CN112585281A - 用于阿尔茨海默氏病的小rna预测因子 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于评估阿尔茨海默氏病(AD)活动的方法和试剂盒，包括在经历AD治疗或AD候选治疗的患者中以及在动物和细胞模型中。具体而言，本公开提供了生物标志物(sRNA预测因子)，其是疾病活动的二元预测因子，并且可用于检测和/或评估AD疾病阶段、等级和进展、预后以及对疗法或候选疗法的反应。所述生物标志物在药物发现和临床试验的背景下进一步有用，以鉴定对疾病的治疗有用的候选药物干预(或其他疗法)。

Description

用于阿尔茨海默氏病的小RNA预测因子

优先权

本申请要求2018年7月25日提交的美国临时申请号62/703,172的权益和优先权，所述申请的内容以引用方式整体并入本文。

背景技术

阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)是最常见的神经退行性疾病，因为它占所有痴呆病例的近70％，并影响多达20％的80岁以上的个体。大脑中各种形态学和组织学变化是现代AD神经病理学的标志。具体而言，已观察到两种神经学现象：淀粉样斑块和神经元纤维缠结。疾病进展可分为各Braak阶段，其中根据脑中缠结神经元的位置和变化的严重性，已将疾病传播区分为六个阶段：Braak I/II阶段：跨内嗅区(颞叶)阶段，临床上无症状病例；Braak III/IV阶段：边缘区阶段，初期阿尔茨海默氏病；以及Braak V/VI阶段：新皮质阶段，完全发展的阿尔茨海默氏病。

阿尔茨海默氏病患者开始表现出早期症状，诸如像记住最近的事件以及形成新的记忆之类的记忆困难。视觉空间和语言问题常常跟随或伴随涉及记忆的早期症状的发作。随着疾病的进展，个体慢慢失去进行日常生活活动的能力，并且最终，注意力、言语能力、解决问题、推理以及所有形式的记忆都受到严重损害。事实上，AD的进展常常伴随着人格的变化，诸如冷漠感、愤怒、依赖感、攻击性增加、妄想症和偶尔不适当的性行为。在AD的后面阶段，个体可能无法沟通，表现出完全混乱的体征并且卧床不起。

阿尔茨海默氏病有两种类型：早发性和晚发性，并且这两种类型都有遗传成分。早发性AD患者在30多岁与60多岁中期之间开始出现症状并且非常罕见，而作为最常见的类型，晚发性AD患者在患者60多岁中期出现体征和症状。已知晚发性AD涉及遗传风险因素，即19号染色体上的载脂蛋白E(APOE)的一种形式APOEε4，其会增加人的风险。

目前，尚无AD的治愈方法，并且可用的治疗通常最多只能暂时减缓症状恶化。此外，阿尔茨海默氏病只有在死亡后通过尸检中的脑组织和病理检查才能得到绝对诊断。

因此，鉴定疾病修正疗法是药物干预和药物发现的主要目标。然而，由于没有临床上有意义的生物标志物来帮助药物发现和开发，这些努力受到了阻碍。此类生物标志物需要是可获得的、预后的和/或疾病特异性的。包括药物干预的治疗干预的发现和研究将受益于与潜在疾病过程相关的生物标志物的可用性。

例如，需要用于评估阿尔茨海默氏病活动的诊断测试，以帮助在受影响的个体中进行治疗和决策，以及在药物发现和临床试验(包括患者入组、分层和疾病监测)中用作生物标志物。

发明内容

本公开提供了用于评估阿尔茨海默氏病(AD)活动的方法和试剂盒，包括在经历AD治疗或AD候选治疗的患者中以及在动物和细胞模型中。具体而言，本公开提供了生物标志物(sRNA预测因子)，其是疾病活动的二元预测因子，并且可用于检测和/或评估AD疾病阶段、等级、进展、预后以及对疗法或候选疗法的反应。生物标志物在药物发现和临床试验的背景下进一步有用，以鉴定对疾病的治疗或管理(例如治疗或进展监测)有用的候选药物干预(或其他疗法)。

在各个方面和实施方案中，本发明涉及检测来自受试者或患者的细胞或生物样品中的阿尔茨海默氏病或阿尔茨海默氏病活动的二元小RNA(sRNA)预测因子。sRNA序列被鉴定为存在于AD实验队列的样品中，而不存在于比较队列的任何样品中(“阳性sRNA预测因子”)。因此，本发明检测作为二元预测因子的sRNA，其对阿尔茨海默氏病表现出100％特异性。

在一些实施方案中，本发明提供了一种用于评估受试者或患者中的AD活动的方法。所述方法包括提供来自表现出AD的症状和体征的受试者或患者的生物样品，并且确定样品中一个或多个sRNA预测因子的存在、不存在或水平。sRNA预测因子的存在或水平与疾病活动相关。

阳性sRNA预测因子包括来自表2A、表4A和表7A(SEQ ID NO:1-403)的一个或多个sRNA预测因子。例如，阳性sRNA预测因子可包括来自表2A(SEQ ID NO:1至46)的一个或多个sRNA预测因子，其在AD患者的脑组织样品的sRNA序列数据中被鉴定，但是在非疾病对照以及各种其他非阿尔茨海默氏病的神经退行性疾病对照(例如帕金森氏病(Parkinson’sdisease))中不存在。在一些实施方案中，一个或多个预测因子的相对或绝对量与疾病阶段或严重性相关。在一些实施方案中，阳性sRNA预测因子包括来自表4A(SEQ ID NO:47-254)的一个或多个sRNA预测因子，其在AD患者的脑脊液(CSF)样品的sRNA序列数据中被鉴定，但是在健康对照以及各种其他非阿尔茨海默氏病的神经退行性疾病对照(例如帕金森氏病)中不存在。在一些实施方案中，阳性sRNA预测因子包括来自表4A(SEQ ID NO:255-403)的一个或多个sRNA预测因子，其在AD患者的血清样品的sRNA序列数据中被鉴定，但是在健康对照以及各种其他非阿尔茨海默氏病的神经退行性疾病对照(例如帕金森氏病)中不存在。

在一些实施方案中，样品中存在的预测因子的数量或预测因子中的一个或多个预测因子的积累与AD的进展或潜在的疾病或活动性症状的严重性直接相关。在一些实施方案中，阳性sRNA预测因子包括来自表5(SEQ ID NO:58、189、78、172、193、97、122、215、248、164、120、93、126、253，112、144、213、244、123、222、150、240、52、220、221、169、165和212)的一个或多个sRNA预测因子，它们与AD进展的Braak阶段相关(例如在CSF样品中)。在一些实施方案中，阳性sRNA预测因子包括来自表8(SEQ ID NO:257、270、272、273、279、286、288、314、319、325、332、341、374、391和393)的一个或多个，它们与AD进展的Braak阶段相关(例如在血清样品中)。

