JPH0967398A - 血清アミロイドａを認識するモノクローナル抗体 - Google Patents
血清アミロイドａを認識するモノクローナル抗体Info
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- JPH0967398A JPH0967398A JP7246695A JP24669595A JPH0967398A JP H0967398 A JPH0967398 A JP H0967398A JP 7246695 A JP7246695 A JP 7246695A JP 24669595 A JP24669595 A JP 24669595A JP H0967398 A JPH0967398 A JP H0967398A
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- C07K—PEPTIDES
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- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明の課題は、炎症等のマーカーとなるヒト
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の凝集反応に基づく免疫学
的測定を可能とするモノクローナル抗体の提供である。 【解決手段】本発明は、次の反応性で特徴付けられるヒ
トＳＡＡを認識するモノクローナル抗体と、このモノク
ローナル抗体を利用したＳＡＡの免疫学的測定試薬、そ
して免疫学的測定方法を提供する。 （１）ヒトＳＡＡの抗原決定基を認識する （２）ヒトＳＡＡと反応して凝集する 【効果】本発明は、モノクローナル抗体によってＳＡＡ
の免疫学的凝集反応に基づく測定を可能にした。本発明
のモノクローナル抗体はＳＡＡに対する力価に優れ、Ｓ
ＡＡを高い感度で特異的に測定できるのみならず、測定
範囲の拡大にも貢献する。
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の凝集反応に基づく免疫学
的測定を可能とするモノクローナル抗体の提供である。 【解決手段】本発明は、次の反応性で特徴付けられるヒ
トＳＡＡを認識するモノクローナル抗体と、このモノク
ローナル抗体を利用したＳＡＡの免疫学的測定試薬、そ
して免疫学的測定方法を提供する。 （１）ヒトＳＡＡの抗原決定基を認識する （２）ヒトＳＡＡと反応して凝集する 【効果】本発明は、モノクローナル抗体によってＳＡＡ
の免疫学的凝集反応に基づく測定を可能にした。本発明
のモノクローナル抗体はＳＡＡに対する力価に優れ、Ｓ
ＡＡを高い感度で特異的に測定できるのみならず、測定
範囲の拡大にも貢献する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト血清中のアミロイ
ドＡ（以下、ＳＡＡと省略する）を認識するモノクロー
ナル抗体、ならびにこのモノクローナル抗体の使用に関
するものである。臨床検査等の分野では、物質の測定を
簡便に行うために、あるいは高い感度で特異的に測定す
るためにしばしば免疫学的な測定方法が利用される。免
疫学的な測定方法には、抗体が必要である。モノクロー
ナル抗体は、均一な性状を備えた抗体を継続して供給で
きる点、１度の免疫操作で多量の抗体を得られるので抗
原の使用量が少なくて済む点、そしてなによりも高度な
特異性を持つ抗体を得やすい等の多くの利点を持ってい
るので免疫学的な測定方法においては欠かすことのでき
ないツールとなっている。また測定のみならず、物質の
精製、生理活性や生体内における挙動の研究においても
モノクローナル抗体は重要なツールとなる。ＳＡＡはあ
る種のアミロイドーシスにおいて組織に沈着するアミロ
イド蛋白Ａ（以下、ＡＡ蛋白と省略する）の前駆体蛋白
とされる、分子量約１２０００の血清蛋白である。（J.
Clin.Invest.53:1054-1061,1974）近年になって、この
ＳＡＡの血清値がアミロイドーシス以外の炎症性疾患で
上昇することが明らかにされ、鋭敏な炎症マーカーとし
て評価されている。（臨床検査32:2,P168,1988）
ドＡ（以下、ＳＡＡと省略する）を認識するモノクロー
ナル抗体、ならびにこのモノクローナル抗体の使用に関
するものである。臨床検査等の分野では、物質の測定を
簡便に行うために、あるいは高い感度で特異的に測定す
るためにしばしば免疫学的な測定方法が利用される。免
疫学的な測定方法には、抗体が必要である。モノクロー
ナル抗体は、均一な性状を備えた抗体を継続して供給で
きる点、１度の免疫操作で多量の抗体を得られるので抗
原の使用量が少なくて済む点、そしてなによりも高度な
特異性を持つ抗体を得やすい等の多くの利点を持ってい
るので免疫学的な測定方法においては欠かすことのでき
ないツールとなっている。また測定のみならず、物質の
精製、生理活性や生体内における挙動の研究においても
モノクローナル抗体は重要なツールとなる。ＳＡＡはあ
る種のアミロイドーシスにおいて組織に沈着するアミロ
イド蛋白Ａ（以下、ＡＡ蛋白と省略する）の前駆体蛋白
とされる、分子量約１２０００の血清蛋白である。（J.
Clin.Invest.53:1054-1061,1974）近年になって、この
ＳＡＡの血清値がアミロイドーシス以外の炎症性疾患で
上昇することが明らかにされ、鋭敏な炎症マーカーとし
て評価されている。（臨床検査32:2,P168,1988）
【０００２】
【従来技術の問題点】ＳＡＡを認識するモノクローナル
抗体については、次のような報告が有る。これらの報告
ではＳＡＡを認識するモノクローナル抗体によってＥＬ
ＩＳＡを構成している。 J.Immunol.Methods 144,149-155;1991 Clin.Chem.40/7,1284-1290;1994
抗体については、次のような報告が有る。これらの報告
ではＳＡＡを認識するモノクローナル抗体によってＥＬ
ＩＳＡを構成している。 J.Immunol.Methods 144,149-155;1991 Clin.Chem.40/7,1284-1290;1994
【０００３】ところで一般にＥＬＩＳＡでは十分に使用
に耐えるモノクローナル抗体も、凝集法では実用的な性
能を示さないことが多い。その理由はラテックスのよう
な担体粒子を利用する方法にしろ、あるいは免疫比濁法
のような担体の助けを借りない方法にしろ、用いる抗体
には次のような条件が要求されるためである。
に耐えるモノクローナル抗体も、凝集法では実用的な性
能を示さないことが多い。その理由はラテックスのよう
な担体粒子を利用する方法にしろ、あるいは免疫比濁法
のような担体の助けを借りない方法にしろ、用いる抗体
には次のような条件が要求されるためである。
【０００４】条件Ａ：凝集法ではより高い親和性が要求
される。 凝集反応を起こし、しかも物理的に安定した凝集塊を維
持するには一般にＥＬＩＳＡで要求されるよりも高い水
準の親和性が必要である。特にモノクローナル抗体では
限られたエピトープに対してのみ反応する抗体分子だけ
で反応を構成しなければならないので、高度な親和性を
持つモノクローナル抗体を用意しなければならないが、
従来のモノクローナル抗体はこのような条件を満足する
ものではなかった。親和性が不十分なモノクローナル抗
体で反応系を構成すると、実用的な感度で分析可能な凝
集塊を形成しないので凝集法による測定を行うことはで
きない。たとえ抗体の使用量を増やして親和性の低さを
カバーするとしても、抗原１分子に対して結合できる抗
体の数は変わらないので十分な感度は得られない。また
ラテックスのような担体に抗体を結合して用いるときに
も、やはり抗体の結合量に限界があるので、抗体の使用
量を増やすという対策では不十分である。
される。 凝集反応を起こし、しかも物理的に安定した凝集塊を維
持するには一般にＥＬＩＳＡで要求されるよりも高い水
準の親和性が必要である。特にモノクローナル抗体では
限られたエピトープに対してのみ反応する抗体分子だけ
で反応を構成しなければならないので、高度な親和性を
持つモノクローナル抗体を用意しなければならないが、
従来のモノクローナル抗体はこのような条件を満足する
ものではなかった。親和性が不十分なモノクローナル抗
体で反応系を構成すると、実用的な感度で分析可能な凝
集塊を形成しないので凝集法による測定を行うことはで
きない。たとえ抗体の使用量を増やして親和性の低さを
カバーするとしても、抗原１分子に対して結合できる抗
体の数は変わらないので十分な感度は得られない。また
ラテックスのような担体に抗体を結合して用いるときに
も、やはり抗体の結合量に限界があるので、抗体の使用
量を増やすという対策では不十分である。
【０００５】条件Ｂ：ＥＬＩＳＡでは問題とならないエ
ピトープの位置関係が凝集法では障害となることがある 凝集反応では、モノクローナル抗体が認識するエピトー
プが同一抗原上に複数存在していなければならない。こ
の条件はＥＬＩＳＡサンドイッチ法と同じである。しか
し凝集法では先に述べたとおり物理的により強い結合を
要求することから、たとえ物理的な位置が異なっていて
も接近したエピトープのみで反応させることは不利であ
る。立体障害を起こしやすく、結果として安定で大きな
凝集塊を得にくくなるためである。このようにエピトー
プの選択という観点から見ても、これまでのモノクロー
ナル抗体は凝集法向きではなかった。
ピトープの位置関係が凝集法では障害となることがある 凝集反応では、モノクローナル抗体が認識するエピトー
プが同一抗原上に複数存在していなければならない。こ
の条件はＥＬＩＳＡサンドイッチ法と同じである。しか
し凝集法では先に述べたとおり物理的により強い結合を
要求することから、たとえ物理的な位置が異なっていて
も接近したエピトープのみで反応させることは不利であ
る。立体障害を起こしやすく、結果として安定で大きな
凝集塊を得にくくなるためである。このようにエピトー
