KR20090114388A - 질환 특이적 결합 분자 및 표적을 제공하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 원래의 내인단백질로부터 유래되고 환자의 체내에 변이체으로 퍼져 있고/있거나 정상적인 생리적 피질로부터 유래되는 질병 관련된 단백질의 네오에피토프를 인식하는 신규한 특이적 결합 분자, 특히 인간 항체, 및 이의 단편, 유도체 및 변이체에 관한 것이다. 또한, 이러한 결합 분자, 항체 및 이의 모방체를 포함하는 약제 조성물, 및 알츠하이머병과 같은 신경성 질환의 치료에서의 표적일 뿐만 아니라 항체이거나 아닐 수 있는 신규한 결합 분자를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

질환 특이적 결합 분자 및 표적을 제공하는 방법 {METHOD OF PROVIDING DISEASE-SPECIFIC BINDING MOLECULES AND TARGETS}
본 발명은 천연 내인단백질로부터 유래되며, 다양한 형태로 환자 체내에 분포되고/거나 정상적인 생리학적 상황으로부터 벗어난 단백질의 네오에피토프를 포함하는 질환 관련 에피토프를 인식하는 신규한 특이적 결합 분자 특히, 인간 항체 및 이의 단편, 유도체 및 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 결합 분자, 항체 및 이의 모방체를 포함하는 약제 조성물 및 신규한 결합 분자를 스크리닝하는 방법에 관한 것이며, 이는 다양한 질환 특히, 신경학적 장애 예컨대, 알츠하이머병, 아밀로이드증 및 베타-아밀로이드 병리의 치료시 항체, 표적 및 약물일 수 있거나 없다.
모노클로날 항체 생성의 성공은 문헌 [Koehler and Milstein, Nature 256 (1975), 495-497]에 원래 기술된 바와 같이, 항원-자극된 B 세포와 뮤린 골수종 세포주를 효과적이고 선택적으로 융합시키고, 안정한 항체를 생성하는 하이브리드를 선택하는데에 있다. 그러나, 인간에서 뮤린 (murine) 기재 항체의 치료학적 유용성은 이들의 비인간 기원의 견지에서 인간 항-마우스 항체 (HAMA)에 의해 훼손된다. 인간 또는 인간 유사 모노클로날 항체를 제조하는 방법은 유전자 조작을 통해 가능해졌다. 그러나, 지금까지 이용가능한 방법들은 생리학적 인간 면역 반응 과정에서 발생하는 항체의 특징을 갖는 항체를 생성하기에 적합하지 않다는 단점을 갖고 있다. 게다가, 이러한 항체는 정상적인 생리학적 작용에서 다른 단백질 및/또는 표적 단백질과의 상호 반응성으로 인해 충분히 특이적일 수 없다. 알츠하이머병 또는 파킨슨 병의 경우, 예를 들어, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 또는 알파-시누클레인의 생리학적 유도체와 높은 친화도로 상호작용하는 항체는 생리학적 표적 구조의 정상적인 작용과 관련된 부작용을 나타내는 것으로 여겨진다. 이와 관련하여, 바람직하지 않은 자가면역 질환이 명백히 유도될 것이다 - 다양한 형태로 생리학적으로 발생하는, 단백질 구조를 이용하는 활성 면역화 실험의 개념적 설계에서는 예측할 수 없는 위험. 표적 구조와 관련되지 않은 부작용 예를 들어, 아나필락시 반응이 외생성 단백질의 전신 투여의 바람직하지 못한 두려운 부작용으로서 예측된다. 최근 발견에 따르면, 이는 또한, 소위 인간화된 항체의 경우일 수 있으며, 이는 원래 비인간 유기체, 일반적으로 마우스로부터 유래된다. 다른 한편으로는, 병리학적 관련 항원으로의 활성 면역화는 이러한 단백질의 생리학적 변이체를 인지하는 T 세포 반응 및 항체를 발생시켜, 위험하고 제어불가능한 자가면역 반응을 초래할 심각한 위험을 갖고 있다.
따라서, 질환과 관련된 표적에 대해 특이적이며, 인체에 의해 용인되는 작용제를 제공해야 한다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 진단학적으로 및 치료학적으로 유용한 결합 분자 특히, 내 인단백질의 병리적 변이체에 대해 유도된 항체를 확인하고, 유효화하고 생성시키는 방법이다. 더욱 특히, 본 발명은
(a) 증상이 없거나 임상적으로 특이적으로 안정하나, 질환에 걸렸거나 발병 위험성이 있는 환자로부터 수득된 샘플을 소정의 병리학적 특징을 갖는 병리학적으로 변형된 세포 또는 조직의 시편으로 처리하고;
(b) 상기 시편에는 결합하나, 건강한 피검체로부터 유래될 수 있는 이러한 병리학적 특징을 갖지 않는 상응하는 세포 또는 조직에는 결합하지 않는 결합 분자를 확인하고, 선택적으로 분리하는 것을 포함하여,
질환-관련 단백질-특이적 결합 분자를 분리하는 방법에 관한 것이다.
자가면역 질환의 경우, 항체는 자가 세포 및 단백질 또는 상기 세포에 의해 발현된 당지질과 같은 화합물에 대한 것이며, 공지된 내성 메카니즘을 회피한다는 점은 인지되어 있다. 또한, 내생성 신생물 발생의 경우, 신생 세포에 대한 세포성 및 체액성 면역성이 발생될 수 있으며, 따라서, 신생 조직 변성에 대한 내생성 면역 보호 메카니즘을 유도할 수 있음은 공지되어 있다.
본 발명은 항체가, 병리학적으로 변형된 전사, 번역 또는 전사후 또는 번역후 변형, 또는 단백질분해 프로세싱 또는 응집으로 인해 형성된 내인단백질 (endogenous proteins)의 병태생리학적 관련 변이체 특히, 네오에피토프에 대해 유도될 수 있다는 놀라운 발견을 이용한다. 이러한 항체는 내인단백질에 대해 유도된 것이며, 이는 정상 생리 현상으로부터 벗어난 이들의 새로운 구조로 인해, 발생하는 병리학적 효과에 의해 병태생리학적으로 관련되게 된다. 면역 관용의 이유 로, 이러한 병리학적 변이체에서 네오에피토프에 대한 상응하는 면역 반응과 관련된 항체는 정상적으로는 생리학적 작용 단백질에 대한 교차 반응을 나타내지 않으며, 이는 자가면역 질환의 경우와 반대된다. 이는 잠재적인 교차-반응 항체의 형성이 공지된 관용 메카니즘에 의해 특정하게 억제되는 반면, 병리학적 네오에피토프에 대한 면역 반응의 발생은 관용으로부터 벗어날 수 있기 때문이다.
따라서, 본 발명은 확인가능한 병리학적 구조물과의 상호작용에 의해 임상적으로 미리 선택된 인간 피검체로부터의 진단학적, 치료학적 및 예방학적 활성 결합 분자 특히, 항체 및 항체 단편을 확인하는 신규한 방법에 관한 것이다.
이와 같이, 본 발명은 천연 내인단백질로부터 유래되며, 다양한 형태 예를 들어, 병리학적 단백질로서 체내에 분포되고/거나 이들의 정상적인 생리학적 상황에서 벗어난 질환 관련 단백질의 네오에피트로를 포함하는 에피토프를 인식할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편 및 유사한 항원 결합 분자에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 면역치료학적 및 면역진단학적 방법에 관한 것이다.
추가로, 항체 확인에서, 본 발명에 따른 방법은 오로지 병리학적 관련 구조물과의 관련성에 의한 이의 분자 표적 구조의 확인에 대해 이전의 가설없이 수행될 수 있다. 이와 같이 특정 질환에 대해 지금까지 비공지된 분자 표적 구조에 대한 확인 가능성 이외에, 병리학적 구조에 대해 배타적으로 유도된 항체의 추가적 이점은, 이들의 약력학적 유효성이 항체의 농도 및 싱크 이펙트 (sink effect)와 관련하여 항체가 완충되어 치료학적 유효 농도의 결정을 방해하는 방식으로 비-질환 조 직으로의 결합에 의해 부정적으로 영향을 받지 않는다는 점에 기초한다. 또한, 본 발명의 항체 및 결합 분자는 바람직하게는, 이들이 다양한 형태의 생체내 질환 관련 단백질 또는 세포 또는 세포 막과 반응하며, 병리학적 특징을 갖는 질환 조직의 절편에서 반응하나, 동족 단백질의 생리학적 변이체와는 반응하지 않거나 현저하게 적은 정도로 반응함을 특징으로 한다; 예를 들어, 실시예 2 참조.
본 발명이 질환 세포 및 조직에서의 분자 표적 구조물을 확인하고 분리할 수 있기 때문에, 추가의 구체예는 각각 항원 및 병리학적 단백질 즉, 질환-관련 단백질에 관한 것이며, 이는 본 발명의 네오에피토프-특이적 항체에 의해 결합된다.
특히 바람직한 구체예는 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며, 이는 항체의 면역학적 결합 특징이 하기 표 2 및 3에 제시된 바와 같은 가변 영역 VH 및/또는 VL에 의해 특성 결정됨을 보여준다. 대안적으로, 항체는 인간화된, 이종성 또는 키메라 인간-뮤린 항체이며, 후자는 특히 진단법 및 동물 연구에 유용하다. 항체 또는 이의 활성 단편, 또는 아고니스트 및 동족 분자, 또는 대안적으로 이의 안타고니스트를 포함하는 치료학적 조성물, 및 질환의 예방, 진단 또는 치료에서 이러한 조성물의 사용 방법이 또한 포함되며, 유효량의 조성물이 이러한 처치가 필요한 환자에 투여된다.
항체의 항원 결합 단편은 단일쇄 Fv 단편, F(ab') 단편, F(ab) 단편 및 F(ab')2 단편, 또는 임의의 다른 항원-결합 단편일 수 있다. 하기 특정 구체예에서, 항체 또는 이의 단편은 인간 IgG 이소형 항체이다.
자연적으로, 본 발명은 각각 불멸화된 인간 B 메모리 림프구 및 B 세포에 까지 연장되며, 이는 하기 정의된 바와 같은 별개의 독특한 특징을 갖는 항체를 생성한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체의 면역글로불린 사슬의 적어도 가변 영역을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 가변 영역은 하기 표 2 및 3에 제시된 바와 같은 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 상응하는 CDR 세트가 하기 표 4에 제공되어 있다.
따라서, 본 발명은 또한, 상기 폴리누클레오티드 및 이로 형질변환된 숙주 세포를 포함하는 벡터뿐만 아니라, 질환 특히, 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 뇌질환에 대한 지시체 및/또는 원인이 되는 네오에피토프에 특이적인 항체 및 동급의 결합 분자를 생성하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.
항체, 면역글로불린 사슬(들), 이의 결합 단편 및 상기 항체에 결합하는 항원은 각각 면역치료 및 진단을 위한 약제학적 및 진단학적 조성물에 사용될 수 있다. 그러나, 의약 제조시 상기 조성물의 사용이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 특정 목적은 각 단백질의 천연 작용에 간섭받지 않으면서 중추신경계에서 단백질의 비정상적 축적 및/또는 침착을 특징으로 하는 신경학적 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 본 방법은 유효 농도의 항체 또는 항체 유도체를 피검체에 투여하는 것을 포함하며, 항체는 정상적인 생리학적 형태의 단백질 보다 병리학적 형태의 단백질 또는 단백질 침착물에 현저하게 높은 친화 도로 결합한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 피검체에서 아밀로이드 베타 펩티드의 축적 및 침착과 관련된 질병 예컨대, 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증의 인지 장애 (mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 혈관병증 (cerebral amyloid angiopathy), 혈관 치매 (vascular dementia), 다발경색 치매 (multi-infarct dementia)를 치료하거나 예방하거나 이의 발병을 지연시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효 농도의 항체 또는 항체 유도체를 피검체에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 정상적인 생리학적 형태의 단백질 보다 병리학적 형태의 단백질 또는 단백질 침착물에 더 높은 친화도로 결합한다. 유사한 치료 방법이 파킨슨병, 헌팅턴병, 크로이츠펠트-야콥병, 낭성섬유증 (cystic fibrosis), 고셔병 (Gaucher's disease) 등의 치료에 구상된다.
본 발명의 추가의 구체예는 하기 설명으로부터 자명해질 것이다.
도 1: 베타-아밀로이드에 대한 항체. A: 인간 항체. B: 인간 베타-아밀로이드에 대한 공지된 항체로 염색된 대조군. 임상적으로 특이적으로 안정한 알츠하이머병 환자는 베타-아밀로이드 플라그 (plaque)에 대한 항체를 함유한다. 병리학적으로 확인된 알츠하이머병 환자로부터 수득한 뇌 단편의 임상적으로 특이적으로 안정한 환자로부터의 항체로의 면역조직화학적 염색은 인간 베타-아밀로이드에 대한 공지된 항체에 의해 확인된 베타-아밀로이드 플라그에 결합하는 항체를 나타낸다.
도 2: 신경원섬유 (neurofibrillary tangles)에 대한 항체. A: 인간 항체. B: 인간 타우 (tau)에 대한 공지된 항체로 염색된 대조군. 건강한 인간 피검체는 신경원섬유에 대한 항체를 함유한다. 건강한 피검체로부터의 항체로의 병리학적으로 확인된 알츠하이머병 환자로부터 수득된 뇌 절편의 면역조직화학적 염색은 인간 타우에 대한 공지된 항체에 의해 확인된 신경원섬유에 결합하는 항체를 나타낸다.
도 3: 이영양성 신경돌기에 대한 항체. A: 인간 항체. B: 인간 타우에 대한 공지된 항체로 염색된 대조군. 건강한 인간 피검체는 이영양성 신경돌기에 대한 항체를 함유한다. 건강한 피검체로부터의 항체로의 병리학적으로 확인된 알츠하이머병 환자로부터 수득된 뇌 절편의 면역조직화학적 염색은 이영양성 신경돌기에 결합하는 항체를 나타낸다.
도 4: 베타-아밀로이드에 대한 항체. 도면은 임상적으로 특이적으로 안정적인 알츠하이머병 환자로부터 수득된 재조합 인간 NI-101.11 항체의 뇌 베타-아밀로이드 플라그로의 특이적 결합을 나타낸다. 신경병리학적으로 확인된 알츠하이머병 환자로부터 수득된 뇌 절편편을 지시된 농도에서 재조합 인간 항체로 염색하였다. 50pM의 농도로 베타-아밀로이드 플라그에 결합하는 항체는 높은 친화도의 결합임을 시사한다.
도 5: 베타-아밀로이드 플라그에 대한 재조합 인간 NI-101.11 항체의 결합은 선형 합성 N-말단 아베타 폴리펩티드와 경쟁하지 않는다. 1μM 이하의 농도에서 1 내지 16번을 나타내는 N-말단 Abeta-유래된 폴리펩티드는 뇌 베타-아밀로이드 (0.5nM)에 대한 재조합 항체의 결합과 경쟁할 수 없다.
도 6: 재조합 인간 NI-101.11 항체는 모노머 Abeta (A베타)에 존재하지 않는 배좌 Abeta 에피토프를 인식한다. 뇌 절편에서 베타-아밀로이드 플라그로의 NI-101.11의 결합은 Abeta1-42 피브릴과는 경쟁하나, 합성 Abeta1-42 모노머와는 경쟁할 수 없다.
도 7: 재조합 인간 NI-101.11 항체는 웨스턴 블롯에서 선형의 모노머 합성 Abeta에 결합하지 않는다. 모노머 Abeta의 제조는 비변성 (non-denaturing) PAGE에 의해 분리된다. 블롯팅된 단백질을 베타-아밀로이드에 대한 인간 재조합 항체 및 N-말단 선형 Abeta 서열에 대한 대조군 항체 (6E10)로 프로빙하였다. NI-101.11이 모노머 Abeta에 결합하지 않는 것으로 검출되었다. 이러한 관찰은 항체가 배좌 Abeta 에피토프를 인식함을 시사한다.
도 8: 인간 NI-101.11 항체는 합성 Abeta1-42 펩티드로부터 제조된 인공 아밀로이드 피브릴에 결합한다. 동일한 코팅 밀도로 ELISA 플레이트상으로 코팅된 합성 Abeta 피브릴 또는 모노머 합성 Abeta를 지시된 농도에서 뇌 베타-아밀로이드에 대한 재조합 인간 항체와 인큐베이션하였다. 인공 아밀로이드 피브릴 (백색 사각형)로의 뇌 베타-아밀로이드에 대한 인간 항체의 결합 활성은 모노머 Abeta (흑색 사각형)과 비교하여 100배 더 높다. 대조군 항체 22C4는 우선적으로 모노머 Abeta (흑색 원)에 결합하고, 피브릴 (백색 원)에 덜 결합한다. 이는 NI-101.11이 합성 Abeta 펩티드로부터 제조된 인공 아밀로이드 피브릴상에 존재하는 배좌 에피토프를 인식함을 시사한다.
도 9: 배양된 세포에서 발생하는 세포성 전장 APP로의 또는 이의 생리학적 유도체와의 재조합 인간 NI-101.11 항체의 교차 반응성 부재. 세포 표면 APP에 결 합하는 대조군 항체 (6E10)와 반대로, 세포 표면에 존재하는 전장 APP로의 NI-101.11의 결합은 존재하지 않는다. 이러한 데이타는 생리학적 세포성 전장 APP로의 NI-101.11의 교차 반응성의 부재를 입증한다.
도 10A-C: 크기별 배제 크로마토그래피를 통한 모노머 Abeta로의 NI-101.11의 결합 부재. 도 10A 및 10B는 모노머 FITC-라벨링된 Abeta1-42로의 NI-101.11 또는 비관련된 대조군 항체의 결합을 나타내지 않는 반면, 도 10C는 Abeta의 C-말단에 존재하는 선형 에피토프를 인식하는 항체 22C4의 현저한 결합을 나타낸다.
도 11: 경쟁 ELISA는 Abeta의 N-말단에서 선형 에피토프에 대해 유도된 항체인 항체 6E10의 결합이 과농도의 모노머 Abeta 펩티드와의 사전인큐베이션시 완전하게 차단될 수 있는 반면, 과농도의 이러한 모노머 Abeta 펩티드 제조물과의 사전인큐베이션은 NI-101.11 결합을 폐지하지 않았음을 나타낸다.
도 12: NI-101.13A 및 NI-101.13B의 알츠하이머병에 걸린 Tg2676 유전자 이식 마우스 모델로부터 수득된 뇌 절편으로의 결합.
도 13: 모노머 Abeta와 비교하여 인공 아밀로이드 피브릴로의 NI-101.13A 및 NI-101.13B의 우선적 결합을 나타내는 ELISA.
도 14A-B: 도 14A는 ELISA를 통한 합성 Abeta1-42 펩티드로의 재조합 NI-101.12의 결합을 나타낸다. 도 14B는 NI-101.12 결합이 과다 Abete1-42 펩티드에 의해 경쟁됨을 보여준다.
도 15: 뇌 베타-아밀로이드에 대한 재조합 인간 NI-101.11 항체는 알츠하이머병의 유전자 이식 마우스 모델의 뇌혈관장벽을 가로지르며, 생체내에서 뇌 베타- 아밀로이드 플라그에 결합한다.
도 16A-B: 재조합 인간 NI-101.11 항체는 알츠하이머병의 유전자 이식 마우스 모델에서 비정상 인지 성향을 개선시킨다. 24개월령 arcAbeta 마우스를 2달 동안 3mg/kg 항체로 주마다 i.p. 처리하였다. Y-maze 성향 시험을 처리 완료 전후에 수행하였다.
도 17: 말초 투여된 NI-101.11에 의한 아밀로이드 플라그의 뇌혈관장벽 침투 및 데코레이션. NI-101-11은 NI-101.11 처리된 마우스에서 뇌혈관장벽을 가로지르며, 베타-아밀로이드 침착물에 결합하는 반면 (왼쪽 패널), 인간 대조군 항체로 처리된 동물에서는 이러한 염색이 보이지 않는다 (오른쪽 패널). 재조합 인간 NI-101.11 항체는 두 달 동안의 전신 처리 후 뇌 베타-아밀로이드 플라그 부하를 저하시킨다.
도 18: NI-101.11로의 수동 면역은 arcAbeta 마우스에서의 베타-아밀로이드 부하를 저하시킨다. (A,B) 티오플라빈 S 및 콩고 레드 플라그 부하 분석은 대조군 항체 처리된 동물과 비교하여 50% 초과의 현저한 저하를 나타낸다 (만-휘트니 유 (Mann-Whitney U); 티오에스 (ThioS): 피질에 있어서 p = 0.02, 해마에 있어서 p = 0.009, 및 콩고 레드 분석 (Congo Red analysis): 피질에 있어서 p = 0.009 및 해마에 있어서 p = 0.04). 스케일 바: 200㎛. (C-E) 티오플라빈 S 분석은 대조군 처리된 동물과 비교하여 NI-101.11 처리된 arcAbeta 마우스에서 적재된 베타-아밀로이드 (C), 베타-아밀로이드 플라그의 수 (D) 및 평균 플라그 크기 (E)에 있어서 현저한 저하를 나타낸다. 만-휘트니 U 통계: 피질에 있어서 플라그 영역 p = 0.02; 해마에 있어서 플라그 영역 p = 0.009; 피질에 있어서 플라그 수 p = 0.047; 해마에 있어서 플라그 수 p = 0.047; 피질에 있어서 플라크 크기 p 0.009; 해마에 있어서 플라그 수 p = 0.009.
도 19: 저하된 베타-아밀로이드 부하는 저하된 별아교세포증 (astrocytosis) 및 미세아교세포종증 (microgliosis)에 의해 달성된다. A) 항-GFAP 염색의 정량화는 대조군 처리된 유전자 이식체와 비교할 경우 NI-101.11 처리된 arcAbeta 마우스의 피질에서 반응성 별아교세포의 수의 현저한 저하를 나타내었다. B) Iba-1 염색의 정량화는 피질 및 해마에서 NI-101.11 처리된 마우스에서 활성화된 미소교질세포 (microglia)의 저하된 수에 대한 경향을 나타내었다. 스케일 바: 200㎛.
도 20: 재조합 인간 NI-101.11 항체로의 2달 처리한 후 뇌 미세출혈이 증가되지 않았다. 입증된 대량의 친콩고성 아밀로이드 혈관병증을 갖는 24개월령 arcAbeta 마우스를 2달 동안 3mg/kg 항체로 주마다 i.p. 처리하였다. arcAbeta 마우스에서 뇌 미세출혈의 대표적 사진이 펄스 프루시안 블루 염색 (Perl's Prussian blue staining)으로 나타내었다 (왼쪽). 정량적 분석은 이들의 야생형 같은 배 새끼와 비교하여 arcAbeta 유전자 이식 마우스에서 미세출혈의 현저하게 증가된 빈도를 입증한다. NI-101.11로의 만성 치료는 미세출혈의 빈도를 증가시키지 않았다. 스케일 바: 20㎛.
도 21: 재조합 인간 NI-101.11 항체는 실험관내에서 합성 Abeta 피브릴의 형성을 억제한다. Abeta 피브릴의 형성에 대한 재조합 인간 NI-101.11 항체의 효과를 형광 분석에 의해 응집된 Abeta로 결합된 티오플라빈 S를 측정함으로써 분석하 였다.
도 22: BV-2 미세교질세포에 의한 FITC-Abeta1-42 피브릴의 항체 매개된 용량 의존적 식균작용을 스캐빈저 수용체 시스템의 억제시 측정하였다. NI-101.11은 Abeta 피브릴의 잠재적인 용량 의존적 Fc감마 수용체-매개된 식균작용을 촉발시킨다.
I. 정의
단수 형태는 대상의 하나 이상을 나타내는 것으로서, 예를 들어, "항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해해야 한다. 이와 같이, 본원에서 단수 형태는 "하나 또는 그 초과" 및 "하나 이상"과 교환가능하게 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드"는 단수의 "폴리펩티드" 및 복수의 "폴리펩티드들"을 포함하는 것으로 의도되며, 아미드 결합 (또한 펩티드 결합으로 공지됨)에 의해 선형으로 연결된 모노머 (아미노산)으로 이루어진 분자를 나타낸다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 나타내며, 특정 길이의 생성물을 나타내는 것은 아니다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬", 또는 2개 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 나타내는데 사용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의내에 포함되며, 용어 "폴리펩티드"는 이들 용어 대신에 또는 이들 용어와 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
용어 "폴리펩티드"는 또한, 비제한적으로, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 또는 비천연발생 아미노산에 의한 변형을 포함하는 폴리펩티드의 발현 후 변형 생성물을 나타내는 것으로 의도된다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 재조합 기법에 의해 생성될 수 있으나, 고안된 핵산 서열로부터 반드시 번역될 필요는 없다. 이는 화학 합성을 포함하는 임의의 방법으로 생성될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상, 또는 2,000개 이상의 아미노산 크기일 수 있다. 폴리펩티드는 규정된 3차원 구조를 가질 수 있으나, 반드시 이러한 구조를 가질 필요는 없다. 규정된 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드는 폴딩된 것을 나타내며, 규정된 3차원 구조를 갖지 않으며 많은 다양한 형태를 취할 수 있는 폴리펩티드는 언폴딩된 것을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 당단백질은 아미노산 잔기 예를 들어, 세린 잔기 또는 아스파라긴 잔기의 산소-함유 또는 질소-함유 측쇄를 통해 단백질에 부착된 하나 이상의 탄수화물 부분에 결합된 단백질을 나타낸다.
"분리된" 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체는 천연 환경에서는 존재하지 않는 폴리펩티드를 의도한다. 특정 수준의 정제가 요구되지는 않는다. 예를 들어, 분리된 폴리펩티드는 이의 천연 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 재조합적으로 생성된 폴리펩티드 및 숙주 세포에서 발현된 단백질은 본 발명의 목적을 위해 분리된 것으로 여겨지며, 분리되거나, 분별화되거나 부분적으로 또는 실질적으로 임의의 적합한 기법에 의해 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드이다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드로서 상기 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체 또는 변이체, 및 이의 임의의 조합이 포함된다. 본 발명의 항체 또는 항체 폴리펩티드를 나타낼 때 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"는 상응하는 천연 결합 분자, 항체 또는 폴리펩티드의 항원-결합 특성중 적어도 일부를 보유하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드의 단편은 본원의 다른 곳에서 논의된 특이적 항체 단편 이외에, 단백질분해 단편 및 결실 단편을 포함한다. 본 발명의 항체 및 항체 폴리펩티드의 변이체는 상기 기술된 바와 같은 단편을 포함하며, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인한 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 천연 또는 비천연 발생적일 수 있다. 비천연 발생 변이체는 당해 공지된 돌연변이유발 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. 네오에피토프-특이적 결합 분자의 유도체 예를 들어, 본 발명의 항체 및 항체 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드에서는 발견되지 않는 부가적인 특징을 나타내도록 변형된 폴리펩티드이다. 예로는 융합 단백질을 포함한다. 변이체 폴리펩티드는 또한, "폴리펩티드 유사체"로서 나타낼 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 결합 분자 또는 이의 단편, 항체 또는 항체 폴리펩티드의 "유도체"는 작용성 측기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 갖는 해당 폴리펩티드를 나타낸다. 또한, "유도체"로서 20개 표준 아미노산의 하나 이상의 천연 발생 아미노산 유도체를 함유하는 펩티드가 포함된다. 예를 들어, 4-히드록시프롤린이 프롤린 대신 치환될 수 있으며; 5-히드록실리신이 리신 대신 치환될 수 있으며; 3-메틸히스티딘이 히스티딘 대신에 치환될 수 있으며; 호모세린이 세린 대신에 치환될 수 있으며; 오르니틴이 리신 대신에 치환될 수 있다.
용어 "폴리누클레오티드"는 단일 핵산 및 다수의 핵산을 포함하는 것으로 의도되며, 분리된 핵산 분자 또는 작제물 예를 들어, 메신저 RNA (mRNA) 또는 플라스미드 DNA (pDNA)를 나타낸다. 폴리누클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비통상적인 결합 (예를 들어, 펩티드 핵산 (PNA)에서 발견된 것과 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은 폴리누클레오티드에 존재하는 하나 이상의 핵산 세그먼트, 예를 들어, DNA 또는 RNA 단편을 나타낸다. "분리된" 핵산 또는 폴리누클레오티드는 이의 천연 환경으로부터 회수된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 나타내는 것이다. 예를 들어, 벡터에 함유된 항체를 엔코딩하는 재조합 폴리누클레오티드는 본 발명의 목적을 위해 분리된 것으로 여겨진다. 분리된 폴리누클레오티드의 추가적 예로는 이종성 숙주 세포중에 유지된 재조합 폴리누클레오티드 또는 용액중의 정제된 (부분적으로 또는 실질적으로) 폴리누클레오티드를 포함한다. 분리된 RNA 분자는 본 발명의 폴리누클레오티드의 생체내 또는 실험관내 RNA 전사체를 포함한다. 본 발명에 따른 분리된 폴리누클레오티드 또는 핵산은 추가로 합성적으로 생성된 이러한 분자를 포함한다. 또한, 폴리누클레오티드 또는 핵산은 조절 엘리먼트 예컨대, 프로모터, 리보좀 결합 부위 또는 전사 종료체일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "코딩 영역"은 아미노산으로 번역된 코돈으로 이루어진 핵산 부분이다. "정지 코돈" (TAG, TGA 또는 TAA)이 아미노산으로 번역되지 않지만, 이는 코딩 영역의 일부로서 간주될 수 있으며, 플랭킹 서열 예를 들어, 프로모터, 리보좀 결합 부위, 전사 종료체, 인트론 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 본 발명의 2개 이상의 코딩 영역은 단일 폴리누클레오티드 작제물 예를 들어, 단일 벡터상 또는 별도의 폴리누클레오티드 작제물 예를 들어, 별도의 (상이한) 벡터상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 함유할 수 있거나, 두개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단일 벡터는 각각 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 별도로 엔코딩할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리누클레오티드 또는 핵산은 결합 분자, 항체, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 엔코딩하는 핵산에 융합되거나 비융합된 이종성 코딩 영역을 엔코딩할 수 있다. 이종성 코딩 영역은 비제한적으로, 특정화된 엘리먼트 또는 모티프 예컨대, 분비 시그널 펩티드 또는 이종성 작용성 도메인을 포함한다.
특정 구체예에서, 폴리누클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우에, 일반적으로 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 폴리누클레오티드는 하나 이상의 코딩 영역과 작동적으로 결합된 프로모터 및/또는 기타 전사 또는 번역 조절 엘리먼트를 포함할 수 있다. 작동가능하게 결합됨은 유전자 생성물 예를 들어, 폴리펩티드에 대한 코딩 영역이 조절 서열(들)의 영향 또는 조종하에 유전자 생성물이 발현되게 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 결합되어 있는 경우이다. 두개의 DNA 단편 (예컨대, 폴리펩티드 코딩 영역 및 이와 관련된 프로모터)은, 프로모터 작용의 유도가 목적하는 유전자 생성물을 엔코딩하는 mRNA의 전사를 초래하고, 두개의 DNA 단편 사이의 연결 특징이 유전자 생성물의 발현을 유도하는 발현 조절 서열의 능력을 간섭하지 않거나 DNA 주쇄가 전사될 능력을 간섭하지 않는 경우, "작동가능하게 결합된" 것이다. 따라서, 프로모터가 핵산의 전사를 수행할 수 있는 경우, 프로모터 영역은 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산과 작동적으로 결합된 것이다. 프로모터는 소정의 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 유도하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외의 다른 전사 조종 엘리먼트 예를 들어, 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 시그널이 폴리누클레오티드에 작동적으로 결합되어 세포-특이적 전사를 유도할 수 있다. 적합한 프로모터 및 기타 전사 조종 영역은 본원에 기술되어 있다.
다양한 전사 조종 영역은 당업자에게 공지되어 있다. 비제한적으로, 척추동물 세포에서 작동하는 전사 조종 영역, 예컨대, 비제한적으로, 사이토메갈로바이러스 (인트로-A와 함께 극초기 프로모터), 시미안 바이러스 40 (초기 프로모터) 및 레트로바이러스 (예컨대, 로우스 사르코마 바이러스 (Rous sarcoma virus))이 포함된다. 기타 전사 조종 영역은 척추동물 유전자로부터 유래된 것 예컨대, 악틴, 열 쇼크 단백질, 보빈 성장 호르몬 및 래빗 β-글로빈, 및 진핵 세포에서 유전자 발현을 조종할 수 있는 그 밖의 서열을 포함한다. 추가적인 적합한 전사 조종 영역은 림포킨 유도성 프로모터 (인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도가능한 프로모터)뿐만 아니라 조직-특이적 프로모터 및 인핸서를 포함한다.
유사하게는, 다양한 번역 조종 엘리먼트가 당업자에게 공지되어 있다. 비제한적으로, 리보좀 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 피코르나바이러스로부터 유래된 엘리먼트 (특히, 내부 리보좀 유입 부위, 또는 IRES, 또는 CITE 서열로서 불림)를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리누클레오티드는 RNA 예를 들어, 메신저 RNA (mRNA) 형태로 존재한다.
본 발명의 폴리누클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 분비성 또는 시그널 펩티드를 엔코딩하는 추가적인 코딩 영역과 결합되며, 이는 본 발명의 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 분비를 유도한다. 신호 가설에 따르면, 일단 조면 소포체를 가로질르는 성장 단백질 사슬의 유출이 개시되면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은 성숙한 단백질로부터 절단되는 시그널 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드가 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 시그널 펩티드를 가지며, 이는 완전 또는 "전장" 폴리펩티드로부터 절단되어 분비되거나 "성숙한" 형태의 폴리펩티드를 생성하는 것으로 인지하고 있다. 특정 구체예에서, 천연 시그널 펩티드 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 시그널 펩티드가 사용되거나, 서열과 작동적으로 결합된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 능력을 보유하는 이러한 서열의 작용성 유도체가 사용된다. 대안적으로, 이종성 포유동물 시그널 펩티드, 또는 이의 작용성 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다아제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "질환" 및 "질병"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "결합 분자"는 주로 항체 및 이의 단편을 나타내나, 비제한적으로, 호르몬, 수용체, 리간드, 주조직복합체 (MHC) 분자, 샤페론 예컨대, 열 쇼크 단백질 (HSP) 및 세포-세포 유착 분자 예컨대, 캐더린 (cadherin), 인테그린, C-타입 렉틴 및 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리의 구성원을 포함하는 네오에피토프에 결합하는 기타 비-항체 분자를 나타낼 수 있다. 따라서, 단지 명확히 하기 위해, 그리고, 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서, 하기 구체예 대부분이 치료제 및 진단제의 개발을 위한 바람직한 결합 분자를 나타내는 항체 및 항체 유사 분자와 관련하여 논의되었다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 상호교환적으로 사용되었다. 항체 또는 면역글로불린은 적어도 중쇄의 가변 도메인을 포함하는 항원-결합 분자이며, 일반적으로, 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 적어도 포함한다. 척추동물계에서 기본적 면역글로불린 구조는 비교적 널리 알려졌다. 예를 들어, 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988] 참조.
