JP2022540089A - 多特異性トランスサイレチン免疫グロブリン融合物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、多特異性結合タンパク質として有用な多特異性トランスサイレチン（ＴＴＲ）複合体に関する。本明細書に記載される多特異性ＴＴＲ複合体は、１つ以上のタンパク質上に存在し得る１つ、２つ、又はそれを超えるエピトープへの結合において特に有用である。本発明のＴＴＲ複合体を用いた疾患の治療方法が、本明細書に記載される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８７１，２４７号に対する優先権及び利益を主張するものである。
配列表の参照
本出願は、コンピュータ可読形式の配列表を含む。配列表は、２０２０年７月１日に作成されたＡ－２４１４－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のテキストファイルとして提供され、サイズが１０１，６６０バイトである。本配列表の電子フォーマットにおける情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、多特異性結合タンパク質として有用な多特異性トランスサイレチン（ＴＴＲ）複合体に関する。本明細書に記載される多特異性ＴＴＲ複合体は、１つ以上のタンパク質上に存在し得る１つ、２つ、又はそれを超えるエピトープへの結合において特に有用である。本発明のＴＴＲ複合体を用いた疾患の治療方法が、本明細書に記載される。
単一特異性抗体、すなわち、単一抗原に結合する抗体は、多様な治療分野で承認されている十分に確立されたクラスの化合物である。実際に、過去１０年間に、多くの単一特異性抗体ベースの医薬品が、様々な国で承認されてきた。
多特異性抗体などの多特異性タンパク質は、ますます多くの研究の対象となっている。多特異性タンパク質は、同じ又は異なるタンパク質上の２つ以上の異なる抗原に結合することができる。このことは、２つの異なる生物学的経路の可能性、又はその経路を同時に実行することを可能にする。
トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、循環チロキシンの一部の運搬及びレチノール結合タンパク質の血清半減期に役割を果たす、非共有結合四量体ヒト血清及び脳脊髄液タンパク質である。ＴＴＲは、典型的には四量体（約５６ｋＤａ）血清タンパク質として存在し、各単量体単位は約１４ｋＤａの分子量を有する。
タンパク質を多量体化する以前からの試みとしては、ストレプトアビジン（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（２）：２０３－２１１（１９９６））、ヘリックスターンヘリックス構築物（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１８：３１－４０（２００１））、ロイシンジッパー（Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１（１３）：７６３０－７６３４，１９９６（１９９６））、バーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）／バースター（ｂａｒｓｔａｒ）複合体（Ｄｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（１２）：１４８６－１４９２（２００３））、及びＤｏｃｋ Ｎ Ｌｏｃｋテクノロジー（プロテインキナーゼとＡ－キナーゼアンカータンパク質アンカードメイン相互作用）（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４９（１）：１５８－１６３（２００８））の使用が挙げられる。
しかしながら、同じ又は異なるタンパク質上の複数のエピトープに結合できる多特異性タンパク質（例えば、抗体全体及び抗体断片）を生成する効率的な手段が、尚、必要とされている。
Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（２）：２０３－２１１（１９９６） Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１８：３１－４０（２００１） Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１（１３）：７６３０－７６３４，１９９６（１９９６） Ｄｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（１２）：１４８６－１４９２（２００３） Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４９（１）：１５８－１６３（２００８）
本発明は、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここで
ＴＴＲタンパク質複合体は、ＴＴＲサブユニットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを含み；
ＴＴＲサブユニットＡ及びＢは、二量体化して、ＴＴＲ二量体ＡＢを形成し；
ＴＴＲサブユニットＣ及びＤは、二量体化して、ＴＴＲ二量体ＣＤを形成し；
ＴＴＲ二量体ＡＢ及びＣＤはさらに二量体化して、ＴＴＲ四量体ＡＢＣＤを形成し；
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれは、ＴＴＲ二量体ＡＢ及びＴＴＲ二量体ＣＤの間の界面における少なくとも１つのアミノ酸が、ＡＢＣＤ四量体の形成が任意の他の四量体（例えば、ＡＢＡＢ四量体又はＣＤＣＤ四量体）の形成よりも有利であるように突然変異されていることを除いて、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
ＴＴＲタンパク質複合体のＡ、Ｂ、Ｃ及びＤサブユニットのそれぞれは、以下の突然変異を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むことができる：Ｃ１０Ａ、Ｋ１５Ａ、又はＣ１０Ａ及びＫ１５Ａの両方。
したがって、一実施形態では、本発明は、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここでＡ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つ全ては、配列番号１の６、７、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、５０、５１、５２、５３、５４、５６、５７、６０、６１、６２、６３、７８、８２、８３、８４、８５、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、及び１２７を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置に突然変異を含む。
別の実施形態では、本発明は、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここでＡ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの全ては、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含む。
別の実施形態では、本発明は、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここでＡ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの全ては、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含み、ここで前記アミノ酸は、アスパルテート、グルタメート、アルギニン、リシン、又はヒスチジンに突然変異されている。
別の実施形態では、本発明は、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここでＡ及びＢは、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含み、ここで前記アミノ酸は、アスパルテート又はグルタメートに突然変異されている。
さらに別の実施形態では、本発明は、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここでＣ及びＤは、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含み、ここで前記アミノ酸は、アルギニン、リシン、又はヒスチジンに突然変異されている。
特定の実施形態では、Ａ及びＢは、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含み、ここで前記アミノ酸は、アスパルテート又はグルタメートに突然変異されており；Ｃ及びＤは、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含み、ここで前記アミノ酸は、アルギニン、リシン、又はヒスチジンに突然変異されている。
いくつかの実施形態では、Ａ及びＢは、配列番号１における少なくとも１つの突然変異を含み、前記突然変異は、Ｋ１５Ｄ、Ｌ１７Ｄ、Ｖ２０Ｄ、Ｒ２１Ｄ、Ｇ２２Ｄ、Ｓ２３Ｄ、Ｐ２４Ｄ、Ｓ５２Ｄ、Ｉ８４Ｄ、Ｔ１０６Ｄ、Ａ１０８Ｄ、Ｓ１１２Ｄ、Ｙ１１４Ｄ、Ｓ１１５Ｄ、Ｔ１１９Ｄ、Ｖ１２１Ｄ、Ｓ１２３Ｄ、Ｋ１５Ｅ、Ｌ１７Ｅ、Ｖ２０Ｅ、Ｒ２１Ｅ、Ｇ２２Ｅ、Ｓ２３Ｅ、Ｐ２４Ｅ、Ｄ５１Ｅ、Ｓ５２Ｅ、Ｉ８４Ｅ、Ｔ１０６Ｅ、Ａ１０８Ｅ、Ｓ１１２Ｅ、Ｙ１１４Ｅ、Ｓ１１５Ｅ、Ｔ１１９Ｅ、Ｖ１２１Ｅ、及びＳ１２３Ｅを含むリストから選択される。本発明はまた、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここでＡ及びＢは、配列番号１における少なくとも１つの突然変異を含み、突然変異は、Ｌ１７Ｄ、Ｌ１７Ｅ、Ｖ２０Ｄ、Ｖ２０Ｅ、Ｇ２２Ｄ、Ｇ２２Ｅ、Ｓ１１２Ｄ、Ｓ１１２Ｅ、Ｔ１１９Ｄ、Ｔ１１９Ｅ、Ｖ１２１Ｄ、及びＶ１２１Ｅを含むリストから選択される。
いくつかの実施形態では、Ｃ及びＤは、配列番号１における少なくとも１つの突然変異を含み、前記突然変異は、Ｋ１５Ｒ、Ｌ１７Ｒ、Ｖ２０Ｒ、Ｇ２２Ｒ、Ｓ２３Ｒ、Ｐ２４Ｒ、Ｄ５１Ｒ、Ｓ５２Ｒ、Ｉ８４Ｒ、Ｔ１０６Ｒ、Ａ１０８Ｒ、Ｓ１１２Ｒ、Ｙ１１４Ｒ、Ｓ１１５Ｒ、Ｔ１１９Ｒ、Ｖ１２１Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｌ１７Ｋ、Ｖ２０Ｋ、Ｒ２１Ｋ、Ｇ２２Ｋ、Ｓ２３Ｋ、Ｐ２４Ｋ、Ｄ５１Ｋ、Ｓ５２Ｋ、Ｉ８４Ｋ、Ｔ１０６Ｋ、Ａ１０８Ｋ、Ｓ１１２Ｋ、Ｙ１１４Ｋ、Ｓ１１５Ｋ、Ｔ１１９Ｋ、Ｖ１２１Ｋ、Ｓ１２３Ｋ、Ｋ１５Ｈ、Ｌ１７Ｈ、Ｖ２０Ｈ、Ｒ２１Ｈ、Ｇ２２Ｈ、Ｓ２３Ｈ、Ｐ２４Ｈ、Ｄ５１Ｈ、Ｓ５２Ｈ、Ｉ８４Ｈ、Ｔ１０６Ｈ、Ａ１０８Ｈ、Ｓ１１２Ｈ、Ｙ１１４Ｈ、Ｓ１１５Ｈ、Ｔ１１９Ｈ、Ｖ１２１Ｈ、及びＳ１２３Ｈを含むリストから選択される。本発明はまた、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここでＣ及びＤは、配列番号１における少なくとも１つの突然変異を含み、突然変異は、Ｌ１７Ｒ、Ｌ１７Ｋ、Ｌ１７Ｈ、Ｖ２０Ｒ、Ｖ２０Ｋ、Ｖ２０Ｈ、Ｇ２２Ｒ、Ｇ２２Ｋ、Ｇ２２Ｈ、Ｓ１１２Ｒ、Ｓ１１２Ｋ、Ｓ１１２Ｈ、Ｔ１１９Ｒ、Ｔ１１９Ｋ、Ｔ１１９Ｈ、Ｖ１２１Ｒ、Ｖ１２１Ｋ、及びＶ１２１Ｈを含むリストから選択される。
別の実施形態では、Ａ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの全ては、独立して、１つの上述した突然変異を含む。さらに別の実施形態では、Ａ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの全ては、独立して、２つの上述した前記突然変異を含む。
特定の実施形態では、本発明は、ＴＴＲタンパク質に関し、ここでＡ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれは、以下の突然変異を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む：
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）；又は
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）。
他の特定の実施形態では、本発明は、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここでＡ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれは、以下の突然変異を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む：
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む（又はその逆）；又は
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む（又はその逆）。
いくつかの実施形態では、Ａ及びＢは、配列番号１における２つの突然変異を含み、前記突然変異は、Ｌ１７Ｄ／Ｖ２０Ｄ、Ｌ１７Ｄ／Ｖ２０Ｅ、Ｌ１７Ｅ／Ｖ２０Ｄ、Ｌ１７Ｅ／Ｖ２０Ｅ、Ｌ１７Ｄ／Ｔ１１９Ｄ、Ｌ１７Ｄ／Ｖ１２１Ｅ、Ｌ１７Ｅ／Ｔ１１９Ｄ、Ｌ１７Ｅ／Ｖ１２１Ｅ、Ｖ２０Ｄ／Ｔ１１９Ｄ、Ｖ２０Ｄ／Ｖ１２１Ｅ、Ｖ２０Ｅ／Ｔ１１９Ｄ、及びＶ２０Ｅ／Ｖ１２１Ｅを含むリストから選択される。
いくつかの実施形態では、Ｃ及びＤは、配列番号１における２つの突然変異を含み、前記突然変異は、Ｌ１７Ｋ／Ｖ２０Ｋ、Ｌ１７Ｋ／Ｖ２０Ｒ、Ｌ１７Ｒ／Ｖ２０Ｋ、Ｌ１７Ｒ／Ｖ２０Ｒ、Ｌ１７Ｋ／Ｖ１２１Ｋ、Ｌ１７Ｋ／Ｖ１２１Ｒ、Ｌ１７Ｒ／Ｖ１２１Ｋ、Ｌ１７Ｒ／Ｖ１２１Ｒ、Ｖ２０Ｋ／Ｖ１２１Ｋ、Ｖ２０Ｋ／Ｖ１２１Ｒ、Ｖ２０Ｒ／Ｖ１２１Ｋ、及びＶ２０Ｒ／Ｖ１２１Ｒを含むリストから選択される。
本発明はまた、ＴＴＲタンパク質複合体におけるＡ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれが、以下の突然変異を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む実施形態を含む：
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋ／Ｖ２０Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋ／Ｖ２０Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒ／Ｖ２０Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒ／Ｖ２０Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）；
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒ／Ｖ１２１Ｋを含む（又はその逆）；又は
Ａ及びＢがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤがＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒ／Ｖ１２１Ｒを含む（又はその逆）。
いくつかの実施形態では、ＴＴＲタンパク質複合体は、１、２、３、４、５、６、７、又は８の生物活性タンパク質、ペプチド、又は小分子に付着する。いくつかの実施形態では、ＴＴＲタンパク質複合体は、１、２、３、４、５、６、７、又は８の抗原結合タンパク質又はペプチドに付着する。他の実施形態では、ＴＴＲタンパク質複合体は、１、２、３、又は４の抗原結合タンパク質又はペプチドに付着する。抗原結合タンパク質又はペプチドは、ＴＴＲサブユニットのＣ末端、又はＴＴＲサブユニットのＮ末端においてＴＴＲタンパク質複合体に付着することができる。加えて、ＴＴＲタンパク質複合体は、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８の抗原結合タンパク質若しくはペプチドに直接付着することができ；又はリンカーを介して１、２、３、４、５、６、７、若しくは８の抗原結合タンパク質若しくはペプチドに付着することができる。特定の実施形態では、ＴＴＲタンパク質複合体は、１、２、３、若しくは４の抗原結合タンパク質若しくはペプチドに直接付着し；又はリンカーを介して１、２、３、若しくは４の抗原結合タンパク質若しくはペプチドに付着する。
リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０のアミノ酸を含むアミノ酸ベースのリンカーであり得る。他の実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸を含むアミノ酸ベースのリンカーである。他の実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のアミノ酸を含むアミノ酸ベースのリンカーである。さらに別の実施形態では、リンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸を含むアミノ酸ベースのリンカーである。特定の実施形態では、リンカーは、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、又はＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧである。他の特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＳＧＧ、ＧＧＧＳＧＧＧＧ、及びＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧを含むリストから選択される。
他の好適なリンカーは、Ｇ（ＧｘＢｙ）ｒＧｚリンカーを含み、式中、Ｇ＝グリシン；Ｂ＝任意のアミノ酸；ｘ＝１～１５；ｙ＝１～５；ｚ＝１～１５；及びｒ＝１～２０である。別の実施形態では、リンカーはＧ（ＧｘＢｙ）ｒＧｚリンカーであり、式中、Ｂ＝Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｐ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｄ又はＮ；ｘ＝４；ｙ＝１；ｚ＝４；及びｒ＝１である。
本発明のいくつかの実施形態では、ＴＴＲタンパク質複合体は、２つの抗原結合タンパク質に付着し、各抗原結合タンパク質は、異なる抗原に結合する。本発明の別の実施形態では、ＴＴＲタンパク質複合体は、４つの抗原結合タンパク質に付着し、抗原結合タンパク質は、少なくとも２つの異なる抗原に結合する（例えば、１つの抗原結合タンパク質が第１の抗原に結合し、３つの抗原結合タンパク質が第２の抗原に結合する；又は２つ抗原結合タンパク質が第１の抗原に結合し、２つの抗原結合タンパク質が第２の抗原に結合する）。
抗原結合タンパク質は、抗体であってもよい。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ又はｓｃＦｖである。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、Ｆａｂである。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体とＦａｂの混合物である。
本発明はまた、上述したＴＴＲタンパク質複合体のいずれかを含む医薬組成物を含む。
加えて、本発明は、本明細書に論じたＴＴＲタンパク質複合体のいずれかを使用するがんの治療方法を含む。本発明のＴＴＲタンパク質複合体は、がんの治療に使用することができる。本発明はまた、がんの治療に使用するための、本明細書に論じたＴＴＲタンパク質複合体のいずれかを含む。
別の実施形態では、本発明は、本明細書に論じたＴＴＲタンパク質複合体のいずれかをコードする、１つ以上の単離された核酸を含む。加えて、本発明は、本明細書に論じたＴＴＲタンパク質複合体のいずれかをコードする核酸を含む発現ベクターを含む。本発明はさらに、そのような核酸又はベクターを含む組換え宿主細胞を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｅ５細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓（ＣＯＳ）細胞、ヒト肝細胞癌細胞、又はヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるＴＴＲタンパク質複合体の作製方法に関し、該方法は：ａ）組換え宿主細胞を培養することと、ｂ）培養物からＴＴＲタンパク質複合体を単離することと、を含む。
図１は、本発明のＴＴＲタンパク質複合体（構築物又は融合タンパク質）の概略図である。図１ａは、本発明のＴＴＲ複合体を構成する４つのＴＴＲサブユニットを示す。図１ｂは、両方の抗体重鎖のＣ末端が各ＴＴＲサブユニットのＮ末端に連結される、例示的なＴＴＲ抗体ヘテロ二量体融合タンパク質である。この例では、２つの抗体が、同じ又は異なるタンパク質のいずれかの異なるエピトープに結合する。図１ｃは、例示的なＴＴＲ抗体／Ｆａｂヘテロ三量体融合タンパク質である。この例では、抗体は、同じ又は異なるタンパク質のいずれかの第１のエピトープに結合し、Ｆａｂは第２のエピトープに結合する。図１ｄは、各ＦａｂのＣ末端が各ＴＴＲサブユニットのＮ末端に連結される例示的なＴＴＲ Ｆａｂヘテロ四量体融合タンパク質である。この例では、２つのＦａｂが、同じ又は異なるタンパク質のいずれかの第１のエピトープに結合し、２つのＦａｂが第２のエピトープに結合する。図１ｂ～図１ｄのそれぞれは、重鎖とＴＴＲの間の任意選択的なリンカーを示す。 図２ａ～図２ｅは、例示的なヘテロマーＴＴＲ Ａｂ、ＴＴＲ Ｆａｂ、及びＴＴＲ Ａｂ／Ｆａｂタンパク質複合体を表す。任意の抗原結合タンパク質（例えば、Ｆａｂ、抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ）又は酵素などのタンパク質を、本発明のＴＴＲタンパク質複合体で使用することができる。図２ｅの「＋」及び「－」の記号は、抗体全体で１つのＴＴＲサブユニットの一貫した付着を可能にするＦｃ電荷対を示す。図２ａ～図２ｅはまた、タンパク質複合体のそれぞれについての簡略化された記述を列挙する（例えば、［［Ｆａｂ「Ａ」］－［負ＴＴＲ］］２：［［正ＴＴＲ］－［Ｆａｂ「Ｂ」］］２）ここで「Ａ」は、第１の標的を指し、「Ｂ」は、第２の標的を指す。「－」は、２つの部分（例えば、［正ＴＴＲ］及び［Ｆａｂ「Ｂ」］）の間の単一の付着点を示し、一方、「＝」は、２つの部分（例えば、［６５５－３４１ Ａｂ］及び［負ＴＴＲ］）の間の２つの付着点を示す。特に、簡略表現（ｓｈｏｒｔｈａｎｄ）はＮ→Ｃ又はＣ→Ｎ配向を示唆するものではなく、分子の「左から右への」簡略化記述である。簡略表現の第２の形態も示される。例えば、図２ａの構築物は、「４Ｘ－Ｆａｂ－ＴＴＲ」と記されてもよく、これは４つのＦａｂがＴＴＲ複合体に付着していることを示す。同様に、構築された図２ｂ及び図２ｅは、それぞれ、「２Ｘ－Ａｂ－ＴＴＲ」及び「４Ｘ－Ａｂ－ＴＴＲ」と記されてもよい。 図３は、ＴＴＲ二量体の２セット（左側）を形成するＴＴＲ単量体間の界面と、ＴＴＲ四量体（右側）を形成するＴＴＲ二量体間の界面を示す。理解され得るように、ＴＴＲ単量体間の界面は、ＴＴＲ二量体間の界面と異なる。 図４は、電荷突然変異がＴＴＲ二量体／二量体界面の実質的な反発をもたらすか否かを評価するため作製されたＴＴＲ（配列番号１）の１８のＴＴＲ電荷バリアント（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／ＸＸ）を示す。 図５は、様々なＴＴＲ二量体／二量体界面（突然変異を有する）が、熱を有し及び有さずに、ＳＤＳ（カオトロープ）の存在にどのように応答したかを示す。 図６は、ＴＴＲバリアントに対する非変性条件の効果を示す。ＴＴＲバリアント、収量、ＴＴＲが四量体又は二量体のどちらで存在しているか（ＳＥＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により）、並びにＴＴＲ融解温度を示す。 図７は、ＳＥＣ（上）及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ（下）の両方によるＴＴＲヘテロ四量体形成の評価を示す。ＳＥＣ（上）分析はバリアント対合の多くが、非ゼロ値（ＴＴＲ四量体と一致する保持時間を有する分子の％）により示されるように、ヘテロ多量体を形成する傾向を有したことを示す。加えて、ＴＴＲヘテロ四量体の多くは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果により示されるように、カオトロピックＳＤＳによる分解に抵抗性であった。 図８は、安定なＴＴＲ四量体を形成する高い傾向を示した正／負対合のさらなるＳＤＳ－ＰＡＧＥ評価を示す。ＴＴＲヘテロ四量体は、ＳＤＳ誘導による変性に抵抗性であり、これは良好な安定性の指標である。各対合について、［１］負（すなわち、塩基性）バリアント；［２］正（すなわち、酸性）バリアント；［３］負及び正バリアントの組み合わせ（四量体を形成する筈である）；並びに［４］カスパーゼに曝露された負及び正バリアントの組み合わせを評価した。 図９は、医薬製剤中に見出されるものと類似の条件において、四量体状態を維持できるか否かを決定するために（ＳＥＣによって）、ｐＨ５．０条件に曝露された場合のＬ１７Ｒ／Ｔ１１９Ｄ、Ｌ１７Ｋ／Ｔ１１９Ｄ、Ｌ１７Ｋ／Ｖ１２１Ｅ、Ｖ２０Ｒ／Ｖ２０Ｄ、Ｖ２０Ｒ／Ｖ２０Ｅ、Ｖ２０Ｋ／Ｖ２０Ｄ、Ｖ２０Ｋ／Ｖ２０Ｅ、Ｖ１２１Ｒ／Ｌ１７Ｄ、Ｖ１２１Ｒ／Ｌ１７Ｅ、及びＶ１２１Ｋ／Ｌ１７Ｄ対合を含むＴＴＲヘテロ四量体の評価を示す。 図１０は、ＴＴＲヘテロ四量体の融解温度の評価を示す。それぞれの場合（図に示す突然変異体）、ＴＴＲヘテロ四量体は、少なくとも９２℃まで安定であり、ヘテロ四量体が熱的に安定であることを示す。 図１１は、二重特異性ＴＴＲヘテロ四量体Ａｂ構築物の構成を示す。例示的な二重特異性ＴＴＲヘテロ四量体Ａｂ構築物を示し、６５５－３４１ Ａｂ（斜線）の各重鎖は、負ＴＴＲ単量体のＮ末端に付着し（一緒になって負ＴＴＲ二量体を形成する）、ＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂの各重鎖（塗りつぶし）は、正ＴＴＲ単量体のＮ末端に付着する（一緒になって正ＴＴＲ二量体を形成する）。４つの負ＴＴＲバリアントが６５５－３４１ Ａｂに融合され、４つの正ＴＴＲバリアントがＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂに融合された。Ａｂ－ＴＴＲ融合物の全ては、ＡｂとＴＴＲ単量体との間のリンカーを有さずに作製された。 図１２は、［６５５－３４１ Ａｂ］＝［負ＴＴＲ］２及び［正ＴＴＲ］２＝［ＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ］四量体の部分が別個の哺乳動物細胞（２９３－６Ｅ ＨＥＫ細胞）中で発現される場合、ＴＴＲヘテロ四量体Ａｂ構築物が効率的に生成しないことを示す。 図１３は、２つの異なる哺乳動物細胞中での２つの四量体部分の発現についての、Ａｂ重鎖とＴＴＲ単量体との間にリンカーを加えることの効果を評価するための、二重特異性ＴＴＲヘテロ二量体Ａｂ構築物の構成を示す。 図１４は、Ａｂ重鎖とＴＴＲ単量体との間にリンカーを有する二重特異性ＴＴＲヘテロ四量体Ａｂ構築物の２つの異なる哺乳動物細胞における２つのＡｂ－ＴＴＲヘテロ二量体部分の発現の結果（リンカーによって順序付けられた）を示す。 図１５は、Ａｂ重鎖とＴＴＲ単量体との間にリンカーを有する二重特異性ＴＴＲヘテロ四量体Ａｂ構築物の２つの異なる哺乳動物細胞における２つのＡｂ－ＴＴＲヘテロ二量体部分の発現のさらなる結果（リンカーによって順序付けられた）を示す。 図１６は、図１４及び図１５の結果の平均を示す。 図１７は、哺乳動物細胞株（ＣＨＯ Ｋ１）におけるＴＴＲ融合物の評価のための、二重特異性ＴＴＲヘテロ四量体Ｆａｂ構築物の構成を示す。 図１８は、図１７の二重特異性ＴＴＲヘテロ四量体Ｆａｂ構築物の評価の結果を示す。 図１９は、ホモ多量体Ａｂ－及びＦａｂ－ＴＴＲ融合物並びに非融合Ａｂ（それぞれ、標準物質として）と比較した、ヘテロ多量体分子１５５２４（［６５５－３４１ Ｆａｂ］－［ＧＧ］－［ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄ）］及び［ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒ）］－［ＧＧ］－［ＤＮＰ－３Ｂ１ Ｆａｂ］）の保持（ＳＥＣ）を示す。 図２０は、分子１５５２４（ヘテロ多量体としての）で予想されたものと一致する、ＳＥＣ結合ＭＳによる溶離種（図１９から）の分子質量の確認を示す。 図２１は、Ａｂ含有ＴＴＲ融合物の共発現が所望のＴＴＲヘテロ四量体［６５５－３４１ Ａｂ］＝［［ＬＸ］－［負ＴＴＲ］］２：［［正ＴＴＲ］－［ＬＸ］］２＝［ＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ］の生成をもたらすか否かを決定するための、Ａｂ含有ＴＴＲ融合物の構成を示す。 図２２は、有意な量の所望のＴＴＲヘテロ四量体が、図２１の組み合わせの複数について形成されたことを示す。 図２３は、ホモ多量体Ａｂ－及びＦａｂ－ＴＴＲ融合物並びに非融合Ａｂ（それぞれ、標準物質として）と比較した、ヘテロ多量体分子１５５３９（［６５５－３４１ Ａｂ］＝［［ＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧ］－［ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄ］］２：［［ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋ）］－［ＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧ］］２＝［ＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ］）の保持（ＳＥＣ）を示す。 図２４は、分子１５５３９（ヘテロ多量体としての）で予想されたものと一致する、ＳＥＣ結合ＭＳによる溶離種（図２３から）の分子質量の確認を示す。 図２５は、図２２の結果の平均を示す。 図２６は、同じ細胞株におけるＡｂ及びＦａｂに融合した負及び正ＴＴＲバリアント（４つの各突然変異）の共発現が、Ａｂ－Ｆａｂ－ＴＴＲ構築物（すなわち、［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［［正ＴＴＲ］＝［Ｆａｂ「Ｂ」］］２構築物）の生成をもたらすか否かの評価を示す。 図２７は、図２６のＡｂ－Ｆａｂ－ＴＴＲ構築物の発現、精製、及び分析の結果を示す。 図２８は、ホモ多量体Ａｂ－及びＦａｂ－ＴＴＲ融合物並びに非融合Ａｂ（それぞれ、標準物質として）と比較した、ヘテロ多量体分子１５５４５（［６５５－３４１ Ａｂ］＝［［ＧＧＧＧ］－［ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄ）］］２：［［ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒ）］－［ＧＧ］－［ＤＮＰ－３Ｂ１－Ｆａｂ］］２）の保持（ＳＥＣによる）を示す。 図２９は、分子１５５４５（ヘテロ多量体としての）で予想されたものと一致する、ＳＥＣ結合ＭＳによる溶離種（図２８から）の分子質量の確認を示す。 図３０は、図２７の結果の平均を示す。 図３１は、二重電荷突然変異が、ホモ多量体と比較して増大した、ヘテロ多量体の選択性を可能にするか否かを評価するために作製された、ＴＴＲ（配列番号１）のＴＴＲ二重電荷バリアント（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／ＸＸ／ＹＹ）を示す。 図３２は、別個に発現した単一及び二重界面突然変異体の発現収率、精製収率、及びＳＥＣ特性を示す。 図３３は、例示的な単一及び二重界面突然変異体のＳＥＣプロファイルを示す。 図３４は、二重電荷突然変異が、ホモ多量体と比較して増大したヘテロ多量体の選択性を可能にするか否かを評価するために作製された、ＴＴＲ（配列番号１）のＴＴＲ二重電荷バリアント（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／ＸＸ／ＹＹ）を示す。 図３５は、負突然変異で分類した単一及び二重界面突然変異体の精製後混合のＳＥＣ特性を示す。 図３６は、正突然変異で分類した単一及び二重界面突然変異体の別個の精製後混合のＳＥＣ特性を示す。 図３７は、精製後混合の後の別個の例示的な単一及び二重界面突然変異体のＳＥＣプロファイルを示す。 図３８は、細胞株の共培養により生成された単一及び二重界面突然変異体の精製収率及びＳＥＣプロファイルを示す。 図３９は、図３８に示したデータの続きを示す。 図４０は、二重界面突然変異体の共培養により生成された例示的な分子のＳＥＣプロファイルを示す。
