KR20210038585A

KR20210038585A - 알츠하이머병에 대한 작은 rna 예측인자

Info

Publication number: KR20210038585A
Application number: KR1020217005177A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 더블유. 살츠만; 알랜 피. 살츠만; 닐 씨. 포스터; 나단 에스. 레이
Original assignee: 에스알엔에이리틱스, 인크.
Priority date: 2018-07-25
Filing date: 2019-07-25
Publication date: 2021-04-07
Also published as: AU2019310113A1; US20210292840A1; WO2020023789A3; EP3827099A2; CN112585281A; JP2021531043A; IL280326A; EP3827099A4; CA3107321A1; WO2020023789A2

Abstract

본 개시내용은 AD에 대한 치료 또는 AD에 대한 후보 치료를 받는 환자뿐만 아니라 동물 및 세포 모델을 포함하는 환자 또는 모델에서, 알츠하이머병(AD) 활성을 평가하기 위한 방법 및 키트를 제공한다. 구체적으로, 본 개시내용은 질병 활성의 이원 예측인자이고 AD 질병 단계, 등급 및 진행, 및 치료법 또는 후보 치료법에 대한 예후 및 반응을 검출하고/하거나 평가하는 데 유용한 바이오마커(sRNA 예측인자)를 제공한다. 바이오마커는 또한, 질병의 치료에 유용한 후보 약물 개입(또는 다른 치료법)을 식별하기 위해 약물 발견 및 임상 시험의 맥락에서 유용하다.

Description

알츠하이머병에 대한 작은 RNA 예측인자

우선권

본 출원은 2018년 7월 25일에 출원된 미국 가출원 제62/703,172호의 혜택을 청구하고, 이러한 문헌을 우선권으로 주장하며, 이러한 문헌의 내용은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.

알츠하이머병(AD)은 모든 치매 사례의 거의 70%를 차지하고 80세 이상의 개인의 최대 20%까지 영향을 미치기 때문에, 가장 흔한 신경퇴행성 질병이다. 뇌의 다양한 형태학적 및 조직학적 변화는 현대 AD 신경병리학의 특징으로 역할을 한다. 구체적으로, 2가지 신경학적 현상, 즉, 아밀로이드 플라크 및 신경섬유 매듭(neurofibrillary tangle)이 관찰되었다. 질병 진행은 브라크 단계(Braak stage)로서 분류될 수 있으며, 매듭을 지닌 신경의 위치 및 뇌의 변화 중증도와 관련하여 하기 6가지 질병 진행 단계로 구별되었다: 브라크 단계 I/II: 비강내 통과(측두엽) 단계, 임상적으로 무증상 사례; 브라크 단계 III/IV: 번역 단계, 초기 알츠하이머병; 및 브라크 단계 V/VI: 신피질 단계, 완전 발달 알츠하이머병.

알츠하이머병 환자는 최근 사건을 기억하고 또한 새로운 기억을 형성하는 것과 같은 기억과 관련된 어려움과 같은 초기 증상을 나타내기 시작한다. 시공간 및 언어 문제는 종종 기억을 수반하는 초기 증상의 개시를 따르거나 동반한다. 질병이 진행됨에 따라, 개인은 일상 생활의 활동을 수행하는 능력을 서서히 상실하고, 결국, 주의력, 언어 능력, 문제 해결, 추론, 및 모든 형태의 기억력이 심각하게 손상된다. 실제로, AD의 진행은 종종 무관심, 분노, 의존성, 공격성, 편집증 및 때때로 부적절한 성적 행동의 증가와 같은 성격의 변화를 동반한다. AD의 후기 단계에서, 개인은 의사 소통을 할 수 있고, 완전한 혼란의 징후를 나타내고, 침대에 누워있을 수 있다.

2가지 타입, 즉, 조기 발병 및 후기 발병, 알츠하이머병가 존재하며, 두 타입 모두는 유전적 요소를 갖는다. 조기 발병 AD 환자는 30대 내지 60대 중반에 증상을 나타내기 시작하고, 매우 드물지만, 후기 발병 AD는 가장 일반적인 타입으로서, 60대 중반의 환자에서 징후 및 증상을 나타내는 환자에서 보여진다. 후기 발병 AD는 19번 염색체 상에 유전적 위험 인자, 한 형태의 아포리포단백질 E(APOE), APOE ε4를 수반하는 것으로서 사람의 위험을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

현재, AD에 대한 치료법은 존재하지 않으며, 이용 가능한 치료는 대개, 고작 증상 악화의 일시적 둔화를 제공하고 있다. 또한, 알츠하이머병는 부검에서 뇌 조직과 병리를 검사함으로써 사망 후에만 절대적으로 진단될 수 있다.

이에 따라, 질병-개량 치료법의 식별은 약학적 개입 및 약물 발견에 대한 주요 목적이다. 그러나, 이러한 노력은 약물 발견 및 개발에 도움이되는 임상적으로 의미가 있는 바이오마커가 존재하지 않는다는 사실로 인해 방해받고 있다. 이러한 바이오마커는 접근 가능하고/하거나, 예후적이고/이거나 질병-특이적이어야 한다. 약학적 개입을 포함하는 치료적 개입의 발견 및 조사는 기저 질병 과정과 상호 연관된 바이오마커의 가용성으로부터 혜택을 받을 것이다.

알츠하이머병 활성을 평가하기 위한 진단 시험은 예를 들어, 영향을 받은 개인에서 이루어지는 치료 및 의사결정을 도울 뿐만 아니라 환자 등록, 계층화, 및 질병 모니터링을 위한 것을 포함하여, 약물 발견 및 임상 시험에서 바이오마커로서 사용하기 위해 필요하다.

본 개시내용은 AD에 대한 치료 또는 AD에 대한 후보 치료를 받는 중인 환자뿐만 아니라 동물 및 세포 모델을 포함하는 환자 또는 모델에서 알츠하이머병(AD) 활성을 평가하기 위한 방법 및 키트를 제공한다. 구체적으로, 본 개시내용은 질병 활성의 이원 예측인자이고 AD 질병 단계, 등급, 진행, 치료법 또는 후보 치료법에 대한 예후, 및 반응을 검출하고/하거나 평가하는 데 유용한 바이오마커(sRNA 예측인자)를 제공한다. 바이오마커는 또한, 약물 발견 및 임상 시험의 맥락에서, 질병의 치료 또는 관리(예를 들어, 치료 또는 진행 모니터링)를 위해 유용한 후보 약학적 개입(또는 다른 치료법)을 식별하는 데 유용하다.

다양한 양태 및 실시형태에서, 본 발명은 세포에서 또는 대상체 또는 환자로부터의 생물학적 샘플에서, 알츠하이머병 또는 알츠하이머병 활성의 이원의 작은 RNA(sRNA) 예측인자를 검출하는 것을 포함한다. sRNA 서열은 비교자 코호트의 임의의 샘플에 존재하지 않지만, AD 실험 코호트의 샘플에 존재하는 것으로 식별된다("양성 sRNA 예측인자"). 이에 의해, 본 발명은 이원 예측인자인 sRNA를 검출하여, 알츠하이머병에 대해 100% 특이성을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 대상체 또는 환자에서 AD 활성을 평가하는 방법을 제공한다. 본 방법은 AD의 증상 및 징후를 나타내는 대상체 또는 환자로부터 생물학적 샘플을 제공하고, 샘플에서 하나 이상의 sRNA 예측인자의 존재, 부재, 또는 수준을 결정하는 것을 포함한다. sRNA 예측인자의 존재 또는 수준은 질병 활성과 상관 관계가 있다.

양성 sRNA 예측인자는 표 2A, 표 4A, 및 표 7A(서열번호 1 내지 403)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함한다. 예를 들어, 양성 sRNA 예측인자는 표 2A(서열번호 1 내지 46)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함할 수 있으며, 이는 AD 환자의 뇌 조직 샘플의 sRNA 서열 데이터에서 식별되었지만, 비-질병 대조군, 및 다양한 다른 비-알츠하이머병의 신경퇴행성 질병 대조군(예를 들어, 파킨슨병)에는 존재하지 않았다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 예측인자의 상대적 또는 절대적 양은 질병 단계 또는 중증도와 상관 관계가 있다. 일부 실시형태에서, 양성 sRNA 예측인자는 표 4A(서열번호 47 내지 254)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함하는데, 이는 AD 환자의 뇌척수액(CSF) 샘플의 sRNA 서열 데이터에서 식별되었지만, 건강한 대조군, 및 다양한 다른 비-알츠하이머병의 신경퇴행성 질병 대조군(예를 들어, 파킨슨병)에는 존재하지 않았다. 일부 실시형태에서, 양성 sRNA 예측인자는 표 4A(서열번호 255 내지 403)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함하는데, 이는 AD 환자의 혈청 샘플의 sRNA 서열 데이터에서 식별되었지만, 건강한 대조군, 및 다양한 다른 비-알츠하이머병의 신경퇴행성 질병 대조군(예를 들어, 파킨슨병)에는 존재하지 않았다.

일부 실시형태에서, 샘플에 존재하는 예측인자의 수, 또는 예측인자 중 하나 이상의 누적(accumulation)은 AD의 진행 또는 질병 또는 활성 증상의 기저 중증도와 직접적으로 상관 관계가 있다. 일부 실시형태에서, 양성 sRNA 예측인자는 표 5(서열번호 58, 189, 78, 172, 193, 97, 122, 215, 248, 164, 120, 93, 126, 253, 112, 144, 213, 244, 123, 222, 150, 240, 52, 220, 221, 169, 165, 및 212)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함하며, 이는 (예를 들어, CSF 샘플에서) AD 진행의 브라크 단계와 상관 관계가 있다. 일부 실시형태에서, 양성 sRNA 예측인자는 표 8(서열번호 257, 270, 272, 273, 279, 286, 288, 314, 319, 325, 332, 341, 374, 391, 및 393)로부터 하나 이상을 포함하며, 이는 (예를 들어, 혈청 샘플에서) AD 진행의 브라크 단계와 상관 관계가 있다.

일부 실시형태에서, 표 2A, 표 4A 및/또는 표 7A 중 하나 이상으로부터 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 sRNA, 또는 적어도 10개의 sRNA, 또는 적어도 40개의 sRNA의 존재, 부재, 또는 수준이 결정된다(서열번호 1 내지 403). 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 음성 sRNA 예측인자의 존재 또는 부재가 또한 결정되며, 이는 건강한 대조군과 같은 비-AD 샘플에서 고유하게 식별된다. 일부 실시형태에서, 표 2A, 표 4A 및/또는 표 7A로부터의 양성 예측인자를 포함하는 sRNA의 패널은 샘플에 대해 시험된다. 일부 실시형태에서, 패널은 표 2A, 표 4A 및/또는 표 7A로부터의 적어도 2, 또는 적어도 5, 또는 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 25개의 sRNA를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 패널은 표 2A, 표 4A 및/또는 표 7A로부터의 모든 sRNA를 포함한다. 예를 들어, 샘플은 표 2A, 표 4A 및/또는 표 7A에서 적어도 약 2, 3, 4 또는 5개의 sRNA 예측인자에 대해 양성일 수 있는데, 이는 활성 질병을 지시하며, 더욱 중증 또는 발달된 질병은 약 10, 15 또는 약 20개의 sRNA 예측인자와 상관 관계가 있다. 일부 실시형태에서, 표 2A, 표 4A 및/또는 표 7A에서 sRNA 예측인자의 상대적 또는 절대적 양은 질병 등급 또는 중증도(예를 들어, 브라크 단계)와 직접적으로 상관 관계가 있다.

일반적으로, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 양성 예측인자의 존재는 AD 활성을 예측한다. 일부 실시형태에서, 5 내지 약 100, 또는 약 5 내지 약 60개의 sRNA 예측인자의 패널은 샘플에 대해 시험된다. 각 실험 샘플이 각 양성 예측인자에 대해 양성인 것은 아니지만, 패널은 트레이닝 코호트(training cohort)(예를 들어, 실험 코호트)에 대해 100% 감수성을 제공하기에 충분히 크다. 즉, 실험 코호트에서 각 샘플은 하나 이상의 양성 sRNA 예측인자의 존재를 갖는다. 패널에서 sRNA 예측인자의 존재 또는 부재는 (정의상) 트레이닝 세트(즉, 실험 코호트)에 대해 100% 특이성 및 100% 감수성을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, sRNA 예측인자는 비-부트스트랩(non-bootstrapped) 및/또는 부트스트랩(bootstrapped) 분류 알고리즘을 포함하는, 계산 분류자 알고리즘에서 이용된다. 예는 지도, 비지도, 반-지도 기계 학습 모델, 예를 들어, 파라미터/비-파라미터 거리 척도, 로지스틱 회귀, 서포트 벡터 머신, 결정 트리, 랜덤 포레스트, 신경망, 프로빗 회귀, 피셔 선형 판별, 나이브 베이즈 분류자, 퍼셉트론, 이차 분류자, 커넬 추정, k-최근접 이웃, 학습 벡터 양자화, 및 주성분 분석을 포함한다. 이러한 분류 알고리즘은 sRNA 예측인자 이외의 다른 sRNA의 존재 및 부재에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 분류자는 하나 이상의 sRNA 예측인자를 선택적으로 포함할 수 있는(즉, 질병 상태에 대해 고유한 것으로서 sRNA 서열 데이터에서 식별됨), ('isomiR'로서 알려진 microRNA 아이소형을 포함하지만, 이로 제한되지 않는) 아이소형의 패널의 존재 또는 부재에 따라 달라질 수 있다.

sRNA는 고형 조직 및/또는 생물학적 유체를 포함하는, 임의의 생물학적 샘플에서 식별되거나 검출될 수 있다. sRNA는 동물(예를 들어, 척추동물 및 무척추동물), 또는 일부 실시형태에서, 배양된 세포 또는 배양된 세포의 배지에서 식별되거나 검출될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 인간 또는 동물 대상체(예를 들어, 포유류 대상체)로부터의 생물학적 유체 샘플, 예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액 또는 뇌척수액일 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 뇌 조직과 같은 고형 조직이다.