在一些实施方案中，确定来自表2A、表4A和/或表7A(SEQ ID NO:1-403)中的一个或多个的至少1、2、3、4或5个sRNA或至少10个sRNA或至少40个sRNA的存在、不存在或水平。在一些实施方案中，还确定了至少一个阴性sRNA预测因子的存在或不存在，其在非AD样品诸如健康对照中被独特地鉴定。在一些实施方案中，针对样品测试了包含来自表2A、表4A和/或表7A的阳性预测因子的sRNA套组。在一些实施方案中，所述套组可包含来自表2A、表4A和/或表7A的至少2个或至少5个或至少10个或至少20个或至少25个sRNA。在一些实施方案中，所述套组包含来自表2A、表4A和/或表7A的所有sRNA。例如，样品对于表2A、表4A和/或表7A中的至少约2、3、4或5个sRNA预测因子可呈阳性，这表明活动性疾病，并且更严重或晚期的疾病与约10、15或约20个sRNA预测因子相关。在一些实施方案中，表2A、表4A和/或表7A中的sRNA预测因子的相对或绝对量与疾病等级或严重性(例如Braak阶段)直接相关。

通常，至少1、2、3、4或5个阳性预测因子的存在可预测AD活动。在一些实施方案中，针对样品测试了5至约100或约5至约60个sRNA预测因子的套组。虽然并非每个实验样品对每个阳性预测因子都呈阳性，但所述套组足够大以提供针对训练队列(例如实验队列)的100％灵敏度。也就是说，实验队列中的每个样品都存在一个或多个阳性sRNA预测因子。在此类实施方案中，套组中的sRNA预测因子的存在或不存在提供了(根据定义)针对训练集(即实验队列)的100％特异性和100％灵敏度。在其他实施方案中，sRNA预测因子用于计算分类器算法，包括非自举和/或自举分类算法中。实例包括有监督、无监督、半监督的机器学习模型，诸如参数/非参数距离测量、逻辑回归、支持向量机、决策树、随机森林、神经网络、概率单位回归、费舍尔(Fisher’s)线性判别、朴素贝叶斯分类器(Naive BayesClassifier)、感知器、二次分类器、核估计、k最近邻、学习向量量化和主成分分析。这些分类算法可依赖于除sRNA预测因子以外的其他sRNA的存在和不存在。例如，分类器可依赖于同工型套组(包括但不限于称为“isomiR”的微小RNA同工型)的存在或不存在，其可任选地包括一个或多个sRNA预测因子(即其在sRNA序列数据中被鉴定为疾病病状所独有的)。

可在任何生物样品包括实体组织和/或生物流体中鉴定或检测sRNA。可在动物(例如脊椎动物和无脊椎动物)中，或在一些实施方案中，在培养细胞或培养细胞的培养基中鉴定或检测sRNA。例如，样品可以是来自人或动物受试者(例如哺乳动物受试者)的生物流体样品，诸如血液、血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液。在一些实施方案中，样品是实体组织诸如脑组织。

在各种实施方案中，sRNA的检测涉及各种检测平台中的一种，其可采用逆转录、扩增和/或探针的杂交，包括定量或定性PCR或实时PCR。在一些实施方案中，PCR检测形式可采用茎环引物进行RT-PCR，并且任选地与荧光标记的探针结合。在一些实施方案中，sRNA通过杂交测定或RNA测序(例如NextGen测序)来检测。在一些实施方案中，RNA测序与扩增套组中的sRNA预测因子或其他sRNA的特定引物结合使用。

本发明涉及展示AD症状和体征的细胞或动物(或由其衍生的样品)中的sRNA(诸如isomiR)的检测。在一些实施方案中，本发明涉及包含载脂蛋白E(APOE)的形式APOEε4的细胞或动物(或由其衍生的样品)中的sRNA预测因子的检测。在各种实施方案中，sRNA预测因子的数量和/或身份或其相对量与具有APOEε4等位基因的患者、受试者或细胞的疾病活动相关。在一些实施方案中，sRNA预测因子指示在其他方面被认为是无症状的患者或受试者中的AD生物过程。

在一些实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，其包含2至约100个sRNA预测因子测定，或约5至约75个sRNA预测因子测定，或5至约20个sRNA预测因子测定的套组。在这些实施方案中，所述试剂盒可包含sRNA预测因子测定(例如用于此类测定的试剂)以确定来自表2A、表4A和/或表7A的sRNA预测因子的存在或不存在。此类测定可包含对sRNA预测因子而不是对其他非预测序列具有特异性的逆转录(RT)引物、扩增引物和探针(诸如荧光探针或双重标记的探针)。在一些实施方案中，所述试剂盒呈包含用于通过杂交来检测sRNA预测因子的探针的阵列或其他底物的形式。

在一些方面，本发明提供了用于评估阿尔茨海默氏病活动的样品的试剂盒。在各种实施方案中，所述试剂盒包含被配置用于检测表2A、表4A和/或表7A(SEQ ID NO:1-403)中列出的多个sRNA的sRNA特异性探针和/或引物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含被配置用于检测表2A、表4A和/或表7A(SEQ ID NO:1-403)中列出的至少5个或至少10个或至少20个或至少40个sRNA的sRNA特异性探针和/或引物。

在其他实施方案中，本发明涉及构建基于特定sRNA分子(例如isomiR或其他类型的sRNA)的存在或不存在的疾病分类器。这些疾病分类器是辨别具有类似症状的疾病病状以及确定疾病亚型的强大工具，包括预测疾病的进程、预测对治疗的反应以及疾病监测。通常，将从代表一种或多种感兴趣的疾病病状的一个或多个训练集的序列数据中确定sRNA套组(例如不同的sRNA变体的套组)。sRNA套组和分类器算法可以使用例如有监督、无监督、半监督的机器学习模型，诸如参数/非参数距离测量、逻辑回归、支持向量机、决策树、随机森林、神经网络、概率单位回归、费舍尔线性判别、朴素贝叶斯分类器、感知器、二次分类器、核估计、k最近邻、学习向量量化和主成分分析来构建。一旦分类器被训练，就可通过检测来自受试者的生物样品中的套组中sRNA标志物的存在或不存在，并应用分类算法来评估独立受试者的疾病病状。分类器可以是二元分类器(即在两种病状之间进行分类)，或者可在三种、四种、五种或更多种疾病病状之间进行分类。分类器依赖于套组中sRNA的存在或不存在，而不是辨别sRNA的正常和异常水平。

例如，在一些实施方案中，本发明提供了一种用于评估受试者的一种或多种疾病病状的方法。所述方法包括提供受试者的生物样品，并确定sRNA套组中多个sRNA的存在或不存在。利用疾病分类器，使用“存在和不存在”的sRNA(二元标志物)的这种概况来在两种或多种疾病病状之间对受试者的病状进行分类。将基于一组训练样品中sRNA套组中sRNA的存在和不存在来训练疾病分类器。例如，训练样品被注释为对一种或多种疾病病状呈阳性或阴性(并可被注释出疾病的亚型、等级或治疗方案)，以及套组中sRNA的存在或不存在(并且在一些实施方案中，其水平)。

