JP2009528059A - 筋萎縮性側索硬化症に関するバイオマーカー及びそれらを使用する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の種々のバイオマーカーを提供する。本発明はまた、ＡＬＳを診断する方法、ＡＬＳへの罹患しやすさを判定する方法、ＡＬＳの進行／後退をモニターする方法、ＡＬＳを処置するための組成物の有効性を評価する方法、ＡＬＳのバイオマーカーを調節する活性に関して組成物をスクリーニングする方法、ＡＬＳを処置する方法、並びにＡＬＳのバイオマーカーに基づく他の方法など、該バイオマーカーを用いる種々の方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００６年２月２８日出願の米国仮特許出願第６０／７７７，３３８号，２００６年４月５日出願の米国仮特許出願第６０／７８９，３９２号、２００６年１０月１２日出願の米国仮特許出願第６０／８５１，１４４号に対する利益を主張する。これらの出願の全内容は、参照として本明細書に組み込まれている。

連邦委託研究に関する記述
本発明は、一部、国立衛生研究所からの補助金第１Ｒ４３ＥＳ０１３６４６−０１号の下、政府後援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。

本発明は全般的に、筋萎縮性側索硬化症に関するバイオマーカー及びそれらバイオマーカーに基づく方法に関する。

ルーゲーリック病としても知られている筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、随意運動を担う神経細胞を急速に攻撃し破壊する致死的な神経系疾患である。運動を制御している脳及び脊髄におけるニューロンの破壊は、最終的には、全ての随意運動の制御が失われる点まで進行する。死亡は典型的には、疾患発症の３〜５年以内に呼吸器不全から生じる。

米国では、およそ２０，０００人がＡＬＳに罹患しており、毎年、５，０００人がＡＬＳと診断されている。ＡＬＳは、世界的によく見られ、全ての人種及び民族背景の人々が罹患している。ＡＬＳ発症の平均年齢は、４０才と６０才との間であるが、それより若年の男性及び女性もＡＬＳに罹患し得る。ＡＬＳの症例の９０〜９５％において、該疾患は明らかにランダムである（散発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ）として知られる）。このようなＳＡＬＳの症例では、該疾患の家族歴はなく、明確に関連づけられた危険要因もない。ＡＬＳの５〜１０％には、遺伝的な関連がある（家族性ＡＬＳ（ＦＡＬＳ）として知られる）。

一態様において、対象が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患しているかどうかを診断する方法が提供される。該方法は、
対象からの生体試料を分析して、該試料中の、（ａ）表３、４、５、６、７及び８に挙げられた１つ又は複数のバイオマーカー、（ｂ）１つ又は複数の生体異物、（ｃ）生体異物の１つ又は複数の代謝物、及び（ｄ）それらの組合せから選択される、筋萎縮性側索硬化症に関する１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び
該試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを、１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較して、対象が筋萎縮性側索硬化症に罹患しているかどうかを診断すること
を含む。

他の態様において、
対象が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を発症しやすいかどうかを判定する方法であって、
対象からの生体試料を分析して、該試料中の、（ａ）表３、４、５、６、７及び８に挙げられた１つ又は複数のバイオマーカー、（ｂ）１つ又は複数の生体異物、（ｃ）生体異物の１つ又は複数の代謝物、及び（ｄ）それらの組合せから選択される、筋萎縮性側索硬化症に関する１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び
該試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、該１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較して、対象が筋萎縮性側索硬化症を発現しやすいかどうかを判定すること
を含む方法が提供される。

さらに他の態様において、対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の進行／後退をモニターする方法が提供される。該方法は、
第１の時点で対象から得られた、対象からの第１の生体試料を分析して、該試料中の、（ａ）表３、４、５、６、７、８、１６、１７、及び１８に挙げられた１つ又は複数のバイオマーカー、（ｂ）１つ又は複数の生体異物、（ｃ）生体異物の１つ又は複数の代謝物、及び（ｄ）それらの組合せから選択される、筋萎縮性側索硬化症に関する１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、
第２の時点で対象から得られた、対象からの第２の生体試料を分析して、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を判定すること、及び
該第１の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、該第２の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）と比較して、対象のＡＬＳの進行／後退をモニターすること
を含む。

さらなる態様において、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置するための組成物の有効性を評価する方法が提供される。該方法は、
筋萎縮性側索硬化症に罹患しており、現在又は以前に組成物で処置されている対象からの生体試料を分析して、（ａ）表３、４、５、６、７、８、１６、１７、及び１８に挙げられた１つ又は複数のバイオマーカー、（ｂ）１つ又は複数の生体異物、（ｃ）生体異物の１つ又は複数の代謝物、及び（ｄ）それらの組合せから選択される、ＡＬＳに関する１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び
該試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、（ａ）該組成物で処置される前に対象から得られた、対象からの事前採取生体試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル、（ｂ）１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性参照レベル、（ｃ）１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陰性参照レベル、（ｄ）１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ進行陽性参照レベル、及び／又は（ｅ）１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ後退陽性参照レベルと比較すること
を含む。

さらに他の態様において、
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置における組成物の有効性を評価する方法であって、
第１の時点で対象から得られた、対象からの第１の生体試料を分析して、該第１の試料中の、（ａ）表３、４、５、６、７、８、１６、１７、及び１８に掲げた１つ又は複数のバイオマーカー、（ｂ）１つ又は複数の生体異物、（ｃ）生体異物の１つ又は複数の代謝物、及び（ｄ）それらの組合せから選択される、ＡＬＳに関する１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、
対象に該組成物を投与すること、
該組成物の投与後、第２の時点で対象から得られた、対象からの第２の生体試料を分析して、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、
該第１の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、該第２の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）と比較して、筋萎縮性側索硬化症を処置するための組成物の有効性を評価すること
を含む方法が提供される。

他の態様において、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置するための２つ以上の組成物の相対的有効性を評価する方法が提供される。該方法は、
筋萎縮性側索硬化症に罹患しており、現在又は以前に第１の組成物で処置されている第１の対象からの第１の生体試料を分析して、（ａ）表３、４、５、６、７、８、１６、１７、及び１８に挙げられた１つ又は複数のバイオマーカー、（ｂ）１つ又は複数の生体異物、（ｃ）生体異物の１つ又は複数の代謝物、及び（ｄ）それらの組合せから選択される、ＡＬＳに関する１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、
ＡＬＳに罹患しており、現在又は以前に第２の組成物で処置されている第２の対象からの第２の生体試料を分析して、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び
該第１の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、該第２の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）と比較して、筋萎縮性側索硬化症を処置するための第１及び第２の組成物の相対的有効性を評価すること
を含む。

さらに他の態様において、
筋萎縮性側索硬化症の１つ又は複数のバイオマーカーの調節における活性に関して組成物をスクリーニングする方法であって、
１つ又は複数の細胞を組成物と接触させること、
１つ又は複数の細胞又は該細胞に関連する生体試料の少なくとも一部を分析して、（ａ）表３、４、５、６、７及び８に掲げた１つ又は複数のバイオマーカー、（ｂ）１つ又は複数の生体異物、（ｃ）生体異物の１つ又は複数の代謝物、及び（ｄ）それらの組合せから選択される、筋萎縮性側索硬化症の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び
１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、該バイオマーカーに関する予め決められた標準的なレベルと比較して、該組成物が該１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を調節したかどうかを判定すること
を含む方法が提供される。

さらなる態様において、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に対する可能性のある標的薬剤を同定する方法が提供される。該方法は、
（ａ）表３、４、５、６、７及び８に挙げられた１つ又は複数のバイオマーカー、（ｂ）１つ又は複数の生体異物、（ｃ）生体異物の１つ又は複数の代謝物、及び（ｄ）それらの組合せから選択される、ＡＬＳに関する１つ又は複数のバイオマーカーに関連する１つ又は複数の生化学的経路を同定すること、及び
該１つ又は複数の同定された生化学的経路の少なくとも１つに影響を及ぼす、筋萎縮性側索硬化症に対する可能性のある標的薬剤であるタンパク質を同定すること
を含む。

他の態様において、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している対象を処置するための方法が提供される。該方法は、ＡＬＳに罹患していない対象と比較してＡＬＳに罹患している対象で減少する、表３、４、５、６、７及び８から選択される１つ又は複数のバイオマーカーの有効量を投与することを含む。

さらに他の態様において、対象が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患しているか、又は末梢ニューロパシー若しくはミオパシーに罹患しているかどうかを識別する方法が提供される。該方法は、
対象からの生体試料を分析して、該試料中の、１つ又は複数の生体異物、生体異物の代謝物、及び／又は表１４及び１５に挙げられたバイオマーカーを含む、筋萎縮性側索硬化症に関する１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び
該試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、該１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較して、対象が、ＡＬＳに罹患しているか、又は末梢ニューロパシー若しくはミオパシーに罹患しているかどうかを判定すること
を含む。

本発明は、筋萎縮性側索硬化症のバイオマーカー、ＡＬＳを診断するための方法、ＡＬＳへの罹患しやすさを判定する方法、ＡＬＳの進行／後退をモニターする方法、ＡＬＳを処置するための組成物の有効性を評価する方法、ＡＬＳのバイオマーカーの調節における活性に関して組成物をスクリーニングする方法、ＡＬＳを処置する方法、並びにＡＬＳのバイオマーカーに基づく他の方法に関する。しかし、さらに詳細に本発明を記述する前に、以下の用語を先ず定義する。

定義：
「バイオマーカー」とは、第１の表現型を有する（例えば、疾患に罹患している）対象又は対象群からの生体試料において、第２の表現型を有する（例えば、疾患に罹患していない）対象又は対象群からの生体試料と比較して差異的に存在（増加又は減少）している化合物、好ましくは、生体異物又は代謝物を意味する。バイオマーカーは、任意のレベルで差異的に存在し得るが、一般に、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、又はそれ以上増加したレベルで存在しているか；又は一般に、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％（すなわち、存在しない）減少したレベルで存在する。バイオマーカーは、統計的に有意なレベルで（すなわち、ウェルシュＴ検定又はウィルコクソン順位和検定を用いて判定した際に、０．０５未満のｐ値及び／又は０．１０未満のｑ値）差異的に存在することが好ましい。

１つ又は複数のバイオマーカーの「レベル」とは、試料中のバイオマーカーの絶対的又は相対的な量又は濃度を意味する。

「試料」又は「生体試料」とは、対象から単離された生物学的材料を意味する。生体試料は、所望のバイオマーカーを検出するために好適な任意の生物学的材料を含有し得、対象からの細胞材料及び／又は非細胞材料を含み得る。試料は、例えば、血液、血漿、尿、又は脳脊髄液（ＣＳＦ）などの任意の好適な生体組織又は体液から単離することができる。

「対象」とは、任意の動物を意味するが、例えば、ヒト、サル、マウス、又はウサギなどの哺乳動物であることが好ましい。

バイオマーカーの「参照レベル」とは、特定の疾患状態、表現型、又はそれらの欠如、並びに疾患状態、表現型、又はそれらの欠如の組合せを示すバイオマーカーのレベルを意味する。バイオマーカーの「陽性」参照レベルとは、特定の疾患状態又は表現型を示すレベルを意味する。バイオマーカーの「陰性」参照レベルとは、特定の疾患状態又は表現型の欠如を示すレベルを意味する。例えば、バイオマーカーの「ＡＬＳ陽性参照レベル」とは、対象におけるＡＬＳの陽性診断を示すバイオマーカーのレベルを意味し、バイオマーカーの「ＡＬＳ陰性参照レベル」とは、対象におけるＡＬＳの陰性診断を示すバイオマーカーのレベルを意味する。他の例として、バイオマーカーの「ＡＬＳ進行陽性参照レベル」とは、対象におけるＡＬＳの進行を示すバイオマーカーのレベルを意味し、バイオマーカーの「ＡＬＳ後退陽性参照レベル」とは、対象におけるＡＬＳの後退を示すバイオマーカーのレベルを意味する。バイオマーカーの「参照レベル」とは、該バイオマーカーの絶対的又は相対的な量又は濃度、該バイオマーカーの存在又は非存在、該バイオマーカーの量又は濃度の範囲、該バイオマーカーの量又は濃度の最小値及び／又は最大値、該バイオマーカーの量又は濃度の平均値、及び／又は該バイオマーカーの量又は濃度の中央値；さらに、バイオマーカーの組合せの「参照レベル」は、２種以上のバイオマーカーの絶対的又は相対的な量又は濃度の互いに関する比率でもあり得る。特定の疾患状態、表現型、又はそれらの欠如に関するバイオマーカーの適切な陽性及び陰性参照レベルは、１つ又は複数の適切な対象における所望のバイオマーカーのレベルを測定することによって決定することができ、このような参照レベルは、対象の特定の集団に対して調整できる（例えば、参照レベルを年齢整合させて、一定の年齢の対象からの試料中のバイオマーカーのレベルと一定の年齢群における特定の疾患状態、表現型、又はそれらの欠如に関する参照レベルとの間の比較を行うことができる）。このような参照レベルはまた、使用される特定の技法に基づいてバイオマーカーのレベルが異なり得る、生体試料中のバイオマーカーのレベルを測定するために使用される特定の技法に対しても調整できる（例えば、ＬＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳなど）。