プの選択という観点から見ても、これまでのモノクロー
ナル抗体は凝集法向きではなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ＳＡ
Ａの凝集反応による測定を可能とする新しいモノクロー
ナル抗体の提供である。そしてこのような新規なモノク
ローナル抗体によって、優れた測定性能を持つＳＡＡの
免疫学的測定試薬と、測定方法を合わせて提供するもの
である。
Ａの凝集反応による測定を可能とする新しいモノクロー
ナル抗体の提供である。そしてこのような新規なモノク
ローナル抗体によって、優れた測定性能を持つＳＡＡの
免疫学的測定試薬と、測定方法を合わせて提供するもの
である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の課題は、次の反
応性で特徴付けられるヒトＳＡＡを認識するモノクロー
ナル抗体により解決される。 （１）ヒトＳＡＡを認識する （２）ヒトＳＡＡと反応して凝集する 本発明において、ＳＡＡと反応して凝集するという条件
は次のような方法によって確認することができる。もっ
とも簡単な方法として、モノクローナル抗体とＳＡＡを
免疫反応に好適な条件の元で反応させ、免疫複合体が沈
降物として生じるかどうかを指標として凝集能を確認す
る方法を示すことができる。ただしこの方法では増感剤
などを組合せない場合は定量的な観察を行うことが困難
である。モノクローナル抗体の凝集能を定量的につかむ
ためには、ラテックス凝集反応を利用するとよい。以下
にモノクローナル抗体のラテックス凝集反応による凝集
能確認方法について説明する。抗ＳＡＡモノクローナル
抗体はポリスチレンラテックス（平均粒径０．１０９μ
m）に３７℃で１時間物理吸着させた後、最終的にラテ
ックス濃度１%となるように分散媒（１%ＢＳＡを含む
０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４）に懸濁させて
モノクローナル抗体感作ラテックス乳液とする。この乳
液を一定のＳＡＡ濃度を持つ試料と反応させ、生じる凝
集を光学的に測定する。光学測定には吸光度変化量や、
散乱光変化量を測定する方法が知られている。以下に吸
光度変化量を免疫学的ラテックス凝集反応測定システム
ＬＡ−２０００（栄研化学・アナリティカルインスツル
メント製、商品名）で確認する方法を例示する。測定条
件は次のとおりである。この条件によって、反応開始後
４００秒間の吸光度変化がＤＯＳとして算出される。こ
の値は、ＬＡ−２０００に固有の値である。 ＳＡＡ濃度 ：３１．５μg/ml 検体量 ：２０μl 乳液量 ：３００μl 吸光度の測定 ：４００秒 この反応条件でまず０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ
７．４）のみを測定して装置自身の光学的なバラ付きを
測定する。更に空試験として同じ緩衝液を検体として試
薬ブランクを取る。試薬ブランクの平均値に標準偏差の
２倍を加え、更に装置のバラ付き幅を加えた値（試薬ブ
ランク＋２ＳＤ＋光学装置のばらつき幅）を基準とし
て、この基準よりも大きな値を示す時に凝集したと判定
できる。同様の試験方法は、ＬＡ−２０００のような専
用システムを利用しなくても一般的な吸光光度計で実施
することも可能である。
応性で特徴付けられるヒトＳＡＡを認識するモノクロー
ナル抗体により解決される。 （１）ヒトＳＡＡを認識する （２）ヒトＳＡＡと反応して凝集する 本発明において、ＳＡＡと反応して凝集するという条件
は次のような方法によって確認することができる。もっ
とも簡単な方法として、モノクローナル抗体とＳＡＡを
免疫反応に好適な条件の元で反応させ、免疫複合体が沈
降物として生じるかどうかを指標として凝集能を確認す
る方法を示すことができる。ただしこの方法では増感剤
などを組合せない場合は定量的な観察を行うことが困難
である。モノクローナル抗体の凝集能を定量的につかむ
ためには、ラテックス凝集反応を利用するとよい。以下
にモノクローナル抗体のラテックス凝集反応による凝集
能確認方法について説明する。抗ＳＡＡモノクローナル
抗体はポリスチレンラテックス（平均粒径０．１０９μ
m）に３７℃で１時間物理吸着させた後、最終的にラテ
ックス濃度１%となるように分散媒（１%ＢＳＡを含む
０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４）に懸濁させて
モノクローナル抗体感作ラテックス乳液とする。この乳
液を一定のＳＡＡ濃度を持つ試料と反応させ、生じる凝
集を光学的に測定する。光学測定には吸光度変化量や、
散乱光変化量を測定する方法が知られている。以下に吸
光度変化量を免疫学的ラテックス凝集反応測定システム
ＬＡ−２０００（栄研化学・アナリティカルインスツル
メント製、商品名）で確認する方法を例示する。測定条
件は次のとおりである。この条件によって、反応開始後
４００秒間の吸光度変化がＤＯＳとして算出される。こ
の値は、ＬＡ−２０００に固有の値である。 ＳＡＡ濃度 ：３１．５μg/ml 検体量 ：２０μl 乳液量 ：３００μl 吸光度の測定 ：４００秒 この反応条件でまず０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ
７．４）のみを測定して装置自身の光学的なバラ付きを
測定する。更に空試験として同じ緩衝液を検体として試
薬ブランクを取る。試薬ブランクの平均値に標準偏差の
２倍を加え、更に装置のバラ付き幅を加えた値（試薬ブ
ランク＋２ＳＤ＋光学装置のばらつき幅）を基準とし
て、この基準よりも大きな値を示す時に凝集したと判定
できる。同様の試験方法は、ＬＡ−２０００のような専
用システムを利用しなくても一般的な吸光光度計で実施
することも可能である。
【０００８】本発明のモノクローナル抗体は、マウス、
ラット等を精製ＳＡＡで免疫し、その抗体産生細胞をな
んらかの手段で不死化することによって得る事ができ
る。不死化技術としては、ミエローマのような腫瘍細胞
との細胞融合、あるいはエプスタインバールウイルスに
よる形質転換等が知られている。細胞融合でハイブリド
ーマを調製するときには、免疫動物と同じ動物種のミエ
ローマを用いても良いし、あるいは別種の動物に由来す
るミエローマとの融合によりヘテロ・ハイブリドーマと
することもできる。ＳＡＡはヒト以外の動物でも血清中
に観察される蛋白であり、免疫という刺激を与える事に
より増加する。したがって免疫動物にはそのような現象
のない動物、例えばラットを利用すれば抗体価が上昇し
やすいので有利である。免疫原に利用するＳＡＡは、公
知の方法によって精製されたものを用いる。具体的に
は、超遠心分離により原料血清から高比重リポタンパク
分画（以下ＨＤＬと省略する）を得、脱脂後イオン交換
クロマトグラフィー等で精製することでＳＡＡを純粋な
蛋白質として回収することができる。このように高度に
精製した蛋白質を用いることは、ＳＡＡに特異的なモノ
クローナル抗体産生細胞を高い収率で得るために大切な
条件である。例えば、超遠心によって得たＨＤＬ分画を
精製することなく免疫原として利用した報告もあるが、
このような免疫原によって得られる抗体産生細胞は各種
アポリポ蛋白質抗原を認識する抗体を産生するものも多
く、クローニング等の点で不利となることが予想され
る。
ラット等を精製ＳＡＡで免疫し、その抗体産生細胞をな
んらかの手段で不死化することによって得る事ができ
る。不死化技術としては、ミエローマのような腫瘍細胞
との細胞融合、あるいはエプスタインバールウイルスに
よる形質転換等が知られている。細胞融合でハイブリド
ーマを調製するときには、免疫動物と同じ動物種のミエ
ローマを用いても良いし、あるいは別種の動物に由来す
るミエローマとの融合によりヘテロ・ハイブリドーマと
することもできる。ＳＡＡはヒト以外の動物でも血清中
に観察される蛋白であり、免疫という刺激を与える事に
より増加する。したがって免疫動物にはそのような現象
のない動物、例えばラットを利用すれば抗体価が上昇し
やすいので有利である。免疫原に利用するＳＡＡは、公
知の方法によって精製されたものを用いる。具体的に
は、超遠心分離により原料血清から高比重リポタンパク
分画（以下ＨＤＬと省略する）を得、脱脂後イオン交換
クロマトグラフィー等で精製することでＳＡＡを純粋な
蛋白質として回収することができる。このように高度に
精製した蛋白質を用いることは、ＳＡＡに特異的なモノ
クローナル抗体産生細胞を高い収率で得るために大切な
条件である。例えば、超遠心によって得たＨＤＬ分画を
精製することなく免疫原として利用した報告もあるが、
このような免疫原によって得られる抗体産生細胞は各種
アポリポ蛋白質抗原を認識する抗体を産生するものも多
く、クローニング等の点で不利となることが予想され
る。
【０００９】また精製ＳＡＡを免疫原とするときに、そ
の抗原性を高めるために様々な技術を応用することがで
きる。フロイントのコンプリート・アジュバント（以
下、ＦＣＡと省略する）は免疫原性を高めるために必要
な成分の一つである。このほか脂質リポソームにＳＡＡ
を吸着させて免疫原とする方法も有効である。ＳＡＡは
多くのほ乳動物がもともと血液中に含んでいる蛋白質で
あるため、免疫動物に対して抗原性を示しにくいことが
指摘されている。これまでに凝集反応に利用できるモノ
クローナル抗体の報告が無いのは、このＳＡＡの抗原性
の低さが原因の一つであると推測される。本発明者らは
高度に精製したＳＡＡを用いるとともに、ＳＡＡを各種
アジュバント成分と組み合せて特殊な形の免疫原とする
ことによってＳＡＡの抗原性を高め、新たなモノクロー
ナル抗体を得ることに成功した。本発明のモノクローナ
ルを得るために有用なアジュバント成分には、ＦＣＡに
結核菌菌体を添加したものを示すことができる。結核菌
はもともとＦＣＡに含まれる成分であるが、これを増強
することにより良い結果を得られる。また百日咳ワクチ
ンを免疫時に筋肉注射する事によってより強い免疫効果
が期待できる。