다양한 실시형태에서, sRNA의 검출은 다양한 검출 플랫폼 중 하나를 포함하며, 이는 정량적 또는 정성적 PCR, 또는 실시간 PCR을 포함하는, 프로브의 역전사, 증폭, 및/또는 혼성화를 이용할 수 있다. PCR 검출 포맷은 일부 실시형태에서 RT-PCR을 위한, 및 선택적으로 형광-표지 프로브와 관련된 스템-루프 프라이머를 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, sRNA는 혼성화 검정 또는 RNA 시퀀싱(예를 들어, NextGen 시퀀싱)에 의해 검출된다. 일부 실시형태에서, RNA 시퀀싱은 패널에서 sRNA 예측인자 또는 다른 sRNA를 증폭시키는 특정 프라이머와 관련하여 이용된다.

본 발명은 AD의 증상 및 징후를 나타내는 세포 또는 동물(또는 이로부터 유래된 샘플)에서 sRNA(예를 들어, isomiR)의 검출을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 한 형태의 아포리포단백질 E(APOE), APOE ε4를 함유하는 세포 또는 동물(또는 이로부터 유래된 샘플)에서 sRNA 예측인자의 검출을 포함한다. 다양한 실시형태에서, sRNA 예측인자의 수 및/또는 식별, 또는 이의 상대적 양은 APOE ε4 대립 유전자를 갖는 환자, 대상체, 또는 세포에 대한 질병 활성과 상관 관계가 있다. 일부 실시형태에서, sRNA 예측인자는 달리 무증상으로 간주되는 환자 또는 대상체에서 AD 생물학적 과정을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 2 내지 약 100개의 sRNA 예측인자 검정, 또는 약 5 내지 약 75개의 sRNA 예측인자 검정, 또는 5 내지 약 20개의 sRNA 예측인자 검정의 패널을 포함하는 키트를 제공한다. 이러한 실시형태에서, 키트는 표 2A, 표 4A 및/또는 표 7A로부터의 sRNA 예측인자의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 sRNA 예측인자 검정(예를 들어, 이러한 검정을 위한 시약)을 포함할 수 있다. 이러한 검정은 역전사(RT) 프라이머, 증폭 프라이머, 및 다른 비-예측 서열에 비해 sRNA 예측인자에 대해 특이적인 프로브(예를 들어, 형광 프로브 또는 이중 표지 프로브)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 혼성화에 의한 sRNA 예측인자의 검출을 위한 프로브를 함유한 어레이 또는 다른 기질의 형태를 갖는다.

일부 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병 활성에 대해 샘플을 평가하기 위한 키트를 제공한다. 다양한 실시형태에서, 키트는 표 2A, 표 4A 및/또는 표 7A(서열번호 1 내지 403)에 나열된 복수의 sRNA를 검출하도록 구성된 sRNA-특이적 프로브 및/또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 표 2A, 표 4A 및/또는 표 7A(서열번호 1 내지 403)에 나열된 적어도 5, 또는 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 40개의 sRNA를 검출하도록 구성된 sRNA-특이적 프로브 및/또는 프라이머를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 특정 sRNA 분자(예를 들어, isomiR 또는 다른 타입의 sRNA)의 존재 또는 부재를 기초로 하여 질병 분류자를 구성하는 것을 포함한다. 이러한 질병 분류자는 유사한 증상과 함께 존재하는 질병 상태를 구별하고 질병의 과정을 예측하고 치료에 대한 반응을 예측하고 질병 모이터링을 포함하는, 질병 서브타입을 결정하기 위한 강력한 도구이다. 일반적으로, sRNA 패널(예를 들어, 별개의 sRNA 변이체의 패널)은 고려되는 하나 이상의 질병 상태를 나타내는 하나 이상의 트레이닝 세트에서의 서열 데이터로부터 결정될 것이다. sRNA 패널 및 분류자 알고리즘은 예를 들어, 지도, 비지도, 반-지도 기계 학습 모델, 예를 들어, 파라미터/비-파라미터 거리 척도, 로지스틱 회귀, 서포트 벡터 머신, 결정 트리, 랜덤 포레스트, 신경망, 프로빗 회귀, 피셔 선형 판별, 나이브 베이즈 분류자, 퍼셉트론, 이차 분류자, 커넬 추정, k-최근접 이웃, 학습 벡터 양자화, 및 주성분 분석을 이용하여 구성될 수 있다. 분류자가 트레이닝된 직후에, 독립 대상체는 대상체로부터의 생물학적 샘플에서, 패널에 sRNA 마커의 존재 또는 부재를 검출하고, 분류 알고리즘을 적용함으로써 질병 상태에 대해 평가될 수 있다. 분류자는 이원 분류자(즉, 2가지 상태로 분류시킴)일 수 있거나, 3, 4, 5가지 또는 그 이상의 질병 상태로 분류할 수 있다. 분류자는 sRNA의 정상 수준 및 비정상 수준을 구별하기보다는 패널에서 sRNA의 존재 및 부재에 따라 달라진다.

예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 질병 상태에 대해 대상체를 평가하는 방법을 제공한다. 본 방법은 대상체의 생물학적 샘플을 제공하고, sRNA 패널에서의 복수의 sRNA의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 포함한다. sRNA의 "존재 및 부재"의 이러한 프로파일(이원 마커)은 질병 분류자를 이용하여 2가지 이상의 질병 상태로 대상체의 상태를 분류하기 위해 사용된다. 질병 분류자는 트레이닝 샘플 세트에서 sRNA 패널에 있는 sRNA의 존재 및 부재를 기초로 하여 트레이닝될 것이다. 예를 들어, 트레이닝 샘플은 하나 이상의 질병 상태에 대해 양성 또는 음성(그리고, 이는 질병 서브타입, 등급, 또는 치료 요법에 대해 주석이 달릴 수 있음)뿐만 아니라 패널에 sRNA의 존재 또는 부재(및 일부 실시형태에서, 수준)로서 주석이 달린다.

패널에 sRNA의 존재 또는 부재는 sRNA 서열 데이터로부터의 트레이닝 세트에서 결정된다. 즉, 개개 sRNA 서열은 참조 서열 또는 유전자좌에 sRNA 서열 변이체를 통합하지 않고 3' 시퀀싱 어댑터를 트리밍함으로써 sRNA 서열 데이터에서 식별된다. 예를 들어, 트리밍 후에, 각 질병 상태 또는 비교자 상태 내에서 고유한 서열 리드가 컴파일링된다(즉, 각 고유 서열에 대한 리드 카운트가 준비됨). 이에 따라, isomiR과 같은 특정 sRNA 서열의 존재 또는 부재는 각 질병 상태에서 결정되며, 이러한 변이체는 참조 서열에 통합되지 않는다. 이러한 서열은 "이원" 마커로서 사용될 수 있고, 즉, 정상 수준 및 비정상 수준을 구별하는 것과는 상반되게, 샘플에서 이의 존재 또는 부재를 기초로 하여 평가될 수 있다.

서열 데이터에서 식별되고 계산 분류자에서 포함되도록 선택된 직후에, 패널에서 sRNA에 대한 분자 검출 시약이 제조될 수 있다. 이러한 검출 플랫폼은 스템 루프 프라이머 및 형광 프로브를 이용하는 것을 포함하는, 정량적 RT-PCR 검정을 포함한다.

본 발명의 다른 양태 및 실시형태는 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.

도 1A 내지 도 1D는 다양한 IBD 부류 및 대조군에 대한 ROC/AUC 곡선을 도시한 것이다: 대조군(1A), 크론병(1B), 궤양성 대장염(1C), 및 게실병(1D).
도 2는 실제 참조 ID에 대한 정확한 다중-부류 질병 예측의 비율을 나타낸 히트 맵(heat map)을 도시한 것이다.
표의 설명
표 1A 내지 표 1B는 알츠하이머병(AD) 코호트를 포함하는 뇌 조직 샘플 코호트(표 1A), 및 건강한 대조군 및 다양한 다른 비-알츠하이머병의 신경 장애 대조군을 포함하는 대조군 코호트(표 1B)를 특징으로 한다.
표 2A는 리드 카운트(read count), 특이성, 및 감수성(예를 들어, 빈도)을 갖는 AD에 대한 뇌 조직 샘플에서의 sRNA 양성 예측인자(서열번호 1 내지 46)를 도시한 것이다. 표 2B는 샘플 당 바이오마커의 수 및 퍼센트 커버리지(percent coverage)를 갖는, 뇌 조직 샘플에서 AD에 대한 양성 예측인자를 나타낸 것이다.
표 3A 내지 표 3B는 알츠하이머병(AD) 코호트를 포함하는 뇌척수액(CSF) 샘플 코호트(표 3A), 및 건강한 대조군 및 다양한 다른 비-알츠하이머병의 신경 장애 대조군을 포함하는 대조군 코호트(표 3B)를 특징으로 한다.
표 4A는 리드 카운트, 특이성, 및 감수성(예를 들어, 빈도)을 갖는 AD에 대한 CSF에서의 sRNA 양성 예측인자(서열번호 47 내지 254)를 나타낸 것이다. 표 4B는 샘플 당 바이오마커의 수 및 퍼센트 커버리지를 갖는, CSF 샘플에서 AD에 대한 양성 예측인자를 나타낸 것이다.
표 5는 AD의 모니터링에서 사용될 수 있는 브라크 단계에 대한 상관 관계를 나타낸 CSF로부터의 28개의 식별된 sRNA 바이오마커의 패널을 나타낸 것이다.
표 6A 내지 표 6B는 알츠하이머병(AD) 코호트를 포함하는 혈청 샘플 코호트(표 6A), 및 건강한 대조군 및 다양한 다른 비-알츠하이머병의 신경 장애 대조군을 포함하는 대조군 코호트(표 6B)를 특징으로 한다.
표 7A는 리드 카운트, 특이성, 및 감수성(예를 들어, 빈도)을 갖는 AD에 대한 혈청에서의 sRNA 양성 예측인자(서열번호 255 내지 403)를 나타낸 것이다. 표 7B는 샘플 당 바이오마커의 수 및 퍼센트 커버리지를 갖는, 혈청 샘플에서 AD에 대한 양성 예측인자를 나타낸 것이다.
표 8은 AD의 모니터링에서 사용될 수 있는 브라크 단계에 대한 상관 관계를 나타낸 혈청으로부터의 15개의 식별된 sRNA 바이오마커의 패널을 나타낸 것이다.
표 9는 염증성 장 질환의 대조군("정상" 개체)에 대한 결장 상피 조직으로부터의 sRNA 바이오마커의 패널을 도시한 것이다.
표 10은 크론병에 대한 결장 상피 조직으로부터의 sRNA 바이오마커의 패널을 나타낸 것이다.
표 11은 궤양성 대장염에 대한 결장 상피 조직으로부터의 sRNA 바이오마커의 패널을 나타낸 것이다.
표 12는 게실병에 대한 결장 상피 조직으로부터의 sRNA 바이오마커의 패널을 나타낸 것이다.

본 개시내용은 AD에 대한 치료 또는 AD에 대한 후보 치료를 받는 중인 환자뿐만 아니라 동물 및 세포 모델을 포함하는 환자 또는 모델에서 알츠하이머병(AD) 활성을 평가하기 위한 방법 및 키트를 제공한다. 구체적으로, 본 개시내용은 질병 활성의 이원 예측인자이고 기저 질병 과정, 질병 등급, 진행, 및 치료법 또는 후보 치료법에 대한 반응을 검출하고/하거나 평가하는 데 유용한 바이오마커(sRNA 예측인자)를 제공한다. 바이오마커는 또한, AD 또는 AD 증상의 치료를 위해 유용한 후보 치료법을 식별할 뿐만 아니라 환자를 선택하거나 계층화하고 질병 진행 또는 치료를 모니터링하기 위해 약물 발견 및 임상 시험의 맥락에서 유용하다.

다양한 양태 및 실시형태에서, 본 발명은 세포 또는 생물학적 샘플에서, 알츠하이머병 또는 알츠하이머병 활성의 이원의 작은 RNA(sRNA) 예측인자를 검출하는 것을 포함한다. sRNA 서열은 비교자 코호트에서 임의의 샘플에 존재하지 않는 반면, AD 실험 코호트의 샘플에 존재하는 것으로서 식별된다. 이러한 sRNA 마커는 "양성 sRNA 예측인자"로 명명되고, 정의상 100% 특이성을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 또한 비교자 코호트의 하나 이상의 샘플에 존재하고 실험 코호트의 임의의 샘플에 존재하지 않는 하나 이상의 sRNA 서열을 검출하는 것을 포함한다. 이러한 예측인자는 "음성 sRNA 예측인자"로 명명되고, 예측에 대한 추가 신뢰 수준을 제공한다. 이상조절된 sRNA(예를 들어, 상향 또는 하향조절된 miRNA)를 검출하는 것과는 대조적으로, 본 발명은 알츠하이머병 활성에 대한 이원 예측인자인 sRNA를 제공한다.