套组中sRNA的存在或不存在是在训练集中从sRNA序列数据确定的。也就是说，通过修剪3’测序衔接子并且在不将sRNA序列变体整合到参考序列或遗传基因座的情况下，在sRNA序列数据中鉴定单个sRNA序列。例如，在修剪后，编译每种疾病病状或比较病状内的独特序列读数(即，制备每个独特序列的读数计数)。因此，在每种疾病病状下确定特定sRNA序列诸如isomiR的存在或不存在，并且不将这些变体整合到参考序列。这些序列可用作“二元”标志物，也就是说基于其在样品中的存在或不存在进行评估，而不是辨别正常和异常水平。

一旦在序列数据中被鉴定，并被选择包含在计算分类器中，就可制备套组中sRNA的分子检测试剂。此类检测平台包括定量RT-PCR测定，包括采用茎环引物和荧光探针的测定。

本发明的其他方面和实施方案从以下详细描述来看将是显而易见的。

附图说明

图1A-图1D示出了各种IBD类别和对照的ROC/AUC曲线：对照(1A)，克罗恩病(Crohn’s disease)(1B)，溃疡性结肠炎(1C)和憩室病(1D)。

图2示出了一张热图，其显示出准确的多类疾病预测相对于其真实参考身份的比例。

表格的描述

表1A至表1B表征了脑组织样品队列，包括阿尔茨海默氏病(AD)队列(表1A)和包括健康对照与各种其他非阿尔茨海默氏病的神经系统病症对照的对照队列(表1B)。

表2A示出了用于AD的脑组织样品中的sRNA阳性预测因子(SEQ ID NO:1-46)以及读数计数、特异性和灵敏度(例如频率)。表2B示出了脑组织样品中用于AD的阳性预测因子，以及每个样品的生物标志物数量和覆盖百分比。

表3A至表3B表征了脑脊液(CSF)样品队列，包括阿尔茨海默氏病(AD)队列(表3A)和包括健康对照与各种其他非阿尔茨海默氏病的神经系统病症对照的对照队列(表3B)。

表4A示出了用于AD的CSF中的sRNA阳性预测因子(SEQ ID NO:47-254)以及读数计数、特异性和灵敏度(例如频率)。表4B示出了CSF样品中用于AD的阳性预测因子，以及每个样品的生物标志物数量和覆盖百分比。

表5示出了来自CSF的28种鉴定的sRNA生物标志物的套组，所述生物标志物显示出与可用于AD监测的Braak阶段的相关性。

表6A至表6B表征了血清样品队列，包括阿尔茨海默氏病(AD)队列(表6A)和包括健康对照与各种其他非阿尔茨海默氏病的神经系统病症对照的对照队列(表6B)。

表7A示出了用于AD的血清中的sRNA阳性预测因子(SEQ ID NO:255-403)以及读数计数、特异性和灵敏度(例如频率)。表7B示出了血清样品中用于AD的阳性预测因子，以及每个样品的生物标志物数量和覆盖百分比。

表8示出了来自血清的15种鉴定的sRNA生物标志物的套组，所述生物标志物显示出与可用于AD监测的Braak阶段的相关性。

表9示出了用于炎性肠病的对照(“正常”个体)的来自结肠上皮组织的sRNA生物标志物套组。

表10示出了用于克罗恩病的来自结肠上皮组织的sRNA生物标志物套组。

表11示出了用于溃疡性结肠炎的来自结肠上皮组织的sRNA生物标志物套组。

表12示出了用于憩室病的来自结肠上皮组织的sRNA生物标志物套组。

具体实施方式

本公开提供了用于评估阿尔茨海默氏病(AD)活动的方法和试剂盒，包括在经历AD治疗或AD候选治疗的患者中以及在动物和细胞模型中。具体而言，本公开提供了生物标志物(sRNA预测因子)，其是疾病活动的二元预测因子，并且可用于检测和/或评估潜在的疾病过程、疾病等级、进展以及对疗法或候选疗法的反应。生物标志物在药物发现和临床试验的背景下进一步有用，以鉴定可用于治疗AD或AD症状的候选疗法，以及选择患者或对患者分层，并监测疾病的进展或治疗。

在各个方面和实施方案中，本发明涉及检测细胞或生物样品中的阿尔茨海默氏病或阿尔茨海默氏病活动的二元小RNA(sRNA)预测因子。sRNA序列被鉴定为存在于AD实验队列的样品中，而不存在于比较队列中的任何样品中。这些sRNA标志物称为“阳性sRNA预测因子”，并根据定义可提供100％特异性。在一些实施方案中，所述方法还包括检测存在于比较队列的一个或多个样品中并且不存在于实验队列的任何样品中的一个或多个sRNA序列。这些预测因子称为“阴性sRNA预测因子”，并为预测提供了额外的置信度。与检测失调的sRNA(诸如被上调或下调的miRNA)相反，本发明提供了作为用于阿尔茨海默氏病活动的二元预测因子的sRNA。

小RNA物种(“sRNA”)是长度小于200个核苷酸的非编码RNA，并且包括微小RNA(miRNA)(包括iso-miR)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、小干扰RNA(siRNA)、穹窿体RNA(vtRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、转移RNA衍生的小RNA(tsRNA)、核糖体RNA衍生的小RNA片段(rsRNA)、小rRNA衍生的RNA(srRNA)和小核RNA(U-RNA)以及新型的未表征的RNA物种。通常，“iso-miR”是指相对于参考miRNA序列(例如，如miRBase所用)具有变化的那些序列。在miRBase中，每个miRNA与miRNA前体以及一个或两个成熟miRNA(-5p和-3p)相关联。深度测序已检测到miRNA生物发生中的大量变异性，这意味着从同一miRNA前体可产生许多不同的序列。iso-miR有四种主要变化：(1)5’修剪，其中5’裂解位点在参考miRNA序列的上游或下游；(2)3’修剪，其中3’裂解位点在参考miRNA序列的上游或下游；(3)3’核苷酸添加，其中核苷酸加入到参考miRNA的3’末端；以及(4)核苷酸取代，其中核苷酸从miRNA前体中改变。

2018年1月23日提交的U.S.2018/0258486和2018年1月23日提交的PCT/US2018/014856(所述专利的全部内容以引用的方式整体并入本文)公开了用于鉴定sRNA预测因子的方法。所述方法包括从RNA测序数据中对3’衔接子进行计算修剪，并根据独特的序列读数对数据进行分选。

在一些实施方案中，本发明提供了用于评估阿尔茨海默氏病(AD)活动的方法。所述方法包括提供来自表现出AD的症状和体征的受试者或患者的细胞或生物样品，或提供从其中提取的RNA，并且确定细胞或样品中一个或多个sRNA预测因子的存在或不存在。一个或多个sRNA预测因子的存在指示阿尔茨海默氏病活动。

术语“阿尔茨海默氏病活动”是指(直接或间接)导致AD症状以及认知、行为和/或运动技能和协调能力总体下降的活动性疾病过程。术语阿尔茨海默氏病活动可进一步指受影响细胞的相对健康。在一些实施方案中，AD活动指示神经元活力。