の抗原性を高めるために様々な技術を応用することがで
きる。フロイントのコンプリート・アジュバント（以
下、ＦＣＡと省略する）は免疫原性を高めるために必要
な成分の一つである。このほか脂質リポソームにＳＡＡ
を吸着させて免疫原とする方法も有効である。ＳＡＡは
多くのほ乳動物がもともと血液中に含んでいる蛋白質で
あるため、免疫動物に対して抗原性を示しにくいことが
指摘されている。これまでに凝集反応に利用できるモノ
クローナル抗体の報告が無いのは、このＳＡＡの抗原性
の低さが原因の一つであると推測される。本発明者らは
高度に精製したＳＡＡを用いるとともに、ＳＡＡを各種
アジュバント成分と組み合せて特殊な形の免疫原とする
ことによってＳＡＡの抗原性を高め、新たなモノクロー
ナル抗体を得ることに成功した。本発明のモノクローナ
ルを得るために有用なアジュバント成分には、ＦＣＡに
結核菌菌体を添加したものを示すことができる。結核菌
はもともとＦＣＡに含まれる成分であるが、これを増強
することにより良い結果を得られる。また百日咳ワクチ
ンを免疫時に筋肉注射する事によってより強い免疫効果
が期待できる。
【００１０】こうして得られた本発明のモノクローナル
抗体は、ＳＡＡと反応して凝集を起こす新規な特徴を備
えている。本発明のモノクローナル抗体は凝集活性に優
れ、単独でＳＡＡと反応して凝集を示すものさえ存在す
る。また好ましい組合せにおいては、単独での使用で得
ることのできる凝集よりも更に強い凝集反応を期待する
ことができる。表１に示したモノクローナル抗体の結合
親和性を測定してみたところ、例えば次のような結果を
得た。親和定数と凝集活性の強さとの間に特別な関連性
は見られず、ＳＡＡに対するモノクローナル抗体の凝集
活性は親和性の強さによって単純に推測することができ
ないものと思われた。 クローン１５：８．４×１０7 クローン１６：２．０×１０8 クローン１７：１．０×１０7 クローン１８：８．５×１０7 更に、本発明者らが実際に得たモノクローナル抗体は、
エピトープとしてたとえば図３に示すような領域を認識
していたが、エピトープと凝集活性の間には一定の関係
を見出すことができなかった。なお図３に示したエピト
ープは、表１に記載したモノクローナルの代表的なもの
について分析した結果である。したがってＳＡＡを認識
するモノクローナル抗体においては、エピトープのみに
よって凝集活性を予測することは困難なものと推定され
る。なお本明細書においては次のようなアミノ酸の略号
を利用する。 アラニン A or Ala アルギニン R or Arg アスパラギン N or Asn アスパラギン酸 D or Asp システイン C or Cys グルタミン Q or Gln グルタミン酸 E or Glu グリシン G or Gly ヒスチジン H or His イソロイシン I or Ile ロイシン L or Leu リジン K or Lys メチオニン M or Met フェニルアラニン F or Phe プロリン P or Pro セリン S or Ser トレオニン T or Thr トリプトファン W or Trp チロシン Y or Tyr バリン V or Val
抗体は、ＳＡＡと反応して凝集を起こす新規な特徴を備
えている。本発明のモノクローナル抗体は凝集活性に優
れ、単独でＳＡＡと反応して凝集を示すものさえ存在す
る。また好ましい組合せにおいては、単独での使用で得
ることのできる凝集よりも更に強い凝集反応を期待する
ことができる。表１に示したモノクローナル抗体の結合
親和性を測定してみたところ、例えば次のような結果を
得た。親和定数と凝集活性の強さとの間に特別な関連性
は見られず、ＳＡＡに対するモノクローナル抗体の凝集
活性は親和性の強さによって単純に推測することができ
ないものと思われた。 クローン１５：８．４×１０7 クローン１６：２．０×１０8 クローン１７：１．０×１０7 クローン１８：８．５×１０7 更に、本発明者らが実際に得たモノクローナル抗体は、
エピトープとしてたとえば図３に示すような領域を認識
していたが、エピトープと凝集活性の間には一定の関係
を見出すことができなかった。なお図３に示したエピト
ープは、表１に記載したモノクローナルの代表的なもの
について分析した結果である。したがってＳＡＡを認識
するモノクローナル抗体においては、エピトープのみに
よって凝集活性を予測することは困難なものと推定され
る。なお本明細書においては次のようなアミノ酸の略号
を利用する。 アラニン A or Ala アルギニン R or Arg アスパラギン N or Asn アスパラギン酸 D or Asp システイン C or Cys グルタミン Q or Gln グルタミン酸 E or Glu グリシン G or Gly ヒスチジン H or His イソロイシン I or Ile ロイシン L or Leu リジン K or Lys メチオニン M or Met フェニルアラニン F or Phe プロリン P or Pro セリン S or Ser トレオニン T or Thr トリプトファン W or Trp チロシン Y or Tyr バリン V or Val
【００１１】本発明のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマは、特許微生物寄託センターに次のような
受託番号で寄託されている。 ＦＥＲＭ Ｐ−１５０８８（ハイブリドーマＳＡＡ−７） ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９０（ハイブリドーマＳＡＡ−１７） ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９２（ハイブリドーマＳＡＡ−２１） ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９３（ハイブリドーマＳＡＡ−２２） これらのハイブリドーマは、ラットを先に述べたような
方法で免疫して抗体産生細胞を回収し、マウスミエロー
マ細胞と細胞融合させることによって確立したラット−
マウスヘテロハイブリドーマである。これらのハイブリ
ドーマは、ヌードマウスの腹腔に接種すれば腹水を回収
してモノクローナル抗体を精製することができる。また
適当な培地で培養すれば、培養上清を回収してモノクロ
ーナル抗体を精製することも可能である。
イブリドーマは、特許微生物寄託センターに次のような
受託番号で寄託されている。 ＦＥＲＭ Ｐ−１５０８８（ハイブリドーマＳＡＡ−７） ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９０（ハイブリドーマＳＡＡ−１７） ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９２（ハイブリドーマＳＡＡ−２１） ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９３（ハイブリドーマＳＡＡ−２２） これらのハイブリドーマは、ラットを先に述べたような
方法で免疫して抗体産生細胞を回収し、マウスミエロー
マ細胞と細胞融合させることによって確立したラット−
マウスヘテロハイブリドーマである。これらのハイブリ
ドーマは、ヌードマウスの腹腔に接種すれば腹水を回収
してモノクローナル抗体を精製することができる。また
適当な培地で培養すれば、培養上清を回収してモノクロ
ーナル抗体を精製することも可能である。
【００１２】更に本発明は、次の反応性で特徴付けられ
るヒトＳＡＡを認識するモノクローナル抗体を含むＳＡ
Ａの免疫学的測定試薬を提供する。 （１）ヒト血清アミロイドＡの抗原決定基を認識する （２）ヒト血清アミロイドＡと反応して凝集する
るヒトＳＡＡを認識するモノクローナル抗体を含むＳＡ
Ａの免疫学的測定試薬を提供する。 （１）ヒト血清アミロイドＡの抗原決定基を認識する （２）ヒト血清アミロイドＡと反応して凝集する
【００１３】本発明のモノクローナル抗体は、複数のモ
ノクローナル抗体を組合せた場合にには先に述べたよう
に組み合わせによって凝集特性に違いが存在する。した
がってこのモノクローナル抗体を試薬として利用すると
きには、期待する感度や測定範囲を容易に実現できるよ
うに適当な組み合わせを経験的に選択すると良い。組み
合わせるモノクローナル抗体の数は、２種類に限定され
るものではなく更に多種類のモノクローナル抗体を組み
合わせることも可能である。３種類以上のモノクローナ
ル抗体の組み合わせによって、より安定で強い結合を持
つ凝集塊の形成を期待できる。あるいはまた、組み合わ
せと混合比により凝集の強度や定量範囲をコントロール
することも可能である。複数のモノクローナル抗体を粒
子担体に結合して本発明の試薬を構成するときには、そ
れぞれ単一種のモノクローナル抗体を粒子担体に結合後
に混合する方法と、あらかじめ複数種のモノクローナル
抗体を混合したものを粒子担体に結合する方法のいずれ
もが採用できる。前者の方法によれば、クローン間の微
妙な結合条件の違いに対応することができ、また抗体の
混合比の調整などが容易となるので有利である。
ノクローナル抗体を組合せた場合にには先に述べたよう
に組み合わせによって凝集特性に違いが存在する。した
がってこのモノクローナル抗体を試薬として利用すると
きには、期待する感度や測定範囲を容易に実現できるよ
うに適当な組み合わせを経験的に選択すると良い。組み
合わせるモノクローナル抗体の数は、２種類に限定され
るものではなく更に多種類のモノクローナル抗体を組み
合わせることも可能である。３種類以上のモノクローナ
ル抗体の組み合わせによって、より安定で強い結合を持
つ凝集塊の形成を期待できる。あるいはまた、組み合わ
せと混合比により凝集の強度や定量範囲をコントロール
することも可能である。複数のモノクローナル抗体を粒
子担体に結合して本発明の試薬を構成するときには、そ
れぞれ単一種のモノクローナル抗体を粒子担体に結合後
