JP3713074B2 - 血清アミロイドａを認識するモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト血清中のアミロイドＡ（以下、ＳＡＡと省略する）を認識するモノクローナル抗体、ならびにこのモノクローナル抗体の使用に関するものである。
臨床検査等の分野では、物質の測定を簡便に行うために、あるいは高い感度で特異的に測定するためにしばしば免疫学的な測定方法が利用される。免疫学的な測定方法には、抗体が必要である。モノクローナル抗体は、均一な性状を備えた抗体を継続して供給できる点、１度の免疫操作で多量の抗体を得られるので抗原の使用量が少なくて済む点、そしてなによりも高度な特異性を持つ抗体を得やすい等の多くの利点を持っているので免疫学的な測定方法においては欠かすことのできないツールとなっている。また測定のみならず、物質の精製、生理活性や生体内における挙動の研究においてもモノクローナル抗体は重要なツールとなる。
ＳＡＡはある種のアミロイドーシスにおいて組織に沈着するアミロイド蛋白Ａ（以下、ＡＡ蛋白と省略する）の前駆体蛋白とされる、分子量約１２０００の血清蛋白である。（J.Clin.Invest.53:1054-1061,1974）近年になって、このＳＡＡの血清値がアミロイドーシス以外の炎症性疾患で上昇することが明らかにされ、鋭敏な炎症マーカーとして評価されている。（臨床検査32:2,P168,1988）
【０００２】
【従来技術の問題点】
ＳＡＡを認識するモノクローナル抗体については、次のような報告が有る。これらの報告ではＳＡＡを認識するモノクローナル抗体によってＥＬＩＳＡを構成している。
J.Immunol.Methods 144,149-155;1991
Clin.Chem.40/7,1284-1290;1994
【０００３】
ところで一般にＥＬＩＳＡでは十分に使用に耐えるモノクローナル抗体も、凝集法では実用的な性能を示さないことが多い。その理由はラテックスのような担体粒子を利用する方法にしろ、あるいは免疫比濁法のような担体の助けを借りない方法にしろ、用いる抗体には次のような条件が要求されるためである。
【０００４】
条件Ａ：凝集法ではより高い親和性が要求される。
凝集反応を起こし、しかも物理的に安定した凝集塊を維持するには一般にＥＬＩＳＡで要求されるよりも高い水準の親和性が必要である。特にモノクローナル抗体では限られたエピトープに対してのみ反応する抗体分子だけで反応を構成しなければならないので、高度な親和性を持つモノクローナル抗体を用意しなければならないが、従来のモノクローナル抗体はこのような条件を満足するものではなかった。
親和性が不十分なモノクローナル抗体で反応系を構成すると、実用的な感度で分析可能な凝集塊を形成しないので凝集法による測定を行うことはできない。たとえ抗体の使用量を増やして親和性の低さをカバーするとしても、抗原１分子に対して結合できる抗体の数は変わらないので十分な感度は得られない。またラテックスのような担体に抗体を結合して用いるときにも、やはり抗体の結合量に限界があるので、抗体の使用量を増やすという対策では不十分である。
【０００５】
条件Ｂ：ＥＬＩＳＡでは問題とならないエピトープの位置関係が凝集法では障害となることがある
凝集反応では、モノクローナル抗体が認識するエピトープが同一抗原上に複数存在していなければならない。この条件はＥＬＩＳＡサンドイッチ法と同じである。しかし凝集法では先に述べたとおり物理的により強い結合を要求することから、たとえ物理的な位置が異なっていても接近したエピトープのみで反応させることは不利である。立体障害を起こしやすく、結果として安定で大きな凝集塊を得にくくなるためである。
このようにエピトープの選択という観点から見ても、これまでのモノクローナル抗体は凝集法向きではなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ＳＡＡの凝集反応による測定を可能とする新しいモノクローナル抗体の提供である。そしてこのような新規なモノクローナル抗体によって、優れた測定性能を持つＳＡＡの免疫学的測定試薬と、測定方法を合わせて提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の課題は、次の反応性で特徴付けられるヒトＳＡＡを認識するモノクローナル抗体により解決される。
（１）ヒトＳＡＡを認識する
（２）ヒトＳＡＡと反応して凝集する
本発明において、ＳＡＡと反応して凝集するという条件は次のような方法によって確認することができる。もっとも簡単な方法として、モノクローナル抗体とＳＡＡを免疫反応に好適な条件の元で反応させ、免疫複合体が沈降物として生じるかどうかを指標として凝集能を確認する方法を示すことができる。ただしこの方法では増感剤などを組合せない場合は定量的な観察を行うことが困難である。モノクローナル抗体の凝集能を定量的につかむためには、ラテックス凝集反応を利用するとよい。以下にモノクローナル抗体のラテックス凝集反応による凝集能確認方法について説明する。
抗ＳＡＡモノクローナル抗体はポリスチレンラテックス（平均粒径０．１０９μm）に３７℃で１時間物理吸着させた後、最終的にラテックス濃度１%となるように分散媒（１%ＢＳＡを含む０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４）に懸濁させてモノクローナル抗体感作ラテックス乳液とする。この乳液を一定のＳＡＡ濃度を持つ試料と反応させ、生じる凝集を光学的に測定する。光学測定には吸光度変化量や、散乱光変化量を測定する方法が知られている。
以下に吸光度変化量を免疫学的ラテックス凝集反応測定システムＬＡ−２０００（栄研化学・アナリティカルインスツルメント製、商品名）で確認する方法を例示する。測定条件は次のとおりである。この条件によって、反応開始後４００秒間の吸光度変化がＤＯＳとして算出される。この値は、ＬＡ−２０００に固有の値である。
ＳＡＡ濃度 ：３１．５μg/ml
検体量 ：２０μl
乳液量 ：３００μl
吸光度の測定 ：４００秒
この反応条件でまず０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）のみを測定して装置自身の光学的なバラ付きを測定する。更に空試験として同じ緩衝液を検体として試薬ブランクを取る。試薬ブランクの平均値に標準偏差の２倍を加え、更に装置のバラ付き幅を加えた値（試薬ブランク＋２ＳＤ＋光学装置のばらつき幅）を基準として、この基準よりも大きな値を示す時に凝集したと判定できる。同様の試験方法は、ＬＡ−２０００のような専用システムを利用しなくても一般的な吸光光度計で実施することも可能である。
【０００８】
本発明のモノクローナル抗体は、マウス、ラット等を精製ＳＡＡで免疫し、その抗体産生細胞をなんらかの手段で不死化することによって得る事ができる。不死化技術としては、ミエローマのような腫瘍細胞との細胞融合、あるいはエプスタインバールウイルスによる形質転換等が知られている。
細胞融合でハイブリドーマを調製するときには、免疫動物と同じ動物種のミエローマを用いても良いし、あるいは別種の動物に由来するミエローマとの融合によりヘテロ・ハイブリドーマとすることもできる。ＳＡＡはヒト以外の動物でも血清中に観察される蛋白であり、免疫という刺激を与える事により増加する。したがって免疫動物にはそのような現象のない動物、例えばラットを利用すれば抗体価が上昇しやすいので有利である。
免疫原に利用するＳＡＡは、公知の方法によって精製されたものを用いる。具体的には、超遠心分離により原料血清から高比重リポタンパク分画（以下ＨＤＬと省略する）を得、脱脂後イオン交換クロマトグラフィー等で精製することでＳＡＡを純粋な蛋白質として回収することができる。このように高度に精製した蛋白質を用いることは、ＳＡＡに特異的なモノクローナル抗体産生細胞を高い収率で得るために大切な条件である。例えば、超遠心によって得たＨＤＬ分画を精製することなく免疫原として利用した報告もあるが、このような免疫原によって得られる抗体産生細胞は各種アポリポ蛋白質抗原を認識する抗体を産生するものも多く、クローニング等の点で不利となることが予想される。
【０００９】