「代謝物」又は「小型分子」とは、細胞内に存在する有機又は無機の分子を意味する。この用語は、大型タンパク質（例えば、２，０００、３，０００、４，０００，５，０００、６，０００，７，０００、８，０００，９，０００、又は１０，０００以上の分子量を有するタンパク質）、大型核酸（例えば、２，０００、３，０００、４，０００，５，０００、６，０００，７，０００、８，０００，９，０００、又は１０，０００以上の分子量を有する核酸）、又は大型多糖類（例えば、２，０００、３，０００、４，０００，５，０００、６，０００，７，０００、８，０００，９，０００、又は１０，０００以上の分子量を有する多糖類）などの大型高分子を含まない。細胞の小型分子は一般に、細胞質内又はミトコンドリアなどの他の細胞小器官内の溶液中に遊離状態で見られるが、そこでそれらはさらに代謝され得るか、又は高分子と呼ばれる大型分子を作出するために使用され得る中間体のプールを形成する。用語「小型分子」は、シグナル伝達分子及び食物から誘導されるエネルギーを使用可能な形態へと変換する化学反応における中間体を含む。小型分子の例としては、糖類、脂肪酸、アミノ酸、ヌクレオチド、細胞過程の間に形成される中間体、及び細胞内に見られる他の小型分子が挙げられる。

「生体異物」とは、所与の生物に対する化学的異物（すなわち、インビボで産生されない）を意味する。生体異物としては、限定はしないが、薬剤、殺虫剤、及び発癌物質が挙げられる。生体異物の代謝は２段階で生じる。第１相の酵素としては、シトクロムＰ４５０酵素が挙げられ、第２相の酵素としては、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ及びグルタチオンＳトランスフェラーゼが挙げられる。

「生体異物の第１相代謝物」とは、生体異物の第１相代謝の産物を意味する。例えば、パラキサンチン（すなわち、１−７−ジメチルキサンチン）、テオフィリン、及びテオブロミンは、カフェインの第１相代謝物である。

「代謝プロファイル」、又は「小型分子プロファイル」とは、標的の細胞、組織、器官、生物、又はそれらの部分（例えば、細胞区画）内の小型分子の完全な、又は部分的なインベントリーを意味する。該インベントリーは、存在する小型分子の量及び／又はタイプを含み得る。「小型分子プロファイル」は、単一の技法又は複数の異なる技法を用いて決定することができる。

「非バイオマーカー化合物」とは、第２の表現型を有する（例えば、第１の疾患に罹患していない）対象又は対象群からの生体試料と比較して、第１の表現型を有する（例えば、第１の疾患に罹患している）対象又は対象群からの生体試料中に差異的には存在していない化合物を意味する。しかし、このような非バイオマーカー化合物は、第１の表現型（例えば、第１の疾患に罹患している）又は第２の表現型（例えば、第１の疾患に罹患していない）と比較して、第３の表現型（例えば、第２の疾患に罹患している）を有する対象又は対象群からの生体試料中のバイオマーカーであり得る。

「メタボローム」とは、所与の生物内に存在する全ての小型分子を意味する。

「神経変性疾患」としては、限定はしないが、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、及びパーキンソン病が挙げられる。

Ｉ．バイオマーカー
本明細書に記載されているＡＬＳバイオマーカーは、メタボロームプロファイリング法を用いて発見された。このようなメタボロームプロファイリング法は、下記の実施例、並びに全内容が参照として本明細書に組み込まれている、米国特許第７，００５，２５５号及び米国特許出願第１１／３５７，７３２号、第１０／６９５，２６５号（公開第２００５／００１４１３２号）、米国特許出願第１１／３０１，０７７号（公開第２００６／０１３４６７６号）、米国特許出願第１１／３０１，０７８号（公開第２００６／０１３４６７７号）、米国特許出願第１１／３０１，０７９号（公開第２００６／０１３４６７８号）、及び米国特許出願第１１／４０５，０３３号に、より詳細に記載されている。

一般に、代謝プロファイルは、ＡＬＳと診断されたヒト対象からの生体試料並びに１つ又は複数の他のヒト対象群（例えば、ＡＬＳと診断されていない健常な対照対象）からの生体試料に関して決定された。ＡＬＳに関する代謝プロファイルを、１つ又は複数の他の対象群からの生体試料に関する代謝プロファイルと比較した。他の群（例えば、ＡＬＳと診断されていない健常な対照対象）と比較して、ＡＬＳ試料の代謝プロファイルにおいて、統計的に有意なレベルで差異的に存在している分子などの差異的に存在している分子を、それらの群を識別するためのバイオマーカーとして同定した。

バイオマーカーは、本明細書においてより詳細に考察される。発見されたバイオマーカーは、以下の群に相当する：
ＡＬＳ対象対ＡＬＳと診断されていない対象を識別するためのバイオマーカー（表３、４、５、６、７、８、及び９を参照）；
ＡＬＳに罹患している対象対末梢ニューロパシーに罹患している対象を識別するためのバイオマーカー（表１４を参照）；
ＡＬＳに罹患している対象対ミオパシーに罹患している対象を識別するためのバイオマーカー（表１５を参照）；
早期ＡＬＳ対後期ＡＬＳを識別するためのバイオマーカー（すなわち、ＡＬＳの進行／後退を識別するためのバイオマーカー）（表１６、１７、及び１８を参照）。

比較群に関連した非バイオマーカー化合物もまた同定された。発見された非バイオマーカー化合物は、以下の群に相当する：
ＡＬＳ対象とＡＬＳとは診断されていない対照対象との間で同じレベルで存在している非バイオマーカー化合物（表３、４、５、６、７、８、１６、１７、及び１８を参照）。

この時点で、バイオマーカー化合物及び非バイオマーカー化合物のいくつかの身元は不明であるが、これら「無名」化合物は、このような同定を可能にする分析法によって十分に特性化されているため、対象からの生体試料中のバイオマーカー化合物又は非バイオマーカー化合物の同定にとって、そのような身元は必要ない。このような全ての「無名」化合物の分析特性化は実施例に記載されている。このような「無名」バイオマーカー化合物及び非バイオマーカー化合物は、本明細書において、「代謝物」の後に特定の代謝物番号の名称を用いて称されている。

また、以前「無名」の代謝物の身元が決定された場合、実際の代謝物の身元の後に、「以前の代謝物−ｘｘｘｘ」（例えば、ラクテート（以前：代謝物−２６９４）−３５）の名称を付けるか、又は「代謝物」番号の後に、「廃棄」と称して、実際の代謝物の身元を付ける（例えば、代謝物−１７１３を廃棄：ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸）。

最後に、「無名」の代謝物に対して、化合物の身元として可能性のあるものが提案されているが、このような身元が確認されていない場合、「代謝物」番号の後に「可能な」と称される（可能性のある化合物の身元と共に）。このような提案された身元は、そうでない場合に「無名」である化合物の分析特性化を限定するものとして考えるべきではない。

ＩＩ．バイオマーカーとしての生体異物及び生体異物代謝物
上記のバイオマーカーに加えて、生体異物（限定はしないが、カフェインを含む）及び生体異物の代謝物は、ＡＬＳに関するバイオマーカーであることが決定されている。

理論に拘束されないが、ＡＬＳ（特に、散発性ＡＬＳ）の病因における少なくとも１つの要因は、第２相の酵素活性に対して、第１相の酵素活性がより高いこと（すなわち、（１）第２相の正常な酵素活性と第１相の正常より高い酵素活性との共役、（２）第１相の正常な酵素活性と第２相の低い酵素活性との共役、又は（３）第１相の正常より高い酵素活性と第２相の低い酵素活性との共役）による、体内の生体異物の代謝不均衡であると考えられている。このような不均衡により、体内により多くの毒素及びフリーラジカルが存在することとなり（第１相の酵素によって産生される）ＡＬＳ、特にＳＡＬＳの発症及び進行へと至り得る。したがって、生体異物及びそれらの対応する代謝物が、本明細書に記載されている種々の方法（例えば、ＡＬＳ対象対正常対象の識別、並びにＡＬＳ対象対ＡＬＳに類似した神経変性疾患に罹患している対象の識別を含む）のためのバイオマーカーとして使用することができる。

ＡＬＳに関するバイオマーカーとして使用できる生体異物及び対応する代謝物の一例はカフェイン及びその対応する代謝物である。実施例４〜７に示されるように、ＡＬＳに罹患している対象を、ＡＬＳに罹患していない正常な対象から識別するために、また、ＡＬＳに罹患している対象を、ＡＬＳに類似した症状を有する他の神経変性疾患（例えば、ミオパシー、ニューロパシー）に罹患している対象から識別するためのバイオマーカーとして、カフェイン及び第１相のカフェイン代謝物（例えば、パラキサンチン（すなわち、１−７−ジメチルキサンチン）、テオフィリン、及びテオブロミン）を使用できる。下記に説明されるように、カフェイン及びカフェイン代謝物（すなわち、パラキサンチン／１，７−ジメチルキサンチン、テオフィリン、テオロミン）のレベルは、健常対象と比較して、ＡＬＳ患者の血漿中ではより低いことが示されており、ＡＬＳとＡＬＳに類似した症状を有する疾患（例えば、ミオパシー、ＰＮ）との間を識別するために、カフェイン及びパラキサンチンのレベルを使用することができる。したがって、このようなバイオマーカーはＡＬＳの診断に有用である。

対照対象の血漿中レベルと比較して、ＡＬＳ患者の血漿中ではより低レベルのカフェイン及びカフェイン代謝物（すなわち、パラキサンチン／１，７−ジメチルキサンチン、テオブロミン、テオフィリン）が測定された（表９及び実施例４を参照）。ＡＬＳ対象において、カフェイン及びカフェイン代謝物がより低レベルなのは、カフェインを代謝する酵素（例えば、毒素、薬剤、アルコール、塗料ヒュームと反応する肝臓の第１相シトクロムＰ４５０酵素並びに肝臓における第２相の反応によって毒性のより低い水溶性の物質に変換され得る化合物を形成する他の多くの物質）の活性の増加によるものであり、これらの対象が低量のカフェインを摂取していることによるわけではないと考えられる。

ＣＹＰＩＡ２、誘導性のシトクロムＰ４５０の活性は、カフェインが身体からどれだけ速く除去されるかを反映する。カフェインの高速クリアランス（すなわち、高比率のカフェイン代謝物／カフェイン）は、毒性物質を除去するために肝臓が高速で働いていることを示す。きわめて高いカフェインクリアランス速度を有する個体は、第１相のシトクロムＰ４５０活性によるこれらの生体異物及び毒素の代謝によってさらなる毒性物質及びフリーラジカルが生じるため、環境毒素、殺虫剤、さらには車の排気ガスに影響を受けやすい。第２相の系の活性もまた高ければ、この系の均衡はとれている。しかし、第２相の系の活性が第１相の活性との均衡から外れていれば、第１相の毒素及びフリーラジカルは蓄積し得る。

肝臓の迅速な第１相の代謝による毒素及びフリーラジカルの生成は、散発性ＡＬＳの発症に寄与し得る可能性がある。カフェイン及びカフェイン代謝物のレベルは、対照対象と比較して、ＡＬＳ対象でははるかに低い（表９及び実施例４を参照）。しかし、カフェインに対するカフェイン代謝物の比率は、対照対象と比較して、ＡＬＳでより高く（表１０及び実施例５を参照）、ＡＬＳ患者における第１相の肝臓解毒系が正常レベルよりも高く働いている可能性を示している。これは年齢効果によるという可能性は低い。種々の年齢の個体の人口統計学的試験で、カフェインとカフェイン代謝物であるパラキサンチンの双方のレベルが、年齢によって増加するからである（表１１及び実施例５を参照）。さらに、表１１に示されているように、パラキサンチン／カフェイン比は、ＡＬＳが典型的に診断される年齢である高齢者群で最も低い。したがって、カフェイン、カフェイン代謝物のレベル及び／又はカフェイン／カフェイン代謝物の比率（すなわち、カフェイン代謝／クリアランス）を測定することにより、ＡＬＳに罹患している個体の診断、並びにＡＬＳの危険性にある個体の同定のために有用な貴重な情報が提供でき、また、散発性ＡＬＳのいくつかの場合の病因において、過剰活性のシトクロムＰ４５０系及び／又は生体異物代謝の他の機序との関係が示唆される。これらの酵素系を標的にし、毒性物質の形成速度を低下させる療法は、ＡＬＳの発症を防止又は相当に遅延できると考えられる。