に混合する方法と、あらかじめ複数種のモノクローナル
抗体を混合したものを粒子担体に結合する方法のいずれ
もが採用できる。前者の方法によれば、クローン間の微
妙な結合条件の違いに対応することができ、また抗体の
混合比の調整などが容易となるので有利である。
【００１４】本発明の免疫学的測定試薬においては、モ
ノクローナル抗体が遊離の状態で用いられても良いしあ
るいは不溶性担体に結合していてもよい。好ましい不溶
性担体には、ラテックス等の有機合成素材、シリカ、ア
ルミナ、金コロイド等の無機素材からなる粒子状担体を
挙げることができる。これらの粒子状担体へモノクロー
ナル抗体を結合するには、化学結合や物理吸着を利用で
きる。
ノクローナル抗体が遊離の状態で用いられても良いしあ
るいは不溶性担体に結合していてもよい。好ましい不溶
性担体には、ラテックス等の有機合成素材、シリカ、ア
ルミナ、金コロイド等の無機素材からなる粒子状担体を
挙げることができる。これらの粒子状担体へモノクロー
ナル抗体を結合するには、化学結合や物理吸着を利用で
きる。
【００１５】本発明の試薬を構成するモノクローナル抗
体は、リウマチ因子や補体による非特異的な影響を抑制
することを目的として適当な酵素で消化した断片として
用いることもできる。抗体断片としては、ペプシンによ
るＦ（ａｂ’）２、パパインによるＦａｂ、プラスミン
によるＦａｃｂ’等が知られている。
体は、リウマチ因子や補体による非特異的な影響を抑制
することを目的として適当な酵素で消化した断片として
用いることもできる。抗体断片としては、ペプシンによ
るＦ（ａｂ’）２、パパインによるＦａｂ、プラスミン
によるＦａｃｂ’等が知られている。
【００１６】本発明のＳＡＡの免疫学的測定試薬には、
この他に公知の成分を組合せることができる。すなわ
ち、免疫反応に必要なｐＨを与える緩衝剤、免疫反応を
促進する反応増強剤、非特異反応を抑制する反応安定剤
やブロッカー、試薬の保存性を高めるアジ化ナトリウム
のような防腐剤等を組合せても良い。
この他に公知の成分を組合せることができる。すなわ
ち、免疫反応に必要なｐＨを与える緩衝剤、免疫反応を
促進する反応増強剤、非特異反応を抑制する反応安定剤
やブロッカー、試薬の保存性を高めるアジ化ナトリウム
のような防腐剤等を組合せても良い。
【００１７】緩衝剤としては、次のようなものが利用さ
れている。 ＧＯＯＤ緩衝剤 ２−モルホリノエタンスルホン酸（2-(N-Morpholino)et
hanesulfonic acid、ＭＥＳと省略する） ピペラジン−ビス（２−エタンスルホン酸）（Piperazi
ne-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)、ＰＩＰＥＳと省
略する） （２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸
（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid、ＡＣ
ＥＳと省略する） ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスル
ホン酸（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoehtanesulfo
nic acid、ＢＥＳと省略する） ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキ
シメチル）メタン（Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hyd
roxymethyl)methane、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓと省略する） ３−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒ
ドロキシプロパンスルホン酸（3-[N,N-Bis(2-hydroxyet
hyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid、ＤＩＰＳ
Ｏと省略する） ２−ヒドロキシエチルピペラジン−３−プロパンスルホ
ン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-3-propanesulfo
nic acid、ＥＰＰＳと省略する） ヒドロキシエチルピペラジン−２−エタンスルホン酸
（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic a
cid 、ＨＥＰＥＳと省略する） ２−ヒドロキシエチルピペラジン−２−ヒドロキシプロ
パン−３−スルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-
N'-2-hydroxypropane-3-sulfonic acid、ＨＥＰＰＳＯ
と省略する） ３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸（3-(N-Morphol
ino)propanesulfonic acid、ＭＯＰＳと省略する） ３−（モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸（3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid
、ＭＯＰＳＯと省略する） ピペラジン−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸）（Pioerazine-N,N'-bis(2-hydroxypropanesulfonic
acid)、ＰＯＰＳＯと省略する） N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic
acid 、ＴＡＰＳと省略する） トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−
３−アミノプロパンスルホン酸（N-Tris(hydroxymethy
l)methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid、Ｔ
ＡＰＳＯと省略する） トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタン
スルホン酸（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoeth
anesulfonic acid、ＴＥＳと省略する） その他の緩衝剤 ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１、３−プロパン
ジオール（2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanedio
l） トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris(hydro
xymethyl)aminomethane）とも呼ばれる リン酸緩衝液 アンモニウム緩衝液 これらの緩衝剤の中でも、ＨＥＰＥＳやＰＩＰＥＳ等の
ＧＯＯＤ緩衝剤は、免疫反応に有利なｐＨを与えるのみ
ならず、蛋白質への影響が小さいので特に好ましい緩衝
剤として挙げられる。
れている。 ＧＯＯＤ緩衝剤 ２−モルホリノエタンスルホン酸（2-(N-Morpholino)et
hanesulfonic acid、ＭＥＳと省略する） ピペラジン−ビス（２−エタンスルホン酸）（Piperazi
ne-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)、ＰＩＰＥＳと省
略する） （２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸
（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid、ＡＣ
ＥＳと省略する） ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスル
ホン酸（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoehtanesulfo
nic acid、ＢＥＳと省略する） ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキ
シメチル）メタン（Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hyd
roxymethyl)methane、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓと省略する） ３−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒ
ドロキシプロパンスルホン酸（3-[N,N-Bis(2-hydroxyet
hyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid、ＤＩＰＳ
Ｏと省略する） ２−ヒドロキシエチルピペラジン−３−プロパンスルホ
ン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-3-propanesulfo
nic acid、ＥＰＰＳと省略する） ヒドロキシエチルピペラジン−２−エタンスルホン酸
（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic a
cid 、ＨＥＰＥＳと省略する） ２−ヒドロキシエチルピペラジン−２−ヒドロキシプロ
パン−３−スルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-