また精製ＳＡＡを免疫原とするときに、その抗原性を高めるために様々な技術を応用することができる。フロイントのコンプリート・アジュバント（以下、ＦＣＡと省略する）は免疫原性を高めるために必要な成分の一つである。このほか脂質リポソームにＳＡＡを吸着させて免疫原とする方法も有効である。ＳＡＡは多くのほ乳動物がもともと血液中に含んでいる蛋白質であるため、免疫動物に対して抗原性を示しにくいことが指摘されている。これまでに凝集反応に利用できるモノクローナル抗体の報告が無いのは、このＳＡＡの抗原性の低さが原因の一つであると推測される。本発明者らは高度に精製したＳＡＡを用いるとともに、ＳＡＡを各種アジュバント成分と組み合せて特殊な形の免疫原とすることによってＳＡＡの抗原性を高め、新たなモノクローナル抗体を得ることに成功した。本発明のモノクローナルを得るために有用なアジュバント成分には、ＦＣＡに結核菌菌体を添加したものを示すことができる。結核菌はもともとＦＣＡに含まれる成分であるが、これを増強することにより良い結果を得られる。また百日咳ワクチンを免疫時に筋肉注射する事によってより強い免疫効果が期待できる。
【００１０】
こうして得られた本発明のモノクローナル抗体は、ＳＡＡと反応して凝集を起こす新規な特徴を備えている。本発明のモノクローナル抗体は凝集活性に優れ、単独でＳＡＡと反応して凝集を示すものさえ存在する。また好ましい組合せにおいては、単独での使用で得ることのできる凝集よりも更に強い凝集反応を期待することができる。
表１に示したモノクローナル抗体の結合親和性を測定してみたところ、例えば次のような結果を得た。親和定数と凝集活性の強さとの間に特別な関連性は見られず、ＳＡＡに対するモノクローナル抗体の凝集活性は親和性の強さによって単純に推測することができないものと思われた。
クローン１５：８．４×１０7
クローン１６：２．０×１０8
クローン１７：１．０×１０7
クローン１８：８．５×１０7
更に、本発明者らが実際に得たモノクローナル抗体は、エピトープとしてたとえば図３に示すような領域を認識していたが、エピトープと凝集活性の間には一定の関係を見出すことができなかった。なお図３に示したエピトープは、表１に記載したモノクローナルの代表的なものについて分析した結果である。
したがってＳＡＡを認識するモノクローナル抗体においては、エピトープのみによって凝集活性を予測することは困難なものと推定される。なお本明細書においては次のようなアミノ酸の略号を利用する。
アラニン A or Ala
アルギニン R or Arg
アスパラギン N or Asn
アスパラギン酸 D or Asp
システイン C or Cys
グルタミン Q or Gln
グルタミン酸 E or Glu
グリシン G or Gly
ヒスチジン H or His
イソロイシン I or Ile
ロイシン L or Leu
リジン K or Lys
メチオニン M or Met
フェニルアラニン F or Phe
プロリン P or Pro
セリン S or Ser
トレオニン T or Thr
トリプトファン W or Trp
チロシン Y or Tyr
バリン V or Val
【００１１】
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、特許微生物寄託センターに次のような受託番号で寄託されている。
ＦＥＲＭ Ｐ−１５０８８（ハイブリドーマＳＡＡ−７）
ＦＥＲＭ ＢＰ−５６１６（ハイブリドーマＳＡＡ−１７）
ＦＥＲＭ ＢＰ−５６１７（ハイブリドーマＳＡＡ−２１）
ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９３（ハイブリドーマＳＡＡ−２２）
これらのハイブリドーマは、ラットを先に述べたような方法で免疫して抗体産生細胞を回収し、マウスミエローマ細胞と細胞融合させることによって確立したラット−マウスヘテロハイブリドーマである。これらのハイブリドーマは、ヌードマウスの腹腔に接種すれば腹水を回収してモノクローナル抗体を精製することができる。また適当な培地で培養すれば、培養上清を回収してモノクローナル抗体を精製することも可能である。
【００１２】
更に本発明は、次の反応性で特徴付けられるヒトＳＡＡを認識するモノクローナル抗体を含むＳＡＡの免疫学的測定試薬を提供する。
（１）ヒト血清アミロイドＡの抗原決定基を認識する
（２）ヒト血清アミロイドＡと反応して凝集する
【００１３】
本発明のモノクローナル抗体は、複数のモノクローナル抗体を組合せた場合にには先に述べたように組み合わせによって凝集特性に違いが存在する。したがってこのモノクローナル抗体を試薬として利用するときには、期待する感度や測定範囲を容易に実現できるように適当な組み合わせを経験的に選択すると良い。組み合わせるモノクローナル抗体の数は、２種類に限定されるものではなく更に多種類のモノクローナル抗体を組み合わせることも可能である。３種類以上のモノクローナル抗体の組み合わせによって、より安定で強い結合を持つ凝集塊の形成を期待できる。あるいはまた、組み合わせと混合比により凝集の強度や定量範囲をコントロールすることも可能である。
複数のモノクローナル抗体を粒子担体に結合して本発明の試薬を構成するときには、それぞれ単一種のモノクローナル抗体を粒子担体に結合後に混合する方法と、あらかじめ複数種のモノクローナル抗体を混合したものを粒子担体に結合する方法のいずれもが採用できる。前者の方法によれば、クローン間の微妙な結合条件の違いに対応することができ、また抗体の混合比の調整などが容易となるので有利である。
【００１４】
本発明の免疫学的測定試薬においては、モノクローナル抗体が遊離の状態で用いられても良いしあるいは不溶性担体に結合していてもよい。好ましい不溶性担体には、ラテックス等の有機合成素材、シリカ、アルミナ、金コロイド等の無機素材からなる粒子状担体を挙げることができる。これらの粒子状担体へモノクローナル抗体を結合するには、化学結合や物理吸着を利用できる。
【００１５】
本発明の試薬を構成するモノクローナル抗体は、リウマチ因子や補体による非特異的な影響を抑制することを目的として適当な酵素で消化した断片として用いることもできる。抗体断片としては、ペプシンによるＦ（ａｂ’）２、パパインによるＦａｂ、プラスミンによるＦａｃｂ’等が知られている。
【００１６】
本発明のＳＡＡの免疫学的測定試薬には、この他に公知の成分を組合せることができる。すなわち、免疫反応に必要なｐＨを与える緩衝剤、免疫反応を促進する反応増強剤、非特異反応を抑制する反応安定剤やブロッカー、試薬の保存性を高めるアジ化ナトリウムのような防腐剤等を組合せても良い。
【００１７】
緩衝剤としては、次のようなものが利用されている。
ＧＯＯＤ緩衝剤
２−モルホリノエタンスルホン酸（2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid、ＭＥＳと省略する）
ピペラジン−ビス（２−エタンスルホン酸）（Piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)、ＰＩＰＥＳと省略する）
（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid、ＡＣＥＳと省略する）
ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoehtanesulfonic acid、ＢＥＳと省略する）
ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓと省略する）
３−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（3-[N,N-Bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid、ＤＩＰＳＯと省略する）
２−ヒドロキシエチルピペラジン−３−プロパンスルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-3-propanesulfonic acid、ＥＰＰＳと省略する）
ヒドロキシエチルピペラジン−２−エタンスルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid 、ＨＥＰＥＳと省略する）