하기 더욱 상세히 논의된 바와 같이, 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 광범위한 부류의 폴리펩티드를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론 (γ, μ, α, δ, ε)으로서 분류되며, 이들중 일부는 하위부류 (예를 들어, γ1-γ4)를 갖는다. 이는 각각 IgG, IgM, IgA, IgG 또는 IgE로서 항체의 "부류"를 결정하는 이러한 사슬의 특징이다. 면역글로불린 하위부류 (이소타입) 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등이 특성 결정되었으며, 작용 특이성을 부여하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 부류 및 이소타입 각각의 변형된 버젼은 본 발명의 관점에서 당업자에게 용이하게 분별가능하며, 따라서, 이는 본 발명의 범위내에 있다. 모든 면역글로불린 부류는 본 발명의 범위내에 있으며, 하기 설명은 면역글로불린 분자의 IgG 부류에 관한 것이다. IgG에 있어서, 표준 면역글로불린 분자는 약 23,000 달톤 분자량의 두개의 동일한 경쇄 폴리펩티드, 및 분자량 53,000-70,000의 두개의 동일한 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 4개의 사슬이 전형적으로, "Y" 형상의 이황화 결합에 의해 연합되며, 여기서 경쇄는 "Y"의 마우스 (mouth)에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속되는 중쇄를 브래킷 (bracket)시킨다.
경쇄는 카파 또는 람다 (κ, λ)으로서 분류된다. 각각의 중쇄 부류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합할 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유적으로 결합되며, 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성되는 경우, 두 중쇄의 "테일" 부분은 공유 이황화 결합 또는 비공유 결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 형상의 포크 끝의 N 말단으로부터 각 사슬 바닥의 C-말단으로 이어진다.
경쇄 및 중쇄는 구조적 및 기능적 상동 영역으로 나누어 진다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) 부분 둘 모두의 가변 도메인은 항원 인지성 및 특이성을 결정한다. 역으로, 경쇄 (CL) 및 중쇄 (CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 중요한 생물학적 특성 예컨대, 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등에 기여한다. 이들이 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 더욱 멀리 떨어질 수록 불변 영역 도메인의 넘버링은 약정 (convention)에 따라 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이며, C-말단 부분은 불변 영역이며, CH3 및 CL 도메인은 실질적으로 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다.
상기 나타낸 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 특이적으로 결합하게 한다. 즉, 항체의 VL 도메인과 VH 도메인, 또는 상보성결정 영역 (CDR)의 서브셋은 연합되어 삼차원 항원 결합 부위를 규정하는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4차 항체 구조는 Y의 각 암의 말단에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 더욱 특정하게, 항원 결합 부위는 각각의 VH 및 VL 사슬 상의 3개의 CDR에 의해 규정된다. 항원에 특정하게 결합하기에 충분한 구조를 함유하는 항체 또는 면역글로불린 단편은 본원에서 "항원 결합 단편" 또는 "면역특이적 단편"으로서 상호교환가능하게 나타내어 진다.
자연 발생 항체에서, 각 항원 결합 도메인에 존재하는 6개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체를 수성 환경에서 이의 3차원 형상으로 추정하는 경우 항원 결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 위치하는 아미노산의 짧은 비연속성 서열이다. "프레임워크" 영역으로서 나타낸 항원 결합 도메인의 나머지 아미노산은 낮은 분자간 가변성을 나타낸다. 프레임워크 영역은 주로 β-시이트 형태를 취하며, CDR은 연결되는 루프를 형성하며, 일부 경우에는, β-시이트 구조의 일부를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 사슬간 비공유 상호작용에 의해 정향으로 CDR를 위치시키기 위해 제공되는 스캐폴드 (scaffold)를 형성하도록 작용한다. 정위된 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원상의 에피토프에 상보적인 표면을 규정한다. 이러한 상보적 표면은 항체의 이의 동족 에피토프로의 비공유 결합을 증진시킨다. CDR 및 프레임워크 영역을 각각 포함하는 아미노산은 당업자에 의해 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대해 용이하게 확인될 수 있는데, 이들이 정밀하게 정의되었기 때문이다 (본원에 전체가 참조로서 통합된 문헌 ["Sequences of Proteins of Immunological Interest, "Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); and Chothia and Lesk, J.Mol.Biol., 196:901-917 (1987)] 참조).
당해분야에서 사용되고/거나 허용되는 용어에 대한 두개 이상의 정의가 존재하는 경우, 본원에 사용된 바와 같은 용어의 정의는 달리 명확하게 언급되어 있지 않는 한 모든 이러한 의미를 포함하는 것으로 의도된다. 특정 예로는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두의 가변 영역내에 발견된 비연속성 항원 조합 부위를 기술하기 위한 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR")의 사용이다. 이러한 특정 영역은 본원에 참조로서 통합된 문헌 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) and by Chothia et al., J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987)]에 기술되어 있으며, 여기서, 정의는 서로 비교할 경우 아미노산 잔기의 오버랩핑 또는 서브셋을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR에 대한 정의의 적용은 본원에 규정되고 사용된 바와 같은 용어의 범위내에 포함되는 것으로 의도된다. 상기 참조문헌 각각에 의해 규정된 바와 같은 CDR을 포함하는 적합한 아미노산 잔기는 비교를 위해 하기 표 I에 기술하였다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 변화될 것이다. 당업자는 통상적으로 어떤 잔기가 항체의 가변 영역 아미노산 서열의 주어진 특정 CDR을 포함하는지 결정할 수 있다.
표 1: CDR 규정1
Figure 112009047738293-PCT00001
1표 1의 모든 CDR 규정의 넘버링은 카뱃 (Kabat) 등의 넘버링 약정에 따른 것이다.
카뱃 등은 또한, 임의의 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 규정한다. 당업자는 서열 자체 이외의 임의의 실험 데이타에 의존하지 않고도 이러한 "카뱃 넘버링 (Kabat numbering)" 시스템을 임의의 가변 도메인 서열에 명확하게 지정할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "카뱃 넘버링"은 문헌 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 의해 규정된 넘버링 시스템에 관한 것이다. 달리 명시하지 않는 한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서 특이적 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 기준은 카뱃 넘버링 시스템에 따른다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 면역특이적 단편, 변이체, 또는 유도체는 비제한적으로, 폴리클로날, 모노클로날, 다중특이적, 인간, 인간화된, 영장류화된 또는 키메라 항체, 단일쇄 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fvs, 단일쇄 Fvs (scFv), 단일쇄 항체, 이황화-연결된 Fvs (sdFv), VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 항체에 대한 항-Id 항체 포함)를 포함한다. ScFv 분자는 당해분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, US 특허 5,892,019에 기술되어 있다. 본 발명의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체는 5가 구조를 갖는 IgM 또는 이의 유도체가 아니다. 특히, 본 발명의 특정 구체예에서, 특히 치료 용도에서, IgM은 IgG 및 다른 이가 항체 또는 상응하는 결합 분자에 비해 덜 유용한데, 그 이유는 IgM은 이의 5가 구조 및 친화도 성숙 결핍으로 인해 종종 비특이적 교차-반응성을 보이며, 매우 낮은 친화도를 나타내기 때문이다.
단일쇄 항체를 포함하는 항체 단편은 가변 영역(들)을 단독으로 또는 하기중 전체 또는 일부와 함께 포함할 수 있다: 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인. 또한, 본 발명에는 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 임의 조합을 포함하는 항원-결합 단편이 포함된다. 본 발명의 항체 또는 면역특이적 단편은 조류 및 포유동물을 포함하는 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간, 뮤린, 원숭이, 래빗, 염소, 기니아 피그, 낙타, 야마, 말 또는 닭 항체이다. 또 다른 구체예에서, 가변 영역은 원래 콘드리초이드 (condricthoid)일 수 있다 (예를 들어, 상어로부터의). 본원에 사용된 바와 같은 "인간" 항체는 하기 기술되고 U.S. 특허 5,939,598 (Kucherlapatie et al.)에 기술된 바와 같이, 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하며, 인간 환자, 인간 면역글로불린 라이브러리 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대한 동물 유전자 이식체로부터 분리되며, 내생성 면역글로불린을 발현하지 않는 항체를 포함한다. 인간 항체는 예를 들어, 결합 특성을 개선하기 위해 항체에서 아미노산 치환이 일어났다 하더라도 여전히 "인간" 항체이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "중쇄부"는 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄부를 포함하는 폴리펩티드는 하기중 하나 이상을 포함한다: CH1 도메인, 힌지 (예를 들어, 상위, 중위 및/도는 하위 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 결합 폴리펩티드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 또한, 본 발명에 사용하기 위한 결합 폴리펩티드는 CH2 도메인의 적어도 일부가 결여될 수 있다 (예를 들어, CH2 도메인의 전부 또는 일부). 상기 기술된 바와 같이, 이들 도메인 (예를 들어, 중쇄부)이 천연 발생 면역글로불린 분자와 아미노산 서열이 상이하도록 변형될 수 있음이 당업자에게는 자명할 것이다.
본원에 기술된 특정 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에서, 멀티머중 하나의 폴리펩티드 사슬의 중쇄부는 멀티머의 제 2 폴리펩티드 사슬의 중쇄부와 동일하다. 대안적으로, 본 발명의 중쇄부-함유 단량체들은 동일하지 않다. 예를 들어, 각 단량체는 예를 들어, 이특이적 (bispecific) 항체를 형성하는 상이한 표적 결합 부위를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 결합 폴리펩티드의 중쇄부는 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 중쇄부는 IgG1 분자로부터 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄부는 부분적으로는 IgG1 분자 및 부분적으로는 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄부는 부분적으로는 IgG1 분자 및 부분적으로는 IgG4 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "경쇄부"는 면역글로불린 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 경쇄부는 VL 또는 CL 도메인중 하나 이상을 포함한다.
항체에 대한 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프의 최소 크기는 약 4 내지 5개 아미노산인 것으로 여겨진다. 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 바람직하게는, 적어도 7개, 더욱 바람직하게는, 적어도 9개, 가장 바람직하게는, 적어도 약 15 내지 약 30개 아미노산을 함유한다. CDR이 3차 형태의 항원 펩티드 또는 폴리펩티드를 인식할 수 있기 때문에, 에피토프를 포함하는 아미노산은 연속성일 필요가 없으며, 일부 경우에, 동일한 펩티드 사슬에 존재하지 않을 수도 있다. 본 발명에서, 본 발명의 항체에 의해 인식되는 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 Aβ의 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 더욱 바람직하게는, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개 또는 약 15개 내지 약 30개의 연속 또는 비연속 아미노산 서열을 함유한다.
본 발명에 따른 용어 "네오에피토프"는 질환 패턴에 따라 독특하고, 건강한 생리 상태로부터 벗어나고/거나 기타 비병리적 단백질로부터의 병리학적 변이체인 질환-관련 단백질에 함유되거나 이에 의해 형성되는 에피토프이다. 상기 병태생리학적 변이체는 병리학적으로 변화된 전사, 병리학적으로 변화된 번역, 번역후 변형, 병리학적으로 변화된 단백질분해 과정, 변화된 코로컬리제이션 (co-localization)에 있어서 생리학적 또는 병태생리학적 상호작용 파트너 또는 세포 구조물과의 병리학적으로 변화된 착물, 또는 병리학적으로 변화된 구조 형태 - 예컨대, 응집, 올리고머화 또는 피브릴화 - 이들의 3차원 또는 4차원 구조는 생리학적 활성 분자의 구조와 상이함 - 에 의해 형성될 수 있다. 게다가, 병태생리학적 변이체는 또한, 이의 일반적인 생리학적 환경 또는 세포이하 구획에 위치하지 않음을 특징으로 할 수 있다. 예로서, 네오에피토프는 작용성 손상을 분명히 입은 또는 이미 입었던 뇌 조직의 영역에서 병리학적으로 특징적인 구조에 위치할 수 있다. 주어지 구조물 예를 들어, 세포 또는 조직, 또는 단백질이 네오에피토프를 나타내는지의 여부는 질환 관련 단백질 특이적 결합 분자를 분리하고 특성 결정하기 위한 하기 기술된 방법을 역으로 함으로써 입증될 수 있는데, 결합 분자 예를 들어, 상기 방법에 의해 확인된 항체는 항체에 결합하기 위한 샘플을 스크리닝하는데 사용되며, 따라서, 네오에피토프의 존재를 결정하기 때문이다.
문구 "질환 관련된 단백질 특이적" 및 "네오에피토프 특이적"은 본원에서 "네오에피토프를 특이적으로 인식하는"과 상호교환적으로 사용된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 예컨대, "교차-반응성의 부재", "특이적", "특이적으로 인지하는", "특이적으로 결합하는", "우선적으로 결합하는" 등은 질환 관련된 단백질의 네오에피토프와 이의 야생형 및 자연 환경에서의 천연 단백질 사이를 구별하는 결합 분자의 능력을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 결합 분자는 적어도 2, 바람직하게는, 적어도 5, 일반적으로, 10의 인수 초과, 특히, 바람직하게는, 50 인수, 및 더욱 바람직하게는, 100 초과의 인수로 천연 단백질 항원에 비해 네오에피토프로의 우선적인 결합 친화도를 갖는다. 또한, 특이적 표적 에피토프 예를 들어, 네오에피토프에 대한 결합 분자 예를 들어, 항체의 상대 KD는 질환 관련 단백질의 천연 대응물 또는 기타 리간드로의 항체의 결합에 대한 KD 보다, 바람직하게는, 적어도 10배, 더욱 바람직하게는, 적어도 100배 넘게 더 적다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 "특이적으로 결합하는", 또는 "특이적으로 인식하는"에서, 이는 일반적으로 결합 분자 예를 들어, 항체가 이의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하며, 결합이 항원 결합 도메인과 에피토프 사이의 일부 상보성을 필요로 함을 의미한다. 이러한 정의에 따르면, 항체가 이의 항원 결합 도메인을 통해 무작위의 비관련된 에피토프로 결합하는 것보다 더욱 용이하게 에피토프에 결합하는 경우, 항체는 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 한다. 용어 "특이성"은 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적 친화도를 정성화하는데 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 항체 "B" 보다 주어진 에피토프에 대한 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있거나, 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"에서 보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
"우선적으로 결합하는"에 있어서, 이는 결합 분자 예를 들어, 항체가 관련된 유사한 상동의 또는 상사한 에피토프에 결합하는 것 보다 더욱 용이하게 에피토프에 결합함을 의미한다. 따라서, 주어진 에피토프에 "우선적으로 결합하는" 항체는 이러한 항체가 관련된 에피토프와 교차반응할 수 있음에도 불구하고 관련된 에피토프 보다 주어진 에피토프에 더 잘 결합할 것이다.
비제한적 예로서, 결합 분자 예를 들어, 항체가 제 2 에피토프에 대한 항체의 해리상수 (KD) 보다 낮은 KD로 제 1 에피토프에 결합하는 경우, 항체가 제 1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적 예에서, 항체가 제 2 에피토프에 대한 항체의 KD 보다 1 이상 낮은 정도의 친화도로 제 1 에피토프에 결합하는 경우, 항체는 제 1 항원에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적 예에서, 항체가 제 2 에피토프에 대한 항체의 KD 보다 2 이상 낮은 정도의 친화도로 제 1 에피토프에 결합하는 경우, 항체는 제 1 항원에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
또 다른 비제한적 예에서, 결합 분자 예를 들어, 항체가 제 2 에피토프에 대한 항체의 오프율 (k(off)) 보다 낮은 오프율로 제 1 에피토프에 결합하는 경우, 항체는 제 1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적 예에서, 항체가 제 2 에피토프에 대해 항체의 k(off) 보다 1 이상 낮은 정도의 친화도로 제 1 에피토프에 결합하는 경우 제 1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적 예에서, 항체가 제 2 에피토프에 대해 항체의 k(off) 보다 2 이상 낮은 정도의 친화도로 제 1 에피토프에 결합하는 경우 제 1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
결합 분자 예를 들어, 본원에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 5 X 10-2 sec-1, 10-2 sec-1, 5 X 10-3 sec-1 또는 10-3 sec-1 이하의 오프율 (k(off))로 본원에 기술된 표적 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 항체는 5 X 10-4 sec-1, 10-4 sec-1, 5 X 10-5 sec-1, 또는 10-5 sec-1 5 X 10-6 sec-1, 10-6 sec-1, 5 X 10-7 sec-1 또는 10-7 sec-1 이하의 오프율 (k(off))로 본원에 기술된 표적 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합할 수 있다.
결합 분자, 예를 들어, 본원에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 103 M-1 sec-1, 5 X 103 M-1 sec-1, 104 M-1 sec-1 또는 5 X 104 M-1 sec-1 이상의 온율 (k(on))로 본원에 기술된 표적 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 항체는 105 M-1 sec-1, 5 X 105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec-1, 또는 5 X 106 M-1 sec-1 또는 107 M-1 sec-1 이상의 온율 (k(on))로 본원에 기술된 표적 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합한다고 할 수 있다.
결합 분자 예를 들어, 항체가 기준 항체의 에피토프로의 결합을 어느 정도 차단하는 범위로 에피토프에 우선적으로 결합하는 경우, 주어진 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 억제한다고 한다. 경쟁 억제는 예를 들어, 경쟁 ELISA 검정과 같은 당해분야의 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 항체는 주어진 에피토프로의 기준 항체의 결합을 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 또는 50% 이상으로 경쟁적으로 차단한다고 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "친화도"는 결합 분자 예를 들어, 면역글로불린 분자의 CDR과 개별 에피토프의 결합 강도의 측정치를 나타낸다. 예를 들어, 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) at pages 27-28] 참조. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "결합활성 (avidity)"은 면역글로불린 집단과 항원간의 착물의 전반적인 안정도를 나타내는 것으로서, 면역글로불린 혼합물과 항원의 작용성 조합 강도를 나타낸다. 예를 들어, 문헌 [Harlow at pages 29-34] 참조. 결합활성은 군집형태의 개별 면역글로불린 분자와 특이적 에피토프와의 친화도 및 또한, 면역글로불린과 항원의 결합가에 관한 것이다. 예를 들어, 이가 모노클로날 항체와 고도의 반복 에피토프 구조를 갖는 항원 예컨대, 중합체 사이의 상호작용은 높은 결합활성 중 하나일 것이다.
결합 분자 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 이들의 교차-반응성에 대해 기술되거나 특정화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "교차-반응성"은 하나의 항원에 특이적인 항체의 제 2 항원과의 반응 능력을 나타내며; 두개의 상이한 항원 물질간의 관련성의 측정치이다. 따라서, 항체는 이의 형성을 유도하는 것 이외의 에피토프에 결합하는 경우 교차 반응성이 있다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로 유도성 에피토프와 많은 동일한 상보적인 구조적 특징을 함유하며, 일부 경우에는 원래의 에피토프 보다 실질적으로 더욱 잘 맞을 수 있다.
예를 들어, 특정 항체는 관련되나 동일하지 않은 에피토프 예를 들어, 기준 에피토프와 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상, 55% 이상 및 50% 이상의 동일성 (당해분야에 공지되고 본원에 기술된 방법을 이용하여 계산)을 갖는 에피토프에 결합한다는 점에 있어서 어느 정도의 교차 반응성을 갖는다고 할 수 있다. 항체는 이들이 기준 에피토프와 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 및 50% 미만의 동일성 (당해분야에 공지되고 본원에 기술된 방법을 이용하여 계산)을 갖는 에피토프에 결합하지 않을 경우 교차-반응성이 없거나 거의 없다고 할 수 있다. 항체는 특정 에피토프의 또 다른 유사체, 오솔로그 (ortholog) 또는 상동체에 결합하지 않는 경우 이러한 에피토프에 대해 "고도로 특이적"인 것으로 간주될 수 있다.
결합 분자 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 이들의 결합 친화도에 대해 기술되고 특정화될 수 있다. 바람직한 결합 친화도는 5 x 10-2M, 10-2M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8M, 10-8M, 5 x 10-9 M, 10-9M, 5 x 10-10M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12M, 10-12M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, 또는 10-15 M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 갖는 것을 포함한다.
이전에 나타낸 바와 같이, 다양한 면역글로불린 부류의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 널리 공지되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하며, 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 제 1 (대부분 아미노 말단) 불변 영역을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하고, 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대한 아미노 말단이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "CH2 도메인"은 통상적인 넘버링 기법을 이용하여 항체의 잔기 약 244번 내지 360번의 중쇄 분자의 일부를 포함한다 (잔기 244번 내지 360번, 카뱃 넘버링 시스템; 및 잔기 231-340, EU 넘버링 시스템; (Kabat EA et al. op.cit) 참조). CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특히다. 그 보다는, 두개의 N-연결된 분지된 탄수화물 사슬이 고유의 천연 IgG 분자의 두개의 CH2 도메인 사이를 중재한다. 또한, CH3 도메인은 CH2 도메인에서 IgG 분자의 C-말단으로 연장되어 있으며, 약 108개 잔기를 포함한다는 것은 널리 입증되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 결합시키는 중쇄 분자의 일부를 포함한다. 이러한 힌지 영역은 약 25개 잔기를 포함하며, 유연성이 있으며, 따라서, 두개의 N-말단 항원 결합 영역이 독립적으로 이동할 수 있게 한다. 힌지 영역은 3개의 별개의 도메인으로 다시 나누어질 수 있다: 상위, 중위 및 하위 힌지 도메인 (Roux et ah, J. Immunol. 161:4083 (1998)).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "이황화 결합"은 두개의 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 이황화 결합을 형성할 수 있거나 두개의 티올 기를 브릿지 (bridge)할 수 있는 티올 기를 포함한다. 대부분의 천연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 이황화 결합에 의해 연결되고, 2개의 중쇄는 카뱃 넘버링 시스템을 이용하여 239번 및 242번 (EU 넘버링 시스템을 이용한 경우, 226번 또는 229번)에 상응하는 위치에서 두개의 이황화 결합에 의해 연결된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조작된 항체"는 중쇄 및 경쇄 또는 이 둘 모두에서 가변 도메인이 공지된 특이성의 항체로부터 하나 이상의 CDR을 적어도 부분적 대체시킴으로써 그리고, 필요에 따라, 부분적인 프레임워크 영역 대체 및 서열 변화에 의해 변화된 항체를 나타낸다. CDR이 프레임워크 영역이 유래되는 항체와 동일한 부류 또는 심지어 하위부류의 항체로부터 유래될 수 있는 경우, CDR은 상이한 부류의 항체 및 바람직하게는, 상이한 종의 항체로부터 유래될 것으로 예견된다. 공지된 특이성의 비인간 항체로부터의 하나 이상의 "도너" CDR이 인간 중쇄 또는 경쇄 프레임워크 영역으로 이식된 조작된 항체는 본원에서 "인간화된 항체"를 나타낸다. 하나의 가변 도메인의 항원 결합 능력을 다른 도메인에 전달하기 위해 반드시 모든 CDR을 도너 가변 영역으로부터의 완전 CDR로 대체할 필요는 없다. 그보다는, 표적 결합 부위의 활성을 유지하는데 필요한 잔기만 전달하면 된다. 예를 들어, U.S. 특허 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762 및 6,180,370의 설명에 따르면, 이는 일정한 실험을 수행함으로써 또는 작용 조작된 또는 인간화된 항체를 수득하기 위한 시험 또는 에러 테스트에 의해 당업자가 수행할 수 있을 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "적당하게 폴딩된 폴리펩티드"는 폴리펩티드를 포함하는 모든 작용성 도메인이 명확하게 활성인 폴리펩티드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "부적당하게 폴딩된 폴리펩티드"는 폴리펩티드의 작용성 도메인중 하나 이상이 불활성인 폴리펩티드를 포함한다. 일 구체예에서, 적당하게 폴딩된 폴리펩티드는 하나 이상의 이황화 결합에 의해 연결된 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 역으로 부적당하게 폴딩된 폴리펩티드는 하나 이상의 이황화 결합에 의해 연결되지 않은 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조작된"은 합성 수단에 의한 핵산 또는 폴리펩티드 분자의 조작을 포함한다 (예를 들어, 재조합 기법에 의해, 실험관내 펩티드 합성에 의해, 펩티드의 효소적 또는 화학적 결합에 의해, 또는 이들 기법의 일부 조합에 의해).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 화학적 컨쥬게이션 또는 재조합 수단을 포함하는 어떤 수단에 의해서 두개 이상의 엘리먼트 또는 성분이 함께 연합됨을 의미한다. "인-프레임 융합"은 원래의 ORF의 정확한 번역 리딩 프레임을 유지하는 방식으로 연속성의 더 긴 ORF을 형성하도록 두개 이상의 폴리누클레오티드 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 연결을 나타낸다. 따라서, 재조합 융합 단백질은 원래의 ORF에 의해 엔코딩된 폴리펩티드에 상응하는 2개 이상의 세그먼트를 함유하는 단일 단백질이다 (이들 세그먼트들은 자연적으로는 이렇게 정상적으로 연합되지 않는다). 리딩 프레임이 융합된 세그먼트를 통해 연속적으로 제조되었지만, 세그먼트들은 예를 들어, 인-프레임 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 가변 영역의 CDR을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 인-프레임 융합될 수 있으나, "융합된" CDR이 연속 폴리펩티드의 일부로서 공동-번역되는 한 하나 이상의 면역글로불린 프레임워크 영역 또는 추가적인 CDR 영역을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 의해 분리된다.
폴리펩티드에 있어서, "선형의 서열" 또는 "서열"은 아미노 내지 카르복실 말단 방향의 폴리펩티드의 아미노산 순서이며, 여기서 서열에서 서로 이웃하는 잔기가 폴리펩티드의 주요 구조에서 연속된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현"은 유전자가 생화학물 예를 들어, RNA 또는 폴리펩티드를 생성하는 과정을 의미한다. 이러한 과정은 비제한적으로, 유전자 넉다운 및 일시적 발현 및 안정적 발현을 포함하는 세포내 유전자의 작용성 존재의 표시를 포함한다. 이는 비제한적으로, 유전자의 메신저 RNA (mRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA) 또는 기타 RNA 생성물, 및 이러한 mRNA의 폴리펩티드(들)로의 번역을 포함한다. 최종 요구되는 생성물이 생화학물인 경우, 발현은 이러한 생화학물 및 임의의 전구체의 생성을 포함한다. 유전자의 발현은 "유전자 생성물"을 생성시킨다. 본원에 사용된 바와 같은 유전자 생성물은 핵산 예를 들어, 유전자 전사에 의해 생성된 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 기술된 유전자 생성물은 추가로 예를 들어, 폴리아데닐화와 같은 전사후 변형된 핵산, 또는 예를 들어, 메틸화, 글리코실화, 지질 첨가, 기타 단백질 서브유닛과의 결합, 단백질 분해 절단 등과 같은 번역후 변형된 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 둘 모두 치료학적 처치 및 예방학적 또는 예방적 측정에 대한 것이며, 여기서 목적은 원하지 않는 생리학적 변화 또는 질환 예컨대, 암의 발달 또는 전이를 예방하거나 저하 (감소)시키는 것이다. 유리하거나 목적하는 임상 결과는 비제한적으로, 검출가능한지의 여부에 상관없이 증상의 완화, 질환 정도의 저하, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않은) 상태, 질환 진행의 지연 또는 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 (부분적이든 전체적이든)을 포함한다. "치료"는 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존 기간과 비교하여 연장된 생존 기간을 갖는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상은 병태 또는 질환을 갖고 있는 대상 및 병태 또는 질환에 걸리기 쉬운 대상 또는 병태 또는 질환의 표시가 억제된 대상을 포함한다.
"피검체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후, 예방 또는 치료가 요망되는 피검체, 특히 포유동물 피검체, 예를 들어, 인간 환자를 의미한다.
II. 결합 분자를 확인하는 방법
본 발명은 임상적으로 미리 선택된 인간 피검체로부터 치료학적으로 유효한 항체를 발견하기 위한 수단 및 방법에 관한 것이다. 실시예에 입증된 바와 같이, 인간 뇌질환에서 비정상 구조물에 대한 인간 항체는 표현형적으로 건강하거나 임상적으로 특이적으로 안정한 환자로부터 분리될 수 있으며, 상응하는 재조합 항체는 실질적인 부작용 없이 뇌 작용의 결함을 치료, 병태의 완화 및 예방하는데 성공적으로 사용될 수 있다. 질환의 임상적 안정성 또는 비진행성은 예를 들어, 시간에 따른 임상적 예를 들어, 인지, 상태 (예를 들어, 신경심리 시험에 의한)의 측정; 전체적인 기능 수준 평가, 일일 생활 능력 또는 행동 결손의 평가; 뇌 구조의 부피 분석; 뇌에서 비정상 단백질의 병리학적 퇴척물 (예를 들어, PET 베타-아밀로이드 이미징) 또는 체액에서 생화학적 변화가능한 물질 (예를 들어, 타우 단백질, 또는 Abeta 펩티드)의 생체내 측정; 및 질환의 자연적 경과/히스토리에 대한 비교에 의해 확인될 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 천연 내인단백질로부터 유래되며, 변이체 형태 예를 들어, 병리학적 단백질 및/또는 이의 정상적 생리학적 상황을 벗어난 단백질로서 환자 체내에 분포되어 있는 질환-관련 단백질의 네오에피토프를 인식할 수 있는 항체 및 결합 분자를 제공한다. 특히, 항체 및 이의 항원-결합 단편이 제공되며, 이는 실시예에 예시된 항체에 대해 개략된 바와 같은 면역학적 결합 특징 및/또는 생물학적 특성을 입증한다. 존재하는 경우, 용어 "면역학적 결합 특징" 또는 항체의 항원과의 다른 결합 특징은 (이의 모든 문법적 형태에서) 항체의 특이성, 친화도, 교차-반응성, 및 기타 결합 특징을 나타낸다. 자연적으로 본 발명은 항체 생성 세포주 및 재조합 세포에 까지 확대된다. 본 발명은 추가로, 본 발명의 결합 분자를 포함하는 진단 분석 및 키트, 및 치료학적 방법 및 이에 기초한 치료학적 평가에 관한 것이다.
본 발명은, 체액성 방어와 관련된는 것으로서 노화로 인해 알츠하이머병과 같은 신경학적 질환에 걸릴 위험성이 있는, 특이적 임상 기준에 따라 미리 선택된 인간 피검체 및 환자에서, 내생성 병태생리적 변이체 예컨대, Abeta 펩티드 응집물, 신경원섬유, 이영양성 신경돌기 및 추가의 세포 구조물에 대한 항체가 또한 발견될 수 있으며, 이는 질환에 대한 신경병리학적 특징을 나타낸다. 이러한 구조물은 단독으로 또는 다른 병리학적 구조물과 함게 발견될 수 있으며, Abeta 응집물 및 신경원섬유의 전구체의 경우, 병리학적 효과를 나타낼 수 있다. 그러나, 상기 구조물을 특정하게 인식하는 이들 항체는 공지된 경우의 자가면역 반응과 달리, 병리학적 구조물에 기초한 단백질의 정상적인 생리학적 작용 형태와 현저하게 낮은 교차-반응성을 나타내거나 나타내지 않는다.
이론에 제한되지 않으면서, 본 발명에 따라 수행된 실험에 기초하여, 특이적 B 세포 또는 B 메모리 세포의 생성 또는 활성화와 같은 체액성 면역계의 실험적으로 측정가능한 활성을 유도하기 위해서, 감염의 경우에서와 같이 질환이 명백하고 표현형적으로 감지되어야 할 필요는 없는 것으로 여겨진다. 생리학적으로 처리되어야 하는 종양 세포 또는 분화된 세포의 경우, 아폽토시스 유도에서 세포성 면역계의 파트너 예컨대, T4 헬퍼 세포 및 세포독성 T 세포 및 천연 킬러 세포가 협력한다는 메카니즘은 이미 공지되어 있다. 건강한 인간에서, 종양 세포 또는 이의 전구체는 변이에 의해 매일 형성되는 것으로 추정해야 한다. 그러나, 체액성 및 세포성 메카니즘에 의해 즉시 아폽토시스로 처리되어, 종양이 검출되지 않는 것이다. 이러한 견지에서, "건강한, 또는 임상적으로 특이적으로 안정한 환자"는 질환을 앓지 않는 개체를 의미하는 것으로 이해되어서는 안되며, 다양한 질환이 표현형적으로 나타나기 전에 메카니즘을 차단하거나 방어함으로써 제어되는 개체를 나타낸다.
상기 견지에서, 표적 구조 에피토프 예를 들어, 네오에피토프의 분자적 특성의 사전 인지 없이, 특이적 환자 집단 또는 건강한 피검체로부터 항체 또는 항체-생성 세포를 확인하는 것이 가능한 것으로 본 발명에 따라 가정할 수 있으며, 여기서, 항체는 도너 유기체중의 내성을 이미 극복한 경우에 - 이는 예를 들어, 자가면역성의 부재에 의해 입증됨 - 재조합적으로 생성된 제제 형태로 질환에 대해 성공적으로 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 항체의 확인은 표적 구조의 분자 에피토프를 사전 인지하지 않은 상태에서 수행될 수 있으며, 단 각각의 질환의 동물 모델 또는 인간 환자로부터 유래된 임상-병리학적으로 잘 특징화된 조직 절편에서 병리학적으로 특징적인 구조의 네오에피토프로의 결합에 의해서만 수행될 수 있다.
따라서, 제 1 양태에서, 본 발명은 질환 관련 단백질 특이적 결합 분자를 분리하는 방법으로서,
(a) 증상이 없거나 임상적으로 특이적으로 안정하나, 질환에 걸렸거나 질환에 걸릴 위험성이 있거나 질환의 표시 또는 분출을 효과적으로 억제하는 환자로부터 수득된 샘플을 소정의 임상 특징의 병리학적 또는 생리학적 변화된 세포 또는 조직의 시편으로 처리하고;
(b) 상기 시편에 우선적으로 결합하며, 건강한 피검체로부터 유래될 수 있는 것과 같은 이러한 병리학적 특징이 없는 상응하는 세포 또는 조직에 대해 현저하게 낮은 친화도를 갖거나 없는 결합 분자를 확인하고 선택적으로 분리하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 당업자에게 널리 공지된 수단으로 실시예에서 요약된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, 환자로부터 수득된 액체 샘플은 오브젝 홀더 (object holder)에 견고하게 고정된 시편 표적 구조물과 접촉되는 도관의 제 1 구멍을 통해 흐르게 하여, 가용성 형태로 또는 세포 표면 및 막에 각각 발현된 샘플중에 존재한 추정 결합 분자가 상기 표적 구조물에 결합되게 할 수 있다. 액체 샘플은 예를 들어, 림프구 및/또는 항체를 함유할 수 있는 반면, 시편은 병리학적 표적 구조에 대해 별개의 분자 또는 분자 조합물로 코팅되는 조직 절편 또는 막일 수 있다.
비결합 물질은 제 2 도관 구멍을 통해 제거될 수 있다. 동시에, 오브젝 홀더의 온도는 오브젝 홀더 온도조절장치에 의해 예를 들어, 추정 결합 분자의 시편에 대해 특이적 항원의 네오에피토프로의 자연적 결합이 체내에서 발생하는 온도로 조정될 수 있다. 유동 운동에 의해, 예를 들어, 표적 구조물 위로 바람직하게는, 체온의 결합 분자를 함유하는 액체 샘플을 통과시킴으로써, 결합 상호작용의 천연 시스템이 모방될 수 있다. 그러나, 예컨대, 쉐이커 또는 회전 테이블에 의해 샘플과 시편을 인큐베이션하는 다른 방법이 또한 사용될 수 있다. 상기 언급된 시스템의 특정 이점은 오브젝 홀더 온도조절장치에 의해 오브젝 홀더의 온도를 저하시킴으로써 임의의 시점에서 대사 공정을 중지시킬 수 있다는 것이다. 이렇게 함으로써, 오브젝 홀더의 온도는 예를 들어, 2-10℃, 특히, 4℃로 저하될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 상응하는 장치는 유럽 특허 출원 EP 1 069 431 A2에 기술되어 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 결합 파트너의 확인 및 특성 결정을 가능하게 할 것이며, 동시에, 결합 과정에 요구되는 분자 부류, 분자 군 및/또는 분자 파트, 즉 지금가지 알려지 않은 시편의 표적 구조를 확인하고 특성 결정할 수 있게 할 것이다. 이는 진단에 대한 새로운 가능한 방법을 제시할 뿐만 아니라, 또한, 분자 수준에서의 치료학적 방법에 대한 새로운 시험 시스템을 제공할 것이다.