N'-2-hydroxypropane-3-sulfonic acid、ＨＥＰＰＳＯ
と省略する） ３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸（3-(N-Morphol
ino)propanesulfonic acid、ＭＯＰＳと省略する） ３−（モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸（3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid
、ＭＯＰＳＯと省略する） ピペラジン−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸）（Pioerazine-N,N'-bis(2-hydroxypropanesulfonic
acid)、ＰＯＰＳＯと省略する） N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic
acid 、ＴＡＰＳと省略する） トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−
３−アミノプロパンスルホン酸（N-Tris(hydroxymethy
l)methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid、Ｔ
ＡＰＳＯと省略する） トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタン
スルホン酸（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoeth
anesulfonic acid、ＴＥＳと省略する） その他の緩衝剤 ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１、３−プロパン
ジオール（2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanedio
l） トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris(hydro
xymethyl)aminomethane）とも呼ばれる リン酸緩衝液 アンモニウム緩衝液 これらの緩衝剤の中でも、ＨＥＰＥＳやＰＩＰＥＳ等の
ＧＯＯＤ緩衝剤は、免疫反応に有利なｐＨを与えるのみ
ならず、蛋白質への影響が小さいので特に好ましい緩衝
剤として挙げられる。
【００１８】また反応増強剤としては、ポリエチレング
リコールや硫酸デキストラン等が知られている。更に反
応安定剤やブロッカーとしては、ＢＳＡ（ウシ血清アル
ブミン）、動物血清、ＩｇＧ、ＩｇＧ断片（ＦａｂやＦ
ｃ）、アルブミン、乳蛋白、アミノ酸、ポリアミノ酸、
コリン、ショ糖等の多糖類、ゼラチン、ゼラチン分解
物、カゼイン、グリセリン等の多価アルコール等が免疫
反応において反応の安定化や非特異反応の抑止に有効な
ことが知られている。
リコールや硫酸デキストラン等が知られている。更に反
応安定剤やブロッカーとしては、ＢＳＡ（ウシ血清アル
ブミン）、動物血清、ＩｇＧ、ＩｇＧ断片（ＦａｂやＦ
ｃ）、アルブミン、乳蛋白、アミノ酸、ポリアミノ酸、
コリン、ショ糖等の多糖類、ゼラチン、ゼラチン分解
物、カゼイン、グリセリン等の多価アルコール等が免疫
反応において反応の安定化や非特異反応の抑止に有効な
ことが知られている。
【００１９】これらの各種成分を含む本発明によるＳＡ
Ａの免疫学的測定試薬は、溶液状態で、あるいは乾燥状
態で供給することができる。溶液状態で流通させるに
は、蛋白の安定性を高めることを目的として、更に各種
界面活性剤、糖、不活性蛋白等を加えても良い。これら
の安定化剤は、試薬を乾燥するときにも安定剤として、
あるいは賦形剤として有効である。
Ａの免疫学的測定試薬は、溶液状態で、あるいは乾燥状
態で供給することができる。溶液状態で流通させるに
は、蛋白の安定性を高めることを目的として、更に各種
界面活性剤、糖、不活性蛋白等を加えても良い。これら
の安定化剤は、試薬を乾燥するときにも安定剤として、
あるいは賦形剤として有効である。
【００２０】本発明によるＳＡＡの免疫学的測定は、先
に述べたＳＡＡの免疫学的測定試薬により実現する。試
薬が凝集反応用のものであれば、凝集反応の進行を光学
的に、もしくは肉眼によって追跡する事によって行う事
ができる。
に述べたＳＡＡの免疫学的測定試薬により実現する。試
薬が凝集反応用のものであれば、凝集反応の進行を光学
的に、もしくは肉眼によって追跡する事によって行う事
ができる。
【００２１】
【作用】本発明のモノクローナル抗体は、凝集反応によ
る免疫学的測定を可能にする。これまでに知られていた
ＳＡＡに対するモノクローナル抗体は、凝集反応を構成
するには親和性が不十分なためＥＬＩＳＡ法のような限
られた測定方法に用途が限定されていた。本発明のモノ
クローナル抗体は、ＳＡＡと反応して凝集するという新
しい特徴を持つ。この特徴によって簡便性に優れる凝集
反応に基づいたＳＡＡの測定方法を提供することができ
るのである。
る免疫学的測定を可能にする。これまでに知られていた
ＳＡＡに対するモノクローナル抗体は、凝集反応を構成
するには親和性が不十分なためＥＬＩＳＡ法のような限
られた測定方法に用途が限定されていた。本発明のモノ
クローナル抗体は、ＳＡＡと反応して凝集するという新
しい特徴を持つ。この特徴によって簡便性に優れる凝集
反応に基づいたＳＡＡの測定方法を提供することができ
るのである。
【００２２】
【発明の効果】本発明の新規なモノクローナル抗体の提
供によって、ＳＡＡの凝集反応を使った免疫学的測定方
法の特異性が向上し、試薬品質の安定化にも貢献する。
これまでは特異性を得にくいうえ、均一な品質の維持が
困難なポリクローナル抗体に頼らざるをえなかったＳＡ
Ａの凝集反応に基づく免疫学的な測定を、モノクローナ
ル抗体によって実現できるのである。しかも本発明のモ
ノクローナル抗体は、ＳＡＡと反応して強く凝集し十分
な感度と測定範囲を実現する。
供によって、ＳＡＡの凝集反応を使った免疫学的測定方
法の特異性が向上し、試薬品質の安定化にも貢献する。
これまでは特異性を得にくいうえ、均一な品質の維持が
困難なポリクローナル抗体に頼らざるをえなかったＳＡ
Ａの凝集反応に基づく免疫学的な測定を、モノクローナ
ル抗体によって実現できるのである。しかも本発明のモ
ノクローナル抗体は、ＳＡＡと反応して強く凝集し十分
な感度と測定範囲を実現する。
【００２３】
１．ＳＡＡ免疫原の調製 １−１．ＳＡＡの精製 ＳＡＡ高値血清（１００μg/ml）１L を出発原料とし、
まず超遠心法により比重１．２３の上層部を採取、次い
で比重１．０６３の下層部を採取し、冷却下メタノール
／エーテル (１：３）で脱脂後、セファデックスＧ−２
００カラム（６M 尿素、０．５%Tween ２０を含む０．
０１M トリス−塩酸緩衝液ｐＨ ８．６で平衡化）にア
プライし、更にブロムシアンで活性化したセファロース
４Ｂ（ファルマシア） に常法により、 抗ＡｐｏＡ−I
抗体、抗ＡｐｏＣIII抗体、および抗ヒト血清アルブミ
ン抗体を結合させたカラムに通して夾雑蛋白を除去し、
１Lの血清より精製ＳＡＡ３０mgが得られた。 精製ＳＡ
ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量１２０００の位置
に単一のバンドを示し、他のアポリポ蛋白抗体とは反応
しなかった。また、アミノ酸配列はＮ末端からSer Phe
Phe Ser PheLeu GlyGlu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp
Met Trp Arg Ala Tyr であり、データベース検索から、
ダウレット他の報告（Biochem.27:P1677,1988 ）による
Ｎ末端のArg を欠いたformII, IVと同一であることがわ
かった。
まず超遠心法により比重１．２３の上層部を採取、次い
で比重１．０６３の下層部を採取し、冷却下メタノール
／エーテル (１：３）で脱脂後、セファデックスＧ−２
００カラム（６M 尿素、０．５%Tween ２０を含む０．
０１M トリス−塩酸緩衝液ｐＨ ８．６で平衡化）にア
プライし、更にブロムシアンで活性化したセファロース
４Ｂ（ファルマシア） に常法により、 抗ＡｐｏＡ−I
抗体、抗ＡｐｏＣIII抗体、および抗ヒト血清アルブミ
ン抗体を結合させたカラムに通して夾雑蛋白を除去し、
１Lの血清より精製ＳＡＡ３０mgが得られた。 精製ＳＡ
ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量１２０００の位置
に単一のバンドを示し、他のアポリポ蛋白抗体とは反応
しなかった。また、アミノ酸配列はＮ末端からSer Phe
Phe Ser PheLeu GlyGlu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp
Met Trp Arg Ala Tyr であり、データベース検索から、
ダウレット他の報告（Biochem.27:P1677,1988 ）による
Ｎ末端のArg を欠いたformII, IVと同一であることがわ
かった。
【００２４】２．モノクローナル抗体 ２−１．ラットの免疫 １で精製したＳＡＡ１００μg/頭と人型結核菌４mg/ml
を加えたＦＣＡで常法によりエマルジョンを作製し、９
週齢のＷＫＡＨ／ＨＫｍラットのメスに免疫した。同時
に沈降精製百日咳ジフテリア破傷風混合ワクチン（武田
薬品工業製）１００μl/頭を左後肢腿に筋肉注射した。
この後３週おきにＳＡＡ５０μg/頭をＦＣＡと常法によ
りエマルジョンとしたものを免疫原として腹腔内注射
し、定期的に採血してＥＬＩＳＡで抗体価を測定した。
ＥＬＩＳＡの操作は次のとおりである。
を加えたＦＣＡで常法によりエマルジョンを作製し、９
