値(Peak Value)とした。即ち、上記200回のレーザー照射により個別に得られた200個のマススペクトルにおいて、m/z1000のピークが100回検出された場合、該ピークのピーク値は100である。
また、上記得られたピーク値は、対象の脳脊髄液試料中における、該ピークのm/zに対応する分子量のシグナルペプチドの存在量の程度を反映している。即ち、これらピーク値に関するデータの集合は、脳脊髄液中のシグナルペプチドのプロファイルを定量的に示す。従って、ここで開示する方法によって、体液中(脳脊髄液中)に存在するシグナルペプチドのプロファイルをピーク値に関するデータの集合として決定することができる。
そして、上記実施例1で得られた各ピークのピーク値について、ALS患者群と健常者群との間でそれぞれ統計学的有意差検定を行った。ここでは、上記統計学的有意差検定として、U検定(Mann-Whitney's U test)を採用し、両側検定(twe-tail test
)を行った。かかる有意差検定では、有意水準を5%(即ち、P値がP<0.05の場合に有意差有り)とした。
その結果、ALS患者群と健常者群との間で、327個のピークについて有意差が認められた。結果を表2~9に示す。
また、上記の結果は、上記ALS患者群と健常者群でピーク値が有意に異なる327個のピークのm/zに対応する分子量のシグナルペプチド(即ちALS関連シグナルペプチド)は、体液中における該シグナルペプチドの存在量の程度を指標にすることで、ALS患者と健常者とを判別可能なシグナルペプチド(即ち、ALSバイオマーカー)であることを示している。
また、これらの結果から、被検体から採取した体液について、これら327個のピークのm/zに対応する分子量のシグナルペプチドのうちのいずれかの存在量の程度を検査し、健常者由来の体液における該シグナルペプチドの存在量の程度と比較することで、該被検体がALSに罹患もしくは発症している可能性が高いか否かを示す情報を入手し得ることを確認した。
即ち、かかる結果は、被検体から採取した体液について、該体液中に存在するシグナルペプチドのプロファイルを決定し、該被検体のシグナルペプチドプロファイルと健常者のシグナルペプチドプロファイルとがこれら25個のピークのm/z(或いは該ピークのm/zに対応する分子量)のいずれかにおいて相違する場合に、該被検体がALSに罹患もしくは発症している可能性が高いことを示す信頼性の高い(精度の高い)情報を入手し得ることを確認した。
換言すると、被検体から採取した体液について、これら25個のピークのm/zに対応する分子量のシグナルペプチドのうちのいずれかの存在量の程度を検査し、健常者由来の体液における該シグナルペプチドの存在量の程度と比較することで、該被検体がALSに罹患もしくは発症している可能性が高いか否かを示す信頼性の高い(精度の高い)情報を入手し得ることを確認した。
上記実施例2で同定された、ALS患者群と健常者群でピーク値が有意に異なる327個のピークについて、該ピークに対応するシグナルペプチドを特定した。即ち、各ピークのm/zと従来公知のシグナルペプチドの分子量とを比較し、シグナルペプチドの分子量が目的のピークのm/z±2の範囲内であるシグナルペプチドを、目的のピークに対応するシグナルペプチドとして特定した。結果を表10~44に示す。
これらの結果は、配列番号1~1580に示すアミノ酸配列の何れかから成るシグナルペプチドについて、該シグナルペプチドの体液中の存在量の程度を指標とすることで、ALSの検出(診断)を補助する情報を入手し得る(典型的には、ALSの診断が可能である)ことを示している。
上述した配列番号1~180に示すアミノ酸配列から成る合成ペプチドを市販のペプチド合成機(Intavis AG社製)を用いてマニュアルどおりに固相合成法(Fmoc法)を実施して合成した。なお、以下の説明では、当該合成ペプチドをペプチド1~180と呼称する。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
上記ペプチド1~180に係る合成ペプチド(合成マーカーペプチド)を1μmol/mLのペプチド濃度となるように、0.1%TFA/50%ACN水溶液にそれぞれ溶解し、ここで開示される合成マーカーペプチドを主成分とする液状組成物(ALS検査組成物)を得た。
上記ペプチド1~180に係る合成ペプチド(合成マーカーペプチド)を基材上に固定したALS検査用チップを作製した。基材としては、MALDI MSにおいて通常使用される測定用プレート上に、EVAフィルムを貼りつけたものを使用した。即ち、かかる基材は、合成マーカーペプチドが固定される面が熱可塑性樹脂製の板状の基材である。
まず、各ALS検査組成物を、それぞれ、0.1%TFA/50%ACN水溶液で100倍希釈し、合成マーカーペプチド希釈液を準備した。そして、かかる合成マーカーペプチド希釈液と、マトリックス液とを1:1の体積比で混合した。上記マトリックス液としては、シナピン酸(CHCA)が0.1%TFA/50%ACN水溶液中に5mg/mL含まれるものを用いた。
そして、上記マトリックス液と合成マーカーペプチド希釈液とを混合した混合溶液を2μL基材上に滴下し、真空乾燥することにより、ALS検査用チップを作製した。
また、ここで開示されるALSバイオマーカーは、該被検体がALSに罹患もしくは発症していることを高い精度で検出(診断)するための指標として好適に利用することができる。即ち、ここで開示される合成マーカーペプチド、(または、該合成マーカーペプチドを含むALS検査組成物、ALS検査キット、ALS検査チップ)は、ALSを高い精度で検出(診断)する目的で好適に利用することができる。
Claims (3)
- 筋萎縮性側索硬化症(ALS)の検出を補助するための方法であって、
被検体由来の体液のマススペクトルを決定すること、および、
前記決定した被検体のマススペクトルを、予め決定した健常検体由来の体液のマススペクトルと比較すること、を包含し、
ここで、前記被検体のマススペクトルにおいて、以下の質量電荷比(m/z):
1502.40, 1521.93, 1629.15, 1691.75, 1821.71, 1836.18, 1948.39, 2011.18, 2092.80, 2099.42, 2177.51, 2179.25, 2186.28, 2211.58, 2226.96, 2254.83, 2278.67, 2502.64, 2640.51, 2698.27,3330.34;
のうち少なくともいずれかで特定されるピーク値が前記健常検体のマススペクトルと比較して増大している場合、及び/又は、
前記被検体のマススペクトルについて、以下の質量電荷比(m/z):
1682.54, 1705.53;
のうち少なくともいずれかで特定されるピーク値が前記健常検体のマススペクトルと比較して減少している場合に、前記被検体がALSに罹患もしくは発症していることに関連する、ALSの検出を補助するための方法。 - 前記被検体のマススペクトルを決定する前に、前記被検体由来の体液を熱可塑性樹脂上に固定すること、を包含し、
前記熱可塑性樹脂上に固定した前記体液のマススペクトルを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計を用いて決定する、請求項1に記載の方法。 - 前記体液が、脳脊髄液である、請求項1または2に記載の方法。
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