작은 RNA 종("sRNA")은 길이가 200개 미만의 뉴클레오타이드인 비-코딩 RNA이고, microRNA(miRNA)(아이소-miR을 포함함), Piwi-상호작용 RNA(piRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), vault RNA(vtRNA), 작은 핵소체 RNA(snoRNA), 전달 RNA-유래 작은 RNA(tsRNA), 리보솜 RNA-유래 작은 RNA 단편(rsRNA), 작은 rRNA-유래 RNA(srRNA), 및 작은 핵 RNA(U-RNA)뿐만 아니라 신규한 비특성화 RNA 종을 포함한다. 일반적으로, "아이소-miR"은 참조 miRNA 서열(예를 들어, miRBase에 의해 사용된 바와 같음)에 대한 변이를 갖는 그러한 서열을 지칭한다. miRBase에서, 각 miRNA는 miRNA 전구체와 및 하나 또는 두 개의 성숙 miRNA(-5p 및 -3p)와 결합된다. 심층 시퀀싱은 miRNA 생물발생에서 다량의 가변성을 검출하였으며, 이는 동일한 miRNA 전구체로부터 다수의 상이한 서열이 생성될 수 있음을 의미한다. 아이소-miR의 4가지 주요 변이가 존재한다: (1) 5' 트리밍, 여기서, 5' 절단 부위는 참조된 miRNA 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 있음; (2) 3' 트리밍, 여기서, 3' 절단 부위는 참조 miRNA 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 있음; (3) 3' 뉴클레오타이드 추가, 여기서, 뉴클레오타이드는 참조 miRNA의 3' 단부에 첨가됨; 및 (4) 뉴클레오타이드 치환, 여기서, 뉴클레오타이드는 miRNA 전구체로부터 변경됨.

U.S. 2018/0258486호(2018년 1월 23일 출원됨), 및 PCT/US2018/014856호(2018년 1월 23일에 출원됨)(이러한 문헌의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함됨)에는 sRNA 예측인자를 식별하는 공정이 개시되어 있다. 이러한 공정은 RNA 시퀀싱 데이터로부터 3' 어댑터의 계산 트리밍하고 고유 서열 리드에 따라 데이터를 정렬하는 것을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 알츠하이머병(AD) 활성을 평가하는 방법을 제공한다. 본 방법은 AD의 증상 및 징후를 나타내는 대상체 또는 환자로부터 세포 또는 생물학적 샘플을 제공하거나 이로부터 추출된 RNA를 제공하고, 세포 또는 샘플에서 하나 이상의 sRNA 예측인자의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 포함한다. 하나 이상의 sRNA 예측인자의 존재는 알츠하이머병 활성을 지시한다.

용어 "알츠하이머병 활성"은 AD 증상, 및 인지, 행동, 및/또는 운동 기술 및 조정의 전반적인 감소를 (직접적으로 또는 간접적으로) 야기시키는 활성 질병 과정을 지칭한다. 용어 또한 알츠하이머병 활성은 영향을 받은 세포의 상대적 건강을 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, AD 활성은 뉴런 생존력을 나타낸다.

양성 sRNA 예측인자는 표 2A, 4A, 또는 7A(서열번호 1 내지 403)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함한다. 본 명세서에 개시된 서열은 역전사된 DNA 서열로서 나타낸다. 예를 들어, 양성 sRNA 예측인자는 표 2A(서열번호 1 내지 46)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함할 수 있으며, 이는 뇌 조직 샘플의 서열 데이터에서 식별되는 바와 같이, AD 및/또는 AD 단계를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 양성 sRNA 예측인자는 표 4A(서열번호 47 내지 154)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함하며, 이는 CSF 샘플의 서열 데이터에서 식별된 바와 같이 AD 및/또는 AD 단계를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 양성 sRNA 예측인자는 표 7A(서열번호 155 내지 403)로부터의 하나 이상을 포함하며, 이는 혈청 샘플의 서열 데이터에서 식별된 바와 같이 AD 및/또는 AD 단계를 나타낸다.

상세하게는, 표 2A 및 2B는 뇌 조직 샘플에서 식별된 바와 같이, AD에 대한 sRNA 양성 예측인자를 나타낸 것이다. 이러한 sRNA 예측인자는 (실험 그룹으로서) AD 뇌 조직 샘플의 코호트에 존재하였지만, 임의의 비교자 그룹 샘플에 존재하지 않았으며, 이는 비-질병 샘플뿐만 아니라 다양한 다른 비-알츠하이머병의 신경 질환 샘플을 포함하였다. 표 2A는 브라크 단계와는 무관하게 AD에 대한 양성 예측인자를 나타낸 것이다. 양성 예측인자 각각은 코호트에서 AD의 존재에 대해 100% 특이성을 제공한다. 표 2A 및 2B는 양성 예측인자에 대한 AD 뇌 조직 샘플의 평균 리드 카운트를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 샘플에 존재하는 예측인자의 수는 AD의 브라크 단계와 직접적으로 상관 관계가 있다.

표 4A 및 4B는 뇌척수액(CSF) 샘플에서 식별된 바와 같이 AD에 대한 sRNA 양성 예측인자를 나타낸 것이다. 이러한 sRNA 예측인자는 (실험 그룹으로서) AD CSF 샘플의 코호트에 존재하였지만, 임의의 비교자 그룹 샘플에 존재하지 않았으며, 이는 건강한 샘플뿐만 아니라 다양한 다른 비-알츠하이머병의 신경 질환 샘플을 포함하였다. 표 4A는 브라크와는 무관하게 AD에 대한 양성 예측인자를 나타낸 것이다. 양성 예측인자 각각은 코호트에서 AD의 존재에 대해 100% 특이성을 제공한다. 표 4A 및 4B는 양성 예측인자에 대한 AD CSF 샘플의 평균 리드 카운트를 나타낸 것이다. 일부 실시형태에서, 샘플에 존재하는 예측인자의 수는 AD의 브라크 단계와 직접적으로 상관 관계가 있다.

표 7A 및 7B는 혈청 샘플에서 식별된 바와 같이, AD에 대한 sRNA 양성 예측인자를 나타낸 것이다. 이러한 sRNA 예측인자는 (실험 그룹으로서) AD 혈청 샘플의 코호트에 존재하였지만, 임의의 비교자 그룹 샘플에 존재하지 않았으며, 이는 건강한 샘플뿐만 아니라 다양한 다른 비-알츠하이머병의 신경 질환 샘플을 포함하였다. 표 7A는 브라크와는 무관하게 AD에 대한 양성 예측인자를 나타낸 것이다. 양성 예측인자 각각은 코호트에서 AD의 존재에 대해 100% 특이성을 제공한다. 표 7A 및 7B는 양성 예측인자에 대한 AD 혈청 샘플의 평균 리드 카운트를 나타낸 것이다. 일부 실시형태에서, 샘플에 존재하는 예측인자의 수는 AD의 브라크 단계와 직접적으로 상관 관계가 있다.

다양한 실시형태에서, 양성 및 음성 예측인자 및 다른 잠재적인 대조군을 포함하는 적어도 5개의 sRNA의 존재, 부재, 또는 수준이 결정된다. 일부 실시형태에서, 적어도 8개의 sRNA, 또는 적어도 10개의 sRNA, 또는 적어도 약 50개의 sRNA의 존재 또는 부재가 결정된다. 총 수의 sRNA가 결정되며, 일부 실시형태에서, 이는 약 1000 미만, 또는 약 500 미만, 또는, 약 200 미만, 또는, 약 100 미만, 또는 약 50 미만이다. 이에 따라, sRNA의 존재, 부재, 또는 수준은 임의의 수의 특정 분자 검출 검정을 이용하여 결정될 수 있다.

일부 실시형태에서, 표 2A, 표 4A 및/또는 표 7A로부터의 적어도 2, 또는 적어도 5, 또는 적어도 10개의 sRNA의 존재, 부재, 또는 수준이 결정된다(서열번호 1 내지 403). 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 음성 sRNA 예측인자의 존재, 부재, 또는 수준이 또한 결정된다. 일부 실시형태에서, 표 2A로부터의 양성 예측인자를 포함하는 sRNA의 패널이 결정되며, 패널은 표 2A로부터의 적어도 2, 적어도 5, 적어도 10, 또는 적어도 20개의 sRNA를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 패널은 표 2A로부터의 모든 sRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표 4A로부터의 양성 예측인자를 포함하는 sRNA의 패널이 결정되며, 패널은 표 4A로부터의 적어도 2, 적어도 5, 적어도 10, 또는 적어도 20개의 sRNA를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 패널은 표 4A로부터의 모든 sRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표 7A로부터의 양성 예측인자를 포함하는 sRNA의 패널이 결정되며, 패널은 표 7A로부터의 적어도 2, 적어도 5, 적어도 10, 또는 적어도 20개의 sRNA를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 패널은 표 7A로부터의 모든 sRNA를 포함한다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 (또는 모든) 양성 sRNA 예측인자는 각각 실험 코호트에서 AD 샘플의 적어도 약 10%, 또는 실험 코호트에서 AD 샘플의 적어도 약 20%, 또는 실험 코호트에서 AD 샘플의 적어도 약 30%, 또는 실험 코호트에서 AD 샘플의 적어도 약 40% 존재한다. 일부 실시형태에서, 예측인자의 식별 및/또는 식별된 예측인자의 수는 활성 질병 과정(예를 들어, 브라크 단계)과 상관 관계가 있다. 예를 들어, 샘플은 표 2A, 4A, 및/또는 7A에서 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 sRNA 예측인자에 대해 양성일 수 있는데, 이는 뇌 조직, CSF, 및/또는 혈청 샘플로부터의 질병을 지시하는 것이며, 더 중증 또는 발달된 질병 과정은 표 4A 또는 7A에서 약 10, 또는 적어도 약 15, 또는 적어도 약 20개의 sRNA 예측인자와 상관 관계가 있다. 일부 실시형태에서, 절대 수준(예를 들어, 시퀀싱 리드 카운트) 또는 상대적 수준(예를 들어, 실시간 PCR과 같은 정량적 검정을 이용함)은 표 4A 또는 표 7A에서 sRNA 예측인자에 대해 결정되며, 이는 브라크 단계와 상관 관계가 있을 수 있다.

일부 실시형태에서, 양성 sRNA 예측인자의 존재 대해 음성으로 시험된 샘플은 적어도 1, 또는 적어도 약 5, 또는 적어도 약 10, 또는 적어도 약 20, 또는 적어도 약 30, 또는 적어도 약 40, 또는 적어도 약 50, 또는 적어도 약 100개의 음성 sRNA 예측인자에 대해 양성으로 시험된다. 음성 예측인자는 건강한 개체 또는 다른 질병 상태(예를 들어, PD 또는 치매)에 대해 특이적일 수 있다. AD에 대해 양성으로 시험된 개체는 통상적으로, 임의의 음성 예측인자의 존재에 대해 양상으로 시험되지 않을 것이다.

일반적으로, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 양성 예측인자의 존재, 및 모든 음성 예측인자의 부재는 AD 활성을 예측한다. 일부 실시형태에서, 샘플에서 5 내지 약 100, 또는 약 5 내지 약 60개의 sRNA 예측인자의 패널이 검출된다. 각 실험 샘플이 각 양성 예측인자에 대해 양성이지는 않지만, 패널은 AD 코호트에서 상태에 대한 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 커버리지를 제공하기에 충분히 크다. 복수의 sRNA 예측인자가 실험 코호트의 각 샘플에 존재하는 패널을 선택함으로써, 패널은 트레이닝 샘플(실험 코호트 및 비교자 코호트)에 대해 100 감수성 및 100 특이성을 제공하도록 조정될 것이다.

다양한 실시형태에서, sRNA 예측인자의 검출은 정량적 또는 정성적 PCR, 또는 실시간 PCR을 포함하는, 프로브의 역전사, 증폭 및/또는 혼성화를 이용할 수 있는 다양한 검출 플랫폼 중 하나를 포함한다. PCR 검출 포맷은 일부 실시형태에서, 및 선택적으로, 형광-표지 프로브와 관련하여, RT-PCR을 위한 스템-루프 프라이머를 이용할 수 있다. 일부 실시형태에서, sRNA는 3' 시퀀싱 어댑터의 계산 트리밍과 함께, RNA 시퀀싱에 의해 검출된다. 시퀀싱은 이원 예측인자에 대해 최대 하나의 특이적 프라이머를 사용하여 역전사 및/또는 증폭을 이용할 수 있다.

일반적으로, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR)은 PCR 동안, 즉, 실시간으로 표적화된 DNA 분자의 증폭을 모니터링한다. 실시간 PCR은 정량적으로, 및 반-정량적으로 사용될 수 있다. 실시간 PCR에서 PCR생성물의 검출을 위한 2가지 통상적인 방법에는 (1) 임의의 이중 가닥 DNA가 인터칼레이션된 비-특이적 형광 염료(예를 들어, SYBR 그린(I 또는 II), 또는 에티듐 브로마이드), 및 (2) 상보성 서열을 갖는 프로브의 혼성화 후에만 검출이 가능한 형광 리프토로 표지된 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 서열-특이적 DNA 프로브(예를 들어, TAQMAN)가 있다.

일부 실시형태에서, 검정 포맷은 TAQMAN 실시간 PCR이다. TAQMAN 프로브는 정량적 PCR의 특이성을 증가시키도록 설계된 가수분해 프로브이다. TAQMAN 프로브 원리는 형광단-기반 검출과 함께, 상보적 표적 서열에 혼성화 동안 이중-표지된 프로브를 절단하기 위한 Taq 폴리머라제의 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성에 따른다. TAQMAN 프로브는 형광단 및 켄처로 이중 표지되며, 형광단이 Taq 엑소뉴클레아제 활성에 의해 올리고뉴클레오타이드 프로브로부터 절단될 때, 형광단 신호가 검출된다(예를 들어, 신호는 표지의 근접성으로 인해 더 이상 켄칭되지 않음). 다른 정량적 PCR 방법에서와 같이, 얻어진 형광 신호는 PCR의 지수 단계 동안 생성물의 축적의 정량적 측정을 가능하게 한다. TAQMAN 프로브 포맷은 검출의 높은 감수성 및 특이성을 제공한다.