週齢のＷＫＡＨ／ＨＫｍラットのメスに免疫した。同時
に沈降精製百日咳ジフテリア破傷風混合ワクチン（武田
薬品工業製）１００μl/頭を左後肢腿に筋肉注射した。
この後３週おきにＳＡＡ５０μg/頭をＦＣＡと常法によ
りエマルジョンとしたものを免疫原として腹腔内注射
し、定期的に採血してＥＬＩＳＡで抗体価を測定した。
ＥＬＩＳＡの操作は次のとおりである。
【００２５】２−２．ＳＡＡ抗体のＥＬＩＳＡ 抗体価の測定と抗原特異的抗体活性の確認は、ＥＬＩＳ
Ａで行った。ブロック、コンジュゲート希釈、血清希釈
には１%のＢＳＡを加えた０．１５MのＮａＣｌを含む２
０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、以下ＢＳＡ−ＰＢＳと
省略する）を用いた。精製ＳＡＡを１０μg/mlとなるよ
うに２０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、以下ＰＢＳと省
略する）に溶解し住友ベークライトメディカル社製６０
穴テラサキプレート（ＭＳ−３１６００）に１０μl/we
ll入れ３７℃で２時間感作し、ＰＢＳで洗浄後１%ＢＳ
Ａ−ＰＢＳを１０μl/well入れ、３７℃で２時間ブロッ
クし、４℃で保存する。プレートをＰＢＳで１回洗浄
後、抗体活性を調べようとする検体１０μlをテラサキ
プレートに採り３７℃で３０分インキュベートした。こ
のプレートをＰＢＳで３回洗浄し、１%ＢＳＡ−ＰＢＳ
で１０，０００倍に希釈した市販の抗ラットＩｇＧ−Ｐ
ＯＤコンジュゲート（Ｃａｐｐｅｌ社製）１０μlを入
れ、３７℃３０分インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄
後、ＯＰＤと過酸化水素を含む基質液１０μlを加え３
７℃で３０分インキュベートして発色を測定した。陰性
対照として１%ＢＳＡ−ＰＢＳを、陽性対照として１０2
に希釈した免疫ラット血清１０μlを用意し、検体にか
えて同じ操作を行った。
Ａで行った。ブロック、コンジュゲート希釈、血清希釈
には１%のＢＳＡを加えた０．１５MのＮａＣｌを含む２
０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、以下ＢＳＡ−ＰＢＳと
省略する）を用いた。精製ＳＡＡを１０μg/mlとなるよ
うに２０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、以下ＰＢＳと省
略する）に溶解し住友ベークライトメディカル社製６０
穴テラサキプレート（ＭＳ−３１６００）に１０μl/we
ll入れ３７℃で２時間感作し、ＰＢＳで洗浄後１%ＢＳ
Ａ−ＰＢＳを１０μl/well入れ、３７℃で２時間ブロッ
クし、４℃で保存する。プレートをＰＢＳで１回洗浄
後、抗体活性を調べようとする検体１０μlをテラサキ
プレートに採り３７℃で３０分インキュベートした。こ
のプレートをＰＢＳで３回洗浄し、１%ＢＳＡ−ＰＢＳ
で１０，０００倍に希釈した市販の抗ラットＩｇＧ−Ｐ
ＯＤコンジュゲート（Ｃａｐｐｅｌ社製）１０μlを入
れ、３７℃３０分インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄
後、ＯＰＤと過酸化水素を含む基質液１０μlを加え３
７℃で３０分インキュベートして発色を測定した。陰性
対照として１%ＢＳＡ−ＰＢＳを、陽性対照として１０2
に希釈した免疫ラット血清１０μlを用意し、検体にか
えて同じ操作を行った。
【００２６】２−３．細胞融合とクローニング ＥＬＩＳＡによる抗体価が１０4に上昇したことを確認
したところで、生理食塩水に溶解したＳＡＡ５０μgを
腹腔内注射し３日後に脾臓を摘出した。 脾細胞を採取
してＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、マウスミエローマ
細胞Ｘ−６３−Ａｇ８−６５３とポリエチレングリコー
ル（以下ＰＥＧと省略する）法によって細胞融合させ
た。融合条件は次のとおりである。すなわち、脾細胞：
ミエローマ細胞が３：１となるように遠心管に分注し、
５０%ＰＥＧ溶液１mlを加え、更に加温した５０mlのＲ
ＰＭＩ１６４０をゆっくり加えてＰＥＧを希釈した。次
いで遠心してＰＥＧを除き、脾細胞として７．１×１０
5/wellとなるようにＨＡＴ培地に分散し、これを９６穴
プレートにプレーティングした。ＨＡＴセレクション後
にほとんどのウエルでコロニーが観察された。各ウエル
の培養上清はＰＯＤ標識抗ラットIｇＧ抗体を用いてＥ
ＬＩＳＡでスクリーニングし、発色した３０ウエルから
クローニングを始め、３回から４回の限界希釈法による
クローニングを行い、最終的にＳＡＡとの反応性を示す
ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を産生する１３クロ
ーンを確立した。マウスを用いた方法、あるいはラット
を用いても従来の免疫法ではこのように多くのクローン
を安定して確立することは困難であったが、今回採用し
た免疫法では同時に多くのクローンを得ることができ
た。この１３クローンを以下の反応性の確認に用いた。
したところで、生理食塩水に溶解したＳＡＡ５０μgを
腹腔内注射し３日後に脾臓を摘出した。 脾細胞を採取
してＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、マウスミエローマ
細胞Ｘ−６３−Ａｇ８−６５３とポリエチレングリコー
ル（以下ＰＥＧと省略する）法によって細胞融合させ
た。融合条件は次のとおりである。すなわち、脾細胞：
ミエローマ細胞が３：１となるように遠心管に分注し、
５０%ＰＥＧ溶液１mlを加え、更に加温した５０mlのＲ
ＰＭＩ１６４０をゆっくり加えてＰＥＧを希釈した。次
いで遠心してＰＥＧを除き、脾細胞として７．１×１０
5/wellとなるようにＨＡＴ培地に分散し、これを９６穴
プレートにプレーティングした。ＨＡＴセレクション後
にほとんどのウエルでコロニーが観察された。各ウエル
の培養上清はＰＯＤ標識抗ラットIｇＧ抗体を用いてＥ
ＬＩＳＡでスクリーニングし、発色した３０ウエルから
クローニングを始め、３回から４回の限界希釈法による
クローニングを行い、最終的にＳＡＡとの反応性を示す
ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を産生する１３クロ
ーンを確立した。マウスを用いた方法、あるいはラット
を用いても従来の免疫法ではこのように多くのクローン
を安定して確立することは困難であったが、今回採用し
た免疫法では同時に多くのクローンを得ることができ
た。この１３クローンを以下の反応性の確認に用いた。
【００２７】３．モノクローナル抗体による試薬の調製 ２で得たハイブリドーマ１３クローンを、それぞれプリ
スタン処理したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ）の
腹腔に接種し２週間後腹水を採集した。この腹水を遠心
（３０００rpm、５分）後、上清から硫安分画によって
モノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿を回収してＰＢ
Ｓに溶解し、同じＰＢＳに対して透析し抗ＳＡＡモノク
ローナル抗体（１０mg/ml）とした。用いたモノクロー
ナル抗体のサブクラスは以下のとおりである。サブクラ
スは、Ｂｅｔｈｙｌ社製抗ラットサブクラス抗血清と培
養上清とのオクテロニー法で決定した。 クローン ３：ＩｇＧ２ａ クローン ６：ＩｇＧ２ｂ クローン ７：ＩｇＧ２ａ クローン１４：ＩｇＧ２ｃ クローン１５：ＩｇＧ２ａ クローン１６：ＩｇＧ２ａ クローン１７：ＩｇＧ１ クローン１８：ＩｇＧ２ａ クローン２０：ＩｇＧ２ａ クローン２１：ＩｇＧ２ａ クローン２２：ＩｇＧ２ａ クローン２５：ＩｇＧ２ａ クローン２７：ＩｇＧ２ａ
スタン処理したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ）の
腹腔に接種し２週間後腹水を採集した。この腹水を遠心
（３０００rpm、５分）後、上清から硫安分画によって
モノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿を回収してＰＢ
Ｓに溶解し、同じＰＢＳに対して透析し抗ＳＡＡモノク
ローナル抗体（１０mg/ml）とした。用いたモノクロー
ナル抗体のサブクラスは以下のとおりである。サブクラ
スは、Ｂｅｔｈｙｌ社製抗ラットサブクラス抗血清と培
養上清とのオクテロニー法で決定した。 クローン ３：ＩｇＧ２ａ クローン ６：ＩｇＧ２ｂ クローン ７：ＩｇＧ２ａ クローン１４：ＩｇＧ２ｃ クローン１５：ＩｇＧ２ａ クローン１６：ＩｇＧ２ａ クローン１７：ＩｇＧ１ クローン１８：ＩｇＧ２ａ クローン２０：ＩｇＧ２ａ クローン２１：ＩｇＧ２ａ クローン２２：ＩｇＧ２ａ クローン２５：ＩｇＧ２ａ クローン２７：ＩｇＧ２ａ
【００２８】各抗ＳＡＡモノクローナル抗体をポリスチ
レンラテックス（平均粒径０．１０９μm）に３７℃で
１時間物理吸着させ、最終的にラテックス濃度１%とな
るように分散媒（１%ＢＳＡを含む０．１MのＨＥＰＥＳ
緩衝液ｐＨ７．４）に懸濁させて１３種類のＳＡＡラテ
ックス凝集反応用試薬（以下単に乳液と呼ぶ）を得た。
レンラテックス（平均粒径０．１０９μm）に３７℃で
１時間物理吸着させ、最終的にラテックス濃度１%とな
るように分散媒（１%ＢＳＡを含む０．１MのＨＥＰＥＳ
緩衝液ｐＨ７．４）に懸濁させて１３種類のＳＡＡラテ
ックス凝集反応用試薬（以下単に乳液と呼ぶ）を得た。
【００２９】４．モノクローナル抗体の反応性 ３で得た各乳液を単独あるいは２種づつを等量混合し、
合計９１種類の試薬を調製し、これをＳＡＡと反応させ
ることによって凝集の有無を観察した。凝集反応は吸光
度分析による免疫学的ラテックス凝集反応測定システム
ＬＡ−２０００（栄研化学・アナリティカルインスツル