カフェインのレベルは、ミオパシーに罹患している個体からの血漿並びに末梢ニューロパシー（ＰＮ）患者からの血漿と比較して、ＡＬＳに罹患している患者からの血漿中で有意により低い（表１２及び実施例６を参照）。したがって、カフェイン及び／又はカフェイン代謝物は、ミオパシー又はＰＮなどの、ＡＬＳに類似した症状を有する疾患からＡＬＳを識別するためにも有用なバイオマーカー（複数可）である。さらにカフェインに対するパラキサンチンの比率は、ミオパシー又はＰＮにおける比率よりもＡＬＳにおいてより高い。このことは、カフェインクリアランスが、ＡＬＳに類似した疾患よりもＡＬＳにおいてより高いことを裏付けており、ＡＬＳに対する可能性のある有用な治療標的を提供する。また、カフェイン、カフェイン代謝物のレベル及び／又はカフェイン代謝物／カフェインの比率は、ＡＬＳをこれらＡＬＳ「模倣体」から識別するための診断試験において有用である。

本明細書に記載された方法のいくつかの実施形態において、使用されるバイオマーカーの少なくとも１つは、例えば、カフェイン及び／又はカフェイン代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及び／又はテオブロミン）などの生体異物及び／又は生体異物の代謝物（好ましくは、生体異物及び生体異物の第１相の代謝物）を含む。

ＩＩＩ．ＡＬＳの診断
ＡＬＳに関するバイオマーカーの同定によって、ＡＬＳの１つ又は複数の症状を呈している対象におけるＡＬＳの診断（又は診断の補助）が可能になる。対象がＡＬＳに罹患しているかどうかを診断する（又は診断を補助する）方法は、（１）対象からの生体試料を分析して、該試料中の筋萎縮性側索硬化症の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び（２）該試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、該１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベル（複数可）と比較して、対象が筋萎縮性側索硬化症に罹患しているかどうかを診断する（又は診断を補助する）ことを含む。使用される１つ又は複数のバイオマーカーは、生体異物（例えば、カフェイン）、生体異物の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン）、及び／又は表３、４、５、６、７及び／又は８、並びにそれらの組合せから選択される。ＡＬＳの診断の補助にこのような方法が使用される場合は、該方法の結果は、対象がＡＬＳに罹患しているかどうかの臨床的判定に有用な他の方法（又はその結果）と共に使用できる。

任意の好適な方法を使用することにより、該試料を分析して、生体試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定することができる。好適な方法としては、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー）質量分析（例えば、ＭＳ、ＭＳ−ＭＳ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体結合、他の免疫化学的方法、及びそれらの組合せが挙げられる。さらに、例えば、測定が望まれているバイオマーカーのレベル（複数可）に相関している１つ又は複数の化合物のレベルが測定されるアッセイを用いて、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を間接的に測定することができる。

対象がＡＬＳに罹患しているかどうかを診断する方法及び診断を補助する方法において、生体異物（例えば、カフェイン）、生体異物の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン）、及び／又は表３、４、５、６、７及び／又は８から選択される１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを決定できる。例えば、生体異物（例えば、カフェイン）、生体異物の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン）、及び／又は表３、４、５、６、７、及び／又は８又はそれらの任意の部分から選択される全てのバイオマーカーの組合せを含む、１つのバイオマーカー、２つ以上のバイオマーカー、３つ以上のバイオマーカー、４つ以上のバイオマーカー、５つ以上のバイオマーカー、６つ以上のバイオマーカー、７つ以上のバイオマーカー、８つ以上のバイオマーカー、９つ以上のバイオマーカー、１０以上のバイオマーカーなどのレベル（複数可）を決定でき、そのような方法に使用できる。バイオマーカーの組合せのレベルを決定することにより、ＡＬＳの診断及びＡＬＳの診断の補助において、より高い感受性及び特異性を可能にすることができ、また、ＡＬＳに類似した、又は重複したバイオマーカーを有し得る他の神経変性疾患からＡＬＳをより良好に識別すること（神経変性疾患に罹患していない対象と比較して）を可能にし得る。例えば、生体試料中の一定のバイオマーカー（及び非バイオマーカー化合物）のレベルの比率は、ＡＬＳの診断及びＡＬＳの診断の補助において、より高い感受性及び特異性を可能にすることができ、また、ＡＬＳに類似した、又は重複したバイオマーカーを有し得る他の神経変性疾患からＡＬＳをより良好に識別すること（神経変性疾患に罹患していない対象と比較して）を可能にし得る。

一定のタイプの試料（例えば、ＣＳＦ試料又は血漿試料）中のＡＬＳ診断（又はＡＬＳ診断の補助）に関して特異的な１つ又は複数のバイオマーカーもまた使用できる。例えば、生体試料が脳脊髄液である場合、対象がＡＬＳに罹患しているかどうかを診断する（又は診断を補助する）ために、表３及び／又は４に挙げられた１つ又は複数のバイオマーカーが使用できる。生体試料が血漿である場合、対象がＡＬＳに罹患しているかどうかを診断する（又は診断を補助する）ために、表５、６、７及び／又は８から選択される１つ又は複数のバイオマーカーが使用できる。

試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定した後、該レベル（複数可）は、ＡＬＳ陽性参照及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較して、対象がＡＬＳに罹患しているかどうかの診断を補助する又は診断する。ＡＬＳ陽性参照レベルに相当する試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（例えば、参照レベルと同じレベル、参照レベルと実質的に同じレベル、参照レベルの最小及び／又は最大以上及び／又は以下、及び／又は参照レベルの範囲内）は、対象におけるＡＬＳの診断を示す。ＡＬＳ陰性参照レベルに相当する試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（例えば、参照レベルと同じレベル、参照レベルと実質的に同じレベル、参照レベルの最小及び／又は最大以上及び／又は以下、及び／又は参照レベルの範囲内）は、対象における非ＡＬＳの診断を示す。また、ＡＬＳ陰性参照レベルと比較して、試料中に差異的に存在している（特に、統計的に有意なレベルで）１つ又は複数のバイオマーカーのレベルは、対象におけるＡＬＳの診断を示す。ＡＬＳ陽性参照レベルと比較して、試料中に差異的に存在している（特に、統計的に有意なレベルで）１つ又は複数のバイオマーカーのレベルは、対象における非ＡＬＳの診断を示す。一実施形態において、試料中のカフェイン及びパラキサンチン及び／又はテオフィリンのレベルが決定され、ＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルは、表１０に挙げられたパラキサンチン／カフェイン比及び／又はテオフィリン／カフェイン比を含み得る。

ＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルに対する生体試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）の単純な比較（例えば、マニュアル比較）を含む種々の技法を用いて、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、ＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較できる。また、１つ又は複数の統計解析（例えば、ｔ検定、ウェルシュＴ検定、ウィルコクソン順位和検定、ランダムフォレスト）を用いて、生体試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、ＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較できる。

また、生体試料を分析して、１つ又は複数の非バイオマーカー化合物のレベル（複数可）を決定できる。このような非バイオマーカー化合物のレベル（複数可）はまた、ＡＬＳに類似した、又は重複したバイオマーカーを有し得る他の神経変性疾患からＡＬＳを識別すること（神経変性疾患に罹患していない対象と比較して）を可能にし得る。例えば、ＡＬＳに罹患している対象及びＡＬＳに罹患していない対象の生体試料に存在する既知の非バイオマーカー化合物をモニターして、他の神経変性疾患に罹患している患者からの生体試料が非バイオマーカー化合物を有しない場合、他の神経変性疾患の診断と比較して、ＡＬＳの診断を検証し得ると考えられる。

ＩＶ．ＡＬＳへの罹患しやすさを判定する方法
ＡＬＳに関するバイオマーカーの同定により、ＡＬＳの症状を有していない対象がＡＬＳを発現しやすいかどうかの判定も可能になる。ＡＬＳの症状を有していない対象が筋萎縮性側索硬化症を発現しやすいかどうかを判定する方法は、（１）対象からの生体試料を分析して、該試料中の生体異物（例えば、カフェイン）、生体異物の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン）、及び／又は表３、４、５、６、７及び／又は８から選択される１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び（２）該試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、該１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較して、対象が筋萎縮性側索硬化症発現を発現しやすいかどうかを判定することを含む。この方法の結果は、対象がＡＬＳを発現しやすいかどうかの臨床的判定に有用な他の方法（又はそれらの結果）と共に使用できる。

上記のようにＡＬＳを診断する（又は診断を補助する）方法に関連して、任意の好適な方法を使用することにより、生体試料を分析して、試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを決定することができる。

上記のＡＬＳを診断する（又はその診断を補助する）方法では、生体異物（例えば、カフェイン）、生体異物の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン）、及び／又は表３、４、５、６、７、及び／又は８又はそれらの任意の部分から選択される全てのバイオマーカーの組合せを含む、１つのバイオマーカー、２つ以上のバイオマーカー、３つ以上のバイオマーカー、４つ以上のバイオマーカー、５つ以上のバイオマーカー、６つ以上のバイオマーカー、７つ以上のバイオマーカー、８つ以上のバイオマーカー、９つ以上のバイオマーカー、１０以上のバイオマーカーなどのレベル（複数可）を決定でき、ＡＬＳの症状を有さない対象がＡＬＳを発現しやすいかどうかを判定する方法に使用できる。

試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定した後、前記レベル（複数可）を、ＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較して、対象が筋萎縮性側索硬化症を発現しやすいかどうかを予測する。ＡＬＳ陽性参照レベルに相当する試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（例えば、参照レベルと同じレベル、参照レベルと実質的に同じレベル、参照レベルの最小及び／又は最大以上及び／又は以下、及び／又は参照レベルの範囲内）は、対象がＡＬＳを発現しやすいことを示す。ＡＬＳ陰性参照レベルに相当する試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（例えば、参照レベルと同じレベル、参照レベルと実質的に同じレベル、参照レベルの最小及び／又は最大以上及び／又は以下、及び／又は参照レベルの範囲内）は、対象がＡＬＳを発現しやすくないことを示す。また、ＡＬＳ陰性参照レベルと比較して、試料中に差異的に存在している（特に、統計的に有意なレベルで）１つ又は複数のバイオマーカーのレベルは、対象がＡＬＳを発現しやすいことを示す。ＡＬＳ陽性参照レベルと比較して、試料中に差異的に存在している（特に、統計的に有意なレベルで）１つ又は複数のバイオマーカーのレベルは、対象がＡＬＳを発現しやすくないことを示す。

さらに、ＡＬＳに罹患していない対象が、ＡＬＳを発現しやすいかどうかの評価に特異的な参照レベルを決定することも可能であり得る。例えば、ＡＬＳ発現に関して、対象における異なる危険度（例えば、低い、中等度、高い）を評価するために、バイオマーカーの参照レベルを決定することが可能であり得る。このような参照レベルを、対象からの生体試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベルとの比較に使用できると考えられる。

上記の方法では、単純な比較、１つ又は複数の統計解析及びそれらの組合せを含む種々の技法を用いて、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、ＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較できる。

対象がＡＬＳに罹患しているかどうかを診断する（又は診断を補助する）方法では、ＡＬＳの症状を有していない対象が、筋萎縮性側索硬化症を発現しやすいかどうかを判定する方法は、生体試料を分析して、１つ又は複数の非バイオマーカー化合物のレベル（複数可）を決定することをさらに含み得る。

Ｖ．ＡＬＳの進行／後退をモニターする方法
ＡＬＳに関するバイオマーカーの同定によって、対象におけるＡＬＳの進行／後退をモニターすることも可能になる。対象における筋萎縮性側索硬化症の進行／後退をモニターする方法は、（１）第１の時点で得られた、対象からの第１の生体試料を分析して、生体異物（例えば、カフェイン）、生体異物の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン）、及び／又は表３、４、５、６、７、８、１６、１７及び／又は１８から選択される、ＡＬＳに関する１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、（２）第２の時点で得られた、対象からの第２の生体試料を分析して、１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを決定すること、及び（３）該第１の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、該第２の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）と比較して、対象におけるＡＬＳの進行／後退をモニターすることを含む。該方法の結果は、対象におけるＡＬＳの経過（すなわち、何らかの変化がある場合は、進行又は後退）を示す。

経時的な１つ又は複数のバイオマーカーのレベルの変化（存在する場合）は、対象におけるＡＬＳの進行又は後退を示し得る。対象におけるＡＬＳの経過を特性化するために、第１の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）、第２の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）、及び／又は第１と第２の試料中のバイオマーカーのレベル（複数可）の比較の結果を、１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較できる。前記比較によって、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）が、経時的に増加又は減少して（例えば、第１の試料と比較して、第２の試料において）、ＡＬＳ陽性参照レベルとの類似性が高く（又は、ＡＬＳ陰性参照レベルとの類似性が低く）なることが示されれば、その結果は、ＡＬＳの進行を示す。前記比較によって、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）が、経時的に増加又は減少して、ＡＬＳ陰性参照レベルとの類似性が高く（又は、ＡＬＳ陽性参照レベルとの類似性が低く）なることが示されれば、その結果は、ＡＬＳの後退を示す。