２−ヒドロキシエチルピペラジン−２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-hydroxypropane-3-sulfonic acid、ＨＥＰＰＳＯと省略する）
３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸（3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid、ＭＯＰＳと省略する）
３−（モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid 、ＭＯＰＳＯと省略する）
ピペラジン−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（Pioerazine-N,N'-bis(2-hydroxypropanesulfonic acid)、ＰＯＰＳＯと省略する）
N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid 、ＴＡＰＳと省略する）
トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid、ＴＡＰＳＯと省略する）
トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid、ＴＥＳと省略する）
その他の緩衝剤
２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１、３−プロパンジオール（2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol）
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）とも呼ばれる
リン酸緩衝液
アンモニウム緩衝液
これらの緩衝剤の中でも、ＨＥＰＥＳやＰＩＰＥＳ等のＧＯＯＤ緩衝剤は、免疫反応に有利なｐＨを与えるのみならず、蛋白質への影響が小さいので特に好ましい緩衝剤として挙げられる。
【００１８】
また反応増強剤としては、ポリエチレングリコールや硫酸デキストラン等が知られている。更に反応安定剤やブロッカーとしては、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、動物血清、ＩｇＧ、ＩｇＧ断片（ＦａｂやＦｃ）、アルブミン、乳蛋白、アミノ酸、ポリアミノ酸、コリン、ショ糖等の多糖類、ゼラチン、ゼラチン分解物、カゼイン、グリセリン等の多価アルコール等が免疫反応において反応の安定化や非特異反応の抑止に有効なことが知られている。
【００１９】
これらの各種成分を含む本発明によるＳＡＡの免疫学的測定試薬は、溶液状態で、あるいは乾燥状態で供給することができる。溶液状態で流通させるには、蛋白の安定性を高めることを目的として、更に各種界面活性剤、糖、不活性蛋白等を加えても良い。これらの安定化剤は、試薬を乾燥するときにも安定剤として、あるいは賦形剤として有効である。
【００２０】
本発明によるＳＡＡの免疫学的測定は、先に述べたＳＡＡの免疫学的測定試薬により実現する。試薬が凝集反応用のものであれば、凝集反応の進行を光学的に、もしくは肉眼によって追跡する事によって行う事ができる。
【００２１】
【作用】
本発明のモノクローナル抗体は、凝集反応による免疫学的測定を可能にする。これまでに知られていたＳＡＡに対するモノクローナル抗体は、凝集反応を構成するには親和性が不十分なためＥＬＩＳＡ法のような限られた測定方法に用途が限定されていた。本発明のモノクローナル抗体は、ＳＡＡと反応して凝集するという新しい特徴を持つ。この特徴によって簡便性に優れる凝集反応に基づいたＳＡＡの測定方法を提供することができるのである。
【００２２】
【発明の効果】
本発明の新規なモノクローナル抗体の提供によって、ＳＡＡの凝集反応を使った免疫学的測定方法の特異性が向上し、試薬品質の安定化にも貢献する。これまでは特異性を得にくいうえ、均一な品質の維持が困難なポリクローナル抗体に頼らざるをえなかったＳＡＡの凝集反応に基づく免疫学的な測定を、モノクローナル抗体によって実現できるのである。しかも本発明のモノクローナル抗体は、ＳＡＡと反応して強く凝集し十分な感度と測定範囲を実現する。
【００２３】
【実施例】
１．ＳＡＡ免疫原の調製
１−１．ＳＡＡの精製
ＳＡＡ高値血清（１００μg/ml）１L を出発原料とし、まず超遠心法により比重１．２３の上層部を採取、次いで比重１．０６３の下層部を採取し、冷却下メタノール／エーテル (１：３）で脱脂後、セファデックスＧ−２００カラム（６M 尿素、０．５%Tween ２０を含む０．０１M トリス−塩酸緩衝液ｐＨ ８．６で平衡化）にアプライし、更にブロムシアンで活性化したセファロース４Ｂ（ファルマシア） に常法により、 抗ＡｐｏＡ−I抗体、抗ＡｐｏＣIII抗体、および抗ヒト血清アルブミン抗体を結合させたカラムに通して夾雑蛋白を除去し、１Lの血清より精製ＳＡＡ３０mgが得られた。 精製ＳＡＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量１２０００の位置に単一のバンドを示し、他のアポリポ蛋白抗体とは反応しなかった。また、アミノ酸配列はＮ末端からSer Phe Phe Ser PheLeu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr であり、データベース検索から、ダウレット他の報告（Biochem.27:P1677,1988 ）によるＮ末端のArg を欠いたformII, IVと同一であることがわかった。
【００２４】
２．モノクローナル抗体
２−１．ラットの免疫
１で精製したＳＡＡ１００μg/頭と人型結核菌４mg/mlを加えたＦＣＡで常法によりエマルジョンを作製し、９週齢のＷＫＡＨ／ＨＫｍラットのメスに免疫した。同時に沈降精製百日咳ジフテリア破傷風混合ワクチン（武田薬品工業製）１００μl/頭を左後肢腿に筋肉注射した。
この後３週おきにＳＡＡ５０μg/頭をＦＣＡと常法によりエマルジョンとしたものを免疫原として腹腔内注射し、定期的に採血してＥＬＩＳＡで抗体価を測定した。ＥＬＩＳＡの操作は次のとおりである。
【００２５】
２−２．ＳＡＡ抗体のＥＬＩＳＡ
抗体価の測定と抗原特異的抗体活性の確認は、ＥＬＩＳＡで行った。ブロック、コンジュゲート希釈、血清希釈には１%のＢＳＡを加えた０．１５MのＮａＣｌを含む２０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、以下ＢＳＡ−ＰＢＳと省略する）を用いた。
精製ＳＡＡを１０μg/mlとなるように２０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、以下ＰＢＳと省略する）に溶解し住友ベークライトメディカル社製６０穴テラサキプレート（ＭＳ−３１６００）に１０μl/well入れ３７℃で２時間感作し、ＰＢＳで洗浄後１%ＢＳＡ−ＰＢＳを１０μl/well入れ、３７℃で２時間ブロックし、４℃で保存する。
プレートをＰＢＳで１回洗浄後、抗体活性を調べようとする検体１０μlをテラサキプレートに採り３７℃で３０分インキュベートした。このプレートをＰＢＳで３回洗浄し、１%ＢＳＡ−ＰＢＳで１０，０００倍に希釈した市販の抗ラットＩｇＧ−ＰＯＤコンジュゲート（Ｃａｐｐｅｌ社製）１０μlを入れ、３７℃３０分インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄後、ＯＰＤと過酸化水素を含む基質液１０μlを加え３７℃で３０分インキュベートして発色を測定した。陰性対照として１%ＢＳＡ−ＰＢＳを、陽性対照として１０2に希釈した免疫ラット血清１０μlを用意し、検体にかえて同じ操作を行った。
【００２６】
２−３．細胞融合とクローニング