특이적 대리 마커가, 놀랍게도, 가능하게는 특이적 내인성 면역 반응으로 인해 임상적으로 표출되지 않는 높은 질환 상태 가능성을 예측하는 경우, 건강한 지원자의 풀도 본 발명에 따라 환자로서 구분될 수 있다. 이러한 견지에서, 다양한 질환과 관련하여, 건강한 고령자는, 신경퇴행성 질환 예컨대, 알츠하이머병 또는 파킨슨병이 아직 임상적으로 나타나지는 않았으나, 상기 언급된 견지에서, 면역계의 세포성 성분과 관련되거나 무관한 체액성 면역계의 초기 중재에 의해 병태생리학적 단백질 변이체 즉, 질환 관련 단백질의 전임상 진행단계가 제한되거나 지연된 개체로서, 건강하나 비 전임상 환자 (not preclinical patient)가 연구에 참여한 경우, 질환의 임상적 징후가 발생하지 않을 때까지의 범위로 제한되거나 지연된 개체일 것이다. 바람직하게는, 자가면역 과정이 진단되지 않거나 기타 가능한 병리학적 병태가 부작용으로서 발생하지 않은 비특징적인 지원자가 제 1 예에서 샘플에 대한 도너로서 모집된다.
원래, 환자로부터의 샘플이 사용될 수 있으며, 이러한 환자는 생리학적 단백질 또는 펩티드의 변이체로 활성 면역화 처리되었으며, 항체 발생이 면역화에 의해 부스팅되었다. 예를 들어, 항체는 Abeta 펩티드로 백신화된 알츠하이머병의 환자로부터 확인되고 분리될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 사용된 문헌 [Hock et al., Nature Medicine 8:1280-1275 (2002), Hock et al., Neuron 38:547-554(2003), and WO 2004/095031] 참조. 그러나, 다양한 병리학적 단백질이 관련되거나 초래되는 질환에 대한 이러한 면역화 또는 상응하는 약물 치료를 받지 않은 지원자로부터의 샘플을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따르면, 환자 예를 들어, 임상적으로 사전 선택된 개체의 샘플을 예를 들어, 임상-병리학적으로 특성결정된 인간 환자 또는 동물 모델 등 예를 들어, 유전자 이식 마우스로부터의 생체외 조직, 또는 실험관내 세포 구조물, 또는 병리학적 동종이계 또는 이종 조직에서 병리학적으로 특징적인 구조물의 시편을 특이적으로 인식하는 결합 분자의 존재에 대해 분석된다. 바람직하게는, 이러한 시편을 제공하는 상기 환자 및/또는 상기 피검체는 인간이며, 가장 바람직하게는, 둘 모두 인간이다.
특징적인 병리학적 또는 생리학적 변화된 샘플, 세포 또는 조직 시편은 바람직하게는, 결합 분자 예를 들어, 본 발명의 항체와의 반응 후 광학 검출에 의해 디스플레이된다. 시편은 세포 샘플, 조직 절편, 세포 도말 시험, 인간 질환의 동물 모델의 세포 또는 조직 샘플 또는 실험관내 배양된 세포 및 조직 물질로서/로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 상기 시편중 하나 이상은 스캔 위치의 형태로 오브젝 홀더에 존재하며, 여기서 각 스캔 위치는 특이적 병리학적 구조에 상응하며, 동시에 스캔 위치중 2개 이상은 항체와의 반응이 검출되도록 노출된다. 예로서, 이러한 신경퇴행성 질환 예컨대, 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 타우병증 (tauopathy)의 신경병리학적 특징에 대한 항체 - 베타-아밀로이드 플라그, 루이소체, 신경원섬유 및 이영양성 신경돌기 포함 - 는 각각의 질환의 임상-병리학적 확인된 진단을 갖는 인간 사후 뇌조직으로부터 수득된 절편에서 검출될 수 있다. 이는 파라핀 함침된 조직의 작은 로드 (rod)를 글라스 슬라이드상에 탑재시킨 후, 환자 또는 건강한 도너의 샘플로 프로빙시킴으로써 수행된다. 항체와의 반응 검출은 면역조직화학법 및 현미경 스캐닝의 표준 과정에 따라 수행된다.
다양한 인간 질환 조직을 함유하는 다수의 조직 마이크로절편이 글라스 슬라이드상에 소집되어 다중 조직 마이크로어레이를 형성할 수 있다. 유사하게는, 인간 질환의 동물 모델의 조직 샘플, 세포 도말 또는 세포로부터의 추가적인 시편을 파라핀에 함침시키고, 단독으로 또는 상기 설명된 인간 사후 알츠하이머병 뇌조직 또는 조직 어레이와 함께 글라스 슬라이드상에 탑재시킬 수 있다. 이와 같이, 글라스 슬라이드상의 단일 시험 위치는 조직 및 병리학적으로 특징적인 구조를 나타내는 다른 시편과의 의 혼합된 어레이를 포함할 수 있다.
분석 처리량을 증가시키기 위해, 하나 초과의 시험 위치가 글라스 슬라이드상에 탑재된다. 바람직하게는, 8개의 시험 위치가 96 웰에 피팅되는 2 x 4 포맷 또는 미세역가 포맷으로 글라스 슬라이드상에 탑재된다. 이러한 미세역가-양립성 조직 마이크로어레이의 더욱 상세한 설명은 하기 보충 방법 섹션에서 찾아볼 수 있다.
언급된 바와 같이, 분석할 샘플은 체액, 세포 샘플 또는 세포 샘플 또는 이의 유도체의 상청액을 포함할 수 있다. 체액 예컨대, 요추 뇌 척수액 (CSF), 혈장 또는 소변이 환자의 동의하에 표준 임상 과정에 따라 수집될 수 있다. 가장 바람직하게는, 샘플은 B-세포 또는 메모리 B-세포를 포함하거나 이들로부터 유래되고/거나 항체를 포함한다.
바람직하게는, 상기 환자는 대리 마커의 존재 또는 부재에 의해 또는 일반적으로 안정한 질환 과정에 의해 아직 명백하지 않은 질환에 걸렸거나 발병 위험성이 있는 것으로 결정될 수 있다. 임상 기준은 임상전 상태의 견지에서 본 발명에 따른 질환의 발생 또는 표출의 증가된 가능성을 갖거나, 반대로, 이미 발생했던 이러한 질환이 발생하지 않을 가능성을 입증하는 대리 마커와 관련되어 고려되어야 하며, 예를 들어, 질환을 조장하는 유전자 배열이 존재하거나 과도한 폭로 (exposition) 또는 생활 방식은 가능한 질환의 표현형 발생을 나타나게 한다. 알츠하이머병의 경우, 이는 본 발명에 따라, 이러한 인간 지원자는 신경병리-관련된 단백질 착물 예컨대, Abeta 응집물, 올리고머 Abeta 종 및 베타-아밀로이드 플라그중의 베타-아밀로이드 피브릴에 대한 B 세포 또는 메모리 B 세포, 신경원섬유에서 타우 필라멘트, 루이소체 또는 연령과 관련하여, 알츠하이머병이 특히 많이 퍼져있거나 알츠하이머병에 걸릴 위험성을 갖는 군집으로부터 유전적으로 비롯된 개체의 군에 속하는 지금까지 분자적으로는 확인되지 않은 성분중의 알파 시누클레인 (synuclein)에 대해 조사된다. 예를 들어, 신경생리학적으로 측정가능한 인지 장애를 갖지 않거나 단지 약간의 장애를 나타내는 75세 초과의 고령자가 있으며, 또는 종양 표시의 경우, 고도의 표시성 종양 마커 예를 들어, 유전자 종양 마커를 가지나, 질환으로부터 고통받지 않는 인간들이 있다 (Alloul et al., Arch. Gerontology Geriatrics 27 (1998), 189; Dunn et al., Immunity 21 (2004) 137-148). 경증 인지 장애의 경우, 임상적으로 분명하고, 추가의 과정에서 진행성인 신경퇴행성 질환의 발병에 대한 20% 초과의 평균 통계학적 위험치를 가짐에도 불구하고, 수년동안 임상적으로, 신경병리학적으로 또는 인지에 있어서 안정한 환자들이 있다. 일 구체예에서, 상기 대리 마커는 높은 연령, 뇌 아밀로이드 부하, ApoE 유전자형, APP 유전자형, PS1 유전자형, 체액내 Abeta 펩티드 수준, 이소프로스탄, 타우 및 포스포-타우로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 방법을 이용하는데 있어서 특정 방법은 전체으로 상이한 또는 관련된 일차 질환의 병리학적으로 특징적인 조직의 시편 어레이에 대한 임상적으로 미리 선택적 지원자로부터의 B 세포 및 B 메모리 세포의 샘플을 시험하는 것이다. 특히, 이러한 병리학적 조직은 신경퇴행성 질환, 단백질-미스폴딩 질환, 조직 아밀로이드 및 병리학적 침착과 관련된 기타 질환, 자가면역 질환, 염증 질환, 이상증식성 및 신생물 질환 예를 들어, 종양, 축적병 및 봉입체증으로 고통받는 인간 환자, 특히, 병리학적으로 관련된 인간 유전자로 변화된 마우스로부터 기인한다.
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 알츠하이머병에 촛점을 맞추고 있다. 이러한 구체예에서, 샘플은 바람직하게는 하기 조건을 충족시키는 피검체로부터 수득된다:
(a) 65세, 바람직하게는, 70세, 더욱 바람직하게는 75세 초과일 것;
(b) 완전한 인지 능력 및 양호한 건강 상태일 것;
(c) 치매에 대한 임상적 징후가 없을 것;
(d) 알츠하이머병 가능성에 대해 확인된 임상적 진단이 있음에도 불구하고 특이적으로 질환의 진행 속도가 느릴 것; 또는
(e) 경증 인지 장애 (MCI)로부터 완전한 알츠하이머병으로 전환 속도가 특이적으로 느릴 것.
추가의 구체예에서, 본 발명의 방법은
a) 시편에 우선적으로 결합하나, 건강한 피검체의 상응하는 세포 또는 조직에는 결합하지 않거나 현저하게 낮은 친화도를 갖는 결합 분자 예를 들어, 항체를 함유하는 것으로 확인된 샘플로부터 B 세포 또는 B 메모리 세포를 정제하는 단계;
b) 상기 B 세포 또는 B 메모리 세포로부터 상기 항체를 엔코딩하는 면역글로불린 유전자 레퍼토리를 수득하는 단계; 및
c) 상기 레퍼토리를 사용하여 상기 항체를 발현시키는 단계를 포함하며,
임의적으로, 상기 단계 (b)는
d) 상기 B 세포 또는 메모리 B 세포로부터 mRNA를 수득하는 단계;
e) 단계 (iv)의 mRNA로부터 cDNA를 수득하는 단계; 및
f) 프라이머 연장 반응을 이용하여 상기 항체의 중쇄 (HC) 및 카파/람다 경쇄 (LC)에 상응하는 단편을 상기 cDNA로부터 증폭하는 단계를 포함한다.
폴리클로날 B 세포 활성화제의 존재하에 엡스테인 바르 바이러스 (EBV)를 사용하여 인간 B 메모리 림프구를 형질변환시키는 단계를 포함하여, 불멸화된 인간 B 세포 및 B 메모리 림프구의 클론을 생성하는 방법이 국제 출원 WO2004/076677에 요약되어 있다. 이러한 국제 출원은 또한, 해당 항체를 엔코딩하는 핵산 서열을 수득하는 방법으로서, 불멸화된 B 세포 클론을 제조하고, 해당 항체를 엔코딩하는 B 세포 클론으로부터 핵산을 수득/시퀀싱하고, 핵산을 삽입하거나 핵산을 이용하여 해당 항체를 발현할 수 있는 발현 숙주를 제조하고, 해당 항체가 발현되는 조건하에 발현 숙주를 배양하거나 계대 배양하고, 임의적으로 해당 항체를 정제하는 단계를 포함하는 방법에 대해 기술하고 있다. 제한 부위를 유입하고/거나 코돈 사용을 변화시키고/거나 전사 및/또는 번역 조절 서열을 부가 또는 최적화시키기 위해 중간에 핵산이 조작될 수 있음이 자명하다. 예를 들어, 핵산 서열은 소프트웨어 예컨대, 벡터 NTI 소프트웨어를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드 서열의 역번역에 의해 생성되어 RNA 안정화를 위해 코돈 최적화되고 RNA 안정도를 위해 최적화된 핵산 서열을 생성할 수 있다. 모든 이러한 기법은 당해분야에 기술되어 있으며, 무리 없이 당업자에 의해 수행될 수 있다. 인간 B 세포를 불멸화시키는 추가적인 방법은 당해분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 인간 하이브리도마 또는 인간-뮤린 키메라 하이브리도마의 작제물이 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 질환 관련 단백질의 네오에피토프를 포함하는 질환 관련 단백질의 에피토프를 선택적으로 인식할 수 있으며, 바람직하게는, 상기 기술되고 하기 실시예에 예시된 본 발명의 방법에 의해 수득되거나 유효하게될 수 있는 결합 분자에 관한 것이다. 유리하게는, 본 발명의 결합 분자는 비질환-관련 형태의 상기 단백질을 실질적으로 인식하지 않는다; 상기 참조.
결합 분자 특히, 항체 및 이의 모방체 (mimics)의 재조합 생성을 위한 수단 및 방법, 및 항체일 수 있거나 아닐 수 있는 경쟁 결합 분자를 스크리닝하는 방법은 당해분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 알츠하이머병의 치료/진단 및 베타-아밀로이드에 대한 항체와 관련하여 국제 출원 WO 2006/103116에 요약되어 있으며, 이의 내용은 치료학적 또는 진단학적 적용을 위한 항체 조작 및 투여의 목적으로 본원에 통합되었다.
그러나, 본원에 기술된 바와 같이, 인간에서 치료학적 적용과 관련하여, 본 발명의 항체는 인간 항체이다. 이와 관련하여, 바람직하게는, 항체에 의해 인식된 다양한 병리학적 단백질은 신경학적 질환, 바람직하게는, 뇌 질환과 관련있다.
게다가, 실시예 3 내지 5에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 수개의 유리한 생물학적 특성을 가지며, 이중 하나 이상은 처음으로 본 발명에 의해 달성되었으며, 예를 들어, 이는
(i) 예를 들어, 병리학적 사건 부위에서 뇌혈관 장벽을 가로지를 수 있으며;
(ii) 베타-아밀로이드 플라그, 뇌혈관 아밀로이드, 확산 Abeta 침착, 신경원섬유, 하이퍼포스포릴화된 타우, 알파-시누클레인 양성 루이체 또는 이영양성 신경돌기와 결합된 단배질 응집물에 결합할 수 있으며;
(iii) 뇌에서 베타-아밀로이드 플라그를 제거하고/거나 뇌에서 아밀로이드 플라크의 형성을 방지할 수 있으며;
(iv) 실질적으로 정상적인 행동으로 회복시킬 수 있으며; 및/또는
(v) 미세출혈을 초래하지 않는다.
특정 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 등가의 결합 분자는 하기 특성중 하나 이상에 의해 다른 항체와 구별될 수 있으며, 예를 들어, 이들은
1. 적어도 소량으로 병리학적 사건 부위에서 뇌혈관 장벽을 통과할 수 있으며;
2. 병태생리학적으로 관련된 세포외 또는 세포 구조에 결합하며;
3. 실험관내 또는 생체내에서 병태생리학적으로 관련 구조물의 저하를 유도하며;
4. 병태생리학적 관련 구조의 저하 및 이와 관련된 독성 저하를 유도하며;
5. 질환 과정의 차단 또는 지연을 유도하며;
6. 세포성 및 유기-특이적 및 유기체 기능의 재생을 유도하며, 가능하게는 병태생리학적 관련 구조물과 연결된 독성의 분해 후 원래의 병태생리의 재발의 이차 예방을 유도하며; 및/또는
7. 증가된 미세출혈과 관련되지 않는다.
또한, 생리학적 전구체 또는 유도체와의 교차-반응성의 부재는 먼저, 건강한 조직 구조에서 싱크 효과 (sink effect)가 회피되는 농도가 예측되며, 두번째로, 원하지 않는 부작용에 있어서 자가면역 반응이 실질적으로 사라진 것으로 결론 내려진다. 또한, 이전의 리포트들은 CAA를 갖는 유전자 이식 마우스 모델에서 처리된 혈관 반응과 대뇌 아밀로이드 맥관병증 (CAA)과의 관계를 시사한다 (Mueggler et al., J Neurosci 22 (2002), 7218-24). 늙은 arcAβ 마우스에서 발생하는 중증 CAA (Knobloch et al., Neurobiol. Aging 28:1297-1306 (2007) epub July 31, 2006)은 침윤된 혈관의 혈관확장 유연성을 억압할 수 있다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 항체로의 치료가 노화된 APP 유전자 이식 마우스에서 혈관반응성 및 뇌혈류를 개선시킬 수 있는 것으로 예측하는 것이 신중하다. 이는 상기 문헌 [Knobloch et al. (2006)]에 기술되고, 본원에 참고문헌으로 통합된 US 출원 ["Transgenic animal model for Alzheimer's disease" by Grimm et al., serial number 60/934,291, filed on June 11, 2007]에 기술된 arcAβ 마우스 모델을 사용하여 확인될 수 있다.
III. 항체
본 발명은 또한, 표 2 및 3에 기술된 바와 같이 결합 분자 예를 들어, 항체 및 이의 결합 단편, 변이체 및 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 특히, NI-101.10, NI-101.11, NI-101.12, NI-101.13, NI-101.12F6A, NI-101.13A, 및 NI-101.13B로 구성된 군으로부터 선택된 기준 항체와 동일한 질환 관련 단백질의 네오에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 또한, NI-101.10, NI-101.11, NI-101.12, NI-101.13, NI-101.12F6A, NI-101.13A, 및 NI-101.13B로 구성된 군으로부터 선택된 기준 항체가 질환 관련 단백질의 네오에피토프에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 또한, NI-101.10, NI-101.11, NI-101.12, NI-101.13, NI-101.12F6A, NI-101.13A, 및 NI-101.13B로 구성된 군으로부터 선택된 항체와 동일한 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 수개의 이러한 결합 분자 예를 들어, 항체 및 이의 결합 단편을 예시하고 있으며, 이는 표 2 (VH) 및 표 3 (VL)에 기술된 아미노산 서열중 임의의 하나를 포함하는 VH 및/또는 VL 가변 영역의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 이들의 가변 영역 예를 들어, 가변 도메인에 포함함을 특징으로 할 수 있다.
표 2. 네오에피토프 특이적 항체의 VH 영역의 아미노산 서열
Figure 112009047738293-PCT00002
표 3. 네오에피토프 특이적 항체의 VL 영역의 아미노산 서열
Figure 112009047738293-PCT00003
상기 확인된 가변 영역을 엔코딩하는 상응하는 누클레오티드 서열은 첨부된 서열 목록에 기술되어 있다. 표 2 및 3에 기술된 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역의 상기 아미노산 서열의 CDR의 예시적 세트가 표 4에 제공되었다. 그러나, 하기 논의된 바와 같이, 당업자는 CDR2 및 CDR3의 경우 이들의 아미노산 서열이 표 4에 제시된 것과 1개, 2개, 3개 또는 심지어 더 많은 아미노산이 상이한 CDR이 추가적으로 또는 대안적으로 사용될 수 있음을 잘 인지하고 있을 것이다.
표 4: 네오에피토프 특이적 항체의 VH 및 VL 영역의 카뱃 명명법에서 CDR 단백질 서열의 종류
Figure 112009047738293-PCT00004
Figure 112009047738293-PCT00005
일 구체예에서, 본 발명의 항체는 표 2 및 3에 설명된 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체중 하나이다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며, 이는 표 2 및 3에 제시된 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역을 갖는 항체중 하나 이상과 네오에피토프로의 결합을 경쟁한다. 이들 항체는 뮤린일 수 있으며, 그러나, 특히 치료학적 적용을 위해서는 인간화된, 이종성, 또는 키메라 인간-뮤린 항체가 바람직하다. 항체의 항원-결합 단편은 예를 들어, 단일쇄 Fv 단편 (scFv), F(ab')단편, F(ab) 단편, 및 F(ab')2 단편일 수 있다. 일부 적용에 있어서, 항체의 단지 가변 영역이 요구되며, 이는 Fab', Fab 또는 F(ab")2 부분을 생성하도록 적합한 제제로 항체를 처리함으로써 수득될 수 있다. 이러한 단편은 방사성 동위원소와 같은 검출 시제로 면역글로불린의 면역특이적 부분을 결합시키는 것을 포함하여, 예를 들어, 면역진단 과정에 사용하기에 충분하다.
본 발명은 추가로, 본 발명의 항체를 구성하는 분리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 폴리펩티드 예를 들어, 면역글로불린 분자로부터 유래된 특이적 항원 결합 영역을 엔코딩하는 아미노산 서열을 포함한다. 고안된 단백질"로부터 유래된" 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 특정 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 기원을 나타낸다. 특정 경우에서, 특정 출발 폴리펩티드 또는 아미노산 서열로부터 유래된 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 출발 서열의 아미노산 서열 또는 적어도 10-20개 아미노산, 적어도 20-30개 아미노산, 적어도 30-50개 아미노산으로 구성된 이의 일부와 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나, 출발 서열에서 이의 기원을 갖는 것으로서 당업자에 의해 달리 확인가능하다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하거나 이러한 영역으로 구성되거나 필수적으로 구성된 분리된 폴리펩티드를 제공하며, 여기서, 중쇄 가변 영역의 VH-CDR중 하나 이상 또는 중쇄 가변 영역의 VH-CDR중 2개 이상은 본원에 기술된 항체로부터의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 또는 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 대안적으로, VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역은 본원에 기술된 항체로부터의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서, 이러한 구체예에 따르면, 본 발명의 중쇄 가변 영역은 상기 표 4에 기술된 그룹과 관련된 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖는다. 표 4는 카뱃 시스템에 의해 규정된 VH-CDR을 나타내지만, 다른 CDR 규정법 예를 들어, 초티아 시스템 (Chothia system)에 의해 규정된 VH-CDR이 또한, 본 발명에 포함되며, 표 2 및 3에 제시된 데이타를 사용하여 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역이 표 4에 제시된 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 군과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하거나, 이러한 영역으로 구성되거나 필수적으로 구성된 분리된 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역이 하나의 VH-CDR중의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산 치환체를 제외하고는 표 4에 기재된 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 군과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하거나, 이러한 영역으로 구성되거나 필수적으로 구성된 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 특정 구체예에서, 아미노산 치환체는 보존적이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 경쇄 가변 영역의 VL-CDR중 하나 이상 또는 경쇄 가변 영역의 VL-CDR중 2개 이상이 본원에 기술된 항체로부터의 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나, 이러한 영역으로 구성되거나 필수적으로 구성된 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 대안적으로, VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3는 본원에 기재된 항체로부터의 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서, 본 구체예에 있어서, 본 발명의 경쇄 가변 영역은 상기 표 4에 기재된 폴리펩티드와 관련된 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖는다. 표 4는 카뱃 시스템에 의해 규정된 VL-CDR을 나타내지만, 다른 CDR 규정법 예를 들어, 초티아 시스템에 의해 규정된 VL-CDR이 본 발명에 포함된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역이 표 4에 제시된 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 군과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나, 이러한 영역으로 구성되거나 필수적으로 구성되는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역이 하나의 VL-CDR중의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산 치환체를 제외하고는 표 4에 기재된 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 군과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나 이러한 영역으로 구성되거나 필수적으로 구성된 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 특정 구체예에서, 아미노산 치환체는 보존적이다.
면역글로불린 또는 이의 엔코딩 cDNA는 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 추가의 구체예에서, 본 발명의 방법은 키메라 항체, 인간화된 항체, 단일쇄 항체, Fab-단편, 2-특이적 항체, 융합 항체, 라벨링된 항체 또는 이들중 어느 하나의 유사체를 생성하는 단계(들)중 어느 하나를 포함한다. 상응하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988]에 기술되어 있다. 상기 항체의 유도체가 파아지 디스플레이 기법에 의해 수득되는 경우, BIA코어 시스템에 사용되는 바와 같은 표면 플라즈몬 공명이 사용되어 본원에 기술된 항체중 하나의 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 파아지 항체의 효율을 증가시키는데 사용될 수 있다 (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J.Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). 키메라 항체의 생성은 예를 들어, 국제 출원 WO 89/09622에 기술되어 있다. 인간화된 항체의 생성 방법은 예를 들어, 유럽 출원 EP-A1 0 239 400 및 국제 출원 WO90/07861에 기술되어 있다. 본 발명에 따라 사용될 항체의 추가의 공급원은 소위 이종형 항체이다. 마우스에서 이종형 항체 예컨대, 인간 항체를 생성시키는 일반적 원리는 예를 들어, 국제 출원 WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 및 WO96/33735에 기술되어 있다. 상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 항체는 완전한 항체 이외에 다양한 형태로 존재할 수 있으며, 예를 들어, Fv, Fab 및 F(ab)2, 및 단일쇄를 포함한다; 예를 들어, 국제 출원 WO88/09344 참조.
본 발명의 항체 또는 이의 상응하는 면역글로불린 사슬(들)은 예를 들어, 당해분야에 공지된 아미노산 결실(들), 삽입(들), 치환(들), 첨가(들) 및/또는 재조합(들) 및/또는 임의의 다른 변형을 단독으로 또는 조합하여 사용함으로써 당해분야에 공지된 통상적인 기법을 이용하여 추가로 변형될 수 있다. 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열의 기초가 되는 DNA 서열에서 이러한 변형을 유도하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다; 예를 들어, 문헌 [Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)] 참조. 본 발명의 항체의 변형은 측쇄 변형, 백본 변형, 및 아세틸화, 히드록실화, 메틸화, 아미드화, 및 탄수화물 또는 리피드 부분, 보조인자 등의 부착을 포함한 N- 및 C-말단 변형을 포함하는, 하나 이상의 구성 아미노산에서의 화학적 및/또는 효소적 유도체화를 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 카르복실 말단에서 면역자극 리간드와 같은 이종 분자에 융합된 아미노 말단에서 기술된 항체 또는 이의 일부 단편을 포함하는 키메라 단백질의 생성을 포함한다; 예를 들어, 상응하는 기술적 상세한 내용에 있어서는 국제 출원 WO 00/30680 참조.
또한, 본 발명은 상기 기술된 결합 분자를 함유하는 예를 들어, 언급된 항체중 하나의 가변 영역의 CDR3 영역, 특히, 중쇄의 CDR3를 함유하는 펩티드를 포함하는 작은 펩티드를 포함하는데, 이는 중쇄 CDR3 (HCDR3)가 더 높은 정도의 가변도를 갖는 영역이며, 항원-항체 상호작용에서의 현저한 관여가 빈번하게 관찰되었기 때문이다. 이러한 펩티드는 본 발명에 따라 유용한 결합제를 생성하기 위한 재조합 수단에 의해 용이하게 합성되거나 생성될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 펩티드는 예를 들어, 시중에서 입수가능한 자동화된 펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 펩티드는 펩티드를 발현하는 DNA를 발현 벡터에 혼입하고, 발현 벡터로 세포를 형질변환시켜 펩티드를 생성시키는 재조합 기법에 의해 생성될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 기술된 수단에 따라 수득가능하며, 언급된 특성 즉, 특이적으로 네오에피토프를 인식하는 특성을 나타내는 결합 분자 예를 들어, 항체 또는 결합 단편에 관한 것이다. 이러한 항체 및 결합 분자는 예를 들어, 상기 기술된 네오에피토프 특이적 결합 분자를 분리하는 방법을 이용함으로써 이의 결합 특이성 및 친화도에 대해 시험할 수 있다.
불멸화된 B 세포 또는 B 메모리 세포의 배양물로부터 직접적으로 면역글로불린을 수득하기 위한 대안으로서, 불멸화된 세포가 후속 발현 및/또는 유전자 조작에 대한 재배열된 중쇄 및 경쇄 로커스의 공급원으로서 사용될 수 있다. 재배열된 항체 유전자는 cDNA를 생성하기 위한 적합한 mRNA로부터 역전사될 수 있다. 필요에 따라, 중쇄 불변 영역은 상이한 이소타입의 영역으로 교환되거나 전체적으로 제거될 수 있다. 가변 영역은 단일쇄 Fv 영역을 엔코딩하도록 연결될 수 있다. 다중 Fv 영역은 하나 초과의 표적으로의 결합 능력을 부여하도록 연결될 수 있거나, 키메라 중쇄 및 경쇄 조합물이 사용될 수 있다. 유전자 물질이 사용가능하면, 목적하는 표적에 결합하는 이들의 능력을 보유하는 상기 기술된 유사체 설계가 간단해 진다. 항체 가변 영역의 클로닝 및 재조합 항체의 생성 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Grilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al., Leukemia 11 (1997), 1787-1792]에 기술되어 있다.
적합한 유전자 물질이 수득되고, 필요에 따라 유사체를 엔코딩하도록 변형되면, 최소한 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 엔코딩하는 서열을 포함하는 코딩 서열이 벡터상에 함유된 발현 시스템으로 삽입될 수 있으며, 이러한 벡터는 표준 재조합 숙주 세포로 트랜스펙션될 수 있다. 다양한 이러한 숙주 세포는 충분한 프로세싱을 위해 사용될 수 있다; 그러나, 포유동물 세포가 바람직하다. 전형적으로, 이러한 목적에 유용한 포유동물 세포주는 비제한적으로, CHO 세포, HEK 293 세포, 또는 NSO 세포를 포함한다.
항체 또는 유사체의 생성은 숙주 세포의 성장 및 코딩 서열의 발현의 적합한 배양 조건하에서 변형된 재조합 숙주를 배양함으로써 취해진다. 그 후, 항체는 배양물로부터 이를 분리함으로써 회수된다. 발현 시스템은 바람직하게는, 단일 펩티드를 포함하는 것으로 설계되며, 생성된 항체는 배지로 분비된다; 그러나, 세포내 생성이 또한 가능하다.
표적 구조물 예를 들어, 질환 관련된 단백질이 샘플 및 샘플내의 각각의 결합 분자에 의해 태깅되면, 예를 들어, 질량 분광 (MS) 기법 예컨대, 국제 출원 WO00/11208에 기술된 방법, 및 문헌 [Hock et al., Nat Med 8 (2002), 1270-1275; Hock et al., Neuron 28 (2003), 547-554]에 기술된 기법을 이용하여 당해분야에 공지된 방법 및 수단에 의해 확인될 수 있다. 따라서, 실험관내에서 생성된 본 발명에 따라 확인된 항체가 병리학적 구조물 예를 들어, 병리학적 뇌 영역 절편에서 베타-아밀로이드 플라그에 결합하고, 건강한 조직에는 현저하게 결합하지 않는 경우, 유력한 항체 후보는 이의 분자 표적 구조가 후속적으로 부화되고, 병리학적 조직으로부터의 항체로의 이의 결합 특성을 통해 정제되는 것으로 확인되었으며, 그 결과, 단백질 분석 및 질량분광법 예를 들어, MALDI/TOF (Williams, Methods Cell. Biol. 62 (2000), 449-453; Yates, J.Mass. Spectrom. 33 (1998), 1-19)에 의해 확인되며 특성 결정될 수 있다.
따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 결합 분자, 특히 상기 기술된 본 발명의 항체에 의해 인식되며, 바람직하게는, 질환-관련 단백질의 적어도 일부인 항원에 관한 것이다.
상기에 따르면, 본 발명은 또한, 본 발명의 항원 또는 결합 분자, 항체의 경우, 바람직하게는, 상기 기술된 항체의 면역글로불린 사슬의 적어도 가변 영역을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 전형적으로, 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 상기 가변 영역은 상기 항체의 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 당업자는 항체의 각 가변 도메인 (중쇄 VH 및 경쇄 VL)이 3개의 과변이 영역, 소위 4개의 비교적 보존된 프레임워크 영역 또는 "FR"에 의해 플랭킹된 상보성 결정 영역 또는 "CDR"을 포함하며, 항원 결합에 기여하는 항체의 아미노산 잔기를 나타냄을 인지하고 있다. 항체의 인간 IgG 서브타입의 과변이 영역 또는 CDR은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interests, 5th Ed Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)]에 기술된 바와 같은 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3)로부터의 아미노산 잔기 및/또는 문헌 [Chothia et al., J.Mol.Biol. 196 (1987), 901-917]에 기술된 바와 같은 과변이 루프 예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 프레임워크 또는 FR 잔기는 과변이 영역 이외의 가변 도메인 잔기로서, 과변이 영역을 브래킷 (bracketing)한다. 용어 "특이적 결합"은 소정의 항원으로 결합하는 항체를 나타낸다. 전형적으로, 항체는 10-7 M 이하의 해리상수 (KD)로 항원에 결합하며, 이는 소정의 항원 이외의 비특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인 또는 다른 특이적 폴리펩티드)에 결합하기 위한 KD 보다 적어도 2배 낮다. 문구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다. 본원에 사용된 바와 같은 "고도로 특이적인"은 특이적 표적 에피토프 예를 들어, 네오에피토프에 대한 항체의 상대적 KD가 항체를 질환-관련 단백질의 다른 리간드 또는 천연 대응물에 결합시키기 위한 KD 보다 적어도 10배 낮음을 의미한다.
항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합 활성은 임의의 적합한 방법 및 본원에 기술된 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다; 예를 들어, 문헌 [Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company New York, N Y (1992)] 참조. 항원에 대한 항체의 친화도를 측정하는 일반적 기법은 ELISA, RIA 및 표면 플라즈몬 공명을 포함한다. 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건 예를 들어, 염 농도, pH하에 측정되는 경우 달라질 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 항원-결합 파라미터 예를 들어, KD, IC50의 측정은 바람직하게는, 항체 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충제로 이루어진다.
당업자는 상기 기술된 가변 도메인을 갖는 항체의 가변 도메인이 목적하는 특이성 및 생물학적 기능의 다른 폴리펩티드 또는 항체의 작제에 사용될 수 있음을 용이하게 인지할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 또한, 상기 기술된 가변 도메인의 하나 이상의 CDR을 포함하며, 유리하게는 첨부된 실시예에 기술된 항체와 실질적으로 동일하거나 유사한 결합 특성을 갖는 항체 및 폴리펩티드를 포함한다. 당업자는 본원에 기술된 가변 도메인 또는 CDR을 사용하여, 항체가 당해분야에 공지된 방법 예를 들어, 유럽 특허 출원 EP 0 451 216 A1 및 EP 0 549 581 A1에 기술된 방법에 따라 작제될 수 있음을 용이하게 인지할 수 있을 것이다. 게다가, 당업자는 결합 친화도가 카뱃에 의해 규정된 바와 같은 CDR와 부분적으로 중복되는 과변이 루프 또는 CDR내의 아미노산 치환체를 제조함으로써 향상될 수 있음을 알고 있다 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917). 따라서, 본 발명은 또한, 언급된 CDR중 하나 이상이 하나 이상, 바람직하게는, 2개 이하의 아미노산 치환체를 포함하는 항체에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 이의 면역글로불린 사슬중 하나 또는 둘 모두에서 표 4에 제시된 바와 같은 가변 영역의 2 또는 모든 3개의 CDR을 포함한다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 결합 분자 예를 들어, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 하나 이상의 이펙터 작용을 매개하는 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 보체의 C1 성분의 항체 불변 영역으로의 결합은 보체 시스템을 활성화시킬 수 있다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용균에 중요하다. 보체의 활성화는 또한, 염증 반응을 자극하고, 자가면역 과민반응에 관련될 수 있다. 또한, 항체는 Fc 영역을 통해 다양한 세포상의 수용체와 결합하며, 항체 Fc 영역상의 Fc 수용체 결합 부위는 세포상의 Fc 수용체 (FcR)에 결합한다. IgG (감마 수용체), IgE (엡실론 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)를 포함한 다양한 부류의 항체에 특이적인 많은 Fc 수용체가 있다. 세포 표면상의 Fc 수용체로의 항체의 결합은 항체-피복된 입자의 함몰 및 파괴, 면역 착물의 제거, 킬러 세포 (소위, 항체-의존적 세포 매개된 세포독성, 또는 ADCC)에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 분해, 염증 매개체의 방출, 태반 이동 및 면역글로불린 생성의 조정을 포함하는 많은 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발시킨다.
