MX2007014537A

MX2007014537A - Genes de la enfermedad de la leucemia y sus usos.

Info

Publication number: MX2007014537A
Application number: MX2007014537A
Authority: MX
Inventors: Natalie C Twine; Michael E Burczynski; Andrew J Dorner; Jennifer Ann Stover
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2005-05-18
Filing date: 2006-05-18
Publication date: 2008-02-12
Also published as: CA2608092A1; WO2006125195A2; EP1888784A2; WO2006125195A3; AU2006247027A1; JP2008545399A; CN101180407A

Abstract

La invencion caracteriza el uso de muestras de sangre completas o muestras que comprenden celulas mono nucleares de sangre periferica (PBMC) para diagnosticar o evaluar el progreso o tratamiento de la leucemia. Los genes que se expresan de forma diferencial en PBMC no fraccionado de pacientes con leucemia, segun se compara con humanos libres de la enfermedad o en paciente que tienen un tipo diferente de leucemia, se pueden identificar de acuerdo con la invencion. Estos genes son genes de la enfermedad de la leucemia y se pueden utilizar para detectar la presencia o progresion de la leucemia en un sujeto de interes. Las leucemias que son favorable para la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, leucemia mielogenosa aguda (AML) y sindrome mielodispasicos (MDS). Ejemplos no limitantes de genes de la enfermedad AML o MDS se proporcionan en las tablas 2, 4 y 6.

Description

GENES DE LA ENFERMEDAD DE LA LEUCEMIA Y SUS USOS CAMPO TÉCNICO La invención se relaciona con los genes de la enfermedad de la leucemia y métodos para utilizarlos para diagnóstico y tratamiento de la leucemia.

ANTECEDENTES Los síndromes mielodisplásicos (MDS) son un grupo heterogéneo de trastornos clónales de precursores de células de médula ósea caracterizados por tandas clínicas variables y resultados. Aproximadamente 30% de los pacientes con MDS progresan eventualmente a leucemia mielógena aguda (AML) y un ensayo diagnóstico clínico especialmente adecuado para la identificación temprana de este subconjunto de pacientes podría ayudar a enfocar las opciones terapéuticas en estos individuos.

Estudios de perfil de expresión recientes han revelado diferencias en las fracciones de células madre ematopoyéticas AC133+ de pacientes con MDS Vs. AML (Miyazato et al. (2001) Blood 98: 422-427). Se han observado resultados similares en perfiles de transcripción de células CD34+ purificadas de médula ósea de pacientes con MDS, que se alteran radicalmente a partir de los perfiles de transcripción de las células CD34+ de individuos libres de la enfermedad (Hofmann et al., (2002) Blood 100: 3553-3560). Estos estudios, sin embargo, involucran la selección positiva de subtipos celulares específicos, que es laborioso y consume tiempo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención caracteriza el uso de muestras de sangre periférica que contienen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para diagnóstico o evaluación de la progresión o tratamiento de AML y MDS. La presente invención no requiere la selección positiva de subtipos celulares específicos de la muestra se sangre, permitiendo por lo tanto el diagnóstico y evaluación rápidos de una leucemia. De acuerdo con esto, las muestras de sangre periférica adecuadas para la presente invención incluyen, pero no se limita a, muestras completas de sangre o muestras que comprende un PBMC no fraccionado. En muchos casos, las muestras de sangre periférica empleadas comprenden PBMC no fraccionado enriquecido. Por "enriquecido", significa que el porcentaje de PBMC en una muestra esa mayor que en la sangre completa. En muchos casos, por lo menos el 75% 80% 85% 90% 95% 99% o 100% de las células en una muestra enriquecida son PBMC. El PBMC enriquecido no fraccionado se puede preparar a partir de sangre completa mediante centrifugación de gradientes Ficol o utilizando tubos de purificación celular (CPT). También se pueden utilizar otros métodos convencionales para prepara el PBMC enriquecido no fraccionado.

La invención proporciona genes cuyos perfiles de expresión son indicadores de la existencia, estoado, progresión o tratamiento de una leucemia. Las leucemias que son favorables para la presente invención incluyen, pero no se limitan a, AML, y MDS. Por ejemplo, la tabla 4 describe genes expresados de forma diferencial en PBMC de pacientes MDS Vs. PBMC de sujetos libres de la enfermedad. La tabla 6 describe genes expresados de manera diferencial en PBMC de pacientes AML Vs. PBMC de pacientes MDS. La tabla 8 describe genes cuyos niveles de expresión son útiles para distinguir humanos con AML de humanos con MDS, humanos con AML de humanos libres de la enfermedad, y humanos con MDS de humanos libres de la enfermedad. La leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítíca crónica, leucemia mielógena crónica, o tricoleucemia también se puede analizar de acuerdo con la presente invención.

Así, en un aspecto, la invención proporciona métodos para diagnóstico, o monitoreo de la ocurrencia, desarrollo, progresión o tratamiento de leucemia (tal como, por ejemplo, AML o MDS) en un sujeto que utiliza genes de la tabla 4 o tabla 6. Los métodos incluyen generar un perfil de expresión de gen a partir de una muestra d sangre periférica del sujeto y comparar el perfil de expresión del gen con uno o más perfiles de expresión de referencia (por ejemplo, un perfil de expresión que representa un humano libre de la enfermedad, un perfil de expresión que representa un humano con leucemia, o un perfil de expresión que representa un humano de diagnóstico incierto). El perfil de expresión de gen y los perfiles de expresión de referencia incluyen los patrones de expresión de uno o más genes seleccionados de la tabla 4 o 6 en PBMC. En algunas modalidades, diferentes genes de aquellos descritos en la tabla 2 se seleccionan de la tabla 4 o 6, aunque los genes mencionados en la tabla 2 se pueden incluir adicionalmente. En algunas modalidades, los genes seleccionados de la tabla 4 o 6 son aquellos también mencionados en la tabal 8.

La diferencia o similitud enlre el perfil de expresión de gen y uno o más perfiles de referencia es indicador de la presencia, ausencia, ocurrencia, desarrollo, progresión, o efectividad del tralamiento de la leucemia en el sujeío. El perfil de expresión del gen y los perfiles de expresión de referencia pueden incluir el patrón de expresión se solo un gen o de dos o más (por ejemplo, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 8 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o mas, 40 o más, 60 o más, 100 o más, 200 o más, 300 o más, o 400 o más). En algunas modalidades los números más pequeños de los genes (por ejemplo, 2 hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 8, hasta 10, hasta 15, hasta 20, hasta 40, hasta 60, hasta 100, o hasta 200) se utilizan.

El perfil de expresión del gen de la enfermedad de la leucemia en un sujeto de interés se puede determinar al medir el nivel de transcripción de ARN de cada uno de los genes en una muestra sanguínea periférica del sujeto. Los métodos adecuados para este propósito incluyen, pero no se limitan a, RT-PCR cuantitativo, disposiciones de ácido nucleico, Northern blot, hibridación in situ, slot-blotting, y ensayo de protección de nucleasa. El perfil de expresión de los genes de la enfermedad de la leucemia también se puede determinar al medir el nivel de producto de proteína en cada uno de los genes en la muestra de sangre periférica del sujeto. Los métodos adecuados para este propósito incluyen, pero no se limitan a, inmuno ensayos (por ejemplo, ELISA, RÍA, FACS, o western blot, arreglos de proteína, electrofóresis de gel en dos dimensiones, y espectroscopia de masa).

El perfil de expresión de referencia típico empleado en la presente invención incluye valores o rangos que son sugestivos del patrón de expresión del gen de la enfermedad de la leucemia en muestras sanguíneas periféricas de humanos libres de la enfermad o pacientes con leucemias conocidas. En un ejemplo, un perfil de expresión de referencia comprende los niveles de expresión promedio de cada uno de los genes de la enfermedad de la leucemia en muestras sanguíneas periféricas de humanos libres de la enfermedad. En otro ejemplo, un perfil de expresión de referencia comprende los niveles de expresión promedio de cada uno de los genes de la enfermedad de la leucemia en muestras sanguíneas periféricas de pacientes que tienen una leucemia conocida. En todavía otra modalidad, un perfil de expresión de referencia comprende dos o más perfiles de expresión individuales, cada uno de los cuales es el perfil de expresión del gen de la enfermedad de la leucemia en una muestra sanguínea periférica de un paciente con diferente leucemia o humano libre de la enfermedad. En una modalidad adicional, un perfil de expresión de referencia comprende rangos que reflejan variaciones en los niveles de expresión de cada uno de los genes de la enfermedad de la leucemia en muestras sanguíneas periféricas de humanos libres de la enfermedad o pacientes con leucemias conocidas.

Un perfil de expresión de referencia empleado en la presente invención se puede preparar utilizando el mismo tipo de muestras sanguíneas periféricas como la muestra sanguínea periférica del sujeto de interés y siguiendo el mismo procedimiento de preparación y metodología. Un perfil de expresión de referencia se puede predeterminar o prerregistrar. Este también se puede determinar actualmente con o después de la medición del perfil de expresión del sujeto de interés.

La comparación del perfil de expresión de un sujeto de interés con un perfil de expresión de referencia se puede desarrollar manualmente o electrónicamente. La diferencia o similitud entre el perfil de expresión del sujeto de interés y el perfil de expresión de referencia es indicador de la presencia o ausencia, o progresión o no progresión, de la leucemia en el sujeto.

En algunas modalidades, el nivel de expresión de cada uno de los genes de la enfermedad de la leucemia empleados en la comparación se correlaciona con una distinción de clase bajo un análisis de vecino cercano o un análisis de significancia de micro disposiciones. La distinción de clase representa un patrón de expresión ideal del gen en un PBMC no fraccionado de humanos libres de la enfermedad y pacientes que tienen una leucemia específica (por ejemplo, uniformemente altos en PBMC de los humanos libres de enfermedad y uniformemente bajos en PBMC de los pacientes de leucemia, o viceversa). El estado de la enfermedad de un sujeto de interés (libre de la enfermedad Vs. Leucemia) se puede predecir al comparar el perfil de expresión de los genes de la enfermedad de la leucemia en el sujeto de interés con un perfil de expresión de referencia de los mismos genes utilizando vecinos k-cercanos o algoritmo de votación ponderada. Basados en la comparación, el sujeto de cuya muestra se toma se puede diagnosticar con leucemia o diagnosticar como libre de enfermedad; o una leucemia existente se puede evaluar para cambios, tal como aquellos asociados con la progresión o tratamiento.

La invención también proporciona un método general para diagnosticar o monitorear la ocurrencia, desarrollo, progresión o tralamiento de MDS. El método incluye generar un perfil de expresión de una muestra de sangre periférica de un sujeto y comparar el perfil de expresión del gen con uno o más perfiles de expresión de referencia (por ejemplo, un perfil de expresión que representa un humano libre de enfermedad, un perfil de expresión que representa un humano con MDS, un perfil de expresión que representa un humano con leucemia no MDS tal como AML, o un perfil de expresión que representa un humano de diagnóstico incierto). El perfil de expresión del gen y uno o más perfiles de expresión de referencia comprenden los patrones de expresión de uno o más genes de la enfermedad MDS en PBMC. La diferencia o similitud entre el perfil de expresión del gen y uno o más perfiles de expresión de referencia es indicador de la presencia, ausencia, ocurrencia, desarrollo, progresión o efectividad del tratamiento de MDS en el sujeto. Los genes de la enfermedad MDS pueden incluir opcionalmente uno o más genes seleccionados de las tablas 4, 6, u 8. El perfil de expresión del gen y los perfiles de expresión de referencia pueden ¡ncluir el patrón de expresión de solo un gen o de dos o más (por ejemplo 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 8 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 40 o más, 60 o más, 100 o más, 200 o más, 300 o más, o 400 o más). En algunas modalidades, los números más pequeños de genes (por ejemplo 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 8, hasta 10, hasta 15, hasta 20, hasta 40, hasta 60, hasta 100, o hasta 200) se utilizan. La comparación del perfil de expresión de gen con los perfiles de expresión de referencia se puede hacer, por ejemplo, mediante un análisis de vecino k-cercano o un algoritmo de votación ponderado. Basado en la comparación, el sujeto de cuya muestra se toma se puede diagnosticar con MDS o diagnosticar como libre de MDS o libre de la enfermedad; o un MDS existente se puede evaluar para cambios, tal como aquellos asociados con la progresión o tratamiento.

La invención también proporciona un método para identificar un paciente MDS quién está probablemente progresando a leucemia mielógena aguda (AML) utilizando uno o más genes de la tabla 6. El método incluye generar un perfil de expresión de gen de una muestra de sangre periférica de un paciente MDS y que comprende el perfil de expresión del gen para uno o más perfiles de expresión de referencia (por ejemplo un perfil de expresión que representa un humano con AML, un perfil de expresión que representa un humano con MDS conocido por progresar a AML, o un perfil de expresión que representa un humano con MDS conocido por no progresar a AML. El perfil de expresión del gen y uno o más perfiles de expresión de referencia incluyen los patrones de expresión en PBMC de uno o más genes de la enfermedad de la leucemia seleccionados de la tabla 6. La diferencia o similitud entre el perfil de expresión de gen y uno o más perfiles de expresión de referencia es indicador de que el paciente MDS probablemente progresa a AML. Los genes de la enfermedad de la leucemia seleccionados de la tabla 6 son opcionalmente diferentes de aquellos mencionados en la tabla 2, aunque los genes de la tabla 2 también se pueden incluir. Los genes de la enfermedad de la leucemia seleccionados de la tabla 6 están opcionalmente entre aquellos también mencionados en la tabla 8.