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的に過ぎず、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。
本明細書では、別段の定義がない限り、本出願と関連して使用される科学用語及び専門用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
一般に、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びに本明細書に記載のタンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及び技術は当該技術分野でよく知られ、且つ一般に使用されているものである。別段の記載がない限り、本出願の方法及び手法は、一般に、当該技術分野においてよく知られる通常の方法に従って実施され、こうした方法及び手法は、本明細書を通して引用及び議論される様々な一般の参考文献及び特定性の高い参考文献に記載されるものである。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。酵素反応及び精製手法は、製造者の説明に従って実施されるか、当該技術分野において一般に達成されるように実施されるか、又は本明細書に記載のように実施される。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、並びに医薬品化学及び製薬化学と関連して使用される専門用語、並びにそれらの実験室的な手順及び手法は、よく知られているものであり、当該技術分野において一般に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬調製、配合、及び送達、並びに患者の治療に標準的な手法が使用され得る。
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬などに限定されず、したがって、変わり得るものであると理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態の説明を目的としているにすぎず、開示の範囲の限定は意図されず、開示の範囲は、特許請求の範囲のみによって定義される。
実施例又は別の形で記載される場合を除き、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を示す数は全て、全ての場合において「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。「約」という用語は、割合と関連して使用されるとき、±１％を意味し得る。
より狭い範囲、具体的には本明細書の特定のパラグラフによって定義される変形よりも狭い範囲全ての実施形態は、本開示に含まれると見なされるべきである。例えば、特定の態様は類概念として説明されており、類概念の全ての構成要素は、個別に、実施形態であり得ることを理解すべきである。また、類概念として記載された態様又は類概念の構成要素を選択する態様は、類概念の２つ以上の構成要素の組み合わせを包含すると理解すべきである。また、様々な実施形態の様々な状況下で「含んでいる」という言語を使用して提示される一方、関連する実施形態はまた、「～からなっている」又は「本質的に～からなっている」という言語を使用して記載され得ると理解すべきである。
本願では、「又は」の使用は、特に断らない限り「及び／又は」を意味する。さらに、「含んでいる」という用語並びに「含む」及び「含まれる」などの他の形態の使用は、限定的ではない。また、「要素」又は「構成要素」などの用語は、特に断らない限り、１つのユニットを含む要素及び構成要素並びに２つ以上のサブユニットを含む要素及び構成要素の両方を包含する。
定義
「アミノ酸」は、当該技術分野におけるその標準の意味を含む。２０種の天然起源のアミノ酸及びそれらの略語は、従来の使用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ－Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，ｅｄｓ．），Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１）（この文献は任意の目的で参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。２０種の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ－アミノ酸）、［α］－，［α］－二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、及び他の非従来型のアミノ酸もまた、ポリペプチドに好適な構成成分であり得、語句「アミノ酸」に含まれる。非従来型アミノ酸の例としては、以下：４－ヒドロキシプロリン、［γ］－カルボキシグルタミン酸、［ε］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリシン、［ε］－Ｎ－アセチルリシン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリシン、［σ］－Ｎ－メチルアルギニン、並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表記法では、標準的な使用法及び慣例に従って、左手方向はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシル末端方向である。
本明細書で使用する場合、「アンタゴニスト」は、概して、分子、例えば、本明細書に提示されるような抗原結合タンパク質を指し、これは、抗原に結合でき、抗原に付随する生物学的シグナルを阻害する、低下させる、又は排除することができる。
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖を含み、且つ可変領域及び定常領域を含む、従来の免疫グロブリン構成を有するタンパク質を指す。例えば、抗体は、同一のポリペプチド鎖の対が２つある「Ｙ字型」構造であり、各対が１つの「軽」鎖（通常、分子量が約２５ｋＤａである）及び１つの「重」鎖（通常、分子量が約５０～７０ｋＤａである）を有する、ＩｇＧであり得る。抗体は、可変領域及び定常領域を有する。ＩｇＧ構造では、可変領域は、一般に約１００～１１０以上のアミノ酸であり、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、主に抗原認識に関与し、異なる抗原に結合する他の抗体間において実質的に異なっている。定常領域は、抗体が免疫系の細胞及び分子を動員することを可能にする。可変領域は、各軽鎖及び重鎖のＮ末端領域からできているが、定常領域は、重鎖及び軽鎖のそれぞれのＣ末端部分からできている。（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，４ｔｈｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（１９９９））。
抗体は、当該技術分野において既知の任意の定常領域を含み得る。ヒト軽鎖は、ヒト軽鎖カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ又はイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が挙げられるが、これらに限定されないいくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２が挙げられるが、これらに限定されないサブクラスを有する。本開示の実施形態は、抗体のこうしたクラス又はアイソタイプの全てを含む。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ型又はラムダ型軽鎖定常領域、例えばヒトカッパ型又はラムダ型軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型又はミュー型重鎖定常領域、例えばヒトアルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型又はミュー型重鎖定常領域であり得る。したがって、例示的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のいずれか１つを含むアイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭの抗体である。
「抗原」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体を含む）などの結合剤による結合を受ける能力を有し、さらに、その抗原に結合する能力を有する抗体を生成するために動物において使用することが可能な分子又は分子の一部を指す。抗原は、異なる抗原結合タンパク質（例えば、抗体）と相互作用する能力を有する１つ以上のエピトープを有し得る。
本明細書で使用する場合、「抗原結合タンパク質」は、特定の標的抗原と特異的に結合する任意のタンパク質を意味する。本用語は、少なくとも１つの抗原結合領域を含むポリペプチドを含む。用語はまた、少なくとも２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含む抗体、並びにその誘導体、バリアント、断片及び変異体を包含する。抗原結合タンパク質としてはまた、以下でより詳細に記載されるように、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）（登録商標）などのドメイン抗体、及びｓｃＦｖが挙げられる。
「抗原結合領域」又は「抗原結合ドメイン」は、分子（例えば、抗原）上の所与のエピトープ又は部位に特異的に結合、相互作用、又はそれを認識する抗体若しくは断片、誘導体、又はこれらのバリアントなどのタンパク質の部分を意味する。例えば、抗原と相互作用し、抗原に対するその特異性及び親和性を抗原結合タンパク質に与えるアミノ酸残基を含む抗原結合タンパク質のその部分は、「抗原結合領域」と称される。抗原結合領域は、１つ以上の「相補的決定領域」（「ＣＤＲ」）を含み得る。特定の抗原結合領域は、１つ以上の「フレームワーク」領域も含む。「フレームワーク」領域は、抗原結合タンパク質の特異的結合に直接寄与し得るが、典型的には、ＣＤＲの適切な立体構造の維持に役立つことで、抗原結合領域と抗原との間の結合を促進し得る。
「がん」、「腫瘍」、「がん性」、及び「悪性」という用語は、典型的には、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳類の生理条件に関するか又はそれを記載する。がんの例としては、腺癌、リンパ腫、芽腫、黒色腫、肉腫、及び白血病を含む癌腫が挙げられるがこれらに限定されない。このようながんの更なる特定の例としては、黒色腫、肺がん、頭頚部がん、腎細胞がん、結腸がん、結腸直腸がん、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、消化管がん、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵がん、神経膠芽腫、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、例えば肝細胞癌及びヘパトーマ（ｈｅｐａｔｏｍａ）など、膀胱がん、乳がん、子宮内膜癌、骨髄腫（多発性骨髄腫など）、唾液腺癌、腎がん、例えば腎細胞癌及びウィルムス腫瘍など、基底細胞癌、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、精巣がん、及び食道がんが挙げられる。
「ＣＤＲ」及びその複数形「ＣＤＲ」（「超可変領域」とも称される）という用語は、抗体若しくは断片、誘導体、又はこれらのバリアントなどのタンパク質の相補的決定領域を指す。軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、各々、３つのＣＤＲを含有する。例えば、軽鎖可変領域は、以下のＣＤＲ：ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含有し；重鎖可変領域は、以下のＣＤＲ：ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含有する。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を含み、したがって抗体分子の機能的活性に寄与する。ＣＤＲは、抗原特異性の主要な決定要因である。
ＣＤＲの境界及び長さの厳密な定義は、各種分類及び付番方式に従う。したがって、ＣＤＲは、本明細書に記載される付番方式を含む、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ｃｏｎｔａｃｔ又は任意の他の境界定義によって表わされ得る。Ｋａｂａｔの付番スキーム（方式）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を一貫した様式で付番するために広く採用されている標準であり、本明細書の他の箇所でも言及されるとおり本発明での適用に好ましいスキームである。さらなる構造的な考慮が抗体のカノニカル構造を決定するために使用される場合がある。例えば、Ｋａｂａｔの付番法では十分に反映されない相違をＣｈｏｔｈｉａらの付番方式によって記載することができ、且つ／又は他の技術、例えば結晶学及び二次元若しくは三次元コンピュータモデリングによって明らかにすることができる。境界が異なっていても、これらの方式の各々は、可変配列内のＣＤＲを構成する部分において、ある程度の重複を有する。したがって、これらの方式によるＣＤＲの定義は、長さ及び隣接するフレームワーク領域に関する境界領域が相違する場合がある。例えば、Ｋａｂａｔ（異種間の配列可変性に基づく手法）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法）及び／又はＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前掲；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１－９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）を参照のこと。抗原結合部位を特徴付けるさらに別の標準は、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されるＡｂＭ定義である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照されたい。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照されたい。
典型的には、ＣＤＲは、カノニカル構造として分類することができるループ構造を形成する。「カノニカル構造」という用語は、抗原結合（ＣＤＲ）ループがとる主鎖の立体構造を指す。比較構造研究から、６つの抗原結合ループのうちの５つは、利用可能な立体構造の限られたレパートリーのみを有することが見出された。各カノニカル構造をポリペプチド骨格のねじれ角によって特徴付けることができる。したがって、抗体間の対応するループは、ループの大部分において、高いアミノ酸配列可変性が見られるにもかかわらず、非常に類似した三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。さらに、採用されたループ構造とその周辺のアミノ酸配列との間に関連性が存在する。特定のカノニカルクラスの立体構造は、ループの長さにより、及びそのループ内並びに保存的フレームワーク内（すなわちループ外）の重要な位置に存在するアミノ酸残基により決定される。したがって、特定のカノニカルクラスへの割り当ては、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行われ得る。
同じエピトープについて競合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその断片）の文脈において使用される場合、「競合する」という用語は、抗原結合タンパク質間の競合を意味し、共通の抗原への参照抗原結合タンパク質の特異的結合を抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその断片）が試験下で阻止又は阻害するアッセイによって決定される。多くの種類の競合結合アッセイを使用することができ、例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２－２５３を参照）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４－３６１９を参照されたい）固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）；Ｉ－１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７－１５を参照されたい）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６－５５２を参照されたい）；及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７－８２）である。典型的には、そのようなアッセイでは、固体表面に結合した精製抗原又はこうした抗原を発現する細胞、非標識試験抗原結合タンパク質及び標識参照抗原結合タンパク質が使用される。競合的阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質には、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質及び立体障害が生じるために参照抗原結合タンパク質が結合するエピトープに十分に近接する隣接エピトープに結合する抗原結合タンパク質が含まれる。競合的結合を決定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書において提供される。例えば、一実施形態では、競合は、ＢｉａＣｏｒｅアッセイに従って決定される。通常、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在すると、競合する抗原結合タンパク質は、共通の抗原への参照抗原結合タンパク質の特異的結合が少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％阻害されることになる。いくつかの場合、結合は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％以上阻害される。
「制御配列」という用語は、それが連結されるコード配列の発現及びプロセシングに影響を与えることができるポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物用制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含み得る。例えば、真核生物用制御配列は、転写因子のための認識部位を１つ又は複数含むプロモーター、転写エンハンサー配列、及び転写終結配列を含み得る。「制御配列」は、リーダー配列及び／又は融合パートナー配列を含み得る。
ポリペプチドの「誘導体」は、挿入、欠失、又は置換バリアントとは異なる何らかの様式で、例えば、別の化学的部分へのコンジュゲーションにより、（例えば、化学的に）改変されたポリペプチドである。
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域のみ又は軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片である。ドメイン抗体の例としては、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）が挙げられる。いくつかの場合、２つ以上のＶＨ領域が、ペプチドリンカーを介して共有結合で連結されることで二価のドメイン抗体が創出される。二価のドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同一又は異なる抗原を標的とし得る。
「有効量」は、一般に、症状の重症度及び／又は頻度を低減する、症状及び／又は根本原因を排除する、症状及び／又はその根本原因の出現を予防する、及び／又はがんに起因する若しくは関連する損傷を改善させる若しくは修復するのに十分である量である。いくつかの実施形態では、有効量は、治療有効量又は予防有効量である。「治療有効量」は、病状（例えば、がん）若しくは症状、具体的には、病状と関連する状態若しくは症状の治療に十分な量、又は方法は何であれ、病状若しくは疾患と関連する任意の他の望ましくない症状の進行の予防、防止、遅延、若しくは好転に十分な量である。「予防有効量」は、対象に投与されると、意図した予防効果、例えば、がんの発症（若しくは再発）の予防若しくは遅延、又はがん若しくはがん症状の発症（若しくは再発）の可能性の低減を有することになる医薬組成物の量である。完全な治療効果又は予防効果は必ずしも１回用量の投与によって生じる必要はなく、一連の用量の投与の後にのみ生じてもよい。したがって、治療的有効量又は予防的有効量は、１回又は複数回の投与で投与し得る。
「エピトープ」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）によって認識され、特異的に結合されることができる抗原の部分を指す。ポリペプチドの文脈において、エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって並置された連続アミノ酸又は非連続アミノ酸から形成され得る。隣接するアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、タンパク質変性時に保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には、タンパク質変性時に失われる。エピトープは、典型的には、特有の空間高次構造中に、少なくとも３個、より典型的には、少なくとも５個又は８～１０個のアミノ酸を含む。「線形エピトープ」又は「連続エピトープ」は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）により、アミノ酸又は一次構造のその線形配列で認識されるエピトープである。「立体エピトープ」又は「不連続エピトープ」は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）により、その三次構造で認識されるエピトープである。これらのエピトープを構成する残基は、一次アミノ酸配列では隣接していない場合があるが、分子の三次構造では、互いに接近している。線形及び立体エピトープは、タンパク質が変性、断片化、又は還元される場合に、一般に、異なる動作をする。
「発現ベクター」又は「発現構築物」という用語は、宿主細胞の形質転換に適しており、そこに機能可能なように連結される１つ以上の異種性コード領域の発現を（宿主細胞と協同して）誘導及び／又は制御する核酸配列を含むベクターを指す。発現構築物は、限定はされないが、転写、翻訳に影響するか、又はそれを制御し、イントロンが存在するのであれば、そこに機能可能なように連結されるコード領域のＲＮＡスプライシングに影響する配列を含み得る。
「Ｆａｂ断片」又は「Ｆａｂ」は、１本の軽鎖と、１本の重鎖のＣＨ１及び可変領域とからなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
「Ｆａｂ’断片」又は「Ｆａｂ’」は、１つの軽鎖と、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインに加えてＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域も含む１つの重鎖の一部とを含み、その結果、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成することでＦ（ａｂ’）２分子を形成することができる。
「Ｆ（ａｂ’）２断片」又は「Ｆ（ａｂ’）２」は、２本の軽鎖と、２本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含む２本の重鎖とを含む。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つの重鎖の間のジスルフィド結合によって共にまとめられた２つのＦａｂ’断片から構成される。
「Ｆｃ領域」は、抗体のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合及びＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって共にまとめられる。
「Ｆｖ領域」は、重鎖と軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠いている。
抗原結合タンパク質、抗体、又はその断片に関して使用される「重鎖」という用語は、全長重鎖を含む。全長重鎖は、可変領域ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常領域ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含む。ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインは、カルボキシル末端にあり、ＣＨ３は、ポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ及びＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１サブタイプ及びＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭ、並びにＩｇＥなどの任意のアイソタイプのものであり得る。重鎖の断片は、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する。
「血液がん」は、骨髄などの血液形成組織、又は免疫系の細胞で生じるがんである。血液がんの例は、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫である。
「ヘテロ二量体融合タンパク質」又は「ヘテロ二量体タンパク質複合体」という用語は、２つの異なるタンパク質（例えば、抗原結合タンパク質；アゴニストペプチドなどのペプチド；及びアゴニストタンパク質ドメイン）を含む融合タンパク質を指す。特定の例では、ヘテロ二量体は、本明細書で記載されるように、ＴＴＲタンパク質を介して連結された２つの異なる抗原結合タンパク質（例えば、２つの異なる抗体）を含むＴＴＲヘテロ二量体融合タンパク質であり得る。別の例では、ヘテロ二量体は、本明細書で記載されるように、ＴＴＲタンパク質を介して連結された１つの抗体と１つのＦａｂとを含むＴＴＲヘテロ二量体融合タンパク質であり得る。例示的なヘテロ二量体融合タンパク質を図１ｂ及び図２ｂに示す。
「ヘテロ三量体融合タンパク質」又は「ヘテロ三量体タンパク質複合体」という用語は、３つの異なるタンパク質（例えば、抗原結合タンパク質；アゴニストペプチドなどのペプチド；及びアゴニストタンパク質ドメイン）を含む融合タンパク質を指す。特定の例では、ヘテロ三量体は、本明細書で記載されるように、ＴＴＲタンパク質を介して連結された１つの抗体と２つのＦａｂとを含むＴＴＲヘテロ三量体融合タンパク質であり得る（例えば、図２ｃを参照されたい）。
「ヘテロ四量体融合タンパク質」又は「ヘテロ四量体タンパク質複合体」という用語は、４つの異なるタンパク質（例えば、抗原結合タンパク質；アゴニストペプチドなどのペプチド；及びアゴニストタンパク質ドメイン）を含む融合タンパク質を指す。特定の例では、ヘテロ四量体は、本明細書で記載されるように、例えば抗体、Ｆａｂ、又はそれらの混合物が、ＴＴＲタンパク質を介して連結されている、ＴＴＲヘテロ四量体融合タンパク質である。例としては、抗原結合タンパク質が、抗体（例えば、図２ａを参照されたい）又はＦａｂ（例えば、図１ｄ及び図２ａを参照されたい）であるものが挙げられる。特定の例では、ヘテロ四量体融合タンパク質は、本明細書で記載されるように、例えば抗体、Ｆａｂ、又はそれらの混合物が、ＴＴＲタンパク質を介して連結されている、ＴＴＲヘテロ四量体融合タンパク質である。
「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換されており、それによって目的とする遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語には、目的遺伝子が存在する限り、子孫の形態又は遺伝的構成が元の親細胞と同一であるか否かにかかわらず、親細胞の子孫が含まれる。
「同一性」という用語は、配列を整列させ、比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子又は２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント」は、比較分子におけるアミノ酸又はヌクレオチドの間で残基が同一であるパーセントを意味し、比較される分子の中で最小のもののサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、アラインメントにおけるギャップ（もしあれば）を、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処しなければならない。整列させた核酸又はポリペプチドの同一性を計算するために使用され得る方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されるものが含まれる。