阳性sRNA预测因子包括来自表2A、表4A或表7A(SEQ ID NO:1-403)的一个或多个sRNA预测因子。本文公开的序列显示为逆转录DNA序列。例如，阳性sRNA预测因子可包括如脑组织样品的序列数据中所鉴定的来自表2A(SEQ ID NO:1-46)的一个或多个sRNA预测因子，其指示AD和/或AD阶段。在一些实施方案中，阳性sRNA预测因子包括如CSF样品的序列数据中所鉴定的来自表4A(SEQ ID NO:47至154)的一个或多个sRNA预测因子，其指示AD和/或AD阶段。在一些实施方案中，阳性sRNA预测因子包括如血清样品的序列数据中所鉴定的来自表7A(SEQ ID NO:155-403)的一个或多个，其指示AD和/或AD阶段。

具体而言，表2A和表2B示出了如脑组织样品中所鉴定的用于AD的sRNA阳性预测因子。这些sRNA预测因子存在于一个AD脑组织样品的队列(作为实验组)中，但不存在于任何比较组样品中，所述比较组样品由非疾病样品以及各种其他非阿尔茨海默氏病的神经系统疾病样品组成。表2A示出了用于AD的阳性预测因子，无论Braak阶段如何。阳性预测因子各自对队列中AD的存在提供100％特异性。表2A和表2B示出了AD脑组织样品中阳性预测因子的平均读数计数。在一些实施方案中，样品中存在的预测因子的数量与AD的Braak阶段直接相关。

表4A和表4B示出了如脑脊液(CSF)样品中所鉴定的用于AD的sRNA阳性预测因子。这些sRNA预测因子存在于一个AD CSF样品的队列(作为实验组)中，但不存在于任何比较组样品中，所述比较组样品由健康样品以及各种其他非阿尔茨海默氏病的神经系统疾病样品组成。表4A示出了用于AD的阳性预测因子，无论Braak阶段如何。阳性预测因子各自对队列中AD的存在提供100％特异性。表4A和表4B示出了AD CSF样品中阳性预测因子的平均读数计数。在一些实施方案中，样品中存在的预测因子的数量与AD的Braak阶段直接相关。

表7A和表7B示出了如血清样品中所鉴定的用于AD的sRNA阳性预测因子。这些sRNA预测因子存在于一个AD血清样品的队列(作为实验组)中，但不存在于任何比较组样品中，所述比较组样品由健康样品以及各种其他非阿尔茨海默氏病的神经系统疾病样品组成。表7A示出了用于AD的阳性预测因子，无论Braak阶段如何。阳性预测因子各自对队列中AD的存在提供100％特异性。表7A和表7B示出了AD血清样品中阳性预测因子的平均读数计数。在一些实施方案中，样品中存在的预测因子的数量与AD的Braak阶段直接相关。

在各种实施方案中，确定至少五个sRNA的存在、不存在或水平，包括阳性和阴性预测因子以及其他可能的对照。在一些实施方案中，确定至少8个sRNA或至少10个sRNA或至少约50个sRNA的存在或不存在。在一些实施方案中，确定的sRNA的总数小于约1000个或小于约500个，或小于约200个，或小于约100个，或小于约50个。因此，可使用许多特定的分子检测测定来确定sRNA的存在、不存在或水平。

在一些实施方案中，确定来自表2A、表4A和/或表7A(SEQ ID NO:1-403)的至少2个或至少5个或至少10个sRNA的存在、不存在或水平。在一些实施方案中，还确定了至少一个阴性sRNA预测因子的存在、不存在或水平。在一些实施方案中，确定包含来自表2A的阳性预测因子的sRNA套组，并且所述套组可包含来自表2A的至少2个、至少5个、至少10个或至少20个sRNA。在一些实施方案中，所述套组包含来自表2A的所有sRNA。在一些实施方案中，确定包含来自表4A的阳性预测因子的sRNA套组，并且所述套组可包含来自表4A的至少2个、至少5个、至少10个或至少20个sRNA。在一些实施方案中，所述套组包含来自表4A的所有sRNA。在一些实施方案中，确定包含来自表7A的阳性预测因子的sRNA套组，并且所述套组可包含来自表7A的至少2个、至少5个、至少10个或至少20个sRNA。在一些实施方案中，所述套组包含来自表7A的所有sRNA。

在一些实施方案中，一个或多个(或所有)阳性sRNA预测因子各自存在于实验队列中的至少约10％的AD样品中，或实验队列中的至少约20％的AD样品中，或实验队列中至少约30％的AD样品中，或实验队列中至少约40％的AD样品中。在一些实施方案中，鉴定的预测因子的身份和/或数量与活动性疾病过程(例如Braak阶段)相关。例如，样品对于表2A、表4A和/或表7A中的至少1、2、3、4或5个sRNA预测因子可呈阳性，这表明来自脑组织、CSF和/或血清样品的疾病，并且更严重或晚期的疾病过程与表4A或表7A中的约10个或至少约15个或至少约20个sRNA预测因子相关。在一些实施方案中，确定表4A或表7A中的sRNA预测因子的绝对水平(例如测序读数计数)或相对水平(例如使用定性分析诸如实时PCR)，其可与Braak阶段相关。

在一些实施方案中，对于阳性sRNA预测因子的存在测试为阴性的样品，对于至少1个，或至少约5个，或至少约10个，或至少约20个，或至少约30个，或至少约40个，或至少约50个，或至少约100个阴性sRNA预测因子测试为阳性。阴性预测因子可对健康个体或其他疾病状态(诸如PD或痴呆)具有特异性。对AD测试为阳性的个体通常将不会对任何阴性预测因子的存在测试为阳性。

通常，至少1、2、3、4或5个阳性预测因子的存在，以及所有阴性预测因子的不存在可预测AD活动。在一些实施方案中，在样品中检测到5至约100个或约5至约60个sRNA预测因子的套组。虽然并非每个实验样品都对每个阳性预测因子呈阳性，但所述套组足够大，从而对AD队列中的病状提供至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％覆盖。通过选择其中实验队列的每个样品中存在多个sRNA预测因子的套组，将对所述套组加以调整，以对训练样品(实验队列和比较队列)提供100的灵敏度和100的特异性。

在各种实施方案中，sRNA预测因子的检测涉及各种检测平台中的一种，其可采用逆转录、扩增和/或探针的杂交，包括定量或定性PCR或实时PCR。在一些实施方案中，PCR检测形式可采用茎环引物进行RT-PCR，并且任选地与荧光标记的探针结合。在一些实施方案中，sRNA通过RNA测序与对3’测序衔接子进行计算修剪来检测。测序可采用对二元预测因子最多使用一种特异性引物进行的逆转录和/或扩增。

通常，实时聚合酶链反应(qPCR)在PCR期间(即实时)监测靶标DNA分子的扩增。实时PCR可定量和半定量使用。实时PCR中检测PCR产物的两种常见方法是：(1)插入任何双链DNA的非特异性荧光染料(例如SYBR绿(I或II)或溴化乙锭)，以及(2)由使用荧光报告分子标记的寡核苷酸组成的序列特异性DNA探针，只有在探针与其互补序列杂交后，所述荧光报告分子才允许进行检测(例如TAQMAN)。