En otro aspecto, la presente invención caracteriza métodos para evaluar la efectividad de un tratamiento de leucemia en un paciente de interés. Estos métodos comprenden comparar un perfil de expresión de por lo menos un gen de la enfermedad de la leucemia en una muestra de sangre periférica del paciente de interés con un perfil de expresión de referencia del mismo gen, en donde la muestra de sangre periférica se aisla del pacientes después de la iniciación del tratamiento, y cada uno de los genes de la enfermedad de la leucemia empleados se expresa de forma diferente en un PBMC no fraccionado de pacientes que tienen la leucemia que se evalúa, según se compara con PBMC no fraccionado de humanos libres e la enfermedad. En un ejemplo, la leucemia que se evalúa en MDS, y el gen de la enfermedad de la leucemia empleado incluyen uno o más genes seleccionados de la tabla 4. Una eliminación o reducción en la diferencia entre el perfil de expresión del gen de la enfermedad de la leucemia en el paciente de interés y el perfil de expresión correspondiente en humanos libres de la enfermedad durante el curso del tratamiento es indicador de la efectividad del tratamiento para el paciente de interés. Según se compara con los métodos convencionales, los métodos basados en perfiles de expresión de gen pueden tener sensibilidad mejorada para la detección de progresión o remisión de la enfermedad.

En todavía otro aspecto, la presente invención caracteriza métodos para evaluar la efectividad de un tratamiento al prevenir la progresión de MDS a AML en un paciente de interés. Estos métodos comprenden comparar un perfil de expresión de por lo menos un gen de la enfermedad de la leucemia en una muestra de sangre periférica del paciente de interés con un perfil de expresión de referencia del mismo gen, en donde la muestra de sangre periférica se aisla del paciente después de la iniciación del tratamiento, y cada uno de los genes de la enfermedad de la leucemia empleados se expresa de forma diferente en PBMC no fraccionado de pacientes MDS según se compara con pacientes AML. Ejemplos de genes de la enfermedad de la leucemia adecuados para este propósito ¡ncluyen, pero no se limita a, aquellos descritos en la tabal 6. El perfil de expresión de gen de la enfermedad de la leucemia en el paciente de interés guante el ciclo del tratamiento es indicador de la efectividad del tratamiento en prevenir la progresión de MDS a AML en el paciente.

La invención también proporciona disposiciones útiles, por ejemplo, para diagnosticar MDS u otras leucemias. Las disposiciones incluyen un sustrato que tiene varias direcciones; sondas distintas, tal como secuencias de ácido nucleico distintas o regiones variables de anticuerpo distintas, se depositan en cada una de las direcciones. En algunas modalidades, (por lo menos el 15% o por lo menos 30% o por lo menos 50%) de las direcciones tienen sondas que pueden detectar específicamente genes de la enfermedad MDS en PBMC; los genes de la enfermedad MDS se seleccionan opcionalmente de la tabla 4. En otras modalidades, por lo menos el 15% (o por lo menos 30% o por lo meno 50%) de las direcciones tienen sondas que pueden detectar específicamente los genes seleccionados de las tablas 4 o 6; los genes seleccionados son diferentes de aquellos mencionados en la tabla 2, aunque los genes de la tabla 2 también se pueden incluir.

La invención también proporciona perfiles de expresión codificados digitalmente, ya que se pueden codificar en un medio legible por computador, útil, por ejemplo, como perfiles de expresión de referencia para evaluar un perfil de expresión de gen de una muestra de sangre periférica. Cada perfil de expresión incluye uno o más señales de expresión digitalmente codificados que incluyen un valor que representa la expresión de un gen seleccionado de las tablas 4 o 6; los genes seleccionados son diferentes de aquellos mencionados en la tabal 2, aunque las señales de expresión digitalmente codificadas incluyen valores que representan la expresión de los genes de la tabla 2 que se pueden incluir adicionalmente en el perfil de expresión. Los valores en las señales de expresión digitalmente codificados pueden representar, por ejemplo, la expresión de los genes en un PBMC de un humano con MDS o un humano con AML. Cada perfil de expresión puede incluir una señal de expresión digitalmente codificada única o puede incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o más 10 señales de expresión codificadas digitalmente, tal como por lo menos 10, por lo menos 20, por lo menos 30, por lo menos 40, por lo menos 50, por lo menos 100, o por lo menos 200.

En otro aspecto, la invención proporciona kits útiles para diagnóstico de un leucemia. En una modalidad, el kit incluye una o más sondas que pueden detectar específicamente los genes de la enfermedad MDS (seleccionados opcionalmente de la tabla 4) en PBMC. Las sondas son opcionalmente polinucleótidos que hibridizan bajo condiciones de hibridización de disposiciones de ácido nucleico o condiciones estrictas para las transcripciones de ARN, o los complementos de estos, de los genes de la enfermedad MDS, o, opcionalmente, son dominios variables de anticuerpo que unen los productos de los genes de la enfermedad MDS. En otra modalidad, el kit incluye una o más sondas que pueden detectar específicamente los genes seleccionados de las tablas 4 y 6; y los genes seleccionados son diferentes de aquellos mencionados en la tabal 2, aunque las sondas para los genes de la tabal 2 se pueden incluir adicionalmente. Los genes seleccionados de las tablas 4 y 6 pueden estar opcionalmente entre aquellos también mencionados en la tabla 8. Los kits también incluyen uno o más controles, cada uno representa un nivel de expresión de referencia de un gen detectable por las sondas.

En otro aspecto, la invención caracteriza un método para tomar una descripción, por ejemplo, seleccionar una clase de pago, para que un curso de tratamiento para una leucemia tal como AML o MDS. El método incluye asignar un individuo a una clase basado en un valor que es una función de la expresión de uno o más genes en una muestra de sangre periférica del individuo, tomando por lo tanto una decisión con relación al individuo. Los genes incluyen uno o más genes de entre aquellos mencionados en las tablas 4 y 6 no mencionados en la tabal 2, aunque la expresión de los genes mencionados en la tabla 2 también se puede considerar. En algunas modalidades, uno o más genes se seleccionan de aquellos también mencionados en la tabal 8. La decisión puede incluir, por ejemplo, seleccionar un tratamiento, tal como un tratamiento AML, tratamiento MDS, tratamiento de otra leucemia, o una ausencia de tratamiento, basado en la asignación del individuo a la clase. La decisión también puede incluir administrar o declinar un tratamiento basado en la asignación; emitir, transmitir o recibir una prescripción; o autorizar, pagar para, o causar una transferencia de fondos par pagar un tratamiento. "Tratamiento" como se utiliza aquí, se refiere a cualquier acción para tratar una enfermedad o condición, sin importar si la acción está destinada como preventiva, curativa, o paliativa, por ejemplo; o para dirigir una causa o síntoma de la enfermedad o condición; o para mejorar un segundo tratamiento mediante, por ejemplo, mejorar su eficacia o superar un efecto colateral. La decisión se puede registrar, tal como en un medio legible por computador.

La invención también caracteriza un método para suministrar información sobre la cual tomar una decisión a cerca de un individuo. El método incluye proporcionar (por ejemplo, al recibir) una evaluación de un sujeto, en donde la evaluación se hace mediante un método descrito aquí, tal como al determinar el nivel de expresión de uno o más genes en una muestra de sangre periférica del sujeto, proporcionando por lo tanto un valor. Los genes incluyen uno o más genes de entre aquellos mencionados en las tablas 4 y 6 pero no mencionado en la tabla 2, aunque la expresión de los genes mencionados en la tabla 2 también se puede considerar. El método también incluye proporcionar una comparación del valor con un valor de referencia, proporcionando por lo tanto información sobre que decisión tomar a cerca del sujeto. El método también puede incluir tomar una decisión o comunicar la información a otra parte, tal como mediante computador, disco compacto, teléfono, fax símil, o carta. La decisión puede incluir seleccionar un sujeto para pago o hacer o autorizar pago para un primer ciclo de acción si el sujeto demuestra un nivel de expresión de ge, patrón o perfil observado en una leucemia (por ejemplo AML o MDS) y un segundo ciclo de acción si el sujeto demuestra un nivel de expresión de gen, patrón o perfil observado en una leucemia diferente (por ejemplo MDS o AML) o en humanos libres de leucemia. El pago puede ser de una primer parte a una segunda parte. La primer parte puede ser un parte diferente del paciente, tal como una tercer parte, una compañía de seguros, empleador, plan de salud patrocinado por el empleador, HMO, o entidad gubernamental. En algunas modalidades, la segunda parte se selecciona del sujeto, un proveedor de servicios de salud, un médico tratante, un HMO; un hospital, una entidad gubernamental, o una entidad que vende o suministra la droga.

En un aspecto, la invención caracteriza un método para elaborar un registro de datos. El método incluye ingresar el resultado de un método descrito aquí en un registro, por ejemplo un registro legible por computador. En algunas modalidades, el registro se evalúa y/o transmite a una tercera parte pagadora, una compañía de seguros, empleador, plan de salud patrocinado por empleador HMO, o entidad gubernamental o un proveedor de servicios de salud, un médico tratante, un HMO, un hospital, una entidad gubernamental, o una entidad que vende o suministra la droga.

En un aspecto, la descripción caracteriza un método para proporcionar datos. El método incluye proporcionar datos descritos aquí, por ejemplo, generados mediante un método descrito aquí para proporcionar un registro, por ejemplo, un registro descrito aquí, para determinar si se proporcionará un pago. En algunas modalidades, los datos se proporcionan por computador, disco compacto, teléfono, fax símil, e-mail, o carta. En algunas modalidades, se proporcionan los datos mediante una primer parte a una segunda parte. En algunas modalidades, la primer parte se selecciona del sujeto, un proveedor de servicios de salud, un médico tratante, un HMO, un hospital, una entidad gubernamental, o una entidad que vende o suministra la droga. En algunas modalidades, la segunda parte es un pagador de tercer parte, una compañía de seguros, empleador, plan de salud patrocinado por empleador HMO, o entidad gubernamental. En lagunas modalidades, la primer parte se selecciona del sujeto, un proveedor de servicios de salud, un médico tratante, un HMO, un hospital, una compañía de seguros, o una entidad que vende o suministra la droga y la segunda parte es una entidad gubernamental. En algunas modalidades, la primer parte se selecciona del sujeto, un proveedor de servicios de salud, un médico tratante, un HMO, un hospital, una compañía de seguros, o una entidad que vende o suministra la droga y la segunda parte es una compañía de seguros.

En un aspecto, la descripción caracteriza un método para transmitir un registro. El método incluye una primer parte que transmite el registro a una segunda parte, tal como mediante computador, disco compacto, teléfono, fax símil, e-mail, o carta. En algunas modalidades, la segunda parte se selecciona del sujeto, un proveedor de servicios de salud, un médico tratante, un HMO, una entidad gubernamental, o una entidad que vende o suministra la droga. En algunas modalidades, la primer parte es una compañía de seguros o entidad gubernamental y la segunda parte se selecciona del sujeto, un proveedor de servicios de salud, un médico tratante, un HMO, un hospital, una entidad gubernamental, o una entidad que vende o suministra la droga. En algunas modalidades, la primer parte es una entidad gubernamental o una compañía de seguros y la segunda parte se selecciona del sujeto, un proveedor de servicios de salud, un médico tratante, un HMO, un hospital, una compañía de seguros, o una entidad que vende o suministra la droga.

Otras características, objetos, y ventajas de la presente invención son evidentes en la siguiente descripción detallada. Se debe entender, sin embargo, que la descripción detallada, mientras indica las modalidades preferidas de la invención, lo hace solo por vía de ilustración, no de limitación. Varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción de tallada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención caracteriza el uso de muestras de sangre o muestras que comprenden PBMC no fraccionado para diagnosticar o monitorear la progresión o tratamiento de AML y MDS. Los genes que se expresan de forma diferencial en PBMC no fraccionado de pacientes AML o (MDS) según se compara con humanos libres de la enfermedad se pueden identificar. Estos genes se pueden utilizar con marcadores subrogados para diagnosticar o evaluar el tratamiento del AML (o MDS) en un sujeto de interés. Los genes que se expresan de forma diferencial en PBMC no fraccionado de pacientes AML según se compara con pacientes MDS también se pueden identificar. Estos genes se pueden utilizar para monitorear la progresión del MDS en un paciente de interés. La presente invención no requiere selección positiva de subtipos celulares específicos (por ejemplo, CD34+ o AC133+), permitiendo por lo tanto el diagnóstico y evaluación rápido del AML y MDS. Otras leucemias, tal como leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, o tricoleucemia, se pueden evaluar de forma similar de acuerdo con la presente invención.

Varios aspectos de la invención se describen en más detalle en las siguientes subsecciones. El uso de subsecciones no significa que limitan la invención. Cada subsección puede aplicar a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se establezca otra cosa.

A. Métodos generales para identificar genes de la enfermedad de la leucemia Esta invención caracteriza el uso de disposiciones de ácido nucleico para la identificación de genes que se expresan de forma diferencial en un PBMC no fraccionado de pacientes con leucemia según se compara con humanos libres de enfermedad o en pacientes que tienen un tipo diferente de leucemia. Las disposiciones de ácido nucleico permiten la detección cuantitativa de los perfiles de expresión de un gran número de genes de una vez. Ejemplos no limitantes de disposiciones de ácido nucleico adecuadas para este propósito incluyen micro disposiciones Genechip® (Affymetrix, Santa Clara, CA), micro disposiciones de cADN (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), y disposiciones de glóbulos (Patente Estadounidense número 6, 288, 220 y 6, 391 , 562).