同一性パーセントを計算する際には、比較する配列を、配列間の最大の一致を与えるような方法で整列させる。同一性パーセントの決定に使用されるコンピュータプログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージであり、このプログラムパッケージは、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む。コンピュータアルゴリズムであるＧＡＰは、配列同一性パーセントが決定されることになる２つのポリペプチド又はポリヌクレオチドのアラインメントをとるために使用される。配列は、それらのそれぞれのアミノ酸又はヌクレオチドが最適に一致するように並べられる（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）。ギャップ開始ペナルティ（３×平均対角として計算される。ここで、「平均対角」は使用される比較マトリックスの対角の平均であり、「対角」は特定の比較マトリックスによってそれぞれの完全アミノ酸一致に割り当てられるスコア又は数である）及びギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップ開始ペナルティの１／１０倍である）、並びにＰＡＭ ２５０又はＢＬＯＳＵＭ ６２などの比較マトリックスが、アルゴリズムと共に使用される。特定の実施形態では、標準比較マトリックス（ＰＡＭ ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５－３５２を参照；ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリックスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５－１０９１９を参照）もまたアルゴリズムによって使用される。
ＧＡＰプログラムを使用し、ポリペプチド又はヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するための推奨パラメーターは、下記のものである。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２（上記）のＢＬＯＳＵＭ ６２；
ギャップペナルティー：１２（ただし、エンドギャップに対するペナルティなし）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアラインメントスキームは、２つの配列の短い領域のみの一致をもたらし得、この小さい整列領域は、２つの全長配列の間に有意な関係がないにもかかわらず、非常に高い配列同一性を有し得る。したがって、選択したアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）は、所望であれば、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続するアミノ酸にわたるアラインメントを生じるように調節し得る。
「免疫調節剤」という語句は、免疫応答を引き起こす、高める、又は抑制する分子を指す。免疫活性化剤は、免疫応答を引き起こす又は増強する分子である。免疫抑制剤は、免疫応答を低下させる又は抑制する分子である。したがって、活性化免疫療法は、対象の免疫系を引き起こす又は高めるために分子を投与することを伴う治療法である。抑制免疫療法は、対象の免疫系を低下させる又は抑制するために、対象が分子で治療される治療法である。
本明細書で使用される、抗体又は免疫グロブリンの鎖（重鎖又は軽鎖）の「断片」という用語は、全長鎖に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠いているが、抗原に特異的に結合することができる抗体の一部（その部分がどのように得られるか、又は合成されるかは問われない）を含む抗原結合タンパク質である。そのような断片は、それが標的抗原に特異的に結合するという点で生物学的に活性であり、所与のエピトープへの結合について、インタクトな抗体を含む、他の抗原結合タンパク質と競合し得る。一態様では、このような断片は、全長軽鎖又は重鎖中に存在する少なくとも１つのＣＤＲを保持し、いくつかの実施形態では、単一の重鎖及び／若しくは軽鎖又はその部分を含むであろう。こうした生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ手法によって生成してよく、又はインタクトな抗体を含む、抗原結合タンパク質の酵素的若しくは化学的な切断によって生成してよい。免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体、及びｓｃＦｖが挙げられ、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダ、又はウサギを含む任意の哺乳類源に由来し得る。例えば、１つ以上のＣＤＲなど、本明細書に開示の抗原結合タンパク質の機能性部分は、第２のタンパク質又は小分子に共有結合で結合させることで、体における特定の標的を対象とする治療剤を創出し、又は血清半減期を延長できることがさらに企図される。
「単離された核酸分子」は、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、若しくは合成を起源とするか、又はそれらの何らかの組み合わせであるＤＮＡ又はＲＮＡであって、単離されたポリヌクレオチドが天然に見出されるポリヌクレオチドの全て若しくは一部を伴わないか、又はそれが天然では連結されないポリヌクレオチドに連結されているＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。本開示の目的では、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は、インタクトな染色体を包含しないと理解されるべきである。特定の核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、その特定の配列に加えて、最大で１０若しくはさらに最大で２０に及ぶ数の他のタンパク質若しくはその一部をコードする配列を含み得、又は記載の核酸配列のコード領域の発現を制御する調節配列を機能可能なように連結して含み得、及び／又はベクター配列を含み得る。
本明細書で使用する場合、用語「単離されたポリペプチド」、「精製されたポリペプチド」、「単離されたタンパク質」、又は「精製されたタンパク質」は、他の成分から単離可能な組成物を指すことが意図され、ここで、ポリペプチドは、自然界から入手可能な状態に比べて任意の程度に精製されている。そのため、精製されたポリペプチドはまた、自然に発生し得る環境から遊離されるポリペプチドを指す。一般に、「精製された」は、様々な他の成分を除去するために分留を実施したポリペプチド組成物を指し、この組成物は、その発現された生物活性を実質的に維持する。用語「実質的に精製された」が使用される場合、この表記は、例えば、組成物中の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％以上のタンパク質を構成するなど、ポリペプチド又はペプチドが組成物の主成分を形成するペプチド又はポリペプチド組成物を指す。
抗原結合タンパク質、抗体又はその断片に関して使用される「軽鎖」という用語は、全長軽鎖を含む。全長軽鎖は、可変領域ドメイン（ＶＬ）及び定常領域ドメイン（ＣＬ）を含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖には、κ鎖及びλ鎖が含まれる。軽鎖の断片は、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する。
ポリペプチド、核酸、宿主細胞などの生物学的材料に関連して本明細書を通して使用される「天然起源」という用語は、天然に見出される材料を指す。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０～６０の塩基長である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０～４０のヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異遺伝子の構築において使用するための一本鎖又は二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのための放射標識、蛍光標識、ハプテン、又は抗原性標識を含む、標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマー、又はハイブリダイゼーションプローブとして使用してもよい。
本明細書で使用される「作動可能に連結される」は、この用語が適用される構成要素が、適切な条件下でそれがその固有機能を実施することが可能になる関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結される」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が制御配列の転写活性と適合する条件下で行われるように、タンパク質コード配列に連結される。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、一本鎖のヌクレオチドポリマーと二本鎖のヌクレオチドポリマーとの両方を含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又はいずれかの型のヌクレオチドの改変形態であり得る。改変には、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基改変、２’，３’－ジデオキシリボースなどのリボース改変、並びにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）及びホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）などのヌクレオチド間結合の改変が含まれる。
特に明記しない限り、本明細書で考察する任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への付加の方向は転写方向と呼ばれ、ＲＮＡ転写産物の５’末端の５’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡ転写産物の３’末端の３’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と呼ばれる。
「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、また、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然起源のアミノ酸の類似体又は模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然起源のアミノ酸ポリマーにも適用される。これらの用語は、また、例えば、（糖タンパク質を形成するための）炭水化物残基の付加、又はリン酸化によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含し得る。ポリペプチド及びタンパク質は、天然起源及び非組換え細胞により、又は遺伝子操作若しくは遺伝子組換え細胞により産生することができ、天然のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、若しくは天然の配列からの１つ以上のアミノ酸の欠失、それへの付加及び／又はその置換を有する分子を含む。「ポリペプチド断片」という用語は、全長タンパク質と比較して、アミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失及び／又は内部の欠失を有するポリペプチドを指す。そのような断片は、全長タンパク質と比較して改変されたアミノ酸も含み得る。特定の実施形態では、断片は、約５～５００のアミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０のアミノ酸長であり得る。
組換えＴＴＲタンパク質を含む、「組換えタンパク質」は、組換え手法の使用、すなわち本明細書に記載の組換え核酸の発現を介して作製されるタンパク質である。組換えタンパク質の生成方法及び生成技術は、当該技術分野においてよく知られている。
「一本鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが可動性リンカーによって連結されることで単一のポリペプチド鎖を形成しているＦｖ分子であり、この単一のポリペプチド鎖によって抗原結合領域が形成される。ｓｃＦｖは、国際公開第８８／０１６４９号パンフレット、並びに米国特許第４，９４６，７７８号明細書及び同第５，２６０，２０３号明細書において詳細に議論されている。
「固形腫瘍」は、通常は、嚢胞又は液体領域を含まない組織の異常な増殖又は塊を指す。固形腫瘍は、良性（がん性ではない）又は悪性（がん性）であり得る。異なるタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプにちなんで名付けられる。固形腫瘍の例は、肉腫、癌腫、及びリンパ腫である。白血病（血液のがん）は、一般に、固形腫瘍を形成しない。
抗原結合タンパク質が、抗原以外の分子にほとんど結合しないか、又は全く結合しないことを示す場合、抗原結合タンパク質は、抗原に「特異的に結合する」。しかしながら、抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、異なる種に由来する抗原と交差反応し得る。典型的には、表面プラズマ共鳴技術（例えば、ＢＩＡＣｏｒｅ，ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により測定した際に、解離定数（ＫＤ）が≦１０－７Ｍ である場合に、抗原結合タンパク質は、抗原に特異的に結合する。抗原結合タンパク質は、（ＢＩＡＣｏｒｅなどの方法を用いて測定した際に）ＫＤ≦５×１０－８Ｍで結合する場合に「高い親和性」で、ＫＤ≦５×１０－９Ｍで結合する場合に「非常に高い親和性」で、抗原に特異的に結合する。
本明細書で使用される「対象」又は「患者」は、任意の哺乳類であり得る。典型的な実施形態では、対象又は患者は、ヒトである。
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」は、記載された分子種が、存在する優勢な種であること、すなわちモル基準で同じ混合物中の任意の他の個々の種よりも豊富であることを意味する。特定の実施形態では、実質的に純粋な分子は、対象種が存在する全ての高分子種の少なくとも５０％（モル基準で）を含む組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％を含む。他の実施形態では、対象種は、従来の検出方法によって組成物中に汚染種を検出することができず、したがって組成物が単一の検出可能な高分子種からなる実質的均質性まで精製される。
「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、損傷、病状、若しくは病態の治療又は改善における成功の任意の兆候を指し、こうした兆候には、症状の軽減、寛解、縮小、又は損傷、病状、若しくは病態の患者耐容性の向上；悪化速度又は衰退速度の鈍化；悪化終点の衰弱軽減；患者の身体的又は精神的な健全性の改善など、任意の客観的又は主観的なパラメーターが含まれる。症状の治療又は改善は、身体検査、神経精神医学的検査及び／又は精神医学的評価の結果を含む、客観的又は主観的なパラメーターに基づき得る。例えば、本明細書に提示されている特定の方法は、例えば、がんの進行若しくは広がりを低減すること、腫瘍増殖を阻害すること、腫瘍の寛解を引き起こすこと、及び／又はがん若しくは腫瘍に関連する症状を改善することにより、がん及び腫瘍の治療に成功している。同様に、本明細書に提示されている他の方法は、感染症の進行若しくは広がりを低減すること、感染症の程度を低減すること、及び／又は感染症に関連する症状を改善することにより、感染症を治療する。
本明細書で使用する場合、「ＴＴＲ」という用語は、「トランスサイレチン」を指す。ヒトＴＴＲは、Ｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２４（２）：５５８－５６４（１９８４）（参照により本明細書に組み込まれる）で記載されている。ヒトＴＴＲに関するアミノ酸配列はまた、ｔｈｅ ＵｎｉＰｒｏｔ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０２７６６＃ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に記載されており、本明細書では、配列番号１として引用される。ヒトＴＴＲに関する核酸は、ＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／７２７６）で記載されている。ＧｅｎＢａｎｋ ｄｅｐｏｓｉｔ Ｋ０２０９１．１もまた参照されたい。ヒトＴＴＲについての核酸配列を配列番号４４として本明細書に列挙する。ネズミＴＴＲのアミノ酸及び核酸配列は、それぞれ、配列番号２及び３に示される。いくつかの実施形態では、ヒトＴＴＲ核酸は、配列番号１のヒトＴＴＲタンパク質をコードする核酸である。他の実施形態では、ネズミＴＴＲ核酸は、配列番号２のネズミＴＴＲタンパク質をコードする核酸である。
「ＴＴＲバリアント」という用語は、配列番号１を有するＴＴＲと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。本発明はまた、このようなＴＴＲバリアントをコードする核酸を含む。具体的なバリアントとしては、例えば、Ｃ又はＮ末端でトランケーションを有するＴＴＲタンパク質が挙げられる。
「腫瘍」とは、がん性細胞が増殖（ｇｒｏｗ）及び増殖（ｍｕｌｔｉｐｌｙ）するときに形成される組織の塊を指し、これは、正常な隣接する組織に侵入して破壊する可能性がある。がん細胞は、悪性腫瘍から離れて血流又はリンパ系に侵入し、がん細胞が原発腫瘍から広がって他の臓器に新しい腫瘍を形成することがある。
ポリペプチドの「バリアント」は、別のポリペプチド配列と比較して、アミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸残基の挿入、欠失及び／又は置換が生じたアミノ酸配列を含む。バリアントには、融合タンパク質が含まれる。
「ベクター」という用語は、核酸分子において、この核酸分子が連結されている別の核酸の輸送が可能な核酸分子を指すことが意図される。ベクターの一種である「プラスミド」は、環状２本鎖ＤＮＡループを指し、追加のＤＮＡセグメントがこれに連結され得る。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、このウイルスベクターでは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、このベクターが導入された宿主細胞中での自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時にこの宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それにより宿主のゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが機能可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書においては、「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態である場合に、同じ意味で用いられ得る。しかし、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）などの発現ベクターの他の形態を含むことを意図している。
ＴＴＲバリアント
前述したように、ヒトＴＴＲは、非共有結合四量体タンパク質である。ＴＴＲ四量体タンパク質は、二量体の二量体から構成される（図３）。興味深いことに、ＴＴＲ二量体を形成するＴＴＲ単量体の間の界面（図３、左側）と、ＴＴＲ四量体を形成するＴＴＲ二量体の間の界面（図３、右側）は異なっている。２つの界面の相違により、ＴＴＲ単量体の間の界面を破壊することなくＴＴＲ二量体の間の相互作用を調節するＴＴＲバリアントの操作が可能となる。
本発明の一態様では、四量体タンパク質を構成する４つのＴＴＲ単量体のそれぞれは、ＴＴＲサブユニットＡ、Ｂ、Ｃ又はＤとして記載することができ－ここで、ＴＴＲサブユニットＡ及びＢは、第１のＡＢ二量体を形成し、ＴＴＲサブユニットＣ及びＤは、第２のＣＤ二量体を形成する（図３）。ＴＴＲ二量体ＡＢ及びＴＴＲ二量体ＣＤは、会合してＴＴＲ四量体ＡＢＣＤを形成する。本発明のＴＴＲ単量体は、ＡＢＣＤ四量体の形成が任意の他の四量体（例えば、ＡＢＡＢ四量体又はＣＤＣＤ四量体）の形成よりも有利であるように、ＴＴＲ二量体ＡＢとＴＴＲ二量体ＣＤとの間の界面において少なくとも１つのアミノ酸突然変異（配列番号１に対して）を含む。
したがって、本発明は、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここで
ＴＴＲタンパク質複合体は、ＴＴＲサブユニットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを含み；
ＴＴＲサブユニットＡ及びＢは、二量体化して、ＴＴＲ二量体ＡＢを形成し；
ＴＴＲサブユニットＣ及びＤは、二量体化して、ＴＴＲ二量体ＣＤを形成し；
ＴＴＲ二量体ＡＢ及びＣＤはさらに二量体化して、ＴＴＲ四量体ＡＢＣＤを形成し；
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれは、ＴＴＲ二量体ＡＢ及びＴＴＲ二量体ＣＤの間の界面における少なくとも１つのアミノ酸が、ＡＢＣＤ四量体の形成が任意の他の四量体（例えば、ＡＢＡＢ四量体又はＣＤＣＤ四量体）の形成よりも有利であるように突然変異されていることを除いて、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
ＴＴＲタンパク質複合体のＡ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれは、以下の突然変異を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むことができる：Ｃ１０Ａ、Ｋ１５Ａ、又はＣ１０Ａ及びＫ１５Ａの両方。
したがって、一実施形態では、本発明は、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここでＡ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つ全ては、配列番号１の６、７、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、５０、５１、５２、５３、５４、５６、５７、６０、６１、６２、６３、７８、８２、８３、８４、８５、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、及び１２７を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置に突然変異を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は、Ｃ１０Ａ及びＫ１５Ａに追加される。
別の実施形態では、本発明は、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここでＡ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの全ては、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は、Ｃ１０Ａ及びＫ１５Ａに追加される。
別の実施形態では、本発明は、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここでＡ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの全ては、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含み、ここで前記アミノ酸は、アスパルテート、グルタメート、アルギニン、リシン、又はヒスチジンに突然変異されている。いくつかの実施形態では、突然変異は、Ｃ１０Ａ及びＫ１５Ａに追加される。
別の実施形態では、本発明は、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここでＡ及びＢは、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含み、ここで前記アミノ酸は、アスパルテート又はグルタメートに突然変異されている。いくつかの実施形態では、突然変異は、Ｃ１０Ａ及びＫ１５Ａに追加される。
さらに別の実施形態では、本発明は、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここでＣ及びＤは、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含み、ここで前記アミノ酸は、アルギニン、リシン、又はヒスチジンに突然変異されている。いくつかの実施形態では、突然変異は、Ｃ１０Ａ及びＫ１５Ａに追加される。
特定の実施形態では、Ａ及びＢは、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含み、ここで前記アミノ酸は、アスパルテート又はグルタメートに突然変異されており；Ｃ及びＤは、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含み、ここで前記アミノ酸は、アルギニン、リシン、又はヒスチジンに突然変異されている。いくつかの実施形態では、突然変異は、Ｃ１０Ａ及びＫ１５Ａに追加される。
いくつかの実施形態では、Ａ及びＢは、配列番号１における少なくとも１つの突然変異を含み、前記突然変異は、Ｋ１５Ｄ、Ｌ１７Ｄ、Ｖ２０Ｄ、Ｒ２１Ｄ、Ｇ２２Ｄ、Ｓ２３Ｄ、Ｐ２４Ｄ、Ｓ５２Ｄ、Ｉ８４Ｄ、Ｔ１０６Ｄ、Ａ１０８Ｄ、Ｓ１１２Ｄ、Ｙ１１４Ｄ、Ｓ１１５Ｄ、Ｔ１１９Ｄ、Ｖ１２１Ｄ、Ｓ１２３Ｄ、Ｋ１５Ｅ、Ｌ１７Ｅ、Ｖ２０Ｅ、Ｒ２１Ｅ、Ｇ２２Ｅ、Ｓ２３Ｅ、Ｐ２４Ｅ、Ｄ５１Ｅ、Ｓ５２Ｅ、Ｉ８４Ｅ、Ｔ１０６Ｅ、Ａ１０８Ｅ、Ｓ１１２Ｅ、Ｙ１１４Ｅ、Ｓ１１５Ｅ、Ｔ１１９Ｅ、Ｖ１２１Ｅ、及びＳ１２３Ｅを含むリストから選択される。本発明はまた、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここでＡ及びＢは、配列番号１における少なくとも１つの突然変異を含み、突然変異は、Ｌ１７Ｄ、Ｌ１７Ｅ、Ｖ２０Ｄ、Ｖ２０Ｅ、Ｇ２２Ｄ、Ｇ２２Ｅ、Ｓ１１２Ｄ、Ｓ１１２Ｅ、Ｔ１１９Ｄ、Ｔ１１９Ｅ、Ｖ１２１Ｄ、及びＶ１２１Ｅを含むリストから選択される。いくつかの実施形態では、突然変異は、Ｃ１０Ａ及びＫ１５Ａに追加される。
いくつかの実施形態では、Ｃ及びＤは、配列番号１における少なくとも１つの突然変異を含み、前記突然変異は、Ｋ１５Ｒ、Ｌ１７Ｒ、Ｖ２０Ｒ、Ｇ２２Ｒ、Ｓ２３Ｒ、Ｐ２４Ｒ、Ｄ５１Ｒ、Ｓ５２Ｒ、Ｉ８４Ｒ、Ｔ１０６Ｒ、Ａ１０８Ｒ、Ｓ１１２Ｒ、Ｙ１１４Ｒ、Ｓ１１５Ｒ、Ｔ１１９Ｒ、Ｖ１２１Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｌ１７Ｋ、Ｖ２０Ｋ、Ｒ２１Ｋ、Ｇ２２Ｋ、Ｓ２３Ｋ、Ｐ２４Ｋ、Ｄ５１Ｋ、Ｓ５２Ｋ、Ｉ８４Ｋ、Ｔ１０６Ｋ、Ａ１０８Ｋ、Ｓ１１２Ｋ、Ｙ１１４Ｋ、Ｓ１１５Ｋ、Ｔ１１９Ｋ、Ｖ１２１Ｋ、Ｓ１２３Ｋ、Ｋ１５Ｈ、Ｌ１７Ｈ、Ｖ２０Ｈ、Ｒ２１Ｈ、Ｇ２２Ｈ、Ｓ２３Ｈ、Ｐ２４Ｈ、Ｄ５１Ｈ、Ｓ５２Ｈ、Ｉ８４Ｈ、Ｔ１０６Ｈ、Ａ１０８Ｈ、Ｓ１１２Ｈ、Ｙ１１４Ｈ、Ｓ１１５Ｈ、Ｔ１１９Ｈ、Ｖ１２１Ｈ、及びＳ１２３Ｈを含むリストから選択される。本発明はまた、ＴＴＲタンパク質複合体に関し、ここでＣ及びＤは、配列番号１における少なくとも１つの突然変異を含み、突然変異は、Ｌ１７Ｒ、Ｌ１７Ｋ、Ｌ１７Ｈ、Ｖ２０Ｒ、Ｖ２０Ｋ、Ｖ２０Ｈ、Ｇ２２Ｒ、Ｇ２２Ｋ、Ｇ２２Ｈ、Ｓ１１２Ｒ、Ｓ１１２Ｋ、Ｓ１１２Ｈ、Ｔ１１９Ｒ、Ｔ１１９Ｋ、Ｔ１１９Ｈ、Ｖ１２１Ｒ、Ｖ１２１Ｋ、及びＶ１２１Ｈを含むリストから選択される。いくつかの実施形態では、突然変異は、Ｃ１０Ａ及びＫ１５Ａに追加される。
本発明のＴＴＲタンパク質複合体は、ＴＴＲサブユニットを含むことができ、ここでＡ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの全ては、独立して、本明細書に論じる１つ又は２つの突然変異を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＴＴＲタンパク質複合体は、ＴＴＲサブユニットを含むことができ、ここでＡ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの全ては、独立して、本明細書に論じる１つの突然変異を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は、Ｃ１０Ａ及びＫ１５Ａに追加される。
特定の実施形態では、本発明のＴＴＲタンパク質複合体は、ＴＴＲサブユニットを含み、ここでＡ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれは、以下の表１の突然変異（及びその逆）を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む：
Figure 2022540089000002
Figure 2022540089000003
Figure 2022540089000004
表１のＴＴＲバリアント及びバリアント対合のいずれも、本発明での使用に好適である。表２は、特定のバリアント及び対合に観察されるＴＴＲ四量体形成の量を示す（実施例２及び図７を参照されたい）。
Figure 2022540089000005
Figure 2022540089000006
本発明のＴＴＲタンパク質複合体は、ＴＴＲサブユニットを含むことができ、ここでＡ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの全ては、独立して、本明細書に論じる２つの突然変異を含む。いくつかの実施形態では、Ａ及びＢは、配列番号１における２つの突然変異を含み、前記突然変異は、Ｌ１７Ｄ／Ｖ２０Ｄ、Ｌ１７Ｄ／Ｖ２０Ｅ、Ｌ１７Ｅ／Ｖ２０Ｄ、Ｌ１７Ｅ／Ｖ２０Ｅ、Ｌ１７Ｄ／Ｔ１１９Ｄ、Ｌ１７Ｄ／Ｖ１２１Ｅ、Ｌ１７Ｅ／Ｔ１１９Ｄ、Ｌ１７Ｅ／Ｖ１２１Ｅ、Ｖ２０Ｄ／Ｔ１１９Ｄ、Ｖ２０Ｄ／Ｖ１２１Ｅ、Ｖ２０Ｅ／Ｔ１１９Ｄ、及びＶ２０Ｅ／Ｖ１２１Ｅを含むリストから選択される。いくつかの実施形態では、突然変異は、Ｃ１０Ａ及びＫ１５Ａに追加される。
いくつかの実施形態では、Ｃ及びＤは、配列番号１における２つの突然変異を含み、前記突然変異は、Ｌ１７Ｋ／Ｖ２０Ｋ、Ｌ１７Ｋ／Ｖ２０Ｒ、Ｌ１７Ｒ／Ｖ２０Ｋ、Ｌ１７Ｒ／Ｖ２０Ｒ、Ｌ１７Ｋ／Ｖ１２１Ｋ、Ｌ１７Ｋ／Ｖ１２１Ｒ、Ｌ１７Ｒ／Ｖ１２１Ｋ、Ｌ１７Ｒ／Ｖ１２１Ｒ、Ｖ２０Ｋ／Ｖ１２１Ｋ、Ｖ２０Ｋ／Ｖ１２１Ｒ、Ｖ２０Ｒ／Ｖ１２１Ｋ、及びＶ２０Ｒ／Ｖ１２１Ｒを含むリストから選択される。いくつかの実施形態では、突然変異は、Ｃ１０Ａ及びＫ１５Ａに追加される。
特定の実施形態では、本発明のＴＴＲタンパク質複合体は、ＴＴＲサブユニットを含み、ここでＡ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれは、以下の表３の突然変異（及びその逆）を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む：
Figure 2022540089000007
いくつかの実施形態では、本発明のＴＴＲタンパク質複合体は、ＴＴＲサブユニットを含み、ここでＡ及びＢ、又はＣ及びＤは、以下の突然変異Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅ／Ｔ１１９Ｄ、Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄ／Ｔ１１９Ｄ、Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅ／Ｔ１１９Ｄ、Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒ／Ｖ２０Ｋ、Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋ／Ｖ２０Ｋ、Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒ／Ｖ１２１Ｒ又はＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒ／Ｖ１２１Ｋを有する配列番号１のアミノ酸配列を含む。