일부 실시형태에서, 샘플에 존재하는 sRNA 예측인자는 sRNA의 한 단부 또는 양 단부의 정보를 얻기 위해 특정 프라이머, 예를 들어, 스템-루프 프라이머를 사용하여 cDNA로 변환된다. 이후에 cDNA의 증폭은 실시간으로, 예를 들어, 형광 리포팅 분자로부터의 신호를 검출함으로써 정량화될 수 있으며, 여기서, 신호 세기는 각 증폭 사이클에서 DNA의 수준과 상관 관계가 있다.

대안적으로, 패널에서 sRNA 예측인자, 또는 이의 앰플리콘은 혼성화에 의해 검출된다. 예시적인 플랫폼은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 및 마이크로어레이 기술을 포함한다. 검출 플랫폼은 일부 실시형태에서 편리한 샘플 처리 및 sRNA 검출을 위해 미세 유체를 사용할 수 있다.

일반적으로, 샘플에서 sRNA의 존재를 결정하는 임의의 방법이 이용될 수 있다. 이러한 방법은 또한, 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 플랩 엔도뉴클레아제-기반 검정뿐만 아니라, 분지된 DNA로의 직접 RNA 포집(QuantiGene™), Hybrid Capture™(Digene), 또는 nCounter™ miRNA 검출(나노스트링)을 포함한다. 검정 포맷은, miRNA 및 다른 sRNA의 존재를 결정하는 것 이외에, 또한, 특히, 고유 신호 세기 변화의 제어를 제공할 수 있다. 이러한 제어는 예를 들어, 백그라운드 신호 세기 및/또는 샘플 처리, 및/또는 혼성화 효율을 위한 제어뿐만 아니라 환자 샘플에서 sRNA를 검출하기 위한 다른 요망되는 제어(예를 들어, 총괄적으로 "정규화 제어(normalization control)"로 언급됨)를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 검정 포맷은 플랩 엔도뉴클레아제-기반 포맷, 예를 들어, Invader™ 검정(Third Wave Technologies)이다. 인베이더 방법(invader method)을 이용하는 경우에, 표적 부위에 영역 3'에 대해 특이적인 서열을 함유한 인베이더 프로브, 및 주형 및 관련되지 않은 플랩 서열의 표적 부위에 영역 5'에 대해 특이적인 서열을 함유한 1차 프로브가 제조된다. 클레아바제(cleavase)는 이후에 이러한 프로브, 표적 분자뿐만 아니라 형광 염료 및 켄처 둘 모두로 표지된 자동-상보적 서열 및 플랩 서열에 대해 상보적인 서열을 함유한 FRET 프로브의 존재 하에서 작용할 수 있다. 1차 프보르가 주형과 혼성화할 때, 인베이더 프로브의 3' 단부는 표적 부위로 침투하며, 이러한 구조는 클레아바제에 의해 절단되어 플랩이 해리된다. 플랩은 FRET 프로브에 결합하며, 형광 염료 부분은 클레아바제에 의해 절단되어 형광을 방출시킨다.

일부 실시형태에서, RNA는 검출을 위한 sRNA 처리 전에 샘플로부터 추출된다. RNA는 예를 들어, 문헌[RNA Methodologies, A laboratory guide for isolation and characterization, 2nd edition, 1998, Robert E. Farrell, Jr., Ed., Academic Press]에 기술된 바와 같은 다양한 표준 절차를 이용하여 정제될 수 있다. 또한, 다양한 공정뿐만 아니라, mirVANA™ Paris miRNA 단리 키트(Ambion), miRNeasy™ 키트(Qiagen), MagMAX™ 키트(Life Technologies), 및 Pure Link™ 키트(Life Technologies)를 포함하는 작은 분자량 RNA의 단리를 위해 상업적으로 입수 가능한 생성물이 존재한다. 예를 들어, 작은 분자량 RNA는 유기 추출에 의해 단리되고, 이후에 유리 섬유 필터 상에서 정제될 수 있다. miRNA를 단리하기 위한 대안적인 방법은 자성 비드에 대한 혼성화를 포함한다. 대안적으로, 검출을 위한 miRNA 처리(예를 들어, cDNA 합성)는 RNA 추출 단계 없이, 생체액 중에서 수행될 수 있다.

일부 실시형태에서, sRNA의 존재 또는 부재는 핵산 시퀀싱에 의해 대상체 샘플에서 결정되며, 개별 sRNA는 개개 sRNA 서열로부터 3' 시퀀싱 어댑터를 계산 트리밍하는 것을 포함하는 공정에 의해 식별된다[미국특허 제2018/0258486호(2018년 1월 23일에 출원됨), 및 PCT/US2018/014856호(2018년 1월 23일에 출원됨) 참조, 이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨]. 일부 실시형태에서, 시퀀싱 공정은 바이오마커에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 sRNA 예측인자를 역전사하고/하거나 증폭시킬 수 있다.

일반적으로, 검정은 각 검정이 주석이 달린 서열 및/또는 다른 비-예측 아이소-miR 및 sRNA에 비해 sRNA(예를 들어, 아이소-miR)에 대해 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98% 특이적이도록 구성될 수 있다. 주석이 달린 서열은 miRBase를 기준으로 결정될 수 있다. 예를 들어, sRNA 예측인자-특이적 실시간 PCR 검정 준비 중에, PCR 프라이머 및 형광 프로브가 제조될 수 있고, 이의 특이성 수준에 대해 시험될 수 있다. 바이사이클릭 뉴클레오타이드 또는 2' 위치(예를 들어, LNA, cET, 및 MOE)를 수반하는 다른 변형, 또는 다른 뉴클레오타이드 변형(염기 변형을 포함함)은 검출의 감수성 또는 특이성을 증가시키기 위해 프로브에서 이용될 수 있다. isomiR 및 sRNA의 특정 검출은 미국특허 제2018/0258486호에 개시되어 있으며, 이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.

sRNA 예측인자는 고형 조직 및/또는 생물학적 유체를 포함하는, 임의의 생물학적 샘플에서 식별될 수 있다. sRNA 예측인자는 동물(예를 들어, 척추동물 및 무척추동물 대상체), 또는 일부 실시형태에서, 배양된 세포 또는 배양된 세포로부터의 배지에서 식별될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 인간 또는 동물 대상체(예를 들어, 포유류 대상체)로부터의 생물학적 유체 샘플, 예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액 또는 뇌척수액이다. miRNA는 세포-대-세포 신호전달에서 중요한 역할을 할 수 있는 분비 메커니즘의 결과로서, 생물학적 유체에서 발견될 수 있다[Kosaka N, et al., Circulating microRNA in body fluid: a new potential bio마커 for cancer diagnosis and prognosis, Cancer Sci. 2010; 101: 2087-2092 참조]. 뇌척수액 및 혈청으로부터의 miR은 질병 상태 및 병인 특징에 대해 환자를 계층화하는 것을 목표로 하는 기존 방법에 따라 프로파일링되었다[Burgos K, et al., Profiles of Extracellular miRNA in Cerebrospinal Fluid and Serum from Patients with Alzheimer's and Parkinson's Diseases Correlate with Disease Status and Features of Pathology, PLOS ONE Vol. 9, Issue 5 (2014)]. 일부 실시형태에서, 샘플은 뉴런을 포함할 수 있는, 고형 조직 샘플이다. 일부 실시형태에서, 조직 샘플은 뇌 조직 샘플, 예를 들어, 전두 피질 영역으로부터의 뇌 조직 샘플이다. 일부 실시형태에서, sRNA 예측인자는 뇌 조직 및 혈액과 같은 생물학적 유체를 포함하는, 적어도 2가지 상이한 타입의 샘플에서 식별된다. 일부 실시형태에서, sRNA 예측인자는 뇌 조직, 뇌척수액(CSF), 및 혈액을 포함하는, 적어도 3가지 상이한 타입의 샘플에서 식별된다.

본 발명은 알츠하이머병 유전자형 또는 표현형을 나타내는 세포 또는 동물에서 sRNA 예측인자의 검출을 포함한다. 일부 실시형태에서, sRNA 예측인자는 달리 비-알츠하이머병 환자 또는 대상체로 간주되는 환자 또는 대상체에서 AD 생물학적 과정을 나타낸다. 일부 실시형태에서, sRNA 예측인자는 AD의 특정 브라크 단계를 나타낸다.

일부 실시형태에서, sRNA 예측인자는 알츠하이머병 과정의 브라크 단계 I 및/또는 II를 나타낸다. 브라크 단계 I/II는 AD 진행의 과정에 걸쳐 은친화성 신경섬유 매듭 및 신경망 실을 발달하는 뇌의 비강내 통과(측두엽) 영역을 지칭한다. 브라크 단계 I/II는 AD 과정에서 이러한 시점에 임상적으로 무증상인 것으로 알려져 있다.

일부 실시형태에서, sRNA 예측인자는 알츠하이머병 과정의 브라크 단계 III 및/또는 IV를 나타낸다. 브라크 단계 III/IV는 AD 진행의 과정에 걸쳐 은친화성 신경섬유 매듭 및 신경망 실을 발달하는 뇌의 번역 영역을 지칭한다. 브라크 단계 III/IV는 AD 과정에서 이러한 시점에 초기 알츠하이머병인 것으로 알려져 있다.

일부 실시형태에서, sRNA 예측인자는 알츠하이머병 과정의 브라크 단계 V 및/또는 VI를 나타낸다. 브라크 단계 V/VI는 AD 진행 과정에 걸쳐 은친화성 신경섬유 매듭 및 신경망 실을 발달하는 뇌의 신피질 영역을 지칭한다. 브라크 단계 V/VI는 AD 과정에서 이러한 시점에 완전히 발달된 알츠하이머병인 것으로 알려져 있다.

일부 실시형태에서, 본 방법은 시간에 따른 sRNA 예측인자 프로파일을 결정하기 위해, 예를 들어, 치료 요법 또는 후보 치료 요법의 영향을 결정하기 위해, 반복된다. 예를 들어, 대상체 또는 환자는 1년에 적어도 약 1회, 또는 6개월마다 적어도 약 1회, 또는 1개월에 적어도 1회, 또는 1주에 적어도 1회의 빈도로 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시간에 따라 존재하는 예측인자 수의 감소, 또는 시간에 따라 검출된 예측인자 수의 느린 증가는 느린 질병 진행 또는 더 경증의 질병 증상을 나타낸다. 본 발명의 실시형태는 AD 치료를 위한 동물 모델을 구성하기 위해 유용할 뿐만 아니라 인간 임상 시험에서 바이오마커로서 유용하다.

일부 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병 활성에 대해 샘플을 평가하기 위한 키트를 제공한다. 다양한 실시형태에서, 키트는 표 2A, 4A, 및/또는 7A(서열번호 1 내지 403)에 나열된 복수의 sRNA를 검출하도록 구성된 sRNA-특이적 프로브 및/또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 표 2A, 4A, 및/또는 7A(서열번호 1 내지 403)에 나열된 적어도 2, 적어도 5, 또는 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 40개의 sRNA를 검출하도록 구성된 sRNA-특이적 프로브 및/또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 표 2A(서열번호 1 내지 46)에 나열된 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 적어도 10, 또는 적어도 20개의 sRNA를 검출하도록 구성된 sRNA-특이적 프로브 및/또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 표 4A(서열번호 47 내지 254)에 나열된 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 40개의 sRNA를 검출하도록 구성된 sRNA-특이적 프로브 및/또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 표 7A(서열번호 255 내지 403)에 나열된 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 적어도 10, 또는 적어도 20개의 sRNA를 검출하도록 구성된 sRNA-특이적 프로브 및/또는 프라이머를 포함한다.

키트는 정량적 또는 정성적 PCR 검정을 위해, 즉, 특정 sRNA 예측인자에 대해 적합한 프로브 및/또는 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 선택적으로 켄처 모이어티(quencher moiety)를 포함할 수 있는 형광 염료 또는 형광-표지 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 스템-루프 RT 프라이머를 포함하고, 일부 실시형태에서, sRNA 말단 각각의 정보를 얻기 위해 스템-루프 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 sRNA-특이적 혼성화 프로브의 어레이를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 5 내지 약 100개의 sRNA 예측인자, 또는 약 5 내지 약 50개의 sRNA 예측인자, 또는 5 내지 약 20개의 sRNA의 패널을 검출하기 위한 시약을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 키트는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20개의 sRNA 예측인자 검정(예를 들어, 이러한 검정을 위한 시약)을 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 키트는 적어도 10개의 양성 예측인자 및 적어도 5개의 음성 예측인자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 적어도 5, 또는 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 40개의 sRNA 예측인자 검정의 패널을 포함하며, sRNA 예측인자는 표 2A, 표 4A 및/또는 표 7A로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1개의 sRNA 예측인자는 표 4B 또는 표 7B로부터 선택된다. 이러한 검정은 주석이 달린 서열 상의 sRNA 예측인자에 대해 특이적인 역전사(RT) 프라이머, 증폭 프라이머 및 프로브(예를 들어, 형광 프로브 또는 이중 표지된 프로브)뿐만 아니라 다른(비-예측) 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 혼성화에 의한 sRNA 예측인자의 검출을 위한 프로브를 함유한 어레이 또는 다른 기질의 형태를 갖는다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 특정 sRNA 분자의 존재 또는 부재를 기초로 하여 샘플을 분류하는 질병 분류자를 구성하는 것을 포함한다. 이러한 질병 분류자는 유사한 증상을 나타내는 질병 상태를 구별할 뿐만 아니라 질병의 과정을 예측하고, 치료에 대한 반응을 예측하고, 질병을 모니터링하는 것을 포함하는, 질병 서브타입을 결정하기 위한 강력한 도구이다. 일반적으로, sRNA 패널(예를 들어, 별도의 sRNA 변이체의 패널)은 고려되는 하나 이상의 질병 상태를 나타내는 하나 이상의 트레이닝 세트에서의 서열 데이터로부터 결정될 것이다. sRNA 패널 및 분류자 알고리즘은 예를 들어, 파라미터/비-파라미터 거리 척도, 로지스틱 회귀, 서포트 벡터 머신, 결정 트리, 랜덤 포레스트, 신경망, 프로빗 회귀, 피셔 선형 판별, 나이브 베이즈 분류자, 퍼셉트론, 이차 분류자, 커넬 추정, k-최근접 이웃, 학습 벡터 양자화, 및 주성분 분석과 같은, 지도, 비지도, 반-지도 기계 학습 모델 중 하나 이상을 이용하여 구성될 수 있다. 분류자가 트레이닝된 직후에, 독립 대상체는 대상체로부터의 생물학적 샘플에서, 패널에서의 sRNA 마커의 존재 또는 부재를 검출하고 분류 알고리즘을 적용함으로써, 질병 상태에 대해 평가될 수 있다. 분류자는 이원 분류자일 수 있거나(즉, 2개의 상태로 분류하거나), 3, 4, 5가지 이상의 질병 상태로 분류할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분류자는 적어도 10가지 질병 상태로 분류할 수 있다.