Los polinucleótidos a ser hibridizados a una disposición de ácido nucleico se pueden etiquetar con una o más porciones de etiquetas para permitir la detección de complejos de polinucleótido hibridizados. Las porciones etiquetadas pueden incluir composiciones que son detectables por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, bioeléctricos, inmuno químicos, eléctricos, ópticos o químicos. Las porciones de etiqueta de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos, compuesto quimiolumíniscentes, proteínas de unión etiquetadas, átomos de metales pesados, marcadores espectroscópicos (tal como marcadores fluorescentes o tintes), etiquetas magnéticas, enzimas ligadas, etiquetas de espectrometría de masa, aceptadores y donantes de transferencia de electrones, y similares. Los polinucleótidos a ser hibridizados para una disposición de ácido nucleico pueden ser cADN, cARN, u otros tipos de moléculas de ácido nucleico.

Se pueden desarrollar reacciones de híbridización en formatos de hibridación diferencial o absolutos. En el formato de hibridización absoluto, los polinucleótidos derivados de una muestra, tal como un PBMC no fraccionado, de un paciente AML o MDS o un humano libre de enfermedad, se hibridizan para las sondas en una disposición de ácido nucleico. Las señales se detectan después de la formación de complejos de hibridización que se correlacionan con los niveles de polinucleótido en la muestra. En el formato de hibridización diferencial, los polinucleótidos derivados de dos muestras biológicas, tal como una de un paciente AML o MDS y la otra de un humano libre de enfermedad, se etiquetan con diferentes porciones de etiqueta (por ejemplo, Cy3 y Cy5, respectivamente). Una mezcla de estos polinucleótidos etiquetados de forma diferente se hibridiza para una disposición de ácido nucleico. La disposición de ácido nucleico se examina luego bajo condiciones en las que las emisiones de las dos etiquetas diferentes son individualmente detectables.

Las señales recolectadas de las disposiciones de ácido nucleico se pueden analizar utilizando software disponible comercialmente, tal como el software proporcionado por Affimetrix o Agilent Technologies. Los controles, tal como para sensibilidad de exploración, etiquetado de sondas o cuantificación de cADN, se pueden incluir en los experimentos de hibridización. En muchas modalidades, las señales de las disposiciones de ácido nucleico se producen a escala o se normalizan antes de ser analizadas adicionalmente. Las señales de expresión de un gen se pueden normalizar para tener en cuenta las variaciones en las intensidades de hibridización cuando se utiliza más de una disposición bajo similares condiciones de prueba. Las señales para la hibridización de complejo de polinucleótido individual también se pueden normalizar utilizando las intensidades derivadas de controles de normalización internos contenidos en cada una de las disposiciones. Adicionalmente, los genes con niveles de expresión relativamente consistentes a través de las muestras se pueden utilizar para normalizar los niveles de expresión de otros genes. En una modalidad, los niveles de expresión se normalizan a través de las muestras de tal forma que la media es 0 y la desviación estándar es 1. En otra modalidad, las señales de expresión de una disposición de ácido nucleico son objeto de un filtro de variación que excluye los genes que muestran variación mínima o insignificante a través de diferentes clases de muestras.

Perfiles de expresión en PBMC no fraccionado de pacientes de leucemia se comparan con los perfiles de expresión correspondientes en humanos libres de enfermedad. Los genes que se expresan de forma diferente en un PBMC no fraccionado de pacientes con leucemia según se compara con PBMC no fraccionado de humanos libres de enfermedad se pueden identificar. Estos genes se refieren aquí en adelante como genes de la enfermedad de leucemia. Al "expresar de forma diferencial", significa que el nivel de expresión promedio de un gen de la enfermedad de leucemia en PBMC no fraccionado de pacientes con leucemia es estadísticamente diferente de aquel en PBMC no fraccionado de humanos libres de la enfermedad. En muchos casos, el valor p de una prueba T de student (por ejemplo, distribución de dos colas, varianza desigual de dos muestras) para la diferencia observada no es más de 0.05, 0.01 , 0.005, 0.001 , 0.0005, 0.0001 , o menos. El nivel de expresión promedio de un gen de enfermedad de leucemia en PBMC no fraccionado de pacientes con leucemia puede ser sustancialmente mayor o menor que aquel en el PBMC libre de la enfermedad. Por ejemplo, el nivel de expresión promedio de un gen de la enfermedad de leucemia en PBMC de pacientes con leucemia puede ser por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 20, o más veces mayor o menor que aquel en PBMC de humanos libres de la enfermedad. Los genes de enfermedad de leucemia que se expresan de forma diferente en pacientes que tienen leucemias diferentes (por ejemplo, AML VS. MDS) pueden ser identificados de forma similar.

Los genes de la enfermedad de leucemia también se pueden identificar utilizando algoritmos de agrupación supervisados o no supervisados. Ejemplos no limitantes de algoritmos de agrupación supervisados incluyen análisis del vecino más cercano, máquinas de vector de soporte. El método SAM (Análisis de Significancia de micro disposiciones), redes neuronales artificiales, y SPLASH. Ejemplos no limitantes de algoritmos de agrupación no supervisados incluyen mapas auto organizados (SOM), media k, análisis de componente principal, y agrupación jerárquica.

El análisis del vecino más cercano, también conocido como el análisis del vecindario, se describe en Golub et al., (1999) Sciencie 286:531-537; Slonim et al., (2000) Proas, del Fourth Annual International Conference on Computacional Molecular Biologv. Tokio, Japan, Abril 8-11 , pp. 263-272; y la Patente U.S No 6, 647, 341 , todas las cuales se incorporan aquí como referencia. En el análisis, el perfil de expresión de cada gen se representa por un vector de expresión g= (ß?, e2, e3l... , en), en donde e¡ corresponde al nivel de expresión del gen "g" en la iésima muestra. Una distinción de clase se puede representar por un patrón de expresión idealizado c= (c-i, c2, c3 cn), en donde C¡ igual 1 o -1 , dependiendo de si la iésima muestra se aisla de la clase 0 o clase 1. La clase 0 incluye sujetos que tienen un primer estado de la enfermedad (por ejemplo libre de enfermedad), y la clase 1 incluye sujetos que tienen un segundo estado de la enfermedad (AML o MDS). Otras formas de distinción de clase también se pueden emplear. Típicamente, una distinción de clase representa un patrón de expresión idealizado, en donde el nivel de expresión de un gen es uniformemente mayor para las muestras en una clase y uniformemente menor para muestras en otras clases.

La correlación entre el gen "g" y la distinción de clase se puede medir mediante una fuente de señal a ruido: P(g,c) - [µ?(g) - µ2(g)]/£s,(g) + s2(g)] En donde µ (g) y µ2 (g) representa los medios de los niveles de expresión log transformados del gen "g" en la clase 0 y clase 1 , respectivamente, y di (g) y d2 (g) representa la desviación estándar de los niveles de expresión log transformados del gen "g" en clase 0 y clase 1 , respectivamente. Un mayor valor absoluto de una clasificación de señal a ruido indica que el gen se expresa más altamente en una clase que en la otra.

En un ejemplo, las muestras utilizadas para derivar la clasificación de señal a ruido comprenden PBMC enriquecido o no fraccionado purificado, y, por lo tanto, la clasificación de señal a ruido p (g,c) representa una correlación entre la distinción de clase y el nivel de expresión del gen "g" en PBMC no fraccionado, la correlación entre el gen "g" y la distinción e clase también se puede medir mediante otros métodos, tal como coeficiente de correlación de Pearson o distancia Euclidiana, como se expresa por aquellos expertos en la técnica.

La significancia de la correlación entre los perfiles de expresión del genh en PBMC no fraccionado y una distinción de clase se puede evaluar utilizando una prueba de permutación aleatoria. Una alta densidad inusual de los genes dentro del vecindario de esta distinción de clase, según se compara con patrones aleatorios, sugiere que muchos de estos genes tienen patrones de expresión que se correlacionan significativamente con la distinción de clase. La correlación entre los genes y una distinción de clase se puede ver diagramáticamente a través de una gráfica de análisis de vecindario, en la cual el eje Y representa el número de genes dentro de varios vecindarios alrededor de la distinción de clase y el eje X indica el tamaño del vecindario (es decir p(g,c)). Las curvas que muestran niveles de significancia diferentes para el número de genes dentro del vecindario correspondiente de distinciones de clase permutadas aleatoriamente también se puede incluir n la gráfica.

En muchas modalidades, los genes de la enfermedad de leucemia identificados por la presente invención están por encima de la mediana del nivel de significancia en la gráfica de análisis de vecindario. Esto significa que la medición de correlación p (g,c) para cada uno de estos genes de la enfermedad de leucemia es tal que el número de genes dentro del vecindario de la distinción de clase tiene el tamaño de p (g,c) que es mayor que el número de genes dentro del vecindario correspondiente de distinciones de clase permutada aleatoriamente en la mediana del nivel de significancia. Los genes de la enfermedad de leucemia identificados por la presente invención también pueden estar por encima del 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2% o 1% de nivel de significancia. Como se utiliza niveles de significancia aquí X% significa que el X% de vecindarios aleatorios contienen tantos genes como el vecindario real alrededor de la distinción de clase.

Los genes de la enfermedad de leucemia identificados por análisis del vecindario más cercano se pueden utilizar APRA constituir pronósticos de clase. Cada pronóstico de clase incluye dos o más genes de la enfermedad de leucemia, y se pueden utilizar para asignar un sujeto de interés a un estado de la enfermedad (por ejemplo, AML, MDS, o libre de enfermedad). En una modalidad, una clase de pronóstico incluye o consiste de genes de la enfermedad de leucemia que se correlacionan significativamente con una distinción de clase media ente la prueba de permutación (por ejemplo, genes por encima del 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% o 50% de nivel de significancia). En otra modalidad una clase de pronósticos incluyen o consisten de genes de la enfermedad de leucemia que tienen un valor absoluto superior de p (g,c).

El método SAM también se puede utilizar para correlacionar estados de la enfermedad con perfiles de expresión de gen en PBMC no fraccionado. El análisis de predicción del método de micro disposición (PBMC) se puede utilizar para identificar pronósticos de clase que caracterizar mejor una enfermedad predefinida o una clase libre de enfermedad y pronosticar el miembro de clase de nuevas muestras. Ver, por ejemplo, Tibshirani et al., (2002) Proc, Nati. Acad.. Sci. U.S.A. 99: 6567-6572.

La exactitud de la predicción de un pronóstico de clase de la presente invención se puede evaluar por validación cruzada de k-veces, tal como validación cruzada 10 veces, validación cruzada 4 veces, o validación cruzada de dejar uno afuera. En una validación cruzada típica de k-veces, los datos se dividen en subconjuntos k de aproximadamente igual tamaño. El modelo se entrena k veces, cada vez dejando afuera uno de los subconjuntos de entrenamiento y utilizando el subconjunto omitido como las muestras de prueba para el calcular el error de predicción. Cuando k es igual al tamaño de la muestra, este llega a ser la validación de cruce dejar uno afuera.

También se pueden utilizar otros métodos para identificar los genes de la enfermedad de leucemia. Estos métodos incluye, pero no se limitan a, RT-PCR cuantitativo, Northern blot, hibridación in situ, disposiciones de proteína, inmuno ensayos, por ejemplo, ELISA; RÍA o Western blot), exhibición diferencial, análisis en serie de expresión de ge (SAGE), análisis de representación diferencial (RDA); hibridización subtractiva, GeneCalling® (CuraGen, New Haven), y análisis de expresión de gen total (TOGA). Los genes así identificados se expresan de forma diferencial en PBMC no fraccionado de una clase de sujetos con relación a otra clase de sujetos, cada clase de sujetos tiene un estado de enfermedad diferente (por ejemplo, AML, MDS, o libre de enfermedad).

Los métodos descritos anteriormente también se pueden utilizar para identificar genes cuyos perfiles de expresión en PBMC no fraccionado son pronóstico de diferentes etapas de progresión de leucemia, o respuesta clínica diferente de pacientes de leucemia para un tratamiento terapéutico. Por ejemplo, los perfiles de expresión de gen en PBMC de pacientes MDS que progresan eventualmente a AML se pueden comparar con los perfiles de expresión de gen correspondientes en paciente MDS que no progresan a AML. Los genes que se expresan de forma diferente en estas dos clases de pacientes se pueden identificar y utilizar para la predicción de progresión de MDS a AML. Para otro caso, los pacientes de leucemia se pueden agrupar con base en su respuesta a un tratamiento terapéutico. Los análisis de expresión de gen global se utilizan luego para identificar genes que se expresan de forma diferente en PBMC de un grupo de pacientes Vs. Otro grupo, los genes así identificados son pronóstico de resultado clínico de un paciente con leucemia con respuesta al tratamiento terapéutico.

B. Identificación de genes de la enfermedad AML y mds Se utiliza HG-U133A Genechips® (Affymetrix, Inc) para identificar los genes de la enfermedad AML o MDS. Los genes que se expresan de forma diferente en PBMC no fraccionado de pacientes AML (o MDS) según se compara con humanos libres de la enfermedad se identifican.

La tabla 1 lista los calificadores en HG-U133A Genechips® que muestran señales elevadas o reducidas cuando se hibridiza con muestras AML según se compara con muestras libres de la enfermedad. Cada calificador en la tabla 1 corresponde a un gen de la enfermedad AML que se expresa de forma diferente en un PBMC no fraccionado de pacientes AML según se compara con humanos libres de la enfermedad. La señal de hibridación en cada uno de los calificadores representa el nivel de expresión del gen correspondiente en PBMC no fraccionado.