在一些实施方案中，测定形式是TAQMAN实时PCR。TAQMAN探针是水解探针，其旨在提高定量PCR的特异性。TAQMAN探针的原理依赖于使用基于荧光团的检测，Taq聚合酶在双重标记探针与互补靶序列杂交期间裂解该双重标记探针的5′至3′核酸外切酶活性。TAQMAN探针使用荧光团和淬灭剂进行双重标记，并且当荧光团通过Taq核酸外切酶活性从寡核苷酸探针上被裂解时，检测到荧光团信号(例如信号不再因标记的邻近而淬灭)。与其他定量PCR方法一样，所得的荧光信号允许定量测量PCR指数阶段期间产物的积累。TAQMAN探针形式提供检测的高灵敏度和特异性。

在一些实施方案中，使用特异性引物例如茎环引物来询问sRNA的一个或两个末端，将存在于样品中的sRNA预测因子转化为cDNA。然后可例如通过检测来自荧光报告分子的信号来实时定量cDNA的扩增，其中信号强度与每个扩增循环时的DNA水平相关。

可替代地，通过杂交来检测套组中的sRNA预测因子或其扩增子。示例性平台包括表面等离子体共振(SPR)和微阵列技术。在一些实施方案中，检测平台可使用微流控，以方便样品处理和sRNA检测。

通常，可采用确定样品中sRNA的存在的任何方法。此类方法还包括基于核酸序列的扩增(NASBA)、基于皮瓣核酸内切酶的测定，以及使用分支DNA(QuantiGene^TM)、HybridCapture^TM(Digene)或nCounter^TM miRNA检测(nanostring)的直接RNA捕获。除了确定miRNA和其他sRNA的存在以外，测定形式还可提供尤其是对固有信号强度变化的对照。此类对照可包括例如用于背景信号强度和/或样品处理和/或杂交效率的对照，以及用于检测患者样品中sRNA的其他期望对照(例如，统称为“归一化对照”)。

在一些实施方案中，测定形式是基于皮瓣核酸内切酶的形式，诸如Invader^TM测定(Third Wave Technologies)。在使用侵入方法的情况下，制备包含对模板靶位点3’区具有特异性的序列的侵入探针，以及包含对模板靶位点5’区具有特异性的序列和不相关的皮瓣序列的初级探针。然后允许裂解酶在这些探针、靶分子以及包含与皮瓣序列互补的序列和使用荧光染料与淬灭剂两者标记的自互补序列的FRET探针的存在下起作用。当初级探针与模板杂交时，侵入探针的3’末端穿透靶位点，并且此结构被裂解酶裂解，从而导致皮瓣解离。皮瓣与FRET探针结合，并且荧光染料部分被裂解酶裂解，从而导致荧光发射。

在一些实施方案中，在用于检测的sRNA处理之前从样品中提取RNA。可使用多种标准程序纯化RNA，如例如RNA Methodologies,Alaboratory guide for isolation andcharacterization,第2版,1998,Robert E.Farrell,Jr.编,Academic Press中所述。此外，有各种可商购获得的用于分离小分子量RNA的方法与产品，包括mirVANA^TM Paris miRNA分离试剂盒(Ambion)、miRNeasy^TM试剂盒(Qiagen)、MagMAX^TM试剂盒(Life Technologies)和Pure Link^TM试剂盒(Life Technologies)。例如，可通过有机提取、然后在玻璃纤维过滤器上纯化来分离小分子量RNA。用于分离miRNA的替代方法包括与磁珠杂交。可替代地，可在生物流体样品中进行用于检测的miRNA处理(例如cDNA合成)，也就是说，无需RNA提取步骤。

在一些实施方案中，在受试者样品中通过核酸测序来确定sRNA的存在或不存在，并且通过包括从单个sRNA序列中计算修剪3′测序衔接子的方法来鉴定单个sRNA。参见2018年1月23日提交的U.S.2018/0258486和2018年1月23日提交的PCT/US2018/014856，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，测序方法可使用对生物标志物具有特异性的引物逆转录和/或扩增sRNA预测因子。

通常，可构建测定，使得每种测定对sRNA(例如iso-miR)而不是对带注释序列和/或其他非预测性iso-miR和sRNA，具有至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％或至少98％特异性。带注释序列可参考miRBase来确定。例如，在制备sRNA预测因子特异性实时PCR测定时，可制备PCR引物和荧光探针并测试其特异性水平。可在探针中采用双环核苷酸或涉及2’位置的其他修饰(例如LNA、cET和MOE)或其他核苷酸修饰(包括碱基修饰)，以提高检测的灵敏度或特异性。US 2018/0258486中公开了isomiR和sRNA的特异性检测，所述专利以引用的方式整体并入本文。

可在任何生物样品包括实体组织和/或生物流体中鉴定sRNA预测因子。可在动物(例如脊椎动物和无脊椎动物受试者)中，或在一些实施方案中，在培养细胞或培养细胞的培养基中鉴定sRNA预测因子。例如，样品是来自人或动物受试者(例如哺乳动物受试者)的生物流体样品，诸如血液、血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液。由于可在细胞间信号传导中发挥重要作用的分泌机制，因此可在生物流体中发现miRNA。参见Kosaka N等,Circulating microRNA in body fluid:a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis,Cancer Sci.2010；101:2087-2092)。根据常规方法对来自脑脊液和血清的miR进行了分析，目的是针对疾病状态和病理特征对患者分层。Burgos K等,Profiles of Extracellular miRNA in Cerebrospinal Fluid and Serum from Patients with Alzheimer’s and Parkinson’s Diseases Correlate with Disease Status and Features of Pathology,PLOS ONE第9卷,第5期(2014)。在一些实施方案中，样品是实体组织样品，其可包含神经元。在一些实施方案中，组织样品是脑组织样品，诸如来自额叶皮质区。在一些实施方案中，在至少两种不同类型的样品中鉴定sRNA预测因子，所述样品包括脑组织和诸如血液的生物流体。在一些实施方案中，在至少三种不同类型的样品中鉴定sRNA预测因子，所述样品包括脑组织、脑脊液(CSF)和血液。

本发明涉及在表现出阿尔茨海默氏病基因型或表型的细胞或动物中检测sRNA预测因子。在一些实施方案中，sRNA预测因子指示在其他方面被认为是非阿尔茨海默氏病患者或受试者的患者或受试者中的AD生物过程。在一些实施方案中，sRNA预测因子指示AD的特定Braak阶段。

在一些实施方案中，sRNA预测因子指示阿尔茨海默氏病过程的Braak I和/或II阶段。Braak I/II阶段是指大脑的跨内嗅区(颞叶)区域在AD进展过程中产生嗜银神经元纤维缠结和神经纤维网线(neurophil thread)。已知Braak I/II阶段在AD过程中此时是临床上无症状的。

在一些实施方案中，sRNA预测因子指示阿尔茨海默氏病过程的Braak III和/或IV阶段。Braak III/IV阶段是指大脑的边缘区域在AD进展过程中产生嗜银神经元纤维缠结和神经纤维网线。已知Braak III/IV阶段在AD过程中此时是初期阿尔茨海默氏病。