上述したように、ＴＴＲバリアントもまた、本発明で使用され得る。本明細書で論じられるＴＴＲバリアントのいずれかも、互いに組み合わせて使用することができる。ＴＴＲバリアントは、配列番号１に関連して突然変位を有するＴＴＲタンパク質と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。
ヒトＴＴＲ（配列番号１）に存在するシステインは、生物活性タンパク質、ペプチド、又は小分子へのコンジュゲーションの部位として使用され得る。いくつかの実施形態では、ヒトＴＴＲ（配列番号１）に存在するシステインは、抗原結合タンパク質（例えば、抗体及びＦａｂ）へのコンジュゲーションの部位として使用され得る。加えて、本発明では、遺伝子操作されたシステインを有するＴＴＲバリアントなどの、部位特異的コンジュゲーションを可能にするＴＴＲバリアントを使用してもよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６３３，１５３号明細書を参照されたい。例えば、ＴＴＲバリアントは、以下のシステイン突然変異のうちの１つ以上を含み得る：Ａ３７Ｃ、Ｄ３８Ｃ、Ａ８１Ｃ、又はＧ８３Ｃ。
本発明において有用なさらなるバリアントとしては、例えば、Ｃ又はＮ末端でトランケーションを有するＴＴＲタンパク質が挙げられる。このようなＴＴＲタンパク質としては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のアミノ酸が、Ｃ又はＮ末端ＴＴＲタンパク質から除去されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、又は８のアミノ酸が、ＴＴＲタンパク質のＣ又はＮ末端から除去されるＴＴＲタンパク質を含む。他の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、又は８のアミノ酸が、ＴＴＲタンパク質のＮ末端から除去されるＴＴＲタンパク質を含む。
本発明で使用できるさらなるＴＴＲバリアントとしては、チロキシンへのＴＴＲの結合を低減又はブロックするものが挙げられる。２つチロキシン結合部位を含有する各ＴＴＲ四量体は、ＴＴＲ四量体の中央チャネルに配置される。このようなバリアントは、例えば、患者のチロキシン生物学への干渉を回避でき、ＴＴＲ融合物がチロキシン代謝経路で作用するのを回避する場合がある。本発明で使用できるさらなる他のＴＴＲバリアントとしては、ＴＴＲのタンパク質分解活性を低下又は排除するものが挙げられる。
加えて、ＴＴＲ－Ｈｉｓタグ融合物を本発明で使用してもよい。例えば、ＴＴＲ－Ｈｉｓタグ融合物は、ＦａｂがＦｃを欠いているＴＴＲ Ｆａｂ構築物の精製で、又はプロテインＡアフィニティカラムの低ｐＨ精製環境を回避することが有益なＴＴＲ Ａｂ構築物の精製に使用され得る。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグは、精製後に除去される。Ｈｉｓタグはまた、最終的な治療分子に存在していてもよい（すなわち、タグが精製後に残っていてもよい）。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグは、Ｈｉｓ、（Ｈｉｓ）２、（Ｈｉｓ）３、（Ｈｉｓ）４、（Ｈｉｓ）５、（Ｈｉｓ）６、（Ｈｉｓ）７、（Ｈｉｓ）８、（Ｈｉｓ）９、又は（Ｈｉｓ）１０タグである。特定の実施形態では、Ｈｉｓタグは、（Ｈｉｓ）６又は（Ｈｉｓ）７タグである。具体的な実施形態では、Ｈｉｓタグは、（Ｈｉｓ）６タグである。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のグリシンアミノ酸をリンカーとして含む。特定の実施形態では、Ｈｉｓタグは、２つのグリシン（例えば、ＧＧＨＨＨＨＨＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、２つのグリシンアミノ酸リンカーは、ＴＴＲバリアントと重鎖又は軽鎖との間に挿入され得る。
さらに、本発明のＴＴＲバリアントは、ＴＴＲ融合物のＰＫ又は溶解度特性を調節するのに役立ち得るグリコシル化部位を組み込んだバリアントを含み得る。加えて、本発明のＴＴＲバリアント又はＴＴＲ融合タンパク質は、有益なＰＫ特性を付与する部分、例えば、トリアジン含有部分（タンパク質と反応することができる末端基を有する構築物内に含まれる；例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０８３６０４号パンフレットを参照）を含むように改変されてもよい。
いくつかの実施形態では、ＴＴＲタンパク質複合体は、１、２、３、４、５、６、７、又は８の抗原結合タンパク質又はペプチドに付着する。他の実施形態では、ＴＴＲタンパク質複合体は、１、２、３、又は４の抗原結合タンパク質又はペプチドに付着する。抗原結合タンパク質又はペプチドは、ＴＴＲサブユニットのＣ末端、又はＴＴＲサブユニットのＮ末端においてＴＴＲタンパク質複合体に付着することができる。加えて、ＴＴＲタンパク質複合体は、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８の抗原結合タンパク質若しくはペプチドに直接付着することができ；又はリンカーを介して１、２、３、４、５、６、７、若しくは８の抗原結合タンパク質若しくはペプチドに付着することができる。特定の実施形態では、ＴＴＲタンパク質複合体は、１、２、３、若しくは４つの抗原結合タンパク質若しくはペプチドに直接付着し；又はリンカー若しくはペプチドを介して１、２、３、若しくは４つの抗原結合タンパク質に付着する。
ヘテロ二量体融合タンパク質（複合体）
本明細書で記載されるとおり、本発明は、部分的には、抗体などの抗原結合タンパク質の多量体化におけるＴＴＲの使用に関する。ＴＴＲは、ヒト血清中で見られるヒト細胞外タンパク質であるため、人体の全体にわたって比較的大きな量で存在すし、これによりＴＴＲは、本発明の多量体化構築物中に存在する場合（例えば、非ヒトタンパク質、細胞内タンパク質及び希少タンパク質と比較した場合）、免疫応答を誘発する可能性が低い。したがって、本発明の多量体化技術におけるその使用は有利である。
例えば、ＴＴＲは、異なるエピトープに結合する抗体の二量体化に使用することができ、ここでエピトープは、例えば、同じ又は異なるタンパク質上に存在する。そのようなヘテロ二量体融合タンパク質において、ＴＴＲ（配列番号１）又はそのバリアントは、四量体として存在し、ここでＴＴＲサブユニットは、抗体重鎖のＣ末端に連結されて、ＴＴＲ抗体ヘテロ二量体を形成する。例えば、各抗体重鎖のＣ末端（各抗体は２つのこのようなＣ末端を含有する）は、各ＴＴＲサブユニットのＮ末端に連結されてもよい（図１及び図２参照）。したがって、各抗体は、ＴＴＲ四量体中の２つのＴＴＲサブユニットに連結しており、ＴＴＲ抗体ヘテロ二量体を得る。
したがって、本発明は、２つの抗原結合タンパク質を含むヘテロ二量体融合タンパク質に関し、ここで各抗原結合タンパク質は、異なるエピトープに結合し、エピトープは、例えば、同じ又は異なるタンパク質上に存在する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体融合タンパク質は、タンパク質複合体に連結した抗原結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、ＴＴＲタンパク質複合体であり、ここでＴＴＲタンパク質複合体は、ＴＴＲ四量体である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体である。
特定の実施形態では、本発明は、ＴＴＲ四量体に連結した２つの抗体を含むヘテロ二量体融合タンパク質に関し、ここで各抗体結合タンパク質は、異なるエピトープに結合し、エピトープは、例えば、同じ又は異なるタンパク質上に存在する。抗体は、リンカーなしで、ＴＴＲ四量体と連結していてもよい（すなわち、抗体は、ＴＴＲに直接連結している）。
他の実施形態では、抗体は、リンカーを介して、ＴＴＲ四量体と連結している。例えば、アミノ酸リンカーは、抗体重鎖のＣ末端のＴＴＲサブユニットＮ末端への連結に使用され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、１～３５、又は１～４０のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、０、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、最大５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大５、１０、１５、又は２０のアミノ酸長である。特定の実施形態では、リンカーは、０、５、１０、１５、又は２０のアミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）５）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）６）である。他の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）３）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）４）である。
他の好適なアミノ酸リンカーとしては、例えば、ジスルフィド結合、（Ｇｌｙ）ｎ（ｎ＝１～１０）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１～５）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ、ＰＡＰＡＰ、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ、（Ａｌａ－Ｐｒｏ）ｎ（ｎ＝１～２０）、ＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶ、ＰＬＧＬＷＡ、ＲＶＬＡＥＡ、ＥＤＶＶＣＣＳＭＳＹ、ＧＧＩＥＧＲＧＳ、ＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥ、ＡＧＮＲＶＲＲＳＶＧ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＦＬＧ、及びＬＥが挙げられる。好適な非アミノ酸リンカーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、抗体は、リンカーあり又はリンカーなしで、トランケーションされたＴＴＲサブユニットに連結している。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸を、１つ以上のＴＴＲサブユニットのＮ末端から除去してもよく、抗体をトランケーションされたＴＴＲサブユニットＮ末端に付着させてもよい。
本発明はまた、本明細書に記載されたヘテロ二量体融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。ヘテロ二量体融合タンパク質を生成するための例示的な方法に関する詳細は、実施例中に見出すことができる。
ヘテロ三量体及びヘテロ四量体融合タンパク質（複合体）
本発明はまた、部分的には、抗体などの抗原結合タンパク質の三量体化又は四量体化におけるＴＴＲの使用に関する。
このようなヘテロ四量体融合タンパク質において、ＴＴＲ（配列番号１）又はそのバリアントは、やはり四量体として存在する。しかし、ＴＴＲ抗体ヘテロ四量体の文脈において、単一抗体重鎖（すなわち、単一抗体中に存在する２つの重鎖のうちの１つのみ）は、各ＴＴＲサブユニットに連結されており、４つの抗体のＴＴＲ四量体への連結を可能にする（図２ｅ参照）。抗体Ｃ末端の２つの重鎖のうちの１つは、各ＴＴＲサブユニットのＮ末端に連結していてもよい（図２ｅ参照）。したがって、各抗体は、ＴＴＲ四量体中の１つのＴＴＲサブユニットに連結しており、ＴＴＲ抗体ヘテロ四量体を得る。
このようなヘテロ四量体融合タンパク質において、Ｆｃヘテロ二量体（上述）の形成は、Ｆｃ中の突然変異により阻害される。そのような改変には、ノブ－イントゥ－ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、ＤｕｏＢｏｄｙ、Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ、電荷対、ＨＡ－ＴＦ、ＳＥＥＤｂｏｄｙ、及び異なるプロテインＡ親和性を有する改変などのＦｃ変異が挙げられる。例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６７（２，Ｐａｒｔ Ａ），２０１５，ｐｐ．９５－１０６を参照。ノブ－イントゥ－ホール（Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）変異は、第１重鎖中のＴ３６６Ｗ、並びに第２重鎖中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及び／又はＹ４０７Ｖを含む。例えば、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９（１９９６），ｐｐ．６１７－６２１；及びＡｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７０（１９９７），ｐｐ．２６－３５を参照。ＤｕｏＢｏｄｙ変異は、第１重鎖中のＦ４０５Ｌ、及び第２の重鎖中のＫ４０９Ｒを含む。例えば、Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１１０（２０１３），ｐｐ．５１４５－５１５０を参照。Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ変異は、第１重鎖中のＴ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及び／又はＹ４０７Ｖ、並びに第２重鎖中のＴ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及び／又はＴ３９４Ｗを含む。例えば、Ｖｏｎ Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，５（２０１３），ｐｐ．６４６－６５４を参照。ＨＡ－ＴＦ変異は、第１重鎖中のＳ３６４Ｈ及び／又はＦ４０５Ａ、並びに第２重鎖中のＹ３４９Ｔ及び／又はＴ３９４Ｆを含む。例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，３（２０１１），ｐｐ．５４６－５５７を参照。ＳＥＥＤｂｏｄｙ変異は、第１重鎖中のＩｇＧ／Ａキメラ変異、並びに第２重鎖中のＩｇＧ／Ａキメラ変異を含む。例えば、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．，２３（２０１０），ｐｐ．１９５－２０２を参照。プロテインＡ親和性が異なる変異は、一方の重鎖中にＨ４３５Ｒを含み、他方の重鎖には変異がない。例えば、米国特許第８，５８６，７１３号明細書を参照。これらの文献の各々は、その全体が参照により組み込まれる。
特定の実施形態では、抗体重鎖の二量体化を阻害するＦｃ電荷対の使用により、抗体のヘテロ四量体化を推進することが可能であり、したがって、ＴＴＲサブユニットに連結されている１つの抗体重鎖とＴＴＲに連結されていない１つの抗体重鎖間の重鎖二量体化を支持する（図１ｃ参照）。例えば、一組の荷電変異は、１つの重鎖に負電荷があり対応する重鎖に正電荷があるか、又は対応する重鎖上の対応する正電荷及び負電荷とペアになる１つの重鎖上の負電荷及び正電荷の混合のいずれかを有する、重鎖のＣＨ３ドメインに組み込まれている可能性がある。例示的な負電荷としては、Ｋ３９２Ｄ＆Ｋ４０９Ｄが挙げられ、例示的な正電荷としては、Ｅ３５６Ｋ＆Ｄ３９９Ｋが挙げられる。異なる電荷が引き付けられる間、ＣＨ３境界面での電荷は反発するので、ホモ二量体化は阻害されるが、ヘテロ二量体化は好まれる。ＴＴＲは、１つの電荷タイプのみの重鎖（正又は負のいずれかであるが、両方ではない）に融合される；したがって、４つの鎖（２つの軽鎖、１つの未融合重鎖、及び１つのＴＴＲ融合重鎖）で構成される完全な抗体でＴＴＲサブユニットをもたらす。さらに、電荷対変異は、例えば、米国特許第９，５４６，２０３号明細書に記載されている。第１重鎖中でＤ２２１Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、及び／又はＬ３６８Ｅ、並びに第２重鎖中でＤ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、及び／又はＫ４０９Ｒを含む電荷対変異はまた、例えば、Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４２０（２０１２），ｐｐ．２０４－２１９に記載されている。これらの文献の各々は、その全体が参照により組み込まれる。
ヘテロ三量体融合タンパク質において、ＴＴＲ（配列番号１）又はそのバリアントは、やはり四量体として存在する。ヘテロ三量体融合タンパク質の例としては、１つの抗体及び２つのＦａｂを含むものが挙げられる。ＴＴＲ抗体ヘテロ三量体の文脈において、各抗体重鎖のＣ末端は、２つのＴＴＲサブユニットのそれぞれのＮ末端に連結され得るとともに、２つのＦａｂのそれぞれのＣ末端は、２つのＴＴＲサブユニットのそれぞれのＮ末端に連結されて、ＴＴＲ Ａｂ／Ｆａｂヘテロ三量体を形成してもよい（図２ｃ及び図２ｄ参照）。したがって、抗体は、ＴＴＲ四量体中の２つのＴＴＲサブユニットに連結し、各ＦａｂはＴＴＲサブユニットに連結して、ＴＴＲ四量体、１つの抗体、及び２つのＦａｂを含むＴＴＲ Ａｂ／Ｆａｂヘテロ三量体を得る。
本発明はまた、部分的には、Ｆａｂの四量体化におけるＴＴＲの使用に関する。そのようなヘテロ四量体融合タンパク質において、ＴＴＲ（配列番号１）、又はそのバリアントは、やはり四量体として存在し、各ＴＴＲサブユニットは、各ＦａｂのＣ末端に連結してＴＴＲ Ｆａｂヘテロ四量体を形成する（図２ａ参照）。したがって、各Ｆａｂは、ＴＴＲ四量体中の単一のＴＴＲサブユニットに連結して、ＴＴＲ Ｆａｂヘテロ四量体を得る。
したがって、本発明は、３つ又は４つの抗原結合タンパク質（例えば、Ａｂ／Ｆａｂ三量体、Ｆａｂ四量体、又はＡｂ四量体）を含むヘテロ三量体及びヘテロ四量体融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態では、ヘテロ三量体及びヘテロ四量体融合タンパク質は、タンパク質複合体に連結される抗原結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、ＴＴＲタンパク質複合体であり、ここでＴＴＲタンパク質複合体は、ＴＴＲ四量体である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体である。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、Ｆａｂである。いくつかの実施形態では、ヘテロ四量体融合タンパク質は、抗体とＦａｂの混合物を含む。
特定の実施形態では、本発明は、ＴＴＲ四量体に連結される４つの抗体を含むヘテロ四量体融合タンパク質に関する。他の実施形態では、本発明は、リンカーを介してＴＴＲ四量体に連結される４つのＦａｂを含むヘテロ四量体融合タンパク質に関する。他の実施形態では、本発明は、リンカーを介してＴＴＲ四量体に連結される１つのＡｂ及び２つのＦａｂを含むヘテロ三量体融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態では、抗体又はＦａｂは、リンカーなしで、ＴＴＲ四量体と連結している（すなわち、抗体又はＦａｂは、ＴＴＲに直接連結している）。
リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０のアミノ酸を含むアミノ酸ベースのリンカーであり得る。他の実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸を含むアミノ酸ベースのリンカーである。他の実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のアミノ酸を含むアミノ酸ベースのリンカーである。さらに他の実施形態では、リンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸を含むアミノ酸ベースのリンカーである。特定の実施形態では、リンカーは、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、又はＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧである。他の特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＳＧＧ、ＧＧＧＳＧＧＧＧ、及びＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧを含むリストから選択される。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）５）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）６）である。他の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）３）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）４）である。
他の好適なリンカーは、Ｇ（ＧｘＢｙ）ｒＧｚリンカーを含み、式中、Ｇ＝グリシン；Ｂ＝任意のアミノ酸；ｘ＝１～１５；ｙ＝１～５；ｚ＝１～１５；及びｒ＝１～２０である。別の実施形態では、リンカーは、Ｇ（ＧｘＢｙ）ｒＧｚリンカーであり、式中、Ｂ＝Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｐ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｄ又はＮ；ｘ＝４；ｙ＝１；ｚ＝４；及びｒ＝１である。
追加の好適なアミノ酸リンカーとしては、例えば、ジスルフィド結合、（Ｇｌｙ）ｎ（ｎ＝１～１０）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１～５）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ、ＰＡＰＡＰ、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ、（Ａｌａ－Ｐｒｏ）ｎ（ｎ＝１～２０）、ＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶ、ＰＬＧＬＷＡ、ＲＶＬＡＥＡ、ＥＤＶＶＣＣＳＭＳＹ、ＧＧＩＥＧＲＧＳ、ＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥ、ＡＧＮＲＶＲＲＳＶＧ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＦＬＧ、及びＬＥが挙げられる。好適な非アミノ酸リンカーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びトリアジン含有部分（タンパク質と反応することができる末端基を有する構築物内に含まれる；例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０８３６０４号パンフレットを参照）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、抗体又はＦａｂは、リンカーあり又はリンカーなしで、トランケーションされたＴＴＲサブユニットと連結している。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸を、１つ以上のＴＴＲサブユニットのＮ末端から除去してもよく、抗体又はＦａｂをトランケーションされたＴＴＲサブユニットＮ末端に付着させてもよい。
本発明はまた、本明細書に記載されるヘテロ三量体及びヘテロ四量体融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。ヘテロ三量体及びヘテロ四量体融合タンパク質を生成するための例示的な方法に関する詳細は、実施例中に見出すことができる。
抗原結合タンパク質
任意の抗原結合タンパク質（例えば、Ｆａｂ、抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ）を、本発明のＴＴＲ融合タンパク質で使用することができる。加えて、酵素などのタンパク質を抗原結合タンパク質と組み合わせて、本発明のＴＴＲ融合タンパク質において使用することができる。
本発明の融合タンパク質は、異なるエピトープ（例えば、同じ又は異なるタンパク質上の）の結合を可能にするので、融合タンパク質は、異なる標的を近接させることが有益な状況に有用である。そのような技術の成功した実施の例としては、エミシズマブが挙げられ、これは活性化因子ＩＸ及び因子Ｘを一緒にするように作用し、それにより、血友病の治療のために第８因子を置き換える必要なしで、凝固プロセスを継続させることができる。
本発明の融合タンパク質はまた、腫瘍学の分野でも有用であり得る。例えば、腫瘍学標的に関連した作用機序に応じて、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）との標的細胞（例えば、がん細胞）の架橋が望ましい場合がある。このような手法は、ＢｉＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）抗体構築物の状況で成功することが証明されている。他の例としては、２つの異なる腫瘍マーカー（例えば、本発明のＴＴＲ融合タンパク質のＡｂ及び／又はＦａｂを介して）及びＣＤ３（例えば、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、Ａｂ、又はＦａｂを介して）に結合することができる三重特異性物質（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃｓ）が挙げられる。
本発明の融合タンパク質はまた、組み合わせ治療の規制評価／承認に関連する複雑さに対処することができる。組み合わせ治療の臨床試験は、特に個々の構成要素のいずれも以前に評価されていない場合、安全性及び有効性を評価するために、より複雑な臨床試験戦略を必要とし得る。本発明の融合タンパク質は、複数の構成要素を組み合わせて単一の構築物にすることによって、そのような複雑性に対処する。
ＴＴＲヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体融合タンパク質の作製方法
本発明のＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）融合物の作製方法は、実施例で論じられる。
一般に、本発明のＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）融合物は、組換え法を用いて生成することができる。したがって、本発明は、ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）融合物をコードするポリヌクレオチドを含む。別の態様では、本発明は、ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）融合物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。特定の実施形態では、発現ベクターは、好適な宿主細胞における発現を支援するために、ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）融合物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）を含む。特定の実施形態では、発現ベクターはまた、宿主細胞における染色体非依存性複製を可能にするポリヌクレオチド配列を含む。例示的なベクターとしては、プラスミド、コスミド、及びＹＡＣＳが挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、ベクターはｐＴＴ５である。
一般に、ＴＴＲヘテロ二量体、ヘテロ三量体、又はヘテロ四量体融合構築物を生成する場合、哺乳類宿主細胞が利用される。哺乳類宿主細胞もまた、Ｆａｂ ＴＴＲ融合構築物を生成するのに好適であるが、原核生物（バクテリア）などの非哺乳類細胞及び非哺乳類（例えば、酵母菌）宿主細胞もまた、使用され得る。
更に別の実施形態では、本発明は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を含む。宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）融合物の発現に好適な条件下でトランスフェクションされた宿主細胞を培養する方法は、当技術分野において既知である。使用されるトランスフェクション手順は、形質転換される宿主に依存し得る。哺乳類細胞への異種性ポリヌクレオチドの特定の導入方法は当該技術分野において既知であり、こうした導入方法としては、限定はされないが、デキストラン介在型遺伝子導入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在型遺伝子導入、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソームへのポリヌクレオチドの封入、及び核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。発現のための宿主として利用可能な特定の哺乳類細胞株は、当該技術分野において既知であり、こうした哺乳類細胞株としては、限定はされないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株（限定はされないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ；例えばＣＨＯ－Ｋ１）細胞、Ｅ５細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、及び多くの他の細胞株を含む）が挙げられる。特定の実施形態では、ＴＴＲヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体融合物をどの細胞株が高レベルで発現し、産生するかを決定することによって細胞株を選択してもよい。
したがって、本発明はまた、本明細書に記載されるＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）融合タンパク質の作製方法に関する。例えば、ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）融合タンパク質は：
ａ）ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）融合物をコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を培養することと；
ｂ）前記培養物からＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）融合タンパク質を単離することと、
によって作製され得る。
医薬組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、医薬的に有効な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、及び／又はアジュバントを伴って、本発明のＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）融合タンパク質のうちの１つ以上の治療有効量を含む医薬品組成物を提供する。本発明の医薬組成物には、液体、凍結及び凍結乾燥組成物が含まれるが、これらに限定されない。