La tabla 1 también ¡lustra las señales de hibridización promedio en cada calificador par AML ("promedio AML") o muestras libres de enfermedad ("promedio libre de enfermedad"). Las desviaciones estándar de estas señales ("StDev AML" y StDev libre de enfermedad", respectivamente) también se proporciona. Adicionalmente, la proporción entre el AML y la señales de hibridación libres de enfermedad ("AML/libre de enfermedad") y lo valores p de la prueba T de student (distribución de dos colas, varianza desigual de dos muestras) para las diferencias observadas se proporcionan.

Tabla 1. Genes Expresados de forma diferente en AML vs. PBMC Libre de Enfermedad Tabla 2. Anotación de genes expresados de forma diferente en AML Vs. PBMC libre de enfermedad Cada calificador en un HG-U133A Genechip® representa un conjunto de sondas de oligonucleótido (PM o sonda de coincidencia perfecta) que se unen de forma estable a las regiones respectivas en el Genechip®. La transcripción de ARN (o el complemento de este) del gen identificado por un calificador puede hibridizar bajo condiciones de hibridación de disposiciones de ácido nucleico para por lo menos una sonda de oligonucleótido del calificador. Preferiblemente, la transcripción de ARN (o el complemento de este) del gen no hibridiza bajo condiciones de hibridación de disposición de ácido nucleico para el desfase (mm) de las sondas del calificador. Una sonda de desfase es idéntica a la sonda PM correspondiente excepto para una sustitución homomérica, única en o cerca del centro de la sonda de desfase. Por ejemplo, la sonda MM para una sonda PM de 25-mer tiene un cambio de base homomérico en la décima tercera posición- En una modalidad, el trascripto de ARN (o su complemento) del gen identificado por un calificador puede hibridizar bajo condiciones de hibridación de disposición de ácido nucleico para por lo menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de las sondas PM del calificador, pero no para las sondas de desfase correspondientes. La clasificación de discriminación (R) para cada una de estas sondas PM, según se mide por la proporción de diferencia de intensidad de hibridización de el par de sonda correspondiente (es decir, PM-menos MM) sobre la intensidad de hibridación general (es decir PM+MM), puede no ser menor de 0.015, 0.02, 0.05, 0J , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 o más. En otra modalidad, el trascripto de ARN (o su complemento) del gen, cuando se hibridiza para 1 HG-U133A Genechip® de acuerdo con las instrucciones del fabricante, produce una llamada "presente" en el calificador correspondiente bajo la configuración por defecto (es decir, el umbral Tau es 0.015 y el nivel de significancia ai es 0.4). Ver Genechip® Expression Analysis-Data Analysis Fundamentáis (Part No 701190 Rev.2, Affymetrix website, Inc., 2002), el contenido completo se incorpora aquí como referencia.

Las secuencias de cada una de las sondas PM en HG-U133A Genechip®, y las secuencias objetivo de las cuales se derivan las sondas PM, se pueden obtener fácilmente a partir de la base de datos de la secuencia Affymetrix en el sitio Web Affymetrix, ver, por ejemplo, HG-U133A_probe_tab.zip, el contenido completo del cual se incorpora aquí como referencia.

La tabla 2 lista los genes que se representan por los calificadores en la tabla 1. Estos genes, así como también sus números de acceso correspondientes Unigene ID y Entrez se identifican de acuerdo con la anotación Affymetrix Genechip®. Un unigen está compuesto de un conjunto no redundante de grupos de genes orientados. Cada grupo unigen se considera que incluye las secuencias que representan un gen único. Las bases de datos entrez recolectan las secuencias de una variedad de fuentes, tal como el GenBank, RefSeq y PDB. Las sondas de oligonucleótido de cada calificador se pueden derivar de su secuencia entrez correspondiente.

La tabla 3 describe calificadores que muestran señales elevadas o reducidas cuando se hibridizan para las muestras MDS según se compara con muestras libres de la enfermedad. Se proporcionan, las señales de hibridación promedio en cada calificador para MDS ("promedio MDS") o muestras libres de enfermedad ("promedio libre de enfermedad"), juntas con sus desviaciones estándar correspondientes ("desvEst MDS" y "desvEst libre de enfermedad"; respectivamente). Adicionalmente, las proporciones entre las señales de hibridación promedio ("MDS/libre de enfermedad") y los valores p de la prueba de student (distribución de dos colas, varianza desigual de dos muestras) para las diferencias observadas también se proporciona. La tabla 4 describe adicionalmente los genes que se representan por el calificador en la tabla 3.

La tabla 5 ilustra calificadores que muestran señales elevadas o reducidas cuando se hibridizan para muestras AML según se compara con las muestras MDS. Similar a las tablas 1 y 3, las señales de hibridación promedio en cada calificador para las muestras AML o MDS ("promedio AML" y "promedio MDS", respectivamente), las desviaciones estándar correspondientes ("DesvEst AML" y "DesvEst MDS", respectivamente), las proporciones entre las señales hibridizadas ("AML/MDS") y los valores P para las diferencias observadas se proporcionan en la tabal 5. Los genes representados por los calificadores en la tabla 5 se describen adicionalmente en la tabla Tabla 3.Gertes expresados de forma diferente en MDS vs.PBMC Libre de Enfermedad Tabla 4. Anotación de Genes Diferencialmente Expresado en MDS vs. Libre de la enfermedad con PBMC Tabla 5. Genes diferencialmente expresados en AML Vs. MDS de PBMC Tabla 6. Anotación de Genes Diferencialmente Expresados en AML vs. Los PBMC del MDS Los genes ilustrados en las tablas 2, 4, y 6 se identificaron de acuerdo con la anotación Affymetrix. Los genes que corresponden a los calificadores en las tablas 1 , 3, y 5 también se pueden identificar mediante la búsqueda BLAST de las secuencias objetivo de estos calificadores contra las bases de datos de la secuencia del genoma humano. Las bases de datos adecuadas para este propósito incluyen, pero no se limitan a, la base de datos del genoma humano en National Center for Biotechology Information (NCBI), Bethesda, MD. La NCBI también suministra programas BLAST, tales como "blastn", para buscar en sus bases de datos de secuencias. Una búsqueda BLAST de un gen que corresponda a un calificador se puede conducir utilizando un segmento no ambiguo de la secuencia objetivo del calificador (es decir, un segmento de secuencia que no contiene ningún residuo de nucleótido desconocido). El gen o los genes cuya secuencia que codifica la proteína tiene una identidad de secuencia significativa con el segmento no ambiguo (por ejemplo, que tiene por lo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia) se puede identificar. El trascripto de ARN (o el complemento del mismo) del gen o genes así identificados puede hibridizar bajo condiciones de hibridización de arreglo de ácido nucleico o estrictas con respecto a probetas PM del calificador. De acuerdo a lo anterior, los calificadores en las tablas 1,3, y 5 representan no solamente genes que se ¡lustran explícitamente en las tablas sino también genes que no están listados pero que sin embargo pueden hibridizar bajo condiciones de hibridización de arreglos de ácido nucleico o estrictas con respecto a las probetas PM de los calificadores.

Como se utiliza aquí, "condiciones estrictas o rigurosas" son por lo menos tan rigurosas como las condiciones G-L en la tabla 7. "Condiciones rigurosas" son por lo menos tan rigurosas como las condiciones A-F en la tabla 7. Para cada condición, la hibridización se lleva a cabo bajo las condiciones de hibridización correspondientes (temperatura y amortiguación de hibridización) durante cerca de 4 horas, seguida por dos lavados de 20 minutos bajo las condiciones de lavado correspondientes (temperatura y amortiguador de lavado).

Tabla 7. Condiciones de rigurosidad 1 : La longitud del híbrido es aquella anticipada para la región o regiones hibridizadas de los polinucleótidos de hibridización. Cuando se hibridiza un polinucleótido a un polinucleótido de secuencia desconocida, la longitud híbrida se asume como aquella del polinucleótido de hibridización. Cuando los polinucleótidos de secuencia conocida se hibridizan, la longitud híbrida se puede determinar mediante alinear las secuencias de los polinucleótidos e identificar la región o regiones de la complementariedad de la secuencia óptima.

H: SSPE (1x SSPE es 0.15 M de NaCI, 10 mM de NaH2PO4 y 1 ,25 mM de EDTA, pH 7,4) se puede sustituir por SSC (1 x SSC es 0.15 M de NaCI y 15 M de citrato de sodio) en la hibridización y en los amortiguadores de lavado.

TB*-TR*: La temperatura de hibridización para los híbridos anticipados que son menores a 50 pares base en longitud debería ser 5 a 10 °C menos que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, en donde Tm se determina de acuerdo a las siguientes ecuaciones. Para híbridos menores a 18 pares base en longitud, Tm (°C)=2 (# de A + T bases)+ 4(# de G + C bases). Para híbridos entre 18 y 49 pares base en longitud, Tm (°C)=81.5 + 16.6 (log10 de Na+) + 0.41 (% de G+C)- (600/N), en donde N es el número de bases en el híbrido, y Na+ es la concentración molar de iones de sodio en el amortiguador de hibridización (Na+ para 1xSSC= 0J65 M).

C. Pronóstico, diagnóstico y selección del tratamiento para el MDS, AML u otras leucemias Los genes de la enfermedad de la leucemia de la presente invención se pueden utilizar para el diagnóstico y el pronóstico de la MDS, AML y otras leucemias. Por ejemplo, los genes de la enfermedad se pueden utilizar para identificar un paciente con MDS quien posiblemente progrese a una leucemia mielogenosa aguda (AML). Los genes de la enfermedad de la leucemia también pueden ser utilizados para evaluar la progresión y la efectividad de un tratamiento de leucemia en un paciente de interés. Cualquier tipo de leucemia se puede determinar de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos de estas leucemias incluyen, pero no se limitan a, AML, MDS, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielogenosa crónica, y leucemia de células pirosas. El diagnóstico y el pronóstico típicamente involucra la comparación de los perfiles de expresión de la sangre periférica de uno o más genes de la enfermedad en el paciente de interés con leucemia a por lo menos un perfil de expresión de referencia.

En una modalidad, los genes de la enfermedad empleados para el diagnóstico y el pronóstico se seleccionan de modo que e perfil de expresión de la sangre periférica de cada gen de la enfermedad se correlaciona con una distinción de clase bajo un análisis de correlación con base en clase (tal como el análisis del vecino más cercano), en donde la distinción de clase representa un patrón de expresión idealizado de los genes seleccionados en las muestras de sangre periférica de los pacientes con leucemia quienes tienen pronósticos clínicos diferentes. En muchos casos, los genes de la enfermedad seleccionada se correlacionan con, la distinción de clase por encima del 50%, 25%, 10%, 5%, o 1 % de nivel de significancia bajo un ensayo de permutación aleatoria.

Los genes de la enfermedad también se puede seleccionar de modo que el perfil de expresión promedio de cada gen en la enfermedad en las muestras de sangre periférica de una clase de pacientes con leucemia es diferente estadísticamente de aquel en otra clase de pacientes con leucemia o humanos que no tienen la enfermedad. Por ejemplo, el valor p bajo un ensayo T de student para la diferencia observada puede ser no más de 0.05, 0.01 , 0.0005, 0.0001 , o menos. En adición, los genes de la enfermedad se pueden seleccionar de modo que el nivel de expresión d sangre periférica promedio de cada gen de la enfermedad en una clase de pacientes es de por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, o 20 veces diferente de aquel en otra clase de pacientes o de humanos que no tienen la enfermedad.

El perfil de expresión de los genes de la enfermedad de la leucemia en una muestra de sangre periférica de un sujeto de interés se puede comparar con un perfil de expresión de referencia del mismo gen o genes para diagnosticar o evaluar la progresión o tratamiento de la leucemia en el sujeto de interés. El perfil de expresión de referencia se puede preparar utilizando el mismo tipo de muestras de sangre periférica (por ejemplo, muestras de sangre completa o muestras de sangre que comprenden los PBMC no fraccionados enriquecidos como la muestra de sangre periférica del sujeto de interés. Ambos perfiles de expresión se pueden preparar utilizando el mismo procedimiento de preparación o metodología. Como consecuencia, para cada componente en el perfil de expresión del sujeto de interés, existe por lo menos un componente correspondiente en el perfil de expresión de referencia. Un perfil de expresión de referencia se puede predeterminar o prerregistrar. También se puede preparar concurrente con o después de la determinación del perfil de expresión del sujeto de interés. Cada perfil de expresión empleado en la presente invención, puede tener cualquier formato, tal como un formato de tabla, un formato gráfico o un formato electrónico o digital.

Un perfil de expresión de referencia empleado en la presente invención típicamente incluye o consiste de valores o rangos que son sugestivos del patrón de expresión del gen o genes de la enfermedad de la leucemia en las muestras de sangre periférica de humanos que no tienen la enfermedad o pacientes quienes se conoce que tienen las leucemias. En una modalidad, un perfil de expresión de referencia comprende los niveles de expresión promedio de cada uno de los genes de la enfermedad de la leucemia en las muestras de sangre periférica de humanos que no tienen la enfermedad. En otro ejemplo, un perfil de expresión de referencia comprende los niveles de expresión promedio de cada uno de los genes de la enfermedad de la leucemia en muestras de sangre periférica de pacientes a los cuales se les ha investigado la leucemia. Cualquier método de promediado puede ser utilizado, incluyendo pero sin limitarse a, medias aritméticas, medias armónicas, promedio de valores absolutos, promedio de valores transformados a logaritmo, y promedios pesados.