ＥＬＩＳＡによる抗体価が１０4に上昇したことを確認したところで、生理食塩水に溶解したＳＡＡ５０μgを腹腔内注射し３日後に脾臓を摘出した。 脾細胞を採取してＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、マウスミエローマ細胞Ｘ−６３−Ａｇ８−６５３とポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと省略する）法によって細胞融合させた。融合条件は次のとおりである。すなわち、脾細胞：ミエローマ細胞が３：１となるように遠心管に分注し、５０%ＰＥＧ溶液１mlを加え、更に加温した５０mlのＲＰＭＩ１６４０をゆっくり加えてＰＥＧを希釈した。次いで遠心してＰＥＧを除き、脾細胞として７．１×１０5/wellとなるようにＨＡＴ培地に分散し、これを９６穴プレートにプレーティングした。
ＨＡＴセレクション後にほとんどのウエルでコロニーが観察された。各ウエルの培養上清はＰＯＤ標識抗ラットIｇＧ抗体を用いてＥＬＩＳＡでスクリーニングし、発色した３０ウエルからクローニングを始め、３回から４回の限界希釈法によるクローニングを行い、最終的にＳＡＡとの反応性を示すＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を産生する１３クローンを確立した。マウスを用いた方法、あるいはラットを用いても従来の免疫法ではこのように多くのクローンを安定して確立することは困難であったが、今回採用した免疫法では同時に多くのクローンを得ることができた。この１３クローンを以下の反応性の確認に用いた。
【００２７】
３．モノクローナル抗体による試薬の調製
２で得たハイブリドーマ１３クローンを、それぞれプリスタン処理したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ）の腹腔に接種し２週間後腹水を採集した。この腹水を遠心（３０００rpm、５分）後、上清から硫安分画によってモノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿を回収してＰＢＳに溶解し、同じＰＢＳに対して透析し抗ＳＡＡモノクローナル抗体（１０mg/ml）とした。用いたモノクローナル抗体のサブクラスは以下のとおりである。サブクラスは、Ｂｅｔｈｙｌ社製抗ラットサブクラス抗血清と培養上清とのオクテロニー法で決定した。
クローン ３：ＩｇＧ２ａ
クローン ６：ＩｇＧ２ｂ
クローン ７：ＩｇＧ２ａ
クローン１４：ＩｇＧ２ｃ
クローン１５：ＩｇＧ２ａ
クローン１６：ＩｇＧ２ａ
クローン１７：ＩｇＧ１
クローン１８：ＩｇＧ２ａ
クローン２０：ＩｇＧ２ａ
クローン２１：ＩｇＧ２ａ
クローン２２：ＩｇＧ２ａ
クローン２５：ＩｇＧ２ａ
クローン２７：ＩｇＧ２ａ
【００２８】
各抗ＳＡＡモノクローナル抗体をポリスチレンラテックス（平均粒径０．１０９μm）に３７℃で１時間物理吸着させ、最終的にラテックス濃度１%となるように分散媒（１%ＢＳＡを含む０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４）に懸濁させて１３種類のＳＡＡラテックス凝集反応用試薬（以下単に乳液と呼ぶ）を得た。
【００２９】
４．モノクローナル抗体の反応性
３で得た各乳液を単独あるいは２種づつを等量混合し、合計９１種類の試薬を調製し、これをＳＡＡと反応させることによって凝集の有無を観察した。凝集反応は吸光度分析による免疫学的ラテックス凝集反応測定システムＬＡ−２０００（栄研化学・アナリティカルインスツルメント製、商品名）で確認した。測定条件は次のとおりである。この条件によって、反応開始後４００秒間の吸光度の差がＤＯＳとして算出される。この値は、ＬＡ−２０００に固有の値である。結果は表１に示した。
ＳＡＡ濃度 ：３１．５μg/ml
検体量 ：２０μl
乳液量 ：３００μl
吸光度の測定 ：４００秒
【００３０】
【表１】
【００３１】
各組合わせのＤＯＳを表にした。表中、１クローンのみの反応（対角線上に位置する）は点線で囲い、ＤＯＳが単独の乳液でのＤＯＳの１／２の和より１０%以上高い（凝集が混合で促進されている）組合わせは斜体で示した。この結果から、単独でも凝集を示すモノクローナル抗体を得たことが確認できた（クローン１７や２１）。また２つのモノクローナル抗体を組み合わせる（つまり乳液を混合する）ことによって、単独の乳液より強い凝集の見られる組み合わせが多数観察された。組み合わせによって凝集を増強するパターンを示す組み合わせの中には、単独では凝集しないものの、特定のモノクローナル抗体と組み合わせることよって非常に強力な凝集能を持つようになる場合も観察された。たとえばクローン７はクローン３やクローン２１と、またクローン２１はクローン１７等と組み合わせた時に大きな凝集能を示している。特に強い凝集が観察されたものを実線で囲んで示した。
他方、混合することによって単独の場合よりも凝集が弱くなるケース（表中で下線で示した）も多く観察され、単に複数種のモノクローナル抗体を組み合わるだけでは凝集の強化にはつながらないことが確認された。
なお凝集能の有無は次の基準によって判断した。まず、０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）のみを測定して装置自身の光学的なバラ付きを測定する（２０）。更に空試験として同じ緩衝液を検体として試薬ブランクを取る（−１１〜＋１０）。試薬ブランクの平均値（０．９３）に標準偏差（２．９３）の２倍を加え、更に装置のバラ付き幅を加えた値（試薬ブランク＋２ＳＤ＋光学装置のばらつき幅）を基準として、この基準よりも大きな値を示す時に凝集したと判断した。今回の実験では、この値は２７である。したがって表中の数値が２７を越えているものは、凝集していると判断できる。
【００３２】
５．複数のモノクローナル抗体の組み合わせ
４で得た２種類の組み合わせの結果を参考にして、３種類以上の組み合わせについても凝集活性を調査した。表１に示したクローンＮｏ．のうち、７、１７、２１、および２２の各モノクローナル抗体で個別に調製した乳液を用意し、これをいろいろな割合で混合して複数種のモノクローナル抗体からなるＳＡＡの凝集反応用試薬を作成した。この複数のモノクローナル抗体からなる乳液を用いて、４と同じ操作により様々な濃度のＳＡＡ含有血清試料を測定した。そして、ポリクローナル抗体によって調製した公知のＳＡＡ測定用ラテックス凝集反応試薬(Ann.Clin.Biochem.1993;30:72-76)による測定値との相関を調査した。結果は図１、および図２に示した。
図に示したように、例として示したモノクローナル抗体の組み合わせではいずれもポリクローナル抗体による測定値と高い相関を示した。このように本発明のモノクローナルを利用すれば、モノクローナル抗体の高い特異性を維持しながら、しかもポリクローナル抗体に匹敵する凝集活性を備えた免疫学的測定試薬の提供が可能である。いくつか示したモノクローナル抗体の組み合わせの中で、もっともポリクローナル抗体による測定値との相関が高かったのは、１７：２１：７：２２＝１：１：１：１混合の場合であった。（図１）
【図面の簡単な説明】
【図１】複数種のモノクローナル抗体で調製した乳液による測定値（μg/ml、縦軸）と、ポリクローナル抗体で調製した乳液による測定値（μg/ml、横軸）の相関図
【図２】複数種のモノクローナル抗体で調製した乳液による測定値（μg/ml、縦軸）と、ポリクローナル抗体で調製した乳液による測定値（μg/ml、横軸）の相関図
【図３】表１に示したモノクローナル抗体が認識するエピトープをＳＡＡのアミノ酸配列にマッピングした図。
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト血清中のアミロイドＡ（以下、ＳＡＡと省略する）を認識するモノクローナル抗体、ならびにこのモノクローナル抗体の使用に関するものである。
臨床検査等の分野では、物質の測定を簡便に行うために、あるいは高い感度で特異的に測定するためにしばしば免疫学的な測定方法が利用される。免疫学的な測定方法には、抗体が必要である。モノクローナル抗体は、均一な性状を備えた抗体を継続して供給できる点、１度の免疫操作で多量の抗体を得られるので抗原の使用量が少なくて済む点、そしてなによりも高度な特異性を持つ抗体を得やすい等の多くの利点を持っているので免疫学的な測定方法においては欠かすことのできないツールとなっている。また測定のみならず、物質の精製、生理活性や生体内における挙動の研究においてもモノクローナル抗体は重要なツールとなる。