예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 질병 상태에 대해 대상체를 평가하는 방법을 제공한다. 본 방법은 대상체의 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 및 sRNA 패널에서의 복수의 sRNA의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다. 이러한 sRNA의 "존재 및 부재"의 프로파일(이원 마커)은 질병 분류자를 이용하여 대상체의 상태를 2가지 이상의 질병 상태로 분류하기 위해 사용된다. 질병 분류자는 트레이닝 샘플의 세트에서 sRNA 패널에서의 sRNA의 존재 및 부재를 기초로 하여 트레이닝될 것이다. 예를 들어, 트레이닝 샘플은 하나 이상의 질병 상태에 대해 양성 또는 음성으로서뿐만 아니라 패널에서의 sRNA의 존재 또는 부재(또는 수준)으로서 주석이 달린다. 일부 실시형태에서, 샘플은 질병 등급 또는 단계, 질병 서브타입, 치료 요법, 및 약물 감수성 또는 내성 중 하나 이상에 대해 주석이 달린다.

패널에서의 sRNA의 존재 또는 부재는 sRNA 서열 데이터로부터의 트레이닝 세트에서 결정된다. 즉, 개개 sRNA 서열은 참조 서열 또는 유전자좌에 sRNA 서열 변이체를 통합하지 않고, 5' 및/또는 3' 시퀀싱 어댑터를 트리밍함으로써 sRNA 서열 데이터에서 식별된다. 예를 들어, 트리밍 후에, 각 샘플 내의 고유한 서열 리드 및 질병 상태 또는 비교자 상태는 각각 컴파일링된다. 이에 따라, 특정 sRNA 서열, 예를 들어, 아이소형의 존재 또는 부재는 각 샘플에서 및 각 질병 상태에 대해 결정되며, 이러한 변이체는 참조 서열에 통합되지 않는다. 이러한 서열은 "이원" 마커로서 사용될 수 있고, 즉, 정상 수준 및 비정상 수준을 구별하는 것과는 상반되게, 샘플에서 이의 존재 또는 부재를 기초로 하여 평가될 수 있다.

일부 실시형태에서, 분류자의 구성 동안에, sRNA는 트레이닝을 위해 사전선택된다. 예를 들어, sRNA 패밀리가 식별될 수 있으며, 여기에서, 질병 상태에서 변이가 증가하고/하거나 질병 상태의 중증도와 함께 증가하고/하거나, 변이는 치료 요법에 반응하여 정상화되거나 개선될 수 있다. 예를 들어, sRNA 사전-선택은 sRNA 아이소형(예를 들어, isomiR)을, 하한 및 상한 임계값을 벗어나는 생물학적으로 관련된 서열 과대-특징(hyper-feature)(예를 들어, sRNA 아이소형의 5' 말단으로부터의 '시드 서열' 뉴클레오타이드 2 내지 8, 및/또는 단일 뉴클레오타이드 다형성)을 기초로 하여 '패밀리'로 그룹핑하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서, 하한 임계값은 1 백만 리드당 0 내지 100개의 트리밍된 리드이며, 상한 임계값은 1백만 리드당 0 내지 100개의 트리밍된 리드이다. 이러한 패밀리는 질병 활성과 상관 관계가 있는 변형에 대해 평가되며, 이러한 전체 패밀리, 또는 임계값보다 높거나 낮은 리드 카운트를 갖는 변형은 분류자에 포함하기 위한 후보물로서 선택된다. 일부 실시형태에서, 이러한 패밀리는 적어도 하나의 질병 상태에서 고유한 적어도 하나의 sRNA 예측인자를 포함한다.

서열 데이터에서 식별되고 계산 분류자에서 포함되도록 선택된 직후에, 패널에서 sRNA에 대한 분자 검출 시약이 제조될 수 있다. 이러한 검출 플랫폼은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 스템 루프 프라이머 및 형광 프로브를 사용하는 것을 포함하는, 정량적 RT-PCR 검정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 독립 샘플은 분자 검출 플랫폼으로 이동하기 보다는 sRNA 시퀀싱에 의해 평가된다.

sRNA 패널(예를 들어, 분류를 위해 사용되는 이원 sRNA 마커)은 약 4 내지 약 200개의 sRNA, 또는 일부 실시형태에서, 약 4 내지 약 100개의 sRNA를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, sRNA 패널은 약 10 내지 약 100개의 sRNA, 또는 약 10 내지 약 50개의 sRNA를 함유한다.

분류자는 일부 실시형태에서 고형 조직 샘플, 생물학적 유체 샘플, 또는 배양된 세포를 포함하는 다양한 타입의 샘플에 대해 트레이닝될 수 있다. 대상체를 평가할 때, sRNA가 평가되는 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액 또는 뇌척수액과 같은 생물학적 유체를 포함한다. 대안적으로, 대상체의 생물학적 샘플은 고형 조직 생검이다.

다양한 실시형태에서, 트레이닝 세트는 적어도 50개의 샘플, 또는 적어도 100개의 샘플, 또는 적어도 200개의 샘플을 갖는다. 일부 실시형태에서, 트레이닝 세트는 각 질병 상태에 대해 적어도 10개의 샘플, 또는 각 질병 상태에 대해 적어도 20개 또는 적어도 50개의 샘플을 포함한다. 더 많은 수의 샘플은 더 양호한 통계적 검증력을 제공할 수 있다.

본 개시내용에 따른 질병 분류자는 다양한 타입의 질병 상태에 대해 구성될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 질병 상태는 중추 신경계의 질병이다. 이러한 질병은 치매 증상을 수반하는 적어도 2개의 신경퇴행성 질병을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 2가지의 질병 상태는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 경도 인지 장애, 진행성 핵상 마비, 전측두엽 치매, 루이 신체 치매, 및 혈관성 치매로부터 선택된다. 대안적으로, 적어도 2가지의 질병 상태는 움직임 조절 상실의 증상을 수반하는 신경퇴행성 질병, 예를 들어, 파킨슨병, 근위축성 측색 경화증, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 및 척수 근위축증이다. 또 다른 실시형태에서, 적어도 2가지의 질병 상태는 탈수초성 질환, 선택적으로, 다발성 경화증, 시신경염, 횡단 척수염, 및 시신경 척수염을 포함하는 탈수초성 질환이다.

이에 따라, 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 질병 상태는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 근위축성 측색 경화증, 및 척수 근위축증으로부터 선택되며; 트레이닝 샘플은 질병 단계, 질병 중증도, 약물 반응성, 또는 질병 진행 과정에 대해 주석이 달린다.

또 다른 실시형태에서, 질병 상태는 상이한 조직 또는 세포 기원의 암이다. 일부 실시형태에서, 질병 상태는 약물 감수성 대 약물 내성 암, 또는 둘 이상의 치료제에 대한 감수성이다. 이러한 실시형태에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플은 종양 또는 암세포 생검일 수 있다.

일부 실시형태에서, 질병 상태는 염증 또는 면역 질병, 및 선택적으로, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 경피증, 자가면역 맥관염, 진성 당뇨병(제1형 또는 제2형), 그레이브병, 애디슨병, 쇼그렌 증후군, 갑상선염, 류머티스성 관절염, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 섬유근통, 건선, 크론병, 궤양성 대장염, 게실병 및 셀리악병 중 하나 이상을 포함하는, 염증 또는 면역 질병이다. 예를 들어, 분류자는 비제한적으로, 크론병, 궤양성 대장염, 및 게실병과 같은 위장 염증 질환을 구별할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 검사받은 대상체로부터의 생물학적 샘플은 생물학적 유체 샘플, 예를 들어, 혈액, 혈청, 또는 혈장일 수 있거나, 생검 조직, 예를 들어, 결장 상피 조직일 수 있다.

일부 실시형태에서, 질병 상태는 심혈관 질환, 선택적으로, 급성 이벤트의 위험에 대한 계층화를 포함하는 심혈관 질환이다. 일부 실시형태에서, 심혈관 질환은 관상 동맥 질병(CAD), 심근 경색, 뇌졸중, 울혈성 심부전, 고혈압성 심장 질환, 심근증, 심장 부정맥, 선천성 심장 질환, 판막성 심장 질환, 심장염, 대동맥류, 말초 동맥 질병 및 정맥 혈전증 중 하나 이상을 포함한다.

다양한 실시형태에서, 패널에서 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 10개의 sRNA는 양성 sRNA 예측인자이다. 즉, 양성 sRNA 예측인자는 트레이닝 세트에서 질병 상태에 대해 양성으로서 주석이 달린 복수의 샘플에 존재하는 것으로서 및 트레이닝 세트에서 질병 상태에 대해 음성으로서 주석이 달린 모든 샘플에 부재하는 것으로서 식별되었다. 일부 실시형태에서, 질병 상태로서 알츠하이머병을 포함하는 질병 분류자와 관련하여, sRNA 패널은 표 2A, 표 4A 및/또는 표 7A(서열번호 1 내지 403)로부터 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 5개 이상, 또는 10개 이상의 sRNA를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, sRNA 패널은 표 2A(서열번호 1 내지 46)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함한다. 일부 실시형태에서, sRNA 패널은 표 4A(서열번호 47 내지 254)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함한다. 일부 실시형태에서, sRNA 패널은 표 4A(서열번호 255 내지 403)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함한다. 일부 실시형태에서, sRNA 패널은 CSF에서 AD 진행의 브라크 단계와 상관 관계가 있는, 표 5(서열번호 58, 189, 78, 172, 193, 97, 122, 215, 248, 164, 120, 93, 126, 253, 112, 144, 213, 244, 123, 222, 150, 240, 52, 220, 221, 169, 165, 및 212)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함한다. 일부 실시형태에서, sRNA 패널은 혈청에서 AD 진행의 브라크 단계와 상관 관계가 있는, 표 8(서열번호 257, 270, 272, 273, 279, 286, 288, 314, 319, 325, 332, 341, 374, 391, 및 393)로부터의 하나 이상의 sRNA를 포함한다.

본 발명의 다른 양태 및 실시형태는 하기 실시예로부터 명확하게 될 것이다.

실시예

실시예 1: 알츠하이머병에 대한 이원 분류자는 뇌 조직, 뇌척수액, 또는 혈청의 실험 또는 비교자 그룹에서 식별됨

알츠하이머병에 대한 이원 작은 RNA 예측인자를 식별하기 위해 작은 RNA 시퀀싱 데이터를 GEO 및 dbGaP 데이터베이스로부터 다운로딩하고, 디스커버리 세트(Discovery Set)(표 1A 내지 1B: 뇌 샘플, 표 3A 내지 3B: CSF 샘플, 및 표 6A 내지 6B: SER 샘플)로서 사용하였다. 모든 샘플을, 물질과는 무관하게, 사후-검증된 알츠하이머병 또는 비-알츠하이머병 샘플(건강한 대조군 또는 다른 비-알츠하이머병 관련 신경 질환, 예를 들어, 파킨슨, 치매를 갖는 파킨슨, 헌팅턴, 등)로부터 유래하였다.

전체 공정은 하기에 기술되어 있다:

파일을 Centos용 SRA Tool Kit v2.8.0을 이용하여 .sra에서 .fastq 포맷으로 변환하고, .fastq 포맷된 파일을 미국특허 제2018/0258486호 및 국제출원 PCT/US2018/014856호(2018년 1월 23일에 출원됨)(이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이 가공하였다. 상세하게는, (Regex) 정규 표현-기반 검색 및 트림 알고리즘, 2의 레벤슈타인 거리(Levenshtein Distance) 또는 5의 해밍 거리(Hamming Distance)를 이용하여 어댑터 서열을 트리밍하여 모든 .fastq 데이터 파일을 가공하였으며, 여기서, 5' TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAA 3'(서열번호 404)(최대 15개의 뉴클레오타이드 3'-말단 절단을 함유함)는 3' 어댑터 서열을 식별하기 위해 입력하였다. Regex 검색을 위한 파라미터는 사용자-지정 검색어의 첫번째 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 삽입, 삭제, 및/또는 스와프(swap)와 관련하여 변경되지 않는다는 것을 필요로 한다.