Los perfiles de expresión de referencia pueden incluir una pluralidad de perfiles de expresión, cada uno de los cuales representa el patrón de expresión de sangre periférica del gen de la enfermedad en un paciente particular con leucemia cuyo resultado clínico se conoce o determina. Por ejemplo, un perfil de expresión de referencia puede incluir dos o más perfiles de expresión individuales, cada uno de los cuales representa el perfil de expresión del gen o genes de la enfermedad de la leucemia en una muestra de sangre periférica de un paciente diferente con leucemia o un voluntario libre de la enfermedad. El perfil de expresión de un sujeto de interés se puede comparar con estos perfiles de expresión de referencia individuales utilizando un algoritmo de reconocimiento del patrón, tal como una votación pesada, los vecinos k más cercanos, o las máquinas de vector de soporte.

Un perfil de expresión de referencia adecuado para la invención puede contener rangos para los niveles de expresión de cada gen de la enfermedad de leucemia empleado. Cada rango se puede seleccionar para que refleje las variaciones en los niveles de expresión del gen correspondiente en las muestras de sangre periférica de humanos libres de la enfermedad o pacientes de quienes se conocen las leucemias. Por ejemplo, el rango se puede seleccionar como una desviación estándar (o múltiple o fracción de ellas) del nivel de expresión medio del gen correspondiente en las muestras de sangre periférica de humanos libres de la enfermedad (o pacientes a quienes se le conoce la leucemia). Donde el nivel de expresión del gen en un sujeto de interés cabe dentro de ese rango, una llamada "similar" puede hacerse con respecto a ese gen.

Otros tipos de perfiles de expresión de referencia también se pueden utilizar en la presente invención, por ejemplo, un umbral numérico se puede utilizar como una referencia.

El perfil de expresión del paciente de interés y los perfiles de expresión de referencia se pueden construir de cualquier forma. En una modalidad, los perfiles de expresión comprenden el nivel de expresión de cada gen de la enfermedad utilizado en la predicción del resultado. Los niveles de expresión pueden ser absolutos, normalizados. O de niveles relativos. Los procedimientos de normalización adecuados incluyen, pero no se limitan a, aquellos utilizados en el análisis de expresión de genes de disposiciones de ácidos nucleicos o aquellos descritos en Hill et al., (2001) Genome Biol., 2:research 0055J -0055.13. EN un ejemplo, los niveles de expresión se normalizan de modo que la media es 0 y la desviación estándar es 1. En otro ejemplo, los niveles de expresión se normalizan con base en controles internos o externos, como se puede apreciar por aquellos versados en la técnica. Todavía en otro ejemplo, los niveles de expresión se normalizan contra uno o más trascriptos de control con abundancias conocidas en las muestras de sangre. En muchos casos, el perfil de expresión del paciente de interés y los perfiles de expresión de referencia se construyen utilizando la misma o metodologías comparables.

En otra modalidad, cada perfil de expresión que es comparado comprende uno o más proporciones entre los niveles de expresión de diferentes genes de la enfermedad. Un perfil de expresión también puede incluir otras medidas que son capaces de representar los patrones de expresión de los genes.

Las muestras de sangre periférica adecuadas para la presente invención incluye, pero no se limita a, muestras de sangre completa lo que comprenden los PBMC no fraccionados. Muchas modalidades, las muestras de sangre periférica comprenden los PBMC no fraccionados enriquecidos empleados. Por "enriquecidos", se quiere significar que el porcentaje de los PBMC en una muestra es mayor que aquel en la sangre completa. En muchos casos, por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o 100% de las células en una muestra enriquecida son los PBMC. Métodos adecuados para preparar los PBMC no fraccionados enriquecidos incluyen, pero no se limitan a, gradientes de centrifugación ficol o tubos de purificación de células (CPT). Otros métodos convencionales también se pueden utilizar para preparar los PBMC no fraccionados enriquecidos.

La construcción de los perfiles de expresión típicamente involucra la detección del nivel de expresión de cada gen de enfermedad utilizado en el diagnóstico o el pronóstico. Los métodos numerosos están disponibles para este propósito. Por ejemplo, el nivel de expresión de un gen se puede determinar mediante medir el nivel trascripto o transcriptos de ARN del gen. Métodos adecuados incluyen, pero no se .imitan a, RT-PCT cuantitativo, Northern blot, hibridización in situ, slot-blotting, ensayo de protección de nucleasa, y disposición de ácido nucleico (incluyendo disposición de perlas). e I nivel de expresión de un gen también se puede determinar mediante medir el nivel del polipéptido o polipéptidos codificados por el gen. Métodos adecuados incluyen, pero no se limitan a, inmuno ensayos, (tales como ELISA, RÍA; FACS, o Western blot), electroforesis de gel bidimensional, espectrometría de masa, o disposiciones de proteína.

El perfil de expresión del gen o genes de la enfermedad de la leucemia en un sujeto de interés se puede determinar mediante medir el nivel de trascrito de ARN de cada uno de los genes en una muestra de sangre periférica del sujeto. Métodos adecuados para este propósito incluyen, pero no se limitan a, RT-PCR cuantitativo, RT-PCR competitivo, RT-PCR en tiempo real, RT-PCR de visualización diferencial, northern blot, hibridización in situ, slot-blotting, ensayos de protección de nucleasa, y disposiciones de ácido nucleico (incluyendo disposiciones de perlas). El perfil de expresión de los genes de la enfermedad de la leucemia también se puede determinar mediante medir el nivel de producto de proteína de cada uno de los genes en la muestra de sangre periférica del sujeto de interés. Métodos adecuados para este propósito incluyen, pero no se limitan a, inmuno ensayos (por ejemplo, ELISA (ensayo inmuno absorbente ligado a enzima), RÍA (radio inmuno ensayo), FACS (clasificador de células activado por florescencia), western blot, dot blot, inmuno histoquímica, o formación de radio imágenes con base en anticuerpo), disposiciones de proteína, secuenciamiento de proteína de alto rendimiento, electroforesis de gel SDS-poliacrilamida bidimensional, y espectrometría de masa. En adición, la actividad biológica (por ejemplo, la actividad enzimática o la actividad de ligado de proteína/ADN) del producto de proteína codificado por un gen de la enfermedad de la leucemia también se puede utilizar para medir el nivel de expresión del gen en una muestra de sangre periférica de interés.

El perfil de expresión del gen o genes de la enfermedad de la leucemia puede tener cualquier forma. En una modalidad, el perfil de expresión incluye el nivel de expresión de cada gen de la enfermedad de la leucemia empleado. Cada nivel de expresión puede ser un nivel de expresión absoluto, o un nivel de expresión normalizado o relativo. Los métodos adecuados para normalizar los niveles de expresión de diferentes genes incluyen, pero no se limita a, aquellos descritos en Hill et al., (2001) Genome Biol., 2:research 0055J -0055.13, y el análisis de expresión de Genechip®-Data analysis Fundamentáis (parte No. 701190 Rev, 2, Affymetrix, Inc., 2002), ambos incorporados aquí como referencia en su totalidad. En un ejemplo, el nivel de expresión de cada gen de la enfermedad de la leucemia se normaliza con base en controles internos o externos. El nivel de expresión de cada gen de la enfermedad de la leucemia se puede también normalizar contra uno o más trascriptos de control con abundancias conocidas en las muestras usadas.

El perfil de expresión del gen o genes de la enfermedad de la leucemia también puede incluir la proporción o proporciones entre los niveles de expresión de diferentes genes de la enfermedad de la leucemia (por ejemplo, proporciones entre los niveles de expresión de genes que se sobre regulan en los PBMC de los pacientes con leucemia contra los genes que son subregulados). Las proporciones entre los niveles de expresión de los genes de la enfermedad de la leucemia contra los genes de enfermedad que no son leucemia se pueden también utilizar para construir los perfiles de expresión de los genes de la enfermedad de la leucemia. Otras medidas que son indicativas de los patrones de expresión del gen se pueden también utilizarse para preparar los perfiles de expresión de genes.

La diferencia o similaridad entre el perfil de expresión de un sujeto de interés y un perfil de expresión de referencia se puede determinar mediante determinar las diferencias o similitudes entre los componentes correspondientes en los dos perfiles. Métodos adecuados para este propósito incluyen, pero no se limitan a, cambios de doblado o diferencias absolutas. En un ejemplo, el nivel de expresión de un gen de la enfermedad de la leucemia en un sujeto de interés se considera similar al nivel de referencia correspondiente en el perfil de expresión de referencia si la diferencia entre los dos niveles es menor a 50%, 40%, 30%, 20% o 10% del nivel de referencia. En otro ejemplo, el nivel de expresión de un gen de la enfermedad de leucemia en un sujeto de interés se considera similar al nivel de referencia correspondiente en el perfil de expresión de referencia si el nivel anterior cabe dentro de la desviación estándar (o un múltiplo o fracción de ella) del nivel de referencia.

El criterio para la similitud general entre el perfil de expresión de un sujeto de interés y un perfil de expresión de referencia puede seleccionarse de modo que la precisión (la proporción de llamadas correctas sobre el total de llamadas correctas e incorrectas) para el diagnóstico de la leucemia o su determinación es relativamente alta. Por ejemplo, el criterio de similaridad se puede seleccionar de modo que la posición para el diagnóstico o determinación de la leucemia es por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más. En un ejemplo, una llamada de similitud general se hace si por o menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de los componentes del perfil de expresión del sujeto de interés se consideran similares a los componentes correspondientes en el perfil de expresión de referencia. Los componentes diferentes en los perfiles de expresión pueden tener el mismo peso o pesos diferentes en comparación. Los métodos con base en la expresión de genes se pueden también combinar con otros ensayos clínicos para mejorar la precisión del diagnóstico o determinación de la leucemia.

El algoritmo de votación pesado esa capaz de asignar una membresía de clase a un sujeto de interés. Ver Golub et al., Supra, y Slonim et al., Supra. Los programas de software adecuados para este propósito incluyen, pero no se limitan a, el software gen Cluster 2 (Broad Institute, Cambrigde, MA).

Bajo una forma del análisis de votación pesada, un sujeto de interés se le asigna a una de dos clases (es decir clase 0 y clase 1), cada plato representa un estado de enfermedad diferente (por ejemplo, AML, MDS, o libre de enfermedad). Por ejemplo, la clase 0 puede incluir a los humanos libres de enfermedad y la clase 1 incluye los pacientes con MDS (o AML). De otro lado, la clase 0 puede incluir los pacientes con AML y la clase 1 incluye pacientes con MDS. Un conjunto de genes de la enfermedad AML o de MDS se pueden seleccionar de las tablas 2, 4, o 6 para formar un clasificador (es decir un proyector de clase). Cada gen en el clasificador tiene un voto pesado para una de las dos clases (clase 0 o clase 1). El voto del gen (G) se puede definir como Vg=ag (Xg-bg), en donde ag es igual a p(g,c) y refleja la correlación entre el nivel de expresión del gen "g" y la distinción de clase entre clase 0 y clase 1. vg es igual a[X0(g)+X1 (g)]/2, que es el promedio de los logaritmos medios de los niveles de expresión del gen "g" en la clase O y en la clase 1. Xg representa el logaritmo normalizado del nivel de expresión del gen "g" en la muestra de interés. Un vg positivo indica un voto para clase 0, y un vg negativo indica un voto para la clase 1. VO denota la suma de todos los votos positivos, y v1 significa el valor absoluto de la suma de todos los votos negativos. Una fuerza de producción se defina como PS= (V0-V1 )/(V0+V1 ).

La validación cruzada se puede utilizar paras evaluar la precisión de un proyector de clase creado bajo el algoritmo de votación pesada. En una modalidad, la validación cruzada incluye sostener una muestra que se ha utilizado en el análisis de vecindad para a identificación de genes de la enfermedad. Un proyector de clase se crea con base en las muestras restantes, y luego se utiliza para producir la clase de la muestra mantenida. Este proceso se repite para cada muestra que se ha utilizado en el análisis de vecindad. Los predictores de clase con diferentes genes de enfermedad de la leucemia se evalúan mediante validación cruzada., y el mejor predictor de clase con la predicción más precisa se puede identificar.

Cualquier número de genes de la enfermedad de la leucemia se puede emplear en la presente invención. En una modalidad, por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, o más genes seleccionados de la tabla 2se utilizan para el diagnóstico o la evaluación de la efectividad de un tratamiento para el AML en un sujeto de interés. En otra modalidad, por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, o más genes seleccionados de la tabla se utilizan para el diagnóstico o la evaluación de la efectividad de un tratamiento para el MDS en un sujeto de interés. Todavía en otra modalidad, por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, o más genes seleccionados de la tabal 6 se utilizan para el diagnóstico o la evaluación de la progresión o el tratamiento contra el MDS en un sujeto de interés. En una modalidad adicional, una combinación de genes seleccionados de las tablas 2,4 o 6 se utiliza para el diagnóstico o evaluación de la progresión o tratamiento del AML o del MDS en un sujeto de interés.

El gen o genes de la enfermedad de la leucemia empleados en la presente invención se puede seleccionar para que tengan valores p no mayores a 0.05, 0.01 , 0.005, 0.001 , 0.0005, 0.0001 , o menos. El gen o genes de la enfermedad de la leucemia también se pueden seleccionar para que incluyan genes que son sobre regulados en pacientes con leucemia en comparación con los humanos libres de la enfermedad, los mismo que genes que se subregulan en pacientes con leucemia en comparación con los humanos libres de la enfermedad. Para mejorar la precisión del diagnóstico o determinación de la leucemia, el gen o genes de la enfermedad de la leucemia también puede seleccionarse mediante el uso de los algoritmos de optimización tal como el algoritmo de la varianza media según se describió en la Solicitud de Patente Estadounidense 20040214179.