따라서, 본 발명의 특정 구체예는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하며, 여기서, 하나 이상의 불변 도메인중의 적어도 분획이 결실되거나, 다르게는 변형되어 저하된 이펙터 작용, 비공유적으로 다이머화되는 능력, 종양 부위에 국소화되는 증가된 능력, 전체와 비교할 경우 저하된 혈청 반감기 또는 증가되 혈청 반감기, 거의 동일한 면역원성의 비변화된 항체와 같은 목적하는 생화학적 특징을 제공한다. 예를 들어, 본원에 기술된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 특정 항체는 면역글로불린 중쇄와 유사한 폴리펩티드 사슬을 포함하나, 하나 이상의 중쇄 도메인의 적어도 일부가 결여된 도메인 결실된 항체이다. 예를 들어, 특정 항체에서, 변형된 항체의 불변 영역의 하나의 전체 도메인이 결실될 것이며, 예를 들어, CH2 도메인의 전부 또는 일부가 결실될 것이다. 다른 구체예에서, 본원에 기술된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 특정 항체는 불변 영역 예를 들어, IGg 중쇄 불변 영역을 가지며, 이는 본원에서 아글리코실화된 또는 "agly" 항체로서 언급된 글리코실화가 제거되도록 변화된 것이다. 이러한 "agly" 항체는 효소적으로 또는 불변 영역에서 콘센서스 글리코실화 부위(들)를 조작함으로써 제조될 수 있다. 이론에 제한되지 않으면서, "agly" 항체는 생체내에서 증가된 안전성 및 안정성을 가질 수 있는 것으로 여겨진다. 목적하는 이펙터 작용을 갖는 아글리코실화된 항체를 생성하는 방법은 본원에 참조로서 통합된 예를 들어, WO 2005/018572에서 찾아볼 수 있다.
본원에 기술된 특정 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에서, Fc 부분은 당해분야에 공지된 기법을 사용하여 이펙터 작용을 저하시키도록 변이될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화 (점 변이 또는 다른 수단을 통한)는 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 저하시켜 종양 국소화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우에, 불변 영역 변형은 본 발명의 온건한 보체 결합과 일관되며, 따라서, 혈청 반감기 및 컨쥬게이트된 세포독소의 비특이적 결합을 저하시킨다. 불변 영역의 또 다른 변형은 증가된 항원 특이성 또는 항체 유연성으로 인한 증가된 국소화를 가능하게 하는 이황화물 결합 또는 올리고사카라이드 부분을 변화시키는데 사용될 수 있다. 변형으로 인한 생성된 생리학적 프로필, 생체이용성 및 기타 생화학적 효과 예컨대, 종양 국소화, 체내분포 및 혈청 반감기는 과도한 실험 없이 널리 공지된 면역학적 기법을 사용하여 용이하게 측정되고 정량화될 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 변형된 형태는 당해분야에 공지된 기법을 이용하여 전체 전구체 또는 어미 항체로부터 제조될 수 있다. 예시적인 기법이 본원에 더욱 상세히 논의되어 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 가변 및 불변 영역은 완전히 인간이다. 완전한 인간 항체는 당해분야에 공지되고 본원에 기술된 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 특이적 항원에 대한 완전한 인간 항체는 항원 자극에 대한 반응에서 이러한 항체를 생성하도록 변형되었으나, 이의 내생성 로커스는 무능력화된 유전자 이식 동물에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 예시적 기법은 US 특허 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140에 기술되어 있다. 다른 기법이 당해 분야에 공지되어 있다. 완전한 인간 항체는 마찬가지로, 다양한 디스플레이 기법 예를 들어, 본원의 다른 곳에 더욱 상세히 설명된 바와 같은 파아지 디스플레이 또는 다른 바이러스 디스플레이 시스템에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 당해분야에 공지된 기법을 이용하여 제조되거나 제작될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체 분자 또는 이의 단편은 "재조합적으로 생성"되며, 즉, 재조합 DNA 기법을 이용하여 생성된다. 항체 분자 또는 이의 단편을 제조하는 예시적인 기법은 본원의 다른 곳에 더욱 상세히 논의되어 있다.
또한, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 예를 들어, 임임의 유형의 분자의 항체로의 공유 부착에 의해 변형된 유도체를 포함하며, 이러한 공유 부착은 항체가 이의 동종 에피토프로 특이적으로 결합하는 것을 방해하지 않아야 한다. 예를 들어, 비제한적으로, 항체 유도체는 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질로의 연결 등에 의해 변형된 항체를 포함한다. 다수의 화학적 변형은 비제한적으로, 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신 (tunicamycin)의 대사 합성 등을 포함하는 공지된 기법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 유도체는 하나 이상의 비전통적 아미노산을 함유할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 치료할 동물 예를 들어, 인간에서 삭제성 면역 반응을 유도하지 않을 것이다. 특정 구체예에서, 결합 분자 예를 들어, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 환자 예를 들어, 인간 환자로부터 유래되며, 후속적으로, 이들이 유래되는 동일한 종 예를 들어, 인간에 사용되어, 삭제성 면역 반응의 발생을 완화 또는 최소화시킨다.
탈면역화는 또한, 항체의 면역원성을 저하시키는데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "탈-면역화"는 T-세포 에피토프를 변형시키기 위해 항체를 변화시키는 것을 포함한다 (예를 들어, WO9852976A1, WO0034317A2 참조). 예를 들어, 출발 항체로부터의 VH 및 VL 서열을 분석하고, 각 V 영역으로부터의 인간 T 세포 에피토프 "맵 (map)"은 서열내의 상보성-결정 영역 (CDR) 및 다른 주요 잔기와 관련하여 에피토프의 위치를 보여준다. T 세포 에피토프 맵으로부터의 개별적인 T 세포 에피토프는 최종 항체의 활성을 변형시킬 낮은 위험도로 대안적인 아미노산 치환체를 확인하기 위해 분석된다. 아미노산 치환의 조합을 포함하는 대안적인 VH 및 VL 서열의 범위가 설계되며, 이들 서열은 후속적으로 결합 폴리펩티드 범위, 예를 들어, 본원에 설명된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 네오-에피토프-특이적 항체 또는 면역특이적 단편에 혼입되고, 작용에 대해 시험된다. 전형적으로, 12개 내지 24개 변이 항체가 생성되며 시험된다. 변형된 V 및 인간 C 영역을 포함하는 완전한 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현 벡터로 클로닝되고, 후속 플라스미드는 전체 항체의 생성을 위한 세포주로 혼입된다. 그 후, 항체는 적합한 생화학 및 생물학적 검정법으로 비교되며, 최적의 변이체가 확인된다.
모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파아지 디스플레이 기법, 또는 이의 조합을 포함하는 당해분야에 공지된 다양한 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 예를 들어, 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981)] (이는 전체가 본원에 참조로서 통합됨)에 교시되고 당해분야애 공지된 것을 포함하는 하이브리도마 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기법을 통해 행성된 항체로 제한되지 않는다. 용어 "모노클로날 항체"는 임의의 진핵, 원핵 또는 파아지 클론을 포함하는 단일 클로으로부터 유래된 항체를 나타내며, 이것이 생성되는 방법을 나타내는 것은 아니다. 따라서, 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기법을 통해 생성된 항체에 제한되지 않는다. 모노클로날 항체는 당해분야에 공지된 매우 다양한 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 본원에 기술된 바와 같은 엡스테인-바르 바이러스로의 형질변환을 통해 불멸화된 인간 B 세포로부터 유래된다.
널리 공지된 하이브리도마 공정 (Kohler et al., Nature 256:495 (1975))에서, 포유동물로부터의 비교적 짧은 수명의 또는 죽을 림프구 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같인 인간 피검체로부터 유래된 B 세포는 불멸의 종양 세포주 (예를 들어, 골수종 세포주)와 융합되어, B 세포의 유전적으로 코딩된 항체를 생성할 수 있으며 불멸인 하이브리드 세포 또는 "하이브리도마"를 생성한다. 생성된 하이브리드는 선택, 희석, 및 단일 항체의 형성을 위한 특이적 유전자를 포함하는 개별 균주와의 재성장에 의해 단일 유전자 균주로 분리된다. 이들은 항체를 생성하며, 이는 목적하는 항원에 대해 상동성이며, 이들의 순수한 유전자 백분율과 관련하여서는, "모노클로날"로 불린다.
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포는 비융합된 어미 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게는, 함유하는 적합한 배양 배지에 시딩되고 성장하게 된다. 당업자는 하이브리도마의 형성, 선택 및 성장을 위한 시약, 세포주 및 배지가 많은 공급원으로부터 시중에서 입수가능하며, 표준 프로토콜이 널리 성립되어 있음을 인지하고 있을 것이다. 일반적으로, 하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 목적하는 항원에 대한 모노클로날 항체의 생성을 위해 분석된다. 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 생체외 검정 예컨대, 면역침전, 방사면역측정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착법 (ELISA), 또는 본원에 기술된 바와 같은 네오에피토프 결합 분석에 의해 결정된다. 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 희석 공정을 제한함으로써 서브클로닝되고, 표준 방법에 의해 성장할 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp 59-103 (1986)). 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 정제 방법 예를 들어, 단백질-A, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 자낭 유체 또는 혈청으로부터 분리될 수 있음이 자명해질 것이다.
특이적 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 기법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편은 효소 예컨대, 파파인 (Fab 단편을 생성하는) 또는 펩신 (F(ab')2 단편을 생성하는)과 같은 효소를 이용하여 면역극로불린 분자의 단백질분해 절단 또는 재조합에 의해 생성될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다.
본원에 기술된 바와 같은 완전한 인간 항체는 특히 인간 환자의 치료학적 처지에 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로빈 서열로부터 유래된 항체 아리브러리를 사용하여 상기 기술된 파아지 디스플레이 방법을 포함하는 당해분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 그 전체가 본원에 참조로서 통합된 U.S. 특허 4,444,887 및 4,716,111; 및 PCT 공개 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO91/10741 참조. 본 발명의 인간 항체는 예를 들어, 질환 예컨대, 알츠하이머병이 발병할 위험성을 가지나 증상이 없는 환자, 또는 특이적으로 안정적인 질환 과정을 갖는 질환에 걸린 환자로부터 분리된다.
또 다른 구체예에서, 목적하는 모노클로날 항체를 엔코딩하는 DNA는 통상적인 과정을 이용하여 용이하게 분리되고 시퀀싱될 수 있다 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고누클레오티드 프로브를 사용함으로써). 분리되고 서브클로닝된 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 분리되면, DNA는 발현 벡터에 위치하며, 이후 벡터는 원핵 또는 진핵 숙주 세포 예컨대, 비제한적으로, E.coli 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 면역글로불린을 생성하지 않는 골수종 세포로 트랜스펙션된다. 더욱 특히, 분리된 DNA (이는 본원에 기술된 바와 같은 합성일 수 있음)는 본원에 참조로서 통합된 문헌 [Newman et al., U.S. Pat. No. 5,658,570. filed January 25, 1995]에 기술된 바와 같은 항체 제조를 위한 불변 및 가변 영역 서열을 클로닝하는데 사용될 수 있다. 본질적으로, 이는 선택된 세포로부터의 RNA의 추출, cDNA로의 전환, 및 Ig 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의한 증폭을 수반한다. 이러한 목적에 적합한 프라이머는 U.S. 특허 5,658,570에 기술되어 있다. 하기 더욱 상세히 논의된 바와 같이, 목적하는 항체를 발현하는 형질변환된 세포는 비교적 대량으로 성장되어 면역글로불린의 임상적 및 시중의 공급을 제공할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체는 항체 분자의 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 2개 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 3개 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 4개 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터 5개 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터 6개 이상의 CDR을 포함한다. 피검체 항체에 포함될 수 있는 하나 이상의 CDR을 포함하는 예시적인 항체 분자는 본원에 기술되어 있다.
특이적 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 당해분야에 널리 공지된 방법 예를 들어, 서열 과변이가능 영역을 결정하기 위해 다른 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 공지된 아미노산 서열과의 비교에 의해 상보성 결정 영역 (CDR)의 서열을 확인하도록 조사될 수 있다. 일정한 재조합 DNA 기법을 이용함으로써, 하나 이상의 CDR이 프레임워크 영역 예를 들어, 인간 프레임워크 영역내로 삽입될 수 있다. 프레임워크 영역은 자연적으로 발생하는 또는 콘센서스 프레임워크 영역일 수 있으며, 바람직하게는, 인간 프레임워크 영역일 수 있다 (예를 들어, 인간 프레임워크 영역의 목록에 있어서는 문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998)] 참조). 특정 구체예에서, 프레임워크 영역 및 CDR의 조합에 의해 생성된 폴리누클레오티드는 목적하는 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 엔코딩한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 프레임워크 영역내에서 발생하여, 예를 들어, 항체의 이의 항원으로의 결합을 증대시킬 수 있다. 또한, 이러한 방법은 하나 이상의 사슬내 이황화물 결합이 결여된 항체를 생성시키기 위해 사슬내 이황화물 결합에 관여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 아미노산 치환 또는 결실을 유도하는데 이용될 수 있다.
대안적으로, 단일쇄 항체의 생성에 요구되는 기법 (U.S. Pat. No. 4,694,778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); and Ward et al., Nature 334:544-554 (1989))이 단일쇄 항체를 생성하는데 적합하게 될 수 있다. 단일쇄 항체는 아미노산 브릿지를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결함으로써 형성되어, 단일쇄 항체를 생성시킨다. E.coli에서의 작용성 Fv 단편의 어셈블리를 위한 기법이 이용될 수 있다 (Skerra et al., Science 242:1038-1041 (1988)).
또 다른 구체예에서, 림프구는 극미조작 및 분리된 가변 유전자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 말초혈액 단핵 세포는 면역화된 또는 자연적인 면역 포유동물 예를 들어, 인간으로부터 분리되고, 실험관내에서 약 7일 동안 배양될 수 있다. 배양물을 스크리닝 기준을 충족시키는 특이적 IgG에 대해 스크리닝될 수 있다. 양성 웰로부터의 세포가 분리될 수 있다. 개별적인 Ig-생성 B 세포는 FACS에 의해 또는 보체-매개된 용혈성 플라크 검정에서 이들을 확인함으로써 분리될 수 있다. Ig-생성 B 세포는 튜브내로 극미조작될 수 있으며, 예를 들어, RT-PCR을 사용하여 VH 및 VL 유전자가 증폭될 수 있다. VH 및 VL 유전자는 항체 발현 벡터로 클로닝될 수 있으며, 발현을 위해 세포내로 트랜스펙션될 수 있다 (예를 들어, 진핵 또는 원핵 세포).
대안적으로, 항체-생성 세포주가 당업자에게 널리 공지된 기법을 이용하여 선택되고 배양될 수 있다. 이러한 기법은 다양한 실험실 매누얼 및 주요 공개문헌에 기술되어 있다. 이러한 점에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 기법은 보충물을 포함한 그 전체가 본원에 참조로 통합된 문헌 [Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)]에 기술되어 있다.
본 발명의 항체는 항체의 합성을 위한 당해분야에 공지된 방법 특히, 화학 합성법 또는 바람직하게는, 본원에 기술된 바와 같은 재조합 발현 기법에 의해 생성될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 하나 이상의 도메인이 부분적으로 또는 전체적으로 결실된 합성 불변 영역을 포함한다 ("도메인-결실된 항체"). 특정 구체예에서, 양립되는 변형된 항체는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실된 작제물 또는 변이체를 포함할 것이다 (△CH2 작제물). 다른 구체예에 있어서, 짧은 연결 펩티드가 결실 도메인에 대신 치환되어 가변 영역의 이동을 위한 유연성 및 자유로움을 제공한다. 당업자는 이러한 작제물이 항체의 이화율에 대한 CH2 도메인의 조절 특성으로 인해 특히 바람직하다는 것을 알고 있을 것이다. 도메인 결실된 작제물은 IgG1 인간 불변 도메인을 엔코딩하는 벡터를 사용하여 유래될 수 있다 (예를 들어, WO 02/060955A2 및 WO02/0906948A2 참조). 이러한 벡터는 CH2 도메인이 결실되고, 도메인 결실된 IgG1 불변 영역을 발현하는 합성 벡터를 제공하도록 조작된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 미니바디이다. 미니바디는 당해분야에 기술된 방법을 이용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, US 특허 5,837,821 또는 WO 94/09817A1 참조).
일 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 모노머 서브유닛 사이의 결합을 허용하는 한 소수개의 또는 심지어 단일 아미노산이 결실되거나 치환된 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역에서 단일 아미노산의 변이는 실질적으로 Fc 결합을 저하시키기에 충분할 수 있으며, 따라서 종양 국소화를 증가시킬 수 있다. 유사하게는, 이는 조절될 이펙터 작용 (예를 들어, 보체 결합)을 조정하는 하나 이상의 불변 영역 도메인의 일부를 단순히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 불변 영역의 부분적 결실은 고유의 해당 불변 영역 도메인과 관련된 다른 바람직한 작용을 유지한 채, 항체의 선택된 특징 (혈청 반감기)을 개선시킬 수 있다. 또한, 상기에 언급된 바와 같이, 본 항체의 불변 영역은 생성된 작제물의 프로필을 향상시키는 하나 이상의 아미노산의 변이 또는 치환을 통해 합성될 수 있다. 이와 관련하여, 보존된 결합 부위 (예를 들어, Fc 결합)에 의해 제공된 활성을 파괴하면서, 변형된 항체의 형상 및 면역원성 프로필을 실질적으로 유지시키는 것이 가능할 수 있다. 또 다른 구체예는 이펙터 작용과 같은 바람직한 특징을 향상시키거나 더 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공하기 위해 불변 영역에 하나 이상의 아미노산을 부가하는 것을 포함한다. 이러한 구체예에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유래된 특이적 서열을 삽입하거나 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 항체 분자 (예를 들어, VH 영역 및/또는 VL 영역)의 변이체 (유도체 포함)를 포함하거나, 이들로로 구성되거나 필수적으로 구성된 항체를 제공하며, 이러한 항체 또는 이의 단편은 질환 관련된 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체에 면역특이적으로 결합한다. 당업자에게 공지된 표준 기법을 이용하여 항체를 엔코딩하는 누클레오티드 서열에 변이를 유도할 수 있으며, 이러한 기법은 비제한적으로, 부위 특이적 돌연변이 유발 및 PCR-매개된 돌연변이 유발을 포함하며, 이는 아미노산 치환을 유도한다. 바람직하게는, 변이체 (유도체 포함)는 기준 VH 영역, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL 영역, VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3과 관련하여 50개 미만의 아미노산 치환체, 40개 미만의 아미노산 치환체, 30개 미만의 아미노산 치환체, 25개 미만의 아미노산 치환체, 20개 미만의 아미노산 치환체, 15개 미만의 아미노산 치환체, 10개 미만의 아미노산 치환체, 5개 미만의 아미노산 치환체, 4개 미만의 아미노산 치환체, 3개 미만의 아미노산 치환체, 또는 2개 미만의 아미노산 치환체를 엔코딩한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 치환체이다. 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당해분야에 규정되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산을 포함한다. 대안적으로, 변이부는 예컨대, 포화 돌연변이 유발에 의해 코딩 서열의 전체 또는 일부에 따라 불규칙적으로 도입될 수 있으며, 생성된 변이체는 활성을 보유하는 변이체를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다 (예를 들어, 질환 관련 폴리펩티드에 결합하는 능력).
예를 들어, 항체 분자의 CDR 영역에서만 또는 프레임워크 영역에서만 변이부를 유입시키는 것이 가능하다. 유입된 변이부는 침묵 또는 중성의 미스센스 변이부일 수 있으며, 예를 들어, 항원에 결합할 수 있는 항체의 능력에 영향을 끼치지 않거나 거의 영향을 끼치지 않으며, 실제로 일부 이러한 변이부는 아미노산 서열을 변화시키지 않는다. 이러한 유형의 변이는 코돈 사용을 최적화시키거나 하이브리도마 항체 생성을 향상시키는데 유용할 수 있다. 본 발명의 항체를 엔코딩하는 코돈-최적화된 코딩 영역은 본원의 다른 곳에 기술되어 있다. 대안적으로, 비중성 미스센스 변이는 항원에 결합하는 항체의 능력을 변화시킬 수 있다. 대부분의 침묵 및 중성 미스센스 변이의 위치는 프레임워크 영역내인 것으로 여겨지며, 대부분의 비중성 미스센스 변이의 위치는 CDR내에 위치하는 것으로 여겨지나, 이는 절대 요건은 아니다. 당업자는 항원 결합 활성 또는 결합 활성의 변화 (예를 들어, 항원 결합 활성의 향상 또는 항체 특이성 변화)가 없는 목적하는 특성을 갖는 변이체 분자를 설계하고 시험할 수 있을 것이다. 돌연변이 유발 후, 엔코딩된 단백질은 일정하게 발현되고, 엔코딩된 단백질의 기능 및/또는 생물학적 활성 (예를 들어, 질환 관련 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 능력)은 당해분야에 공지된 일정한 변형 기법 또는 본원에 기술된 기법을 이용하여 결정될 수 있다.
IV. 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드
상기에 있어서, 본 발명은 또한, 본 발명의 결합 분자 예를 들어, 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 항체의 경우, 폴리누클레오티드는 상기 기술된 항체의 면역글로불린 사슬의 적어도 가변 영역을 엔코딩할 수 있다. 상기 기술된 항체를 엔코딩하는 본 발명의 폴리누클레오티드는 예를 들어, DNA, cDNA, RNA 또는 합성적으로 생성된 DNA 또는 RNA, 또는 이러한 폴리누클레오티드를 단독으로 또는 조합하여 포함하는 재조합적으로 생성된 키메라 핵산 분자일 수 있다. 바람직하게는, 상기 폴리누클레오티드는 벡터의 일부이다. 이러한 벡터는 적합한 숙주 세포 및 적합한 조건하에서 상기 벡터의 선택을 가능하게 하는 마커 유전자와 같은 추가의 유전자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리누클레오티드는 원핵 세포 또는 진핵 세포에서의 발현을 허용하는 조종 서열에 작동적으로 연결된다. 상기 폴리누클레오티드의 발현은 번역가능한 mRNA로의 폴리누클레오티드의 전사를 포함한다. 진핵 세포 바람직하게는, 포유동물 세포에서의 발현을 보장하는 조절 엘리먼트는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이들은 일반적으로, 전사의 개시를 보장하는 조절 서열 및 전사의 종결 및 선택적으로, 전사체의 안정화를 보장하는 폴리-A 시그널을 포함한다. 추가적인 조절 엘리먼트는 전사적 및 번역적 인핸서, 및/또는 자연적으로 관련된 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다.
항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 폴리리보누클레오티드 또는 폴리데옥시리보누클레오티드로 이루어질 수 있으며, 이는 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 예를 들어, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA, 및 단일 가닥일 수 있거나, 더욱 특히, 이중 가닥 또는 단일 가닥과 이중 가역 영역의 혼합물일 수 있는 DNA와 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 이루어질 수 있다. 또한, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 둘 모두를 포함하는 삼중 가닥 영역으로 이루어질 수 있다. 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한, 하나 이상의 변형된 염기 또는 안정도 또는 다른 이유로 변형된 DNA 또는 RNA 백본을 함유할 수 있다. "변형된" 염기는 예를 들어, 트리틸화된 염기 및 일반적이지 않은 염기 예컨대, 이노신을 포함한다. DNA 및 RNA에 다양한 변형이 이루어질 수 있으며; 따라서, "폴리누클레오티드"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다.
면역글로불린 (예를 들어, 면역글로불린 중쇄부 또는 경쇄부)으로부터 유래된 폴리펩티드의 비천연 변이체를 엔코딩하는 분리된 폴리누클레오티드는 엔코딩된 단백질로 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 도입되도록 면역글로불린의 누클레오티드 서열로의 하나 이상의 누클레오티드 치환, 첨가 또는 결실을 도입함으로써 생성될 수 있다. 변이는 표준 기법 예컨대, 부위 특이적 돌연변이 유발 및 PCR-매개된 돌연변이 유발에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환은 하나 이상의 비필수 아미노산 잔기에서 이루어진다.
널리 공지된 바와 같이, RNA는 표준 기법 예컨대, 구아니디늄 이소티오시아네이트 추출 및 침전 후 원심분리 또는 크로마토그래피에 의해 원래의 하이브리도마 세포 또는 다른 형질변환된 세포로부터 분리될 수 있다. 필요에 따라, mRNA가 표준 기법 예컨대, 올리고 dT 셀룰로오스상의 크로마토그래피에 의해 전체 RNA로부터 분리될 수 있다. 적합한 기법은 당해분야에 잘 알려져 있다.
일 구체예에서, 항체의 경쇄 및 중쇄를 엔코딩하는 cDNA는 동시에 또는 별도로 널리 공지된 방법에 따라 역전사효소 및 DNA 중합효소에 의해 이루어질 수 있다. PCR은 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열을 기초로 하는 콘센서스 불변 영역 프라이머 또는 더욱 특이적 프라이머에 의해 개시될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, PCR은 또한, 항체 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 DNA 클론을 분리하는데 사용될 수 있다. 이러한 경우, 라이브러리는 콘센서스 프라이머 또는 더 큰 상동성 프로브 예컨대, 마우스 불변 영역 프로브에 의해 스크리닝될 수 있다.
예를 들어, 재조합 DNA 기법과 관련하여 상기 참조문헌에서 상세히 기술된 널리 공지된 표준 기법에 따라 제한 맵핑되고 시퀀싱된 DNA 전형적으로, 플라스미드 DNA는 당해분야에 공지된 기법을 사용하여 세포로부터 분리될 수 있다. 물론, DNA는 분리 과정 또는 후속 분석 동안 임의의 시점에서 본 발명에 따라 합성될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VH)을 엔코딩하는 핵산을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나 이들로 구성된 분리된 폴리누클레오티드로서, 중쇄 가변 영역의 CDR중 하나 이상 또는 중쇄 가변 영역의 VH-CDR중 2개 이상은 본원에 기술된 항체로부터의 기준의 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 또는 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 폴리누클레오티드를 제공한다. 대안적으로, VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역은 본원에 기술된 항체로부터의 기준의 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3와 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서, 본 구체예에 따르면, 본 발명의 중쇄 가변 영역은 표 4에 기재된 폴리펩티드 서열과 관련된 VH-CDR1, VH-CDR2 또는 VH-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 엔코딩하는 핵산을 포함하거나, 이러한 핵산으로 구성되거나 필수적으로 구성된 분리된 폴리누클레오티드로서, 경쇄 가변 영역의 VL-CDR중 하나 이상 또는 경쇄 가변 영역의 VL-CDR중 2개 이상은 본원에 기술된 항체로부터의 기준의 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 폴리누클레오티드를 제공한다. 대안적으로, VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역은 본원에 기술된 항체로부터의 기준의 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3와 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서, 본 구체예에 따르면, 본 발명의 경쇄 가변 영역은 표 4에 기재된 폴리펩티드 서열과 관련된 VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VH)을 엔코딩하는 핵산을 포함하거나, 이러한 핵산으로 구성되거나 필수적으로 구성된 분리된 폴리누클레오티드로서, VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역은 표 4에 기재된 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3와 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리누클레오티드를 제공한다.
당해분야에 공지된 바와 같이, 두개의 폴리펩티드 또는 두개의 폴리누클레오티드 사이의 "서열 동일성"은 하나의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 아미노산 또는 핵산 서열을 제 2 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 서열과 비교함으로써 결정된다. 본원에 논의된 바와 같이, 임의의 특정 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드와 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한지의 여부는 비제한적으로, BESTFIT 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)과 같은 당해분야에 공지된 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어를 이용하여 결정될 수 있다. BESTFIT는 스미스 및 워터맨 (Smithe and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981))의 로컬 상동성 알고리즘을 사용하여 두 서열간의 가장 우수한 상동성 세그먼트를 발견한다. 특정 서열이 본 발명에 따른 기준 서열과 예를 들어, 95% 동일한지의 여부를 결정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하는 경우, 파라미터는 물론, 동일율이 기준 폴리펩티드 서열 전체 길이에 걸쳐 계산되고, 기준 서열에서의 아미노산의 전체 수의 5% 이하의 상동성 갭이 허용되도록 세팅된다.
표 5. 네오에피토프 특이적 항체의 VH 영역의 폴리누클레오티드 서열
Figure 112009047738293-PCT00006
Figure 112009047738293-PCT00007
표 6. 네오에피토프 특이적 항체의 VL 영역의 폴리누클레오티드 서열
Figure 112009047738293-PCT00008
Figure 112009047738293-PCT00009
이와 관련하여, 당업자는 경쇄 및/또는 중쇄의 적어도 가변 도메인을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 둘 모두의 면역글로불린 사슬 또는 단지 하나의 면역글로불린 사슬의 가변 도메인을 엔코딩할 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 마찬가지로, 상기 폴리누클레오티드는 동일한 프로모터의 조종하에 있을 수 있거나, 발현을 위해 별도로 조종될 수 있다. 원핵 숙주 세포에서 발현을 허용하는 가능한 조절 엘리먼트는 예를 들어, E.coli에서 PL, lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함하며, 원핵 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 조절 엘리먼트의 예로는 효모에서의 AOX1 또는 GAL1 프로모터, 또는 포유동물 및 기타 동물 세포에서의 CMV-, SV40-, RSV-프로모터, CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 글로빈 인트론이 있다. 전사 개시를 유도하는 엘리먼트 이외에, 이러한 조절 엘리먼트는 또한, 폴리누클레오티드의 다운스트림의 전사 종료 시그널 예컨대, SV40-폴리-A- 부위 또는 tk-폴리-A 부위를 포함할 수 있다. 게다가, 사용된 발현 시스템에 따라, 폴리펩티드를 세포 구획으로 유도할 수 있거나 이를 배지로 분비할 수 있는 리더 서열이 본 발명의 폴리누클레오티드의 코딩 서열에 부가될 수 있으며, 이는 당해분야에 널리 공지되어 있다. 리더 서열(들)은 번역, 개시 및 종결 서열과 적합한 상으로 조립되며, 바람직하게는, 번역된 단백질과 또는 이의 일부의 주변세포질 공간 또는 세포외 배지로의 분비를 유도할 수 있는 리더 서열과 조립된다. 선택적으로, 이종성 서열은 목적하는 특징 예를 들어, 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 간단화된 정제를 부여하는 C- 또는 N-말단 확인 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 엔코딩할 수 있다. 이러한 상황에서, 적합한 발현 벡터 예컨대, Okayama-Berg cDNA 발현 벡터 pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen), 또는 pSPORT1 (GIBCO BRL)이 당해분야에 공지되어 있다. 바람직하게는, 발현 조종 서열은 진핵 숙주 세포를 형질변환 또는 트랜스펙션시킬 수 있는 벡터중의 진핵 프로모터 시스템일 것이며, 원핵 숙주에 대한 조종 서열이 또한 사용될 수 있다. 벡터가 적합한 숙두로 혼입되면, 숙주는 누클레오티드 서열의 높은 수준의 발현에 적합한 조건하에서 유지되며, 필요에 따라, 면역글로불린 경쇄, 중쇄, 경쇄/중쇄 다이머 또는 본래의 항체, 결합 단편 또는 다른 면역글로불린 형태의 수집 및 정제가 수행될 수 있다; 예를 들어, 문헌 [Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979)] 참조.
본 발명은 또한, 다른 곳에 기술된 바와 같은 본 발명의 폴리누클레오티드의 단편을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 융합 폴리누클레오티드, Fab 단편 및 기타 유도체를 엔코딩하는 추가적인 폴리누클레오티드는 또한 본원에서 고찰된다.
폴리누클레오티드는 당해분야에 공지된 방법에 의해 생성되거나 조작될 수 있다. 예를 들어, 항체의 누클레오티드 서열이 공지된 경우, 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고누클레오티드로부터 조립될 수 있으며 (예를 들어, 문헌 [Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)]에 기술되어 있음), 이는 간략하게는, 항체를 엔코딩하는 서열의 일부를 함유하는 올리고누클레오티드를 중복하고, 이들 올리고누클레오티드를 어닐링시키고 결찰시킨 후, PCR에 의해 결찰된 올리고누클레오티드를 증폭시키는 합성법에 관한 것이다.
대안적으로, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 적합한 공급원으로부터의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 특정 항체를 엔코딩하는 핵산을 함유하는 클론이 입수될 수 없으나, 항체 분자의 서열이 공지된 경우, 항체를 엔코딩하는 핵산은, 서열의 3' 및 5' 말단으로 하이브리드화가능한 합성 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시키거나 예를 들어, 항체를 엔코딩하는 cDNA 라이브러리로부터 cDNA 클론을 확인하기 위한 특정 유전자 서열에 대해 특이적인 올리고누클레오티드 프로브를 사용하여 클로닝함으로써 화학적 합성하거나 적합한 공급원 (예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 이로부터 생성된 cDNA 라이브러리, 또는 핵산, 바람직하게는, 이로부터 분리된 폴리 A+RNA, 네오항원-특이적 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예컨대, 항체를 발현시키기 위해 선택된 하이브리도마 세포)으로부터 수득될 수 있다. 그 후, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 당해분야에 널리공지된 방법을 이용하여 복제가능한 클로닝 벡터로 클로닝될 수 있다.
항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 누클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열이 결정되면, 이의 누클레오티드 서열은 누클레오티드 서열의 조작에 대해 당해분야에 널리 공지된 방법 예를 들어, 재조합 DNA 기법, 부위 특이적 돌연변이 유발, PCR 등 (예를 들어, 본원에 그 전체가 참조로서 통합된 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) and Ausubel et al., eds., Current Protocols im Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998)] 참조)을 이용하여 조작되어 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성시키며, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 유도할 수 있다.
V. 항체 폴리펩티드의 발현
본 발명은 또한, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 벡터를 갖는 세포를 유전자적으로 조작하는 것을 포함하여, 본 발명의 항체 또는 이의 상응하는 면역글로불린 사슬(들)을 발현할 수 있는 세포를 생성시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 세포는 예를 들어, 본 발명의 항체와 이의 항원의 상호작용을 시험하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 제공하기 위한 분리된 유전자 물질을 조작한 후, 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 전형적으로, 목적하는 양의 항체를 생성시키는데 사용될 수 있는 숙주 세포로 혼입시키기 위한 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
항체, 또는 이의 단편, 유도체 또는 유사체, 예를 들어, 본원에 기술된 표적 분자에 결합하는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 재조합 발현. 본 발명의 항체 분자, 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이의 일부 (바람직하게는, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 함유)를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 수득되면, 항체 분자의 생성을 위한 벡터는 당해분야에 널리 공지된 기법을 이용하여 재조합 DNA 기법에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 누클레오티드 서열을 엔코딩하는 항체를 함유하는 폴리누클레오티드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 당업자에게 널리 공지된 방법이 항체 코딩 서열 및 적합한 전사 및 번역 조종 시그널을 함유하는 박현 벡터를 작제하는데 이용될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 실험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체 분자, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 엔코딩하는, 프로모터에 작동적으로 연결된 누클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 항체 분자의 불변 영역을 엔코딩하는 누클레오티드 서열 (예를 들어, PCT 공개 WO 86/05807; PCT 공개 WO 89/01036; 및 U.S. 특허 5,122,464 참조)을 포함할 수 있으며, 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위해 이러한 벡터로 클로닝될 수 있다.