샘플을 2개의 그룹, 즉, 실험 그룹 또는 비교자 그룹 중 1개의 그룹에 컴파일링하였다. sRNA-Split는 실험 그룹 또는 비교자 그룹에 고유한 작은 RNA뿐만 아니라 실험 그룹 및 비교자 그룹 둘 모두에 존재하는 작은 RNA를 식별한다. 실험 그룹 또는 비교자 그룹에 고유한 작은 RNA는 100% 특이성(정의상)을 갖는다. 고유한(이원) 작은 RNA는 이러한 것이 식별되는 그룹에 대한 분류자로서 역할을 한다. 이원 작은 RNA 분류자는 비-부트스트랩핑 및/또는 부트스트랩핑 계산 분류 알고리즘(예를 들어, 지도, 비지도, 반-지도 기계 학습 모델, 예를 들어, 파라미터/비-파라미터 거리 척도, 로지스틱 회귀, 서포트 벡터 머신, 결정 트리, 랜덤 포레스트, 신경망, 프로빗 회귀, 피셔 선형 판별, 나이브 베이즈 분류자, 퍼셉트론, 이차 분류자, 커넬 추정, k-최근접 이웃, 학습 벡터 양자화, 및 주성분 분석, 등)에서 사용될 수 있으며, 이러한 것은 또한, 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-qPCR)에 대한 표적으로서 사용될 수 있다.

sRNA-Split로 트리밍된 작은 RNA 리드를 분석함으로써 이원 작은 RNA 분류자를 식별하였다. 트리밍된 리드를 1백만 리드당 트리밍된-리드로 변환하였다. 각 샘플이 커버리지를 제공하는 최소 1개의 마커를 가질 필요가 있도록 여과하였다. 브라크 단계와 상관 관계가 있는 바이오마커를 식별하기 위해, 작은 RNA는 최소 3 연속 브라크 단계에 존재하여야 하고, 0.75 이상의 피어슨 상관 계수(Pearson Correlation Coefficient)를 갖는다.

이원 작은 RNA 예측인자를 함유한 특정의 바이오마커 패널(실험 그룹의 샘플에 존재하지만 비교자 그룹 중 임의의 샘플에 존재하지 않음)을 하기와 같이 식별하였다:

(1) AD 대 비-AD

(A) 뇌 조직(표 2)

(B) CSF(표 4)

(C) 혈청(표 7)

(2) 알츠하이머병 모니터링

(A) CSF(표 5)

(B) 혈청(표 8)

Chi-Square 2x2 분할표 및 단측 피셔 직접적 확률 시험을 이용하여 각 개개 이원 작은 RNA 예측인자에 대해 확률 스코어(p-값)를 계산하였다.

Chi-Square 2x2 분할표 및 단측 피셔 직접적 확률 시험(모두는 100% 특이성 및 100% 감수성을 제공함)을 이용하여 각 실험 그룹에 대한 이원 작은 RNA 예측인자의 패널에 대해 확률 스코어(p-값)를 계산하였다.

실시예 2: 염증성 장 질환(IBD)의 다중-부류 질병 분류자의 구성

특정 sRNA 분자의 존재 또는 부재를 기초로 하여 IBD 샘플을 분류하는 질병 분류자를 구성하기 위해, 크론병, 궤양성 대장염, 및 게실병과 같은 고려되는 상이한 질병 상태를 나타내는 다양한 트레이닝 세트에서 서열 데이터로부터 sRNA 패널을 결정하였다.

샘플

모든 샘플을 각 기관 검토위원회(IRB) 승인에 따라 수집하였고, 무제한 사용에 대해 환자 동의를 받았다. 데이터를 전자 의료 기록 및 차트 검토로부터 수집하였다. 임상 데이터는 연령, 성별, 인종, 민족, 체중, 체질량 지수, 흡연 이력, 음주 이력, 질병의 가족력과 같은 정보를 포함한다. 질병-관련 데이터는 진단, 염증성 장 질환(IBD) 진단시 연령, 현 및 종래 약물, 동반 질환, 직장대장 절제술 및 회장낭 항문 문합술(IPAA)에서의 연령뿐만 아니라 낭 나이(pouch age), 회장루의 폐쇄로부터의 시간, 또는 낭 수술로부터의 시간(여기서, 이러한 사전 절차를 받은 환자로부터 적용 가능한 경우)과 같은 정보를 포함한다.

생검을 결장 상피로부터 획득하였다. 수술불능 궤양성 대장염(IUC), 수술가능 궤양성 대장염(OUC), 크론병(CD), 게실병(DD), 용종/용종증(PP), 거치상 용종/용종증(SPP), 결장암(CC), 직장암(RC)을 임상, 내시경, 조직학, 및 영상 연구에 따라 정의하였다. 또한 포함 기준은 CD 환자에 대한 것이고 내시경에 의해 확인되고 IUC 환자에 대한 조직학에 의해 확인된 바와 같이 정상 말단 회장을 갖는 회장염의 존재이었다. 일상적인 스크리닝을 위해 대장 내시경이 필요하고 내시경 및/또는 조직학에 의해 비-질병 장 조직을 갖는 것으로서 확인된 개체를 정상 대조군으로 표지하였다.

모든 생검을 최소 2명의 기관 IBD-트레이닝된 병리학자에 의해 평가하였으며, 합의 스코어 및 진단을 임상 및 산업 표준 진단 프로토콜에 따라 제공하였다. 간단하게, 활성 염증 특징을 호중구 침윤(0 내지 3), 및 궤양 부위(0 내지 3)에 따라 점수를 매겼으며, 각 샘플을 비활성, 음와염, 선와 농양, 여러 선와 농양(> 3/고배율장) 및 궤양으로 분류하였다. UC를 분류하기 위해 본래 게보스 스코어(Original Geboes Score; OGS) 또는 단순화된 게보스 스코어(Simplified Geboes Score; SGS)를 이용하였다. CD를 분류하기 위해 크론병 활성 지수(CDAI) 및 크론병 중증도 내시경 지수(CDEIS)를 이용하였다. DD를 특징화하기 위해 힌체이 분류(Hinchey Classification)를 이용하였다. 대장암, 용종 및 거치상 용종을 대장암(CRC)에 대한 다학회 태스크포스(Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer)의 가장 최근의 제안에 따라 분류하였다.

사용된 IBD 샘플의 개요는 하기에 나타내었다:

IBD와 관련된 질병 부류에 대한 작은 RNA 예측인자를 식별하기 위해, 작은 RNA 시퀀싱 데이터를 GEO 데이터베이스로부터 다운로딩하고, Discovery Set로서 사용하였다. 작은 RNA 시퀀싱 데이터를 크론병(GSE66208), 궤양성 대장염(GSE114591), 게실병(GSE89667), 및 정상/대조군(GSE118504)에 대해 Geodatabase 연구로부터 다운로딩하였다.

파일을 Centos용 SRA Tool Kit v2.8.0을 이용하여 .sra에서 .fastq 포맷으로 변환하고, .fastq 포맷된 파일을 미국특허 제2018/0258486호 및 국제출원 PCT/US2018/014856호(2018년 1월 23일에 출원됨)(이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이 가공하였다. 상세하게는, (Regex) 정규 표현-기반 검색 및 트림 알고리즘, 2의 레벤슈타인 거리 또는 5의 해밍 거리를 이용하여 어댑터 서열을 트리밍하여 모든 .fastq 데이터 파일을 가공하였으며, 여기서, 5' TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAA 3'(서열번호 404)(최대 15개의 뉴클레오타이드 3'-말단 절단을 함유함)는 3' 어댑터 서열을 식별하기 위해 입력하였다. Regex 검색을 위한 파라미터는 사용자-지정 검색어의 첫번째 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 삽입, 삭제, 및/또는 스와프와 관련하여 변경되지 않는다는 것을 필요로 한다.

샘플을 2개 그룹, 즉, 실험 그룹 또는 비교자 그룹 중 1개의 그룹에 컴파일링하였다. sRNA-Split는 실험 그룹 또는 비교자 그룹에 고유한 작은 RNA뿐만 아니라 실험 그룹 및 비교자 그룹 둘 모두에 존재하는 작은 RNA를 식별한다. 실험 그룹 또는 비교자 그룹에 대해 고유한 작은 RNA는 100% 특이성(정의상)을 갖는다. 고유한(이원) 작은 RNA는 이러한 것이 식별된 그룹에 대한 분류자로서 역할을 한다. 이원 작은 RNA 분류자를 빕-부트스트랩핑 및/또는 부트스트랩핑 계산 분류 알고리즘(예를 들어, 지도, 비지도, 반-지도 기계 학습 모델, 예를 들어, 파라미터/비-파라미터 거리 척도, 로지스틱 회귀, 서포트 벡터 머신, 결정 트리, 랜덤 포레스트, 신경망, 프로빗 회귀, 피셔 선형 판별, 나이브 베이즈 분류자, 퍼셉트론, 이차 분류자, 커넬 추정, k-최근접 이웃, 학습 벡터 양자화, 및 주성분 분석, 등)에서 사용할 수 있으며, 이러한 것을 또한, 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-qPCR)을 위한 표적으로서 사용할 수 있다.

트리밍된, 작은 RNA 리드를 sRNA-Split로 분석함으로써 이원 작은 RNA 분류자를 식별하였다. 트리밍된 리드를 1백만 리드당 트리밍된-리드로 변환시켰다. 각 샘플이 커버리지를 제공하는 최대 1 마커를 갖기 위해 필요하도록 바이오마커를 여과하였다.

부류별 매트릭스

질병 부류를 식별하는 데 가장 중요한 마커를 식별하기 위해 각 부류에 대해 부류별 매트릭스를 결정하였다. 고려되는 상이한 질병 상태를 나타내는 다양한 트레이닝 세트에서 서열 데이터로부터 sRNA 패널을 결정하였다. 질병 부류의 작은 RNA 예측인자를 함유한 특정 바이오마커 패널을 하기와 같이 식별하였다:

대조군(건강한 개체/"정상" 개체): 표 9;

크론병: 표 10;

궤양성 대장염: 표 11; 및

게실병: 표 12.

지도, 비-파라미터, 로지스틱 회귀 기계 학습 모델을 이용함으로써, 최종 선택 마커 카운트는 128에서 최대 100으로 감소되었다. 분류 모델 성능을 평가하기 위해, 부류 당 식별된 각 마커 세트에 대해 ROC/AUC 곡선을 얻었으며, 여기서, ROC는 확률 곡선이며, AUC는 분리성의 정도 또는 척도를 나타낸다. ROC 곡선은 거짓 양성률에 대한 실제 양성률로 플롯팅된다. ROC/AUC 곡선을 상기에 논의된 바와 같이, 다양한 IBD 부류 및 대조군에 대해 설정하였으며, 이러한 것은 도 1에 도시되어 있다.

다중-부류 질병 분류

질병 분류자를 sRNA 패널의 양성 또는 음성 마커뿐만 아니라 대조군, 크론병, 궤양성 대장염, 및 게실병에 대해 상기에서 식별된 패널에서 sRNA의 존재 또는 부재를 기초로 하여 트레이닝하였다. 부류 매트릭스가 모두 결합되었을 때 계산 모델의 정확성을 평가하기 위해, 각 부류의 참조 샘플에 대한 모델의 식별 예측력을 평가하기 위한 시험을 수행하였다. 모델이 98%의 정확도 비율을 갖는다는 것이 확인되었다. 도 2는 실제 참조 ID에 대한 질병 부류의 정확한 예측 비율을 보여주는 히트 맵을 도시한 것이다. 이러한 결과는 또한 하기 매트릭스에 나타나 있다:

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> SRNALYTICS, INC. Salzman, David W. Salzman, Alan P. Foster, Neal C. Ray, Nathan S. <120> SMALL RNA PREDICTORS FOR ALZHEIMER'S DISEASE <130> SRN-004PC <140> PCT/US19/43508 <141> 2019-07-25 <150> US 62/703,172 <151> 2018-07-25 <160> 638 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 1 caggcagtta cagatcgaac tcc 23 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 2 ggtcagttac agatcgaac 19 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 3 ctggctgggt tgttcgagac ccgc 24 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 4 ttatgtgatg acttaca 17 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 5 ttctgtgatg acttaca 17 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 6 aggttatggg ttcgtgtccc acc 23 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 7 tcttgctccg tccactcc 18 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 8 ggtagagcat gggactctta atcgc 25 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 9 tcgtgctggg cccataacc 19 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 10 gggttgtggg ttcgggtccc acc 23 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 11 tttatcacgt tcgcctc 17 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 12 aggttccggg ctcgggaccc ggc 23 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 13 catatgtggt gaatacgtgt t 21 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 14 gcggtagagc atgggactct taatccc 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 15 gatccattgg ggtttccccg cgcaggt 27 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 16 ccatgggact cttaatcc 18 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 17 ggtaaacatc tccgactgga a 21 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 18 agggtgtggg ttcgaatccc acc 23 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 19 aaggttccgg gttcgtgtcg cggc 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 20 aagtttccgg gttcgggccc cggc 24 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 21 aggttgtgga ttcgtgtccc acc 23 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 22 gaagttccgg gttcgggtcc cggc 24 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 23 aggctgtggg ttcgaatccc acc 23 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 24 gggtgtgatg acttaca 17 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 25 aagtttccgg gttcgggacc cggc 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 26 aaggttccgg gttcggttcc cggc 24 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 27 actgtggact ctgaatcca 19 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 28 aaggttccgg gttcgggtac cggc 24 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 29 gcacgggact cttaatccc 19 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 30 aagtttgtgg gttcgtatcc cacc 24 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 31 ggagtgtggg ttcgtgtccc atc 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 32 aggttgtggg ttcgaggccc acc 23 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 33 agagtttccg ggttcgtgtc ccggc 25 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 34 ttgagggtgc gtgtccct 18 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 35 agaggttccg gggtcgggtc ccggc 25 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 36 agtgtgaggg ttcgtgtccc t 21 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 37 cacccgtagt accgacctcg cg 22 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 38 agaggttccg agttcgggtc ccggc 25 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 39 tccccggtgg tctagtggtt aggattccgc gct 33 <210> 40 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 40 gacgtcggat cagaaga 17 <210> 41 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 41 ttttgggatg acttaca 17 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 42 ttcacgtaat ccaggaaaag ct 22 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 43 gaggttacgg gttcgtgtcc cggc 24 <210> 44 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 44 atgtgactct taatctc 17 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 45 agggtgtggg ttcgtcccac c 21 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 46 tatagcactc tggactctga atccagc 27 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 47 ccacggactc ccaaaagcag ctt 23 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 48 accccgtaga tccgaccttg tga 23 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 49 tcaccgggtg tacatcaagc 20 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 50 caacggaatc tccaaagcag ct 22 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 51 tcttgcactc gtcccggcct cat 23 <210> 52 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 52 tttcggcact gaggcct 17 <210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 53 tcacccgggt gtcaatcagc tg 22 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 54 cccccgtcga accgcccttg cga 23 <210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 55 gttaaaattc ctgaaccggg acgcggc 27 <210> 56 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 56 ggttcgtgct gacggcctgt atcctaggct acaccctgag gact 44 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 57 cccccgtcga accgaccttg 20 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 58 ttcacagtgg ctcagttctg cc 22 <210> 59 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 59 ttaaactctg tcgtgctgg 19 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 60 gctaataccg gataagaaag c 21 <210> 61 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 61 tccctggtgg tctggtggtt aggagtcggc gc 32 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 62 taaagtgctg accgtgcaga t 21 <210> 63 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 63 tcctctgtag ttcagtcggt agaac 25 <210> 64 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 64 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<220> <223> Synthetic polymer. <400> 72 cgcggggtgg agcagcctgg tagct 25 <210> 73 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 73 cgggtcgtgg gttcgcccca cgttgggcgc 30 <210> 74 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 74 tctacagtcc gacgatacga ctcttagcgg 30 <210> 75 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 75 gggcccctac ccggccgtcg ccggcagtcg ag 32 <210> 76 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 76 tcttccgtag tgtagtggtt atgacgttcg cct 33 <210> 77 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 77 tcaaggctaa aactcaaa 18 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 78 tacagtactg tgctaactga aaa 23 <210> 79 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 79 gccacggtgg ccgagtggtt aaggc 25 <210> 80 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 80 cccccactgc tacatttgac tgtctt 26 <210> 81 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 81 acggataaaa ggtacctcgg ggataac 27 <210> 82 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 82 cttctagaaa tttctgaaaa tgctctg 27 <210> 83 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 83 ccccccactg ctaaatttga ctggctact 29 <210> 84 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 84 ggccgcgtgc ctaatggata aggcgtctga t 31 <210> 85 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 85 ctgtgagggt gagcgaatcg ctgaaagccg gcc 33 <210> 86 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 86 gcttgcggag tgtagtggtt atcacgttcg cct 33 <210> 87 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 87 caacggataa aaggtactct agggataaca ggct 34 <210> 88 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 88 cattggtggt tccgtggtag aattctcgcc tgcc 34 <210> 89 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 89 ggctggtccg atggtagtgg ggtatcagaa cttg 34 <210> 90 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 90 ttgaccttac cggatggcac aaagagaagt gggcaagttc 40 <210> 91 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 91 tccctagttc gtttctggga gcggagacca 30 <210> 92 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 92 tcccatgtgg tctagcggtt aggattcct 29 <210> 93 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 93 cgggcctttc ggggcctctt ccccgggc 28 <210> 94 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 94 gtggttccgg ctttggac 18 <210> 95 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 95 gtgctaatct gcgataagcg tcggt 25 <210> 96 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 96 tcagtgcatc accgaccttt gtt 23 <210> 97 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 97 tccctgagac cctttaaacc tgt 23 <210> 98 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 98 ctagtacgag aggaccggag tggacgcatc 30 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 99 gaggcagcag tagggaatat 20 <210> 100 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 100 tagcaccatt tgcaatcggt tg 22 <210> 101 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 101 ttagacagtt cggtccctat ctgcc 25 <210> 102 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 102 tgatgtcggc tcatctcatc ctggggct 28 <210> 103 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 196 cgcgacctca gatcagacgt ggcgacccgc tgagtgtaag c 41 <210> 197 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 197 gcaggttcag tcctgccgcg gtcgc 25 <210> 198 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 198 gtgatataga cagcaggacg gtggcca 27 <210> 199 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 199 ccagtgtgaa agtaggttat cttcaggct 29 <210> 200 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 200 gtaccgggtg taaatcagct g 21 <210> 201 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 201 caccgaaatc gcggatatga gcgttcct 28 <210> 202 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 202 agtctggcac ggtgaagaga catgagaggg g 31 <210> 203 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 203 gtaaccgggg 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cct 33 <210> 235 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 235 tagaccgcct gggaataccg gttgctgtag gctt 34 <210> 236 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 236 gggaggcttt gaagtgtgga cgccagtctg c 31 <210> 237 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 237 gggatgaacc gaccgccggg tt 22 <210> 238 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 238 gtcggcagtt caatcctgcc catgggcacc a 31 <210> 239 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 239 atagtgcgtg ttcccgtgtg aaagtaggtc atcgtcaggc t 41 <210> 240 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 240 ggtcatctcg ggggaacct 19 <210> 241 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 241 cactccagcc tgggcaacat agcgcgaccc cgtctctta 39 <210> 242 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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tcccacctga ttc 43 <210> 258 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 258 cacctgtgcg tgtgggtgct gctgcgggct gtcagatgct gacc 44 <210> 259 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 259 ctcagatcag acgtggcg 18 <210> 260 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 260 tttgagagga tgatcagcca cactgggact g 31 <210> 261 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 261 ctgtttcaac caacgcttga ctgagaactc tttc 34 <210> 262 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 262 tcagggtcag tctaagtgaa gacaaagaga ggc 33 <210> 263 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 263 agtgcgagtt tgagggctgt gaccggcgct 30 <210> 264 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 264 catgttgctt tatttatca 19 <210> 265 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 265 tgtgggagag taggacgccg ccggaca 27 <210> 266 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 266 tctgttacgg aactgtactc tctgagggcc tcccacctga ctc 43 <210> 267 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 267 aggactggtg gagcgcttag aag 23 <210> 268 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 268 gccccagtgg cctaatggat aaggcattgg cttagggac 39 <210> 269 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 269 cagggcacgg tatttcttgt tacttccctg cacacggact gtg 43 <210> 270 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 270 tacaaggaag gtcactaccg ttctttcac 29 <210> 271 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 271 ctgctttctt ctttggatcg tcgttcaact 30 <210> 272 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 272 ttagcaacaa caggaagccc cttttatcct 30 <210> 273 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 273 tctgaatcaa cccttattac tct 23 <210> 274 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 274 tctcatttgg gcagaatatg tcagagggaa gatc 34 <210> 275 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 275 cctcctaagt attacacc 18 <210> 276 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 276 cccatcttgc tgagatgagg cc 22 <210> 277 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 277 ccttgtaata acctctagtc ctttcc 26 <210> 278 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 278 attcatggtg ctttcaagtc aggttttct 29 <210> 279 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 279 catcagagac agtggca 17 <210> 280 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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polymer. <400> 288 ccctagtctt catttgttgt tatgtcattg cctgcctt 38 <210> 289 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 289 cccaggttca agtgattctc ctgcctcagc ctccagagta cc 42 <210> 290 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 290 cttcacctga gagtgtc 17 <210> 291 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 291 ccccagaagc aggtgtcaat 20 <210> 292 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 292 cccatatttc ataatttcac gcttctgtct tgcatgcttc 40 <210> 293 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 293 cacttgtgct tgtgggtgct actgcgggcg gtcagatgct cacc 44 <210> 294 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 294 tgggcagtgg cttatgggaa gatgacctct gattaaataa ttcc 44 <210> 295 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 295 cgcgacctca 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 601 aacattcaac gctgtcggtg 20 <210> 602 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 602 atgcagcacg taaatattgg cg 22 <210> 603 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 603 tgccgacggg cgctgacccc ctt 23 <210> 604 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 604 attggtcgtg gttgtagtcc gtgcgagaa 29 <210> 605 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 605 tggcagtgtc ttagctggtt g 21 <210> 606 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 606 tgtcagtttg tcaaata 17 <210> 607 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 607 accctgagac cctaacttgt ga 22 <210> 608 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 608 tggcagtttg tcaaatacc 19 <210> 609 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 609 actggacttg gagtcagaag gcatat 26 <210> 610 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 610 tcgaccggac ctcgaccggc taga 24 <210> 611 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 611 tcagcaccag gatattgttg ga 22 <210> 612 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 612 tgtaaccgca actccatgtg ga 22 <210> 613 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 613 actggacttg gagtcagaag gcatta 26 <210> 614 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 614 aacactgtct ggtaaagatg gc 22 <210> 615 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 615 tgtaaacatc ctacactctc agctta 26 <210> 616 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 616 actggacttt gagtcagaag gca 23 <210> 617 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 617 actggacttg gagccagaag gcaa 24 <210> 618 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 618 gtaacagcaa ctccatgtgg aaa 23 <210> 619 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 619 actggacttg gagtcagaag gcaata 26 <210> 620 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 620 ctggacttgg agtcagaagg caga 24 <210> 621 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 621 tgatatgttt gatatattag gtta 24 <210> 622 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 622 tgaaatgttt aggaccacta gaat 24 <210> 623 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 623 tggacttgga gtcagaaggc at 22 <210> 624 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 624 tgtaacagca actccatgtg gacta 25 <210> 625 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 625 tcgaccggac ctcgaccggc ta 22 <210> 626 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 626 tgagatgaag cactgtagct cata 24 <210> 627 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 627 tttcagtcgg atgtttgcag caa 23 <210> 628 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 628 gacctatgaa ttgacagcca t 21 <210> 629 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 629 ccactgcccc aggtgctgct gga 23 <210> 630 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 630 ctgacctatg aattgacagc catga 25 <210> 631 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 631 accacagggt agaaccacgg acga 24 <210> 632 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 632 tcgaccggac ctcgaccggc tga 23 <210> 633 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 633 tggctcagtt cagcaggaac agga 24 <210> 634 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 634 agcttatcag actgatgttg aaa 23 <210> 635 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 635 atcacattgc cagggataaa a 21 <210> 636 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 636 tcaacaaaat cactgatgct gga 23 <210> 637 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 637 acattgccag ggatttcca 19 <210> 638 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polymer. <400> 638 aacactgtct ggtaaagatg 20