En donde una votación pesada o un algoritmo de vecindad cercano a k se utilizan, los genes de la enfermedad de la leucemia en un predictor de clase se pueden seleccionar de modo que ellos se correlacionen significativamente con la distinción de clase en el análisis de la vecindad. Por ejemplo, los genes de la enfermedad de la leucemia que están por encima del 1 %, 5%, o 10% del nivel de significancia en el análisis de la vecindad se pueden seleccionar. Ver Golyb et al., Supra, y Slonim et al., Supra. Los genes de la enfermedad de la leucemia en un predictor de clase también pueden incluir genes de la enfermedad de la leucemia sobre regulados superiores, lo mismo que genes de la enfermedad de la leucemia subregulados superiores.

En un ejemplo, un predictor de clase empleado en la presente invención comprende o consiste de por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20,40, o más genes seleccionados de la tabla 2 o la tabla 4. El predictor de clase puede incluir por lo menos dos grupos de genes. El primer incluye un gen o genes que tienen proporciones de AMIJIibre de enfermedad (o MDS/libre de enfermedad) de por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más genes y el segundo grupo incluye gen o genes que tienen proporciones de AML/libre de enfermedad (o proporciones de MDS/libre de enfermedad) no mayores a 0.5, 0.333, 0.25, 0.2, 0J , o menos.

En otro ejemplo, un predictor de clase empleado en la presente invención comprende o consiste de por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20,40, o más genes seleccionados de la tabla 6. El predictor de clase puede incluir también por lo menos dos grupos de genes. El primer grupo incluye un gen o genes que tienen proporciones AML/MDS de por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más genes, y el segundo grupo incluye un gen o genes que tienen proporciones de AML/MDS no mayores 0.5, 0.333, 0.25, 0.2, 0J , o menos.

Adicional a los genes ilustrados en las tablas 2, 4, y 6, la presente invención también contempla el uso de otros genes de la enfermedad de la leucemia para el diagnóstico o determinación de la progresión o tratamiento de la leucemia en un sujeto de interés. Estos genes pueden hibridizar bajo condiciones de hibridización rigurosas o de disposición de ácido nucleico en los calificadores seleccionados de las tablas 2,4, y 6. Como se usa aquí, un gen puede hibridizar a un calificador si el trascripto de ARN (o complemento del mismo), dependiendo del tipo de cadena de las probetas de oligonucleótido del calificador, del gen puede hibridizar en por lo menos una probeta de oligonucleótido del calificador. En muchas instancias, el trascripto de ARN (o su complemento) del gen puede hibridizar bajo condiciones rigurosas o de disposición de ácido nucleico en por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de las probetas del oligonucleótido del calificador y producir una llamada "presente" en el calificador en un Affymetrix Genechip® bajo condiciones normales (es decir, el umbral Tau es 0.015 y el nivel de significancia a1 es 0.4). Ver Genechip® Expression Analysis-Data Analysis Fundamentáis (parte No. 701190, Rev. 2, Affymetrix, Inc., 2002).

D. Otras aplicaciones Una infección clínica relacionada con AML, MDS u otras enfermedades de la sangre o de la médula del hueso es la respuesta altamente variable de pacientes a una terapia. El concepto básico farmacogenómicos es entender un genotipo del paciente en relación con las opciones de tratamiento disponibles y luego individualizar la opción más apropiada para el paciente. De acuerdo con la presente invención, las clases diferentes de pacientes se pueden crear con base en sus diferentes respuestas a una terapia dada. Los genes diferencialmente expresados en los PBMC no fraccionados de una clase de respuesta en comparación con otra clase de respuesta se pueden identificar utilizando el análisis de expresión de genes global. Estos genes son marcadores moleculares para predecir si un paciente de interés tendrá más o menos respuesta a la terapia. Para pacientes predichos con un resultado favorable, los esfuerzos para una toxicidad minimizada de la terapia se pueden considerar, mientras que para aquellos que se les predijo que no había respuesta a la terapia, el tratamiento con otras terapias u otros regímenes experimentales pueden ser explorados.

En una modalidad, los pacientes se agrupan en por lo menos dos clases (clase 0 y clase 1). La clase 0 incluye pacientes que mueren dentro de un periodo de tiempo especificado (tal como un año) después de la iniciación del tratamiento. La clase 1 incluye pacientes que sobreviven más allá del periodo de tiempo especificado después de la iniciación de un tratamiento. Los genes que se expresan diferencialmente en los PBMC no fraccionados de los pacientes clase 0 en comparación con los PBMC no fraccionados de los pacientes clase 1 se pueden identificar. Estos genes son marcadores de pronóstico del resultado clínico del paciente. Otros criterios para el resultado clínico, tales como remisión/no remisión, tiempo de progreso, respuesta completa, respuesta parcial, enfermedad estable, o enfermedad progresiva, también se pueden utilizar para agrupar pacientes con leucemia para identificar los genes de pronóstico correspondientes.

Los genes de la enfermedad de la leucemia de la presente invención también se pueden utilizar para identificar o probar drogas para el tratamiento del AML o del MDS. La habilidad de una droga candidato para reducir o eliminar la expresión anormal de los genes de la enfermedad AML o MDS en los PBMC no fraccionados es sugestivo de la efectividad de la droga candidato en el tratamiento del AML o del MDS. Los métodos para seleccionar o evaluar drogas candidato se conocen bien en la técnica. Estos métodos se pueden llevar a cabo sea en modelos animales o durante ensayos clínicos humanos.

La presente invención también contempla vectores de expresión que codifican los genes de la enfermedad AML o MDS. Estos genes de la enfermedad AML o MDS se pueden subexpresar en células de tumor de AML o MDS.. Mediante introducir los vectores de expresión dentro de los pacientes que lo requieren, la expresión anormal de estos genes se puede corregir. Los vectores de expresión y las técnicas de suministro de genes adecuadas para este propósito son bien conocidos en la técnica.

En adición, esta invención contempla secuencias que son anti sentido con respecto a los genes de la enfermedad AML o MDS o vectores de expresión que los codifican. Los genes de la enfermedad AML o MDS se pueden sobre expresar en células de tumor de AML o MDS. Mediante introducir las secuencias anti sentido o los vectores de expresión que la codifican, la expresión anormal de estos genes de la enfermedad se puede corregir.

La expresión de un gen de la enfermedad AML o MDS puede inhibirse mediante la interferencia del ARN ("iARN"). El ¡ARN es una técnica utilizada en silenciar genes post transcripcionales ("PTGS"), en los cuales la actividad del gen objetivado es eliminada específicamente. El iARN se parece en muchos aspectos al PTGS en las plantas y se ha detectado en muchos invertebrados incluyendo tripanosoma, hidra, planaria, nematodo, y la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster). Puede estar involucrado en la modulación de elementos transportables y en la formación del estado anti viral. El ¡ARN en sistemas de mamíferos está divulgado en la solicitud PCT WO00/63364. En una modalidad, dsARN de por lo menos cerca de 21 nucleótidos se introduce dentro de células para silenciar la expresión del gen objetivo.

En adición, la presente invención caracteriza anticuerpos que reconocen específicamente los polipéptidos codificados por los genes de la enfermedad AML o MDS. Estos anticuerpos se pueden administrar al paciente que lo necesita. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención puede reducir o inhibir sustancialmente la actividad de un gen de la enfermedad. Por ejemplo, el anticuerpo puede reducir la actividad de un gen de la enfermedad en por lo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o más. Anticuerpos adecuados para la presente invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena única, fragmentos fab, y fragmentos producidos por una librería de expresión de fab. En muchas modalidades, los anticuerpos de la presente invención pueden ligar a los productos de gen de la enfermedad AML o MDS respectiva u otros antígenos deseados con una constante de afinidad de ligado ka de por lo menos 106"1, 107"1, 108"1, 109"1, o más.

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un polinucleótido de la presente invención se puede preparar. La composición farmacéutica se puede formular para ser compatible con su vía propuesta de administración. Ejemplos de vías de administración incluyen, pero no se limita a, administración parenteral, intravenosa, íntradérmica, subcutánea, oral, inhalacional, transdérmica, tópica, transmucosal, y rectal.

Los métodos para preparar las composiciones farmacéuticas deseables son bien conocidos en la técnica.

La presente invención caracteriza adicionalmente kits o aparatos para el diagnóstico o el monitoreo de la progresión o tratamiento del AML o MDS. En una modalidad, un kit o aparato de la presente invención incluye o consiste esencialmente de uno o más polinucleótidos, cada uno de los cuales es capaz de hibridizar bajo condiciones estrictas a un gen seleccionado de las tablas 2, 4, o 6. El polinucleótido o los polinucleótidos pueden estar marcados con partes fluorescentes, radiactivas u otras detectables. El polinucleótido o los polinucleótidos también pueden estar sin marcar. Cualquier número de polinucleótidos puede incluirse en un kit o aparato. Por ejemplo, por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, o más polinucleótidos se pueden incluir en un kit o aparato, cada polinucleótido es capaz de hibridizar bajo condiciones estrictas en un gen diferente respectivo seleccionado de las tablas 2, 4, o 6. En un ejemplo, el polinucleótido o los polinucleótidos incluidos en un kit o aparato están encerrados en un frasco, un tubo, una botella, u otro medio que los pueda contener. En otro ejemplo, el polinucleótido o polinucleótidos están ligados establemente a uno o más sustratos. La hibridización de ácido nucleico se puede conducir directamente sobre el sustrato o los sustratos. Los reactivos de hibridización también pueden estar incluidos en un kit o aparato de la presente invención.

En otra modalidad, un kit o aparato de la presente invención incluye o consiste esencialmente de uno o más anticuerpos específicos para el polipéptido o polipéptidos codificados por el gen o genes seleccionados de las tablas 2,4 o 6. El anticuerpo o anticuerpos pueden estar marcados con uno o más partes detectables para permitir la detección de los complejos anticuerpo-antígeno. El anticuerpo o anticuerpos también pueden estar sin marcar.

Cualquier número de anticuerpos se pueden incluir en un kit o aparato. Por ejemplo, por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, o más anticuerpos pueden estar incluidos en un kit o aparato, y cada uno de estos anticuerpos puede reconocer específicamente un producto de gen de la enfermedad AML o MDS diferente respectivo. Los reactivos de inmuno detección (tales como anticuerpos secundarios, controles o sustratos de enzima) pueden también ser incluidos en un kit o aparato de la presente invención. En un ejemplo, un kit de la presente invención incluye uno o más contenedores que encierran el anticuerpo o anticuerpos. En otro ejemplo, el anticuerpo o anticuerpos en un aparato de la presente invención están ligados establemente a uno o más sustratos. Los sustratos adecuados para este propósito incluyen, pero no se limitan a, películas, membranas, matrices de columna, o pozos de una placa micro título. Los inmuno ensayos se pueden llevar a cabo directamente sobre el o los sustratos.

Más aún, la presente invención caracteriza sistemas capaces de comparar un perfil de expresión de interés en por lo menos un perfil de expresión de referencia. En muchas modalidades, los perfiles de expresión de referencia están almacenados en una base de datos, la comparación entre el perfil de expresión de interés y los perfiles de expresión de referencia se puede llevar a cabo electrónicamente, tal como por medio de utilizar un sistema de computadora. El sistema de computadora típicamente comprende un procesador acoplado a una memoria la cual almacena datos que representan los perfiles de expresión que se van a comparar. En una modalidad, la memoria es legible lo mismo que reescribible. Los perfiles de expresión pueden ser recuperados o modificados. El sistema de computadora incluye uno o más programas capaces de causar que el procesador compare los perfiles de expresión. En una modalidad, el sistema de computadora incluye un programa capaz de ejecutar una votación pesada o un algoritmo de vecinos k más cercanos. En otra modalidad, el sistema de computar está acoplado a una disposición de ácidos nucleicos de la cual las señales de hibridización se pueden alimentar directamente dentro del sistema.

Kits para el pronóstico, diagnóstico o selección del tratamiento de MDS, AML, y otras leucemias En adición, la presente invención caracteriza kits útiles para el pronóstico, diagnóstico o selección de tratamiento de MDS, AML, u otras leucemias. Cadun kitincluye o consiste esencialmente de por lo menos una probeta para un gen de la enfermedad de la leucemia (por ejemplo, un gen seleccionado de las tablas 2, 4 o 6). Los reactivos o amortiguadores que facilitan el uso del kit también se pueden incluir. Cualquier tipo de probeta se puede utilizar en la presente invención, tal como probetas de hibridización, cebadores de amplificación, o anticuerpos.

En una modalidad, un kit de la presente invención incluye o consiste esencialmente de por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más probetas de polinucleótido o cebadores. Cada probeta/cebador puede hibridizar bajo condiciones estrictas o condiciones de hibridización de disposición de ácido nucleico a un gen de la enfermedad de la leucemia diferente respectivo. Como se usa aquí, un polinucleótido puede hibridizar a un gen si el polinucleótido puede hibridizar a un trascripto de ARN, o su complemento del gen. En otra modalidad, un kit de la presente invención incluye uno o más anticuerpos, cada uno de los cuales es capaz de ligar a un polipéptido codificado por un gen de la enfermedad de la leucemia diferente respectivo.

En un ejemplo, un kit de la presente invención incluye o consiste esencialmente de probetas (por ejemplo, probetas de hibridización o de amplificación PCR o anticuerpos) por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 o más genes seleccionados de la tabla 2, 4 o 6.

Las probetas empeladas en la presente invención pueden estar marcadas o no marcadas. Las probetas marcadas pueden ser detectables por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, bioelectrónicas, inmuno químicos, eléctricos, ópticos, químicos, u otros adecuados. Las partes marcadas ilustrativas para una probeta incluyen radio isótopos, compuesto quimio luminiscentes, proteínas de ligado marcadas, átomos de metal pesados, marcadores espectroscópicos, tales como marcadores fluorescentes y tinturas, marcadores magnéticos, enzimas ligadas, tarjetas de espectrometría de masa, marcadores del giro, donores de transferencia de electrones y aceptores de transferencia de electrones, y similares.