好ましくは、製剤材料は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに無毒なものである。具体的な実施形態では、治療有効量のＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）融合タンパク質を含む医薬組成物が提供される。
特定の実施形態では、医薬組成物は、組成物の、例えば、ｐＨ、モル浸透圧濃度、粘性、透明性、色調、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解速度若しくは放出速度、吸収性、又は透過性の改変、維持、又は保存を目的とする製剤材料を含み得る。このような実施形態では、好適な製剤材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、プロリン、又はリジンなど）；抗菌剤；酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝液（ホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸、リン酸又は他の有機酸など）；充填剤（マンニトール又はグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなど）；注入剤；単糖類；二糖類；及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；着色剤、香味剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（ベンザルコニウムクロリド、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０などのポリソルベート、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））；安定化促進剤（スクロース又はソルビトールなど）；等張性促進剤（アルカリ金属ハロゲン化物など、好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／又は医薬アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８”Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。
特定の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式及び所望の投与量に応じて当業者によって決定されることになる。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（前掲）を参照されたい。特定の実施形態では、そのような組成物は、本発明の抗原結合タンパク質の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏでの放出速度及びｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス速度に影響し得る。特定の実施形態では、医薬組成物における主要なビヒクル又は担体は、水性又は非水性のいずれかの性質を有し得る。例えば、好適なビヒクル又は担体は、注射用水、生理食塩水溶液又は人工脳脊髄液であり得、場合により非経口投与用組成物で一般的な他の材料が補充される。中性緩衝生理食塩水又は血清アルブミンを混合した生理食塩水もさらなる例示的なビヒクルである。具体的な実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ７．０～８．５のトリス緩衝液、又は約ｐＨ４．０～５．５の酢酸塩緩衝液を含み、ソルビトール又はその適切な代替物をさらに含んでよい。本発明の特定の実施形態では、ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）組成物は、凍結乾燥ケーク又は水性溶液の形態において、所望の度合いの純度を有する選択された組成物を任意選択的な配合剤（前掲のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することによって保管のために調製され得る。さらに、特定の実施形態では、ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）は、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤化され得る。
本発明の医薬組成物は、非経口送達を目的として選択することができる。あるいは、組成物は、吸入、又は経口など、消化管を介した送達を目的として選択してよい。そのような医薬的に許容可能な組成物の調製は、当該技術分野の範囲内である。製剤成分は、好ましくは投与部位に許容される濃度で存在する。特定の実施形態では、緩衝剤は、組成物を生理学的ｐＨ又は僅かに低いｐＨ、典型的には、約５～約８のｐＨ範囲内に維持するために使用される。
非経口投与が企図される場合、本発明における使用のための治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望のＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）を含む、パイロジェンフリーの非経口的に許容される水溶液の形態で提供され得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）は、その中で適切に保存された滅菌等張溶液として製剤化される。特定の実施形態では、製剤は、デポ注射を介して送達できる産物の制御性又は持続放出を提供し得る薬剤、例えば注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸若しくはポリグリコール酸など）、ビーズ又はリポソームと、所望の分子との製剤を含み得る。特定の実施形態では、循環中の持続期間を増進する効果を有するヒアルロン酸も使用され得る。特定の実施形態では、所望の抗原結合タンパク質を導入するために埋め込み可能な薬物送達デバイスを使用してよい。
本発明の医薬組成物は、吸入を目的として製剤化することができる。これらの実施形態では、ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）は、有利には、乾燥した、吸入可能な粉末として製剤化される。具体的な実施形態では、ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）吸入溶液は、エアロゾル送達のための噴霧剤とともに製剤化してもよい。特定の実施形態では、溶液を噴霧してよい。経肺の投与、ひいては製剤化方法は、国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第９４／００１８７５号明細書（参照によって組み込まれる）にさらに記載されており、この文献では、化学的に改変されたタンパク質の経肺送達について記載されている。
製剤は経口投与可能であるとも考えられる。この様式で投与されるＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）は、錠剤及びカプセルなどの固形剤形の製剤化において習慣的に使用される担体とともに、又はこうした担体を使用せずに製剤化することができる。特定の実施形態では、消化管においてバイオアベイラビリティが最大化し、全身循環前分解（ｐｒｅ－ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小化する時点で製剤の活性部分が放出されるようにカプセルを設計してよい。ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）の吸収を促進するために追加の薬剤を含めることができる。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤及び結合剤を用いてもよい。
持続送達製剤又は制御送達製剤において、ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）を伴う製剤を含む更なる医薬組成物は、当業者には明らかであろう。リポソーム担体、生物侵食性微粒子又は多孔性ビーズ及びデポ注射など、様々な他の持続送達手段又は制御送達手段の製剤化手法も当業者に知られている。例えば、国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号明細書（参照によって組み込まれる）を参照されたい。この文献では、医薬組成物を送達するための多孔性ポリマー微粒子の制御放出について記載されている。持続放出調製物は、例えば、フィルム又はマイクロカプセルなどの成形物品の形態の半透性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出性マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（その各々が参照により組み込まれる、米国特許第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許出願公開第０５８４８１号明細書に開示される）、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２：５４７－５５６）、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７－２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８－１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１、前掲）又はポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号明細書）を含み得る。持続放出組成物は、当該技術分野において既知のいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームも含み得る。例えば、参照により組み込まれる、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８－３６９２；欧州特許出願公開第０３６，６７６号明細書；同第０８８，０４６号明細書及び同第１４３，９４９号明細書を参照されたい。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される医薬組成物は、典型的には、無菌調製物として提供される。無菌化は、無菌濾過膜を介す濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する無菌化は、凍結乾燥及び再構成の前又は後のいずれかに実施してよい。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態又は溶液で保存することができる。非経口組成物は、一般に、無菌のアクセスポートを有する容器に充填され、こうした容器は、例えば、静脈注射用溶液バッグ、又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルである。
本発明の態様は、自己緩衝性ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）を含み、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０６１３８１８１Ａ２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２５９９）に記載されているような医薬組成物として使用できる。
上述したように、特定の実施形態は、ヘテロ多量体に加えて、１つ以上の賦形剤、例えば本節及び本明細書の他の箇所に例示的に記載されているものを含む、ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）組成物、特に医薬ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）組成物を提供する。賦形剤は、粘度の調整などの製剤の物理的、化学的又は生物学的特性の調整及び／又は有効性を向上させ、且つ／若しくはこのような製剤を安定化するための本発明の方法、並びに例えば製造、輸送、保管、使用前の調製、投与中及びこれらの後に生じるストレスに起因する劣化及び損傷に対する方法など、広範囲の目的を考慮して本発明で使用することができる。
タンパク質の安定化並びにこれに関して有用な製剤材料及び方法に対して様々な説明が利用可能であり、例えばＡｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｏｌｖｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．８（３）：２８５－９１（１９９１）；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」：ＲＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＳＩＧＮ ＯＦ ＳＴＡＢＬＥ ＰＲＯＴＥＩＮ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１－８４（２００２）及びＲａｎｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９－７５（２００２）（各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、特に獣医学的及び／又はヒト医療用途のタンパク質医薬品及びプロセスに関して、特に本発明による自己緩衝性タンパク質製剤と同じ賦形剤及びプロセスに関する部分を参照されたい。
塩は、本発明の特定の実施形態に従って、例えば製剤のイオン強度及び／若しくは等張性を調整するため、並びに／又は本発明による組成物のタンパク質若しくは他の成分の溶解度及び／若しくは物理的安定性を向上させるために使用され得る。
よく知られているとおり、イオンは、タンパク質の表面上の荷電残基に結合することにより、且つタンパク質中の荷電基及び極性基を遮蔽し、その静電気相互作用、引力及び反発相互作用の強度を低減することにより、天然状態のタンパク質を安定化することができる。イオンは、特にタンパク質の変性ペプチド結合（－－ＣＯＮＨ）に結合することによって変性状態のタンパク質を安定化することもできる。さらに、タンパク質中の荷電基及び極性基とのイオン相互作用は、分子間静電相互作用を低減し、それによりタンパク質の凝集及び不溶化を防止又は低減することもできる。
イオン種によってタンパク質に及ぼすそれらの効果は、著しく異なる。イオン及びタンパク質に対するその効果の分類上の順位付けがいくつか立案されており、これを本発明による医薬組成物の製剤化に使用することができる。一例は、イオン性溶質及び極性非イオン性溶質を溶液中のタンパク質の立体構造安定性に対する効果によって順位付けするホフマイスター系列である。安定化する溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化する溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープは、一般に、溶液からタンパク質を沈殿（「塩析」）させるために高濃度（例えば、＞１モル硫酸アンモニウム）で使用される。カオトロープは、一般に、タンパク質を変性及び／又は可溶化（「塩溶」）させるために使用される。「塩溶」及び「塩析」に対するイオンの相対的な効果により、ホフマイスター系列でのイオンの位置が定義される。
遊離アミノ酸は、充填剤、安定化剤及び酸化防止剤として、並びに他の標準的用途として、本発明の様々な実施形態によるＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）製剤に使用することができる。リジン、プロリン、セリン及びアラニンは、製剤中のタンパク質を安定化するために使用することができる。グリシンは、凍結乾燥において適切なケーキ構造及び特性を確保するのに有用である。アルギニンは、液体及び凍結乾燥のいずれの製剤でもタンパク質の凝集を阻害するのに有用であり得る。メチオニンは、酸化防止剤として有用である。
ポリオールは、糖、例えばマンニトール、スクロース及びソルビトール並びに多価アルコール、例えばグリセロール及びプロピレングリコール並びに本明細書での議論を目的としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質を含む。ポリオールは、コスモトロピックである。それらは、液体及び凍結乾燥のいずれの製剤でもタンパク質を物理的及び化学的劣化過程から保護するのに有用な安定化剤である。ポリオールは、製剤の等張性を調整するのにも有用である。
ポリオールの中で本発明の選択された実施形態において有用なのは、マンニトールであり、これは、凍結乾燥製剤においてケーキの構造安定性を確保するために一般に使用される。マンニトールは、ケーキの構造安定性を確保する。一般に、これは、凍結乾燥保護剤、例えばスクロースとともに使用される。ソルビトール及びスクロースは、等張性を調整するための薬剤及び輸送中又は製造工程でのバルク調製時の凍結解凍ストレスから保護するための安定化剤として好ましいものの中に含まれる。還元糖（遊離アルデヒド基又はケトン基を含有する）、例えばグルコース及びラクトースは、表面のリジン及びアルギニン残基を糖化することができる。したがって、それらは、一般に、本発明による使用のための好ましいポリオールの中に含まれない。加えて、そのような反応種を形成する糖、例えばスクロースも、酸性条件下でフルクトース及びグルコースに加水分解され、その結果糖化を生じさせる点で本発明の好ましいポリオールの中に含まれない。ＰＥＧは、タンパク質を安定化すること及び凍結保護物質として有用であり、この点に関して本発明に使用することができる。
ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）製剤の実施形態は、界面活性剤を更に含む。タンパク質分子は、表面への吸着並びに気体－液体界面、固体－液体界面及び液体－液体界面での変性及びその結果としての凝集を引き起こしやすいことがある。これらの効果は、一般にタンパク質濃度に反比例する。これらの有害な相互作用は、一般に、タンパク質濃度と反比例し、典型的には、例えば製品の輸送及び取り扱い時に生じる物理的撹拌によって悪化する。
界面活性剤は、慣例的に、表面吸着を防止するか、最小化するか、又は低減するために使用される。この点に関して本発明において有用な界面活性剤としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートの他の脂肪酸エステル及びポロキサマー１８８が挙げられる。
界面活性剤は、タンパク質の立体構造安定性を制御するためにも一般に使用される。任意の所与の界面活性剤は、典型的には、一部のタンパク質を安定化し、他を不安定化するため、この点において、界面活性剤の使用は、タンパク質特異的である。
ポリソルベートは、酸化劣化を起こしやすく、多くの場合、供給されるとき、タンパク質残基の側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすほど十分な過酸化物量を含有している。したがって、ポリソルベートは、注意して使用すべきであり、使用時には最小影響濃度で用いなければならない。この点で、ポリソルベートは、賦形剤を最小影響濃度で用いるべきとする一般通則を例示している。
ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）製剤の実施形態は、１種以上の酸化防止剤を更に含む。適切なレベルの周囲酸素及び周囲温度を維持することにより、且つ光への暴露を回避することにより、医薬製剤中でのタンパク質の有害な酸化をある程度まで防止することができる。酸化防止賦形剤を、タンパク質の酸化劣化を防止するためにも同様に使用することができる。この点で特に有用な酸化防止剤には、還元剤、酸素／フリーラジカル捕捉剤及びキレート剤が含まれる。本発明による治療用タンパク質製剤に使用するための酸化防止剤は、好ましくは、水溶性であり、製品の有効期間にわたって活性を維持する。この点で、ＥＤＴＡが本発明による好ましい酸化防止剤である。
酸化防止剤は、タンパク質を損傷することがある。例えば、還元剤、例えばグルタチオンは、特に分子内ジスルフィド結合を破壊し得る。したがって、本発明に使用するための酸化防止剤は、とりわけ、それ自体が製剤中のタンパク質に損傷を与える可能性を排除するか又はその可能性を十分に低減するように選択される。
本発明による製剤は、タンパク質の補因子であり、タンパク質配位化合物を形成するのに必要とされる金属イオン、例えば特定のインスリン懸濁液を形成するのに必要とされる亜鉛を含み得る。金属イオンは、タンパク質を分解するいくつかの過程も阻害することができる。しかしながら、金属イオンは、タンパク質を分解する物理的及び化学的過程も触媒する。
マグネシウムイオン（１０～１２０ｍＭ）は、アスパラギン酸からイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために使用され得る。Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を増大させ得る。しかしながら、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化し得る。同様に、Ｃａ＋２及びＳｒ＋２は、第ＶＩＩＩ因子を安定化することができ、これは、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２及びＦｅ＋２によって不安定化されることがあり、その凝集は、Ａｌ＋３イオンによって増大し得る。
ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）製剤の実施形態は、１種以上の防腐剤を更に含む。保存剤は、同じコンテナからの２回以上の取り出しを伴う複数回用量の非経口製剤を開発する際に必要となる。その主な機能は、製剤の貯蔵寿命又は使用期間にわたって微生物の増殖を阻害し、製品の無菌性を確保することである。一般に使用される防腐剤としては、ベンジルアルコール、フェノール及びｍ－クレゾールが挙げられる。保存剤は、低分子の非経口薬との使用において長い歴史を有するが、保存剤を含むタンパク質製剤の開発は、困難であり得る。保存剤は、ほぼ常に、タンパク質に対して不安定化効果（凝集）を有しており、これが複数回用量のタンパク質製剤における使用を制限する主要な要因となっている。現在に至るまで、ほとんどのタンパク質薬は、単回使用用としてのみ製剤化されている。しかしながら、複数回用量製剤が可能である場合、患者の利便性及び高い市場性を実現するという利点が加わる。防腐処理された製剤の開発により、より便利な複数回使用の注射ペンの提案が製品化に至ったヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、その良い例である。ｈＧＨの保存処理された製剤を含有するそのようなペンデバイスは、少なくとも４つが現在市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥－デュアルチャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）は、フェノールを含有する一方、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）は、ｍ－クレゾールで製剤化されている。
保存処理された剤形の製剤化及び開発中、いくつかの態様を考慮する必要がある。製剤中の効果的な防腐剤濃度を最適化しなければならない。これには、剤形中の所与の防腐剤を、タンパク質の安定性を損なうことなく抗微生物効果を付与する濃度範囲で試験することが必要となる。
予想され得るように、防腐剤を含有する液体製剤の開発は凍結乾燥製剤よりも困難である。フリーズドライ製品は、防腐剤なしで凍結乾燥され、使用時に希釈剤を含有する防腐剤で再構成することができる。これにより保存剤がタンパク質と接触する時間が短縮され、付随する安定性のリスクが大幅に最小化される。液体製剤の場合、保存剤の有効性及び安定性は、製品有効期間全体（例えば、約１８～２４か月）にわたって維持されるべきである。注意すべき重要な点として、保存剤の有効性は、活性薬物及び全ての賦形剤成分を含有する最終製剤において実証される必要がある。
ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）製剤は、一般に、とりわけバイオアベイラビリティ及び持続性の範囲において、特定の投与経路及び投与方法、特定の投与量及び投与頻度、特定の疾患の特定の治療に合わせて設計されることになる。したがって、製剤は、経口、聴覚、眼、直腸、及び膣を含むがこれらに限定されない任意の好適な経路による、並びに静脈内及び動脈内注射、筋肉内注射、並びに皮下注射を含む非経口経路による送達のために、本発明に従って設計され得る。
医薬組成物が製剤化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶、又は脱水粉末若しくは凍結乾燥粉末として無菌バイアルにおいてそれを保存してもよい。そのような製剤は、即時使用が可能な形態か、又は投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥品）のいずれで保存してもよい。本発明は、単回用量投与単位を生成するためのキットも提供する。本発明のキットは、乾燥タンパク質を有する第１の容器と、水性製剤を有する第２の容器の両方を各々含む。本発明の特定の実施形態では、単一及び多チャンバー式充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジ及び溶解シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが提供される。
用いられるべきＴＴＲヘテロ多量体含有（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）医薬組成物の治療有効量は、例えば、治療の内容及び目的に依存するであろう。治療に適した投与量レベルは、送達される分子、ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）が使用される徴候、投与経路、並びに患者のサイズ（体重、体表、若しくは臓器サイズ）及び／又は状態（年齢及び総体的な健康）に一部は応じて変わることになると当業者であれば理解するであろう。特定の実施形態では、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投与量の力価を判断し、投与経路を改変してよい。典型的な投与量は、上記の要因に応じて約０．１μｇ／ｋｇ～最大約３０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。具体的な実施形態では、投与量は、１．０μｇ／ｋｇ～最大約２０ｍｇ／ｋｇ、任意選択的に１０μｇ／ｋｇ～最大約１０ｍｇ／ｋｇ又は１００μｇ／ｋｇ～最大約５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
治療有効量のＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）は、好ましくは、疾患症状の重症度の低下、疾患無症状期間の頻度若しくは期間の増加、又は疾患の苦痛による障害若しくは無能の防止をもたらす。
医薬組成物は、医療デバイスを使用して投与されてもよい。医薬組成物を投与するための医療デバイスの例は、米国特許第４，４７５，１９６号明細書；同第４，４３９，１９６号明細書；同第４，４４７，２２４号明細書；同第４，４４７，２３３号明細書；同第４，４８６，１９４号明細書；同第４，４８７，６０３号明細書；同第４，５９６，５５６号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；及び同第５，３９９，１６３号明細書（全てが本明細書に参照として組み込まれる）に記載されている。
ＴＴＲヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体融合タンパク質の治療的使用
実施例に示すように、本発明の多特異性ＴＴＲ融合タンパク質は、１つ以上のタンパク質上の２つ以上のエピトープに結合することができることが発見された。このような多特異性ＴＴＲ融合物は、それらが複数の生物学的経路に関与して、伝統的な治療モードと比較して疾患状態（例えば、がん）のより有効な治療を可能にすることができる点で特に有用である。
本発明の多特異性ＴＴＲ融合タンパク質は、多くの既知の二重特異性／多特異性手法を超える利益を有する。例えば、本発明は、例えばヘテロ－ＩｇＧ構築物と比較して、親和性損失を低減又は排除する、抗原結合ドメインの二価二重特異性提示を提供する。ヘテロ－ＩｇＧ構築物を超えるさらなる利益としては、本発明の多特異性ＴＴＲ融合タンパク質が、ヘテロ－ＩｇＧ構築物における重鎖のヘテロ二量体化を推進するのに必要な、Ｆｃ電荷対突然変異（ＣＰＭ）を必要とすることなく生成できること、並びに、半－抗体及び軽鎖ミスマッチ（ヘテロ－ＩｇＧ及びＩｇＧ－Ｆａｂ構築物に存在する）などの望ましくない副産物の低減又は排除が挙げられる。実際に、本発明のＴＴＲ融合タンパク質は、他の構築物に必要な、Ａｂ又はＦａｂ操作の多く（任意選択的に、全て）を低減する。
ＩｇＧ－Ｆａｂ及びＩｇＧ－ｓｃＦｖ構築物と比較して、本発明のＴＴＲ融合タンパク質の抗原結合ドメインは、Ｎ末端抗原結合領域が露出され、立体的に誘導される親和性損失が低減又は排除されるように、最適に配向されている。
本発明のＴＴＲ融合タンパク質の別の利益は、親和性損失及びｍＡｂをｓｃＦｖ構築物に変換する際に観察される凝集傾向の増大を低減することを助けるナイーブＩｇＧフォーマットの使用から発する。Ｇｉｌ ａｎｄ Ｓｃｈｒｕｍ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４：７３－８４（２０１３）。
加えて、本発明のＴＴＲ融合タンパク質は、多様な抗原結合ドメインの効率的な組込みを可能にするため、二重特異性（又は多特異性）組み合わせの迅速なスキャニングが可能となる。
ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）融合タンパク質はまた、個々の抗体及び／又はＦａｂと比較して、改善された抗原クラスター化を示す。抗体（例えば、ＩｇＧ抗体）が標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の抗原に結合すると、得られたクラスター化Ｆｃドメインは、ＮＫ細胞及びマクロファージなどの免疫エフェクター細胞に見られるＦｃγＲと結合する。このクラスター化は、ＦｃγＲを介したシグナル伝達を助け、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び抗体依存性細胞性貪食（ＡＤＣＰ）などの細胞媒介エフェクター機能の開始をもたらす。したがって、ＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）融合タンパク質は、高い抗体又はＦａｂの親和性／アビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）活性が生物学的効果の強化につながるリガンドのターゲッティングに特に有用である。本発明のＴＴＲヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及びヘテロ四量体）構築物による細胞媒介エフェクター機能の強化により、例えば、がんの治療に有用な、細胞を殺す能力の増加がもたらされる。