対象における経過は、第１の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、第２の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）、及び／又は第１と第２の試料中のバイオマーカーのレベル（複数可）の比較の結果を、ＡＬＳ進行陽性及び／又はＡＬＳ後退陽性参照レベル（例えば、下記の実施例１１は、ＡＬＳの進行につれて一定のバイオマーカーが増加するか減少するかを示す早期のＡＬＳ対後期のＡＬＳを識別するためのバイオマーカーを記述しており；このようなＡＬＳの後期対早期におけるバイオマーカーの傾向及び／又はレベルは、ＡＬＳ進行の陽性参照レベルの一例である）と比較することによっても特性化できる。前記比較によって、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）が、経時的に増加又は減少して（例えば、第１の試料と比較して、第２の試料において）、ＡＬＳ進行陽性参照レベルとの類似性が高く（又は、ＡＬＳ後退陽性参照レベルとの類似性が低く）なることが示されれば、その結果は、ＡＬＳの進行を示す。前記比較によって、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）が、経時的に増加又は減少して、ＡＬＳ後退陽性参照レベルとの類似性が高く（又は、ＡＬＳ進行陽性参照レベルとの類似性が低く）なることが示されれば、その結果は、ＡＬＳの後退を示す。

本明細書に記載された他の方法で、対象におけるＡＬＳの進行／後退をモニターする方法でなされる比較は、単純な比較、１つ又は複数の統計解析、及びそれらの組合せを含む種々の技法を用いて実施できる。

前記方法の結果は、対象におけるＡＬＳの進行／後退の臨床的モニタリングに有用な他の方法（又はそれらの結果）と共に使用できる。

ＡＬＳを診断する（又は診断を補助する）方法に関連して上記のように、任意の好適な方法を使用することにより、生体試料を分析して、試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを決定することができる。また、生体異物（例えば、カフェイン）、生体異物の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン）、及び／又は表３、４、５、６、７、８、１６、１７、及び／又は１８又はそれらの任意の部分から選択される全てのバイオマーカーの組合せを含む１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを決定して、対象におけるＡＬＳの進行／後退をモニターする方法に使用できる。

このような方法は、ＡＬＳに罹患している対象におけるＡＬＳの経過をモニターするために実施できるか、又はＡＬＳへの罹患しやすさのレベルをモニターするために、ＡＬＳに罹患していない対象（例えば、ＡＬＳを発現しやすいことが疑われる対象）において使用できる。

ＶＩ．ＡＬＳを処置するための組成物の有効性を評価する方法
また、ＡＬＳに関するバイオマーカーの同定により、ＡＬＳを処置するための組成物の有効性の評価並びにＡＬＳを処置するための２種以上の組成物の相対的有効性の評価も可能になる。例えば、このような評価は、有効性試験並びにＡＬＳを処置するための組成物の優位選択に使用できる。

筋萎縮性側索硬化症を処置するための組成物の有効性を評価する方法は、（１）筋萎縮性側索硬化症に罹患しており、現在又は以前に組成物で処置されている対象（又は対象群）からの生体試料（又は試料群）を分析して、生体異物（例えば、カフェイン）、生体異物の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン）、及び／又は表３、４、５、６、７、８、１６、１７、及び／又は１８から選択される１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び（２）該試料（又は試料群）中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、（ａ）該組成物で処置される前に対象（又は対象群）から得られた、対象（又は対象群）からの事前採取生体試料（又は試料群）中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）、（ｂ）１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性参照レベル、（ｃ）１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陰性参照レベル、（ｄ）１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ進行陽性参照レベル、及び／又は（ｅ）１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ後退陽性参照レベルと比較することを含む。この比較の結果は、ＡＬＳを処置するための組成物の有効性を示す。

したがって、ＡＬＳを処置するための組成物の有効性を特性化するために、生体試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、（１）ＡＬＳ陽性参照レベル、（２）ＡＬＳ陰性参照レベル、（３）ＡＬＳ進行陽性参照レベル、（４）ＡＬＳ後退陽性参照レベル、及び／又は（５）該組成物による処置前の対象（又は対象群）における１つ又は複数のバイオマーカーの以前のレベルと比較する。

生体試料（筋萎縮性側索硬化症に罹患していて、現在又は以前に組成物によって処置されている対象又は対象群からの）中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、ＡＬＳ陽性参照レベル、ＡＬＳ陰性参照レベル、ＡＬＳ進行陽性参照レベル、ＡＬＳ後退陽性参照レベルと比較する場合、ＡＬＳ陰性参照レベル又はＡＬＳ後退陽性参照レベルに相当する試料（複数可）中のレベル（複数可）（例えば、参照レベルと同じ、参照レベルと実質的に同じ、参照レベルの最小及び／又は最大以上及び／又は以下、及び／又は参照レベルの範囲内のレベル）は、該組成物がＡＬＳ処置に関して有効性を有していることを示す。ＡＬＳ陽性参照レベル又はＡＬＳ進行陽性参照レベルに相当する試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）（例えば、参照レベルと同じ、参照レベルと実質的に同じ、参照レベルの最小及び／又は最大以上及び／又は以下、及び／又は参照レベルの範囲内のレベル）は、該組成物がＡＬＳ処置に関して有効性を有さないことを示す。前記比較はまた、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）に基づいて、ＡＬＳ処置に関する有効性の程度も示し得る。

生体試料（ＡＬＳに罹患していて、現在又は以前に組成物によって処置されている対象又は対象群からの）中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、該組成物による処置前に、対象（又は対象群）からの事前採取生体試料（複数可）中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）と比較する場合、該１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）の変化は、ＡＬＳを処置するための組成物の有効性を示す。すなわち、該１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）が該組成物による処置の後に増加又は減少して、ＡＬＳ陰性又はＡＬＳ後退陽性参照レベルとの類似性がより高くなった（又は、ＡＬＳ陽性又はＡＬＳ進行陽性参照レベルとの類似性がより低くなった）ことが前記比較によって示されるならば、その結果は、該組成物がＡＬＳ処置に関して有効性を有することを示す。該１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）が該組成物による処置の後に増加又は減少せず、ＡＬＳ陰性又はＡＬＳ後退陽性参照レベルとの類似性がより高くなった（又は、ＡＬＳ陽性又はＡＬＳ進行陽性参照レベルとの類似性がより低くなった）ことが前記比較によって示されるならば、その結果は、該組成物がＡＬＳ処置に関して有効性を有さないことを示す。前記比較はまた、処置後の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）に見られる変化の量に基づいて、ＡＬＳ処置に関する有効性の程度も示し得る。このような比較の特性化を補助するために、該組成物によって現在又は以前に処置されている対象における１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）の変化、処置前の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）、及び／又は１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、該１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性、ＡＬＳ陰性、ＡＬＳ進行陽性、及び／又はＡＬＳ後退陽性参照レベルと比較できる。

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置における組成物の有効性を評価するための他の方法は、（１）第１の時点で対象（又は対象群）から得られた、対象からの第１の生体試料（又は試料群）を分析して、生体異物（例えば、カフェイン）、生体異物の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン）、及び／又は表３、４、５、６、７、８、１６、１７、及び／又は１８から選択される１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、（２）対象に該組成物を投与すること、（３）該組成物の投与後、第２の時点で対象から得られた、対象からの第２の生体試料を分析して、該１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び（４）該第１の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、該第２の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）と比較して、筋萎縮性側索硬化症の処置用組成物の有効性を評価することを含む。上記に示されたように、該試料の比較によって、該１つ又は複数のバイオマーカーのレベルが、該組成物の投与後に増加又は減少して、ＡＬＳ陰性又はＡＬＳ後退陽性参照レベルとの類似性がより高くなった（又はＡＬＳ陽性又はＡＬＳ進行陽性参照レベルとの類似性がより低くなった）ことが示されるならば、その結果は、該組成物がＡＬＳ処置に関して有効性を有することを示す。該比較によって、該１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）が、該組成物の投与後に増加又は減少せず、ＡＬＳ陰性又はＡＬＳ後退陽性参照レベルとの類似性がより高くなった（又はＡＬＳ陽性又はＡＬＳ進行陽性参照レベルとの類似性がより低くなった）ことが示されるならば、その結果は、該組成物がＡＬＳ処置に関して有効性を有さないことを示す。該比較はまた、該組成物の投与後に、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）において見られた変化の量に基づいた、ＡＬＳ処置に関する有効性の程度も示す。このような比較の特性化を補助するために、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）の変化、該組成物の投与前の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）、及び／又は該組成物の投与後の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、２つの組成物の１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性、ＡＬＳ陰性、ＡＬＳ進行陽性、及び／又はＡＬＳ後退陽性参照レベルと比較することができる。

筋萎縮性側索硬化症を処置するための２種以上の組成物の相対的有効性を評価する方法は、（１）現在又は以前に第１の組成物で処置されている、ＡＬＳに罹患している第１の対象からの第１の生体試料を分析して、生体異物（例えば、カフェイン）、生体異物の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン）、及び／又は表３、４、５、６、７、８、１６、１７、及び／又は１８から選択される１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、（２）現在又は以前に第２の組成物で処置されている、ＡＬＳに罹患している第２の対象からの第２の生体試料を分析して、該１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、（３）該第１の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、該第２の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）と比較して、筋萎縮性側索硬化症の処置に関する第１及び第２の組成物の相対的有効性を評価することを含む。その結果は、これら２種の組成物の相対的有効性を示し、相対的有効性の特性化を補助するために、該結果（又は第１の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル及び／又は第２の試料中の該１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可））を、ＡＬＳ陽性、ＡＬＳ陰性、ＡＬＳ進行陽性、及び／又はＡＬＳ後退陽性参照レベルと比較することができる。

有効性を評価する方法の各々は、１人又は複数の対象又は１つ又は複数の対象群に対して実施できる（例えば、第１の群は第１の組成物によって処置し、第２の群は第２の組成物によって処置する）。

本明細書に記載された他の方法で、ＡＬＳを処置するための組成物の有効性（又は相対的有効性）を評価する方法において行われる比較は、単純な比較、１つ又は複数の統計的解析、及びそれらの組合せを含む種々の技法を用いて実施できる。任意の好適な方法を用いて該生体試料を分析して、試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定することができる。また、生体異物（例えば、カフェイン）、生体異物の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン）、及び／又は表３、４、５、６、７、８、１６、１７、及び／又は１８、又はそれらの任意の部分から選択される全てのバイオマーカーの組合せを含めて、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定することができ、ＡＬＳを処置するための組成物の有効性（又は相対的有効性）を評価する方法に使用できる。

最後に、ＡＬＳを処置するための１つ又は複数の組成物の有効性（又は相対的有効性）を評価する方法は、該生体試料を分析して、１つ又は複数の非バイオマーカー化合物のレベル（複数可）を決定することをさらに含む。次いで、該非バイオマーカー化合物を、ＡＬＳに罹患している（又は罹患していない）対象に関する非バイオマーカー化合物の参照レベルと比較することができる。

ＶＩＩ．ＡＬＳ関連バイオマーカーの調節における活性に関して組成物をスクリーニングする方法
ＡＬＳに関するバイオマーカーの同定はまた、ＡＬＳの処置において有用であり得る、ＡＬＳ関連バイオマーカーの調節における活性に関する組成物のスクリーニングも可能にする。ＡＬＳの処置に有用な組成物をスクリーニングする方法は、生体異物（例えば、カフェイン）、生体異物の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン）、及び／又は表３、４、５、６、７、及び／又は８から選択される１つ又は複数のバイオマーカーのレベルの調節における活性に関して試験組成物をアッセイすることを含む。このようなスクリーニングアッセイは、インビトロ及び／又はインビボで実施でき、例えば、細胞培養アッセイ、臓器培養アッセイ、及びインビボアッセイ（例えば、動物モデルを含むアッセイ）など、試験組成物の存在下、このようなバイオマーカーの調節をアッセイすることに関して有用な、当業界に知られている任意の形態で実施できる。

一実施形態において、筋萎縮性側索硬化症の１つ又は複数のバイオマーカー調節における活性に関して組成物をスクリーニングする方法は、（１）１つ又は複数の細胞を組成物と接触させること、（２）１つ又は複数の細胞又は該細胞に関連する生体試料の少なくとも一部を分析して、生体異物（例えば、カフェイン）、生体異物の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン）、及び／又は表３、４、５、６、７及び／又は８から選択される、筋萎縮性側索硬化症の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び（３）１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、該１つ又は複数のバイオマーカーに関する予め決められた標準的なレベルと比較して、該組成物が該１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を調節したかどうかを判定することを含む。上記で考察したように、該細胞は、インビトロ及び／又はインビボで該組成物に接触させることができる。１つ又は複数のバイオマーカーの予め決められた標準的レベルは、該組成物の非存在下、１つ又は複数の細胞における１つ又は複数のバイオマーカーのレベルであり得る。１つ又は複数のバイオマーカーの予め決められた標準的レベルはまた、該組成物に接触させなかった対照細胞における１つ又は複数のバイオマーカーのレベルでもあり得る。