ＳＡＡはある種のアミロイドーシスにおいて組織に沈着するアミロイド蛋白Ａ（以下、ＡＡ蛋白と省略する）の前駆体蛋白とされる、分子量約１２０００の血清蛋白である。（J.Clin.Invest.53:1054-1061,1974）近年になって、このＳＡＡの血清値がアミロイドーシス以外の炎症性疾患で上昇することが明らかにされ、鋭敏な炎症マーカーとして評価されている。（臨床検査32:2,P168,1988）
【０００２】
【従来技術の問題点】
ＳＡＡを認識するモノクローナル抗体については、次のような報告が有る。これらの報告ではＳＡＡを認識するモノクローナル抗体によってＥＬＩＳＡを構成している。
J.Immunol.Methods 144,149-155;1991
Clin.Chem.40/7,1284-1290;1994
【０００３】
ところで一般にＥＬＩＳＡでは十分に使用に耐えるモノクローナル抗体も、凝集法では実用的な性能を示さないことが多い。その理由はラテックスのような担体粒子を利用する方法にしろ、あるいは免疫比濁法のような担体の助けを借りない方法にしろ、用いる抗体には次のような条件が要求されるためである。
【０００４】
条件Ａ：凝集法ではより高い親和性が要求される。
凝集反応を起こし、しかも物理的に安定した凝集塊を維持するには一般にＥＬＩＳＡで要求されるよりも高い水準の親和性が必要である。特にモノクローナル抗体では限られたエピトープに対してのみ反応する抗体分子だけで反応を構成しなければならないので、高度な親和性を持つモノクローナル抗体を用意しなければならないが、従来のモノクローナル抗体はこのような条件を満足するものではなかった。
親和性が不十分なモノクローナル抗体で反応系を構成すると、実用的な感度で分析可能な凝集塊を形成しないので凝集法による測定を行うことはできない。たとえ抗体の使用量を増やして親和性の低さをカバーするとしても、抗原１分子に対して結合できる抗体の数は変わらないので十分な感度は得られない。またラテックスのような担体に抗体を結合して用いるときにも、やはり抗体の結合量に限界があるので、抗体の使用量を増やすという対策では不十分である。
【０００５】
条件Ｂ：ＥＬＩＳＡでは問題とならないエピトープの位置関係が凝集法では障害となることがある
凝集反応では、モノクローナル抗体が認識するエピトープが同一抗原上に複数存在していなければならない。この条件はＥＬＩＳＡサンドイッチ法と同じである。しかし凝集法では先に述べたとおり物理的により強い結合を要求することから、たとえ物理的な位置が異なっていても接近したエピトープのみで反応させることは不利である。立体障害を起こしやすく、結果として安定で大きな凝集塊を得にくくなるためである。
このようにエピトープの選択という観点から見ても、これまでのモノクローナル抗体は凝集法向きではなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ＳＡＡの凝集反応による測定を可能とする新しいモノクローナル抗体の提供である。そしてこのような新規なモノクローナル抗体によって、優れた測定性能を持つＳＡＡの免疫学的測定試薬と、測定方法を合わせて提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の課題は、次の反応性で特徴付けられるヒトＳＡＡを認識するモノクローナル抗体により解決される。
（１）ヒトＳＡＡを認識する
（２）ヒトＳＡＡと反応して凝集する
本発明において、ＳＡＡと反応して凝集するという条件は次のような方法によって確認することができる。もっとも簡単な方法として、モノクローナル抗体とＳＡＡを免疫反応に好適な条件の元で反応させ、免疫複合体が沈降物として生じるかどうかを指標として凝集能を確認する方法を示すことができる。ただしこの方法では増感剤などを組合せない場合は定量的な観察を行うことが困難である。モノクローナル抗体の凝集能を定量的につかむためには、ラテックス凝集反応を利用するとよい。以下にモノクローナル抗体のラテックス凝集反応による凝集能確認方法について説明する。
抗ＳＡＡモノクローナル抗体はポリスチレンラテックス（平均粒径０．１０９μm）に３７℃で１時間物理吸着させた後、最終的にラテックス濃度１%となるように分散媒（１%ＢＳＡを含む０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４）に懸濁させてモノクローナル抗体感作ラテックス乳液とする。この乳液を一定のＳＡＡ濃度を持つ試料と反応させ、生じる凝集を光学的に測定する。光学測定には吸光度変化量や、散乱光変化量を測定する方法が知られている。
以下に吸光度変化量を免疫学的ラテックス凝集反応測定システムＬＡ−２０００（栄研化学・アナリティカルインスツルメント製、商品名）で確認する方法を例示する。測定条件は次のとおりである。この条件によって、反応開始後４００秒間の吸光度変化がＤＯＳとして算出される。この値は、ＬＡ−２０００に固有の値である。
ＳＡＡ濃度 ：３１．５μg/ml
検体量 ：２０μl
乳液量 ：３００μl
吸光度の測定 ：４００秒
この反応条件でまず０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）のみを測定して装置自身の光学的なバラ付きを測定する。更に空試験として同じ緩衝液を検体として試薬ブランクを取る。試薬ブランクの平均値に標準偏差の２倍を加え、更に装置のバラ付き幅を加えた値（試薬ブランク＋２ＳＤ＋光学装置のばらつき幅）を基準として、この基準よりも大きな値を示す時に凝集したと判定できる。同様の試験方法は、ＬＡ−２０００のような専用システムを利用しなくても一般的な吸光光度計で実施することも可能である。
【０００８】
本発明のモノクローナル抗体は、マウス、ラット等を精製ＳＡＡで免疫し、その抗体産生細胞をなんらかの手段で不死化することによって得る事ができる。不死化技術としては、ミエローマのような腫瘍細胞との細胞融合、あるいはエプスタインバールウイルスによる形質転換等が知られている。
細胞融合でハイブリドーマを調製するときには、免疫動物と同じ動物種のミエローマを用いても良いし、あるいは別種の動物に由来するミエローマとの融合によりヘテロ・ハイブリドーマとすることもできる。ＳＡＡはヒト以外の動物でも血清中に観察される蛋白であり、免疫という刺激を与える事により増加する。したがって免疫動物にはそのような現象のない動物、例えばラットを利用すれば抗体価が上昇しやすいので有利である。
免疫原に利用するＳＡＡは、公知の方法によって精製されたものを用いる。具体的には、超遠心分離により原料血清から高比重リポタンパク分画（以下ＨＤＬと省略する）を得、脱脂後イオン交換クロマトグラフィー等で精製することでＳＡＡを純粋な蛋白質として回収することができる。このように高度に精製した蛋白質を用いることは、ＳＡＡに特異的なモノクローナル抗体産生細胞を高い収率で得るために大切な条件である。例えば、超遠心によって得たＨＤＬ分画を精製することなく免疫原として利用した報告もあるが、このような免疫原によって得られる抗体産生細胞は各種アポリポ蛋白質抗原を認識する抗体を産生するものも多く、クローニング等の点で不利となることが予想される。
【０００９】
また精製ＳＡＡを免疫原とするときに、その抗原性を高めるために様々な技術を応用することができる。フロイントのコンプリート・アジュバント（以下、ＦＣＡと省略する）は免疫原性を高めるために必要な成分の一つである。このほか脂質リポソームにＳＡＡを吸着させて免疫原とする方法も有効である。ＳＡＡは多くのほ乳動物がもともと血液中に含んでいる蛋白質であるため、免疫動物に対して抗原性を示しにくいことが指摘されている。これまでに凝集反応に利用できるモノクローナル抗体の報告が無いのは、このＳＡＡの抗原性の低さが原因の一つであると推測される。本発明者らは高度に精製したＳＡＡを用いるとともに、ＳＡＡを各種アジュバント成分と組み合せて特殊な形の免疫原とすることによってＳＡＡの抗原性を高め、新たなモノクローナル抗体を得ることに成功した。本発明のモノクローナルを得るために有用なアジュバント成分には、ＦＣＡに結核菌菌体を添加したものを示すことができる。結核菌はもともとＦＣＡに含まれる成分であるが、これを増強することにより良い結果を得られる。また百日咳ワクチンを免疫時に筋肉注射する事によってより強い免疫効果が期待できる。