在一些实施方案中，sRNA预测因子指示阿尔茨海默氏病过程的Braak V和/或VI阶段。Braak V/VI阶段是指大脑的新皮质区域在AD进展过程中产生嗜银神经元纤维缠结和神经纤维网线。已知Braak V/VI阶段在AD过程中此时是完全发展的阿尔茨海默氏病。

在一些实施方案中，重复所述方法以确定随时间推移的sRNA预测因子概况，例如，以确定治疗方案或候选治疗方案的影响。例如，可以每年至少约一次，或每六个月至少约一次，或每月至少一次，或每周至少一次的频率对受试者或患者进行评估。在一些实施方案中，随时间推移存在的预测因子的数量的减少，或随时间推移检测到的预测因子的数量的增加变慢指示疾病进展变慢或疾病症状变轻。本发明的实施方案可用于构建AD治疗的动物模型，并且可用作人临床试验中的生物标志物。

在一些方面，本发明提供了用于评估阿尔茨海默氏病活动的样品的试剂盒。在各种实施方案中，所述试剂盒包含被配置用于检测表2A、表4A和/或表7A(SEQ ID NO:1-403)中列出的多个sRNA的sRNA特异性探针和/或引物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含被配置用于检测表2A、表4A和/或表7A(SEQ ID NO:1-403)中列出的至少2个、至少5个或至少10个或至少20个或至少40个sRNA的sRNA特异性探针和/或引物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含被配置用于检测表2A(SEQ ID NO:1-46)中列出的至少2、3、4、5个或至少10个或至少20个sRNA的sRNA特异性探针和/或引物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含被配置用于检测表4A(SEQ ID NO:47-254)中列出的至少2、3、4、5个或至少10个或至少20个或至少40个sRNA的sRNA特异性探针和/或引物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含被配置用于检测表7A(SEQ ID NO:255-403)中列出的至少2、3、4、5个或至少10个或至少20个sRNA的sRNA特异性探针和/或引物。

所述试剂盒可包含适用于定量或定性PCR测定，即用于特定sRNA预测因子的探针和/或引物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含荧光染料或荧光标记的探针，其可任选地包含淬灭剂部分。在一些实施方案中，所述试剂盒包含茎环RT引物，并且在一些实施方案中，可包含茎环引物以询问每个sRNA末端。在一些实施方案中，所述试剂盒可包含一系列sRNA特异性杂交探针。

在一些实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，其包含用于检测5至约100个sRNA预测因子，或约5至约50个sRNA预测因子，或5至约20个sRNA的套组的试剂。在这些实施方案中，所述试剂盒可包含至少5个、至少10个、至少20个sRNA预测因子测定(例如用于此类测定的试剂)。在各种实施方案中，所述试剂盒包含至少10个阳性预测因子和至少5个阴性预测因子。在一些实施方案中，所述试剂盒包含至少5个，或至少10个，或至少20个，或至少40个sRNA预测因子测定的套组，所述sRNA预测因子选自表2A、表4A和/或表7A。在一些实施方案中，至少1个sRNA预测因子选自表4B或表7B。此类测定可包含对sRNA预测因子而不是对带注释序列以及其他(非预测)变化具有特异性的逆转录(RT)引物、扩增引物和探针(诸如荧光探针或双重标记的探针)。在一些实施方案中，所述试剂盒呈包含用于通过杂交来检测sRNA预测因子的探针的阵列或其他底物的形式。

在其他实施方案中，本发明涉及构建基于特定sRNA分子的存在或不存在对样品分类的疾病分类器。这些疾病分类器是辨别具有类似症状的疾病病状以及确定疾病亚型的强大工具，包括预测疾病的进程、预测对治疗的反应以及疾病监测。通常，将从代表一种或多种感兴趣的疾病病状的一个或多个训练集的序列数据中确定sRNA套组(例如不同的sRNA变体的套组)。sRNA套组和分类器算法可以使用例如有监督、无监督、半监督的机器学习模型，诸如参数/非参数距离测量、逻辑回归、支持向量机、决策树、随机森林、神经网络、概率单位回归、费舍尔线性判别、朴素贝叶斯分类器、感知器、二次分类器、核估计、k最近邻、学习向量量化和主成分分析中的一种或多种来构建。一旦分类器被训练，就可通过检测来自受试者的生物样品中的套组中sRNA标志物的存在或不存在，并应用分类算法来评估独立受试者的疾病病状。分类器可以是二元分类器(即在两种病状之间进行分类)，或者可在三种、四种、五种或更多种疾病病状之间进行分类。在一些实施方案中，分类器可在至少十种疾病病状之间进行分类。

例如，在一些实施方案中，本发明提供了一种用于评估受试者的一种或多种疾病病状的方法。所述方法包括提供受试者的生物样品，并确定sRNA套组中多个sRNA的存在或不存在。利用疾病分类器，使用“存在和不存在”的sRNA(二元标志物)的这种概况来在两种或多种疾病病状之间对受试者的病状进行分类。将基于一组训练样品中sRNA套组中sRNA的存在和不存在来训练疾病分类器。例如，训练样品被注释为对一种或多种疾病病状呈阳性或阴性，以及套组中sRNA的存在或不存在(或水平)。在一些实施方案中，样品被注释出疾病等级或阶段、疾病亚型、治疗方案和药物敏感性或耐药性中的一种或多种。

套组中sRNA的存在或不存在是在训练集中从sRNA序列数据确定的。也就是说，通过修剪5’和/或3’测序衔接子并且在不将sRNA序列变体整合到参考序列或遗传基因座的情况下，在sRNA序列数据中鉴定单个sRNA序列。例如，在修剪后，每个样品和疾病病状或比较病状内的独特序列读数各自被编译。因此，在每个样品中并且针对每种疾病病状确定特定sRNA序列诸如同工型的存在或不存在，并且不将这些变体整合到参考序列。这些序列可用作“二元”标志物，也就是说基于其在样品中的存在或不存在进行评估，而不是辨别正常和异常水平。

在一些实施方案中，在分类器的构建过程中，预选sRNA用于训练。例如，可鉴定sRNA家族，其中变化在疾病病状中增加和/或随着疾病病状的严重性而增加，和/或变化可响应于治疗方案而正常化或得到改善。例如，sRNA预选择可涉及基于生物学相关序列超特征(例如，从sRNA同工型5’末端的“种子序列”核苷酸2-8，和/或单核苷酸多态性)，在上限和下限阈值之外将sRNA同工型(诸如isomiR)分组为“家族”，其中下限阈值为每百万读数0至100个修剪读数，并且上限阈值为每百万读数0至100个修剪读数。对于与疾病活动相关的变化，评估这些家族，并选择这些整个家族或具有读数计数高于或低于阈值的变化作为包含在分类器中的候选。在一些实施方案中，这些家族包含至少一个sRNA预测因子，其在至少一种所述疾病病状中是独特的。