したがって、本発明はまた、本明細書に記載されるヘテロ二量体融合タンパク質及びヘテロ四量体融合タンパク質を用いたがんの治療方法に関する。
他の実施形態では、本発明は、がんの治療における、本明細書に記載されるヘテロ二量体融合タンパク質及びヘテロ四量体融合タンパク質の使用に関する。
更に他の実施形態では、本発明は、がんの治療にて使用するための、本明細書に記載されるヘテロ二量体融合タンパク質及びヘテロ四量体融合タンパク質に関する。
以下の実施例は、本発明の具体的な実施形態又は特徴を例示する目的で提供されるものであり、その範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１：一般的技術
実施例１は、実施例の残りの部分で論じられるＴＴＲ負及び正構築物を作製及び特性評価するために使用された一般的な技術を記載する。
以下の技術を用いて、ＴＴＲサブユニット当たり１つのＴＴＲ二量体／二量体界面突然変異（「Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／ＸＸ」）を有するＴＴＲバリアントを含有するＴＴＲ負及び正構築物を生成した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＴＴＲ負及び正バリアントのクローニング
Ａｍｇｅｎ Ｌａｒｇｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ Ｃ３７９７９（ｐＡＭＧ２１：ｈｕＴＴＲ（ｏｐｔ－Ｃ１０Ａ、Ｋ１５Ａ））を、全てのＴＴＲ負及び正バリアント（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／ＸＸを含有する）の鋳型として使用した。ＴＴＲ負及び正バリアントを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、部位特異的ＰＣＲ突然変異誘発、制限エンドヌクレアーゼ消化及び細菌発現プラスミドへの酵素的連結を含む標準的な分子生物学技術を用いて生成した。ＴＴＲ Ｎ末端にＭＫＨ６ＧＧを含むＴＴＲ負及び正バリアントも生成した。
これらの手法は一般に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕｅｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．で参照できる方法に従って行われた。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＴＴＲ負及び正バリアントの発現
ＴＴＲ負及び正バリアントをコードするｐＡＭＧ２１ベクターを含むＢＬ２１細胞を、２５０ｍｌバッフル付き振盪フラスコ中、２０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む５０ｍｌ容積のＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｔ７０６０）中で３０～３７℃で一晩増殖させた。翌日、３５ｍｌの一晩培養物を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び５０μＬのＳｉｇｍａ Ｙ－３０消泡剤を含む１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈに添加し、６００ｎｍでのＯＤが０．４に達するまで３３℃でインキュベートした。１ｍｌのＳｉｇｍａ Ｋ－３２５５ Ｎ－（β－ケトカプロイル）－ＤＬ－ホモセリンラクトンオートインデューサー（エタノールに溶解したストック溶液）を培養物に添加し、これを３０～３３℃で４時間発現させた。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＴＴＲ負及び正バリアントの精製
凍結大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ペーストを、Ｏｍｎｉ ＴＨ（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｋｅｎｎｅｓａｗ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＵＳＡ）ハンドヘルドホモジナイザーを使用して、１：１０（重量対容積）の５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０溶液中でホモジナイズした。次いで、得られた懸濁液を、Ｍ－１１０Ｓ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｒｖｉｎｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）に通して１３，８００ＰＳＩで２回処理した。次いで、溶解物を２２，０００ＲＣＦで１時間、４℃で遠心分離した。可溶性画分を０．４５μｍセルロースアセテートフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）に通して濾過し、ＦＰＬＣ精製のための出発物質として保持し；不溶性画分を廃棄物として処分した。
ＡｅＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）ＦＰＬＣに接続した５ｍＬ Ｎｉ－ＮＴＡ ＳｕｐｅｒＦｌｏｗカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、試料の適用前に、５カラム容積（ＣＶ）の５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０で平衡化した。濾過した可溶性溶解物をカラム上に注入し、１５ＣＶの５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０で洗浄し、１０ＣＶの５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０で段階的に溶出した。
精製プールを、ＶｉｖａＳｐｉｎ １０ｋＤＡ ＭＷＣＯ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）遠心フィルターを使用して濃縮し、所望の容積に達するまで３，０００ＲＣＦで遠心分離した。
濃縮試料を、Ｓｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）透析カートリッジを使用して、計算により出発緩衝液が１％未満になるまで、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌに対して透析した。
ＴＴＲ負及び正バリアント（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））のＰＣ分析
Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによってタンパク質定量を行った。
非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を、試料を加熱し及び加熱せずに行った。両方の場合において、試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料緩衝液で処理し、製造業者のプロトコルに従って４～２０％ Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で泳動した。加熱実験では、試料及び試料緩衝液を８５℃で５分間加熱した後にゲル上にロードし；非加熱試料は、試料緩衝液添加後、ゲル上に直接ロードした。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して製造業者のマイクロ波プロトコルに従ってゲルを染色した。
Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）に接続したＳＥＣ－３０００、７．８×３００ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）上でＨＰＬＣ ＳＥＣ分析を行い、定組成５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．９移動相を１ｍＬ／分で流し、２８０ｎｍでＵＶ吸光度を観察した。
ＴＴＲ負及び正バリアント二量体化
精製したＴＴＲ試料を、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで希釈することによって、実験コホートの最低共通モル濃度に正規化した。試料を等容積で合わせ、４℃で一晩インキュベートした。
混合試料の一部を、以下のようにカスパーゼ切断によって処理した。精製したタンパク質試料濃度を、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを使用して希釈することによって２．５ｍｇ／ｍＬに調整した。２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ ２－メルカプトエタノール、ｐＨ８．０からなる５×消化緩衝液を調製し、水浴中で２５℃にし、５×緩衝液を水で希釈することによって１×消化緩衝液も調製した。カスパーゼ－３（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）のストックアリコートを、１×消化緩衝液を使用して０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した。４部のタンパク質、４部の希釈したカスパーゼ－３、８部の５×消化緩衝液及び２０部の水を合わせ、水浴中で２５℃で２時間インキュベートした。消化溶液を除去し、２０部のＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料緩衝液（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析について以前に特定されたものと同じ試薬）を添加した。以前に特定されたものと同じプロトコルを用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上での切断反応を実行した。
得られた分子混合物、カスパーゼ処理及び非処理を非還元、非加熱ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ ＳＥＣによって分析した。
（１）［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［正ＴＴＲ］２＝［Ａｂ「Ｂ」］（２Ｘ Ａｂ－ＴＴＲ）；（２）［［Ａｂ「Ａ」］－［負ＴＴＲ］］２：［［正ＴＴＲ］－［Ａｂ「Ｂ」］］２（４Ｘ Ａｂ－ＴＴＲ）；及び（３）［［Ｆａｂ「Ａ」］－［負ＴＴＲ］］２：［［正ＴＴＲ］－［Ｆａｂ「Ｂ」］］２（４Ｘ Ｆａｂ－ＴＴＲ）分子（リンカーなし）のクローニング
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、部位特異的ＰＣＲ突然変異誘発、制限エンドヌクレアーゼ消化、及び哺乳動物発現プラスミドへの酵素的連結を含む標準的な分子生物学技術を用いて、ハイブリドーマ由来抗ＣＢ１、抗ＧＩＴＲ及び抗ＴＲ２抗体重鎖（ＨＣ）のいくつかの操作されたバリアントにＴＴＲを融合させた。Ｈｉｓ－タグ化Ｆａｂ－ＴＴＲ分子も生成した。これらのクローニングされたＴＴＲ融合バリアント重鎖及びＦａｂ ＤＮＡを、それらのそれぞれのクローニングされた抗ＣＢ１、抗ＧＩＴＲ及び抗ＴＲ２抗体軽鎖（ＬＣ）ＤＮＡと組み合わせて使用して、２Ｘ Ａｂ－ＴＴＲ、４Ｘ Ａｂ－ＴＴＲ及び４Ｘ Ｆａｂ－ＴＴＲの発現のために哺乳動物細胞にトランスフェクトした。この技術は一般に、Ｍｏｌｅｔｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕｅｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．で参照できる方法に従って行われた。
ＴＴＲ抗体及びＦａｂ融合配列は、ＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＳＣ）又はＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＧＧＡ）によって生成した。組み合わされたＤＮＡ断片は、スプライシングオーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＳＯＥ－ＰＣＲ）により生成され、又は外部ベンダーから合成的に注文された。ＧＳＣクローニングに使用されたＳＯＥ－ＰＣＲ生成物は、所望のアミノ酸変化部位についてのコドンを取り囲む１５ｂｐのオーバーラップ領域を共有する２つのＰＣＲ生成物を作製した変異原性パリンドロームプライマーと対になったフランキングプライマーを使用して作製した。ＧＧＡに使用されたＳＯＥ－ＰＣＲ生成物は、ＢｓｍＢＩ消化によって生成された方向性のユニークな４塩基対オーバーハングを含むように設計された。
要約すると、ＧＧＡは、ＩＩ型制限酵素及びＴ４ ＤＮＡリガーゼを利用して、複数のＤＮＡ断片を切断し、シームレスに連結した（Ｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，Ｖｏｌ．３（１１）：ｅ３６４７，２００８）。この実施例では、複数のＤＮＡ断片は、（ｉ）コザックコンセンサス配列、シグナルペプチド配列、完全抗体遺伝子、リンカー及びＴＴＲ配列をコードする合成核酸配列（ＧｅｎｅＢｙｔｅ、Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）；並びに（ｉｉ）発現ベクター骨格からなっていた。ＧＧＡ反応物は、５０ｎｇのＧｅｎｅＢｙｔｅ、２０ｎｇの発現ベクター、１μｌの１０×Ｆａｓｔ Ｄｉｇｅｓｔ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ＋０．５ｍＭのＡＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、０．５μｌのＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ Ｅｓｐ３Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び水１０μｌまでで構成された。反応は、３７℃で２分間の消化工程及び１６℃で３分間の連結工程からなる１５サイクルにわたって行われた。１５サイクル後、最後の３７℃での５分間の消化工程及び８０℃での５分間の酵素不活化工程が続いた。
［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［正ＴＴＲ］２＝［Ａｂ「Ｂ」］分子（リンカーなし）の発現
ＨＥＫ ２９３－６Ｅ細胞を、０．１％（ｗ／ｖ）Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、６ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２５μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ１７ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、振盪フラスコ中、５％ ＣＯ２、湿度８０％～９０％のインキュベーター内で３６℃で維持し、２５ｍｍ振盪径のシェーカー上で１２０ｒｐｍで撹拌した。トランスフェクションの２日前に、２９３－６Ｅ細胞を０．４×１０６細胞／ｍｌで播種した。トランスフェクション当日、細胞は指数増殖期にあった（約１．５×１０６細胞／ｍｌ、＞９５％生存率）。０．５ｍｇ／Ｌ ＤＮＡ（０．１ｍｇ／Ｌの目的の遺伝子構築物ＤＮＡ＋０．４ｍｇ／ＬのベクターＤＮＡ）及び２ｍｇ／ＬのＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ Ｍａｘ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃ ２４７６５－２）の混合物を細胞培養物に添加することによって、一過性トランスフェクションを２０％遺伝子用量で行った。トランスフェクションの４時間後に、独自の飼料｛Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ（０．５％ｗ／ｖ）及びグルコース（３ｇ／Ｌ）｝を添加した。細胞を４０００ｒｐｍ（３４８５ｘｇ）で４０分間遠心分離することによって、トランスフェクションの６日後に生成物を回収した。上清を０．４５μＭ ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルターで濾過した。
［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［正ＴＴＲ］２＝［Ａｂ「Ｂ」］分子（リンカーなし）の精製
ＡｅＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）ＦＰＬＣに接続したｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を、試料適用前に、ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）で平衡化した。濾過した細胞培養培地をカラム上に注入し、５カラム容積（ＣＶ）のＤＰＢＳで洗浄し、８ＣＶの５０ｍＭ ＨＯＡｃ、ｐＨ３．２で段階的に溶出した。１Ｍトリスを使用して溶出液をｐＨ５．０に滴定した後、０．４５μｍセルロースアセテート真空フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）に通して濾過した。滴定及び濾過したｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａプールを、さらなる精製のために２つの別個のプールに分割した。
ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａプールの半分を２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．０で１：５容積に希釈した後、２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０で以前に平衡化した、ＡｅＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）ＦＰＬＣに接続したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に注入した。カラムを５ＣＶの２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０で洗浄し、２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０から２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０への２０ＣＶ勾配で溶出した。
ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙ ＬａｂＣｈｉｐ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して製造業者のプロトコルに従って、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩマイクロキャピラリー電気泳動システムで分析した。単量体Ａｂ－ＴＴＲ、対、不適合ＭＷ種のおよその分子量でのバンドの富化のために画分を選択した後、プールした。
ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅプールを、Ｓｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）透析カートリッジを使用して、計算により出発緩衝液が１％未満になるまで、１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５に対して透析した。
ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａプールの他方の半分を、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．５で以前に平衡化したＡｅＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）ＦＰＬＣに接続したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラム上に注入した。カラムを、１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５中で定組成的に溶出した。
［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［正ＴＴＲ］２＝［Ａｂ「Ｂ」］分子（リンカーなし）のＰＣ分析
Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによってタンパク質定量を行った。
試料を１００ｍＭヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理した後、１０％ Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙゲル上に直接ロードし、製造業者のプロトコルに従って泳動することにより非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料緩衝液及び試料還元剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理することによって行った。試料を８５℃で５分間インキュベートした後、１０％ Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙゲル上にロードし、製造業者のプロトコルに従って泳動した。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して製造業者のマイクロ波プロトコルに従ってゲルを染色した。
Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）に接続したＺｅｎｉｘ－Ｃ ＳＥＣ－３００、７．８×３００ｍｍカラム（Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ、ＵＳＡ）上でＨＰＬＣ ＳＥＣ分析を行い、定組成５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．９移動相を１ｍＬ／分で流し、２８０ｎｍでＵＶ吸光度を観察した。
［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［正ＴＴＲ］２＝［Ａｂ「Ｂ」］分子（リンカーなし）のＤＡＳ分析
変性ＬＣ－ＭＳ：全てのＬＣ－ＭＳデータは、１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣシステムを有するＡｇｉｌｅｎｔ ６２３０ ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳシステムで取得した。クロマトグラフィー分離は、７５℃の温度で操作されるＺｏｒｂａｘ ＳＢ３００－Ｃ８ ３．５μｍ ２．１×５０ｍｍカラムを使用して達成した。使用した溶媒は以下のとおりであった：移動相Ａは、０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡを含有する水であった。移動相Ｂは、０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡを含有する９０％ ｎ－プロパノールであった。初期勾配条件は、０．０～１．０分の２０％移動相Ｂ；１．０～９．０分、２０～７０％移動相Ｂ；９．０～１０．０分、７０～１００％移動相Ｂであり、１００％でさらに１分間保持した。流速は、０．２ｍＬ／分であった。約５μｇのＩｇＧ１－ビオチンコンジュゲートを、各分析のためにＬＣ－ＭＳシステムにロードした。ｍ／ｚ範囲１０００～７０００にわたってデータを得た。ソースフラグメンター、スキマー及びオクタポール１ ＲＦ値は：それぞれ、４６０Ｖ、９５Ｖ、及び８００Ｖ（ピーク・ツー・ピーク）であった。ＥＳＩキャピラリー電圧は、５．９ｋＶであった。ガス温度は、３４０℃であった。乾燥ガスは、１３Ｌ／分であった。ネブライザーは、２５ｐｓｉｇであった。Ｏａ－ＴｏＦ較正は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｕｎｅ Ｍｉｘを使用して、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｄａｔａ ＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎバージョンＢ．０６．０１、Ｂｕｉｌｄ ６．０１．６１５７により実施される自動較正手順を用いて行った。
［６５５－３４１ Ａｂ］＝［［ＬＸ］－［負ＴＴＲ］］２：［［正ＴＴＲ］－［ＬＸ］］２＝［６５５－３４１ Ａｂ］分子の発現
発現は、［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［正ＴＴＲ］２＝［Ａｂ「Ｂ」］分子について記載したように行った。
［６５５－３４１ Ａｂ］＝［［ＬＸ］－［負ＴＴＲ］］２：［［正ＴＴＲ］－［ＬＸ］］２＝［６５５－３４１ Ａｂ］分子の精製
濾過した細胞培養培地を、ＡｅＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接続した、それぞれＤＰＢＳ及び１０ｍＭ ＭＥＳ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で平衡化したｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＤｅｓａｌｔｉｎｇ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）インラインタンデム精製システムに注入した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ ＡカラムをＤＰＢＳで洗浄し、１００ｍＭ ＨＯＡｃ、ｐＨ３．６で段階的に溶出した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ溶出液をＤｅｓａｌｔｉｎｇ ＨｉＴｒａｐカラム上で１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５と緩衝液交換した。
［６５５－３４１ Ａｂ］＝［［ＬＸ］－［負ＴＴＲ］］２：［［正ＴＴＲ］－［ＬＸ］］２＝［６５５－３４１ Ａｂ］分子のＤＡＳ分析
変性ＬＣ－ＭＳを、［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［正ＴＴＲ］２＝［Ａｂ「Ｂ」］分子について記載したように行った。
（１）［［Ｆａｂ「Ａ」］－［負ＴＴＲ］］２：［［正ＴＴＲ］－［Ｆａｂ「Ｂ」］］２、（２）［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［正ＴＴＲ］２＝［Ａｂ「Ｂ」］、及び（３）［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［［正ＴＴＲ］－［Ｆａｂ「Ｂ」］］２分子（共発現）の発現
ＣＨＯ－Ｋ１増殖培地は、５０％ ＣＳ９ Ｍｅｄｉａ（非選択、Ａｍｇｅｎ独自）＋５０％ ＥｘＣｅｌｌ３０２（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃１４３２４Ｃ）＋２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ＃２５０３０－０８１）からなる。選択培地は、増殖培地＋１０ｕｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＃Ａ１１１３８－０３）＋５００μｇ／ｍｌハイグロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１０６８７－０１０）からなる。生産培地は、ＣＨＯ－Ｋ１ ６ＤＣＤ（ＡＴＯ Ｍｅｄｉａ Ｌａｂ、Ａｍｇｅｎ独自）からなる。
トランスフェクション試薬は、リポフェクタミンＬＴＸ（Ｇｉｂｃｏ ＃１５３３８－１００（ｐ／ｎ ９４７５６））及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ還元血清培地（Ｇｉｂｃｏ ＃３１９８５－０７０）からなる。増殖条件は、通気振盪フラスコを使用して１２０ＲＰＭで振盪する加湿インキュベーター内の３６℃＋５％ ＣＯ２での懸濁液増殖であった。トランスフェクション手順は、以下のとおりであった。トランスフェクションの前日、宿主培養物を７～１０ｅ５ ＶＣＤ／ｍｌに分割した。ＤＮＡ／リポフェクタミンＬＴＸ複合体を、以下のように調製した。４μｇの非線形化ＤＮＡを、２４ＤＷＢ内の０．５ｍｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地中に希釈した（２．０μｇ ＧＯＩ（目的の遺伝子）及び２．０μｇのＰＢ２００（高活性トランスポザーゼ））。４鎖トランスフェクションのために、０．５ｕｇの各鎖及び２．０μｇのＰＢ２００（高活性トランスポザーゼ）を、合計４．０μｇ／トランスフェクションのために使用した。３鎖トランスフェクションのために、０．６６μｇの各鎖及び２．０μｇのＰＢ２００（高活性トランスポザーゼ）を、合計４．０μｇ／トランスフェクションのために使用した。１０μｌのリポフェクタミンＬＴＸを１５ｍｌポリプロピレンチューブ内の０．５ｍｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地中で希釈し、５分間放置した。次いで、希釈したＤＮＡをリポフェクタミンＬＴＸと合わせ、ピペッティングによって徹底的に混合した。混合物を室温で１５～２０分間インキュベートし、時折混合した。次いで、２ｅ６生存細胞／トランスフェクションを１５～５０ｍｌポリプロピレンチューブに移し、＠１２００ｒｐｍで５分間回転させ、培地を吸引した。次いで、細胞を完全な再懸濁により１ｘＰＢＳで洗浄し、＠１２００ｒｐｍで５分間回転させた。次いで、１ｘＰＢＳを吸引し、細胞を１ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（トランスフェクション当たり）中に再懸濁した。次いで、１ｍｌの細胞を各ウェルに添加し、次いでＤＮＡ／ＬＴＸ複合体を各ウェルに滴加した。細胞を２３５ｒｐｍでの振盪、３６℃＋５％ ＣＯ２で５～６時間インキュベートした。次いで、２．０ｍｌの非選択増殖培地（ＣＨＯ－Ｋ１培地）を細胞に添加した。トランスフェクションの７２時間後の選択は、細胞を完全再懸濁により４ｍｌの選択培地中に配置することによって行われた。６日目の増殖スケールアップは、ＤＷＢ培養物からの１．６ｍｌを、５０ｍｌ通気スピンチューブ内の１２ｍｌに直接添加することにより行った。１０日目の生成は、約１３ｍｌのＮ－１培養物を生産培地中に再懸濁して、４０ｍｌバッチ生成物を接種することによって行った。１７日目の回収は、細胞を遠心分離した後、条件培地を滅菌濾過することによって行った。
［［Ｆａｂ「Ａ」］－［負ＴＴＲ］］２：［［正ＴＴＲ］－［Ｆａｂ「Ｂ」］］２分子（共発現）の精製