본 발명은 임의적으로 본 발명의 항체의 다른 면역글로불린 사슬의 가변 도메인을 엔코딩하는 본 발명의 폴리누클레오티드와 함께, 항원을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 또는 바람직하게는, 본 발명의 항체의 면역글로불린 사슬의 가변 도메인을 포함하는 통상적으로 유전자 조작에 사용되는 벡터, 특히 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파아지에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 벡터는 발현 벡터 및/또는 유전자 트랜스퍼 또는 표적화 벡터이다. 바이러스 예컨대, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 보바인 파필로마 바이러스로부터 유래된 발현 벡터는 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 벡터를 표적화된 세포 군집에 전달하는데 사용될 수 있다. 당업자에게 널리 공지된 방법은 재조합 바이러스 벡터를 작제하는데 사용될 수 있다; 예를 들어, 문헌 [Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)] 참조. 대안적으로, 본 발명의 폴리누클레오티드 및 벡터는 표적 세포로 전달하기 위한 리포좀으로 재구성될 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드 (예를 들어, 면역글로불린 사슬 엔코딩 서열 및 발현 조종 서열의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인(들))를 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 상이한 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포로 이동될 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 트랜스펙션은 원핵 세포에 주로 이용되는 반면, 인산칼슘 처리 또는 전기천공법은 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다: 상기 삼브룩 문헌 참조.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 숙주 세포로 목적하는 유전자를 도입시키고 발현시키기 위한 비히클로서 본 발명에 따라 사용된 벡터를 나타내는 것으로 본원에 사용된다. 당업자에게 공지된 것으로 이러한 벡터는 플라스미드, 파아지, 바이러스 및 레트로바이러스로 구성된 군으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명과 양립되는 벡터는 선택 마커, 목적하는 유전자의 클로닝을 촉진하는 적합한 제한 부위, 및 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 유입 및/또는 복제하는 능력을 포함할 것이다.
본 발명의 목적을 위해서, 많은 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터의 한 부류는 동물 바이러스 예컨대, 보빈 파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 바쿨로바이러스, 레트로바이러스 (RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스로부터 유래된 DNA 엘리먼트를 사용한다. 다른 것은 내부 리보좀 결합 부위를 갖는 폴리시스트론 시스템의 사용을 포함한다. 추가적으로, DNA를 이들의 크로모좀으로 삽입시킨 세포는 트랜스펙션된 숙주 세포의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선택될 수 있다. 마커는 보조영양적 숙주에 대한 프로토트로피 (prototrophy), 살생제 내성 (예를 들어, 항생제) 또는 중금속 예컨대, 구리에 대한 내성을 위해 제공될 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접적으로 연결되거나, 공동형질변환에 의해 동일한 세포로 유입될 수 있다. mRNA의 최적의 합성을 위해 추가적인 엘리먼트가 또한 필요할 수 있다. 이들 엘리먼트는 시그널 서열, 스플라이스 시그널 및 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 시그널을 포함할 수 있다.
특히 바람직한 구체예에서, 클로닝된 가변 영역 유전자는 상기 기술된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자 (바람직하게는, 인간) 합성물과 함게 발현 벡터로 삽입된다. 일 구체예에서, 이는 NEOSPLA로서 언급된 Biogen IDEC, Inc. 소유의 발현 벡터를 사용하여 수행된다 (U.S. 특허 6,159,730에 기술됨). 본 벡터는 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서, 마우스 베타 글로빈 주요 프로모터, 복제의 SV40 오리진, 보빈 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 엑손 1 및 엑손 2, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자 및 리더 서열을 함유한다. 이러한 벡터는 가변 및 불변 영역 유전자의 혼입, CHO 세포에서의 트랜스펙션 및 이어서, G418 함유 배지에서의 선택 및 메토트렉세이트 증식시 항체의 매우 높은 수준의 발현을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 물론, 진핵 세포에서 발현을 유도할 수 있는 발현 벡터가 본 발명에 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예로는 비제한적으로, 플라스미드 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1 및 pZeoSV2 (인비트로겐 (Invitrogen, San Diego, CA)로부터 입수가능), 및 플라스미드 pCI (프로메가 (Promega, Madison, WI)로부터 입수가능)를 포함한다. 일반적으로, 적합하게는 높은 수준의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 발현하는 벡터에 대한 많은 수의 유전자 이식된 세포를 스크리닝하는 것은 예를 들어, 로보트 시스템에 의해 수행될 수 있는 일정한 실험이다. 벡터 시스템은 그 전체에 본원에 참조로서 통합된 U.S. 특허 5,736,137 및 5,658,570에 교시되어 있다. 이러한 시스템은 높은 발현 수준 예를 들어, > 30pg/세포/일을 제공한다. 다른 예시적 벡터 시스템물은 예를 들어, U.S. 특허 6,413,777에 기술되어 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 본원에 그 전체가 통합된 미국특허 출원 공개 번호 2003-0157641 A1 (2002년 11월 18일 출원)에 기술된 것과 같은 폴리시스트론 작제물을 이용하여 발현될 수 있다. 이러한 신규한 발현 시스템에서, 항체의 중쇄 및 경쇄와 같은 흥미로운 다중 유전자 생성물이 단일 폴리시스트론 작제물로부터 생성될 수 있다. 이들 시스템은 유리하게는, 비교적 높은 수준의 항체를 제공하기 위해 내부 리보좀 유입 부위 (internal ribosome entry site; IRES)를 이용한다. 적합한 IRES 서열은 본원에 또한 통합된 U.S. 특허 6,193,980에 기술되어 있다. 당업자는 이러한 발현 시스템이 본 출원에 기재된 전체 범위의 항체를 효과적으로 생성하는데 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
더욱 일반적으로, 일단 항체의 모노머 서브유닛을 엔코딩하는 DNA 서열 또는 벡터가 준비되면, 발현 벡터는 적합한 숙주 세포로 도입될 수 있다. 플라스미드의 숙주 세포로의 도입은 당업자에게 널리 공지된 다양한 기법으로 달성될 수 있다. 이러한 기법으로는 비제한적으로, 트랜스펙션 (전기영동법 및 전기천공법 포함), 원형질체 융합, 인산칼슘 침전, 엔벨로핑된 DNA와의 세포 융합, 미세주입, 및 고유의 바이러스로의 감염을 포함한다. 문헌 [Ridgway, A.A.G. "Mammalian Expression Vectors" Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds., Butterworths, Boston, Mass., Chapter 24.2, pp. 470-472 (1988)] 참조. 전형적으로, 숙주로의 플라스미드 도입은 전기천공을 통해 이루어 진다. 발현 작제물을 잠복하고 있는 숙주 세포는 경쇄 및 중쇄의 생성에 적합한 조건하에서 성장되며, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해 분석된다. 예시적인 분석 기법은 효소-연결된 면역흡착법 (ELISA), 방사면역측정 (RIA) 또는 형광-활성화된 세포 분석 (FACS), 면역조직화학법 등을 포함한다.
발현 벡터는 통상적인 기법에 의해 숙주 세포로 이동되며, 트랜스펙션된 세포가 통상적인 기법에 의해 배양되어 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 항체를 생성시킨다. 따라서, 본 발명은 이종성 프로모터에 작동적으로 연결된, 본 발명의 항체, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 이중쇄 항체의 발현에 바람직한 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 엔코딩하는 벡터는 하기 기술된 바와 같은 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위한 숙주 세포에 공동 발현될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 벡터로 형질변환된 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 숙주 세포에 존재하는 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 벡터는 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있거나, 염색체외적으로 유지될 수 있다. 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포 예컨대, 박테리아, 곤충, 진균류, 식물, 동물 또는 인간 세포일 수 있다. 바람직한 진균 세포는 예를 들어, 속 사카로마이세스 (Saccharomyces), 특히, 종 S. 세레비시애 (S. cerevisiae)의 세포이다. 용어 "원핵"은 본 발명의 항체 또는 상응하는 면역글로불린 사슬의 발현을 위한 DNA 또는 RNA 분자로 형질변환 또는 트랜스펙션될 수 있는 모든 박테리아를 포함하는 것을 의미한다. 원핵 숙주는 그람 네거티브 및 그람 파지티브 박테리아 예를 들어, E.coli, S. 티피무리움 (S. typhimurium), 세라티아 마르세스센스 (Serratia marcescens) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)를 포함할 수 있다. 용어 "진핵"은 효모, 고등 식물, 곤충 및 바람직하게는, 포유동물 세포, 가장 바람직하게는, HEK 293, NSO 및 CHO 세포를 포함하는 것을 의미한다. 재조합 생성 과정에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 항체 또는 면역글로불린 사슬이 글리코실화되거나 비글리코실화될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 상응하는 면역글로불린 사슬이 또한 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 당업자에게 통상적으로 공지된 임의의 기법을 이용하여 숙주를 형질변환 또는 트랜스펙션시키는데 사용될 수 있다. 또한, 융합되고 작동적으로 연결된 유전자를 제조하고, 예를 들어, 포유동물 세포 및 박테리아에서 이를 발현시키는 방법은 당해분야에 널리 공지되어 있다 (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 본원에 기술된 유전자 작제물 및 방법은 진핵 또는 숙주 세포에서 본 발명의 항체 또는 상응하는 면역글로불린 사슬의 발현에 이용될 수 있다. 일반적으로, 삽입된 폴리누클레오티드의 효과적인 전사를 촉진하는 프로모터 서열을 함유하는 발현 벡터는 숙주와 관련하여 사용된다. 발현 벡터는 전형적으로, 복제 오리진, 프로모터, 및 종결제, 및 형질변환된 세포의 표현형 선택을 제공할 수 있는 특이적 유전자를 함유한다. DNA 서열에 적합한 공급원 세포 및 면역글로불린 발현 및 분비를 위한 숙주 세포는 많은 공급원 예컨대, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 수득될 수 있다 (본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 ["Catalogue of Cell Lines and Hybridoms," Fifth edition (1985) Rockville, Maryland, U.S.A.]). 또한, 본 발명의 세포를 포함하는 유전자 이식 동물, 바람직하게는, 포유류가 본 발명의 항체의 대량 생산을 위해 사용될 수 있다.
따라서, 추가의 구체예에서, 본 발명은 질환 관련 단백질 특이적 결합 분자 예를 들어, 항체 또는 이의 결합 단편 또는 면역글로불린(들)을 생성하는 방법으로서,
(a) 상기 기술된 세포를 배양하고;
(b) 배양물로부터 상기 항원, 결합 분자, 항체 또는 이의 결합 단편 또는 면역글로불린 사슬(들)을 분리하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
형질변환된 숙주는 발효기에서 성장하고, 최적의 세포 성장을 달성하기 위해 당해분야에 공지된 기법에 따라 배양될 수 있다. 일단 발현되면, 본 발명의 전체 항체, 이들의 다이머, 개별 경쇄 및 중쇄, 또는 다른 면역글로불린 형태가 황산암모늄 침전, 친화도 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당해분야의 표준 공정에 따라 정제될 수 있다: 문헌 [Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982)] 참조. 그 후, 본 발명의 항체 또는 이의 상응하는 면역글로불린 사슬(들)이 성장 배지, 세포 용해물 또는 세포 막 분획물로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합적으로 발현된 항체 또는 면역글로불린 사슬의 분리 및 정제는 임의의 통상적인 수단 예를 들어, 조제용 크로마토그래피 분리법 및 면역학적 분리법 예컨대, 예를 들어, 본 발명의 항체의 불변 영역에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 사용을 포함하는 수단에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 항체가 예를 들어, 약물 표적화 및 이미지화 적용을 위해 다른 부분에 추가로 결합될 수 있다는 것은 당업자에게 자명해질 것이다. 이러한 결합은 부착 부위에 대한 항원 또는 항체 또는 결합 생성물의 발현이 DNA 수준으로 본 발명의 항체 또는 항원으로 조작된 후, 화학적으로 수행될 수 있다. 그 후, DNA는 적합한 숙주 시스템에서 발현되고, 발현된 단백질이 수집되고 필요에 따라 재생된다.
약제학적 용도를 위해, 적어도 약 90 내지 95% 상동성의 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하고, 98 내지 99% 또는 그 초과의 상동성이 가장 바람직하다. 요망하는 바에 따른 상동성을 또는 부분적으로 정제되면, 이후 항체는 치료적으로(체외적인 것을 포함) 또는 검정 절차를 진행하고 수행하는 데 사용될 수 있다.
숙주 세포는 본 발명의 두 개의 발현 벡터, 즉 중쇄 유래된 폴리펩티드를 엔코딩하는 제 1 벡터, 및 경쇄 유래된 폴리펩티드를 엔코딩하는 제 2 벡터로 코-트랜스펙션될 수 있다. 두 벡터는 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 다르게는, 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두를 엔코딩하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 상황에서, 경쇄는 과잉의 독성 비함유 중쇄를 피하기 위해 중쇄 앞에 위치하는 것이 유리하다(Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)). 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 구성된 벡터를 지니며, 하나 이상의 이종 유전자를 엔코딩하는 세포를 나타낸다. 재조합 숙주로부터 항체를 분리하기 위한 공정을 기술함에 있어서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은 명백하게 다르게 언급하지 않는 한, 항체 공급원을 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 즉, "세포"로부터 폴리펩티드의 회수는 스핀 다운(spin down)된 전 세포로부터, 또는 배지 및 현탁된 세포 둘 모두를 함유하는 세포 배양물로부터의 폴리펩티드 회수를 의미할 수 있다.
다양한 숙주 발현 벡터 시스템이 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 항체 분자를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 숙주 발현 시스템은 주목되는 코딩 서열이 생성되고, 이후 정제될 수 있는 비히클을 나타낼 뿐만 아니라, 적합한 누클레오티드 코딩 서열로 형질변환되거나 트랜스펙션되는 경우에, 본 발명의 항체 분자를 제자리에서 발현시킬 수 있는 세포를 나타낼 수 있다. 이러한 시스템은 항체 코딩 서열을 함유하는, 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DAN, 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질변환된 박테리아(예를 들어, E. coli, B. subtilis); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질변환된 효모(예를 들어, Saccharomyces, Pichia); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus, CaMV); 담배 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus, TMV))로 감염되거나, 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질변환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 레이트(late) 프로모터; 백시나 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래된 프로모터를 함유하는 재조합 발현 작제물을 지닌 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BLK, 293, 3T3 cells)과 같은 미생물을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)와 같은 박테리아 세포, 보다 바람직하게는, 특히 전 재조합 항체 분자의 발현을 위해 진핵 세포가 재조합 항체 분자의 발현에 사용된다. 예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유 동물 세포가 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 조기 유전자 프로모터 엘리먼트와 같은 벡터와 함께 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다(Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al, Bio/Technology 8:2 (1990)).
단백질 발현을 위해 사용되는 숙주 세포주는 종종 포유동물 기원이며, 당업자들은 그 안에서 발현되어야 하는 요망된 유전자 산물에 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 우선적으로 결정할 수 있는 능력이 있는 것으로 여겨진다. 예시적인 숙주 세포주는 CHO(중국 햄스터 난소), DG44 및 DUXB11(중국 햄스터 난소 세포주, DHFR 공제), HELA(인간 자궁경부 암종), CVI(원숭이 신장 세포주), COS(SV40 T 항원과의 CVI의 유도체), VERY, BHK(새끼 햄스터 신장), MDCK, 293, WI38, R1610(중국 햄스터 섬유아세포), BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 골수종), P3x63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(우 내피 세포), RAJI(인간 림프구) 및 293(인간 신장)을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. CHO 세포가 특히 바람직하다. 숙주 세포주는 일반적으로 상업적 서비스업체인 디 아메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션(The American Tissue Culture Collection) 또는 공개된 문헌으로부터 입수가능하다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 요망되는 특정 형태로 유전자 생성물을 변형하고 처리하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 처리(예를 들어, 분해)는 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 후전사 처리 및 변형에 대한 특징적이고, 특이적인 메카니즘을 갖는다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현된 외래 단백질의 올바른 변형 및 처리를 보장하도록 선택될 수 있다. 이러한 목적으로, 유전자 생성물의 1차 전사, 글리코실화 및 포스포릴화의 적합한 처리를 위한 세포 기계(cellular machinery)를 지닌 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다.
재조합 단백질의 장기간 고수율 생성을 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정하게 발현시키는 세포주가 조작될 수 있다. 복제 기원 바이러스를 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다는, 숙주 세포는 적합한 발현 조종 엘리먼트(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종료체, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택가능한 마커에 의해 조종되는 DNA로 형질변환될 수 있다. 외래 DNA의 도입후, 조작된 세포는 농축 배지 중에서 1-2일 동안 성장되도록 될 수 있으며, 이후 선택적 배지로 변환된다. 재조합 플라스미드의 선택가능한 마커는 선택에 대해 내성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 염색체로 안정하게 통합되고, 성장하여 병소를 형성하게 하고, 이는 클로닝되고 세포주로 확대될 수 있다. 이러한 방법은 항체 분자를 안정하게 발현시키는 세포주를 조작하는 데 유리하게 사용될 수 있다.
다수의 선택 시스템이 사용될 수 있으며, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제(Wigler et al, Cell 11:223 (1977)), 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy et al., Cell 22:817 1980)를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니며, 유전자는 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포로 사용될 수 있다. 또한, 대사 길항제 내성이 하기 유전자에 대해 선택적으로 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 dhfr(Wigler et al, Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1527 (1981)); 미코페놀산에 내성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코시드에 내성을 부여하는 neo(G-418 Clinical Pharmacy 72:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 5:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. (52:191-217 (1993); TIB TECH ll(5):155-215 (May, 1993)); 및 히그로마이신에 내성을 부여하는 hygro(Santerre et al, Gene 30:147 (1984)). 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 당해 통상적으로 공지되어 있는 방법은 그 전부가 본원에 참조로 통합되는 문헌(Ausubel et al (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al, J. MoI. Biol. 150:1 (1981))에 기술되어 있다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증대될 수 있다(참고예: Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987)). 항체를 발현하는 벡터 시스템내 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제의 수준 증가는 마커 유전자의 복사체의 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체 유전자와 관련있기 때문에, 항체의 생성 또한 증가할 것이다(Crouse et al, MoI. Cell. Biol. 3:257 (1983)).
시험관내 생성은 많은 양의 요망되는 폴리펩티드를 제공하도록 규모를 증대시킨다. 조직 배양 조건 하에서 포유 동물 세포의 배양 기술은 당해 공지되어 있으며, 예를 들어, 에어리프트(airlift) 반응기 또는 연속 교반 반응기에서의 균질 현탁액 배양, 또는 예를 들어 중공 섬유, 마이크로캡슐에서, 아가로스 마이크로비즈 또는 세라믹 카트리지 상에서의 부동화되거나 엔트랩핑된 세포 배양을 포함한다. 필요에 따라 및/또는 요망에 따라, 폴리펩티드 용액은 예를 들어 합성 힌지 영역 폴리펩티드의 우선적 생합성 후에 또는 본원에 기술된 HIC 크로마토그래피 단계 전 또는 후에, 예를 들어, 겔 투과, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로스 상에서의 크로마토그래피 또는 (면역-)친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
또한, 본 발명의 유전자 엔코딩 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 박테리아 또는 곤충 또는 효모 또는 식물 세포와 같은 발현된 비포유동물 세포일 수 있다. 핵산을 용이하게 취할 수 있는 박테리아는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 또는 살모넬라(Salmonella)의 균주와 같은 엔테로박테리아세아에; 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실라세아에(Bacillaceae); 뉴모코쿠스(Pneumococcus); 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 및 하에모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)의 일원을 포함한다. 또한, 박테리아에서 발현되는 경우, 이종 폴리펩티드가 일반적으로 봉입체(inclusion body)의 일부가 되는 것으로 인지되어야 할 것이다. 이종 폴리펩티드는 분리되고, 정제된 후, 기능성 분자로 회합되어야 한다. 4가 형태의 항체가 요망되는 경우, 서브유닛은 이후 4가 항체로 자가 회합될 것이다(WO 02/096948 A2).
박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터는, 발현되는 항체 분자에 대해 의도되는 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 이러한 단백질이 다량 생성되어야 하는 경우, 항체 분자의 약제 조성물을 생성하기 위해, 용이하게 정제되는, 높은 수준의 융합 단백질 생성물 발현을 유도하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는 항체 코딩 서열이 개별적으로 lacZ 코딩 영역을 지닌 프레임내 벡터로 결찰됨으로써 융합 단백질이 생성되는 E. coli 발현 벡터 pUR278 (Ruther et al, EMBO J. 2:1791 (1983)); pIN 벡터(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 73:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); 등을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, pGEX 벡터는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와 함께 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고, 매트릭스 글루타티온-아가로스 비즈로의 흡착 및 결합 후 유리 글루타디온의 존재하에서의 용리에 의해 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자(Xa) 프로테아제 분해 부위를 포함하도록 설계됨으로써 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 부분으로부터 분리될 수 있다.
원핵 생물 이외에, 진핵 생물 미생물이 사용될 수도 있다. 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상의 베이커용 효모가 진핵 생물 미생물 중에서 가장 보편적으로 사용되나, 예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 다수의 다른 균주도 통상적으로 입수가능하다.
사카로마이세스에서의 발현을 위해, 예를 들어 플라스미드 YRp7(Stinchcomb et al, Nature 252:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al, Gene 10:157 (1980))가 보편적으로 사용된다. 상기 플라스미드는 이미 TRPl 유전자를 함유하고 있으며, 이 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여되어 있는 효모의 변형 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 (1977))에 선택적인 마커를 제공한다. 이후, 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trpl 병변의 존재가 트립토판의 부재 하에서의 성장에 의해 형질변환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
곤충 시스템에서, 오토그라파 캘리포니카 핵 다면체 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus: AcNPV)가 외래 유전자를 발현시키는 벡터로서 일반적으로 사용된다. 상기 바이러스는 스포돕테라 프루기퍼다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열은 바이러스의 비필수적 영역(예를 들어, 다각체 유전자)로 개별적으로 클로닝되어, AcNPV 프로모토(예를 들어, 다각체 프로모터)의 조절 하에 놓일 수 있다.
본 발명의 항체 분자가 재조합적으로 발현되면, 예를 들어, 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화성, 특히 프로테인 A(Protein A) 다음의 특이적 항체에 대한 친화성에 의해, 그리고 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 시차 용해도에 의한 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당해 공지되어 있는 임의의 방법에 의해, 또는 단백질 정제를 위한 그 밖의 임의의 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체의 친화성을 증대시키기 위한 바람직한 방법이 US 2002 0123057 Al에 기술되어 있다.
VI. 융합 단백질 및 컨쥬게이트
본 발명의 항체는 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 연결된 추가의 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 연결은 당해 공지되어 있으며, 상기 기술되어 있는 방법에 따른 유전자 융합에 기초하거로, 예컨대 국제 출원 WO 94/04686에 기술되어 있는 바와 같이 예를 들어 화학적 가교에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 항체를 포함하는 융합 단백질에 존재하는 추가의 도메인은 바람직하게는 유연한 링커, 유리하게는 폴리펩티드 링커에 의해 연결될 수 있으며, 여기서 상기 폴리펩티드 링커는 상기 추가 도메인의 C-말단과 본 발명의 항체의 N-말단 사이의 간격, 또는 그 반대의 간격에 미치기에 충분한 길이의 다수개의 친수성 펩티드 결합된 아미노산을 포함한다. 치료적 또는 진단적 활성제가 본 발명의 항체에 또는 이의 항원 결합 단편에 여러 수단에 의해 결합될 수 있다. 이는 예를 들어, 펩티드 결합과 같은 공유 방법에 의해 치료적 또는 진단적 활성제에 결합되는 본 발명의 항체의 가변 영역을 포함하는 단쇄 융합 단백질을 포함한다. 추가의 예는 추가의 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 적어도 항원 결합 단편을 포함하는 분자를 포함하며, 하기 비제한적 예시적 리스트에 있는 것들을 포함한다. 문헌(Traunecker, Int. J. Cancer Surp. SuDP 7 (1992), 51-52)은 CD3로 유도된 Fv 영역이 가용성 CD4 또는 OVCA 및 IL-7과 같은 그 밖의 리간드에 결합되는 이중 특이적 시제인 자누신(janusin)을 기술하고 있다. 유사하게, 본 발명의 항체의 가변성 영역은 Fv 분자로 구성되고, 인용된 논문에 예시되어 있는 것들과 같은 또 다른 리간드에 결합될 수 있다. 문헌(Higgins, J. Infect Disease 166 (1992), 198-202)은 GP120의 V3 영역의 특이적 서열에 대한 항체에 가교된 OKT3으로 구성된 헤테로-컨쥬게이트 항체를 기술하고 있다. 또한, 이러한 헤테로-컨쥬게이트 항체는 본 방법의 항체에 함유된 적어도 가변성 영역을 사용하여 구성될 수 있다. 특이적 항체의 추가적 예에는 문헌(Fanger, Cancer Treat. Res. 68 (1993), 181-194; 및 Fanger, Crit. Rev. Immunol. 12 (1992), 101-124)에 기술되어 있는 것들이 포함된다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 결합 분자, 항체, 면역글로불린 쇄 또는 이의 결합 단편 또는 항원은 검출가능하게 표지된다. 표지화제는 본 발명의 항체 또는 항원에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 간접 결합의 일 예는 스페이서 부분을 사용하는 것이다.
따라서, 결합 분자, 예컨대 확인된 항체의 생물학적 활성은, 이들 분자가 질병이 있는 세포 및 조직의 적합한 표면 구조를 각각 발현시키는 세포에 대한 약물 편재화를 위한 유망한 후보물질이 되게 하는 충분한 친화성을 지님을 시사한다. 이러한 세포에 대한 표적화 및 결합은 치료적 또는 진단적 활성제의 전달 및 유전자 치료/유전자 전달에 유용할 수 있다. 본 발명의 항체를 지닌 분자/입자는 병리학적 단백질의 변이체를 발현시키는 세포/조직에 특이적으로 결합하고, 이에 따라 진단적 및 치료적 용도를 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표지되어(예컨대, 형광, 방사선활성, 효소, 핵자기, 중금속), 생체내에서, 또는 시험관내 "면역화학"과 같은 검정을 포함하는 시험관내에서 특이적 표적을 검출하는데 사용될 수 있다. 생체내에서, 조직, 세포 또는 네오에피토프를 발현시키는 그 밖의 물질을 검출하기 위한 핵의학 영상 기술과 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 따라서, 추가의 구체예에서, 본 발명은 병리학적 화합물 또는 이의 체액으로부터의 전구체의 생체내 검출을 위한 조성물의 제조, 또는 뇌내 질환 관련 단백질에 대해 치료제 및/또는 진단제를 표적화하고, 병리학적 화합물 또는 이의 체액으로부터 전구체를 검출하고, 이의 형성을 억제하고, 피검체내 병리학적 단백질 응집물 또는 형태물(conformation)을 감소시키기 위한, 질병과 관련된 인지력을 개선시키거나 인지 장애를 지연 또는 반전시키기 위한, 병리학적 화합물 또는 이의 체액으로부터의 전구체의 체외 추출을 위한, 본 발명의 결합 분자 또는 항체 또는 이의 결합 단편을 용도에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 항체 폴리펩티드는 일반적으로 항체와 관련되지 않는 하나 이상의 부분 또는 아미노산 서열을 포함한다. 예시적 변형은 하기에서 보다 자세히 기술될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 단쇄 fv 항체 단편은 유연한 링커 서열을 포함하거나 작용성 부분(예컨대, PEG, 약물, 독소, 또는 표지)을 부가하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 항체 폴리펩티드는 융합 단백질을 포함하거나, 필수적으로 융합 단백질로 구성되거나, 융합 단백질로 이루어진다. 융합 단백질은, 예를 들어, 하나 이상의 표적 결합 부위를 갖는 면역글로불린 항원-결합 도메인 및 하나 이상의 이종 부분, 즉, 그것이 본래 자연적으로 연결되어 있지 않은 부분을 포함하는 키메라 분자이다. 아미노산 서열은 일반적으로 함께 융합 폴리펩티드에 도입되는 별도의 단백질에 존재하거나, 일반적으로 동일한 단백질에 존재할 수 있지만, 융합 폴리펩티드내 새로운 배열로 배치될 수도 있다. 융합 단백질은 예를 들어, 화학 합성에 의해, 또는 펩티드 영역이 요망되는 관계로 엔코딩되는 폴리누클레오티드를 생성시키고 전사시킴으로써 생성될 수 있다.
폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드에 대해 사용되는 용어 "이종"은 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드가 비교되는 나머지 실체로부터 차별되는 실체로 유래되는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유사체에 융합되는 "이종 폴리펩티드"는 동일한 종의 비면역글로불린 폴리펩티드 또는 상이한 종의 면역글로불린 또는 비면역글로불린 폴리펩티드로부터 유래된다.
본원의 다른 부분에서 보다 자세히 논의되어 있는 바와 같이, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 추가로 N- 또는 C-말단에서 이종 폴리펩티드에 재조합에 의해 융합되거나, 폴리펩티드 또는 그 밖의 조성물에 화학적으로 컨쥬게이트될 수 있다(공유 및 비공유 컨쥬게이트 포함). 예를 들어, 항체는 검출 검정에서 표지로서 유용한 분자 및 이종 폴리펩티드, 의약, 방사성누클라이드, 또는 독소와 같은 이펙터(effector) 분자에 재조합에 의해 융합되거나 컨쥬게이트될 수 있다(참조예: PCT 공개 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; U.S. 특허 제5,314,995호; 및 EP 제396,387호).
본 발명의 항체, 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합, 즉 펩티드 이소스테레(peptide isostere)에 의해 서로 결합된 아미노산으로 구성될 수 있으며, 20개의 유전자 엔코딩된 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다. 항체는 자연적인 과정, 예컨대 후전사 과정에 의해, 또는 당해 널리 공지되어 있는 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 베이직 텍스트(basic text)에 잘 기술되어 있으며, 전공논문에 보다 자세히 기술되어 있고, 방대한 연구 문헌에 잘 기술되어 있다. 변형은 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단, 또는 탄수화물과 같은 부분 상에서와 같이 항체 어디에서도 일어날 수 있다. 동일한 타입의 변형이 제시된 항체의 여러 부위에서 동일하게 또는 상이한 정도로 존재할 수 있는 것으로 인지될 것이다. 또한, 제시된 항체는 많은 타입의 변형을 함유할 수 있다. 항체는 예를 들어, 유비퀴틴화(ubiquitination)의 결과로서 분지될 수 있으며, 분지화가 있거나 없는 시클릭일 수 있다. 시클릭, 분지형 및 분지형 시클릭 항체는 후전사 자연적 과정으로부터 초래되거나, 합성 방법에 의해 이루어질 수 있다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, 헴(heme) 부분의 공유 결합, 누클레오티드 또는 누클레오티드 유도체의 공유 결합, 리피드 또는 리피드 유도체의 공유 결합, 포스포티딜리노시톨의 공유 결합, 가교, 고리화, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백질분해 과정, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 설페이트화, 아미노산의 단백질로의 트랜스퍼-RNA 매개된 부가(예컨대, 아르기닐화), 및 유비퀴틴화를 포함한다(참조예: Proteins - Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)).
또한, 본 발명은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체, 및 이종 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질은 본 발명의 항체의 하나 이상의 VH 영역의 아미노산 서열 또는 본 발명의 항체 또는 이의 단편 또는 변이체의 하나 이상의 VL 영역의 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드, 및 이종 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 이로 이루어진다. 또 다른 구체예에서, 본원에서 기술되는 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 융합 단백질은 항체, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체의 임의의 1, 2 또는 3개의 VH-CDR의 아미노산 서열, 또는 항체, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체의 임의의 1, 2 또는 3개의 VL-CDR의 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드, 및 이종 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 이로 이루어진다. 일 구체예에서, 융합 단백질은 본 발명의 항체, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체의 VH-CDR3의 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드, 및 이종 폴리펩티드 서열을 포함하며, 질병 관련된 단백질의 하나 이상의 네오에피토트에 특이적으로 결합한다. 또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 본 발명의 항체의 하나 이상의 VH 영역의 아미노산 서열 및 본 발명의 항체, 또는 이의 단편, 유도체 또는 변이체의 하나 이상의 VL 영역의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 이종 폴리펩티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 융합 단백질의 VH 및 VL 영역은 질병 관련된 단백질의 하나 이상의 네오펩티드와 특이적으로 결합하는 단일 공급원 항체(또는 scFv 또는 Fab 단편)에 상응한다. 또 다른 구체예에서, 본원에서 기술되는 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 융합 단백질은 항체의 임의의 1, 2, 3 또는 그 초과의 VH CDR의 아미노산 서열 및 항체, 또는 이의 단편 또는 변이체의 임의의 1, 2, 3 또는 그 초과의 VL CDR의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 이종 폴리펩티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 초과의 VH-CDR 또는 VL-CDR은 본 발명의 단일 공급 항체(또는 scFv 또는 Fab 단편)에 상응한다. 또한, 이러한 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자가 본 발명에 포함된다.
문헌에 보고되어 있는 예시적인 융합 단백질에는, T 세포 수용체(Gascoigne et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936-2940 (1987)); CD4 (Capon et al, Nature 337:525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 539:68-70 (1989); Zettmeissl etal, DNA Cell Biol. USA 9:347-353 (1990); and Byrn et al, Nature 344:667-670 (1990)); L-셀렉틴(L-Selectin)(호밍 수용체(homing receptor)) (Watson et al, J. Cell. Biol. 110:2221-2229 (1990); and Watson et al., Nature 349:164-167 (1991)); CD44 (Aruffo et al, Cell 61:1303-1313 (1990)); CD28 및 B7 (Linsley et al, J. Exp Med. 173:721-730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al, J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al, Cell 66:1133-1144 (1991)); TNF 수용체(Ashkenazi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:10535-10539 (1991); Lesslauer et al, Eur. J. Immunol. 27:2883-2886 (1991); and Peppel et al, J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991)); 및 IgE 수용체 a (Ridgway and Gorman, J Cell. Biol. Vol. 115, Abstract No. 1448 (1991))의 융합물이 포함된다.
본원의 다른 부분에서 논의되는 바와 같이, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 폴리펩티드의 생체내 반감기를 증가시키기 위해, 또는 당해 공지되어 있는 방법을 사용하여 면역검정에 사용하기 위해 이종 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, PEG는 생체내 반감기를 증가시키기 위해 본 발명의 항체에 컨쥬게이트될 수 있다(Leong, S.R., et al, Cytokine 16:106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); or Weir et al, Biochem. Soc. Transactions 30:512 (2002)).
또한, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 이의 정제 또는 검출을 용이하게 하기 위해 펩티드와 같은 마커 서열에 융합될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 마커 아미노산 서열은 특히 헥사-히스티딘 펩티드, 예컨대 pQE 벡터에 제시된 태그(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif, 91311)이며, 다수가 구입가능하다. 예를 들어, 문헌(Gentz et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989))에 기술되어 있는 바와 같이, 헥사-히스티딘은 편리한 융합 단백질 정제법을 제공한다. 정제에 유용한 그 밖의 펩티드 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 "HA" 태그(Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) 및 "flag" 태그를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
융합 단백질은 당해 널리 공지되어 있는 방법을 사용하여 제조될 수 있다(예를 들어, US 특허 제5,116,964호 및 제5,225,538호). 융합이 일어나는 정확한 부위는 융합 단백질의 분비 또는 결합 특징을 최적화하도록 실험에 의해 선택될 수 있다. 이후, 융합 단백질을 엔코딩하는 DNA가 발현을 위해 숙주 세포로 트랜스펙션된다.