一旦在序列数据中被鉴定，并被选择包含在计算分类器中，就可制备套组中sRNA的分子检测试剂。此类检测平台包括定量RT-PCR测定，包括采用茎环引物和荧光探针的测定，如本文所述。在一些实施方案中，通过sRNA测序来评估独立样品，而不是迁移到分子检测平台。

sRNA套组(例如用于分类的二元sRNA标志物)可包含约4至约200个sRNA，或在一些实施方案中，约4至约100个sRNA。在一些实施方案中，sRNA套组包含约10至约100个sRNA，或约10至约50个sRNA。

分类器可在各种类型的样品，包括实体组织样品、生物流体样品或一些实施方案中为培养的细胞上进行训练。当评估受试者时，评估其sRNA的生物样品可包括生物流体，诸如血液、血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液。可替代地，受试者的生物样品是实体组织活检样品。

在各种实施方案中，训练集具有至少50个样品，或至少100个样品，或至少200个样品。在一些实施方案中，训练集包括每种疾病病状的至少10个样品，或每种疾病病状的至少20个或至少50个样品。数量更多的样品可提供更好的统计能力。

根据本公开的疾病分类器可被构建用于各种类型的疾病病状。例如，在一些实施方案中，疾病病状是中枢神经系统疾病。此类疾病可包括至少两种涉及痴呆症状的神经退行性疾病。在一些实施方案中，至少两种疾病病状选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病(Huntington’s Disease)、轻度认知障碍、进行性核上性麻痹、额颞痴呆、路易体痴呆和血管性痴呆。可替代地，至少两种疾病病状是涉及运动控制丧失的症状的神经退行性疾病，诸如帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿氏病、多发性硬化和脊髓性肌萎缩。在其他实施方案中，至少两种疾病病状是脱髓鞘疾病，任选地包括多发性硬化、视神经炎、横贯性脊髓炎和视神经脊髓炎。

因此，在一些实施方案中，至少一种疾病病状选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化和脊髓性肌萎缩；并且训练样品被注释出疾病阶段、疾病严重性、药物反应性或疾病进展过程。

在其他实施方案中，疾病病状是不同组织或细胞起源的癌症。在一些实施方案中，疾病病状是药物敏感性与耐药性癌症，或对两种或更多种治疗剂的灵敏度。在此类实施方案中，来自受试者的生物样品可以是肿瘤或癌细胞活检样品。

在一些实施方案中，疾病病状是炎性或免疫性疾病，并任选地包括系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、自身免疫性血管炎、糖尿病(1型或2型)、格雷夫斯病(Grave’s disease)、艾迪生氏病(Addison’s disease)、干燥综合征、甲状腺炎、类风湿性关节炎、重症肌无力、多发性硬化、纤维肌痛、银屑病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、憩室病和乳糜泻中的一种或多种。例如，分类器可区分胃肠炎性病状，诸如但不限于克罗恩病、溃疡性结肠炎和憩室病。在此类实施方案中，来自待测试受试者的生物样品可以是生物流体样品，诸如血液、血清或血浆，或者可以是活检组织，诸如结肠上皮组织。

在一些实施方案中，疾病病状是心血管疾病，任选地包括针对急性事件风险的分层。在一些实施方案中，心血管疾病包括以下中的一种或多种：冠状动脉疾病(CAD)、心肌梗塞、中风、充血性心力衰竭、高血压性心脏病、心肌病、心律失常、先天性心脏病、瓣膜性心脏病、心脏炎、主动脉瘤、外周动脉疾病和静脉血栓形成。

在各种实施方案中，套组中的至少一个，或至少两个，或至少五个，或至少十个sRNA是阳性sRNA预测因子。也就是说，阳性sRNA预测因子被鉴定为存在于训练集中被注释为对疾病病状呈阳性的多个样品中，并且不存在于训练集中被注释为对疾病病状呈阴性的所有样品中。在一些实施方案中，关于包括阿尔茨海默氏病作为疾病病状的疾病分类器，sRNA套组可包括来自表2A、表4A和/或表7A(SEQ ID NO:1-403)的一个或多个，或两个或更多个，或五个或更多个，或十个或更多个sRNA。

在一些实施方案中，sRNA套组包括来自表2A(SEQ ID NO:1至46)的一个或多个sRNA预测因子。在一些实施方案中，sRNA套组包括来自表4A(SEQ ID NO:47-254)的一个或多个sRNA预测因子。在一些实施方案中，sRNA套组包括来自表4A(SEQ ID NO:255-403)的一个或多个sRNA预测因子。在一些实施方案中，sRNA套组包括来自表5(SEQ ID NO:58、189、78、172、193、97、122、215、248、164、120、93、126、253、112、144、213、244、123、222、150、240、52、220、221、169、165和212)的一个或多个sRNA预测因子，它们与CSF中AD进展的Braak阶段相关。在一些实施方案中，sRNA套组包括来自表8(SEQ ID NO:257、270、272、273、279、286、288、314、319、325、332、341、374、391和393)的一个或多个sRNA，它们与血清中AD进展的Braak阶段相关。

本发明的其它方面和实施方案从以下实施例来看将是显而易见的。

实施例

实施例1：在脑组织、脑脊液或血清的实验组或比较组中鉴定用于阿尔茨海默氏病 的二元分类器。

为了鉴定用于阿尔茨海默氏病的二元小RNA预测因子，从GEO和dbGaP数据库下载小RNA测序数据，并将其用作发现集(Discovery Set)(表1A-表1B：脑样品，表3A-表3B：CSF样品和表6A-表6B：SER样品)。所有样品，无论是何材料，均来源于事后验证的阿尔茨海默氏病或非阿尔茨海默氏病样品(健康对照或其他非阿尔茨海默氏病相关神经系统疾病，诸如帕金森氏病、帕金森氏病痴呆、亨廷顿氏病等)。

总体过程描述如下：

诊断样品材料样品数(N)

CSF＝脑脊液，SER＝血清。

使用Centos的SRA工具套件v2.8.0将文件从.sra转换为.fastq格式，并如2018年1月23日提交的U.S.2018/0258486和国际申请号PCT/US2018/014856(以引用的方式整体并入本文)中所述处理.fastq格式的文件。具体而言，所有的.fastq数据文件都通过使用(Regex)基于正则表达式的搜索和修剪算法的修剪衔接子序列进行处理，其中输入5’TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAA 3’(SEQ ID NO:404)(包含多达15个核苷酸的3’末端截短)以鉴定3’衔接子序列，并且莱文斯坦距离为2或汉明距离为5。Regex搜索的参数要求用户指定的搜索术语的第1个核苷酸相对于核苷酸插入、缺失和/或交换不发生变化。

将样品编入2组中的1组，即实验组或比较组。sRNA-Split鉴定实验组或比较组独特的小RNA，以及实验组和比较组中均存在的小RNA。实验组或比较组独特的小RNA具有100％特异性(根据定义)。独特的(二元)小RNA充当它们被鉴定的组的分类器。二元小RNA分类器可用于非自举和/或自举计算分类算法(例如有监督、无监督、半监督的机器学习模型，诸如参数/非参数距离测量、逻辑回归、支持向量机、决策树、随机森林、神经网络、概率单位回归、费舍尔线性判别、朴素贝叶斯分类器、感知器、二次分类器、核估计、k最近邻、学习向量量化和主成分分析等)，并且其还可用作定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)的靶标。