Los kits de la presente invención también pueden tener contenedores que contienen amortiguadores o medios reporteros. En adición, los kits pueden incluir reactivos para conducir controles positivos o negativos. En una modalidad, las probetas empleadas en la presente invención se ligan establemente a uno o más soportes de sustrato. La hibridización de ácido nucleico o los inmuno ensayos se pueden llevar directamente en los soportes de sustrato. Los soportes de sustrato adecuados para este propósito incluyen, pero no se limitan a, vidrios, sílice, cerámicas, nylon, galletas de cuarzo, geles, metales, papeles, perlas, tubos, fibras, películas, membranas, matrices de columna o pozos de placa micro título. Los kits de la presente invención también pueden contener uno o más controles cada uno representan un nivel de expresión de referencia de un gen de la enfermedad detectable por una o más probetas contenidas en los kits.

Se debería entender que las modalidades anteriormente descritas y los siguientes ejemplos se dan como ilustración y no como limitación. Varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la presente invención serán evidentes para aquellos versados en la técnica a partir de la presente descripción.

E. Ejemplos Ejemplo 1. Purificación de los PBMC y del ARN Se recolectó sangre completa de voluntarios libres de la enfermedad, pacientes con MDS, y pacientes con AML. Los consentimientos informados para las porciones farmacogenómicas de estos estudios clínicos se recibieron y el proyecto se aprobó por la junta de revisión institucional local y en los sitios clínicos participantes. Los pacientes con MDS fueron principalmente de descendencia caucásica y tenían una edad promedio de 66 años (rango de 52 a 84 años). Los pacientes con AML fueron exclusivamente de descendencia caucásica y tenían una edad promedio de 45 años (rango de 19 a 65 años). Los voluntarios libres de la enfermedad fueron exclusivamente de descendencia caucásica con edad promedio de 23 años (rango entre 18 a 32 años).

El criterio de inclusión para los pacientes con AML incluyó retículos en exceso de 20% en la médula del hueso, diagnóstico morfológico del AML de acuerdo con el sistema de clasificación fab y análisis de citometría de flujo que indica un estado de CD33+. El criterio de inclusión para los pacientes con MDS incluyó diagnóstico morfológico del MDS y clasificación fab cono anemia refractaria, anemia refractaria con sideroblastos timbrados, anemia refractaria con exceso de retículo, o anemia refractaria con exceso de retículos en transformación (en donde la estabilidad de la enfermedad había demostrado un mínimo de 2 meses).

Las muestras de sangre se retiraron en tubos Vacutainer de preparación de células CPT (Becton Dickinson). Los PBMC se aislaron sobre gradientes de ficol de acuerdo con el protocolo del fabricante (Becton Dickinson). El ARN total se aisló de los granulos de PBMC no fraccionados utilizando mini kits Quiagen RNeasy® (Quiagen, Valencia, CA).

Ejemplo 2. Amplificación del ARN y generación de probetas de hibridización Genechip® El objetivo marcado para los arreglos de oligonucleótido se preparó utilizando una modificación del procedimiento descrito en Lockhart et al., (1996)Nature Biotechnology 14:1675-1680. Dos microgramos del ARN total se convirtieron en cADN utilizando un cebador ligo-d(T)24 que contiene el promotor de polimerasa del ADN T7 en el extremo 5'. El cADN se utilizó como la plantilla para la transcripción in Vitro utilizando el kit de polimerasa de ADN T7 (Ambion, Woodlands, TX, USA) y el CTP biotinilado y UTP (Enzo, Farmingdale, NY, USA). El cARN marcado se fragmentó en 40 mM de tris-acetato con pH 8.0, 100 mM de KOAc, 30 mM de MgOAc durante 35 min a 94 °C en un volumen final de 40 µl.

Ejemplo 3. Hibridización a micro arreglos Affymetrix y detección de fluorescencia Las muestras de individuos enfermos y libres de enfermedad se hibridizan a los Genechip® HG-U133A (Affymetrix). Ninguna de las muestras fue agrupada. 10 µg del objetivo marcado se diluye en 1X de amortiguador MES con 100 µg/ml de ADN de espermatozoides de arenque y 50 µg/ml de BSA acetilado. Para normalizar el arreglo de uno a otro y para estimar la sensibilidad de los arreglos de oligonucleótidos, transcriptos sintetizados in Vitro de 11 genes bacterianos se incluyen en cada reacción de hibridización, como se describió en Hill et al. (2000) Sciencie 290:809-812. La abundancia de estos transcriptos varía entre 1 :300.000 (3 ppm) a 1 : 1.000 (1000 ppm) establecido en términos del número de transcriptos de control por transcriptos totales. Como se determinó mediante la respuesta de señal de estos transcriptos de control, la sensibilidad de detección de los arreglos puede variar entre 1 :300.000 y 1 :100.000 copias/millón.

Las probetas marcadas son desnaturalizas a 99 °C durante 5 minutos y luego 45 °C durante 5 minutos e hibridizados para arreglos de oligonucleótidos comprendidos en 12500 genes humanos (HG-U133A, Affymetrix). Los arreglos se hibridizan durante 16 horas a 45 °C. El amortiguador de hibridización incluye 100 mM de MDS, 1 M [Na+], 20 mM de EDTA, y 0.01% de Tween 20. Después de la hibridización, los cartuchos se lavan extensivamente con amortiguador de lavado 6x SSPET (por ejemplo tres veces a temperatura ambiente durante por lo menos 10 minutos cada vez). Estas condiciones de hibridización y de lavado son referidas colectivamente como "condiciones de hibridización de arreglo de ácido nucleico". Los cartuchos lavados se manchan subsiguientemente con ficoeritrina acoplada a estreptavidina.

Un material de 12 por M MES contiene 1.22 M de MES y 0.89 M [Na+]. Para 1000 ml, el material se puede preparar mediante mezclar 70.4 g de monohidrato de MES libre de ácido, 193, 3 g de sal de sodio MES y 800 ml de agua grado biología molecular, y se ajusta el volumen a 1000 ml. El pH podría estar entre 6.5 y 6.7. 2 por amortiguador de hibridización se puede preparar mediante mezclar 8.3 ml de 12x material de MES, 17.7 ml de 5 M de NaCI, 4.0 ml de 5.0 de EDTA, 0J ml de 10% de Tween 20 y 19.9 ml de agua. 6 x SSPET contiene 0.9 m de NaCI, 60 mM de NaH2PO4 6 mM de EDTA, pH 7.4, y 0.005% de Tritón X-100. En algunos casos, el amortiguador de lavado se reemplaza con un amortiguador de lavado más riguroso. 1000 ml del amortiguador de lavado más riguroso se puede preparar mediante mezclar 83.3 ml de 12 x material de MES, 5.2 ml de 5 M de NaCI, 1.0 ml de 10% de Tween 20 y 910, 5 ml de agua.

Ejemplo 4. Análisis de datos de la expresión de genes El análisis de datos y la determinación de llamadas ausente/presente se llevan a cabo en valores de intensidad fluorescente bastas utilizando el software Genechip® 3.2 (Affymetrix). Los valores de "la diferencia promedio" para cada trascripto se normalizan a valores de "frecuencia" utilizando los métodos de normalización escalada a frecuencia en los cuales las diferencias promedio para 11 cARN de control con abundancia de picos conocidos en cada solución de hibridización se utilizaron para generar una curva de calibración global. Ver Hill et al. (2001) Genome Biol., 2(12): research 0055J -0055.13, cuyo contenido completo se incorpora aquí como referencia. Esta calibración se utiliza entonces para convertir los valores de diferencia promedio para todos los transcriptos a estimados de frecuencia, establecido en unidades de partes por millón que varía entre 1 :300.000 (tres partes por millón (ppm)) a 1 :1000 (1000 ppm).

El software Genechip® 3.2 usa algoritmos para calcular la probabilidad como si un gen estuviera "ausente" o "presente" los mismo que un valor de intensidad de hibridización específica o "diferencia promedio" para cada trascripto representado en la disposición. Los algoritmos utilizados en estos cálculos se describen en la guía del usuario de Suite de análisis Genechip® de Affymetrix.

Los trascriptos específicos pueden ser evaluados adicionalmente si ellos cumplen el siguiente criterio. Primero, los genes están designados "ausentes" por el software Genechip® 3.2 en todas las muestras son excluidos del análisis. Segundo, en comparaciones de los niveles de trascripto entre disposiciones, un gen se le requiere estar presente en por lo menos una de las disposiciones. Tercero, por comparaciones de niveles de trascripto entre grupos, un ensayo T de student se aplica par identificar un subconjunto de trascritos que tienen una diferencia significativa (p < 0.05) en valores de frecuencia. En muchos casos, un cuarto criterio, que requiere que los cambios de doblez promedio en valores de frecuencia a través del subconjunto de genes significativamente estadístico sea dos veces o mayor, también se utiliza.

Una agrupación de genes jerárquicos y no supervisados y/o disposiciones en la base de similaridad de sus perfiles de expresión se puede llevar a cabo utilizando el procedimiento descrito en Eisen et al., (1998) Porc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 95:14866-14868. El análisis de predicción del vecino más cercano y el análisis de grupo supervisado se puede llevar a cabo utilizando la métrica ilustrada en Golub et al., Supra. Para la agrupación jerárquica y el análisis de predicción del vecino más cercano, los datos pueden ser primero transformados a logaritmo y luego normalizados para tener un valor medio de 0 y una varianza de 1. Un ensayo T de student s puede utilizar para comparar los perfiles de expresión libre de enfermedad, del AML y MDS en los PBMC. Un valor p de no más de 0.05 (por ejemplo no más 0.01 , 0.001 , o menos) se puede utilizar para indicar la significancia estadística.

Un modelo del vecino k más cercano se puede utilizar para llevar a cabo un análisis de vecindada de datos permutados reales o aleatoriamente utilizando una métrica de correlación [P (g,c)= (µ1-µ2)/(s1-s2)], en donde g es el vector de expresión del gen g, c es un vector de clase, µ1 y s1 definen el nivel de expresión medio y la desviación estándar del gen g en la clase 1 , respectivamente, y µ2 y s2 definen el nivel de expresión media y la desviación estándar del gen g en la clase 2, respectivamente. Las medidas de correlación para la mayoría de los genes estadísticamente significativos observados en las distinciones de clase reales (AML Vs. Libre de enfermedad, MDS Vs. Libre de enfermedad, o AML Vs. MDS) se pueden comparar en cuanto a las medidas de correlación estadísticamente más significativas observadas en distinción de clases permutadas aleatoriamente. Las medidas superiores a 1%, 5% y la distancia media de 100 clases permutadas aleatoriamente comparadas con las medidas de distancia observadas para AML contra libre de enfermedad, MDS contra libre de enfermedad, o AML contra MDS se pueden graficar para mostrar la verificación estadística de los genes de la enfermedad de la leucemia identificados por esta invención.

Ejemplo 5. Los clasificadores de genes para la predicción de libre de enfermedad contra MDS contra AML Una firma de 24 calificadores (8 a cADN que representan 7 genes que definen AML, 8 cADN que representan 7 genes que definen MDS, y 8 cADN que presentan 8 genes que definen libre de enfermedad se identificaron). Esta firma puede predecir de manera precisa y clasificar muestras PBMC de individuos libres de la enfermedad, pacientes con MDS, o pacientes con AML. Esta firma también identifica los progresores de MDS rápidos como "AML", con implicaciones para la detección temprana de la progresión de AML en pacientes con MDS.

Los calificadores en la firma de 24 calificadores de dan en la tabla 8, más adelante. Para cada calificador, el valor de señal a ruido asociado con el calificador se suministra en la columna marcada "calificación". Cada valor de señal a ruido fue mayor que el valor en la columna "Perm 1%" adyacente, que representa los valores de señal a ruido observados para el superior a 1 % de las permutaciones aleatorias cuando las etiquetas de los perfiles se mezclaron y luego se compararon utilizando tamaños de clase idénticos. Así, los valores reales de señal a ruido para los calificadores fueron superiores a aquellos en el superior a 1 % de las permutaciones aleatorias. Los genes humanos correspondientes se identifican por nombre, por símbolo, por localización cromosomal ("citobanda"), por número de unigen, por número de acceso en el GenBank. Los genes humanos utilizados para identificar el AML incluyen el myb humano, la proteína neuronal 3J humana, la mieloperoxidasa humana, la catalasa humana; el CGI-498 humano; el factor de crecimiento celular de células no diferenciadas humanas; y el inhibidor de peptidaza serina humano, kazal tipo 2 (inhibidor de acrosina- tripsina). Los genes humanos utilizados para identificar el MDS incluyen el NEDD4L humano; glutatione peroxidasa humano 3; el grupo de sangre Kx ligado a x humano; la sinoucleina humana, alfa; el cromosoma 8 humano de cuadro de lectura abierto 51/proteína hipotética MGC3113; interferón humano, proteína inducible por alfa 27; y transglutaminasa 3 humana. Los genes humanos utilizados para identificar los PBMC de los individuos libres de la enfermedad incluyen el cromosoma 21 humano de cuadro abierto de lectura 7; el miembro 2 de la familia a de ligado a la proteína precursora beta A4 amiloide humana; el KIAA0449 humano; la proteína 21 solamente de la caja F humana; la proteína de apoptosis similar a ced-4 formadora de filamento efector de muerte humano; la proteína de dedo de zinc humano 14; el receptor 1 de péptido intestinal vasoactivo humano; y la KIAA0443 humana.