また、前記方法はまた、１つ又は複数の細胞又は該細胞に関連した生体試料の少なくとも一部を分析して、筋萎縮性側索硬化症の１つ又は複数の非バイオマーカー化合物のレベル（複数可）を決定することをさらに含み得る。次いで、非バイオマーカー化合物のレベルを、１つ又は複数の非バイオマーカー化合物の予め決められた標準的レベルと比較することができる。

任意の好適な方法を使用することにより、１つ又は複数の細胞又は該細胞に関連した生体試料の少なくとも一部を分析して１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）（又は非バイオマーカー化合物のレベル）を決定することができる。好適な方法としては、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー）、質量分析（例えば、ＭＳ、ＭＳ−ＭＳ）、ＥＬＩＳＡ、抗体結合、他の免疫化学的技法、及びそれらの組合せが挙げられる。さらに、例えば、測定が望まれるバイオマーカー（複数可）（又は非バイオマーカー化合物）のレベルに関連している化合物（１つ又は複数）のレベルを測定するアッセイを用いることにより、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）（又は非バイオマーカー化合物のレベル）を間接的に測定できる。

ＶＩＩＩ．可能性のある薬剤標的を同定する方法
ＡＬＳに関するバイオマーカーの同定により、ＡＬＳに対する可能性のある薬剤標的の同定も可能になる。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に対する可能性のある薬剤標的を同定する方法は、（１）生体異物（例えば、カフェイン）、生体異物の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン）、及び／又は表３、４、５、６、７及び／又は８から選択される、ＡＬＳに関する１つ又は複数のバイオマーカーに関連する１つ又は複数の生化学的経路を同定すること、及び（２）該１つ又は複数の同定された生化学的経路の少なくとも１つに影響を及ぼす、筋萎縮性側索硬化症に対する可能性のある薬剤標的であるタンパク質（例えば、酵素）を同定することを含む。

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に対する可能性のある薬剤標的を同定する他の方法は、（１）生体異物（例えば、カフェイン）、生体異物の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン）、及び／又は表３、４、５、６、７及び／又は８から選択される、ＡＬＳに関する１つ又は複数のバイオマーカー、並びに表３、４、５、６、７及び／又は８から選択される、ＡＬＳの１つ又は複数の非バイオマーカー化合物に関連した１つ又は複数の生化学的経路を同定すること、及び（２）該１つ又は複数の同定された生化学的経路の少なくとも１つに影響を及ぼす、筋萎縮性側索硬化症に対する可能性のある薬剤標的であるタンパク質を同定することを含む。

１つ又は複数のバイオマーカー（又は非バイオマーカー化合物）に関連する１つ又は複数の生化学的経路（例えば、生合成及び／又は代謝（異化）経路）が同定される。該生化学的経路が同定された後、少なくとも１つの該経路に影響を及ぼす１つ又は複数のタンパク質が同定される。複数の経路に影響を及ぼしているタンパク質が同定されることが好ましい。

１つの代謝物（例えば、経路中間体）の増加は、該代謝物の「ブロック」下流の存在を示していることが考えられ、該ブロックは、下流代謝物（例えば、生合成経路の産物）の低／非存在レベルをもたらし得る。同様な様式で、代謝物の非存在は、非活性又は非機能的な酵素（複数可）から、又は該産物を産生する上で必要な物質である生化学的中間体が利用できないことから生じる該代謝物の上流の経路における「ブロック」の存在を示していると考えることができる。或いは、代謝物レベルの増加は、異常タンパク質を生じさせる遺伝子変異によって代謝物の過剰産生及び／又は蓄積がもたらされ、次いで、他の関連した生化学的経路の変化が導かれ、その経路を介した正常な流動の調節不全がもたらされること；さらに、生化学的中間代謝物の増加が毒性であり得るか、又は関連経路にとって必要な中間体の産生を損ない得ることを示していると考えることができる。現在、経路間の関連性が不明であっても、本データがこのような関連性を解明し得ることが可能である。

例えば、ＡＬＳにおける高グルタメートレベルにより、グルタメート受容体の過剰興奮性に至り、神経毒性を生じさせることが提案されている。薬剤リルゾール（Ｒｉｌｕｚｏｌｅ）は、中枢神経系におけるグルタメート放出をシナプス前阻害することによるグルタメートレベルの低下によって作用すると考えられる。しかし、この薬剤は、体内の総グルタメートレベルは低下させない。正常対象と比較して、ＡＬＳにおいて上昇するバイオマーカーとしてのグルタメートの本性により、可能性のある薬剤標的は、グルタメート産生を導く経路内にあり得ることが示唆されるであろう。グルタメート合成の阻害により機能すると考えられる組成物は、グルタメートのレベルを抑制し得る。このような酵素の一例は、グルタミンをグルタメートへと変換するグルタミナーゼ２である。何らかの上昇バイオマーカーの産生を導く経路は、薬剤発見のための多数の可能性のある標的を提供すると考えられる。

次いで、可能性のある薬剤標的として同定されたタンパク質を用いて、遺伝子療法のための組成物を含むＡＬＳ治療に関する可能性のある候補であり得る組成物を同定できる。

ＩＸ．ＡＬＳを処置する方法
ＡＬＳに関するバイオマーカーの同定により、ＡＬＳの処置も可能になる。例えば、ＡＬＳに罹患している対象を処置するために、ＡＬＳに罹患していない健常対象と比較してＡＬＳにおいて減少する１つ又は複数のＡＬＳバイオマーカーの有効量を該対象に投与できる。投与できるバイオマーカーは、ＡＬＳに罹患していない対象と比較してＡＬＳにおいて減少する、表３、４、５、６、７、及び／又は８における１つ又は複数のバイオマーカーを含み得る。このようなバイオマーカーは、バイオマーカー化合物の身元（すなわち、化合物名）に基づいて単離できるであろう。現在名づけられていない代謝物であるバイオマーカーは、下記の実施例に挙げられたバイオマーカーに関する分析的特性化に基づいて単離できるであろう。いくつかの実施形態において、投与されるバイオマーカーは、ＡＬＳにおいて低下し、０．０５未満のｐ値及び／又は０．１０未満のｑ値を有する、表３、４、５、６、７、及び／又は８に挙げられた１つ又は複数バイオマーカーである。他の実施形態において、投与されるバイオマーカーは、ＡＬＳにおいて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％（すなわち、非存在）減少している、表３、４、５、６、７、及び／又は８に挙げられた１つ又は複数のバイオマーカーである。

Ｘ．他の神経変性疾患に対してＡＬＳバイオマーカーを用いる方法
本明細書に記載されたＡＬＳに関するバイオマーカーのいくつかは、神経変性疾患一般に関するバイオマーカーでもあり得ると考えられる。したがって、ＡＬＳのバイオマーカーの少なくともいくつかは、神経変性疾患一般に関して、本明細書に記載された方法において使用できると考えられる。すなわち、ＡＬＳに関して本明細書に記載された方法は、神経変性疾患の診断（又は診断の補助）、神経変性疾患の進行／後退をモニターする方法、神経変性疾患を処置するための組成物の有効性を評価する方法、神経変性疾患に関連するバイオマーカー調節における活性に関して組成物をスクリーニングする方法、神経変性疾患に対して可能性のある薬剤標的を同定する方法、神経変性疾患を処置する方法にも使用できる。このような方法は、ＡＬＳに関して本明細書に記載されたとおりに実施できるであろう。

ＸＩ．ＡＬＳを他の神経変性疾患から識別する方法
ＡＬＳに関するバイオマーカーの同定により、対象が筋萎縮性側索硬化症に罹患しているか、又はＡＬＳに類似した症状を有する他の神経変性疾患（例えば、末梢ニューロパシー又はミオパシー）に罹患しているかを識別することが可能になる。対象がＡＬＳに罹患しているか、又はＡＬＳに類似した症状を有する他の神経変性疾患（例えば、末梢ニューロパシー又はミオパシー）に罹患しているかを識別する方法は、（１）対象からの生体試料を分析して、該試料中の筋萎縮性側索硬化症の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び（２）該試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、該１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較して、対象が筋萎縮性側索硬化症に罹患しているか、又は他の神経変性疾患（例えば、末梢ニューロパシー又はミオパシー）に罹患しているかを判定することを含む。ＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルは、他の特定の神経変性疾患との比較にとって特定のレベル（例えば、末梢ニューロパシー又はミオパシーとの間を識別する、ＡＬＳに関するバイオマーカーの参照レベル）であり得る。

使用される１つ又は複数のバイオマーカーは、生体異物（例えば、カフェイン）、生体異物の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン）、及び／又は表１４及び／又は１５から選択される。例えば、他の態様において、対象が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患しているか、又は末梢ニューロパシー若しくはミオパシーに罹患しているかを識別する方法は、（１）対象からの生体試料を分析して、該試料中の、１つ又は複数の生体異物、生体異物の代謝物、及び／又は表１４及び１５に挙げられたバイオマーカーを含む、筋萎縮性側索硬化症に関する１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び（２）該試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、該１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較して、対象がＡＬＳに罹患しているか、又は末梢ニューロパシー若しくはミオパシーに罹患しているかを判定することを含む。

任意の好適な方法を使用することにより、該試料を分析して、該生体試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定することができる。好適な方法としては、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー）質量分析（例えば、ＭＳ、ＭＳ−ＭＳ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体結合、他の免疫化学的方法、及びそれらの組合せが挙げられる。さらに、例えば、測定が望まれているバイオマーカー（複数可）のレベルに相関している１つ又は複数の化合物のレベルが測定されるアッセイを用いて、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を間接的に測定できる。

該試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定した後、該レベル（複数可）を、ＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較して、対象がＡＬＳに罹患しているか、又はＡＬＳに関する症状を呈す他の疾患（例えば、ＰＮ又はミオパシー）に罹患しているかを識別する。ＡＬＳ陽性参照レベルに相当する試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（例えば、参照レベルと同じ、参照レベルと実質的に同じ、参照レベルの最小及び／又は最大以上及び／又は以下、及び／又は参照レベルの範囲内のレベル）は、対象におけるＡＬＳの診断を示す。ＡＬＳ陰性参照レベルに相当する試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（例えば、参照レベルと同じ、参照レベルと実質的に同じ、参照レベルの最小及び／又は最大以上及び／又は以下、及び／又は参照レベルの範囲内のレベル）は、対象における非ＡＬＳの診断を示す。また、ＡＬＳ陰性参照レベルと比較して、該試料中に差異的に存在する（特に、統計的に有意なレベルで）１つ又は複数のバイオマーカーのレベルは、対象におけるＡＬＳに診断を示す。ＡＬＳ陽性参照レベルと比較して、該試料中に差異的に存在する（特に、統計的に有意なレベルで）１つ又は複数のバイオマーカーのレベルは、対象における非ＡＬＳに診断を示す。本明細書に記載されるように、バイオマーカーの比率（例えば、カフェインに対するパラキサンチン比率）を、ＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルとして使用できる。

ＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルに対する該生体試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）の単純な比較（例えば、マニュアル比較）などの種々の技法を用いて、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、ＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較することができる。また、１つ又は複数の統計的解析（例えば、ｔ検定、ウェルシュＴ検定、ウィルコクソン順位和検定、ランダムフォレスト）を用いて、該生体試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、ＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較することもできる。

ＸＩＩ．他の方法
本明細書において考察されたバイオマーカーを用いる他の方法もまた考慮されている。例えば、本明細書に開示された１つ又は複数のバイオマーカー及び／又は本明細書に開示された１つ又は複数の非バイオマーカーを含む小型分子プロファイルを用いて、米国特許第７，００５，２５５号及び米国特許出願第１０／６９５，２６５号に開示された方法が実施できる。

本明細書に挙げられた方法のいずれかにおいて、使用されるバイオマーカーは、０．０５未満のｐ値を有する、表３、４、５、６、７、８、１４、１５、１６、１７、及び／又は１８中のバイオマーカー、及び／又は０．１０未満のｑ値を有する表３、４、５、６、７、８、１４、１５、１６、１７、及び／又は１８中のバイオマーカーから選択できる。本明細書に記載された方法のいずれかにおいて使用されるバイオマーカーはまた、対照群（例えば、ＡＬＳに罹患していない対象、早期のＡＬＳに罹患している対象など）と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％（すなわち、非存在）減少している、表３、４、５、６、７、８、１４、１５、１６、１７、及び／又は１８中のバイオマーカー；及び／又は対照群と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、又はそれ以上増加している、表３、４、５、６、７、８、１４、１５、１６、１７、及び／又は１８中のバイオマーカーからも選択できる。