본 발명의 항체는 비-컨쥬게이트된 형태로 사용되거나, 예를 들어, 분자의 치료적 특성을 개선시키기 위해, 표적 검출을 용이하게 하기 위해, 또는 영상화 또는 환자의 치료를 위해 여러 분자 중 하나 이상에 컨쥬게이트될 수 있다. 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 정제가 수행되는 경우, 정제 전 또는 후에 표지되거나 컨쥬게이트될 수 있다.
특히, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 치료제, 전구약물, 펩티드, 단백질, 효소, 바이러스, 리피드, 생물학적 반응 개질제, 약학적 제제 또는 PEG에 컨쥬게이트될 수 있다.
통상적인 항체를 포함하는 면역독소(immunotoxin)인 컨쥬게이트는 당해 널리 개시되어 있다. 이러한 독소는 통상적인 결합 기술에 의해 항체에 결합될 수 있거나, 단백질 독소 부분을 함유하는 면역독소는 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 본 발명의 항체는 이러한 면역독소를 수득하기 위한 상응하는 방법에 사용될 수 있다. 이러한 면역독소의 예는 문헌(Byers, Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70 및 Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54)에 기술된 것들이다.
상기 기술된 융합 단백질은 프로테이나제를 위한 분해가능한 링커 또는 분해 부위를 추가로 포함할 수 있다. 이어서, 이러한 스페이서 부분은 불용성이거나 가용성일 수 있으며(Diener et al, Science 231 (1986), 148), 표적 부위에서 항원으로부터 약물 방출이 가능하도록 선택될 수 있다. 면역요법을 위해 본 발명의 항체 및 항원에 결합될 수 있는 치료제의 예는 약물, 방사성동위원소, 렉틴, 및 독소이다. 본 발명의 항체 및 항원에 컨쥬게이트될 수 있는 약물은 미토마이신 C, 다우노루비신, 및 빈블라스틴과 같은 약물로서 분류 언급될 수 있는 화합물을 포함한다. 예를 들어, 면역요법을 위해, 본 발명의 방사성동위원소로 컨쥬게이트된 항체 또는 항원을 사용함에 있어서, 특정 동위원소가 안정성 및 방출율 뿐만 아니라 백혈구 분포와 같은 인자에 의존하는 다른 것들에 비해 보다 바람직할 수 있다. 자가면역 반응에 의존하여, 일부 방출물질이 다른 것들에 비해 바람직할 수 있다. 일반적으로, α 및 β 입자 방출 동위원소가 면역요법에 바람직하다. 212Bi와 같은 짧은 범위 고에너지 방출물질이 바람직하다. 치료 목적으로 본 발명의 항체 또는 항원에 결합될 수 있는 방사성동위원소의 예는 128I, 131I, 90Y, 67Cu, 64Cu, 212Bi, 212At, 211Pb, 47Sc, 109Pd 및 188Re을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 결합 분자, 예컨대, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합될 수 있는 그 밖의 치료제뿐만 아니라 생체외 및 생체내 치료 프로토콜이 공지되어 있거나, 당업자들에게 용이하게 확인될 수 있다. 경우에 따라, 당업자들은 그 자체로 단백질성 물질 대신에 상기 기술된 항체, 항원 또는 상응하는 벡터중 어느 하나를 엔코딩하는 본 발명의 폴리누클레오티드를 사용할 수 있다.
당업자들은, 컨쥬게이트가 또한 컨쥬게이트되는 선택된 제제에 따라 다양한 기술을 사용하여 회합될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 비오틴과의 컨쥬게이트는 결합 폴리펩티드를 예를 들어, 비오틴 N-히드록시석신이미드 에스테르와 같은 비오틴의 활성화된 에스테르와 반응시킴으로써 제조된다. 유사하게, 형광 마커와의 컨쥬게이트는 예를 들어, 본원에 기재되어 있는 것들과 같은 결합제의 존재 하에, 또는 이소티오시아네이트, 바람직하게는 플루오레세인-이소티오시아네트와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 컨쥬게이트는 유사한 방식으로 제조된다.
본 발명은 진단제 또는 치료제에 컨쥬게이트된 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 추가로 포함한다. 항체는 예를 들어, 소정의 치료 및/또는 예방 요법의 효능을 측정하기 위해 임상 시험 절차의 일부로서 신경성 질환의 발병 또는 진행을 모니터링하기 위해 진단적으로 사용될 수 있다. 검출은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 검출가능한 물질에 결합시킴으로써 용이하게 될 수 있다. 검출가능한 물질의 예는, 여러 효소, 보결분자단(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 바이오발광 물질, 방사성활성 물질, 다양한 양전자 방출 단층술을 이용하는 양전자 방출 금속, 및 비방사성활성 상자성 금속 이온을 포함한다(본 발명에 따른 진단법으로서 사용하기 위해 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 금속 이온에 대해서는 미국 특허 제4,741,900호를 참조하라). 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린스테라제를 포함하고; 적합한 보결분자단 착물의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀(luminol)을 포함하고; 바이오발광 물질의 예는 루시퍼라제(luciferase), 루시페린(luciferin), 및 애쿠오린(aequorin)을 포함하고, 적합한 방사성활성 물질의 예는 125I, 131I, 111In 또는 99Tc을 포함한다.
또한, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 이를 화학발광 화합물에 결합함으로써 검출가능하게 표지될 수 있다. 이후, 화학발광 태그된 항체의 존재는 화학 반응 과정 동안에 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 측정된다. 특히 유용한 화학발광 화합물의 예는 루미놀(luminol), 이소루미놀, 테로마틱(theromatic) 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르이다.
항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체가 검출가능하게 표지될 수 있는 방법 중 하나는 이를 효소에 동일하게 결합시키고, 효소 면역검정(enzyme immunoassay: EIA)에서 결합된 생성물을 사용하는 것이다(Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2:1-7 (1978)); Voller et al, J. Clin. Pathol. 57:507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FIa., (1980); Ishikawa, E. et al., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981). 항체에 결합되어 있는 효소는 예를 들어, 분광분석, 형광분석에 의해, 또는 시각적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학 부분을 생성하는 방식으로, 적합한 기질, 바람직하게는 색원체 기질(chromogenic substrate)과 반응할 것이다. 항체를 검출가능하게 표지하는 데 사용될 수 있는 효소에는 말레에이트 데히드로게나제(malate dehydrogenase), 스타필로코칼 누클레아제(staphylococcal nuclease), 델타-5-스테로이드 아이소머라제, 효모 알코올 데하이드로게나제, 알파-글리세로포스페이트, 데하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 아이소머라제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보누클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린스테라제가 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 검출은 효소에 대한 색원체 기질을 사용하는 비색법(colorimetric method)에 의해 달성될 수 있다. 또한, 검출은 유사하게 제조된 표준물질과 비교하여, 기질의 효소적 반응 정도를 시각적으로 비교하여 달성될 수 있다.
또한, 검출은 여러 다른 면역검정 중 어느 하나를 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 방사성활성 표지시킴으로써, 방사성면역검정(radioimmunoassay: RIA)의 사용에 의한 항체 검출이 가능하다[본원에 참조로 통합되는 문헌(Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (March, 1986) 참조]. 방사성활성 동위원소는 감마 계수기(gamma counter), 섬광 계수기(scintillation counter), 또는 오토라디오그래피(autoradiography)를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아닌 수단에 의해 검출될 수 있다.
또한, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 152Eu와 같은 형광 방출 금속, 또는 그 밖의 란타니드 계열을 사용하여 검출가능하게 표지될 수 있다. 이러한 금속은 디에틸렌트리아민펜트아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이트화기를 사용하여 항체에 부착될 수 있다.
다양한 부분을 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체에 컨쥬이트시키기 위한 기술은 널리 공지되어 있다(참조예: Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), and Thorpe et ah, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)).
특정 구체예에서, 결합 분자, 예를 들어, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 이의 면역특이적 단편의 안정성 또는 효능을 증진시키는 부분이 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, PEG는 생체내 반감기를 증가시키기 위해 본 발명의 결합 분자에 컨쥬게이트될 수 있다(Leong, S. R., et al, Cytokine 16:106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); 또는 Weir et al, Biochem. Soc. Transactions 50:512 (2002)).
VII. 조성물 및 사용 방법
또한, 본 발명은 상기 언급된 결합분자, 예컨대, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 화학적 유도체, 또는 본 발명의 폴리누클레오티드, 벡터 또는 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "화학적 유도체"는 일반적으로 기본 분자의 일부가 아닌 추가의 화학 부분을 함유하는 분자를 나타낸다. 이러한 부분은 기본 분자의 용해도, 반감기, 흡수율 등을 개선시킬 수 있다. 대안적으로, 상기 부분은 기본 분자의 바람직하지 않은 부작용을 약하게 하거나, 기본 분자의 독성을 감소시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 약제 조성물은 약제 조성물의 의도되는 용도에 따라 인터루킨 또는 인터페론과 같은 제제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 알츠하이머병의 치료에 사용하기 위한, 추가의 제제는 유기 소분자, 항-Abeta 항체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 알츠하이머병 진행의 치료 또는 예방을 위해; 알츠하이머병과 관련된 증상의 개선을 위해; 알츠하이머병의 존재에 대해 피검체를 진단 또는 스크리닝하기 위해; 알츠하이머병의 발병 위험이 있는 피검체를 결정하기 위해 약제 또는 진단 조성물을 제조하기 위한, 결합 분자, 예컨대 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이들 중 어느 하나의 실질적으로 동일한 결합 특이성을 지닌 결합 분자, 또는 본 발명의 폴리누클레오티드, 벡터 또는 세포의 용도에 관한 것이다. 상기 약제 조성물은 정맥내, 근내, 피하, 복강내, 비경구적으로 또는 에어로졸로서 투여되도록 고안될 수 있다(하기 참조).
따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 중추 신경계내 단백질의 비정상적 축적 및/또는 침착에 의해 특징되는 신경성 질환을 치료하는 방법으로서, 이러한 치료가 요망되는 피검체에게 치료 유효량의 본 발명의 상기 기술된 결합 분자, 항체, 항원, 폴리누클레오티드, 벡터 또는 세포 중 어느 하나를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
용어 "신경성 질환"은 알츠하이머병, 경도인지장애(mild cognitive impairment), 전측두엽성 치매(fronto-temporal dementia), 루이소체 질환(Lewy-body disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 피크병(Pick's disease), 빈스완거병(Binswanger's disease); 콩고레드 친화성 아밀로이드 맥관병증(congophilic amyloid angiopathy), 대뇌 아밀로이드 맥관병증(cerebral amyloid angiopathy), 다운 증후군(Down's syndrome), 다발 경색 치매(multi-infarct dementia), 헌팅톤병(Huntington's Disease), 크로이츠펠트 야콥병(Creutzfeldt-Jakob Disease), AIDS 치매 합병증(AIDS dementia complex), 우울증(depression), 불안 장애(anxiety disorder), 공포증(phobia), 벨 마비(Bell's Palsy), 간질(epilepsy), 뇌염(encephalitis), 다발성 경화증(multiple sclerosis); 신경근육장애(neuromuscular disorder), 신경종양 장애(neurooncological disorder), 뇌종양( brain tumor), 뇌졸중(stroke)을 포함하는 신경혈관 장애(neurovascular disorder), 신경면역장애(neuroimmunological disorder), 신경종양 질환, 척수손상(spinal cord injury)을 포함하는 신경외상(neurotrauma), 신경병증성 동통(neuropathic pain)을 포함하는 동통, 소아 신경 및 정신신경 장애(pediatric neurological and neuropsychiatric disorder), 수면 장애(sleep disorder), 뚜렛 증후군(Tourette syndrome), 경도인지손상(mild cognitive impairment), 혈관성 치매(vascular dementia), 다발성 뇌경색성 치매(multi-infarct dementia), 낭성섬유증(cystic fibrosis), 고세병(Gaucher's disease), 그 밖의 동작 장애(movement disorder) 및 중추신경계(CNS)의 질환을 일반적으로 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 다르게 명시되지 않는 한, 용어 신경퇴행성(neurodegenerative), 신경성(neurological) 또는 신경정신성(neuropsychiatric)은 본원에서 서로 교환가능하게 사용된다.
본 발명에 있어서, 다수의 질병에 대해 인간 항체를 특징화하고, 이후 면역 시스템이 질병 발병에 대해 상응하는 면역 반응과 반응하지 않은 환자에게 진단적으로, 치료적으로 또는 예방적으로 사용되도록 상기 항체를 생성하는 방법이 기술된다. 특히, 이는 고령의 노인에게서 질병이 나타날 것으로 예상되는데, 그 이유는 알려져 있는 바와 같이, 면역 시스템의 반응성이 고령화됨에 따라 계속해서 크게 감소하기 때문이다. 이러한 경우, 치료적 또는 예방적 활성 항체는 내인성 병태생리적 단백질 변이체의 농축을 차단하는 것과 관련하여 면역 시스템의 연령 관련 제약을 보상할 수 있으며, 이에 따라 고령자들의 보다 나은 건강 상태에 기여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 의약 용도는 특히 예를 들어, 60, 65, 70, 75, 80 또는 그 이상의 연령의 상기 기술된 환자 그룹에 적용될 수 있으며, 기본적으로는 내인단백질의 병태생리적 변이체를 나타냄으로써 표현형으로, 예를 들어, 엔도프로테올리시스(endoproteolysis), 형태 변경(conformation alteration), 후전사 변형의 변경, 소마틱 돌연변이(somatic mutation), 또는 이들의 조합과 같은 임의의 종류의 탈선 형태의 그 자체로 확실한 모든 질병에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 병태생리적 변이체는 생리적이지 않은 병리학적 네오에피토프를 함유하는 변이체인 것으로 간주된다(상기 참조).
특히, 치료 용도는 종양 질환, 염증성 질환, 및 중추신경제 질환, 예컨대, 알츠하이머병, 파킨슨병, 피크병, 루이소체 치매, 크로이츠펠트 야콥병을 포함하는 프리온병(Prion disease), 전진적 상핵 마비(progressive supranuclear palsy), 다계통위축(multiple system atrophy), 피질 기저핵 변성(corticobasal degeneration), 염색체 17 헌팅톤병(chromosome 17 Huntingdon's disease)과 결부된 전측두엽성 퇴행(frontotemporal degeneration), 전측두엽성 치매, 대뇌 아밀로이드 맥관병증(cerebral amyloid angiopathy), 경도인지장애(mild cognitive impairment), 다운 증후군(Down's syndrome), 아밀로이드증(amyloidosis) 더치(Dutch) 타입 및 아일랜드(Icelandic) 타입에 의한 유전성 뇌출혈(hereditary cerebral hemorrhage), 녹내장(glaucoma) 뿐만 아니라 척수소뇌성 운동실조(spinocerebellar ataxia) 및 근위축성측색경화증(amyotrohic lateral sclerosis), 봉입체 근염(inclusion body myositis), 가족성 아밀로이드 다발 신경병증(familial amyloid polyneuropathy) 및 하기 전구체 단백질 중 하나 이상으로부터 유래된 원섬유성(fibrilary) 단백질을 포함하는 아밀로이드증: SAA(혈청-아밀로이드-단백질 A(Serum-Amyloid-Protein A)), AL(면역글로불린의 k 또는 l 경쇄), AH(gl Ig-중쇄), ATTR(T트랜스티레틴(ransthyretin), 혈청-프리알부민(Serum-Prealbumin)), AApo-A-1(아폴리포프로테인(Apolipoprotein) Al), AApoA2(아폴리포프로테인 A2), AGeI(겔솔린(Gelsolin)), ACys(시스타틴(Cystatin) C), ALys(리소자임(Lysozyme)), AFib(피브리노겐(Fibrinogen)), 베타-아밀로이드(Beta-amyloid) (아밀로이드 전구체 단백질(Amyloid precursor protein)), 베타-아밀로이드2M(Beta-amyloid2M)(베타2-미소글로불린), APrP(프리온 프로테인(Prion protein)), ACaI(프로칼시토닌(Procalcitonin)), AIAPP(랑게르한스섬 아밀로이드 폴리펩티드(islet amyloid polypeptide)); APro(프롤락틴(Prolactin)), AIns(인슐린(Insulin)); AMed(락타드헤린(Lactadherin)); Aker(케라토-에피텔린(Kerato-epithelin)); ALac(락토페린(Lactoferrin)), Abri(AbriPP), ADan(ADanPP); 또는 AANP(심방 이뇨 펩티드(Atrial natriuretical peptide)), (Skovronsky at al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2006; 1 :151-70; Buxbaum, Curr Opin Rheumatol 2003; 16: 67-75).
본 발명의 치료적 방법의 특별한 이점은 건강한 임상전 또는 임상적으로 특이적으로 안정한 유기체로부터의 B 세포 또는 B 기억 세포로부터 유래된 항체가 소정의 가능성으로 임상적으로 명백한 질병을 예방할 수 있거나, 임상적으로 명백한 질병의 발병 위험을 감소시킬 수 있거나, 임상적으로 명백한 질병의 발병 시기를 지연시킬 수 있다는 사실에 있다. 일반적으로, 이러한 항체는 또한 이미 신체 성숙(somatic maturation), 즉, 항체의 가변 영역의 신체 변형에 의한 표적 분자와의 높은 친화성 결합에서의 선택성 및 효율성에 대한 최적화를 성공적으로 마쳤다.
생체내, 예를 들어, 인간에게서 이러한 세포가 자가면역 또는 알레르기 반응에 있어서 관련되어 있거나 그 밖의 생리적 단백질 또는 세포 구조에 의해 활성화되지 않았다는 사실은, 이것이 임상 시험 단계를 통해 성공적으로 생존할 기회를 상당히 증가시키는 것을 나타내기 때문에, 의학적으로 크게 중요하다. 말하자면, 효능, 허용성 및 내성이 한명 이상의 인간 피검체의 예방적 또는 치료적 항체의 임상전 연구 전에 이미 입증된 것이다. 따라서, 본 발명의 따른 절차에 의해, 치료제로서 항체의 표적 구조-특이적 효능, 및 이의 부작용 가능성 감소 둘 모두가 이의 임상 성공 가능성을 증가시키는 것으로 예상될 수 있다.
상기로부터, 본 발명은 특히 알츠하이머병 및 아밀로이드베타 침착과 관련된 질병의 각각의 진단 및/또는 치료를 위한, 상기 기술된 항체의 하나 이상의 CDR을 포함하는 질병 특이적 결합 분자의 임의의 용도를 포함함이 명백하다. 바람직하게는, 상기 결합 분자는 본 발명의 항체 또는 이의 면역글로불린 쇄이다. 또한, 본 발명은 상기 기술된 언급되어 있는 임의의 어느 한 항체의 항-이디오타입(anti-idiotypic) 항체와 관련된다. 이들은 항원 결합 부위에 인접한 항체 가변 영역 상에 로딩된 특이적 항원성 펩티드 서열에 결합하는 항체 또는 다른 결합 분자이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 상기 기술된 결합 분자, 항체, 항원 결합 단편, 폴리누클레오티드, 벡터 또는 세포 중 어느 하나, 및 임의로, 면역 또는 핵산 기재 진단 방법에 통상적으로 사용되는 시제와 같은 검출에 적합한 수단을 포함하는 진단 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체는, 예를 들어, 액체 상에 사용되거나 고체 상 담체에 결합될 수 있는 면역검정법에 사용되기에 적합하다. 본 발명의 항체를 이용할 수 있는 면역검정법의 예는 직접 또는 간접 포맷(format)의 경쟁적 및 비경쟁적 면역검정법이다. 이러한 면역검정의 예는 방사면역검정법(radioimmunoassay (RIA)), 샌드위치(면역측정 검정법(immunometric assay)), 유세포 분석법(flow cytometry) 및 웨스턴 블롯 검정법(Western blot assay)이 있다. 본 발명의 항원 및 항체는 많은 상이한 담체에 결합될 수 있으며, 이에 특이적으로 결합된 세포를 분리시키는 데 사용될 수 있다. 널리 공지되어 있는 담체의 예는 유리, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카르보네이트, 텍스트란, 나일론, 아밀로스, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스, 및 마그네타이트를 포함한다. 담체의 특성은 본 발명의 목적에 부합하여 가용성이거나 불용성일 수 있다. 당업자들에게 공지되어 있는 다수의 상이한 표지 및 표지화 방법이 존재한다. 본 발명에 사용될 수 있는 표지 타입의 예는, 효소, 방사성동위원소, 콜로이드 금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물, 및 바이오발광 화합물이 있다(상기 논의된 구체예 참조).
추가의 구체예에 의하면, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 또한 혈액 샘플, 림프 샘플 또는 다른 임의의 체액 샘플일 수 있는 시험 개체로부터의 체액 샘플을 취하고, 체액 샘플을 항체-항원 착물을 형성시킬 수 있는 조건 하에서 본 발명의 항체와 접촉시킴으로써, 개체의 질병을 진단하는 방법에 사용될 수 있다. 이후, 이러한 착물의 수준이 당해 공지되어 있는 방법에 의해 측정되는 데, 대조군 샘플에 형성되어 있는 것보다 현저히 높은 수준은 시험된 개체에서의 질병을 나타낸다. 동일한 방식으로, 본 발명의 항체에 의해 결합된 특이적 항원이 또한 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 결합 분자, 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 시험관내 면역검정법에 관한 것이다.
이와 관련하여, 본 발명은 또한 이러한 목적을 위해 특이적으로 설계된 수단에 관한 것이다. 예를 들어, 단백질- 또는 항체 기재 어레이가 사용될 수 있으며, 이러한 어레이는 예를 들어, 상기 언급된 질병 관련 단백질로부터 유래되고, 예를 들어, 신경성 질환, 특히 알츠하이머병을 앓고 있는 환자에게 존재할 수 있는 자가항체를 검출하기 위해 네오에피토프를 함유하는 항원으로, 또는 상기 단백질중 어느 하나를 특이적으로 인식하는 본 발명의 항체 또는 동등한 항원 결합 분자로 로딩된다. 예를 들어, 류마티스 관절염의 자가항체에 대한 항원 마이크로어레이 프로파일링(antigen microarray profiling)이 휴버(Hueber) 등에 의해 보고되어 있다(Arthritis Rheum. 52 (2005), 2645-2655). 마이크로어레이 면역검정법의 설계는 문헌(Kusnezow et al, MoI. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696)에 요약되어 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따라 확인된 결합 분자 또는 항원이 로딩된 마이크로어레이에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 기술된 성분, 예를 들어, 본 발명의 결합 분자, 항체, 또는 이의 결합 단편, 항원, 폴리누클레오티드, 벡터 또는 세포 중 하나 이상을 포함하는 각각의 약제 및 진단용 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기에는 약제학적 또는 생물학적 제품의 제조, 용법 또는 판매를 규정하는 정부 기관에 의해 규정되는 형태로 통지서가 결합되며, 이러한 통지서는 인간 투여를 위한 제조, 용법 또는 판매 기관에 의한 승인이 반영된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 키트는 적합한 진단 검정에 사용하기 위한 시제 및/또는 지시서를 포함한다. 조성물, 예를 들어, 본 발명의 키트는 상기 정의된 바와 같은 질병 관련 단백질의 존재로 동반되는 질병, 특히 아밀로이드증의 진단, 예방 및 치료에 특히 적합하고, 특히 알츠하이머병(AD)의 치료에 적용될 수 있다.
용어 "치료", "치료하는" 등은 본원에서 일반적으로 목적하는 약리적 및/또는 생리적 효과를 달성하는 것을 의미하는 것으로 사용된다. 상기 효과는 질병 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 점에서 예방적일 수 있고/거나 질병 및 /또는 질병으로 인한 부작용을 부분적으로 또는 완전히 치유한다는 점에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "치료"는 포유 동물, 특히 인간 질병의 임의의 치료를 포함하고, (a) 질병의 경향이 있기는 하지만 아직은 질병에 걸린 것으로 진단받지 않은 피검체에게서 질병이 걸리지 않도록 예방하는 것; (b) 질병을 억제하는 것, 즉, 질병의 진행을 중지시키는 것; 또는 (c) 질병을 완화시키는 것, 예를 들어, 질병의 퇴행을 유발시키는 것을 포함한다.
추가로, 용어 "피검체" 또는 "환자"는 병태, 질병 또는 질환에 대한 치료를 필요로 하는 포유동물, 바람직하게는 인간을 나타낸다.
본 발명의 약제 조성물은 당해 널리 공지되어 있는 방법에 따라 제형될 수 있다(참조예: Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472). 적합한 약제학적 담체의 예는 당해 널리 공지되어 있으며, 인산염 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대, 오일/물 에멀젼, 여러 타입의 습윤화제, 멸균 용액 등이 포함된다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지되어 있는 통상적인 방법에 의해 제형될 수 있다. 이러한 약제 조성물은 적합한 용량으로 피검체에게 투여될 수 있다. 적합한 조성물의 투여는 상이한 방식, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하, 근내, 국소적 또는 피내 투여에 의해 수행될 수 있다. 비(nasal) 분무 제형과 같은 에어로졸 제형은 보존제 및 등장제와 함께 제제의 정제된 수성 또는 그 밖의 용액을 포함한다. 이러한 제형은 바람직하게는 비점막과 적합성인 pH 및 등장성 상태로 조절된다. 직장 또는 질 투여를 위한 제형은 적합한 담체와 함께 좌제로서 제공될 수 있다.
추가로, 본 발명은 본 발명의 약물을 투여하기 위해 두개(skull)에 작은 구멍을 뚫기 위한 현재 표준(다행히도 드물기는 하지만) 절차를 포함하지만, 바람직한 특징에서는, 결합 분자, 특히 본 발명의 항체 또는 항체 기재 약물은 혈액-뇌 장벽을 통과하여 정맥내 또는 경구 투여가 가능할 수 있다.
투여 섭생은 주치의 및 임상적 인자에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 임의의 환자의 용량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 전반적인 건강, 및 그 밖의 동시에 투여되고 있는 다른 약물을 포함하는 많은 인자에 의존한다. 전형적인 용량은 예를 들어, 0.001 내지 1000μg (또는 이러한 범위의 발현을 위한 또는 발현의 억제를 위한 핵산의) 범위내일 수 있지만, 특히 상기 언급된 인자를 고려하면, 상기 예시적 범위 미만 또는 초과의 용량도 고려된다. 일반적으로, 용량은 숙주 체중의 예를 들어, 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 일반적으로 0.01 내지 5 mg/kg (예를 들어, 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 등) 범위일 수 있다. 예를 들어, 용량은 1mg/kg 체중 또는 10mg/kg 체중 또는 1-10 mg/kg 범위내, 바람직하게는 1mg/kg 이상일 수 있다. 상기 범위내 중간인 용량이 본 발명의 범위내에 있는 것으로 의도된다. 피검체는 매일, 격일로, 매주, 또는 실험적 분석에 의해 결정된 임의의 다른 스케쥴에 따라서 상기 용량이 투여될 수 있다. 예시적 치료는 예를 들어, 6개월 이상의 오랜 기간에 걸쳐 다중 용량으로의 투여를 수반한다. 추가의 예시적 치료 섭생은 매 2주마다 1회 또는 매달 1회, 또는 매 3 내지 6개월에 1회 투여를 수반한다. 예시적 용량 스케쥴은 수일간 연속해서 1-10 mg/kg 또는 15 mg/kg, 격일로 30mg/kg, 또는 매주 60mg/kg를 포함한다. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 지닌 두개 이상의 모노클로날 항체가 동시에 투여되며, 이 경우, 각각의 투여된 항체의 용량은 지시된 범위내에 있다. 진행은 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대, 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는, 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함하고, 염수 및 완충 매질을 포함한다. 비경욱 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트 링거, 또는 고정유(fixed oid)을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충물(nutrient replenisher), 전해질 보충물(electrolyte replenisher)(예컨대, 링거 덱스토스를 기재로 하는 것들), 등을 포함한다. 또한, 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 그 밖의 첨가제가 존재할 수 있다. 또한, 본 발명의 약제 조성물은 약제 조성물의 의도된 용도에 의존하여 도파민 또는 항정신병 약물(psychopharmacologic drug)과 같은 추가의 제제를 포함할 수 있다. 또한, 약제 조성물은 예를 들어, 본 발명의 약제 조성물이 피동 면역화를 위한 항-Aβ 항체를 포함하는 경우, 백신으로서 제형될 수도 있다.
또한, 다른 제제의 동시 투여 또는 연속 투여가 바람직할 수 있다. 치료적 유효 용량 또는 유효량은 증상 또는 병태를 개선시키기에 충분한 활성 성분의 양을 나타낸다. 예를 들어, ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량), 및 LD50(집단의 50%에 대한 치사 용량)과 같은 이러한 화합물의 치료 효능 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물의 표준 약제학적 절차에 의해 측정될 수 있다. 치료 효과와 독성 효과 간의 용량 비가 치료 지수이며, 이는 비 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 바람직하게는 조성물 중의 치료제는 알츠하이머병의 경우에 정상적인 거동 및/또는 인지 특성을 회복하기에 충분한 양으로 존재한다.
본 발명에 따른 약제 조성물은 바람직하게는 알츠하이머병, 파킨슨병, 피크병, 루이소체 치매, 크로이츠펠트 야콥병을 포함하는 프리온병, 전진적 상핵 마비, 다계통위축, 피질 기저핵 변성, 염색체 17 헌팅톤병과 유사한 파킨슨병에 의한 전측두엽성 퇴행, 전측두엽성 치매, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 경도인지장애, 다운 증후군, 아밀로이드증 더치 타입 및 아일랜드 타입에 의한 유전성 뇌출혈, 척수소뇌성 운동실조, 근위축성측색경화증, 벨 마비, 간질, 뇌염, 신경근육장애, 녹내장, 봉입체 근염, 가족성 아밀로이드 다발 신경병증 및 하기 전구체 단백질 중 하나 이상으로부터 유래된 원섬유성 단백질을 포함하는 아밀로이드증: SAA(혈청-아밀로이드-단백질 A), AL(면역글로불린의 k 또는 1 경쇄), AH(gl Ig-중쇄), ATTR(트랜스티레틴, 혈청-프리알부민), AApo-A-1(아폴리포프로테인 Al), AApoA2(아폴리포프로테인 A2), AGeI(겔솔린), ACys(시스타틴 C), ALys(리소자임), AFib(피브리노겐), 베타-아밀로이드(아밀로이드 전구체 단백질), 베타-아밀로이드2M(베타2-미소글로불린), APrP(프리온 프로테인), ACaI(프로칼시토닌), AIAPP(랑게르한스섬 아밀로이드 폴리펩티드); APro(프롤락틴), AIns(인슐린); AMed(락타페린); Aker(케라토-에피텔린); ALac(락토페린), Abri(AbriPP), ADan(ADanPP); 또는 AANP(심방 이뇨 펩티드)(Skovronsky at al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2006; 1 :151-70; Buxbaum, Curr Opin Rheumatol 2003; 16: 67-75), 신경-종양학, 신경-면역학, 신경-이과학(neuro-otology) 동통, 소아 신경학, 공포증, 정동 장애(affective disorder), 수면 장애, 뚜렛 증후군, 그 밖의 동작 장애, 및 일반적으로 중추신경계(CNS) 질환을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아닌 신경성 질환의 치료에 사용될 수 있다.
상기 및 그 밖의 구체예가 본 발명의 상세한 설명 및 실시예에 기술되어 포함된다. 본 발명에 따라 사용되는 물질, 방법, 용도, 및 화합물 중 어느 하나와 관련된 추가의 문헌은 예를 들어 전자 장치를 사용하여 공공 도서관 및 데이타베이스로부터 찾을 수 있다. 예를 들어, 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(National Center for Biotechnology Information) 및/또는 내셔널 인스티튜츠 오브 헬쓰의 내셔널 라이브러리 오브 메디슨에서 주관하는, 공용 데이타베이스 "Medline"이 이용될 수 있다. 유럽피언 모리큘러 바이올로지 래보러토리(European Molecular Biology Laboratory: EMBL)의 파트인 유럽피언 바이오인포매틱스 인스티튜브(European Bioinformatics Institute: EBI)와 같은 또 다른 데이타베이스 및 웹 주소가 당업자들에게 공지되어 있으며, 인터넷 서치 엔진을 사용하여 얻어질 수 있다. 소급되는 서치 및 현행 주지에 유용한 특허 정보에 대한 관련 자료의 조사 및 생명공학의 특허 정보 개요는 문헌(Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364)에 제시되어 있다.
상기 기재는 본 발명을 일반적으로 기술한 것이다. 다르게 명시되지 않는 한, 본원에 사용되는 용어는 사전(Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, 2000 개정, 2003재발행, ISBN 0 19 850673 2)에 있는 정의에 따른다. 수개의 문헌이 본 명세서의 본문에 인용된다. 완전한 서지 인용은 청구 범위 앞의 명세서의 말단에서 찾아볼 수 있다. 모든 인용된 문헌(본 출원 전반에 인용된 참조 문헌, 등록 특허, 공개된 특허 출원, 제조업자의 설명서, 지시서 등을 포함)의 내용은 분명히 본원에서 참고로 통합되지만, 인용된 임의의 문헌이 사실상 본 발명에 대한 선행 기술인 것으로 인정되는 것은 아니다.
본원에서 예시적 목적으로 제시되는 하기 특정 실시예를 참조하여 보다 완전하게 이해될 수 있으나, 발명의 범위가 이로 제한되지 않아야 한다.
본 발명을 추가로 예시하는 하기 실시예는 어떠한 식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않아야 한다. 본원에서 사용된 것들과 같은 종래 방법에 대한 상세한 설명은 인용 문헌에서 찾아볼 수 있다(참조예: "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy" Seventeenth Ed. ed by Beers and Berkow (Merck & Co., Inc. 2003)).
본 발명의 실시는 다르게 명시되지 않는 한, 당업자들에게 인지되는, 세포 생물학, 세포 배양학, 분자 생물학, 유전자이식 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 본 발명의 실시에 유용한 일반적인 기술에 대한 상세한 설명을 위해, 실시자는 세포 생물학 및 조직 배양학의 일반 텍스트북 및 논평을 참고할 수 있으며, 또한 실시예에서 인용된 참고문헌을 참조한다. 분자 및 세포 생화학에서의 일반적인 방법은 일반 텍스트북(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al, Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (Hames and Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et al, eds.); 및 Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press). Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, VoIs. 154 and 155 (Wu et al, eds.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (Weir and Blackwell, eds., 1986). Protein Methods (Bollag et al, John Wiley & Sons 1996); Non-viral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplitt & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998))에서 찾아볼 수 있다. 본원에서 언급되는 유전자 조작을 위한 시제, 클로닝 벡터 및 키트는 바이오라드(BioRad), 스트라타진(Stratagene), 인비트로젠(Invitrogen), 시그나-알드리치(Sigma-Aldrich), 및 클론테크(ClonTech)와 같은 상업적 판매자로부터 입수가능하다. 세포 배양 및 배지 수거에 대한 일반적인 기술은 문헌(Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al, Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); 및 Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch et al, Bioprocess Technol. 19 (1990), 251); Extracting information from cDNA arrays, Herzel et al, CHAOS 11 (2001), 98-107)에 개략적으로 서술되어 있다.
하기 실험은 항체 NI-101.11과 관련하여 예시되고 기술된다. 그러나, NI 101 계열의 다른 항체, 특히 NI 101.10가 구조적으로 유사하며, 이에 따라 유사한 결과를 나타낼 것으로 예상할 수 있다.