メント製、商品名）で確認した。測定条件は次のとおり
である。この条件によって、反応開始後４００秒間の吸
光度の差がＤＯＳとして算出される。この値は、ＬＡ−
２０００に固有の値である。結果は表１に示した。 ＳＡＡ濃度 ：３１．５μg/ml 検体量 ：２０μl 乳液量 ：３００μl 吸光度の測定 ：４００秒
合計９１種類の試薬を調製し、これをＳＡＡと反応させ
ることによって凝集の有無を観察した。凝集反応は吸光
度分析による免疫学的ラテックス凝集反応測定システム
ＬＡ−２０００（栄研化学・アナリティカルインスツル
メント製、商品名）で確認した。測定条件は次のとおり
である。この条件によって、反応開始後４００秒間の吸
光度の差がＤＯＳとして算出される。この値は、ＬＡ−
２０００に固有の値である。結果は表１に示した。 ＳＡＡ濃度 ：３１．５μg/ml 検体量 ：２０μl 乳液量 ：３００μl 吸光度の測定 ：４００秒
【００３０】
【表１】
【００３１】各組合わせのＤＯＳを表にした。表中、１
クローンのみの反応（対角線上に位置する）は点線で囲
い、ＤＯＳが単独の乳液でのＤＯＳの１／２の和より１
０%以上高い（凝集が混合で促進されている）組合わせ
は斜体で示した。この結果から、単独でも凝集を示すモ
ノクローナル抗体を得たことが確認できた（クローン１
７や２１）。また２つのモノクローナル抗体を組み合わ
せる（つまり乳液を混合する）ことによって、単独の乳
液より強い凝集の見られる組み合わせが多数観察され
た。組み合わせによって凝集を増強するパターンを示す
組み合わせの中には、単独では凝集しないものの、特定
のモノクローナル抗体と組み合わせることよって非常に
強力な凝集能を持つようになる場合も観察された。たと
えばクローン７はクローン３やクローン２１と、またク
ローン２１はクローン１７等と組み合わせた時に大きな
凝集能を示している。特に強い凝集が観察されたものを
実線で囲んで示した。他方、混合することによって単独
の場合よりも凝集が弱くなるケース（表中で下線で示し
た）も多く観察され、単に複数種のモノクローナル抗体
を組み合わるだけでは凝集の強化にはつながらないこと
が確認された。なお凝集能の有無は次の基準によって判
断した。まず、０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
４）のみを測定して装置自身の光学的なバラ付きを測定
する（２０）。更に空試験として同じ緩衝液を検体とし
て試薬ブランクを取る（−１１〜＋１０）。試薬ブラン
クの平均値（０．９３）に標準偏差（２．９３）の２倍
を加え、更に装置のバラ付き幅を加えた値（試薬ブラン
ク＋２ＳＤ＋光学装置のばらつき幅）を基準として、こ
の基準よりも大きな値を示す時に凝集したと判断した。
今回の実験では、この値は２７である。したがって表中
の数値が２７を越えているものは、凝集していると判断
できる。
クローンのみの反応（対角線上に位置する）は点線で囲
い、ＤＯＳが単独の乳液でのＤＯＳの１／２の和より１
０%以上高い（凝集が混合で促進されている）組合わせ
は斜体で示した。この結果から、単独でも凝集を示すモ
ノクローナル抗体を得たことが確認できた（クローン１
７や２１）。また２つのモノクローナル抗体を組み合わ
せる（つまり乳液を混合する）ことによって、単独の乳
液より強い凝集の見られる組み合わせが多数観察され
た。組み合わせによって凝集を増強するパターンを示す
組み合わせの中には、単独では凝集しないものの、特定
のモノクローナル抗体と組み合わせることよって非常に
強力な凝集能を持つようになる場合も観察された。たと
えばクローン７はクローン３やクローン２１と、またク
ローン２１はクローン１７等と組み合わせた時に大きな
凝集能を示している。特に強い凝集が観察されたものを
実線で囲んで示した。他方、混合することによって単独
の場合よりも凝集が弱くなるケース（表中で下線で示し
た）も多く観察され、単に複数種のモノクローナル抗体
を組み合わるだけでは凝集の強化にはつながらないこと
が確認された。なお凝集能の有無は次の基準によって判
断した。まず、０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
４）のみを測定して装置自身の光学的なバラ付きを測定
する（２０）。更に空試験として同じ緩衝液を検体とし
て試薬ブランクを取る（−１１〜＋１０）。試薬ブラン
クの平均値（０．９３）に標準偏差（２．９３）の２倍
を加え、更に装置のバラ付き幅を加えた値（試薬ブラン
ク＋２ＳＤ＋光学装置のばらつき幅）を基準として、こ
の基準よりも大きな値を示す時に凝集したと判断した。
今回の実験では、この値は２７である。したがって表中
の数値が２７を越えているものは、凝集していると判断
できる。
【００３２】５．複数のモノクローナル抗体の組み合わ
せ ４で得た２種類の組み合わせの結果を参考にして、３種
類以上の組み合わせについても凝集活性を調査した。表
１に示したクローンＮｏ．のうち、７、１７、２１、お
よび２２の各モノクローナル抗体で個別に調製した乳液
を用意し、これをいろいろな割合で混合して複数種のモ
ノクローナル抗体からなるＳＡＡの凝集反応用試薬を作
成した。この複数のモノクローナル抗体からなる乳液を
用いて、４と同じ操作により様々な濃度のＳＡＡ含有血
清試料を測定した。そして、ポリクローナル抗体によっ
て調製した公知のＳＡＡ測定用ラテックス凝集反応試薬
(Ann.Clin.Biochem.1993;30:72-76)による測定値との相
関を調査した。結果は図１、および図２に示した。図に
示したように、例として示したモノクローナル抗体の組
み合わせではいずれもポリクローナル抗体による測定値
と高い相関を示した。このように本発明のモノクローナ
ルを利用すれば、モノクローナル抗体の高い特異性を維
持しながら、しかもポリクローナル抗体に匹敵する凝集
活性を備えた免疫学的測定試薬の提供が可能である。い
くつか示したモノクローナル抗体の組み合わせの中で、
もっともポリクローナル抗体による測定値との相関が高
かったのは、１７：２１：７：２２＝１：１：１：１混
合の場合であった。（図１）
せ ４で得た２種類の組み合わせの結果を参考にして、３種
類以上の組み合わせについても凝集活性を調査した。表
１に示したクローンＮｏ．のうち、７、１７、２１、お
よび２２の各モノクローナル抗体で個別に調製した乳液
を用意し、これをいろいろな割合で混合して複数種のモ
ノクローナル抗体からなるＳＡＡの凝集反応用試薬を作
成した。この複数のモノクローナル抗体からなる乳液を
用いて、４と同じ操作により様々な濃度のＳＡＡ含有血
清試料を測定した。そして、ポリクローナル抗体によっ
て調製した公知のＳＡＡ測定用ラテックス凝集反応試薬
(Ann.Clin.Biochem.1993;30:72-76)による測定値との相
関を調査した。結果は図１、および図２に示した。図に
示したように、例として示したモノクローナル抗体の組
み合わせではいずれもポリクローナル抗体による測定値
と高い相関を示した。このように本発明のモノクローナ
ルを利用すれば、モノクローナル抗体の高い特異性を維
持しながら、しかもポリクローナル抗体に匹敵する凝集
活性を備えた免疫学的測定試薬の提供が可能である。い
くつか示したモノクローナル抗体の組み合わせの中で、
もっともポリクローナル抗体による測定値との相関が高
かったのは、１７：２１：７：２２＝１：１：１：１混
合の場合であった。（図１）
【図１】複数種のモノクローナル抗体で調製した乳液に
よる測定値（μg/ml、縦軸）と、ポリクローナル抗体で
調製した乳液による測定値（μg/ml、横軸）の相関図
よる測定値（μg/ml、縦軸）と、ポリクローナル抗体で
調製した乳液による測定値（μg/ml、横軸）の相関図
【図２】複数種のモノクローナル抗体で調製した乳液に
よる測定値（μg/ml、縦軸）と、ポリクローナル抗体で
調製した乳液による測定値（μg/ml、横軸）の相関図
よる測定値（μg/ml、縦軸）と、ポリクローナル抗体で
調製した乳液による測定値（μg/ml、横軸）の相関図
【図３】表１に示したモノクローナル抗体が認識するエ
ピトープをＳＡＡのアミノ酸配列にマッピングした図。
ピトープをＳＡＡのアミノ酸配列にマッピングした図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (20)
- 【請求項１】次の反応性で特徴付けられるヒト血清アミ
ロイドＡを認識するモノクローナル抗体 （１）ヒト血清アミロイドＡの抗原決定基を認識する （２）ヒト血清アミロイドＡと反応して凝集する - 【請求項２】モノクローナル抗体産生細胞が、ラットの
抗体産生細胞に由来する請求項１のモノクローナル抗体 - 【請求項３】モノクローナル抗体が、単独でヒト血清ア
ミロイドＡと反応して凝集する請求項１のモノクローナ
ル抗体 - 【請求項４】受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９０として
寄託されたハイブリドーマＳＡＡ−１７が産生する請求
項３のモノクローナル抗体 - 【請求項５】受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９２として
寄託されたハイブリドーマＳＡＡ−２１が産生する請求
項３のモノクローナル抗体 - 【請求項６】モノクローナル抗体が、ヒト血清アミロイ
ドＡを認識する他のモノクローナル抗体と組み合わせた
ときに凝集する請求項１のモノクローナル抗体 - 【請求項７】受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５０８８として
寄託されたハイブリドーマＳＡＡ−７が産生する請求項
６のモノクローナル抗体 - 【請求項８】受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９３として
寄託されたハイブリドーマＳＡＡ−２２が産生する請求