【００１０】
こうして得られた本発明のモノクローナル抗体は、ＳＡＡと反応して凝集を起こす新規な特徴を備えている。本発明のモノクローナル抗体は凝集活性に優れ、単独でＳＡＡと反応して凝集を示すものさえ存在する。また好ましい組合せにおいては、単独での使用で得ることのできる凝集よりも更に強い凝集反応を期待することができる。
表１に示したモノクローナル抗体の結合親和性を測定してみたところ、例えば次のような結果を得た。親和定数と凝集活性の強さとの間に特別な関連性は見られず、ＳＡＡに対するモノクローナル抗体の凝集活性は親和性の強さによって単純に推測することができないものと思われた。
クローン１５：８．４×１０7
クローン１６：２．０×１０8
クローン１７：１．０×１０7
クローン１８：８．５×１０7
更に、本発明者らが実際に得たモノクローナル抗体は、エピトープとしてたとえば図３に示すような領域を認識していたが、エピトープと凝集活性の間には一定の関係を見出すことができなかった。なお図３に示したエピトープは、表１に記載したモノクローナルの代表的なものについて分析した結果である。
したがってＳＡＡを認識するモノクローナル抗体においては、エピトープのみによって凝集活性を予測することは困難なものと推定される。なお本明細書においては次のようなアミノ酸の略号を利用する。
アラニン A or Ala
アルギニン R or Arg
アスパラギン N or Asn
アスパラギン酸 D or Asp
システイン C or Cys
グルタミン Q or Gln
グルタミン酸 E or Glu
グリシン G or Gly
ヒスチジン H or His
イソロイシン I or Ile
ロイシン L or Leu
リジン K or Lys
メチオニン M or Met
フェニルアラニン F or Phe
プロリン P or Pro
セリン S or Ser
トレオニン T or Thr
トリプトファン W or Trp
チロシン Y or Tyr
バリン V or Val
【００１１】
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、特許微生物寄託センターに次のような受託番号で寄託されている。
ＦＥＲＭ Ｐ−１５０８８（ハイブリドーマＳＡＡ−７）
ＦＥＲＭ ＢＰ−５６１６（ハイブリドーマＳＡＡ−１７）
ＦＥＲＭ ＢＰ−５６１７（ハイブリドーマＳＡＡ−２１）
ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９３（ハイブリドーマＳＡＡ−２２）
これらのハイブリドーマは、ラットを先に述べたような方法で免疫して抗体産生細胞を回収し、マウスミエローマ細胞と細胞融合させることによって確立したラット−マウスヘテロハイブリドーマである。これらのハイブリドーマは、ヌードマウスの腹腔に接種すれば腹水を回収してモノクローナル抗体を精製することができる。また適当な培地で培養すれば、培養上清を回収してモノクローナル抗体を精製することも可能である。
【００１２】
更に本発明は、次の反応性で特徴付けられるヒトＳＡＡを認識するモノクローナル抗体を含むＳＡＡの免疫学的測定試薬を提供する。
（１）ヒト血清アミロイドＡの抗原決定基を認識する
（２）ヒト血清アミロイドＡと反応して凝集する
【００１３】
本発明のモノクローナル抗体は、複数のモノクローナル抗体を組合せた場合にには先に述べたように組み合わせによって凝集特性に違いが存在する。したがってこのモノクローナル抗体を試薬として利用するときには、期待する感度や測定範囲を容易に実現できるように適当な組み合わせを経験的に選択すると良い。組み合わせるモノクローナル抗体の数は、２種類に限定されるものではなく更に多種類のモノクローナル抗体を組み合わせることも可能である。３種類以上のモノクローナル抗体の組み合わせによって、より安定で強い結合を持つ凝集塊の形成を期待できる。あるいはまた、組み合わせと混合比により凝集の強度や定量範囲をコントロールすることも可能である。
複数のモノクローナル抗体を粒子担体に結合して本発明の試薬を構成するときには、それぞれ単一種のモノクローナル抗体を粒子担体に結合後に混合する方法と、あらかじめ複数種のモノクローナル抗体を混合したものを粒子担体に結合する方法のいずれもが採用できる。前者の方法によれば、クローン間の微妙な結合条件の違いに対応することができ、また抗体の混合比の調整などが容易となるので有利である。
【００１４】
本発明の免疫学的測定試薬においては、モノクローナル抗体が遊離の状態で用いられても良いしあるいは不溶性担体に結合していてもよい。好ましい不溶性担体には、ラテックス等の有機合成素材、シリカ、アルミナ、金コロイド等の無機素材からなる粒子状担体を挙げることができる。これらの粒子状担体へモノクローナル抗体を結合するには、化学結合や物理吸着を利用できる。
【００１５】
本発明の試薬を構成するモノクローナル抗体は、リウマチ因子や補体による非特異的な影響を抑制することを目的として適当な酵素で消化した断片として用いることもできる。抗体断片としては、ペプシンによるＦ（ａｂ’）２、パパインによるＦａｂ、プラスミンによるＦａｃｂ’等が知られている。
【００１６】
本発明のＳＡＡの免疫学的測定試薬には、この他に公知の成分を組合せることができる。すなわち、免疫反応に必要なｐＨを与える緩衝剤、免疫反応を促進する反応増強剤、非特異反応を抑制する反応安定剤やブロッカー、試薬の保存性を高めるアジ化ナトリウムのような防腐剤等を組合せても良い。
【００１７】
緩衝剤としては、次のようなものが利用されている。
ＧＯＯＤ緩衝剤
２−モルホリノエタンスルホン酸（2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid、ＭＥＳと省略する）
ピペラジン−ビス（２−エタンスルホン酸）（Piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)、ＰＩＰＥＳと省略する）
（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid、ＡＣＥＳと省略する）
ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoehtanesulfonic acid、ＢＥＳと省略する）
ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓと省略する）
３−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（3-[N,N-Bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid、ＤＩＰＳＯと省略する）
２−ヒドロキシエチルピペラジン−３−プロパンスルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-3-propanesulfonic acid、ＥＰＰＳと省略する）
ヒドロキシエチルピペラジン−２−エタンスルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid 、ＨＥＰＥＳと省略する）
２−ヒドロキシエチルピペラジン−２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-hydroxypropane-3-sulfonic acid、ＨＥＰＰＳＯと省略する）
３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸（3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid、ＭＯＰＳと省略する）
３−（モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid 、ＭＯＰＳＯと省略する）
ピペラジン−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（Pioerazine-N,N'-bis(2-hydroxypropanesulfonic acid)、ＰＯＰＳＯと省略する）