また、本明細書に記載された方法のいずれかにおいて、使用されるバイオマーカーは、例えば、カフェイン、及び／又はカフェインの１つ又は複数の代謝物（例えば、パラキサンチン、テオフィリン、及び／又はテオブロミン）などの、１つ又は複数の生体異物及び／又は生体異物の１つ又は複数の代謝物（生体異物及び／又は生体異物の１つ又は複数の第１相の代謝物など）から選択できる。

本発明を、限定は意図されていない以下の例示的実施例によってさらに説明する。

Ｉ．一般的方法
Ａ．ＡＬＳに関する代謝プロファイルの同定
数百種の代謝物の濃度を決定するために、各試料を分析した。代謝物を分析するために、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析）及びＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）などの分析技法を用いた。複数のアリコートを同時に、並行して分析し、適切な品質管理（ＱＣ）の後、各分析から誘導された情報を再び合わせた。各試料を数千の特徴によって特性化すると、最終的に数百の化学種になる。使用された技法は、新規で化学的に無名の化合物を同定することができた。

Ｂ．統計的解析
いくつかの統計的方法を用いてデータを解析し、限定可能な集団間（例えば、ＡＬＳと対照；ＡＬＳとミオパシー又は末梢ニューロパシー）の識別に有用な、限定可能な集団又は亜集団において差異的レベルで存在する分子（既知の命名されている代謝物又は無名の代謝物のいずれか）（例えば、対照の生体試料と比較したＡＬＳの生体試料に関するバイオマーカー；ＡＬＳに類似した症状を有する他の疾患と比較したＡＬＳに関するバイオマーカー）を同定した。限定可能な集団又は亜集団における他の分子（既知の命名されている代謝物又は無名の代謝物のいずれか）もまた同定された。

Ｃ．バイオマーカーの同定
統計的に有意であるとして同定されたものを含めて、分析（例えば、ＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＭＳ−ＭＳ）において同定された種々のピークを、化学的同定法に基づいた質量分析に供した。

（実施例１）
一実施例において、（１）ヒト対象の種々の群からのＣＳＦ試料を分析して、該試料中の代謝物のレベルを決定すること、次いで（２）前記結果を統計的に解析して、２つの群に差異的に存在する代謝物を判定することにより、バイオマーカーを発見した。

該分析に使用されたＣＳＦ試料は、９９人のＡＬＳ対象（１４人のＦＡＬＳ対象及び８５人のＳＡＬＳ対象）及びＡＬＳと診断されなかった３６人の対照対象からのものであった。代謝物のレベルを決定後、一変量のＴ検定（すなわち、ウェルシュＴ検定）（表３）、ウィルコクソン順位和検定（表４）、及びランダムフォレスト解析を用いて、該データを解析した。

２つの集団（例えば、ＡＬＳ対対照）の未知の平均値の差異を判定するために、Ｔ検定を用いた。ウィルコクソン順位和検定は、２つの集団の中心値を比較するために用いられた非パラメーター検定である。Ｑ値を用いて、複数の比較を説明した。Ｑ値は、偽発見率の予測を提供する（例えば、ｑ値＜０．１０を有する全てが有意であると示されれば、そのリスト中のもののおよそ１０％は偽発見物である）。ランダムフォレスト解析解析は、個体の分類に用いられた。「オアウトオブバッグ」（ＯＯＢ）誤差率は、ランダムフォレストモデルを用いて、どのくらい正確に新観察が予測できるか（例えば、試料がＡＬＳ対象からのものか、それとも対照対象からのものか）の予想を提供する。

ランダムフォレストモデル
ＣＳＦ試料からのＧＣ−ＭＳデータを回収して、該データを部分的に非盲検化した。その非盲検化データに基づいて、ランダムフォレストモデルを構築した。このランダムフォレストからのＯＯＢ誤差はおよそ３１％であり、このモデルにより、対照対象の本性は、その時の７１％正しく予測でき、ＡＬＳ対象は、その時の６８％予測できたことが予想された。次いでそのモデルを、ＧＣ−ＭＳデータの盲検部分に適用した。予測が提供された後、該データを非盲検化した。該データの盲検化部分に対する予測の結果は、表１に示されている。最初のランダムフォレストモデルからのＯＯＢ誤差は、該データの盲検化部分に対するモデルを用いた場合に判定された実際の誤差（およそ２９％）にきわめて類似していた。

表１：メタボロミック予測の結果

最後に、ランダムフォレストモデルを用いて、完全ＧＣ−ＭＳ及びＬＣ−ＭＳデータを分類した。ランダムフォレストに関するコンフュージョンマトリックスを表２に示す。どの化合物がより重要であるかを見るために、予測に関する化合物の重要性に基づいて、それらを順位付けし、重要性プロットを構成した（図１に示す）。

表２：ランダムフォレストＣＳＦの結果：対照対ＡＬＳ、完全データセット

バイオマーカー
下表３〜４に挙げたように、ＡＬＳ対象とＡＬＳと診断されなかった対照対象からの試料間に差異的に存在するバイオマーカーが発見された。

表３及び表４は、挙げられた各バイオマーカー及び非バイオマーカー化合物に関して、該バイオマーカーに関するデータの統計的解析において判定されたｐ値及びｑ値、特定の化合物の平均値がより高いのは、ＡＬＳ試料においてか、それとも対照試料においてか、の表示（「＋」は、対照試料と比較して、ＡＬＳ試料においてより高い平均値を示し、「−」は、対照試料と比較して、ＡＬＳ試料においてより低い平均値を示す）、及び対照の平均値と比較して、ＡＬＳの平均値における差異パーセンテージの表示を含む。これらの表を通して、記号「−３５」で終わっている代謝物の名称は、これらの化合物のレベルがＬＣ−ＭＳを用いて測定されたことを示し、記号「−９」で終わっている名称は、これらの化合物のレベルがＧＣ−ＭＳを用いて測定されたことを示す。表中に用いられている用語「同重体」は、解析に用いられた分析プラットフォーム上で、互いに識別できなかった化合物を示す（すなわち、同重体の化合物は、ほぼ同時に溶出し、同様の（時には正確に）量子イオンを有し、したがって、識別することができない）。

また、該解析で同定された非バイオマーカー化合物は、０％のＡＬＳの変化率を有する化合物として下表３及び４に挙げられている。

表３：ＣＳＦ試料からのＡＬＳバイオマーカー−ＡＬＳ対対照のＴ検定

表４．ＣＳＦからのＡＬＳバイオマーカー：ウィルコクソンの順位和検定ＡＬＳ対対照

（実施例２）
別の実施例において、バイオマーカーは、（１）ヒト対象の種々の群からの血漿試料を分析して、該試料中の代謝物のレベルを決定すること、次いで（２）この結果を統計的に解析して、２つの群に差異的に存在するこれらの代謝物を判定することにより発見された。下記の表５〜６に挙げられたように、ＡＬＳ対象とＡＬＳと診断されなかった対照対象からの試料間に差異的に存在したバイオマーカーが発見された。

解析に用いられた血漿試料は、１９９人のＡＬＳ対象及びＡＬＳと診断されなかった９４人の対照対象に由来した。代謝物のレベルが決定された後、データは、Ｔ検定（表５）及びウィルコクソンの順位和検定（表６）を用いて解析された。

挙げられた各々のバイオマーカー及び非バイオマーカー化合物に関して、表５及び表６は、該バイオマーカーに関するデータの統計解析で決定されたｐ値及びｑ値、特定の化合物の平均値がより高かったのは、ＡＬＳ試料においてか、それとも対照試料においてかの表示（「＋」は、対照試料と比較して、ＡＬＳ試料においてより高い平均値を示し、「−」は、対照試料と比較して、ＡＬＳ試料においてより低い平均値を示す）、及び対照の平均値と比較して、ＡＬＳ平均値における差異パーセンテージの表示を含む。これらの表を通して、「−３５」の記号で終わっている代謝物の名称は、これらの化合物のレベルがＬＣ−ＭＳを用いて測定されたことを示し、「−９」の記号で終わっている名称は、これらの化合物のレベルがＧＣ−ＭＳを用いて測定されたことを示す。表中に用いられている用語「同重体」とは、解析に用いられた分析プラットフォーム上で互いに識別できなかった化合物を示す（すなわち、同重体の化合物は、ほぼ同時に溶出され、同様の（時には正確に）量子イオンを有し、したがって識別することができない）。

分析で同定された非バイオマーカー化合物はまた、０％のＡＬＳの変化率を有する化合物として下表に記載される。

表５：血漿試料からのＡＬＳバイオマーカー−対照対ＡＬＳからの血漿のＴ検定解析

表６．血漿試料からのＡＬＳバイオマーカー−ウィルコクソンの順位和検定ＡＬＳ対対照

（実施例３）
バイオマーカーは、（１）ヒト対象の種々の群からの血漿試料を分析して、該試料中の代謝物のレベルを決定すること、次いで（２）この結果を統計的に解析して、２つの群に差異的に存在する代謝物を判定することにより発見された。下表７〜８に挙げられたように、ＡＬＳ対象とＡＬＳと診断されなかった対照の対象からの試料間に差異的に存在したバイオマーカーが発見された。また、解析で同定された非バイオマーカー化合物は、０％のＡＬＳの変化率を有する化合物として下表に挙げられている。

解析に用いられた血漿試料は、６２人のＡＬＳ対象及びＡＬＳと診断されなかった６２人の対照の対象に由来した。代謝物のレベルが決定された後、データは、Ｔ検定（表７）及びウィルコクソンの順位和検定（表８）を用いて解析された。

挙げられた各々もバイオマーカー及び非バイオマーカー化合物に関して、表７及び表８は、化合物を判定するのに使用した分析方法、該バイオマーカーに関するデータの統計解析で決定されたｐ値及びｑ値、及び対照の平均値と比較してＡＬＳ平均値における差異パーセンテージの表示を含む。陽性の変化パーセンテージは、対照と比較してＡＬＳにおける増加を示し、陰性の変化パーセンテージは、対照と比較してＡＬＳにおける減少を示している。表中に用いられる用語の「同重体」とは、解析に用いられた分析プラットフォーム上で互いに識別できなかった化合物を示す（すなわち、同重体の化合物は、ほぼ同時に溶出され、同様の（時には正確に）量子イオンを有し、したがって識別することはできない）。

表７：血漿試料からのＡＬＳバイオマーカー−対照からの血漿対ＡＬＳからの血漿のＴ検定解析

表８：血漿試料からのＡＬＳバイオマーカー−ウィルコクソンの順位和検定ＡＬＳ対対照

（実施例４）
ＡＬＳ患者及び健常な対象個体におけるカフェイン及びカフェイン代謝物
健常な対照の対象と比較してＡＬＳ患者からの血漿中代謝物濃度の変化を評価するために２つの独立したＡＬＳ試験の代謝物分析を実施した。３１人の健常な対照志願者及び３１人のＡＬＳに罹患している参加者を試験１に登録した。試験２は、９９人のＡＬＳに罹患している参加者及び９４人の健常志願者を含んだ。全ての調査参加者は、インフォームドコンセントを提供した。委員会公認の神経科医が審査し、全ての参加者に対する診断を確認した。性別、年齢、体重、及び薬物治療に関するデータを集めた。ＡＬＳに罹患している参加者に関しては、症状発症の日付及び部位、診断日、及びＡＬＳの家族歴を記録した。健常対照の対象は、既知の神経学的障害がないこととして定義された。

表９は、健常な対照の対象からの血漿試料と比較して、ＡＬＳ患者からの血漿試料中のカフェイン及びカフェイン代謝物（すなわち、１，７−ジメチルキサンチン、テオブロミン、及びテオフィリン）のレベル間のＴ検定解析結果を挙げている。カフェイン及びカフェイン代謝物の平均レベルは、健常な対照志願者と比較してＡＬＳ患者においてより低かった（表９）。

レベル差は、ｐ値が０．０５９１であるテオブロミンを除いて、０．００１以下のｐ値で統計的に有意性が高い。さらに、偽発見率の目安であるｑ値もまた、０．３４７８のｑ値であるテオブロミンを除いて、全て０．１以下の値で有意である。

表９．対照の対象と比較してＡＬＳ患者におけるカフェイン及びカフェイン代謝物のレベル

（実施例５）
ＡＬＳ患者における生体異物代謝
表９に示されるとおり、ＡＬＳ患者は、カフェインレベルが対照の対象よりも低い。これは、ＡＬＳ患者においてカフェインの取込みがより低いためという可能性が考えられる。或いは、生体異物を代謝する酵素（例えば、ＣＹＰ１Ａ２）の活性増加を示していると考えられる。