項６のモノクローナル抗体 - 【請求項９】受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５０８８として
寄託されたハイブリドーマＳＡＡ−７ - 【請求項１０】受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９０とし
て寄託されたハイブリドーマＳＡＡ−１７ - 【請求項１１】受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９２とし
て寄託されたハイブリドーマＳＡＡ−２１ - 【請求項１２】受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９３とし
て寄託されたハイブリドーマＳＡＡ−２２ - 【請求項１３】次の反応性で特徴付けられるヒト血清ア
ミロイドＡを認識するモノクローナル抗体を含む血清ア
ミロイドＡの免疫学的測定試薬 （１）ヒト血清アミロイドＡの抗原決定基を認識する （２）ヒト血清アミロイドＡと反応して凝集する - 【請求項１４】モノクローナル抗体が不溶性担体に結合
している請求項１３の免疫学的測定試薬 - 【請求項１５】不溶性担体が粒子状担体である請求項１
４の免疫学的測定試薬 - 【請求項１６】複数種のモノクローナル抗体を組み合わ
せた、請求項１３の免疫学的測定試薬 - 【請求項１７】少なくとも３種類のモノクローナル抗体
を組合せた請求項１６の免疫学的測定試薬 - 【請求項１８】次の反応性で特徴付けられるヒト血清ア
ミロイドＡを認識するモノクローナル抗体を、血清アミ
ロイドＡと反応させることによる血清アミロイドＡの免
疫学的測定方法 （１）ヒト血清アミロイドＡの抗原決定基を認識する （２）ヒト血清アミロイドＡと反応して凝集する - 【請求項１９】モノクローナル抗体が粒子状担体に結合
されており、ヒト血清アミロイドＡとの反応に基づく凝
集を光学的に測定する請求項１８の免疫学的測定方法 - 【請求項２０】モノクローナル抗体とヒト血清アミロイ
ドＡとの反応によって生じる免疫沈降反応生成物を光学
的に測定する請求項１８の免疫学的測定方法
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24669595A JP3713074B2 (ja) | 1995-08-30 | 1995-08-30 | 血清アミロイドａを認識するモノクローナル抗体 |
| PCT/JP1996/002342 WO1997008335A1 (fr) | 1995-08-30 | 1996-08-22 | Anticorps monoclonal permettant de reconnaitre l'amyloïde a serique |
| EP96927871A EP0872558A4 (en) | 1995-08-30 | 1996-08-22 | MONOCLONAL ANTIBODIES FOR RECOGNIZING AMYLO OF A SERIUM |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24669595A JP3713074B2 (ja) | 1995-08-30 | 1995-08-30 | 血清アミロイドａを認識するモノクローナル抗体 |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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| JP2007525437A (ja) * | 2003-03-24 | 2007-09-06 | ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド | 抗ｉｌ−２０抗体および結合パートナーならびに炎症において用いる方法 |
| WO2019004168A1 (ja) | 2017-06-26 | 2019-01-03 | 栄研化学株式会社 | 各種動物の血清アミロイドａの測定方法及びその測定試薬 |
| CN110105448A (zh) * | 2019-05-10 | 2019-08-09 | 上海钹乐诗生物技术有限公司 | 一种鼠源抗人saa单抗的制备方法 |
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| JP3511023B2 (ja) | 1999-08-25 | 2004-03-29 | アキュプレックス，リミティド ライアビリティーカンパニー | 感染及び炎症状態の検出のための分泌された生物学的流体の診断アッセイ |
| US6509444B1 (en) | 1999-10-22 | 2003-01-21 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Serum amyloid a isoform from colostrum |
| EP1222275A2 (en) * | 1999-10-22 | 2002-07-17 | The Board of Regents of the University of Nebraska | Serum amyloid a isoform from colostrum |
| US6815175B2 (en) | 2001-03-16 | 2004-11-09 | Cornell Research Foundation, Inc. | Anti-amyloid peptide antibody based diagnosis and treatment of a neurological disease or disorder |
| US7368546B2 (en) | 2003-01-21 | 2008-05-06 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Human SAA3 nucleic acid molecule, protein, and methods of use for same |
| EP2730659A3 (en) * | 2007-12-28 | 2016-01-13 | Prothena Biosciences Limited | Treatment and Prophylaxis of Amyloidosis |
| EP2368564B1 (en) * | 2010-03-22 | 2015-09-02 | Reinhold Paul Linke | Pharmaceutical composition containing SAA for use in the treatment of acute and chronic dysregulated inflammatory diseases or conditions |
| KR101708651B1 (ko) * | 2010-12-31 | 2017-03-08 | (주) 프로탄바이오 | 혈청 아밀로이드 ａ에 대한 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포 |
| JP7177767B2 (ja) | 2016-07-29 | 2022-11-24 | ダイアザイム ラボラトリーズ， インコーポレイテッド | ビタミンｄをアッセイするための方法および組成物 |
| GB2568297A (en) * | 2017-11-13 | 2019-05-15 | Univ Stellenbosch | Method of Detecting Inflammation |
| CN109678945A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-04-26 | 迪亚莱博（张家港）生物科技有限公司 | 一种血清淀粉样蛋白a抗原表位、其预测与验证方法及单克隆抗体的制备方法 |
| CN109975555B (zh) * | 2019-03-11 | 2022-03-08 | 杭州利安生物科技有限公司 | 一种提高c反应蛋白试剂盒热稳定性的试剂、方法以及高热稳定性c反应蛋白试剂盒 |
| CN110927370A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-03-27 | 蓝怡科技集团股份有限公司 | 一种微球试剂的制备方法 |
| CN113698479B (zh) * | 2021-07-30 | 2023-01-17 | 杭州博岳生物技术有限公司 | 一种抗血清淀粉样蛋白a人-鼠嵌合单克隆抗体 |
-
1995
- 1995-08-30 JP JP24669595A patent/JP3713074B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-08-22 US US09/029,345 patent/US6375949B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-22 EP EP96927871A patent/EP0872558A4/en not_active Withdrawn
- 1996-08-22 WO PCT/JP1996/002342 patent/WO1997008335A1/ja not_active Application Discontinuation
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| JP2007525437A (ja) * | 2003-03-24 | 2007-09-06 | ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド | 抗ｉｌ−２０抗体および結合パートナーならびに炎症において用いる方法 |
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