Claims

대상체에서 알츠하이머병을 평가하는 방법으로서,
하나 이상의 알츠하이머병 증상을 나타내는 대상체로부터 생물학적 샘플을 제공하거나, 상기 샘플로부터 추출된 RNA를 제공하는 단계,
상기 샘플에서 하나 이상의 양성 sRNA 예측인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 양성 sRNA 예측인자의 존재가 알츠하이머병 활성을 나타내는, 상기 존재 또는 부재를 결정하는 단계
를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 sRNA 예측인자가 표 2A, 표 4A 및/또는 표 7A(서열번호 1 내지 403)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함하는, 방법.
제2항에 있어서, 상기 양성 sRNA 예측인자가 표 2A(서열번호 1 내지 46)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함하는, 방법.
제2항에 있어서, 상기 양성 sRNA 예측인자가 표 4A(서열번호 47 내지 254)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함하는, 방법.
제2항에 있어서, 상기 양성 sRNA 예측인자가 표 7A(서열번호 255 내지 403)로부터의 하나 이상의 예측인자를 포함하는, 방법.
제2항에 있어서, 상기 양성 sRNA 예측인자가 표 5(서열번호 58, 189, 78, 172, 193, 97, 122, 215, 248, 164, 120, 93, 126, 253, 112, 144, 213, 244, 123, 222, 150, 240, 52, 220, 221, 169, 165, 및 212)로부터의 하나 이상의 예측인자를 포함하는, 방법.
제2항에 있어서, 상기 양성 sRNA 예측인자가 표 8(서열번호 257, 270, 272, 273, 279, 286, 288, 314, 319, 325, 332, 341, 374, 391, 및 393)로부터의 하나 이상의 예측인자를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 적어도 10개의 sRNA 예측인자의 존재 또는 부재가 결정되는, 방법.
제8항에 있어서, 표 2A, 표 4A 및/또는 표 7A(서열번호 1 내지 403)로부터의 적어도 2개의 sRNA의 존재 또는 부재가 결정되는, 방법.
제9항에 있어서, 표 2A, 표 4A 및/또는 표 7A로부터의 적어도 5개의 sRNA의 존재 또는 부재가 결정되는, 방법.
제9항에 있어서, 표 2A, 표 4A 및/또는 표 7A로부터의 적어도 10개의 sRNA의 존재 또는 부재가 결정되는, 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 음성 sRNA 예측인자의 존재 또는 부재가 결정되는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 생물학적 유체인, 방법.
제13항에 있어서, 상기 생물학적 유체가 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액 또는 뇌척수액으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 고형 조직이고, 선택적으로, 뇌 조직인, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sRNA의 존재 또는 부재가 정량적 또는 정성적 PCR 검정에 의해 결정되는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 sRNA의 존재 또는 부재가 형광 염료 또는 형광-표지 프로브를 이용하여 결정되는, 방법.
제17항에 있어서, 상기 sRNA의 존재 또는 부재가 형광-표지 프로브를 이용하여 결정되며, 상기 프로브는 켄처 모이어티(quencher moiety)를 더 포함하는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, sRNA가 스템-루프 RT 프라이머(stem-loop RT primer)를 사용하여 증폭되는, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sRNA의 존재 또는 부재가 혼성화 검정을 이용하여 결정되는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 혼성화 검정이 sRNA-특이적 프로브를 포함하는 혼성화 어레이를 이용하는, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sRNA의 존재 또는 부재가 핵산 시퀀싱에 의해 결정되며, sRNA가 개개 sRNA 서열로부터 3' 시퀀싱 어댑터를 트리밍(trmming)하는 것을 포함하는 공정에 의해 상기 샘플에서 식별되는, 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 AD를 갖는 것으로 진단되지 않은, 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 브라크 단계 I/II를 갖는, 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 브라크 단계 III/IV를 갖는, 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 브라크 단계 V/VI를 갖는, 방법.
제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 반복되는, 방법.
제27항에 있어서, 대상체가 1년에 적어도 약 1회, 또는 6개월마다 적어도 약 1회, 또는 1개월에 적어도 1회 또는 1주에 적어도 1회의 빈도로 평가되는, 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 AD 또는 AD 증상에 대한 치료 또는 후보 치료(candidate therapy)를 받고 있는 중인, 방법.
대상체에서 알츠하이머병을 평가하는 방법으로서,
알츠하이머병으로의 진행과 상관 관계가 있는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 대상체로부터 생물학적 샘플을 제공하거나 상기 샘플로부터 추출된 RNA를 제공하는 단계; 및
알츠하이머병 활성 및/또는 진행의 지표로서 하나 이상의 양성 sRNA 예측인자의 존재, 부재, 또는 수준을 결정하는 단계
를 포함하는, 방법.
제30항에 있어서, 적어도 1개의 sRNA 예측인자가 표 2A, 표 4A 또는 표 7A(서열번호 1 내지 403)로부터인 것인, 방법.
제31항에 있어서, 상기 sRNA 예측인자의 존재 또는 부재가 sRNA-특이적 프라이머 및/또는 프로브와의 정량적 또는 정성적 PCR; 혼성화 검정 sRNA-특이적 프로브; 또는 3' 시퀀싱 어댑터의 계산 트리밍(computational trimming)과 함께 핵산 시퀀싱으로부터 선택된 공정을 이용하여 결정되는, 방법.
제32항에 있어서, 상기 sRNA 예측인자의 존재 또는 부재가 실시간 PCR을 이용하여 결정되는, 방법.
제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sRNA의 존재 또는 부재가 형광 염료 또는 형광-표지 sRNA-특이적 프로브를 이용하여 결정되는, 방법.
제34항에 있어서, 상기 sRNA의 존재 또는 부재가 형광-표지 sRNA-특이적 프로브를 이용하여 결정되며, 상기 프로브는 켄처 모이어티를 더 포함하는, 방법.
제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, sRNA가 스템-루프 RT 프라이머를 사용하여 증폭되는, 방법.
제36항에 있어서, 상기 sRNA의 존재 또는 부재가 sRNA-특이적 프로브와의 혼성화 검정을 이용하여 결정되는, 방법.
제37항에 있어서, 상기 혼성화 검정이 sRNA-특이적 프로브를 포함하는 혼성화 어레이를 이용하는, 방법.
제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sRNA의 존재 또는 부재가 핵산 시퀀싱에 의해 결정되며, sRNA가 3' 시퀀싱 어댑터를 트리밍하는 것을 포함하는 공정에 의해 상기 샘플에서 식별되는, 방법.
제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양성 sRNA 예측인자가 표 2A(서열번호 1 내지 46)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함하는, 방법.
제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양성 sRNA 예측인자가 표 4A(서열번호 47 내지 245)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함하는, 방법.
제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양성 sRNA 예측인자가 표 7A(서열번호 255 내지 403)로부터의 하나 이상의 sRNA 예측인자를 포함하는, 방법.
제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양성 sRNA 예측인자가 표 5(서열번호 58, 189, 78, 172, 193, 97, 122, 215, 248, 164, 120, 93, 126, 253, 112, 144, 213, 244, 123, 222, 150, 240, 52, 220, 221, 169, 165, 및 212)로부터의 하나 이상의 예측인자를 포함하는, 방법.
제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양성 sRNA 예측인자가 표 8(서열번호 257, 270, 272, 273, 279, 286, 288, 314, 319, 325, 332, 341, 374, 391, 및 393)로부터의 하나 이상의 예측인자를 포함하는, 방법.
제30항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 5개의 sRNA 예측인자의 존재 또는 부재가 결정되는, 방법.
제45항에 있어서, 표 2A, 표 4A 또는 표 7A로부터의 적어도 2개의 sRNA의 존재 또는 부재가 결정되는, 방법.
제46항에 있어서, 표 2A, 표 4A 또는 표 7A로부터의 적어도 5개의 sRNA의 존재 또는 부재가 결정되는, 방법.
제46항에 있어서, 표 2A, 표 4A 또는 표 7A로부터의 적어도 10개의 sRNA의 존재 또는 부재가 결정되는, 방법.
제30항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 음성 sRNA 예측인자의 존재 또는 부재가 결정되는, 방법.
제30항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 AD의 동물 모델인 대상체로부터의 것이거나 부검 샘플인, 방법.
제50항에 있어서, 상기 샘플이 뇌 조직 샘플인, 방법.
제30항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 생물학적 유체인, 방법.
제52항에 있어서, 상기 생물학적 유체가 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액 또는 뇌척수액으로부터 선택되는, 방법.
제53항에 있어서, 상기 대상체가 AD에 대한 후보 치료를 받고 있는 중인, 방법.
알츠하이머병에 대해 샘플을 평가하기 위한 키트로서,
표 2A, 표 4A 또는 표 7A(서열번호 1 내지 403)에 나열된 복수의 sRNA를 검출하도록 구성된 sRNA-특이적 프로브 및/또는 프라이머를 포함하는, 키트.
제55항에 있어서, 표 2A, 표 4A 또는 표 7A 5(서열번호 1 내지 403)에 나열된 적어도 5개의 sRNA를 검출하도록 구성된 sRNA-특이적 프로브 및/또는 프라이머를 포함하는, 키트.
제55항에 있어서, 표 2A, 표 4A 또는 표 7A(서열번호 1 내지 403)에 나열된 적어도 10개의 sRNA를 검출하도록 구성된 sRNA-특이적 프로브 및/또는 프라이머를 포함하는, 키트.
제55항에 있어서, 표 2A, 표 4A 또는 표 7A(서열번호 1 내지 403)에 나열된 적어도 18개의 sRNA를 검출하도록 구성된 sRNA-특이적 프로브 및/또는 프라이머를 포함하는, 키트.
제55항에 있어서, 표 2A, 표 4A 또는 표 7A(서열번호 1 내지 403)에 나열된 적어도 40개의 sRNA를 검출하도록 구성된 sRNA-특이적 프로브 및/또는 프라이머를 포함하는, 키트.
제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 정량적 또는 정성적 PCR 검정을 위해 적합한 프로브 및/또는 프라이머를 포함하는, 키트.
제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 염료 또는 형광-표지 프로브를 포함하는, 키트.
제61항에 있어서, 형광-표지 프로브를 포함하며, 상기 프로브는 켄처 모이어티를 더 포함하는, 키트.
제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 스템-루프 RT 프라이머를 포함하는, 키트.
제55항에 있어서, sRNA-특이적 혼성화 프로브의 어레이를 포함하는, 키트.
하나 이상의 질병 상태에 대해 대상체를 평가하는 방법으로서,
상기 대상체의 생물학적 샘플을 제공하고, sRNA 패널에서의 복수의 sRNA의 존재 또는 부재를 결정하는 단계;
질병 분류자(disease classifier)를 이용하여 상기 대상체의 상태를 하나 이상의 질병 상태로 분류하는 단계
를 포함하되;
상기 질병 분류자는 트레이닝 샘플(training sample)의 세트에서 상기 sRNA 패널에서의 상기 sRNA의 존재 및 부재를 기초로 하여 트레이닝되며; 상기 트레이닝 샘플은 상기 하나 이상의 질병 상태에 대해 양성 또는 음성으로서 주석이 달린 방법.
제65항에 있어서, 상기 패널에서의 상기 sRNA의 존재 또는 부재가 sRNA 서열 데이터로부터의 상기 트레이닝 세트에서 결정되며, sRNA 서열이 참조 서열 또는 유전자좌에 sRNA 서열 변이체를 통합하지 않고 5' 시퀀싱 어댑터 및 3' 시퀀싱 어댑터를 트리밍함으로써 상기 sRNA 서열 데이터에서 식별되는, 방법.
제66항에 있어서, 상기 샘플에서 상기 sRNA의 존재 또는 부재가 정량적 RT-PCR 검정에 의해 결정되는, 방법.
제65항에 있어서, 상기 질병 분류자가 샘플을 적어도 3가지의 질병 상태, 또는 적어도 5가지의 질병 상태로 분류하는, 방법.
제68항에 있어서, 상기 질병 분류자가 샘플을 적어도 10가지 질병 상태로 분류하는, 방법.
제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 패널이 약 4 내지 약 200개의 sRNA, 또는 약 4 내지 약 100개의 sRNA, 또는 약 4 내지 약 50개의 sRNA를 함유하는, 방법.
제65항에 있어서, 상기 트레이닝 샘플이 고형 조직 샘플, 생물학적 유체 샘플, 또는 배양된 세포 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
제65항에 있어서, 상기 대상체의 상기 생물학적 샘플이 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액 또는 뇌척수액인, 방법.
제65항에 있어서, 상기 대상체의 생물학적 샘플이 고형 조직 생검인, 방법.
제65항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트레이닝 세트가 각 질병 상태에 대한 적어도 10개의 샘플을 포함하는 적어도 100개의 샘플을 갖는, 방법.
제65항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병 분류자가 지도, 비지도, 반-지도 기계 학습 모델 중 하나 이상, 예를 들어, 파라미터/비-파라미터 거리 척도(Parametric/non-parametric Distance Measures), 로지스틱 회귀(Logistic Regression), 서포트 벡터 머신(Support Vector Machines), 결정 트리(Decision Trees), 랜덤 포레스트(Random Forests), 신경망(Neural Networks), 프로빗 회귀(Probit Regression), 피셔 선형 판별(Fisher's Linear Discriminant), 나이브 베이즈 분류자(Naive Bayes Classifier), 퍼셉트론(Perceptron), 이차 분류자(Quadratic classifiers), 커넬 추정(Kernel Estimation), k-최근접 이웃(k-Nearest Neighbor), 학습 벡터 양자화(Learning Vector Quantization), 및 주성분 분석(Principal Components Analysis)을 이용하여 트레이닝되는, 방법.
제65항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병 상태가 중추 신경계의 질병인, 방법.
제76항에 있어서, 적어도 2가지의 질병 상태가 치매의 증상을 수반하는 신경퇴행성 질병인, 방법.
제77항에 있어서, 적어도 2가지의 질병 상태가 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 경도 인지 장애, 진행성 핵상 마비, 전측두엽 치매, 루이 신체 치매, 및 혈관성 치매로부터 선택된 방법.
제76항에 있어서, 적어도 2가지의 질병 상태가 움직임 조절 상실의 증상을 수반하는 신경퇴행성 질병인, 방법.
제79항에 있어서, 적어도 2가지의 질병 상태가 파킨슨병, 근위축성 측색 경화증, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 및 척수 근위축증인, 방법.
제79항 또는 제80항에 있어서, 적어도 2가지의 질병 상태가 다발성 경화증, 시신경염, 횡단 척수염, 및 시신경 척수염을 선택적으로 포함하는, 탈수초성 질환인, 방법.
제65항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 질병 상태가 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 근위축성 측색 경화증, 및 척수 근위축증으로부터 선택되며; 트레이닝 샘플이 질병 단계, 질병 중증도, 약물 반응성, 또는 질병 진행 과정에 대해 주석이 달린, 방법.
제65항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병 상태가 상이한 조직 또는 세포 기원의 암인, 방법.
제65항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병 상태가 약물 감수성 암 및 약물 내성 암인, 방법.
제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 대상체로부터의 상기 생물학적 샘플이 종양 또는 암세포 생검인, 방법.
제65항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병 상태가 염증 또는 면역 질병이고, 선택적으로, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 경피증, 자가면역 맥관염, 진성 당뇨병(제1형 또는 제2형), 그레이브병, 애디슨병, 쇼그렌 증후군, 갑상선염, 류머티스성 관절염, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 섬유근통, 건선, 크론병, 궤양성 대장염, 및 셀리악병 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
제86항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈액, 혈청, 또는 혈장인, 방법.
제65항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병 상태가 급성 이벤트의 위험에 대한 계층화를 선택적으로 포함하는, 심혈관 질환인, 방법.
제88항에 있어서, 상기 심혈관 질환이 관상 동맥 질병(CAD), 심근 경색, 뇌졸중, 울혈성 심부전, 고혈압성 심장 질환, 심근증, 심장 부정맥, 선천성 심장 질환, 판막성 심장 질환, 심장염, 대동맥류, 말초 동맥 질병 및 정맥 혈전증 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
제65항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 패널에서의 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 10개의 sRNA가, 상기 트레이닝 세트에서 질병 상태에 대해 양성으로서 주석이 달린 복수의 샘플에 존재하고 상기 트레이닝 세트에서 상기 질병 상태에 대해 음성으로서 주석이 달린 모든 샘플에 부재한 것으로서 식별된, 양성 sRNA 예측인자인, 방법.