カフェインに対するカフェイン代謝物の比率にはカフェインクリアランス率の測定値が反映される。より高い比率は、対照の個体よりもＡＬＳ患者に関してＰ／Ｃ及びＴ／Ｃ双方の比率に見られる（表１０）。これは、ＡＬＳ患者が、健常な対照の対象よりも迅速にカフェインを代謝し得ることを示している（ＡＬＳ患者のより低いカフェイン取込みを示しているのではなく）。さらに、ＡＬＳ対象は一般に、健常な個体又はＡＬＳ症状と同様の症状を有する病気を罹患している個体とは差異的に生体異物を代謝し得る。

例えば、カフェインクリアランス率を用いて、カフェインを含む生体異物を代謝する肝臓におけるＣＹＰ１Ａ２、誘導性チトクロームＰ４５０酵素の活性が測定される。Ｐ４５０類の産物は毒素及びフリーラジカルを含むため、カフェインの迅速な代謝は、「病理学的解毒剤」に関連する。第２相の抱合反応は、これらの産物をさらに代謝して排泄可能で毒性が低い水溶性の化合物へと変化させる。活性過剰な生体異物代謝過程（例えば、肝臓Ｐ４５０酵素系）及び／又は活性過少な第２相の解毒過程が、ＡＬＳの病因に寄与し、薬物発見及び治療処置に対する標的を提供し得る可能性がある。

表１０．対照対象及びＡＬＳ対象からの血漿中のカフェインに対するカフェイン代謝物の比率

２７０人の健常志願者からの血漿のメタボロミック人口統計試験において、カフェイン及びその代謝物パラキサンチン双方のレベルは、年齢と共に増加する（表１１）。しかしながら、Ｐ／Ｃ比率は、２つの若年群と事実上同じであり、高齢者群においてはより低い（表１１）。この高齢者群は、ＡＬＳ患者及びＡＬＳ試験の対照対象と同様の年齢群である。

表１１．種々の年齢の正常な成人からの血漿中カフェインに対するカフェイン代謝物の比率

（実施例６）
ＡＬＳ患者及びＡＬＳと同様の症状を有する患者におけるカフェイン及びカフェイン代謝物
ＡＬＳ症状と同様の症状を有する２つの神経変性疾患、末梢ニューロパシー又はミオパシーに罹患している患者と比較して、ＡＬＳ患者からの血漿中代謝物レベルの変化を評価するためにメタボロミック分析を実施した。この試験は、ＡＬＳに罹患している９９人の参加者、ミオパシーに罹患している３６人の参加者、及び末梢ニューロパシーに罹患している５２人の参加者を含んだ。全ての調査参加者は、インフォームドコンセントを提供した。委員会公認の神経科医が審査し、全ての参加者に対する診断を確認した。性別、年齢、体重、及び薬物治療に関するデータを集めた。ＡＬＳ参加者に関しては、症状発症の日付及び部位、診断日、及びＡＬＳの家族歴を記録した。

表１２は、（１）末梢ニューロパシー患者からの血漿試料と比較したＡＬＳ患者から、並びに（２）ミオパシー患者からの血漿試料と比較したＡＬＳ患者からの血漿試料中のカフェイン及びパラキサンチンのレベル間のＴ検定解析結果を記載している。カフェイン及びカフェイン代謝物の平均レベル（表１２）は、末梢ニューロパシー（ＰＮ）患者又はミオパシー患者と比較してＡＬＳ患者において低下することが示された。レベル差は、０．０５のｐ値により統計的に有意である。さらに、偽発見率の目安であるｑ値もまた、ＰＮに罹患している個体にとって特に有意である。

表１２．ミオパシー患者又は末梢ニューロパシー患者からの血漿と比較して、ＡＬＳ患者からのより低い血漿中カフェインレベル及びパラキサンチンレベル

（実施例７）
ＡＬＳ症状と同様の症状を有する神経変性疾患における生体異物代謝
ミオパシー又はＰＮよりもＡＬＳにおいてより低いカフェイン及びカフェイン代謝物レベルは、可能性としてカフェイン摂取を低下させることによるが、カフェイン代謝物のより高い比率の結果であるとも考えられる。カフェイン代謝物に対する１つの十分に特性化された系は、チトクロームＰ４５０酵素により肝臓中で実施された第１相の解毒系である。

表１３は、ＡＬＳに罹患している対象、末梢ニューロパシーに罹患している対象、及びミオパシーに罹患している対象からの血漿中のパラキサンチン及びカフェインの平均レベル並びにパラキサンチン／カフェイン率を挙げている。カフェインに対するカフェイン代謝物の比率は、同様の症状を有する疾患対象（すなわち、ＰＮ及びミオパシー）と比較して、ＡＬＳ患者において高い（表１３）。この比率差は、ＡＬＳがＰＮと比較される場合により明白である。このように、このデータにより、関連症状を有する疾患に罹患している患者におけるＣＹＰ１Ａ２及び／又は同様の生体異物代謝酵素の正常なレベル及び／又は活性と比較して、ＡＬＳ患者におけるＣＹＰ１Ａ２及び／又は同様の生体異物代謝酵素のより高いレベル及び／又はより高い活性が示されている（カフェインのより低い取込みよりもむしろ）。この結果は、カフェイン及び／又は生体異物の代謝（例えば、ＣＹＰ１Ａ２及び／又は他の同様の酵素系の酵素レベル及び／又は活性）が、ＡＬＳにおいて変化しているという考えを裏付けている。このように、カフェインの代謝は、ＡＬＳ患者とＡＬＳと同様の症状を有する患者とを識別するための有用な方法を提供する。

表１３．ＡＬＳ患者、ミオパシー患者又は末梢ニューロパシー患者からの血漿中カフェインに対するカフェイン代謝物パラキサンチンの比率

（実施例８）
ＡＬＳと他の神経変性疾患とを識別するためのバイオマーカー
ＡＬＳと同様の症状を有する２つの神経変性疾患、末梢ニューロパシー又はミオパシーに罹患している患者と比較してＡＬＳ患者の代謝物レベルの変化を評価するために、メタボロミック分析を実施した。

下表１４は、ＡＬＳ対象と末梢ニューロパシー対象とを識別する、発見されたバイオマーカーを挙げている。

下表１５は、ＡＬＳ対象とミオパシー対象とを識別する、発見されたバイオマーカーを挙げている。

記載された各々のバイオマーカーに関して、表１４及び１５は、該バイオマーカーに関するデータの統計解析で決定されたｐ値及びｑ値、並びに対照、ＡＬＳ、末梢ニューロパシー（表１４）、及びミオパシー（表１５）試料中の各バイオマーカーのレベルの中央値の表示を含む。表中に用いられる用語の「同重体」とは、解析に用いられた分析プラットフォーム上で互いに識別できなかった化合物を示す（すなわち、同重体の化合物は、ほぼ同時に溶出され、同様の（時には正確に）量子イオンを有し、したがって識別することができない）。

表１４．ＡＬＳ対象と末梢ニューロパシー対象（ＰＮ）とを識別するバイオマーカー

表１５：ＡＬＳとミオパシーとを識別するバイオマーカー

（実施例９）
疾患進行に関するバイオマーカー
下表１６、１７及び１８に挙げられているように、疾患過程に亘ってＡＬＳ対象からの試料間に差異的に存在する、疾患進行を示すバイオマーカーを発見した。挙げられた各々のバイオマーカー及び非バイオマーカー化合物の各々に関して、表１６、１７及び１８は、バイオマーカーに関するデータの統計解析で決定されたｐ値及びｑ値を含む。これらの表を通して、欄の見出しの「ＬＩＢ＿ＩＤ」は、化合物のレベルを測定するために用いられた分析プラットフォームを示している。数字の「６１」は、これらの化合物のレベルがＬＣ−ＭＳを用いて測定されたことを示し、数字の「５０」は、これらの化合物のレベルがＧＣ−ＭＳを用いて測定されたことを示している。表中に用いられる用語の「同重体」とは、分析に用いられた分析プラットフォーム上で互いに識別できなかった化合物を示す（すなわち、同重体の化合物は、ほぼ同時に溶出され、同様の（時には正確に）量子イオンを有し、したがって識別することができない）。

分析で同定された非バイオマーカー化合物もまた、０の勾配及び／又は経時的に０％のパーセンテージ変化を有する化合物として下表１６、１７及び１８に挙げられている。

バイオマーカーは、（１）種々の時間でヒトＡＬＳ対象からの血漿試料を分析して該試料中の代謝物レベルを決定すること、次いで（２）この結果を統計解析して種々の時点で差異的に存在するこれらの代謝物を判定すること、によって発見された。下表１６〜１８に挙げられているように、疾患の重症度が進んでいた場合、後期に採取された試料と比較して、疾患早期のＡＬＳ対象からの試料に差異的に存在するバイオマーカーを発見した。この代謝物の変化はまた、疾患重症度を示す臨床測定値である努力性肺活量（ＦＶＣ）の変化とを比較して評価された。疾患が進行するにつれてＦＶＣ測定値は減少する。最も重症に冒されたＡＬＳ患者は、最低のＦＶＣスコアを有する。

解析に用いられた血漿試料は、疾患過程時に数回、４０人のＡＬＳ対象から採取した。試料は、早期（スクリーニング／０カ月及び／又は１カ月）と、スクリーニング後６カ月目と、スクリーニング後１２カ月目とに採取した。代謝物レベルが決定されたら、対象からのデータは、無作為係数回帰解析及びＴ検定を用いて解析された。

初発の無作為係数回帰解析に関して、無作為係数回帰（Ｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．、Ｍｉｌｌｉｋｅｎ Ｇ．、Ｓｔｒｏｕｐ，Ｗ．、Ｗｏｌｆｉｎｇｅｒ，Ｒ．（１９９６）混合モデルに関するＳＡＳシステム（ＳＡＳ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍｉｘｅｄ Ｍｏｄｅｌｓ）、７章、ＳＡＳ（登録商標）Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、キャリー、ノースカロライナ州）を、各化合物に関して最初に実施した。このモデルにより、全ての対象と交差する共通の切片及び勾配を有する各対象に関して、種々の切片及び種々の勾配が可能になる。この解析は、共通の勾配がゼロであるかどうかを検定する。ｘ変数は、０、１、６、及び１２カ月目の可能な値を有した月数であった。この解析の結果は、表１６に示されている。この勾配が正である場合、該化合物のレベルが経時的に増加したことを意味し；同様に、この勾配が負である場合、該化合物のレベルが経時的に減少したことを意味する。

別の無作為係数回帰を、ＦＶＣ（努力性肺活量）について、各化合物に関して実施した。元のＦＶＣ値を１時点当り三重に測定したことから、ｘ値は平均ＦＶＣ値であった。初発の分析に用いられた４０人の患者もまた、この無作為係数回帰解析に用いられた。この結果は表１７に示されている。正の勾配は、その化合物がＦＶＣと陽性に相関したことを意味する（すなわち、ＦＶＣが増加するにつれてその化合物が増加し、又はＦＶＣが減少するにつれてその化合物が減少する）。負の勾配は、ＦＶＣが増加すると、その化合物が減ることを示している（又は、その逆もまた同様）。

１カ月目に採取された試料中の該化合物のレベルを、１２カ月目に採取された試料中の該化合物のレベルと比較することによって、Ｔ検定を実施した。１カ月目と１２カ月目の双方の時点での全患者を解析に含めた（合計３７人の患者）。標準マッチドペア検定を用いて、この解析を実施した。結果は表１８に示されている。挙げられたバイオマーカー及び非バイオマーカー化合物の各々に関して、この表は、スクリーニング後の１２カ月目の平均レベルと比較して、スクリーニング後の１カ月目の平均レベルにおける差異パーセンテージの表示を含み、正のパーセンテージ変化は、疾患の進行につれて該代謝物レベルの増加があったことを示し、負のパーセンテージ変化は、疾患の進行につれて該代謝物レベルの減少があったことを示す。

表１６．経時的無作為係数回帰解析

表１７．努力性肺活量に関する無作為係数回帰解析

表１８．１カ月目と１２カ月目のＴ検定比較

（実施例１０）
同重体、無名バイオマーカー、及び無名非バイオマーカー化合物の分析的特性化
下表１９は、上記表３、４、５、６、７、８、１６、１７、及び１８に記載された各同重体及び無名代謝物の分析的特徴を含んでいる。この表は、各々記載された同重体及び代謝物に関して、上記の分析法を用いて得られた保持時間（ＲＴ）、保持指標（ＲＩ）、質量、量子質量、及び極性を含む。「質量」とは、化合物の定量化に使用される親イオンのＣ１２同位元素の質量のことである。「量子質量」に関する値は、定量化に使用された分析法の表示を与え：「Ｙ」はＧＣ−ＭＳを示し、「ｌ」はＬＣ−ＭＳを示す。「極性」は、陽性（＋）又は陰性（−）のいずれかである量的イオンの極性を示す。

表１９．同重体及び無名代謝物の分析的特徴

本発明は、その具体的な実施形態を参照にして詳細に記載されているが、種々の変更及び修飾が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなくなされ得ることは当業者にとって明白である。