Ｆａｂ－ＴＴＲ融合タンパク質は、Ｃ末端６ｘ ｈｉｓタグを含み、２ｍｌ／分の流速でＩＭＡＣアフィニティークロマトグラフィー（１ｍｌ ＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１７－３７１２－０５）を介してＣＭから捕捉した。次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５Ｍイミダゾール、ｐＨ７．４で２ｍｌ／分でタンパク質を段階的に溶出することにより、５ＣＶの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４で４ｍｌ／分の流速でＩＭＡＣカラムを洗浄した。ＩＭＡＣカラムを６Ｍグアニジン－ＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８でストリッピングし、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４で平衡化した後、次の試料をロードした。
全ての精製タンパク質を、最後に、５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１７－１４０８－０１）に流速２ｍｌ／分で通すことにより、１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６中に緩衝液交換した。全ての分取クロマトグラフィー操作は、ＡｅＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。次いで、Ａ２８０タンパク質定量、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、マイクロキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）、及びＳＤＳ－ＰＡＧＥを含む分析方法の組み合わせを用いて、生成されたタンパク質の量及び質を特性評価した。
［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［正ＴＴＲ］２＝［Ａｂ「Ｂ」］及び［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［［正ＴＴＲ］－［Ｆａｂ「Ｂ」］］２分子（共発現）の精製
抗体－ＴＴＲ融合タンパク質を、２ｍｌ／分の流速でタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー（１ｍｌ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＨｉＴｒａｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ；１１－００３４－９３）を介してＣＭから補足した。次いで、１００ｍＭ酢酸、ｐＨ３．６で２ｍｌ／分での段階的なタンパク質溶出によって、タンパク質Ａカラムを、５ＣＶの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４で４ｍｌ／分の流速で洗浄した。カラムを６Ｍグアニジン－ＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８でストリッピングし、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４で平衡化した後、次の試料をロードした。
全ての精製タンパク質を、最後に、５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１７－１４０８－０１）に流速２ｍｌ／分で通すことにより、１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６中に緩衝液交換した。全ての分取クロマトグラフィー操作は、ＡｅＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。
（１）［［Ｆａｂ「Ａ」］－［負ＴＴＲ］］２：［［正ＴＴＲ］－［Ｆａｂ「Ｂ」］］２、（２）［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［正ＴＴＲ］２＝［Ａｂ「Ｂ」］、及び（３）［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［［正ＴＴＲ］－［Ｆａｂ「Ｂ」］］２分子（共発現）のＰＣ分析
Ａ２８０定量 － Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｇｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を使用して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによってタンパク質定量を行った。
ＳＥＣ － ＴＴＲ－融合タンパク質試料を、１００ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、７．５％エタノール、ｐＨ６．９の移動相中、流速０．４ｍｌ／分でＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ ２００Å、１．７μｍ、４．６×３００ｍｍ ＳＥＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ；１８６００５２２６）に適用し、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を観察した。１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を使用して分析ＳＥＣを行った。これらのＴＴＲ－融合分子の大きいＭＷ（２４９～３４７ｋＤａ）と、製造関連の不純物に起因して、ＭＷベンチマーク分子を使用して特定の融合分子の予想ＭＷのおよそのＳＥＣ保持時間を価した。これらのベンチマーク分子は、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．製の分子であり、２つの異なる抗体（それぞれ１４５ｋＤａ；タンパク質ロットＢＲ４２１４－１及びＰＬ４１５９１）、抗体－ＴＴＲヘテロ四量体（６３５ｋＤａ；タンパク質ロットＰＬ３８００２）、抗体－ＴＴＲヘテロ二量体（２６５ｋＤａ；タンパク質ロットＰＬ４６７９６）、及びＦａｂ－ＴＴＲヘテロ四量体（２４８ｋＤａ；タンパク質ロットＰＬ３８０００）を含んでいた。
ＭＣＥ － ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を使用して、マイクロキャピラリー電気泳動によるＴＴＲ－融合タンパク質試料の特性評価を行った。試料を、製造業者のガイドラインに従って、還元及び非還元で調製した。マイクロ流体チップ技術は、タンパク質試料を自動的に染色、脱色、電気泳動的に分離、及び分析する。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ － ＴＴＲ－融合タンパク質試料を、８％、１０％、及び４～２０％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ；Ｗｅｄｇｅ Ｗｅｌｌ：それぞれＸＰ０００８０、ＸＰ００１００、ＸＰ０４２００）を含む多様なＴｒｉｓ－グリシン、一次元ゲル上で泳動した。試料は、非加熱、又は８５℃で１０分間加熱して、非還元で調製した。ゲルをＳｉｍｐｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＬＣ６０６０）を使用して染色し、所望の生成物バンドの同定のためにＭＷ参照標準と比較した。
（１）［［Ｆａｂ「Ａ」］－［負ＴＴＲ］］２：［［正ＴＴＲ］－［Ｆａｂ「Ｂ」］］２、（２）［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［正ＴＴＲ］２＝［Ａｂ「Ｂ」］、及び（３）［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［［正ＴＴＲ］－［Ｆａｂ「Ｂ」］］２分子（共発現）のＤＡＳ分析
変性ＬＣ－ＭＳを、［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［正ＴＴＲ］２＝［Ａｂ「Ｂ」］分子について記載したように行った。
ＳＥＣ－ネイティブ－ＭＳ：全てのＱＴｏＦ実験は、正ＥＳＩモードで操作されるＳｙｎａｐｔ Ｇ１ ＨＤＭＳ機器で行った。この機器は、Ｂｕｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０１０，８２：９５５７－９５６５により記載されているものと類似のＲＦ閉じ込めドリフトチューブ機器に変換されていた。全ての重要な機器電圧及び圧力は、以下のとおりである：キャピラリー電圧３．１ｋＶ；試料コーン２００Ｖ、抽出コーン１Ｖ；ソースブロック温度２５℃；トラップ衝突エネルギー５０Ｖ；移動衝突エネルギー２０Ｖ；トラップ入口２．０Ｖ；トラップバイアス５Ｖ；トラップ出口０．０Ｖ；ＩＭＳ入口－２０Ｖ；ＩＭＳ出口２１Ｖ；移動入口１．０Ｖ；移動出口１．０Ｖ；移動速度２４８ｍ／秒；移動波振幅３．０Ｖ；ソースＲＦ振幅（ピーク・ツー・ピーク）４５０Ｖ；三波ＲＦ振幅（ピーク・ツー・ピーク）トラップ３８０Ｖ、ＩＭＳ ２５０Ｖ、移動３８０Ｖ；ソースバッキング圧力６．０ｍｂａｒ；トラップ／移動圧力ｃＣ４Ｆ８、２．００ｅ－２ｍｂａｒ（ピラニ真空計表示：流速４．０ｍＬ／分）。機器制御及びデータの取得を、ＭａｓｓＬｙｎｘ ４．１ ＳＣＮ ８７２により行った。
周囲温度で流速７５μＬ／分で操作されるＡｇｉｌｅｎｔ １２００ポンプシステム及び２．１×５０ｍｍ、３００Å、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨを使用してＳＥＣを行った。移動相は、２００ｍＭ酢酸アンモニウムであった。ＳＥＣ分離は、定組成６分方法で行った。２５～５０μｇの材料を分析のために注入した。２００ｍＭ酢酸アンモニウムは、それが揮発性緩衝液であり、したがって質量分析計と適合性であるため使用した。機器制御は、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎにより行った。
以下の技術を用いて、ＴＴＲサブユニット当たり２つのＴＴＲ二量体／二量体界面突然変異（「Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／ＸＸ／ＹＹ」）を有するＴＴＲバリアントを含有するＴＴＲ負及び正構築物を生成した。
２つのＴＴＲ二量体／二量体界面突然変異を含むＴＴＲバリアントを有するＦａｂ ＴＴＲ二量体のクローニング
２つのＴＴＲ二量体／二量体界面突然変異を含むＴＴＲバリアントを有するＦａｂ ＴＴＲ二量体のクローニングは、（１）［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［正ＴＴＲ］２＝［Ａｂ「Ｂ」］（２Ｘ Ａｂ－ＴＴＲ）；（２）［［Ａｂ「Ａ」］－［負ＴＴＲ］］２：［［正ＴＴＲ］－［Ａｂ「Ｂ」］］２（４Ｘ Ａｂ－ＴＴＲ）；及び（３）［［Ｆａｂ「Ａ」］－［負ＴＴＲ］］２：［［正ＴＴＲ］－［Ｆａｂ「Ｂ」］］２（４Ｘ Ｆａｂ－ＴＴＲ）分子（リンカーなし）のクローニングを記載した節に記載されるものと類似の方法を用いて達成した。
２つのＴＴＲ二量体／二量体界面突然変異を含むＴＴＲバリアントを有するＦａｂ ＴＴＲ二量体の発現
トランスフェクションは、５０ｍｌスケールで行った。ＨＥＫ ２９３－６Ｅ細胞を、０．１％（ｗ／ｖ）Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、６ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２５μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ１７ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、振盪フラスコ中、５％ ＣＯ２、湿度８０％～９０％のインキュベーター内で３６℃で維持し、２５ｍｍ振盪径のシェーカー上で１２０ｒｐｍで撹拌した。トランスフェクションの２日前に、２９３－６Ｅ細胞を０．４×１０６細胞／ｍｌで播種した。トランスフェクション当日、細胞は指数増殖期にあった（約１．５×１０６細胞／ｍｌ、＞９５％生存率）。０．５ｍｇ／Ｌ ＤＮＡ及び２ｍｇ／Ｌ ＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ Ｍａｘ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃ ２４７６５－２）の混合物を細胞培養物に添加することによって、一過性トランスフェクションを行った。トランスフェクションの４時間後に、独自の飼料｛Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ（０．５％ｗ／ｖ）及びグルコース（３ｇ／Ｌ）｝を添加した。細胞を４０００ｒｐｍ（３４８５ｘｇ）で４０分間遠心分離することによって、トランスフェクションの６日後に生成物を回収した。上清を０．４５μＭ ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルターで濾過した。
２つのＴＴＲ二量体／二量体界面突然変異を含むＴＴＲバリアントを有するＦａｂ ＴＴＲ二量体の精製
濾過した細胞培養培地を、ＡｅＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接続した、それぞれ２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４及び１０ｍＭ ＭＥＳ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉｓＴｒａｐエクセルカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＤｅｓａｌｔｉｎｇ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）インラインタンデム精製システムに注入した。ＨｉｓＴｒａｐエクセルカラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄し、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で段階的に溶出した。ＨｉｓＴｒａｐエクセル溶出液を、Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ＨｉＴｒａｐカラム上で１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０と緩衝液交換した。
２つのＴＴＲ二量体／二量体界面突然変異を含むＴＴＲバリアントを有するＦａｂ ＴＴＲ二量体のＰＣ
ＭｕｌｔｉＳｋａｎ ＦＣ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによってタンパク質定量を行った。
非還元及び還元マイクロキャピラリー電気泳動分析を、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム上で、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙ ＬａｂＣｈｉｐ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って行った。
Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に接続したＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ４５０ ＳＥＣ ２．５μｍ ７．８×３００ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）上でＨＰＬＣ－ＳＥＣ分析を行い、定組成１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ ＮａＣｌ，７．５％ ＥｔＯＨ、ｐＨ６．９移動相を０．４ｍＬ／分で流し、２８０ｎｍでＵＶ吸光度を観察した。
［［Ｆａｂ「Ａ」］－［二重負ＴＴＲ］］及び［［二重正ＴＴＲ］－［Ｆａｂ「Ｂ」］］のヘテロ二量体化：別個に生成した構築物の混合及び分析
精製したＴＴＲ－Ｆａｂ試料を１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で希釈することにより０．２ｍｇ／ｍＬに正規化した。試料を等容積で合わせ、４℃で一晩インキュベートした。得られた分子混合物をＨＰＬＣ－ＳＥＣにより分析した。
［［Ｆａｂ「Ａ」］－［二重負ＴＴＲ］］及び［［二重正ＴＴＲ］－［Ｆａｂ「Ｂ」］］の共発現
トランスフェクションを個々に行い、完了後（１～４時間後）、［［Ｆａｂ「Ａ」］－［二重負ＴＴＲ］］及び［［二重正ＴＴＲ］－［Ｆａｂ「Ｂ」］］構築物をプールし、４ｍｌスケールで一緒に生成した。ＨＥＫ ２９３－６Ｅ細胞を、０．１％（ｗ／ｖ）Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、６ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２５μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ１７ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、振盪フラスコ中、５％ ＣＯ２、湿度８０％～９０％のインキュベーター内で３６℃で維持し、２５ｍｍ振盪径のシェーカー上で１２０ｒｐｍで撹拌した。トランスフェクションの２日前に、２９３－６Ｅ細胞を０．４×１０６細胞／ｍｌで播種した。トランスフェクション当日、細胞は指数増殖期にあった（約１．５×１０６細胞／ｍｌ、＞９５％生存率）。０．５ｍｇ／Ｌ ＤＮＡ及び２ｍｇ／Ｌ ＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ Ｍａｘ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃ ２４７６５－２）の混合物を細胞培養物に添加することによって、一過性トランスフェクションを行った。トランスフェクションの４時間後に、独自の飼料｛Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ（０．５％ｗ／ｖ）及びグルコース（３ｇ／Ｌ）｝を添加した。細胞を４０００ｒｐｍ（３４８５ｘｇ）で４０分間遠心分離することによって、トランスフェクションの６日後に生成物を回収した。上清を０．４５μＭ ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルターで濾過した。
共発現［［Ｆａｂ「Ａ」］－［二重負ＴＴＲ］］及び［［二重正ＴＴＲ］－［Ｆａｂ「Ｂ」］］の精製
濾過した細胞培養培地を、ＡｅＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接続した、それぞれ２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４及び１０ｍＭ ＭＥＳ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉｓＴｒａｐエクセルカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＤｅｓａｌｔｉｎｇ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）インラインタンデム精製システムに注入した。ＨｉｓＴｒａｐエクセルカラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄し、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で段階的に溶出した。ＨｉｓＴｒａｐエクセル溶出液を、Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ＨｉＴｒａｐカラム上で１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０と緩衝液交換した。
共発現［［Ｆａｂ「Ａ」］－［二重負ＴＴＲ］］及び［［二重正ＴＴＲ］－［Ｆａｂ「Ｂ」］］のＰＣ分析
ＭｕｌｔｉＳｋａｎ ＦＣ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによってタンパク質定量を行った。非還元及び還元マイクロキャピラリー電気泳動分析を、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム上で、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙ ＬａｂＣｈｉｐ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って行った。Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に接続したＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ４５０ ＳＥＣ ２．５μｍ ７．８×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）上でＨＰＬＣ－ＳＥＣ分析を行い、定組成１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ ＮａＣｌ、７．５％ ＥｔＯＨ、ｐＨ６．９移動相を０．４ｍＬ／分で流し、２８０ｎｍでＵＶ吸光度を観察した。
実施例２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生された、ＴＴＲサブユニット当たり１つのＴＴＲ二量体／二量体界面突然変異（「Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／ＸＸ」）を有するＴＴＲバリアントを含有するＴＴＲヘテロ四量体の評価
ＴＴＲ（配列番号１）の１８のＴＴＲ電荷バリアント（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／ＸＸ）を作製して、どの電荷突然変異がＴＴＲ二量体／二量体界面の実質的な反発をもたらすかを決定した（図４参照）。ＴＴＲバリアントのそれぞれは、Ｃ１０Ａ及びＫ１５Ａ突然変異と、「ＸＸ」と表記される第３の突然変異を含んでいた。これらの実験では、ＸＸは、Ｋ１５Ｒ、Ｌ１７Ｒ、Ｖ２０Ｒ、Ｒ２１Ｅ、Ｇ２２Ｒ、Ｓ２３Ｒ、Ｐ２４Ｒ、Ｄ５１Ｒ、Ｓ５２Ｒ、Ｉ８４Ｒ、Ｔ１０６Ｒ、Ａ１０８Ｒ、Ｓ１１２Ｒ、Ｙ１１４Ｒ、Ｓ１１５Ｒ、Ｔ１１９Ｒ、Ｖ１２１Ｒ、又はＳ１２３Ｒであった。
ＴＴＲバリアントのうちの９つ（Ｐ２４Ｒ、Ｉ８４Ｒ、Ｌ１７Ｒ、Ｖ１２１Ｒ、Ｖ２０Ｒ、Ｇ２２Ｒ、Ｓ１１２Ｒ、Ｔ１１９Ｒ、Ｙ１１４Ｒ、及びＳ１１５Ｒ）は、ＴＴＲ四量体が、加熱なしでＳＤＳ（カオトロープ）の存在下で、対応するＴＴＲ二量体に分解されたという事実により証明されるように、ＴＴＲ二量体／二量体界面の実質的な弱化を示した（図５参照、「非加熱」ゲル）。バリアントのうちの６つ（Ｖ２０Ｒ、Ｇ２２Ｒ、Ｓ１１２Ｒ、Ｔ１１９Ｒ、Ｙ１１４Ｒ、及びＳ１１５Ｒ）はまた、ＳＥＣにより評価されるように、非変性（天然）条件下で二量体／二量体相互作用を妨害する（図６参照）。加えて、バリアントのうちの４つ（Ｐ２４Ｒ、Ｉ８４Ｒ、Ｌ１７Ｒ、及びＶ１２１Ｒ）は、非変性ＳＥＣ条件下で、主にＴＴＲ四量体を形成することが観察され、より低い融解温度を示し、二量体／二量体界面がこれらのバリアントにおいて弱化したことを再び示した。
最も好ましい６つの二量体／二量体界面突然変異部位（図６、赤色）を選択して、さらなるＴＴＲバリアントを生成し、２つの異なるＴＴＲ単量体配列を含むＴＴＲヘテロ四量体の形成を評価した。これらの実験において、所望のＴＴＲヘテロ四量体は、［１］それ自体２つのＴＴＲ単量体からなる１つのＴＴＲ二量体（各単量体は、「負」ＴＴＲバリアントである）；及び［２］それ自体２つのＴＴＲ単量体からなる１つのＴＴＲ二量体（各単量体は、「正」ＴＴＲバリアントである）を含む。好ましい６つの二量体／二量体界面突然変異部位を、ＳＥＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ条件下でヘテロ四量体を形成するそれらの能力に基づいて選択した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ条件下で主に二量体形成を導く突然変異部位を、初期カットオフとして選択した（すなわち、Ｌ１７Ｒ、Ｖ１２１Ｒ、Ｖ２０Ｒ、Ｇ２２Ｒ、Ｓ１１２Ｒ、Ｔ１１９Ｒ、Ｙ１１４Ｒ、及びＳ１１５Ｒ）。Ｙ１１４Ｒ及びＳ１１５Ｒは、タンパク質の収率が明らかに低いため、さらなる考慮から除外した。
負ＴＴＲバリアントはＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／ＸＸ突然変異を含み、各ＸＸは、Ｌ１７Ｄ、Ｌ１７Ｅ、Ｖ２０Ｄ、Ｖ２０Ｅ、Ｇ２２Ｄ、Ｇ２２Ｅ、Ｓ１１２Ｄ、Ｓ１１２Ｅ、Ｔ１１９Ｄ、Ｔ１１９Ｅ、Ｖ１２１Ｄ、又はＶ１２１Ｅであった。同様に、正ＴＴＲバリアントはＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／ＸＸ突然変異を含み、各ＸＸは、Ｌ１７Ｒ、Ｌ１７Ｋ、Ｖ２０Ｒ、Ｖ２０Ｋ、Ｇ２２Ｒ、Ｇ２２Ｋ、Ｓ１１２Ｒ、Ｓ１１２Ｋ、Ｔ１１９Ｒ、Ｔ１１９Ｋ、Ｖ１２１Ｒ、又はＶ１２１Ｋであった。したがって、合計２４の電荷界面バリアント（１２の負及び１２の正）が生成された（図７）。
正バリアントを負バリアントと混合し（対様式で）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣの両方によってＴＴＲヘテロ四量体形成を評価した。バリアント対合の多くは、図７の非ゼロＳＥＣ値によって示されるように、所望のヘテロ四量体を形成するいくらかの傾向を示した（値は、ヘテロ四量体形成の％を表す）。実際に、いくつかの対合は、ヘテロ四量体を形成する非常に高い傾向を示し、四量体形成は４０～１００％であった。
これらのＴＴＲヘテロ四量体の多くは、同じく図７に示すＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果により示されるように、カオトロピックＳＤＳによる分解に抵抗性であった。安定なヘテロ四量体を形成する高い傾向を示した正／負対合は（ＳＥＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥデータを相互参照）：Ｌ１７Ｒ／Ｔ１１９Ｄ、Ｌ１７Ｋ／Ｔ１１９Ｄ、Ｌ１７Ｋ／Ｖ１２１Ｅ、Ｖ２０Ｒ／Ｖ２０Ｄ、Ｖ２０Ｒ／Ｖ２０Ｅ、Ｖ２０Ｋ／Ｖ２０Ｄ、Ｖ２０Ｋ／Ｖ２０Ｅ、Ｖ１２１Ｒ／Ｌ１７Ｄ、Ｖ１２１Ｒ／Ｌ１７Ｅ、及びＶ１２１Ｋ／Ｌ１７Ｄを含む。
安定なＴＴＲ四量体を形成する高い傾向を示した正／負対合を、さらにＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した。この実験では、各対合について、［１］負（すなわち、塩基性）バリアント；［２］正（すなわち、酸性）バリアント；［３］負及び正バリアントの組み合わせ（これは四量体を形成する筈である）；並びに［４］カスパーゼに暴露した負及び正バリアントの組み合わせを評価した（図８）。図８に示すように、別々の負及び正バリアントは、ゲルの下部に移動し、一方、負及び正バリアントの組み合わせは、ゲルの途中までしか移動しなかった。これは、さらに、負及び正バリアントが組み合わされると、高分子量種（ＨＭＷ）（おそらく所望のヘテロ四量体）を形成することを証明する。負及び塩基性バリアントの組み合わせをカスパーゼで処理すると（これは、ＤＥＶＤ配列の包含に起因して、正バリアントからポリヒスチジンタグを切断するのみである）、切断されていない四量体よりも僅かに低く走る殆ど均一なバンドが生成され、これは、正成分が存在することを示し、四量体が殆ど均一であり、おそらくヘテロ四量体であることを示す。
次いで、Ｌ１７Ｒ／Ｔ１１９Ｄ、Ｌ１７Ｋ／Ｔ１１９Ｄ、Ｌ１７Ｋ／Ｖ１２１Ｅ、Ｖ２０Ｒ／Ｖ２０Ｄ、Ｖ２０Ｒ／Ｖ２０Ｅ、Ｖ２０Ｋ／Ｖ２０Ｄ、Ｖ２０Ｋ／Ｖ２０Ｅ、Ｖ１２１Ｒ／Ｌ１７Ｄ、Ｖ１２１Ｒ／Ｌ１７Ｅ、及びＶ１２１Ｋ／Ｌ１７Ｄ対合を含むヘテロ四量体を、ｐＨ５．０条件に暴露して、医薬製剤で見出されるものと類似の条件下で、それらが四量体状態を維持できるか否かを決定した（ＳＥＣにより）（図９）。実際に、図９の単一ピークは、ヘテロ四量体がそれらの四量体状態を維持できたことを示す。
３つのヘテロ四量体の融解温度を評価した。それぞれの場合、ヘテロ四量体は、少なくとも９２℃まで安定であり、ヘテロ四量体が熱的に非常に安定であることが示された（図１０）。
実施例３：哺乳動物細胞で産生された、ＴＴＲサブユニット当たり１つのＴＴＲ二量体／二量体界面突然変異（「Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／ＸＸ」）を有するＴＴＲバリアントを含有するＴＴＲヘテロ四量体Ｆａｂ、Ａｂ、及び混合Ｆａｂ／Ａｂ構築物の評価
ＴＴＲヘテロ四量体Ｆａｂ、Ａｂ、及び混合Ｆａｂ／Ａｂ構築物を形成する能力を評価した。これらの構築物では、２つの正ＴＴＲバリアント及び２つの負ＴＴＲバリアント（上述したような）を含むＴＴＲ四量体を使用して、４つのＦａｂ、２つのＡｂ、又は１つのＡｂ及び２つのＦａｂに付着したＴＴＲヘテロ四量体を生成することができる。それぞれ図２ａ、２ｂ及び２ｃを参照されたい。Ｆａｂ構築物中の電荷対突然変異を使用して、適切なＨＣ／ＬＣ Ｆａｂ対合を推進することができる。このようなＴＴＲヘテロ四量体構築物の１つの利点は、Ａｂ及び／又はＦａｂのＣ末端へのＴＴＲ単量体単位の融合によって、複数の抗原標的化部分（例えば、Ａｂ及び／又はＦａｂ）のアセンブリを可能にすることである。これは、Ａｂ及び／又はＦａｂを、それらの抗原結合ドメインが、典型的にはＩｇＧ Ｃ末端へのＦａｂ又はｓｃＦｖ Ｎ末端の融合に起因する、他の二価二重特異性プラットフォーム（例えば、ＩｇＧ－Ｆａｂ及びＩｇＧ ｓｃＦｖ構築物）に見られる立体障害を受けにくいように配向する。
ＴＴＲヘテロ四量体Ａｂ構築物
二重特異性ＴＴＲヘテロ四量体Ａｂ構築物を生成した。これらの構築物では、１つのＡｂ（６５５－３４１ Ａｂ）が、ヒトＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子関連のアポトーシス誘導リガンド）受容体２（ＴＲ－２、死受容体５）の細胞外ドメインに特異的であり、他方のＡｂ（ＤＮＰ－３Ｂ１）が、ＤＮＰに特異的であった。例示的な二重特異性ＴＴＲヘテロ四量体Ａｂ構築物を図１１に示し、６５５－３４１ Ａｂ（斜線）の各重鎖は負ＴＴＲ単量体のＮ末端に付着し（一緒に負ＴＴＲ二量体を形成する）、ＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ（塗りつぶし）の各重鎖は、正ＴＴＲ単量体のＮ末端に付着している（一緒に正ＴＴＲ二量体を形成する）。
４つの負ＴＴＲバリアントは６５５－３４１ Ａｂに融合され、４つの正ＴＴＲバリアントは、ＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂに融合された（図１１）。Ａｂ－ＴＴＲ融合物の全ては、ＡｂとＴＴＲ単量体との間のリンカーを有さずに作製された。これらのバリアントは、培地への分泌のために哺乳動物細胞（２９３－６Ｅ ＨＥＫ細胞）で生成された。形質転換細胞の２つのセットを生成した：１つは６５５－３４１ Ａｂ／負ＴＴＲ融合物（［６５５－３４１ Ａｂ］＝［負ＴＴＲ］２）を生成し、もう１つはＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ／正ＴＴＲ融合物（［正ＴＴＲ］２＝［ＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ］）を生成する。