N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid 、ＴＡＰＳと省略する）
トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid、ＴＡＰＳＯと省略する）
トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid、ＴＥＳと省略する）
その他の緩衝剤
２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１、３−プロパンジオール（2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol）
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）とも呼ばれる
リン酸緩衝液
アンモニウム緩衝液
これらの緩衝剤の中でも、ＨＥＰＥＳやＰＩＰＥＳ等のＧＯＯＤ緩衝剤は、免疫反応に有利なｐＨを与えるのみならず、蛋白質への影響が小さいので特に好ましい緩衝剤として挙げられる。
【００１８】
また反応増強剤としては、ポリエチレングリコールや硫酸デキストラン等が知られている。更に反応安定剤やブロッカーとしては、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、動物血清、ＩｇＧ、ＩｇＧ断片（ＦａｂやＦｃ）、アルブミン、乳蛋白、アミノ酸、ポリアミノ酸、コリン、ショ糖等の多糖類、ゼラチン、ゼラチン分解物、カゼイン、グリセリン等の多価アルコール等が免疫反応において反応の安定化や非特異反応の抑止に有効なことが知られている。
【００１９】
これらの各種成分を含む本発明によるＳＡＡの免疫学的測定試薬は、溶液状態で、あるいは乾燥状態で供給することができる。溶液状態で流通させるには、蛋白の安定性を高めることを目的として、更に各種界面活性剤、糖、不活性蛋白等を加えても良い。これらの安定化剤は、試薬を乾燥するときにも安定剤として、あるいは賦形剤として有効である。
【００２０】
本発明によるＳＡＡの免疫学的測定は、先に述べたＳＡＡの免疫学的測定試薬により実現する。試薬が凝集反応用のものであれば、凝集反応の進行を光学的に、もしくは肉眼によって追跡する事によって行う事ができる。
【００２１】
【作用】
本発明のモノクローナル抗体は、凝集反応による免疫学的測定を可能にする。これまでに知られていたＳＡＡに対するモノクローナル抗体は、凝集反応を構成するには親和性が不十分なためＥＬＩＳＡ法のような限られた測定方法に用途が限定されていた。本発明のモノクローナル抗体は、ＳＡＡと反応して凝集するという新しい特徴を持つ。この特徴によって簡便性に優れる凝集反応に基づいたＳＡＡの測定方法を提供することができるのである。
【００２２】
【発明の効果】
本発明の新規なモノクローナル抗体の提供によって、ＳＡＡの凝集反応を使った免疫学的測定方法の特異性が向上し、試薬品質の安定化にも貢献する。これまでは特異性を得にくいうえ、均一な品質の維持が困難なポリクローナル抗体に頼らざるをえなかったＳＡＡの凝集反応に基づく免疫学的な測定を、モノクローナル抗体によって実現できるのである。しかも本発明のモノクローナル抗体は、ＳＡＡと反応して強く凝集し十分な感度と測定範囲を実現する。
【００２３】
【実施例】
１．ＳＡＡ免疫原の調製
１−１．ＳＡＡの精製
ＳＡＡ高値血清（１００μg/ml）１L を出発原料とし、まず超遠心法により比重１．２３の上層部を採取、次いで比重１．０６３の下層部を採取し、冷却下メタノール／エーテル (１：３）で脱脂後、セファデックスＧ−２００カラム（６M 尿素、０．５%Tween ２０を含む０．０１M トリス−塩酸緩衝液ｐＨ ８．６で平衡化）にアプライし、更にブロムシアンで活性化したセファロース４Ｂ（ファルマシア） に常法により、 抗ＡｐｏＡ−I抗体、抗ＡｐｏＣIII抗体、および抗ヒト血清アルブミン抗体を結合させたカラムに通して夾雑蛋白を除去し、１Lの血清より精製ＳＡＡ３０mgが得られた。 精製ＳＡＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量１２０００の位置に単一のバンドを示し、他のアポリポ蛋白抗体とは反応しなかった。また、アミノ酸配列はＮ末端からSer Phe Phe Ser PheLeu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr であり、データベース検索から、ダウレット他の報告（Biochem.27:P1677,1988 ）によるＮ末端のArg を欠いたformII, IVと同一であることがわかった。
【００２４】
２．モノクローナル抗体
２−１．ラットの免疫
１で精製したＳＡＡ１００μg/頭と人型結核菌４mg/mlを加えたＦＣＡで常法によりエマルジョンを作製し、９週齢のＷＫＡＨ／ＨＫｍラットのメスに免疫した。同時に沈降精製百日咳ジフテリア破傷風混合ワクチン（武田薬品工業製）１００μl/頭を左後肢腿に筋肉注射した。
この後３週おきにＳＡＡ５０μg/頭をＦＣＡと常法によりエマルジョンとしたものを免疫原として腹腔内注射し、定期的に採血してＥＬＩＳＡで抗体価を測定した。ＥＬＩＳＡの操作は次のとおりである。
【００２５】
２−２．ＳＡＡ抗体のＥＬＩＳＡ
抗体価の測定と抗原特異的抗体活性の確認は、ＥＬＩＳＡで行った。ブロック、コンジュゲート希釈、血清希釈には１%のＢＳＡを加えた０．１５MのＮａＣｌを含む２０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、以下ＢＳＡ−ＰＢＳと省略する）を用いた。
精製ＳＡＡを１０μg/mlとなるように２０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、以下ＰＢＳと省略する）に溶解し住友ベークライトメディカル社製６０穴テラサキプレート（ＭＳ−３１６００）に１０μl/well入れ３７℃で２時間感作し、ＰＢＳで洗浄後１%ＢＳＡ−ＰＢＳを１０μl/well入れ、３７℃で２時間ブロックし、４℃で保存する。
プレートをＰＢＳで１回洗浄後、抗体活性を調べようとする検体１０μlをテラサキプレートに採り３７℃で３０分インキュベートした。このプレートをＰＢＳで３回洗浄し、１%ＢＳＡ−ＰＢＳで１０，０００倍に希釈した市販の抗ラットＩｇＧ−ＰＯＤコンジュゲート（Ｃａｐｐｅｌ社製）１０μlを入れ、３７℃３０分インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄後、ＯＰＤと過酸化水素を含む基質液１０μlを加え３７℃で３０分インキュベートして発色を測定した。陰性対照として１%ＢＳＡ−ＰＢＳを、陽性対照として１０2に希釈した免疫ラット血清１０μlを用意し、検体にかえて同じ操作を行った。
【００２６】
２−３．細胞融合とクローニング
ＥＬＩＳＡによる抗体価が１０4に上昇したことを確認したところで、生理食塩水に溶解したＳＡＡ５０μgを腹腔内注射し３日後に脾臓を摘出した。 脾細胞を採取してＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、マウスミエローマ細胞Ｘ−６３−Ａｇ８−６５３とポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと省略する）法によって細胞融合させた。融合条件は次のとおりである。すなわち、脾細胞：ミエローマ細胞が３：１となるように遠心管に分注し、５０%ＰＥＧ溶液１mlを加え、更に加温した５０mlのＲＰＭＩ１６４０をゆっくり加えてＰＥＧを希釈した。次いで遠心してＰＥＧを除き、脾細胞として７．１×１０5/wellとなるようにＨＡＴ培地に分散し、これを９６穴プレートにプレーティングした。