Los patrones de expresión en las células mononucleares de sangre periférica se midieron por disposiciones de oligonucleótido para 45 sujetos libres de la enfermedad, 36 pacientes diagnosticados con AML y 20 pacientes con diagnóstico inicial de MDS. Las comparaciones de estos grupos identificaron las diferencias transcripcionales que separan fácilmente los voluntarios AML y MDS de los voluntarios saludables, y las anotaciones revelan que muchas de estas diferencias aparecen debido a la proliferación de los retículos CD34+ en la circulación de estos pacientes. La posibilidad de discriminar entre pacientes con MDS y AML sobre la base de perfiles transcripcionales en la sangre periférica se exploró enseguida. De los 20 pacientes con diagnóstico inicial de MDS, 6 de las muestras de los pacientes de determinaron que venían de 1) pacientes con MDS con diagnósticos conflictivos entre el sitio patologístico y pacientes MDS de patologísta central (n=3) o 2) pacientes con MDS que progresaron rápidamente después de la muestra de sangre (mayor a tres meses), n=3. Un modelo supervisado sobre el conjunto de entrenamiento de muestras saludables, con AML y con MDS no progresiva se utilizó para identificar un clasificador de gen correlacionado con los perfiles en los individuos saludables, pacientes con MDS estables y pacientes con AML. Un clasificador de 8 genes fue predictivo óptimamente, exhibiendo una precisión general del 94% en el conjunto de entrenamiento (62/66 sujetos asignados correctamente mediante validación cruzada de saque 1). Uno de las 4 muestras mal clasificadas en el conjunto de entrenamiento fue de un paciente con MDS con un diagnóstico en conflicto que fue "mal clasificado" luego de la validación cruzada como AML. Cuando los 8 clasificadores de genes se aplicaron a las muestras restantes en el conjunto de ensayo, estos clasificadores identificaron las muestras restantes no ambiguas en el conjunto de ensayo con precisión similar (87%) de precisión general en la asignación de clase). Este predictor de 8 genes también asignó ambas muestras de los pacientes con diagnóstico en conflicto y todas las tres muestras de pacientes con MDS con tiempos rápidos para progresión de la enfermedad como se originó de los pacientes con AML. Estos resultados preliminares implican que los perfiles transcripcionales similares a AML de los pacientes con diagnóstico de MDS pueden preceder a la evidencia clínica estándar de la progresión AML (por ejemplo, hiperproliferación de retículos). Los resultados de estos estudios indican que los patrones de expresión de los trascriptos seleccionados en sangre periférica pueden suministrar indicadores tempranos de la progresión del AML en pacientes leucémicos con porcentajes de reticulación que se asocian comúnmente como un diagnóstico de MDS.

Tabla 8. Calificador de 24 calificadores para AML, MDS, y PBMC normales La descripción anterior de la presente invención suministra ilustración y descripción, pero no tiene el propósito de ser exhaustiva o de limitar la invención a los precisamente descrito. Modificaciones y variaciones son posibles a la luz de las enseñanzas anteriores y pueden se4r adquiridas de la práctica de la invención. Así, se anota que el alcance de la invención se define por las reivindicaciones y sus equivalentes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para el diagnóstico, o para monitorear la ocurrencia, desarrollo, progresión o tratamiento, de síndromes mielodisplásicos (MDS), el método comprende las etapas de: (1) generar un perfil de expresión de genes de una muestra de sangre periférica de un sujeto; y 2) comparar el perfil de expresión de gen a uno o más perfil de expresión de referencia, en donde el perfil de expresión de gen y el uno o más perfiles de expresión de referencia comprende los patrones de expresión de uno o más Genes de la enfermedad MDS en células mononucleares de sangre periférica (PBMC), y en donde la diferencia o similaridad entre el perfil de expresión de gen y el uno o más perfiles de expresión de referencia es indicativo de la presencia, ausencia, ocurrencia, desarrollo, progresión, o efectividad del tratamiento del MDS en el sujeto.

2. El método de la reivindicación 1 , en donde la muestra de sangre periférica comprende sangre completa o PBMC no fraccionado enriquecido.

3 El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el uno o más Genes de la enfermedad MDS comprende uno o más genes seleccionados de las Tablas 4 o 6.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el uno o más Genes de la enfermedad MDS comprende diez o más genes seleccionados de las Tablas 4 o 6.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el uno o más Genes de la enfermedad MDS comprende uno o más Genes de la enfermedad MDS seleccionados de la Tabla 8.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el uno o más perfiles de expresión de referencia comprende un perfil de expresión de referencia que representa un humano libre de la enfermedad.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa (2) comprende comparar el perfil de expresión de gen con el uno o más perfiles de expresión de referencia mediante un análisis del vecina k más cercano o un algoritmo de votación pesada.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente la etapa de diagnosticar o determinar el MDS en el sujeto con base en la comparación de la etapa (2).

9. Un método para el diagnóstico, o monitoreo de la ocurrencia, desarrollo, progresión o tratamiento, de leucemia en un sujeto, el método comprende las etapas de: (1) generar un perfil de expresión de genes de una muestra de sangre periférica del sujeto; y (2) comparar el perfil de expresión de gen a uno o más perfiles de expresión de referencia, en donde el perfil de expresión de gen y el uno o más perfiles de expresión de referencia comprende los patrones de expresión de uno o más genes de la enfermedad de la leucemia seleccionados de la Tabla 4 o 6 en células mononucleares de sangre periférica (PBMC), en donde la diferencia o similaridad entre el perfil de expresión de gen y el uno o más perfiles de expresión de referencia es indicativo de la presencia, ausencia, ocurrencia, desarrollo, progresión, o efectividad del tratamiento de la leucemia en el sujeto, en donde el uno o más genes de la enfermedad de la leucemia no se mencionan en la Tabla 2.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la muestra de sangre periférica comprende sangre completa o PBMC no fraccionado enriquecido.

11. El método de la reivindicación 9 o 10, en donde el uno o más genes de la enfermedad de la leucemia comprende diez o más genes seleccionados de la Tabla 4 o 6.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 , en donde el uno o más genes de la enfermedad de la leucemia seleccionados de la Tabla 4 o 6 comprende uno o más genes también mencionados en la Tabla 8.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en donde el uno o más perfiles de expresión de referencia comprenden un perfil de expresión de referencia que representa un humano libre de la enfermedad.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en donde la etapa (2) comprende comparar el perfil de expresión de gen con el uno o más perfiles de expresión de referencia mediante un análisis del vecino k más cercano o un algoritmo de votación pesada.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-14, en donde la leucemia es una leucemia mielogenosa aguda.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-14, en donde la leucemia es un síndrome mielodisplásico.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-16, que comprende adicionalmente la etapa de diagnosticar o determinar la leucemia en el sujeto con base en la comparación de la etapa (2).

18. Un método para identificar un paciente con MDS que tiene la probabilidad de progresar a una leucemia mielogenosa aguda (AML), el método comprende las etapas de: (1) generar un perfil de expresión de genes de una muestra de sangre periférica de un paciente con MDS; (2) comparar el perfil de expresión de gen con uno o más perfiles de expresión de referencia, en donde el perfil de expresión de gen y el uno o más perfiles de expresión de referencia comprende los patrones de expresión de uno o más genes de la enfermedad de la leucemia seleccionados de la Tabla 6 en células mononucleares de sangre periférica (PBMC), en donde la diferencia o similaridad entre el perfil de expresión de gen y el uno o más perfiles de expresión de referencia es indicativo de que el paciente con MDS probablemente progresara a AML.

19. El método de la reivindicación 18, en donde el uno o más perfiles de expresión de referencia comprende un perfil de expresión de referencia que representa un paciente con AML.

20. El método de la reivindicación 18 o 19, en donde la muestra de sangre periférica comprende sangre completa o PBMC no fraccionado enriquecido.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 18-20, en donde el uno o más genes de la enfermedad de la leucemia seleccionados de la Tabla 6 son también mencionados en la Tabla 8.

22. Una disposición para uso en un método para diagnosticar un síndrome mielodisplásico (MDS) que comprende un sustrato que tiene una pluralidad de direcciones, cada dirección comprende una probeta distinta dispuesta en ella, en donde por lo menos 15% de la pluralidad de direcciones tiene dispuestas en ella probetas que pueden detectar específicamente Genes de la enfermedad MDS en células mononucleares de sangre periférica.

23. La disposición de la reivindicación 22, en donde por lo menos 30% de la pluralidad de direcciones tiene dispuestas en ella probetas que pueden detectar específicamente Genes de la enfermedad MDS en células mononucleares de sangre periférica.

24. La disposición de la reivindicación 22, en donde por lo menos 50% de la pluralidad de direcciones tiene dispuestas en ella probetas que pueden detectar específicamente Genes de la enfermedad MDS en células mononucleares de sangre periférica.

25. La disposición de una cualquiera de las reivindicaciones 22-24, en donde los Genes de la enfermedad MDS son seleccionados de la Tabla 4.

26. La disposición de una cualquiera de las reivindicaciones 22-25, en donde la probeta es una probeta de ácido nucleico.

27. La disposición de una cualquiera de las reivindicaciones 22-25, en donde la probeta es una probeta de anticuerpo.

28. Una disposición para uso en un método para el diagnóstico de la leucemia comprende un sustrato que tiene una pluralidad de direcciones, cada dirección comprende una probeta distinta dispuesta en ella, en donde por lo menos 15% de la pluralidad de direcciones tiene dispuestas en ella probetas que pueden detectar específicamente genes seleccionados de las Tablas 4 o 6, en donde los genes no se mencionan en la Tabla 2.

29. La disposición de la reivindicación 28, en donde por lo menos 30% de la pluralidad de direcciones tienen dispuestas en ella probetas que pueden detectar específicamente genes seleccionados de las Tablas 4 o 6, en donde los genes no se mencionan en la Tabla 2.

30. La disposición de la reivindicación 28, en donde por lo menos 50% de la pluralidad de direcciones tiene dispuestas en ella probetas que pueden detectar específicamente genes seleccionados de las Tablas 4 o 6, en donde los genes no se mencionan en la Tabla 2.

31. La disposición de una cualquiera de las reivindicaciones 28-30, en donde la probeta es una probeta de ácido nucleico.

32. La disposición de una cualquiera de las reivindicaciones 28-30, en donde la probeta es una probeta de anticuerpo.

33. Un medio legible por computadora que comprende un perfil de expresión codificado digitalmente que comprende una pluralidad de señales de expresión codificadas digitalmente, en donde cada una de la pluralidad de señales de expresión codificadas digitalmente comprende un valor que representa la expresión de un gen seleccionado de las Tablas 4 o 6, en donde el gen no se menciona en la Tabla 2.

34. El medio legible por computadora de la reivindicación 33, en donde el valor representa la expresión del gen en una célula mononuclear de sangre periférica de un paciente con un síndrome mielodisplásico (MDS).

35. El medio legible por computadora de la reivindicación 33, en donde el valor representa la expresión del gen en una célula mononuclear de sangre periférica de un paciente con leucemia mielogenosa aguda (AML).

36. El medio legible por computadora de la reivindicación 33, en donde un perfil de expresión codificado digitalmente comprende por lo menos diez señales de expresión codificadas digitalmente.

37. Un kit para el diagnóstico de un síndrome mielodisplásico (MDS), el kit comprende: a) una o más probetas que pueden detectar específicamente Genes de la enfermedad MDS en células mononucleares de sangre periférica; y b) uno o más controles, cada una que representa un nivel de expresión de referencia de un gen de la enfermedad MDS detectable por la una o más probetas.

38. El kit de la reivindicación 37, en donde los genes de la enfermedad MDS son seleccionados de la Tabla 4.

39. El kit de la reivindicación 38, en donde los genes de la enfermedad MDS seleccionados de la Tabla 4 son también mencionados en la Tabla 8.

40. Un kit para el diagnóstico de leucemia, el kit comprende: a) una o más probetas que pueden detectar específicamente genes seleccionados de las Tablas 4 o 6, en donde los genes no se mencionan en la Tabla 2; y b) uno o más controles, cada uno que representa un nivel de expresión de referencia de un gen de la enfermedad detectable por la una o más probetas.

41. El kit de la reivindicación 40, en donde los genes seleccionados de las Tablas 4 o 6 son también mencionados en la Tabla 8.

42. Un método de para tomar una decisión con respecto a un individuo, el método comprende la etapa de: asignar el individuo a una clase con base en un valor que es una función de la expresión, en una muestra de sangre periférica del individuo, de uno o más genes seleccionados de las Tablas 4 o 6, en donde los genes no se mencionan en la Tabla 2, y por lo tanto tomar una decisión con respecto al individuo.

43. El método de la reivindicación 42, en donde el uno o más genes seleccionados de las Tablas 4 o 6 son también mencionados en la Tabla 8.

44. El método de la reivindicación 42 o 43, en donde la decisión es grabada.

45. El método de la reivindicación 44, en donde la decisión es grabada en un medio legible por computadora.

46. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 42-45, en donde el método incluye adicionalmente seleccionar un tratamiento contra la leucemia con base en la asignación.

47. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 42-46, en donde el método incluye adicionalmente administrar un tratamiento contra la leucemia tratamiento con base en la asignación.

48. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 42-47, en donde el método comprende adicionalmente emitir, transmitir o recibir una prescripción para un tratamiento contra la leucemia con base en la asignación.

49. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 42-48, en donde el método comprende adicionalmente autorizar, pagar por, o causar una transferencia de fondos para pagar por un tratamiento contra leucemia con base en la asignación.