興味深いことに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生されたＴＴＲ四量体（実施例２）とは対照的に、有意な量の分泌構築物は：自己会合６５５－３４１ Ａｂ／負ＴＴＲ融合物（すなわち、［６５５－３４１ Ａｂ］＝［負ＴＴＲ］２：［負ＴＴＲ］２＝［６５５－３４１ Ａｂ］）、自己会合ＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ／正ＴＴＲ融合物（すなわち、［ＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ］＝［正ＴＴＲ］２：［正ＴＴＲ］２＝［ＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ］）、又は他のＨＭＷ種であった。遊離６５５－３４１ Ａｂ／負ＴＴＲ融合物（［６５５－３４１ Ａｂ］＝［負ＴＴＲ］２）及びＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ／正ＴＴＲ融合物（［正ＴＴＲ］２＝［ＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ］）は、分泌構築物の１１～３２％を占めた（図１２）。急速な緩衝液交換は、ＨＭＷ種の量を減少させたが、これは、主に自己会合種の増加をもたらした。
Ａｂ重鎖とＴＴＲ単量体との間にリンカーを加える効果を、同じ８つの電荷バリアントを使用して調べた。サイズが２～１０のアミノ酸の範囲の５つのリンカーを評価した（図１３）。主に分泌されたリンカー含有Ａｂ／ＴＴＲ融合種は、再度、自己会合（例えば、［６５５－３４１ Ａｂ］＝［［ＬＸ］：［負ＴＴＲ］］２：［［負ＴＴＲ］：［ＬＸ］］２＝［６５５－３４１ Ａｂ］）及びＨＭＷ種であった。遊離６５５－３４１ Ａｂ／負ＴＴＲ融合物及びＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ／正ＴＴＲ融合物（［６５５－３４１ Ａｂ］＝［［ＬＸ］：［負ＴＴＲ］］２及び［［正ＴＴＲ］：［ＬＸ］］２＝［ＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ］）は、分泌構築物の３１％までを占めた（図１４及び図１５）。特に、より短いリンカーは一般に、より高い力価及び収率（すなわち、より多くのタンパク質産生）並びにより低いレベルのＨＭＷ種をもたらした（図１６）。加えて、負ＴＴＲ融合物は、適度に高い収率及びより低いＨＭＷ種レベルをもたらした。リンカー含有Ａｂ－ＴＴＲ融合物のいずれも、主生成物としての６５５－３４１ Ａｂ／負ＴＴＲ融合物又はＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ／正ＴＴＲ融合物を形成しなかった。他の観察事項には、より短いリンカーがより高いレベルのＳＤＳ耐性自己会合Ａｂ／ＴＴＲ融合物を産生したこと；Ｖ２０Ｋ、Ｖ２０Ｒ、及びＶ１２１Ｋがより高いレベルのＳＤＳ感受性自己会合Ａｂ／ＴＴＲ融合物を産生したこと；Ｔ１１９Ｄ、Ｖ２０Ｄ、Ｖ１２１Ｅ、及びＬ１７Ｄがより高い力価／収率及び減少した量の遊離Ａｂ／ＴＴＲ融合物を産生したこと；並びに負バリアントがより少ない量のＨＭＷ種を産生したようであることが含まれた。
これらの観察に照らして、哺乳動物細胞は、「四量体化されていない」ＴＴＲを効率的に産生し得ないという仮説が立てられた。すなわち、哺乳動物細胞は、［６５５－３４１ Ａｂ］＝［負ＴＴＲ］２又は［正ＴＴＲ］２＝［ＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ］（リンカーを有し又は有さない）を産生することが困難であり得、これはこのような構築物が、２つのＴＴＲ単量体しか含まない（４つのＴＴＲ単量体を有する天然起源のＴＴＲと比較して）ためである。これを調べるために、６５５－３４１ Ｆａｂ／負ＴＴＲ融合物とＤＮＰ－３Ｂ１ Ｆａｂ／正ＴＴＲ融合物の５つの組み合わせを、哺乳動物細胞株（ＣＨＯ Ｋ１）において共産生させた。これらの構築物では、Ｆａｂ ＨＣをＧＧリンカーを介してＴＴＲに付着させた（図１７）。
ＣＨＯ Ｋ１における［６５５－３４１ Ｆａｂ］－［ＧＧ］－［負ＴＴＲ］及び［正ＴＴＲ］－［ＧＧ］－［ＤＮＰ－３Ｂ１ Ｆａｂ］の共産生は、所望の［［６５５－３４１ Ｆａｂ］－［ＧＧ］－［負ＴＴＲ］］２：［［正ＴＴＲ］－［ＧＧ］－［ＤＮＰ－３Ｂ１ Ｆａｂ］］２（７８～８８％）の有意な形成と、減少した量のＨＭＷ種（それぞれの場合、５％未満）とをもたらした（図１８）。Ｆａｂ形成は、全ての突然変異対について非常に効率的であることが見出されたが、Ｌ１７Ｄ／Ｖ１２１Ｒ対では僅かな利点のみ存在するように思われた。加えて、あたかもＶ２０Ｒ／Ｖ２０Ｄ対が、ＳＤＳによって破壊され得る弱いヘテロ四量体を形成し得るかのように思われた。
Ａｂ－及びＦａｂ－ＴＴＲ融合物並びに非融合ＡｂをＳＥＣ標準物質として使用すると、分子１５５２４（［６５５－３４１ Ｆａｂ］－［ＧＧ］－［ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄ）］及び［ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒ）］－［ＧＧ］－［ＤＮＰ－３Ｂ１ Ｆａｂ］）は、４Ｘ－Ｆａｂホモ多量体と同様の保持時間を有し、２Ｘ－Ｆａｂ－ＴＴＲ融合物（これは対照Ａｂの後に溶出する筈である）に予想される保持時間よりも実質的に短いことが分かる（図１９）。さらに、１５５２４をＳＥＣ結合ＭＳによって評価する場合、溶離種の分子質量は、予想されるものと一致する（図２０）。
同じ手法を行って、Ａｂ含有ＴＴＲ融合物の共発現が所望のＴＴＲヘテロ四量体［６５５－３４１ Ａｂ］＝［［ＬＸ］－［負ＴＴＲ］］２：［［正ＴＴＲ］－［ＬＸ］］２＝［ＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ］の生成をもたらすか否かを決定した。合計５つのＴＴＲ電荷バリアント及び３つのリンカー長（Ｘ＝０、４、及び１０のアミノ酸）を、合計１５の組み合わせについて試験した（図２１）。有意な量の所望のＴＴＲヘテロ四量体が、多くの組み合わせについて、７０％まで形成された（図２２）。加えて、４アミノ酸リンカーは、０アミノ酸リンカーと比較して、より高い力価及び収率をもたらした。Ａｂ－及びＦａｂ－ＴＴＲ融合物並びに非融合ＡｂをＳＥＣ標準物質として使用すると、分子１５５３９（［６５５－３４１ Ａｂ］＝［［ＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧ］－［ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄ］］２：［［ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋ）］－［ＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧ］］２＝［ＤＮＰ－３Ｂ１ Ａｂ］）が、２Ｘ－Ａｂ－ＴＴＲホモ多量体のものとほぼ同一の主ピーク保持時間を有することが観察されたことが分かる（図２３）。さらに、構築物をＳＥＣ結合ＭＳによって評価した場合、溶離種の分子質量は、所望のＴＴＲヘテロ四量体のものと一致する（図２４）。平均して、Ｌ４リンカーは、所望の生成物の良好な優先的産生と結びついた良好な収率をもたらすように思われることが観察された。加えて、Ｌ１７Ｋ／Ｔ１１９Ｄ、Ｖ２０Ｋ／Ｖ２０Ｄ、及びＶ２０Ｒ／Ｖ２０Ｄ突然変異の組み合わせは、高い発現及び収率をもたらすように思われた。最後に、Ｌ１７Ｋ／Ｖ１２１Ｅ、Ｖ１２１Ｋ／Ｌ１７Ｄ、及びＶ２０Ｋ／Ｖ２０Ｄ突然変異の組み合わせは、ＴＴＲヘテロ四量体の所望のアセンブリを推進することが最も可能であるように思われた。図２５を参照されたい。
本発明者らは、次に、同じ細胞株においてＡｂ及びＦａｂに融合した負及び正ＴＴＲバリアント（各突然変異の４つ）の共発現が、Ａｂ－Ｆａｂ－ＴＴＲ構築物（すなわち、［Ａｂ「Ａ」］＝［負ＴＴＲ］２：［［正ＴＴＲ］＝［Ｆａｂ「Ｂ」］］２構築物）の生成をもたらすか否かを決定することを模索した。３つのリンカー長（Ｘ＝０、４、及び１０アミノ酸）及び２つのＡｂ／Ｆａｂを組み合わせた合計５つのＴＴＲバリアントを、合計３０の組み合わせについて試験した（図２６）。多くの組み合わせについて、ＳＥＣに基づいて、所望のＡｂ－Ｆａｂ－ＴＴＲ構築物を形成したＡｂ融合物の量は、４５．６％までであった（図２７）。加えて、４アミノ酸及び１０アミノ酸リンカーは、０アミノ酸リンカーと比較して、より多くの所望のＡｂ－Ｆａｂ－ＴＴＲ構築物を産生するように思われる（力価及び精製収率に基づいて）。Ａｂ－及びＦａｂ－ＴＴＲ融合物並びに非融合ＡｂをＳＥＣ標準物質として使用すると、分子１５５４５（［６５５－３４１ Ａｂ］＝［［ＧＧＧＧ］－［ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄ）］］２：［［ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒ）］－［ＧＧ］－［ＤＮＰ－３Ｂ１－Ｆａｂ］］２）は、予想されるように、２Ｘ－Ａｂ－ＴＴＲホモ多量体と４Ｘ－Ｆａｂ－ＴＴＲホモ多量体との間の保持を有するピークを生成することが観察された（図２８）。さらに、この分子をＳＥＣ結合ＭＳによって評価する場合、溶離種の分子質量は、所望の構築物と一致する（図２９）。平均して、Ｌ１０リンカーは、Ａｂ－Ｆａｂ－ＴＴＲ構築物において好ましいことが観察された。加えて、Ｌ１７Ｋ／Ｔ１１９Ｄ ＴＴＲ突然変異は、Ａｂ－Ｆａｂ－ＴＴＲ構築物において好ましいと思われる。図３０を参照されたい。
実施例４：哺乳動物細胞における、ＴＴＲサブユニット当たり２つのＴＴＲ二量体／二量体界面突然変異（「Ｃ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／ＸＸ／ＹＹ」）を有するＴＴＲバリアントを含有するＴＴＲヘテロ四量体Ｆａｂ、Ａｂ、及び混合Ｆａｂ／Ａｂ構築物の評価
２つの荷電界面突然変異を有するＡｂ－及びＦａｂ－ＴＴＲ融合物を、単一荷電界面突然変異について以前に記載したように、哺乳動物細胞において別個に生成した。力価、アフィニティークロマトグラフィー後収率及びＳＥＣ性能を、単一荷電界面突然変異について以前に記載したように評価した。次いで、精製された単一及び二重荷電界面バリアントをマトリックス様式で混合し、混合物を、単一電荷バリアントについて以前に記載したように、ＳＥＣによって評価した。
単一及び二重荷電界面突然変異を有するＡｂ－及びＦａｂ－ＴＴＲ融合物を、単一荷電界面突然変異について以前に記載したように、反対に荷電したＴＴＲバリアントを有する哺乳動物細胞を共培養することによって生成した。アフィニティークロマトグラフィー後収率及びＳＥＣ性能を、単一荷電界面突然変異について以前に記載したように評価した。
これらの実験の結果は、図３１～図４０で見出すことができる。図３５及び図３６で理解され得るように、バリアントの特定の組み合わせは、混合前に個々に産生された分子の単純な混合物について産生されたものと比較して、４Ｘ－Ｆａｂ形成の顕著な増加を生じた（プレミックス４Ｘ－Ｆａｂレベルの平均をとり、観察された４Ｘ－Ｆａｂからその値を減算することによって決定される）。図３７は、混合物の４Ｘ－Ｆａｂ ＳＥＣピークが、プレミックス４Ｘ－Ｆａｂピークよりもはるかに大きいことを示すことによって、これを例示する。加えて、特定の共培養条件は、より多量の４Ｘ－Ｆａｂの形成をもたらした（図３８及び図３９）。図４０は、共培養された４Ｘ－Ｆａｂピークが個々に培養された分子の４Ｘ－Ｆａｂピークよりも有意に大きいことを示し、電荷カウンターバリアントの存在下での４Ｘ－Ｆａｂ形成の可能な増加を示す。
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Claims (48)

  1. トランスサイレチン（ＴＴＲ）タンパク質複合体であって、前記ＴＴＲタンパク質複合体は、ＴＴＲサブユニットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを含み；
    ＴＴＲサブユニットＡ及びＢは、二量体化して、ＴＴＲ二量体ＡＢを形成し；
    ＴＴＲサブユニットＣ及びＤは、二量体化して、ＴＴＲ二量体ＣＤを形成し；
    ＴＴＲ二量体ＡＢ及びＴＴＲ二量体ＣＤはさらに二量体化して、ＴＴＲ四量体ＡＢＣＤを形成し；
    Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれは、ＴＴＲ二量体ＡＢ及びＴＴＲ二量体ＣＤの間の界面における少なくとも１つのアミノ酸が、ＡＢＣＤ四量体の形成がＡＢＡＢ四量体又はＣＤＣＤ四量体の形成よりも有利であるように突然変異されていることを除いて、配列番号１のアミノ酸配列を含む、トランスサイレチン（ＴＴＲ）タンパク質複合体。
  2. Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれは、Ｃ１０Ａ、Ｋ１５Ａ、又はＣ１０Ａ及びＫ１５Ａの両方の突然変異を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  3. Ａ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの全ては、配列番号１の６、７、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、５０、５１、５２、５３、５４、５６、５７、６０、６１、６２、６３、７８、８２、８３、８４、８５、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、及び１２７を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含む、請求項１又は２に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  4. Ａ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの全ては、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含む、請求項３に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  5. Ａ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの全ては、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含み、
    ここで、前記アミノ酸は、アスパルテート又はグルタメートに突然変異されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  6. Ａ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの全ては、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含み、
    ここで、前記アミノ酸は、アルギニン、リシン、又はヒスチジンに突然変異されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  7. Ａ及びＢは、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含み、
    ここで、前記アミノ酸は、アスパルテート又はグルタメートに突然変異されている、請求項１～６のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  8. Ｃ及びＤは、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含み、
    ここで、前記アミノ酸は、アルギニン、リシン、又はヒスチジンに突然変異されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  9. Ａ及びＢは、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含み、ここで、前記アミノ酸は、アスパルテート又はグルタメートに突然変異され；
    Ｃ及びＤは、配列番号１の１５、１７、２０、２１、２２、２３、２４、５１、５２、８４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１５、１１９、１２１、及び１２３を含むリストから選択される１つ以上のアミノ酸位置における突然変異を含み、ここで、前記アミノ酸は、アルギニン、リシン、又はヒスチジンに突然変異されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  10. Ａ及びＢは、配列番号１における少なくとも１つの突然変異を含み、前記突然変異は、Ｋ１５Ｄ、Ｌ１７Ｄ、Ｖ２０Ｄ、Ｒ２１Ｄ、Ｇ２２Ｄ、Ｓ２３Ｄ、Ｐ２４Ｄ、Ｓ５２Ｄ、Ｉ８４Ｄ、Ｔ１０６Ｄ、Ａ１０８Ｄ、Ｓ１１２Ｄ、Ｙ１１４Ｄ、Ｓ１１５Ｄ、Ｔ１１９Ｄ、Ｖ１２１Ｄ、Ｓ１２３Ｄ、Ｋ１５Ｅ、Ｌ１７Ｅ、Ｖ２０Ｅ、Ｒ２１Ｅ、Ｇ２２Ｅ、Ｓ２３Ｅ、Ｐ２４Ｅ、Ｄ５１Ｅ、Ｓ５２Ｅ、Ｉ８４Ｅ、Ｔ１０６Ｅ、Ａ１０８Ｅ、Ｓ１１２Ｅ、Ｙ１１４Ｅ、Ｓ１１５Ｅ、Ｔ１１９Ｅ、Ｖ１２１Ｅ、及びＳ１２３Ｅを含むリストから選択される、請求項１～７及び９のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  11. Ａ及びＢは、配列番号１における少なくとも１つの突然変異を含み、前記突然変異は、Ｌ１７Ｄ、Ｌ１７Ｅ、Ｖ２０Ｄ、Ｖ２０Ｅ、Ｇ２２Ｄ、Ｇ２２Ｅ、Ｓ１１２Ｄ、Ｓ１１２Ｅ、Ｔ１１９Ｄ、Ｔ１１９Ｅ、Ｖ１２１Ｄ、及びＶ１２１Ｅを含むリストから選択される、請求項１０に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  12. Ｃ及びＤは、配列番号１における少なくとも１つの突然変異を含み、前記突然変異は、Ｋ１５Ｒ、Ｌ１７Ｒ、Ｖ２０Ｒ、Ｇ２２Ｒ、Ｓ２３Ｒ、Ｐ２４Ｒ、Ｄ５１Ｒ、Ｓ５２Ｒ、Ｉ８４Ｒ、Ｔ１０６Ｒ、Ａ１０８Ｒ、Ｓ１１２Ｒ、Ｙ１１４Ｒ、Ｓ１１５Ｒ、Ｔ１１９Ｒ、Ｖ１２１Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｌ１７Ｋ、Ｖ２０Ｋ、Ｒ２１Ｋ、Ｇ２２Ｋ、Ｓ２３Ｋ、Ｐ２４Ｋ、Ｄ５１Ｋ、Ｓ５２Ｋ、Ｉ８４Ｋ、Ｔ１０６Ｋ、Ａ１０８Ｋ、Ｓ１１２Ｋ、Ｙ１１４Ｋ、Ｓ１１５Ｋ、Ｔ１１９Ｋ、Ｖ１２１Ｋ、Ｓ１２３Ｋ、Ｋ１５Ｈ、Ｌ１７Ｈ、Ｖ２０Ｈ、Ｒ２１Ｈ、Ｇ２２Ｈ、Ｓ２３Ｈ、Ｐ２４Ｈ、Ｄ５１Ｈ、Ｓ５２Ｈ、Ｉ８４Ｈ、Ｔ１０６Ｈ、Ａ１０８Ｈ、Ｓ１１２Ｈ、Ｙ１１４Ｈ、Ｓ１１５Ｈ、Ｔ１１９Ｈ、Ｖ１２１Ｈ、及びＳ１２３Ｈを含むリストから選択される、請求項１～６、８及び９のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  13. Ｃ及びＤは、配列番号１における少なくとも１つの突然変異を含み、前記突然変異は、Ｌ１７Ｒ、Ｌ１７Ｋ、Ｌ１７Ｈ、Ｖ２０Ｒ、Ｖ２０Ｋ、Ｖ２０Ｈ、Ｇ２２Ｒ、Ｇ２２Ｋ、Ｇ２２Ｈ、Ｓ１１２Ｒ、Ｓ１１２Ｋ、Ｓ１１２Ｈ、Ｔ１１９Ｒ、Ｔ１１９Ｋ、Ｔ１１９Ｈ、Ｖ１２１Ｒ、Ｖ１２１Ｋ、及びＶ１２１Ｈを含むリストから選択される、請求項１２に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  14. Ａ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの全ては、独立して、１つの前記突然変異を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＴＲタンパク質複合体。
  15. Ａ及びＢの両方、Ｃ及びＤの両方、又はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの全ては、独立して、２つの前記突然変異を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＴＲタンパク質複合体。
  16. Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれは、以下の突然変異を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体：
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｇ２２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｓ１１２Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む；又は
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む。
  17. Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む；又は
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋを含む、
    請求項１～１５のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  18. Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれは、以下の突然変異を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体：
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋ／Ｖ２０Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅ／Ｖ２０Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒ／Ｖ２０Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｄ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｋ／Ｖ１２１Ｒを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒ／Ｖ１２１Ｋを含む；又は
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒ／Ｖ１２１Ｒを含む。
  19. Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれは、以下の突然変異を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体：
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｅ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｖ２０Ｒ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅ／Ｔ１１９Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒ／Ｖ１２１Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒ／Ｖ２０Ｋを含む；
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｄ／Ｖ２０Ｄを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｋ／Ｖ２０Ｋを含む；又は
    Ａ及びＢの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｅ／Ｖ１２１Ｅを含み、Ｃ及びＤの両方がＣ１０Ａ／Ｋ１５Ａ／Ｌ１７Ｒ／Ｖ１２１Ｒを含む。
  20. 前記ＴＴＲタンパク質複合体は、１、２、３、４、５、６、７、又は８の抗原結合タンパク質又はペプチドに付着する、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  21. 前記ＴＴＲタンパク質複合体は、１、２、３、又は４の抗原結合タンパク質又はペプチドに付着する、請求項２０に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  22. 前記抗原結合タンパク質又はペプチドは、ＴＴＲサブユニットのＣ末端においてＴＴＲタンパク質複合体に付着する、請求項２０又は２１に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  23. 前記抗原結合タンパク質又はペプチドは、ＴＴＲサブユニットのＮ末端においてＴＴＲタンパク質複合体に付着する、請求項２０又は２１に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  24. 前記ＴＴＲタンパク質複合体は：
    １、２、３、４、５、６、７、又は８の抗原結合タンパク質又はペプチドに直接付着し；又は
    リンカーを介して１、２、３、４、５、６、７、又は８の抗原結合タンパク質に付着する、請求項２０～２３のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  25. 前記ＴＴＲタンパク質複合体は：
    １、２、３、又は４の抗原結合タンパク質に直接付着し：又は
    リンカーを介して１、２、３、又は４の抗原結合タンパク質に付着する、請求項２０～２３のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  26. 前記リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０のアミノ酸を含むアミノ酸ベースのリンカーである、請求項２５に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  27. 前記リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸を含むアミノ酸ベースのリンカーである、請求項２６に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  28. 前記リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のアミノ酸を含むアミノ酸ベースのリンカーである、請求項２７に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  29. 前記リンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸を含むアミノ酸ベースのリンカーである、請求項２８に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  30. 前記リンカーは、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、又はＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧである、請求項２６に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  31. 前記リンカーは、Ｇ（ＧｘＢｙ）ｒＧｚであり、式中：
    Ｇ＝グリシン；
    Ｂ＝アミノ酸
    ｘ＝１～１５；
    ｙ＝１～５；
    ｚ＝１～１５；及び
    ｒ＝１～２０である、請求項２６に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  32. Ｂ＝Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｐ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｄ又はＮ；
    ｘ＝４；
    ｙ＝１；
    ｚ＝４；及び
    ｒ＝１である、請求項３０に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  33. 前記リンカーは：ＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＳＧＧ、ＧＧＧＳＧＧＧＧ、及びＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧを含むリストから選択される、請求項２６に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  34. 前記ＴＴＲタンパク質複合体は、２つの抗原結合タンパク質に付着し、前記抗原結合タンパク質は、異なる抗原に付着する、請求項２０～３３のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  35. 前記ＴＴＲタンパク質複合体は、４つの抗原結合タンパク質に付着し、前記抗原結合タンパク質は、少なくとも２つの異なる抗原に付着する、請求項２０～３３のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  36. 前記抗原結合タンパク質は抗体である、請求項２０～３５のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  37. 前記抗原結合タンパク質はＦａｂ又はｓｃＦｖである、請求項２０～３５のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  38. 前記抗原結合タンパク質はＦａｂである、請求項３７に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  39. 前記抗原結合タンパク質は、抗体とＦａｂの混合物である、請求項２０～３５のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  40. 請求項１～３９のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体を含む医薬組成物。
  41. 請求項１～３９のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体を使用するがんの治療方法。
  42. がんの治療における、請求項１～３９のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体の使用。
  43. がんの治療にて使用するための、請求項１～３９のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体。
  44. ＴＴＲサブユニット、抗原結合タンパク質又はペプチド（抗体又はＦａｂなど）に融合又は連結されたＴＴＲサブユニット、又は請求項１～３９のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体をコードする、１つ以上の単離された核酸。
  45. 請求項４４に記載の核酸を含む発現ベクター。
  46. 請求項４４に記載の核酸又は請求項４５に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
  47. 前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｅ５細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓（ＣＯＳ）細胞、ヒト肝細胞癌細胞、又はヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞である、請求項４５に記載の組換え宿主細胞。
  48. 請求項１～３９のいずれか一項に記載のＴＴＲタンパク質複合体の作製方法であって、前記方法は：
    ａ）請求項４６又は４７に記載の組換え宿主細胞を培養することと、
    ｂ）前記培養物から前記ＴＴＲタンパク質複合体を単離することと、
    を含む、方法。
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