ＨＡＴセレクション後にほとんどのウエルでコロニーが観察された。各ウエルの培養上清はＰＯＤ標識抗ラットIｇＧ抗体を用いてＥＬＩＳＡでスクリーニングし、発色した３０ウエルからクローニングを始め、３回から４回の限界希釈法によるクローニングを行い、最終的にＳＡＡとの反応性を示すＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を産生する１３クローンを確立した。マウスを用いた方法、あるいはラットを用いても従来の免疫法ではこのように多くのクローンを安定して確立することは困難であったが、今回採用した免疫法では同時に多くのクローンを得ることができた。この１３クローンを以下の反応性の確認に用いた。
【００２７】
３．モノクローナル抗体による試薬の調製
２で得たハイブリドーマ１３クローンを、それぞれプリスタン処理したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ）の腹腔に接種し２週間後腹水を採集した。この腹水を遠心（３０００rpm、５分）後、上清から硫安分画によってモノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿を回収してＰＢＳに溶解し、同じＰＢＳに対して透析し抗ＳＡＡモノクローナル抗体（１０mg/ml）とした。用いたモノクローナル抗体のサブクラスは以下のとおりである。サブクラスは、Ｂｅｔｈｙｌ社製抗ラットサブクラス抗血清と培養上清とのオクテロニー法で決定した。
クローン ３：ＩｇＧ２ａ
クローン ６：ＩｇＧ２ｂ
クローン ７：ＩｇＧ２ａ
クローン１４：ＩｇＧ２ｃ
クローン１５：ＩｇＧ２ａ
クローン１６：ＩｇＧ２ａ
クローン１７：ＩｇＧ１
クローン１８：ＩｇＧ２ａ
クローン２０：ＩｇＧ２ａ
クローン２１：ＩｇＧ２ａ
クローン２２：ＩｇＧ２ａ
クローン２５：ＩｇＧ２ａ
クローン２７：ＩｇＧ２ａ
【００２８】
各抗ＳＡＡモノクローナル抗体をポリスチレンラテックス（平均粒径０．１０９μm）に３７℃で１時間物理吸着させ、最終的にラテックス濃度１%となるように分散媒（１%ＢＳＡを含む０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４）に懸濁させて１３種類のＳＡＡラテックス凝集反応用試薬（以下単に乳液と呼ぶ）を得た。
【００２９】
４．モノクローナル抗体の反応性
３で得た各乳液を単独あるいは２種づつを等量混合し、合計９１種類の試薬を調製し、これをＳＡＡと反応させることによって凝集の有無を観察した。凝集反応は吸光度分析による免疫学的ラテックス凝集反応測定システムＬＡ−２０００（栄研化学・アナリティカルインスツルメント製、商品名）で確認した。測定条件は次のとおりである。この条件によって、反応開始後４００秒間の吸光度の差がＤＯＳとして算出される。この値は、ＬＡ−２０００に固有の値である。結果は表１に示した。
ＳＡＡ濃度 ：３１．５μg/ml
検体量 ：２０μl
乳液量 ：３００μl
吸光度の測定 ：４００秒
【００３０】
【表１】
各組合わせのＤＯＳを表にした。表中、１クローンのみの反応（対角線上に位置する）は点線で囲い、ＤＯＳが単独の乳液でのＤＯＳの１／２の和より１０%以上高い（凝集が混合で促進されている）組合わせは斜体で示した。この結果から、単独でも凝集を示すモノクローナル抗体を得たことが確認できた（クローン１７や２１）。また２つのモノクローナル抗体を組み合わせる（つまり乳液を混合する）ことによって、単独の乳液より強い凝集の見られる組み合わせが多数観察された。組み合わせによって凝集を増強するパターンを示す組み合わせの中には、単独では凝集しないものの、特定のモノクローナル抗体と組み合わせることよって非常に強力な凝集能を持つようになる場合も観察された。たとえばクローン７はクローン３やクローン２１と、またクローン２１はクローン１７等と組み合わせた時に大きな凝集能を示している。特に強い凝集が観察されたものを実線で囲んで示した。
他方、混合することによって単独の場合よりも凝集が弱くなるケース（表中で下線で示した）も多く観察され、単に複数種のモノクローナル抗体を組み合わるだけでは凝集の強化にはつながらないことが確認された。
なお凝集能の有無は次の基準によって判断した。まず、０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）のみを測定して装置自身の光学的なバラ付きを測定する（２０）。更に空試験として同じ緩衝液を検体として試薬ブランクを取る（−１１〜＋１０）。試薬ブランクの平均値（０．９３）に標準偏差（２．９３）の２倍を加え、更に装置のバラ付き幅を加えた値（試薬ブランク＋２ＳＤ＋光学装置のばらつき幅）を基準として、この基準よりも大きな値を示す時に凝集したと判断した。今回の実験では、この値は２７である。したがって表中の数値が２７を越えているものは、凝集していると判断できる。
【００３２】
５．複数のモノクローナル抗体の組み合わせ
４で得た２種類の組み合わせの結果を参考にして、３種類以上の組み合わせについても凝集活性を調査した。表１に示したクローンＮｏ．のうち、７、１７、２１、および２２の各モノクローナル抗体で個別に調製した乳液を用意し、これをいろいろな割合で混合して複数種のモノクローナル抗体からなるＳＡＡの凝集反応用試薬を作成した。この複数のモノクローナル抗体からなる乳液を用いて、４と同じ操作により様々な濃度のＳＡＡ含有血清試料を測定した。そして、ポリクローナル抗体によって調製した公知のＳＡＡ測定用ラテックス凝集反応試薬(Ann.Clin.Biochem.1993;30:72-76)による測定値との相関を調査した。結果は図１、および図２に示した。
図に示したように、例として示したモノクローナル抗体の組み合わせではいずれもポリクローナル抗体による測定値と高い相関を示した。このように本発明のモノクローナルを利用すれば、モノクローナル抗体の高い特異性を維持しながら、しかもポリクローナル抗体に匹敵する凝集活性を備えた免疫学的測定試薬の提供が可能である。いくつか示したモノクローナル抗体の組み合わせの中で、もっともポリクローナル抗体による測定値との相関が高かったのは、１７：２１：７：２２＝１：１：１：１混合の場合であった。（図１）
【図面の簡単な説明】
【図１】複数種のモノクローナル抗体で調製した乳液による測定値（μg/ml、縦軸）と、ポリクローナル抗体で調製した乳液による測定値（μg/ml、横軸）の相関図
【図２】複数種のモノクローナル抗体で調製した乳液による測定値（μg/ml、縦軸）と、ポリクローナル抗体で調製した乳液による測定値（μg/ml、横軸）の相関図
【図３】表１に示したモノクローナル抗体が認識するエピトープをＳＡＡのアミノ酸配列にマッピングした図。
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- 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５６１６として寄託されたハイブリドーマＳＡＡ−１７が産生するモノクローナル抗体
- 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５６１７として寄託されたハイブリドーマＳＡＡ−２１が産生するモノクローナル抗体
- 次の反応性で特徴付けられるヒト血清アミロイドＡを認識する請求項１または請求項２のモノクローナル抗体
（１）ヒト血清アミロイドＡの抗原決定基を認識する
（２）ラテックス粒子に担持されたとき単独でヒト血清アミロイドＡと反応して凝集する - 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５６１６として寄託されたハイブリドーマＳＡＡ−１７
- 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５６１７として寄託されたハイブリドーマＳＡＡ−２１
- 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５６１６として寄託されたハイブリドーマＳＡＡ−１７が産生するモノクローナル抗体を含む、免疫学的測定試薬
- 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５６１７として寄託されたハイブリドーマＳＡＡ−２１が産生するモノクローナル抗体を含む、免疫学的測定試薬
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