実施例１で説明されたランダムフォレスト解析に関する重要性プロットを示す図である。

Claims (46)

1. 対象が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患しているかどうかを診断する方法であって、
   対象からの生体試料を分析して、前記試料中の、（ａ）表３、４、５、６、７及び８に挙げられた１つ又は複数のバイオマーカー、（ｂ）１つ又は複数の生体異物、（ｃ）生体異物の１つ又は複数の代謝物、及び（ｄ）それらの組合せから選択される、筋萎縮性側索硬化症に関する１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び
   前記試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを、１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較して、対象が筋萎縮性側索硬化症に罹患しているかどうかを診断すること
   を含む上記方法。
2. 前記１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陰性参照レベルが、ＡＬＳに罹患していない１人又は複数の対象からの１つ又は複数の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを含み、前記１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性参照レベルが、ＡＬＳと診断された１人又は複数の対象からの１つ又は複数の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記試料レベルとＡＬＳ陰性参照レベルとの間の１つ又は複数のバイオマーカーの差異的レベルが、対象におけるＡＬＳの診断を示す、請求項２に記載の方法。
4. 前記試料レベルとＡＬＳ陽性参照レベルとの間の１つ又は複数のバイオマーカーの差異的レベルが、対象における非ＡＬＳの診断を示す、請求項２に記載の方法。
5. ＡＬＳ陽性参照レベルに相当する前記試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベルが、対象におけるＡＬＳの診断を示す、請求項２に記載の方法。
6. ＡＬＳ陰性参照レベルに相当する前記試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベルが、対象における非ＡＬＳの診断を示す、請求項２に記載の方法。
7. 前記１つ又は複数のバイオマーカーが、０．０５未満のｐ値を有する表３、４、５、６、７及び８におけるバイオマーカー、及び／又は０．１０未満のｑ値を有する表３、４、５、６、７及び８におけるバイオマーカーから選択される、請求項１に記載の方法。
8. 前記生体試料を分析して、表３、４、５、６、７及び８から選択される２種以上のバイオマーカーのレベルを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記生体試料を分析して、表３、４、５、６、７及び８から選択される３種以上のバイオマーカーのレベルを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記生体試料を分析して、表３、４、５、６、７及び８から選択される４種以上のバイオマーカーのレベルを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記生体試料を分析して、表３、４、５、６、８及び９から選択される５種以上のバイオマーカーのレベルを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記生体試料を分析して、表３、４、５、６、７及び８から選択される１０種以上のバイオマーカーのレベルを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記生体試料を分析して、表３、４、５、６、７及び８から選択される１５種以上のバイオマーカーのレベルを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
14. 前記生体試料が脳脊髄液であり、前記１つ又は複数のバイオマーカーが、表３及び４に挙げられた１つ又は複数のバイオマーカーを含む、請求項１に記載の方法。
15. 前記生体試料が血漿であり、前記１つ又は複数のバイオマーカーが、表５、６、７及び８に挙げられた１つ又は複数のバイオマーカーを含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記試料が、質量分析、ＥＬＩＳＡ、及び抗体結合からなる群から選択される１つ又は複数の技法を用いて分析される、請求項１に記載の方法。
17. 前記１つ又は複数のバイオマーカーが、１つ又は複数の生体異物及び／又は生体異物の第１相代謝物を含む、請求項１に記載の方法。
18. 前記１つ又は複数のバイオマーカーが、カフェイン及び／又は１つ又は複数のカフェイン代謝物を含む、請求項１に記載の方法。
19. 前記１つ又は複数のカフェイン代謝物が、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミンからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記１つ又は複数のバイオマーカーが、カフェイン及び１つ又は複数のカフェイン代謝物を含む、請求項１に記載の方法。
21. 前記１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルが、カフェイン及びカフェイン代謝物のレベルのＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照比率を含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記１つ又は複数のバイオマーカーが、表３、４、５、６、７及び８から選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む、請求項１に記載の方法。
23. 前記１つ又は複数のバイオマーカーが、０．０５未満のｐ値を有し、及び／又は０．１０未満のｑ値を有する、表３、４、５、６、７及び８から選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む、請求項１に記載の方法。
24. 対象が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を発症しやすいかどうかを判定する方法であって、
    対象からの生体試料を分析して、前記試料中の、（ａ）表３、４、５、６、７及び８に挙げられた１つ又は複数のバイオマーカー、（ｂ）１つ又は複数の生体異物、（ｃ）生体異物の１つ又は複数の代謝物、及び（ｄ）それらの組合せから選択される、筋萎縮性側索硬化症に関する１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び
    前記試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、前記１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較して、対象が筋萎縮性側索硬化症を発現しやすいかどうかを判定すること
    を含む上記方法。
25. 対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の進行／後退をモニターする方法であって、
    第１の時点で対象から得られた、対象からの第１の生体試料を分析して、前記試料中の、（ａ）表３、４、５、６、７、８、１６、１７、及び１８に挙げられた１つ又は複数のバイオマーカー、（ｂ）１つ又は複数の生体異物、（ｃ）生体異物の１つ又は複数の代謝物、及び（ｄ）それらの組合せから選択される、筋萎縮性側索硬化症に関する１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、
    第２の時点で対象から得られた、対象からの第２の生体試料を分析して、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を判定すること、及び
    前記第１の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、前記第２の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）と比較して、対象のＡＬＳの進行／後退をモニターすること
    を含む上記方法。
26. 前記第１の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）、前記第２の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）、及び／又は前記第１と第２の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）の比較の結果を、前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベルであるＡＬＳ陽性参照レベル、ＡＬＳ陰性参照レベル、ＡＬＳ進行陽性参照レベル、及び／又はＡＬＳ後退陽性参照レベルと比較することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記１つ又は複数のバイオマーカーが表１６、１７、及び１８から選択される、請求項２５に記載の方法。
28. 前記１つ又は複数のバイオマーカーが、０．０５未満のｐ値を有する表１６、１７、及び１８中のバイオマーカー、及び／又は０．１０未満のｑ値を有する表１６、１７、及び１８中のバイオマーカーから選択される、請求項２５に記載の方法。
29. 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置するための組成物の有効性を評価する方法であって、
    筋萎縮性側索硬化症に罹患しており、現在又は以前に組成物で処置されている対象からの生体試料を分析して、（ａ）表３、４、５、６、７、８、１６、１７、及び１８に挙げられた１つ又は複数のバイオマーカー、（ｂ）１つ又は複数の生体異物、（ｃ）生体異物の１つ又は複数の代謝物、及び（ｄ）それらの組合せから選択される、ＡＬＳに関する１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び
    前記試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、（ａ）前記組成物で処置される前に対象から得られた、対象からの事前採取生体試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル、（ｂ）１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性参照レベル、（ｃ）１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陰性参照レベル、（ｄ）１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ進行陽性参照レベル、及び／又は（ｅ）１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ後退陽性参照レベルと比較すること
    を含む上記方法。
30. 前記１つ又は複数のバイオマーカーが表１６、１７、及び１８から選択される、請求項２９に記載の方法。
31. 前記１つ又は複数のバイオマーカーが、０．０５未満のｐ値を有する表１６、１７、及び１８中のバイオマーカー、及び／又は０．１０未満のｑ値を有する表１６、１７、及び１８中のバイオマーカーから選択される、請求項２９に記載の方法。
32. 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置における組成物の有効性を評価する方法であって、
    第１の時点で対象から得られた、対象からの第１の生体試料を分析して、前記第１の試料中の、（ａ）表３、４、５、６、７、８、１６、１７、及び１８に掲げた１つ又は複数のバイオマーカー、（ｂ）１つ又は複数の生体異物、（ｃ）生体異物の１つ又は複数の代謝物、及び（ｄ）それらの組合せから選択される、ＡＬＳに関する１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、
    対象に前記組成物を投与すること、
    前記組成物の投与後、第２の時点で対象から得られた、対象からの第２の生体試料を分析して、１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、
    前記第１の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、前記第２の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）と比較して、筋萎縮性側索硬化症を処置するための組成物の有効性を評価すること
    を含む上記方法。
33. 前記１つ又は複数のバイオマーカーが表１６、１７、及び１８から選択される、請求項３２に記載の方法。
34. 前記１つ又は複数のバイオマーカーが、０．０５未満のｐ値を有する表１６、１７、及び１８中のバイオマーカー、及び／又は０．１０未満のｑ値を有する表１６、１７、及び１８中のバイオマーカーから選択される、請求項３２に記載の方法。
35. 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置するための２つ以上の組成物の相対的有効性を評価する方法であって、
    筋萎縮性側索硬化症に罹患しており、現在又は以前に第１の組成物で処置されている第１の対象からの第１の生体試料を分析して、（ａ）表３、４、５、６、７、８、１６、１７、及び１８に挙げられた１つ又は複数のバイオマーカー、（ｂ）１つ又は複数の生体異物、（ｃ）生体異物の１つ又は複数の代謝物、及び（ｄ）それらの組合せから選択される、ＡＬＳに関する１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、
    ＡＬＳに罹患しており、現在又は以前に第２の組成物で処置されている第２の対象からの第２の生体試料を分析して、前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び
    前記第１の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、前記第２の試料中の前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）と比較して、筋萎縮性側索硬化症を処置するための第１及び第２の組成物の相対的有効性を評価すること
    を含む上記方法。
36. ＡＬＳに罹患しており、現在又は以前に第３の組成物で処置されている第３の対象からの第３の生体試料を分析して、前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び
    第３の試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、第１及び第２の試料中の前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）と比較して、筋萎縮性側索硬化症を処置するための第１、第２、及び第３の組成物の相対的有効性を評価すること
    をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
37. 前記１つ又は複数のバイオマーカーが表１６、１７、及び１８から選択される、請求項３５に記載の方法。
38. 前記１つ又は複数のバイオマーカーが、０．０５未満のｐ値を有する表１６、１７、及び１８中のバイオマーカー、及び／又は０．１０未満のｑ値を有する表１６、１７、及び１８中のバイオマーカーから選択される、請求項３５に記載の方法。
39. 筋萎縮性側索硬化症の１つ又は複数のバイオマーカーの調節における活性に関して組成物をスクリーニングする方法であって、
    １つ又は複数の細胞を組成物と接触させること、
    １つ又は複数の細胞又は前記細胞に関連する生体試料の少なくとも一部を分析して、（ａ）表３、４、５、６、７及び８に掲げた１つ又は複数のバイオマーカー、（ｂ）１つ又は複数の生体異物、（ｃ）生体異物の１つ又は複数の代謝物、及び（ｄ）それらの組合せから選択される、筋萎縮性側索硬化症の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び
    前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、そのバイオマーカーに関する予め決められた標準的なレベルと比較して、前記組成物が前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を調節したかどうかを判定すること
    を含む上記方法。
40. 前記バイオマーカーに関する予め決められた標準レベルが、前記組成物の非存在下での１つ又は複数の細胞における１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）である、請求項３９に記載の方法。
41. 前記バイオマーカーに関する予め決められた標準レベルが、前記組成物と接触しなかった１つ又は複数の対照細胞における１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）である、請求項３９に記載の方法。
42. インビボで実施される、請求項３９に記載の方法。
43. インビトロで実施される、請求項３９に記載の方法。
44. 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に対する可能性のある標的薬剤を同定する方法であって、
    （ａ）表３、４、５、６、７及び８に挙げられた１つ又は複数のバイオマーカー、（ｂ）１つ又は複数の生体異物、（ｃ）生体異物の１つ又は複数の代謝物、及び（ｄ）それらの組合せから選択される、ＡＬＳに関する１つ又は複数のバイオマーカーに関連する１つ又は複数の生化学的経路を同定すること、及び
    前記１つ又は複数の同定された生化学的経路の少なくとも１つに影響を及ぼす、筋萎縮性側索硬化症に対する可能性のある標的薬剤であるタンパク質を同定すること
    を含む上記方法。
45. 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している対象を処置するための方法であって、前記対象に、ＡＬＳに罹患していない対象と比較してＡＬＳに罹患している対象で減少する、表３、４、５、６、７及び８から選択される１つ又は複数のバイオマーカーの有効量を投与することを含む方法。
46. 対象が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患しているか、又は末梢ニューロパシー若しくはミオパシーに罹患しているかどうかを識別する方法であって、
    対象からの生体試料を分析して、前記試料中の、１つ又は複数の生体異物、生体異物の代謝物、及び／又は表１４及び１５に挙げられたバイオマーカーを含む、筋萎縮性側索硬化症に関する１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を決定すること、及び
    前記試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベル（複数可）を、前記１つ又は複数のバイオマーカーのＡＬＳ陽性及び／又はＡＬＳ陰性参照レベルと比較して、対象が、ＡＬＳに罹患しているか、又は末梢ニューロパシー若しくはミオパシーに罹患しているかどうかを判定すること
    を含む上記方法。

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