보충적 방법
메모리 B 세포 디스플레이
특이적으로 양성 임상 상태, 예를 들어, 위험 인자의 존재 하에 질병의 임상적 징후의 없거나, 질병의 진행이 없는 경증 또는 전구성 징후의 안정한 상태로 특징되는 임상적으로 조심스럽게 선택된 인간 피검체 또는 장기간 비진행성 환자를 채택하여 메모리 B 세포를 분리시키기 위한 출발 물질로서 말초혈 림프구를 제공하였다. 이러한 방법은 피검체의 메모리 B 세포 풀(pool)이 항체 특이성을 보존하고, 또한 가능하게는 선행 항원이 직면되는 동안에 생성된 항체 빈도를 보존한다는 감염 면역학에서 확립되어 있는 개념을 기초로 한다(McHeyzer- Williams and Ahmed Curr. Opin. Immunol. 11 (1999), 172-179; Bernasconi et al, Science 298 (2002), 2199-202; Traggiai et al , Nat. Med. 10 (2004), 871-875)). 이러한 개념은 1차 감염 후 항체 매개된 면역성을 설명할 뿐만 아니라, 감염성 제제에 대한 적응 면역성을 설명하기 위해 개발되어 있다. 이러한 이론에 따르면, 자연적으로 또는 백신화에 의해 피검체 이력에서 항체 반응을 유발시킨 모든 항원에 대한 항체의 완전 보충은 메모리 B 세포 풀에서 완전히 나타나야 한다. 본 발명에 따르면, 이러한 이론은 다른 생리적 관련 단백질의 비정상 응집 또는 형태(conformation)의 결과로서 생성된 내인성 항원에 적용되고, 그 자체로는 생리적 면역학적 관용(physiological immunologic tolerance)에는 적용받지 않으며, 이에 따라 항원성 특성을 획득하고, 형태적 네오-에피토프(네오에피토프)에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
메모리 B 세포는 IgM, IgD, IgE, 및 IgA를 발현시킨 항원-무경험 B 세포의 네가티브 선택과 함께, 판(pan) B 세포 마커 CD22를 포함하는 표면 마커로 분리된다. 이러한 기술에 의해, 대략 10,000 내지 150,000개의 메모리 B 세포가 30ml의 인간 혈액으로부터 얻어질 수 있다. 이들 세포는 예를 들어, 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr Virus)로 불멸화되고, 조사된 인간 섬유아세포 제공층 상에서 올리고클론적으로(oligo-clonally) 배양된다(Zubler et al, J Immunol. 134 (1985), 3662-3668; Traggiai et al, Nat. Med. 10 (2004), 871-875)). 항체-분비 메모리 B 세포의 형질변환 및 불멸화 효능을 개선시키기 위해, 박테리아 비-메틸화된 CpG-디누클레오티드의 활성을 모방하는 CpG 2006(Hartmann and Krieg J Immunol 164(2) (2000), 944-953)이 사용될 수 있다.
실험 프로토콜:
PBL의 벌크로부터 B 세포의 선택은 MACS 기술 및 CD22 마이크로비즈를 사용하여 수행하였다(Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany). PBL을 MACS 항 인간 CD22, 피코에리트린-컨쥬게이트된 항 인간 IgD 및 APC-컨쥬게이트된 항체 항 인간 IgM, IgA, CD3, CD8, CD56로 표지화하였다(Becton Dickinson, Basel, Switzerland). CD22-양성 세포를 LS 컬럼 및 미디(Midi) MACS 장치(Miltenyi)를 사용하여 분리시킨 후, MoFIo 세포 분류기(cell sorter)를 사용하여 피코에리트린- 및 APC-음성 세포를 선택하였다(Dako, Fort Collins, USA). 이후, CD22-양성, IgM-, IgD-, IgA-, 및 IgE-음성 B 세포를 B 세포 배지(10% 우태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640(Hyclone, Perbio, Lausanne, Switzerland)) 중 2.5mg/ℓ의 농도로 B95-8 세포 및 CpG 2006로부터 수득된 상청액을 함유하는 엡스타인 바르 바이러스 (Sigma, Buchs, Switzerland)와 함께 인큐베이팅시켰다. 5-50개의 세포를 지원자 도너로부터 제조된 30.000 조사된 인간 PBL에 대해 B 세포 배지에서 코스타(Costar) 둥근 바닥 96웰 플레이트(Corning, Vitaris, Baar, Switzerland)의 웰당 시딩하였다. 메모리 B 세포 배양물을 2-4주 동안 가습된 세포 배양 인큐베이터내에서 37℃ 및 5% CO2에서 유지시키고, 이후, 배양물의 컨디셔닝된 배지를 ELISA로, 조직 어레이에 대해 검정하였다.
항체 스크리닝
컨디셔닝된 배지 중의 항체를, 알츠하이머병을 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌 병리학적임이 확인된 진단을 받은 인간 환자로부터 얻거나, 인간 질병의 유전자이식된 마우스 모델의 조직 부분으로부터, 또는 고령의 비인간 영장류를 포함하는 인간 질병의 동물 모델로부터 얻은 조직 부분으로부터, 또는 응집된 합성 펩티드 제제의 ELISA에 의한 조직 부분 상의 단백질 응집물 및 비정상 병리학적 관련 구조를 포함하는 병리학적 에피토르로의 결합에 대해 스크리닝하였다. 본 발명에 있어서, 병원원 구조는 β-아밀로이드 플라그, 신경원섬유(neurofibrillary tangle), 루이소체의 알파-시누클레인 응집물, 및 이영양성 신경돌기에 침착된 단백질 응집물을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 인간 조직은 정상 세 포 또는 수퍼 세포 조직 구조와의 항체의 교차반응성을 배제시키는 데 사용된다. 선택된 항체는 추가로 클래스(class) 및 경쇄 서브클래스(subclass) 결정을 위해 추가로 분석된다. 메모리 B 세포 배양물로부터 선택된 병리학적 관련 항체 메시지는 RT-PCR를 사용함으로써 전사되고, 클로닝되고, 재조합 생성을 위한 발현 벡터로 결합된다.
실험 프로토콜:
마이크로역가-적합성 조직 마이크로어레이(microtiter-compatible tissue microarray)를 사용하는 B 세포 컨디셔닝된 배지의 스크리닝
어레이 제조
파라핀 삽입된 인간 사후의 알츠하이머병 뇌조직을 직경 1-2mm 및 길이 10mm의 로드로 절삭하였다. 네개의 로드를 파라핀에 수직으로 삽입시켜 9x9mm 마이크로역가 포맷을 맞추는 사각형을 형성하였다. 5㎛ 조직 슬라이스를 상기 어셈블리로부터 마이크로톰(microtome)을 사용하여 잘라내고, 두개의 슬라이스를 서로 인접하게 유리 슬라이드 상에 올려 두어 96웰 마이크로역가 포맷을 맞추는 2x4개의 로드의 어셈블리를 형성하게 하였다. 다르게는, APP 유전자 이식된 마우스로부터의 조직을 사용하여 조직 어레이를 제조하였다.
B 세포 스크리닝
메모리 B 세포 배양물로부터 컨디셔닝된 배지를 멀티채널 피펫(multichannel pipette)을 사용하여 조직 어레이 슬라이드에 옮기고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅시켰다. 세척 단계 후, 인간 항체의 조직 부분으로의 결합을 인간 IgG에 대한 Cy3-컨쥬게이트된 2차 항체를 사용하여 분석하였다(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Suffolk, UK). 도립형광현미경(inverted fluorescence microscope)으로 형광 분석을 수행하였다(Leica, Heerbrugg, Switzerland).
ELISA
96웰 하프 에어리어 마이크로플레이트(96 well half area Microplate) (Corning)를 4℃에서 밤새 코팅 완충액(15mM Na-CCb, 35 mM NaHCO3, pH 9.42) 중의 1㎍/ml의 표준 농도로 합성 Abeta-펩티드로 코팅하였다. 플레이트를 세척하고, 비특이적 결합 부위를 2% BSA를 함유하는 PBS(Sigma, Buchs, Switzerland)로 실온에서 1시간 동안 블록킹하였다. B 세포 컨디셔닝된 배지를 메모리 B 세포 배양 플레이트로부터 ELISA 플레이트로 옮기고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅시켰다. 인간 항체의 결합을 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 컨쥬게이트된 당나귀 항-인간 IgG 폴리클로날 항체(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Cambridgeshire, UK)를 사용하여 측정한 후, 표준 비색 검정법(standard colorimetric assay)으로 HRP 활성을 측정하였다.
주목되는 특이성을 나타내는 항체의 분자 클로닝
선택된 메모리 B 세포 배양물의 생존 B 세포를 세포 분류기를 사용하여 수거하였다. mRNA를 제조하고, 3' 프라이머로서 모든 인간 J-H 세그먼트에 특이적인 프라이머와 함께 5' 프라이머로서 모든 인간 가변성 중쇄 및 경쇄 프레임워크 1(FR1) 패밀리에 특이적인 Ig-프레임워크를 사용하여 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열을 얻었다(Marks et al, MoI. Biol. 222 (1991)., 581-597). 다르게는, 메모리 B 세포 배양물로부터의 단일 분류된 세포의 단일-세포 RT-PCR가 Ig 중쇄 및 경쇄 서열의 공급원으로서 사용될 수 있다(Babcook et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 7843-7848; Brezinschek et al, J. Immunol. 155 (1995), 190-202; Coronella et al, Nucleic Acids Research 28 (2000); Owens, et al, J. Immunol. 171 (2003), 2725-2733). 단일 세포 분류는 B 세포 배양물에서 원래 생성된 항체클론의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 올바른 페어링(pairing)을 유지시킨다.
요망되는 특이성을 지닌 항체 클론의 확인은 완전 항체의 재조합 발현시 ELISA 및 마이크로역가 적합성 조직 마이크로어레이 상의 재스크리닝에 의해 수행된다. 완전 IgG1 항체의 재조합 발현은, 5-프라임에서 단일 펩티드를 엔코딩하는 서열로, 그리고 3'-말단에서 적합한 비가변성 도메인(들)으로 가변 영역 서열을 보충하는 발현 벡터에 "올바른 리딩 프레임 내" 가변성 중쇄 및 경쇄 서열을 삽입하여 달성된다. 결국, 프라이머는 가변성 중쇄 및 경쇄 서열의 항체 발현 벡터로의 클로닝을 용이하게 하도록 설계된 제한 부위를 함유한다. 중쇄 면역글로불린은 프레임 내 면역글로불린 중쇄 RT-PCR 생성물을 단일 펩티드 및 인간 면역글로불린의 비가변성 도메인을 지닌 중쇄 발현 벡터에 삽입함으로써 발현된다. 카파 경쇄 면역글로불린은 프레임 내 카파 경쇄 RT-PCR 생성물을 단일 펩티드 및 인간 카파 경쇄 면역글로불린의 비가변성 도메인 1을 제공하는 경쇄 발현 벡터에 삽입함으로써 발현된다. 다르게는, 람다 경쇄 면역글로불린이 프레임 내 람다 경쇄 RT-PCR 생성물을 단일 펩티드 및 인간 람다 경쇄 면역글로불린의 비가변성 도메인 1을 제공하 는 람다 경쇄 발현 벡터에 삽입함으로써 발현된다.
기능적 재조합 모노클로날 항체는 Ig-중쇄 발현 벡터 및 카파 또는 람다 Ig-경쇄 발현 벡터의 HEK 293 세포(또는 임의의 다른 적합한 수령 세포주)로의 동시-트랜스펙션(co-transfection)시에 얻어진다. 재조합 인간 모노클로날 항체는 이후 표준 프로테인 A 컬럼 정제를 사용하여 컨디셔닝된 배지로부터 정제된다. 재조합 인간 모노클로날 항체는 일시적으로 또는 안정적으로 트랜스펙션된 세포를 사용하여 무제한적 양으로 생성될 수 있다. 재조합 인간 모노클로날 항체를 생성하는 세포주는 직접적으로 Ig-발현 벡터를 사용함으로써, 또는 Ig-가변 영역을 상이한 발현 벡터로 재클로닝함으로써 형성될 수 있다. F(ab), F(ab)2 및 scFv와 같은 유도체가 또한 이러한 Ig-가변 영역으로부터 생성될 수 있다.
시험 프로토콜:
벌크 B 세포의 RT-PCR
선택된 메모리 B 세포 배양물의 전방향 및 측방향 광산란 특성에 의해 확인된 생존 세포를, MoFlo 세포 분류기를 사용하여 20㎕의 RNAlater(Ambion, Huntingdon, UK)가 충전된 0.2ml PCR 튜브 중에서 직접적으로 100 내지 2000개의 세포의 분취액에서 분류하였다. mRNA를 mRNA-디렉트 마이크로 키트(mRNA-Direct Micro Kit)(Dynal, Invitrogen, Basel, Switzerland)를 사용하여 제조하였다. cDNA를 "PCR을 위한 RT" 키트(Clontech BectonDickinson, Basel, Switzerland)를 사용하여 제조하고, 면역글로불린(Ig) 중쇄 및 경쇄 가변 서열의 PCR을, 3' 프라이머로서 인간 Ig 중쇄 또는 Ig 카파 또는 Ig 람다 경쇄의 비가변성 도메인에 특이적 인 프라이머와 함께 5' 프라이머로서 모든 인간 가변성 중쇄 및 경쇄 프레임 워크 1(FR1) 패밀리에 특이적인 프라이머를 사용하는 어드밴티지 2 PCR 키트(Advantage 2 PCR Kit)(Clontech)를 사용하여 수행하였다. 프라이머를 마이크로신쓰(Microsynth) (Balgach, Switzerland)로부터 구입하였다.
모든 발현 벡터에서 사용된 단일 펩티드는, PCR 증폭된 가변 영역 (ATGGACATGCGGGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTAGATGC; SEQ ID NO: 1)의 클로닝을 용이하게 하기 위해 제한 부위 Xba 1을 제공하도록 설계되고 V-염기에서 기재되어 있는 바와 같은 인간 면역글로불린 카파 경쇄 패밀리 1 L5 서열(MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC; SEQ ID NO: 2)로부터 유래된다. Xbal은 침묵 돌연변이(silent mutagenesis)에 의해 도입된다. 가변성 중쇄 영역의 클로닝을 위해 사용되는 3' 제한 부위로서, 제한 부위 Sal1이 카파 경쇄의 C1에 도입되고, Xho1이 람다 경쇄의 C1에 도입된다. PCR 생성물의 제한효소 분해 및 수령 벡터로의 결찰은 표준 절차에 따라 수행되었다. 플라스미드 DNA를 표준 키트(Quiagen, Hombrechtikon, Switzerland)를 사용하여 제조하였다. 수령 벡터는 포유 동물 세포에서 항체 유전자의 발현을 위해 CMV 프로모터를 함유하였다.
단일 세포 RT-PCR
배양된 B 세포로부터 Ig 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 단일 세포 RT-PCR을 위해, 오웬즈(Owens) 등에 의해 기술된 방법을 변형하여 사용하였다(Owens et al., 2003). 단일 세포를 MoFlo 세포 분류기를 사용하여 0.2 PCR 튜브의 어레이 중 각각의 튜브에 직접 넣었다. 각각의 튜브는 수퍼스크립트 II(Superscript II) 역전 사효소(Invitrogen)에 대해 10㎕의 RT 완충액을 함유하도록 제조하였다. RCT 튜브를 드라이 아이스 상에서 급속 냉동시키고, RT-PCR 직전에 해동시켰다. cDNA을 랜덤 헥사머(random hexamer)(Clontech) 및 수퍼스크립트 II 역전사효소 (Invitrogen)를 사용하여 준비하였다. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 1 라운드 PCR은 5' 프라이머로서, Ig-가변 영역 패밀리 중에서 보존된 모든 시그널 펩티드에서 프라이밍된 프라이머 셋을 사용하여 수행하였다. 3' 위치에서, Ig C1 중쇄 또는 Ig 카파- 또는 Ig 람다 경쇄의 비가변성 영역에 특이적인 단일 프라이머가 사용되었다. 제 2 라운드 PCR은 벌크 B 세포 RT-PCR을 위해 기술된 프라이머를 사용하여, 제 1 라운드 PCR 동안에 얻어진 PCT 생성물에 대해 수행하였다. 이에 따라, 수령 벡터로의 클로닝을 수행하였다.
대안적 세포 클로닝
표준 제한된 희석 방법을 사용하거나, 세포 분류기(MoFIo, Dako, Fort Collins, USA)를 사용하여 단일 세포를 96웰 배양 플레이트에 놓음으로써 클로닝을 수행하였다. 희석 제한을 위해, 메모리 B 세포 배양물의 세포를 수거하고, 30㎛ 나일론 메쉬(Falcon, Becton Dickinson, Basel, Switzerland)를 통과시키고, 배지 중에 재현탁시키고, 웰당 0.3 세포의 농도로 96웰 플레이트 또는 384 웰 플레이트에 시딩하였다.
세포 분류기에 의한 시딩을 위해, B 세포 배지로 보충된 96웰 플레이트에 직접 웰당 하나의 단일 세포(단일 1 모드)가 놓이도록 장치를 설정하였다. 이러한 배지를 활성화된 T 세포로 컨디셔닝된 배지로 보충하였다. 다르게는, 30.000 조사 된 공급 세포를 배지에 첨가하였다.
면역글로불린 가변 영역 서열의 서열 분석
클로닝된 면역글로불린 가변 영역 서열의 서열화를, 발현 벡터내 삽입된 Ig 가변 영역의 CMW 프로모터가 존재하는 5'에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 수행하였다. 다르게는, Ig 중쇄 및 경쇄의 비가변성 도메인에서 프라이밍된 프라이머를 사용하였다. 얻어진 서열을 분석하고, 벡터 NTI 소프트웨어(Informax-Invitrogen)를 사용하여 정렬하였다. 리더 펩티드 및 비가변성 도메인을 갖는 프레임내 완전 면역글로불린 가변 영역을 엔코딩한 플라스미드 함유 서열을 발현에 사용하였다.
기능성 재조합 모노클로날 항체의 발현
당해 공지되어 있는 기술을 사용하여 재조합 발현에 의해 항체를 충분량으로 제조하였다(Trill et ah, Curr. Opin. Biotechnol. 6 (1995), 553-601). 1mg 이하의 재조합 인간 모노클로날 항체가 293 HEK 세포의 일시적 트랜스펙션시에 생성되었다. 100mg 이하의 재조합 인간 모노클로날 항체는 재조합 렌티바이러스 벡터를 사용한 뮤린 NSO 세포 또는 293 HEK 세포의 안정한 트랜스펙션시에 생성되었다.
일시적 트랜스펙션에 의한 인간 재조합 항체의 소규모 제조
Ig-중쇄 벡터 및 Ig-경쇄 벡터를 표준 인산칼슘 공침전법을 사용하여 HEK 293 세포에 공동-트랜스펙션시켰다. 재조합 항체를 단백질 A 컬럼 정제(GE-Healthcare, Otelfingen, Switzerland)를 사용하여 트랜스펙션된 HEK 293 세포에 의해 컨디셔닝된 배지로부터 정제하였다.
안정한 트랜스펙션에 의한 인간 재조합 항체의 대규모 제조
여기서, 인간 재조합 항체를 생성하는 안정하게 형질도입된 세포주를 생성하기 위해 렌티바이러스 기재 트랜스펙션 시스템을 이용하였다(Zufferey et al., J. Virol. 72 (1998), 9873-9880). HEK 293 세포를 하나는 Ig 중쇄에 대한 발현 카세트를 지니고, 다른 하나는 재조합 항체의 Ig 경쇄에 대한 카세트를 지니는, 두개의 상이한 렌티벡터로 공동 형질도입되었다. 이러한 형질도입 방법은 CHO 및 NSO 세포와 같은 광범위한 포유동물 세포주에 사용될 수 있다.
인간 질병의 유전자 이식된 마우스 모델의 검증
유전자 이식된 마우스를 C57B1/6 및 DBA2의 하이브리드 배경기술에 대해 앞서 기술된 바와 같이(Knobloch et al., Neurobiol. Aging July 28 (2006)) 생성하였다. 시험 그룹을 C57B1/6로 1회 역교배하였다. 마우스를 전환되는 12h:12h 명/암 사이클에 대한 표준 수용 조건 하에서 유지시키고, 음식과 물은 자유롭게 접근하게 하였다. 처리 그룹은 연령(첫번째 시험에서는 24개월, 두번째 시험에서 26개월) 및 성에 대해 균형을 이루도록 하였다. 동물 당 8회 주사되도록 2개월의 기간 동안에 매주 1회 복강내 주사에 의해 항체로 처리하였다.
Y-미로에서의 행동 시험
자발적 교대율(spontaneous alternation rate)을 40 x 20 x 10cm 아암 크기를 갖는 Y자형 플라스틱 미로를 사용하여 평가하였다. 5분 기간 동안에, 아암 입장의 순서를 기록하고, 교대율은 중복되는 세개의 셋트에서, 세개의 아암으로 연속 입장하는 것으로 정의하였다. 교대율의 %는 가능한 교대율에 대한 실제 교대율의 비로서 계산하였다. 항체 치료 2개월 후, 마우스를 Y-미로에서 다시 시험하였다. 실험은 전제 실험 동안에 처리군 및 유전형 모두에 대해 항상 블라인드되었다.
혈액-뇌 장벽 침투 및 뇌내 비정상 구조로의 결합
선택된 항체 또는 이의 단편이 혈액-뇌 장벽을 침투할 수 있는 지, 그리고 뇌 내의 비정상적으로 응집되거나 형태적으로 변경된 단백질 표적물에 결합하는 지를 평가하기 위해, 유효량의 항체를 뇌에 응집되거나 형태적으로 변경된 단백질 표적물의 비생리적 축적에 의해 특징되는 유전자 이식된 동물에 전신, 복강내, 정맥내, 근내, 피하 또는 비강내 투여하였다. 이후, 뇌의 병리학적 특이적 구조로의 항체의 결합을 표지된 항-인간 Ig 2차 항체에 의한 면역염색법에 이어 표준 면역조직화학적 검출에 의해 평가하였다.
실험 프로토콜:
알츠하이머병에 대해 PS-1/APPswe 유전자 이식된 모델 마우스에 15O㎍ NI-101.11를 제 1일 및 제 3일에 두번 말초 주사하였다. 두번째 투여 후 24시간 후에 마우스를 희생시키고, PBS를 주입하였다. 뇌를 냉동시키고, 크라이오톰(cryotome)을 사용하여 냉동된 조직으로부터 조직 슬라이스를 준비하였다. 냉각기 단면 상의 인간 항체의 존재를 Cy3-표지된 항 인간 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, UK)로 염색함으로써 평가하였다. 뮤린 Abeta-특이적 대조군 항체 6E10 (Covance, Catalog Number SIG-39320로부터 입수가능)에 이어 FITC-표지된 항 마우스 IgG 항체로 냉각기 단면을 공동 염색함으로써 아밀로이드 플라그의 편재화를 수행하였다. 다르게는, Cy3-표지된 항 인간 IgG 항체로의 염색을 단독으로 사용하였 다. 도립형광현미경(Leica) 상에서 형광 분석을 수행하였다.
뇌 질병의 감소
뇌 내의 응집되거나 형태적으로 변경된 단백질 표적물의 수준에 대한 항체 치료의 효과를, 뇌내 응집되어 있거나 형태적으로 변경된 단백질 표적물의 비생리적 축적으로 특징되는 유전자 이식된 동물로의 항체(뇌실질내(intracranical), 수강내(intrathecal) 또는 뇌실내(intraventricular)) 및 관련되지 않은 항체 대조군의 표적된 뇌 전달에 의해 또는 전신 치료에 의해 평가하였다. 치료 효과는 변경되거나 응집된 단백질 표적물을 면역염색 또는 조직화학적 염색 처리하고, 이러한 응집물에 의해 피복된 면적, 응집물 크기 및 응집물의 수를 측정하고, 상이한 뇌 영역에서 단백질 표적물의 농도를 생화학적으로 정량화하여 평가하였다.
항체 치료 관련 부작용의 부재
항체 치료의 잠재적 표적물 관련 부작용이 뇌내 응집되어 있거나 형태적으로 변경된 단백질 표적물의 비생리적 축적으로 특징되는 유전자 이식된 동물로의 항체(뇌실질내, 수강내 또는 뇌실내) 및 관련되지 않은 항체 대조군의 표적된 뇌 전달에 의해 또는 전신 치료에 의해 평가될 것이다. 잠재적 부작용은 면역염색 또는 조직화학적 염색(예를 들어, 미세출혈(microhemorrhage)에 대해 프러시안 블루(Prussian blue), 헤마톡실린-에오신(hematoxilin-eosin), 활성화된 백혈구) 및 생화학적 정량화(예를 들어, ELISA에 의한 시토킨 수준)에 의해 평가될 것이다.
생존 세포의 면역형광 염색
HEK 293 세포를, 세포내 C 말단에서 황색 형광 단백질 변이체 시트 린(Citrine)에 융합된 인간 야생형 APP를 발현하는 벡터로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 24시간 후, 세포를 30분 동안 4℃에서 인간 재조합 항체 또는 대조군 항체와 함께 인큐베이팅시켰다. 세척 단계 후, 세포를 고정화시키고, 표면 결합된 항체를 인간 또는 마우스 IgG (Jackson ImmunoResearch)에 대한 Cy-3 표지된 2차 항체를 사용하여 검출하였다. 공초점 현미경(Leica)으로 형광 분석을 수행하였다.
Abeta 피브릴의 제조
Abeta 펩티드를 바켐(Bachem)((Bubendorf, Switzerland)으로부터 구입하였다. 동결된 펩티드를 TFA 중에서 재구성시키고, 검정시 단량체 Abeta로서 사용하기 직전에 PBS 중에 재현탁시켰다. 24시간 동안 37℃에서 PBS 중 lOO㎍/ml의 농도로 단량체 Abeta1-42 펩티드를 인큐베이션함으로써 Abeta 피브릴을 제조하였다. 단량체 Abeta 펩티드 및 피브릴 제제는 ELISA 플레이트를 코팅하는 기판으로서 사용되었다.
웨스턴 블롯팅(Western blotting)
단량체 Abeta 펩티드를 로딩 염료와 혼합하고, 가열 변성시키고, 0.2㎍을 레인당 로딩시키고, SDS-PAGE 구배로 분리하였다. 블롯을 2시간 동안 1차 항체로 인큐베이팅하였다. 1차 인간 모노클로날 항체 또는 마우스 대조군 항체 6E10의 결합이 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)로 컨쥬게이트된 2차 항 인간 또는 항 마우스 항체를 사용하여 밝혀졌다. 블롯을 수퍼시그널 웨스트 펨토 맥시멈 센서티버티 섭스트레이트(SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate)(Pierce, Fisher Scientific, Wohlen, Switzerland)를 사용하여 디벨롭핑하였다.
조직 아밀로이드 플라그 결합의 경쟁
재조합 인간 NI-101.11 항체를 Abeta 펩티드 제제와 함께 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 이후, 항체/Abeta 제제를 신경병리학적으로 확인된 알츠하이머병을 앓고 있는 환자로부터 얻은 뇌 절편을 면역화학적으로 염색하는데 사용하였다. 5㎛의 크라이오(cryo)-부분을 준비하고, 1시간 동안 실온에서 PBS 중의 4% BSA, 5% 염소 혈청 및 5% 말 혈청으로 블록킹하고, 1시간 동안 실온에서 NI-101.11/Abeta 제제로 염색하였다. 세척 단계 후, 조직 부분에 대한 인간 항체의 결합을 인간 IgG(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd)에 대한 Cy3-컨쥬게이트된 2차 항체를 사용하여 분석하였다. 도립형광현미경(Leica, Heerbrugg, Switzerland)으로 형광 분석을 수행하였다.
실시예 1
인간 뇌 질병에 침범된 비정상 구조물에 대한 인간 항체의 검출
표현형적으로 건강한 피검체, 또는 알츠하이머병에 대해 임상적으로 특이적으로 안정한 환자로부터의 항체를, 알츠하이머병이 병리학적으로 확인된 환자로부터 얻은 뇌 절편에 대해 면역조직화학에 의해 시험하였다. 도 1A는 인간 베타-아밀로이드에 대한 공지의 항체로의 공동 염색에 의해 확인된 바와 같이(항체 4G8; 도 1B), 베타-아밀로이드 플라그에 결합하는 임상적으로 특이적으로 안정한 환자에게 항체가 존재함을 입증하고 있다. 알츠하이머병이 있는 환자로부터 얻은 조직 절편에서 신경섬유 덩어리에 대한 항체가 건강한 인간 피검체에서 존재함이 도 2A 에 도시되어 있다. 이러한 결과는 인간 tau(HT7)에 대한 공지된 항체에 의한 공동 염색에 의해 확인되었다. 도 3A는 알츠하이머병이 있는 환자로부터 얻은 조직 절편에서의 이영양성 신경돌기에 대한 항체가 건강한 인간 피검체에서 존재함을 밝혀주고 있다. 인간 tau(HT7)에 대한 공지된 항체로의 대조군 염색은 도 3B에 도시되어 있다. 이들 결과는 조직병리학적으로 확인 진단된 인간 조직 샘플내의 확인가능한 병리학적 구조물에 대해 항체가 표현형적으로 건강하거나, 임상적으로 특이적으로 안정한 환자에게서 존재함을 입증하는 것이다.
실시예 2
재조합 인간 항체는 생체내 비정상 구조물에 대한 특이성을 유지하고, 뇌 아밀로이드 플라그의 질병 관련된 베타-아밀로이드 단백질의 형태적 에피토프를 인식하지만, 생리적 전구체 또는 이의 비병원성 유도체를 인식하지 않는다
항체 NI-1Ol.11, NI-101.12, NI-101.13A 및 NI-101.13B를, 인지 장애가 상당한 감소된 임상적으로 특이적으로 안정한 알츠하이머병 환자로부터 얻었다. 항체 분리 및 재조합 생성은 보충적 방법에서 명시되어 있는 바와 같이 수행하였다.
NI-101.11
재조합 NI-101.11을 뇌 베타-아밀로이드 플라그로의 결합에 대해 시험하였다(도 4). 신경병리학적으로 확인된 알츠하이머병이 있는 환자로부터 얻은 뇌 절편을 지시된 농도로 염색하였다. 50pM의 농도를 갖는 베타-아밀로이드 플라그에 대한 항체 결합은 높은 친화도 결합을 암시한다. 0.5nM의 농도에서 베타-아밀로이드 플라그에 대한 항체 NI-101.11의 결합은 1μM 이하의 농도에서 1 내지 16 위치 를 나타내는 선형의 합성 N 말단 Abeta 유래된 폴리펩티드의 과량 첨가에 의해 경쟁될 수 없다(도 5). 또한, 8nM 농도에서 뇌 절편 상의 베타-아밀로이드 플라그로의 NI-101.11의 결합은 과량의 Abeta1-42 피브릴(4μM)에 의해 경쟁되나, 4μM 농도에서의 선형 합성 Abeta1-42 단량체에 의해서는 경쟁되지 않는데, 이는 NI-101.11 가 단량체 Abeta에 존재하지 않는 형태적 에피토프를 인식함을 시사하는 것이다(도 6).
선형의 단량체 합성 Abeta로의 인간 재조합 NI-101.11의 결합을 추가로 평가하기 위해, 단량체 Abeta의 제제를 비변성 PAGE에 의해 분리하였다. 블롯팅된 단백질을 N말단 선형 Abeta 서열(6E10)에 대한 대조군 항체 및 인간 재조합 NI-101.11 항체로 프로브하였다. 6E10은 단량체 Abeta 펩티드를 우세하게 염색하였으나, 인간 NI-101.11에 대해서는 결합이 전혀 검출되지 않았는데, 이는 NI-101.11가 선형의 단량체 Abeta 펩티드에 결합하지 않으나, 형태적 Abeta 에피토프를 인식함을 시사하는 것이다(도 7).
합성 Abeta1-42 펩티드 및 단량체 Abeta로부터 제조된 인공 아밀로이드 피브릴에 대한 재조합 NI-101.11의 결합을 ELISA에 의해 측정하였다(도 8). 동일한 코팅 밀도에서 ELISA 플레이트 상에 코팅된 합성 Abeta 피브릴 또는 단량체 합성 Abeta를 지시된 농도로 NI-101.11와 함께 인큐베이팅하였다. 인공 아밀로이드 피브릴에 대한 결합(개방된 사각형)은 단량체 Abeta(진한 사각형)와 비교하여 10배 이상 높다. Abeta의 C-말단에 대한 대조군 항체 22C4는 우선적으로 단량체 Abeta(진한 원형)에 결합하고, 피브릴(개방된 원형)에 대해 덜 잘 결합한다. 이는 NI-101-10가 또한 합성 Abeta 펩티드로부터 제조된 인공 아밀로이드 피브릴 상에 존재하는 형태적 에피토프를 인식함을 시사하는 것이다.
세포 전장 APP에 대한, 또는 그 임의의 생리적 유도체와의 재조합 인간 NI-101.11 항체의 교차반응성을 세포 결합 검정에 의해 측정하였다(도 9).
마커로서 시트린에 융합된 인간 APP를 안정하게 발현하는 살아있는 HEK 293 세포를, N-말단 선형 Abeta 서열에 대한 대조군 항체 6E10 또는 재조합 인간 NI-101.11 항체와 함께, 내면화(internalization)를 방지하기 위해 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 시트린-양성 시그널은 APP-발현 세포를 지시하였다. 융합 작제물을 발현하는 모든 세포에서 세포-표면 APP에 결합하는 대조군 항체(6E10)와는 대조적으로, 전장 APP에 대한 재조합 인간 NI-101.11 항체의 결합은 전혀 검출되지 않았다. 이러한 데이타는 생리적 세포 APP에 대한 NI-101.11의 교차반응성이 부재함을 입증한다.
단량체 Abeta로의 NI-101.11의 결합 결여는 추가로 크기 배제 크로마토그래피에 의해 입증되었다: 단량체 FITC-표지된 Abetal-42에 대한 NI-101.11 또는 관련없는 대조군 항체의 결합이 관찰되지 않았다(도 1OA, 도 10B). 대조적으로, Abeta의 C-말단에 존재하는 선형 에피토프에 대해 유도된 항체 22C4는 FITC-Abetal-42 단량체와 함께 용리되었다(도 10C).
경쟁 ELISA에서, Abeta의 N-말단에서의 선형 에피토프에 대해 유도된 항체인 6E10의 결합은 과잉 농도의 단량체 Abetal-16, Abetal-28 및 Abetal-40 펩티드와의 사전 인큐베이션시 완전히 블록킹될 수 있다. 대조적으로, 과잉 농도의 선형 Abeta 펩티드의 사전 인큐베이션은 NI-101.11 결합을 무효화하지 않았는데, 이는 NI- 101.11가 형태적 에피토프를 필요로 함을 시사하는 것이다(도 11).
NI-101.13A 및 13B
재조합 인간 항체 NI-101.13A 및 13B를 알츠하이머병(Tg2576)의 APP 유전자 이식된 마우스 모델로부터 얻은 뇌 절편으로의 결합에 대해 시험하였다. NI-1Ol.13A 및 NI-101.13B는 10nM 농도에서 베타-아밀로이드 플라그가 명백하게 염색되게 하였다(도 12). 합성 Abeta1-42 펩티드 및 단량체 Abeta로부터 제조된 인공 아밀로이드 피브릴에 대한 재조합 NI-101.13A 및 NI-101.13B의 결합을 ELISA에 의해 측정하였다. 동일한 코팅 밀도로 ELISA 플레이트 상에 코팅된 Abeta 피브릴 또는 단량체 합성 Abeta를 지시된 농도로 NI-101.13A 및 NI-101.13B와 함께 인큐베이팅하였다. 시험된 두 항체에 대해 단량체 Abeta에 비해 인공 아밀로이드 피브릴에 대한 우선적인 결합이 관찰되었다(도 13).
NI-101.12
합성 Abeta1-42 펩티드에 대한 재조합 NI-101.12의 결합을 ELISA에 의해 확인하였다(도 14A). 133nM에서 NI-101.12 결합이 과잉의 Abetal-42 펩티드에 의해 경쟁되었다(도 14B).
실시예 3
뇌 베타-아밀로이드에 대한 재조합 인간 항체는 알츠하이머병의 유전자 이식된 마우스 모델에서 혈액 뇌 장벽을 통과하여, 생체내 뇌 베타-아밀로이드 플라그에 결합한다
재조합 인간 NI-101.11 항체가 혈액 뇌 장벽을 통과하여 생체내 뇌 베타-아밀로이드 플라그에 결합하는 지를 측정하기 위해, 유전자 이식된 PS-1/APPswe 알츠하이머병 모델 마우스에 150㎍ NI-101.11을 제 1일 및 제 3일에 두번 말초 주입하였다. 2번째 주입 후 24시간 후 마우스를 희생시키고, PBS를 주입하였다. 뇌를 수거하고, 뇌 절편을 인간 IgG에 대한 FITC 표지된 항체로 염색하거나, 마우스 모노클로날 Abeta 항체 6E10로 염색한 후 마우스 IgG에 대한 FITC 표지된 항체로 염색하여 뇌 베타-아밀로이드 플라그의 존재를 확인하였다. 항-인간 IgG로의 아밀로이드 플라그의 강한 염색은, 재조합 인간 NI-101.11 항체가 유전자 이식된 마우스의 혈액-뇌 장벽을 통과하여, 살아있는 동물의 뇌 베타-아밀로이드 플라그에 결합할 수 있음을 나타내는 것이다(도 15).
실시예 4
베타-아밀로이드에 대한 재조합 인간 항체는 비정상 인지 거동을 개선시키고, 미세출혈의 빈도를 증가시키지 않으면서 알츠하이머병의 유전자 이식된 마우스 모델의 베타-아밀로이드 플라그 로드, 별아교세포증가증(astrogliosis) 및 소교세포증(microgliosis)을 감소시킨다
24개월령 arcAbeta 마우스 및 동일 월령의 야생형 한배의 새끼를 2개월 동안 매주 3 mg/kg 재조합 NI-101.11 항체 또는 이소타입의 인간 대조군 항체로 치료하였다. 유전자 이식된 마우스의 비정상 거동에 대한 치료 효과를 평가하기 위해, Y-미로 거동 시험을 치료 완료 전후에 수행하였다. 자발적 교대율을 40 x 20 x 10cm 아암 크기를 갖는 Y자형 플라스틱 미로를 사용하여 평가하였다. 5분 기간 동 안에, 아암 입장의 순서를 기록하고, 교대율은 중복되는 세개의 셋트에서, 세개의 아암으로 연속 입장하는 것으로 정의하였다. 교대율의 %는 가능한 교대율(총 아암 입장의 수 - 2로서 정의됨)에 대한 실제 교대율의 비 x 100으로서 계산하였다. 치료받지 않은 arcAbeta 마우스 및 야생형 한배의 새끼 대조군의 Y-미로 수행능을 독립표본 t-시험(unpaired t-test)을 사용하여 비교하였다. 비모수 크루스칼-월리스 시험(nonparametric Kruskal-Wallis test)을 사용하여 모든 4개의 그룹의 치료 후에 개선사항을 비교하였다. 비모수 만-휘트니 U 시험(nonparametric Mann- Whitney U test)을 상이한 그룹의 개별쌍별 비교를 위해 채택하였다. 제로-수행자(zero-performer)(즉, 마우스가 놓여 있었던 아암을 떠나지 않은 마우스)는 분석에서 제외시켰다.
상술된 연구에서 관찰된 바와 같이, 치료되지 않은 24개월령 arcAbeta 마우스는 이들의 야생형 한배의 새끼에 비해 상당히 손상되었다(도 16A, 치료 전; 독립표본 t-test, p=0.0007).
NI-101.11 치료된 arcAbeta 마우스는 치료 2개월 NI-101.11 치료된 야생형 대조군 마우스에 필적할 만한, 명백히 증진된 변경 수준을 나타내었다. 개선점(즉, 치료 후의 수행능 - 치료 전의 수행능)의 분석에서는 4개의 그룹 간에 상당한 차이를 나타냈다(도 16B, 크루스칼-월리스 시험; p=0.03). 모든 그룹 간의 개별쌍별 후-hoc 분석에서는 NI-101.11 치료된 arcAbeta 마우스가 야생형 마우스보다 인지 수행능이 현저히 개선된 것으로 나타났다(만-휘트니 U; p=0.05 NI-101.11 tg vs. NI-101.11 wt; p=0.008 NI-101.11 tg vs. 대조군 wt). 상기 마우스 그룹은 또 한 대조군 항체 처리된 유전자 이식된 한배의 새끼와 비교하여 개선된 수행능의 경향이 강하게 나타났다(만-휘트니-U; p=0.08 NI-101.11 tg vs. 대조군 tg). 모든 마우스가 재시험에서는 수행능이 대략 10% 개선된 것으로 나타났으며, 이는 익숙한 작업 환경으로 기인한 듯하다.
아밀로이드 축적, 별아교세포증가증 및 소교세포증에 대한, 장기간인 2개월간 NI-101.11 치료에 대한 효과를 정량적 조직화학 및 면역조직화학 분석에 의해 분석하였다. 이를 위해, 마우스를 거동 시험의 종료 후에 마취하고, PBS를 경심 관류시켰다. 어느 한 뇌 반구를 4% 파라포름알데히드에 고정시키고, 파라핀 중에 삽입하였다. 5㎛ 시상면(sagittal section)을 레이카(Leica) RM 2135 마이크로톰(Bannockburn, Illinois)으로 잘라냈다. 피질 및 해마 중의 베타-아밀로이드 플라그 로드를 표준 프로토콜에 따라 티오플라빈(Thioflavin) S 및 콩고 레드(Congo Red)로 염색된 뇌 절편에 대해 정량화하였다. 면역조직화학분석을 위해, 슬라이스를 탈확스처리하고, 실온에서 1시간 동안 PBS 중의 4% BSA, 5% 염소 혈청 및 5% 말 혈청으로 블록킹하였다. 항체를 하기 희석율을 사용하여 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다: 항 GFAP (Advanced Immunochemicals) 1:500, 항 IBAl (WAKO) 1:500. 2차 플루오로포어(fluorophore) 결합된 항체를 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 마우스 뇌당 75㎛ 이격되어 있는 2-3개의 절편을 각가의 염색에 사용하였따. 절편당 2개의 이미지를 취하여 피질 분석(두정 및 전두 영역)을 위해 10배 확대하였다. 전체 해마 영역(ROI에 대해 5배 확대)을 해마 분석을 위해 취하였다. 소프트웨어 이미지제이(software ImageJ)로 자동화 이미지 분석을 수행하였다.
6E10 및 항-인간 IgG로 면역화된 arcAbeta 마우스로부터의 뇌 절편의 이중 염색에 의해 NI-101.11가 Abeta 침착물에 결합한다는 것이 밝혀졌으며(도 17, 좌측 패널), 이는 NI-101.11가 혈액 뇌 장벽을 통과하여, 뇌 베타-아밀로이드 플라그에 결합할 수 있음을 나타낸다. Abeta 침착물로의 인간 항체의 결합은 대조군 항체 처리된 arcAbeta 마우스에서는 나타나지 않았다(도 17, 우측 패널).
3mg/kg의 NI-101.11에 의한 장기간 치료는 티오플라빈 S 및 콩고 레드 염색에 의해 밝혀진 바와 같이 아밀로이드 플라그 로드를 현저히 감소시켰다. 이러한 감소는 대조군 항체 치료된 arcAbeta 마우스와 비교하여 피질 및 해마에서 50% 초과의 수준에 달하였다(도 18A, B). 플라그 영역 이외에(도 18C), 플라그의 수(도 18D) 및 평균 플라그 크기(도 18E)에서도 현저한 감소가 관찰되었다.
NI-101.11에 의한 장기간 치료가 arcAbeta 마우스의 신경염증 반응에 영향을 미치지는 지를 시험하기 위해, 반응성 성상세포 및 미소교질세포를 면역조직학적 염색 후에 정량화하였다. 반응성 성상세포 수의 감소(항 GFAP-염색)가 대조군 항체 치료된 동물과 비교하여 NI-101.11 치료된 arcAbeta 마우스의 피질에서 관찰되었다(도 19A; 만-휘트니-U; p=0.047). 해마에서는 변화가 전혀 검출되지 않았다. 미소교질세포 및 마크로파지의 마커에 대한 항체(항-Ibal)로의 염색에서는 또한 감소된 염증에 대한 통계적 경향이 나타났다(도 19B; 만-휘트니-U; 피질 및 해마 둘 모두에 대해 p=0.075). 성상세포 및 미소교질세포에서의 감소는 NI-101.11 치료 후 관찰된 감소된 베타-아밀로이드 로드에 따른다.
Abeta에 대해 유도된 특정 모노클로날 항체로의 피동 면역요법은 증가된 뇌 내 미세출혈의 빈도와 관련될 수 있다(Pfeifer et al., Science 298 (2002), 1379; Wilcock et al., J Neuroinflammation 1 (2004), 24). NI-101.11로의 장기간 치료에 대한 효과를 평가하기 위해, 장기간 NI-1O1.11 치료 후 arcAbeta 및 야생형 마우스로부터의 뇌 절편 상에서 펄스 프러시안 블루 염색(Perl's Prussian blue) 염색을 수행하였다. 이러한 염색은 헤모시데린(hemosiderin), 헤모글로빈의 분해 산물, 및 이전의 미세출혈의 마커의 존재를 밝혀주었다(도 20). 대조군 항체로 치료된 늙은 마우스에서, 프로시안 블루 양성 프로파일의 빈도는 야생형 한배의 새끼에 비해 현저히 상승되었다(만-휘트니-U; p=0.001). NI-101.11로의 치료는 대조군-항체 치료된 arcAbeta 마우스와 비교한 경우 미세출혈의 수를 증가시키지 않았으며(만-휘트니-U; p=0.347), 이는 NI-101.11 치료의 유익한 치료 효과가 피동 Abeta 면역요법의 이러한 흔히 관찰되는 부작용의 부재시에 발생한다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 5
뇌 베타-아밀로이드에 대한 인간 재조합 항체는 시험관내 합성 Abeta 피브릴의 형성을 억제한다
Abeta-피브릴의 형성에 대한 재조합 인간 NI-101.11 항체의 효과를 형광 분석에 의해 응집된 Abeta에 결합된 티오플라빈 S을 측정하여 검정하였다. 단량체 Abeta 용액을 증가하는 농도의 NI-101.11의 존재 하에 24시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 시험관내 합성 Abeta 피브릴의 형성은 농도 의존적 방식으로 재조합 인간 NI-101.11에 의해 억제되었다(도 21).
실시예 6
BV-2 미소교질세포-유래된 세포에 의한 Abeta 피브릴의 생체외 식세포 작용(Phagocytosis)에 대한 효과
Abeta 피브릴의 Fc감마-수용체 매개된 식세포작용에 대한 NI-101.11에 대한 효과를 BV-2 미소교질세포-유래된 세포주에서 연구하였다. BV-2 세포를 5% FBS, 펜/스텝(Pen/Step) 및 글루타민 보충된 DMEM 중에서 유지시켰다. 세포를 트립신화시키고, 120,O00개의 BV-2 세포/웰을 평평한 저부의 24-웰 플레이트에서 시딩하였다. 12시간 후, 배지를 2OmM HEPES(pH 7.3), 1% BSA, 10㎍/ml 펜/스텝으로 보충된 400㎕ DMEM/F12/웰로 대체하였다. 스캐빈져 수용체의 억제제인 100㎍/ml의 푸코이단(Fucoidan)을 실험 30분 전에 첨가하였다. 50μM FITC-표지된 Abeta 피브릴을 30분 동안 37℃에서 지시된 농도의 항체와 사전 인큐베이팅시키고, 2회 세척하고 5분 동안 14,0OO x g으로 원심분리하였다. 이 현탁액을 조직 배양 플레이트에 첨가하였다. 30분 후, BV-2 세포를 HBSS로 2회 세척하여 결합되지 않은 원섬유성 Abeta를 제거하였다.
세포를 4℃에서 20분 동안 250㎍/ml의 트립신/EDTA로 처리하고, 2회 세척하고 4℃에서 5분 동안 500 x g로 원심분리하였다. 세포를 FACS-Fix(PBS, 2%FA, 2%글루코스, 5mM NaN) 중에서 20분 동안 고정시키고, FACS 세척액 (PBS, 5μM EDTA, 0.2% BSA)으로 세척하였다. 10,000개의 세포의 형광(FL-1)을 FACS 분석에 의해 측정하였다(문헌(Webster SD et al, JI 2001)에 기초하여).
FITC-표지된 Abeta1-42 피브릴의 Fc감마 수용체-의존적 식세포작용을 스캐빈 져 수용체 시스템의 억제에 대해 측정하였다. 인간 NI-101.11 및 Abeta 펩티드(6El0)의 N-말단에서 선형 에피토프에 대해 유도된 구입가능한 항체의 비교 분석은 Abeta 피브릴의 식세포작용의 용량-의존적 유도를 입증하였다. NI-101.11에 의해 매개된 피브릴의 흡수율은 6E10 항체에 대해 관찰된 것보다 3배 이하로 더 높다(도 22). 이러한 데이타는 NI-101.11가 미소교질세포에 의한 Abeta의 용량-의존적 Fc감마 수용체 매개된 식세포작용을 유력하게 유발시킴을 나타낸다.
결론
본 발명에 따라 수행된 상기 실험에서 입증된 바와 같이, 놀랍게도 표현형으로 건강한, 비증상 인간 피검체에게서 뿐만 아니라 인지 장애 또는 알츠하이머병의 진단 있음에도 불구하고 특이적으로 안정한 임상적 질병이 있는 환자에게서 보호적이고, 치료 활성인 항체 및 B 세포 생성 항체를 검출가능하였다. 보다 구체적으로, 항원의 생리적 기능성 형태를 식별하는 새로운 부류의 인간 항체는 검출되고 분리될 수 있어서, 지금까지 면역요법의 문제점인 자가면역 부작용을 위험을 최소화시킨다. 따라서, 병태생리적 관련 구조에서 항원의 변이체를 특이적으로 인식하는 항체 및 등가의 결합 분자가 제공되며, 항체는 예를 들어 FcR 발현 마크로파지 또는 미소교질세포에 대한 병원체를 보이게 하여 무해하게 함으로써 독성을 감소시키거나 농도를 감소하거나 분해를 촉진시키기 위해 결합하게 된다. 실시예에서 추가로 입증된 바와 같이, 이러한 항체는 치료에 효과적이고, 뇌 미세출혈의 빈도를 증가시키지 않으면서 비정상 병리학적 단백질 및 이의 응집물을 현탁시키고 유해한 효과를 방지할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Zurich <120> Method of providing disease-specific binding molecules and targets <130> NE30A06/P-WO <160> 56 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 66 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(66) <223> Leader peptide derived from human Vkappa I L5, restriction site Xba 1 introduced 3' of the sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(66) <400> 1 atg gac atg cgg gtg ccc gcc cag ctg ctg ggc ctg ctg ctg ctg tgg 48 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 ttc ccc ggc tct aga tgc 66 Phe Pro Gly Ser Arg Cys 20 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ser Arg Cys 20 <210> 3 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(372) <223> NI-101.10-variable heavy (Vh) chain sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <400> 3 gag gtg cag cta gtg cag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48 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Ser Val Asp Ala Ser Lys Asn Gln Leu 65 70 75 80 Ser Leu Ser Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Ala Gly Glu Asn Ser Gly Gly Ile Glu Pro Tyr Tyr 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 11 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(330) <223> NI-101.12-variable kappa (Vkappa) light chain sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <400> 11 gac gag atc gtg ctg acc cag agc ccc agc agc ctg agc gcc agc atc 48 Asp Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile 1 5 10 15 ggc gac cgg gtg acc atc acc tgc cgg gcc agc gag agc atc aac aag 96 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asn Lys 20 25 30 tac gtg aac tgg tac cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc aag ctg ctg 144 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 atc tac gcc gcc agc agc ctg cag agc ggc gcc ccc agc cgg gtg agc 192 Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Ala Pro Ser Arg Val Ser 50 55 60 ggc agc ggc ttc ggc cgg gac ttc agc ctg acc atc agc ggc ctg cag 240 Gly Ser Gly Phe Gly Arg Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 gcc gag gac ttc ggc gcc tac ttc tgc cag cag agc tac agc gcc ccc 288 Ala Glu Asp Phe Gly Ala Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro 85 90 95 tac acc ttc ggc cag ggc acc aag gtg gag atc aag cgg acc 330 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 12 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asn Lys 20 25 30 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Ala Pro Ser Arg Val Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Phe Gly Arg Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Phe Gly Ala Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 13 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(363) <223> NI-101.13-variable heavy (Vh) chain sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 13 cag gta cag ctg cag gag tca ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc agc aga aga 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Arg 20 25 30 agt tac tac tgg ggc tgg atc cgc cag tcc cca ggg aag ggg ctg gag 144 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg agt gga agt atc cat tat agc ggg agc acc tac tac aac ccg tcc 192 Trp Ser Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtc acc ata tct gta gac acg tcc aag aac cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg aaa ctg agc tct gtt acc gcc gca gac acg gct gtc tat tac 288 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga tca cgt tgg ggc agc agc tgg gta ttt gac tac tgg ggc 336 Cys Ala Arg Ser Arg Trp Gly Ser Ser Trp Val Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 cag ggc aca ctg gtc acc gtc tct tcg 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Arg 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ser Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Arg Trp Gly Ser Ser Trp Val Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(330) <223> NI-101.13-variable lambda (Vlambda) light chain sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <400> 15 cag agc gtg ctg acc cag ccg ccg agc gcg agc ggc acc ccg ggc cag 48 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 cgc gtg acc att agc tgc agc ggc agc agc agc aac att ggc agc aac 96 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 tat gtg tat tgg tat cag cag ccg ccg ggc acc gcg ccg aaa ctg ctg 144 Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 att tat cgc aac aac cag cgc ccg agc ggc gtg ccg gat cgc ttt agc 192 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agc aaa agc ggc acc agc gcg agc ctg gcg att agc ggc ctg cgc 240 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 agc gaa gat gaa gcg gat tat tat tgc gcg gcg tgg gat gat agc ctg 288 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 agc ggc tat gtg ttt ggc acc ggc acc aaa gtg acc gtg ctg 330 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 16 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.10 Vh, CDR1 <400> 17 Ser Tyr Gly Ile His 1 5 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.10 Vh, CDR2 <400> 18 Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.10 Vh, CDR3 <400> 19 Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.11 and NI-101.12F6A Vh, CDR1 <400> 20 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.11 and NI-101.12F6A Vh, CDR2 <400> 21 Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.11and NI-101.12F6A Vh, CDR3 <400> 22 Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.10, NI-101.11 and NI-101.12F6A Vkappa, CDR1 <400> 23 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.10, NI-101.11 and NI-101.12F6A Vkappa, CDR2 <400> 24 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.10, NI-101.11 and NI-101.12F6A Vkappa, CDR3 <400> 25 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.12 Vh, CDR1 <400> 26 Ser Gly Ser Ile Cys 1 5 <210> 27 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.12 Vh, CDR2 <400> 27 Trp Ile Gly Tyr Phe Cys Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Tyr Thr Pro Ser 1 5 10 15 Leu Arg Gly <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.12 Vh, CDR3 <400> 28 Arg Ala Gly Glu Asn Ser Gly Gly Ile Glu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.12 Vkappa, CDR1 <400> 29 Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asn Lys Tyr Val Asn 1 5 10 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.12 Vkappa, CDR2 <400> 30 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.12 Vkappa, CDR3 <400> 31 Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Tyr Thr 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.13 Vh, CDR1 <400> 32 Arg Arg Ser Tyr Tyr Trp Gly 1 5 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(16) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.13 Vh, CDR2 <400> 33 Ser Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.13 Vh, CDR3 <400> 34 Ser Arg Trp Gly Ser Ser Trp Val Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(13) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.13 Vlambda, CDR1 <400> 35 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.13 Vlambda, CDR2 <400> 36 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.13 Vlambda, CDR3 <400> 37 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 38 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(372) <223> NI-101.12F6A-variable heavy (Vh) chain sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <400> 38 cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tct gga ttc gcc ttc agt agc tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gtt ata tgg ttt gat gga act aaa aaa tac tat aca gac tcc gtg 192 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc aga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac aca ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac acc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga gat agg ggt ata gga gct cgg cgg ggg ccg tac tac atg gac 336 Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp 100 105 110 gtc tgg ggc aaa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 372 Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 40 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(324) <223> NI-101.12F6A-variable kappa (Vkappa) light chain sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 40 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agc tat 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 tta aat tgg tat caa cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgt cag cag agt tac agt acc cct ctc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt 324 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 41 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 42 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(121) <223> NI-101.13A-variable heavy (Vh) chain sequence <400> 42 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Arg 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ser Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Arg Trp Gly Ser Ser Trp Val Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(121) <223> NI-101.13B-variable heavy (Vh) chain sequence <400> 43 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Arg 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ser Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Arg Trp Gly Ser Ser Trp Val Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(107) <223> NI-101.13A-variable light (Vl) chain sequence <400> 44 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 45 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(108) <223> NI-101.13B-variable light (Vl) chain sequence <400> 45 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.13A-variable light (Vl) chain sequence, CDR1 <400> 46 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.13A-variable light (Vl) chain sequence, CDR2 <400> 47 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.13A-variable light (Vl) chain sequence, CDR3 <400> 48 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Arg Thr 1 5 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.13B-variable light (Vl) chain sequence, CDR1 <400> 49 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.13B-variable light (Vl) chain sequence, CDR2 <400> 50 Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> complementarity determining region (CDR) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> Denomination of CDR protein sequences in Kabat Nomenclature of NI-101.13B-variable light (Vl) chain sequence, CDR3 <400> 51 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Arg Thr 1 5 <210> 52 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(363) <223> NI-101.13A-variable heavy (Vh) chain sequence <400> 52 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agaagaagtt actactgggg ctggatccgc 120 cagtccccag ggaaggggct ggagtggagt ggaagtatcc attatagcgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatctgtag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccctgaaac tgagctctgt taccgccgca gacacggctg tctattactg tgcgagatca 300 cgttggggca gcagctgggt atttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tcg 363 <210> 53 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(363) <223> NI-101.13B-variable heavy (Vh) chain sequence <400> 53 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agaagaagtt actactgggg ctggatccgc 120 cagtccccag ggaaggggct ggagtggagt ggaagtatcc attatagcgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatctgtag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccctgaaac tgagctctgt taccgccgca gacacggctg tctattactg tgcgagatca 300 cgttggggca gcagctgggt atttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tcg 363 <210> 54 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(324) <223> NI-101.13A-variable light (Vl) chain sequence <400> 54 gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccagaacgtt cggccaaggg 300 accaaggtgg agatcaaacg tacg 324 <210> 55 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(327) <223> NI-101.13B-variable light (Vl) chain sequence <400> 55 gacatccagt tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagattcca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attctcgaac gttcggccaa 300 gggaccaagc tggagatcaa acgtacg 327 <210> 56 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(372) <223> NI-101.11-variable heavy (Vh) chain sequence <400> 56 gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt cgccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtttg atggaactaa aaaatactat 180 acagactccg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactgtat 240 ctgcaaatga acaccctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatagg 300 ggtataggag ctcggcgggg gccgtactac atggacgtct ggggcaaagg gaccacggtc 360 accgtctcct ca 372

Claims (51)

  1. 질병 관련 단백질 특이적 결합 분자를 분리시키는 방법으로서,
    (a) 증상은 없으나 질병에 걸려 있거나 발병의 위험이 있는 환자, 또는 특이적으로 안정한 질병이 있는 환자로부터 얻은 샘플을 설정된 임상 특징을 지닌 병리학적으로 변경된 세포 또는 조직의 시편으로 처리하고,
    (b) 상기 시편에는 결합하나 건강한 피검체의 상응하는 세포 또는 조직에는 결합하지 않는 결합 분자를 확인하고, 임의로 분리하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 샘플이 체액 또는 세포 샘플을 포함하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 체액이 뇌척수액, 혈장 또는 5 소변인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자가 항체인 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 B-세포 또는 메모리 B-세포를 포함하거나 이로부터 유래되는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 환자 및 피검체가 각 각 인간인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 대리 마커(surrogate marker)의 존재 또는 부재에 의해 아직 명백하지 않은 질병에 걸려 있는지 또는 그러한 질병에 걸릴 위험이 있는지를 측정하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 대리 마커가 고령자, 뇌 아밀로이드 로드, ApoE 유전형, APP 유전형, PS1 유전형, Abeta 펩티드의 체액 수준, 이소프로스탄(isoprostane), Tau, 및 포스포-Tau로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 질병이 신경성 질환, 자가면역 질환 및 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 질병이 알츠하이머병인 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 샘플이 하기 기준에 부합하는 환자로부터 얻어지는 방법:
    (i) 65세 이상일 것;
    (ii) 완전한 인지 능력 및 양호한 건강상태일 것; 및
    (iii) 치매에 대한 임상적 징후가 없을 것; 또는
    (iv) 알츠하이머병 가능성에 대해 확인된 임상적 진단이 있음에도 불구하고 특이적으로 질병의 진행 속도가 느릴 것.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 시편에는 결합하지만 건강한 피검체의 상응하는 세포 또는 조직에는 결합하지 않는 결합 분자, 예를 들어, 항체를 함유하는 것으로 확인된 샘플로부터 B 세포 또는 메모리 B 세포를 정제하는 단계;
    (ii) 상기 B 세포 또는 B 기억 세포로부터 상기 항체에 대한 면역글로불린 유전자 레퍼토리를 얻는 단계; 및
    (iii) 상기 항체를 발현시키기 위해 상기 레퍼토리를 이용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 단계(ii)가
    (iv) 상기 B 세포 또는 메모리 B 세포로부터 mRNA를 수득하는 단계;
    (v) 단계 (iv)의 mRNA로부터 cDNA를 수득하는 단계; 및
    (vi) 프라이머 연장 반응을 이용하여 상기 항체의 중쇄 (HC) 및 카파 경쇄 (LC)에 상응하는 단편을 상기 cDNA로부터 증폭시키는 단계를 포함하는 방법.
  14. 질병 관련 단백질의 네오에피토프(neoepitope)를 선택적으로 인식할 수 있 는, 제 1 항 내지 제 13 항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 얻을 수 있는 결합 분자.
  15. 제 14 항에 있어서, 비질병 관련 형태의 상기 단백질을 실질적으로 인식하지 않는 결합 분자.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 결합 분자.
  17. 제 16 항에 있어서, 인간 항체인 결합 분자.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 질병이 신경성 질환인 결합 분자.
  19. 제 14 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 질병이 뇌의 장애인 결합 분자.
  20. 제 14 항 내지 제 19 항 중의 어느 한 항에 있어서, 병리학적 부위에서 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있는 결합 분자.
  21. 제 14 항 내지 제 20 항 중의 어느 한 항에 있어서, 베타-아밀로이드 플라그, 뇌혈관 아밀로이드, 확산 Abeta 침착물, 신경원섬유, 과인산화 tau, 알파-시누클레인(synuclein) 양성 루이소체 또는 이영양성 신경돌기에 침착된 단백질 응집물에 결합할 수 있는 결합 분자.
  22. 제 14 항 내지 제 21 항 중의 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 정상적인 거동을 회복시킬 수 있는 결합 분자.
  23. 제 14 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 있어서, 단일 쇄 Fv 단편(scFv), F(ab') 단편, F(ab) 단편, 및 F(ab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 분자.
  24. 제 14 항 내지 제 23 항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 결합 단편이 가변 영역에 표 4에서 기재된 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 결합 분자.
  25. 표 2 및 3에 기재된 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열을 포함하는 제 24 항에 따른 항체 또는 이의 결합 단편.
  26. 제 14 항 내지 제 25 항 중의 어느 한 항에 따른 결합 분자에 의해 인식되는 항원.
  27. 제 26 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 26 항 중의 어느 한 항에 따른 질병 관련 단백질의 일부 또는 전부인 항원.
  28. 제 14 항 내지 제 25 항 중의 어느 한 항에 따른 결합 분자 또는 제 26 항 또는 제 27 항에 따른 항원을 엔코딩하는 폴리누클레오티드.
  29. 제 28 항에 있어서, 제 24 항 또는 제 25 항의 항체 또는 결합 단편의 면역글로불린 쇄의 적어도 가변 영역을 엔코딩하는 폴리누클레오티드.
  30. 임의로 상기 항체의 다른 면역글로불린 쇄의 가변 영역을 엔코딩하는 제 29 항의 폴리누클레오티드와 함께 제 28 항의 폴리누클레오티드 또는 제 29 항의 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터.
  31. 제 28 항 또는 제 29 항의 폴리누클레오티드, 또는 제 30 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  32. 질병 관련 단백질 특이적 결합 분자, 항체 또는 이의 결합 단편 또는 면역글 로불린 쇄(들)을 제조하는 방법으로서,
    (a) 제 31 항의 세포를 배양하고,
    (b) 배양물로부터 상기 결합 분자, 항체 또는 이의 결합 단편 또는 면역글로불린 쇄(들)을 분리시키는 것을 포함하는 방법.
  33. 제 28 항 또는 제 29 항의 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되거나, 제 32 항의 방법에 의해 얻어질 수 있는 결합 분자, 항체, 이의 면역글로불린 쇄 또는 결합 단편.
  34. 검출가능하게 표지된, 제 14 항 내지 제 25 항 또는 제 33 항 중의 어느 한 항의 결합 분자, 항체 또는 결합 단편.
  35. 제 34 항에 있어서, 검출가능한 표지가 효소, 방사성동위원소, 플루오로포어(fluorophore) 및 중금속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 분자, 항체, 또는 결합 단편.
  36. 약물이 부착된, 제 14 항 내지 제 25 항 또는 제 33 항 내지 제 35 항 중의 어느 한 항의 결합 분자, 항체 또는 결합 단편.
  37. 제 14 항 내지 제 25 항 또는 제 33 항 내지 제 36 항 중의 어느 한 항의 결 합 분자, 항체 또는 결합 단편, 제 28 항 또는 제 29 항의 폴리누클레오티드, 제 30 항의 벡터 또는 제 31 항의 세포를 포함하는 조성물.
  38. 제 37 항에 있어서, 약제 조성물이며, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  39. 제 38 항에 있어서, 유기 소분자, 항-Abeta 항체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 알츠하이머병을 치료하는데 유용한 추가의 제제를 추가로 포함하는 조성물.
  40. 제 37 항에 있어서, 진단 조성물이며, 면역 또는 핵산 기재 진단 방법에 통상적으로 사용되는 시제를 추가로 포함하는 조성물.
  41. 알츠하이머병을 치료하거나 진행을 예방하기 위한 약제 또는 진단 조성물을 제조하기 위한, 알츠하이머병과 관련된 증상을 개선시키기 위한, 알츠하이머병의 존재에 대해 피검체를 진단 또는 스크리닝하기 위한, 또는 피검체의 알츠하이머병의 발병에 대한 위험을 측정하기 위한, 제 14 항 내지 제 25 항, 또는 제 33 항 내지 제 36 항 중의 어느 한 항의 결합 분자, 항체 또는 결합 단편, 또는 이들의 실질적으로 동일한 결합 특이성을 지닌 항체, 제 26 항 또는 제 27 항의 항원, 제 28 항 또는 제 29 항의 폴리누클레오티드, 제 30 항의 벡터, 또는 제 31 항의 세포의 용도.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 약제 조성물이 정맥내, 근내, 피하, 복강내, 비강내, 비경구적으로 또는 에어로졸로서 투여되는 용도.
  43. 중추신경계에서 단백질의 비정상적 축적 및/또는 침착에 의해 특징되는 신경질환을 치료하는 방법으로서, 이러한 치료가 필요한 피검체에게 치료 유효량의, 제 14 항 내지 제 25 항, 또는 제 33 항 내지 제 36 항 중의 어느 한 항의 결합 분자, 제 26 항 또는 제 27 항의 항원, 제 28 항 또는 제 29 항의 폴리누클레오티드, 제 30 항의 벡터, 또는 제 31 항의 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 신경성 질환이 알츠하이머병, 다운 증후군, 경도인지장애, 대뇌 아밀로이드 맥관병증(cerebral amyloid angiopathy), 혈관성 치매(vascular dementia), 다발성 뇌경색성 치매(multi-infarct dementia), 파킨슨병, 헌팅톤병, 크로이츠펠트 야콥병(Creutzfeldt-Jakob Disease), 낭성섬유증(cystic fibrosis), 또는 고세병(Gaucher's disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  45. 제 43 항 또는 제 44 항에 있어서, 정맥내, 근내, 피하, 복강내, 비강내, 비경구적으로 또는 에어로졸로서 투여되는 방법.
  46. 알츠하이머병 및 Abeta 침착과 관련된 질병을 진단 및/또는 치료하는 방법으로서, 피검체에게 치료 유효량의, 제 24 항 또는 제 25 항의 항체 또는 결합 단편의 하나 이상의 CDR을 포함하는 리간드 Abeta 결합 분자, 또는 상응하는 항-이디오타입 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  47. 청구되는 펩티드 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 질병 관련 단백질의 존재로 동반되는 질병을 진단하기 위한 키트로서, 제 14 항 내지 제 25 항, 또는 제 33 항 내지 제 36 항 중의 어느 한 항의 결합 분자, 항체 또는 결합 단편, 제 26 항 또는 제 27 항의 항원, 제 28 항 또는 제 29 항의 폴리누클레오티드, 제 30 항의 벡터, 또는 제 31 항의 세포, 및 임의로 시제 및/또는 사용 설명서를 포함하는 키트.
  48. 뇌내 질병 관련 단백질에 대해 치료제 및/또는 진단제를 생체내 검출 또는 표적하고, 피검체에서 병리학적 단백질 응집물 또는 형태물의 검출하고, 이의 형성을 억제하기 위한, 질병과 관련된 인지 장애를 늦추거나 역전시키거나, 인지력을 개선시키기 위한, 또는 병리학적 화합물 또는 이의 체액으로부터의 전구체를 체외 추출하기 위한, 제 14 항 내지 제 25 항, 또는 제 33 항 내지 제 36 항 중의 어느 한 항의 결합 분자, 항체 또는 이의 결합 단편의 용도.
  49. NI-101.10, NI-101.11, NI-101.12, NI-101.13, NI-101.12F6A, NI-101.13A, 및 NI-101.13B로 이루어진 군으로부터 선택된 기준 항체와 질병 관련된 단백질의 동일한 네오에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  50. NI-101.10, NI-101.11, NI-101.12, NI-101.13, NI-101.12F6A, NI-101.13A, 및 NI-101.13B로 이루어진 군으로부터 선택된 기준 항체가 질병 관련된 네오에피토프로와 결합하지 않도록 경쟁적으로 억제하는 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  51. NI-101.10, NI-101.11, NI-101.12, NI-101.13, NI-101.12F6A, NI-101.13A, 및 NI-101.13B로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 동일한 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
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