通过使用sRNA-Split分析修剪的小RNA读数来鉴定二元小RNA分类器。将修剪读数转换为每百万读数的修剪读数。过滤生物标志物，使得每个样品至少需要有1个标志物才提供覆盖。为了鉴定与Braak阶段相关的生物标志物，小RNA必须存在于至少3个连续的Braak阶段中，并且皮尔逊(Pearson)相关系数≥0.75。

包含二元小RNA预测因子(存在于实验组的样品中，但不存在于比较组的任何样品中)的特异性生物标志物套组鉴定如下：

(1)AD与非AD

(A)脑组织(表2)

(B)CSF(表4)

(C)血清(表7)

(2)阿尔茨海默氏病监测

(A)CSF(表5)

(B)血清(表8)

使用卡方(Chi-Square)2x2列联表和单尾费舍尔(Fisher’s)精确概率检验，计算每个单独的二元小RNA预测因子的概率分数(p值)。

使用卡方2x2列联表和单尾费舍尔精确概率检验(均给出100％特异性和100％灵敏度)，计算每个实验组的二元小RNA预测因子套组的概率分数(p值)。

实施例2：炎性肠病(IBD)的多类疾病分类器的构建。

为了构建基于特定sRNA分子的存在或不存在对IBD样品进行分类的疾病分类器，从代表感兴趣的不同疾病病状(诸如克罗恩病、溃疡性结肠炎和憩室病)的各种训练集的序列数据中确定sRNA套组。

样品

所有样品都根据其各自的机构审查委员会(IRB)的批准进行收集，并征得患者同意用于无限制使用。从电子病历和图表审查中收集数据。临床数据包括以下信息：诸如年龄、性别、种族、民族、体重、体重指数、吸烟史、饮酒史、疾病家族史。疾病相关的数据包括以下信息：诸如诊断、炎性肠病(IBD)诊断时的年龄、目前和先前的药物治疗、合并症、直肠结肠切除术和回肠储袋肛管吻合术(IPAA)时的年龄以及储袋年龄、从回肠造口术闭合或储袋手术(适用时，从患者经历这些手术)开始的时间。

活检样品取自结肠上皮。根据临床、内窥镜、组织学和影像学研究对不可手术的溃疡性结肠炎(IUC)、可手术的溃疡性结肠炎(OUC)、克罗恩病(CD)、憩室病(DD)、息肉/息肉病(PP)、锯齿状息肉/息肉病(SPP)、结肠癌(CC)、直肠癌(RC)进行定义。进一步的纳入标准是CD患者存在回肠炎以及通过内窥镜检查看到末端回肠正常，并通过IUC患者的组织学证实。需要结肠镜检查以进行常规筛查并通过内窥镜检查和/或组织学证实其肠组织未患病的个体被标记为正常对照。

所有活检样品均由至少两(2)名经过IBD训练的机构病理学家进行评估，并根据临床和行业标准诊断方案提供共识分数和诊断。简而言之，根据中性粒细胞浸润(0–3)和溃疡面积(0–3)对活动性炎症特征进行评分，将每个样品分为非活动性、隐性炎、隐窝脓肿、大量隐窝脓肿(>3/高倍视野)和溃疡。将原始吉布斯(Geboes)分数(OGS)或简化吉布斯分数(SGS)用于对UC进行分类。将克罗恩病活动指数(CDAI)和克罗恩病内窥镜严重性指数(CDEIS)用于对CD分类。将辛奇(Hinchey)分类用于表征DD。根据结直肠癌(CRC)多学科工作组的最新建议对结直肠癌、息肉和锯齿状息肉进行分类。

所使用IBD样品的概述展示如下：

诊断正常克罗恩病溃肠疡性炎结憩室病

为了鉴定用于与IBD相关的疾病类别的小RNA预测因子，从GEO数据库中下载小RNA测序数据，并将其用作发现集。从用于克罗恩病(GSE66208)、溃疡性结肠炎(GSE114591)、憩室病(GSE89667)和正常/对照(GSE118504)的Geo数据库(Geodatabase)研究中下载小RNA测序数据。

使用Centos的SRA工具套件v2.8.0将文件从.sra转换为.fastq格式，并如2018年1月23日提交的U.S.2018/0258486和国际申请号PCT/US2018/014856(以引用的方式整体并入本文)中所述处理.fastq格式的文件。具体而言，所有的.fastq数据文件都通过使用(Regex)基于正则表达式的搜索和修剪算法的修剪衔接子序列进行处理，其中输入5’TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAA 3’(SEQ ID NO:404)(包含多达15个核苷酸的3’末端截短)以鉴定3’衔接子序列，并且莱文斯坦距离为2或汉明距离为5。Regex搜索的参数要求用户指定的搜索术语的第1个核苷酸相对于核苷酸插入、缺失和/或交换不发生变化。

将样品编入2组中的1组，即实验组或比较组。sRNA-Split鉴定实验组或比较组独特的小RNA，以及实验组和比较组中均存在的小RNA。实验组或比较组独特的小RNA具有100％特异性(根据定义)。独特的(二元)小RNA充当它们被鉴定的组的分类器。二元小RNA分类器可用于非自举和/或自举计算分类算法(例如有监督、无监督、半监督的机器学习模型，诸如参数/非参数距离测量、逻辑回归、支持向量机、决策树、随机森林、神经网络、概率单位回归、费舍尔线性判别、朴素贝叶斯分类器、感知器、二次分类器、核估计、k最近邻、学习向量量化和主成分分析等)，并且其还可用作定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)的靶标。

通过使用sRNA-Split分析修剪的小RNA读数来鉴定二元小RNA分类器。将修剪读数转换为每百万读数的修剪读数。过滤生物标志物，使得每个样品至少需要有1个标志物才提供覆盖。

每类指标

为每个类别确定每类指标，以鉴定对于鉴定疾病类别最重要的标志物。从代表感兴趣的不同疾病病状的各种训练集的序列数据中确定sRNA套组。包含疾病类别的小RNA预测因子的特异性生物标志物套组鉴定如下：

·对照(健康个体/“正常”个体)：表9；

·克罗恩病：表10；

·溃疡性结肠炎：表11；以及

·憩室病：表12。

通过使用有监督的、非参数的、逻辑回归机器学习模型，将最终选择标志物计数从128个减少到最多100个。为了评估分类模型的性能，对于每类鉴定的每组标志物获得ROC/AUC曲线，其中ROC是概率曲线，并且AUC代表可分离性的程度或量度。ROC曲线以真阳性率对假阳性率作图。如上所讨论，为各种IBD类别和对照建立ROC/AUC曲线，并且这些曲线描绘在图1中。

多类疾病分类

基于sRNA套组的阳性或阴性标志物以及用于对照、克罗恩病、溃疡性结肠炎和憩室病的上文鉴定的套组中sRNA的存在或不存在，对疾病分类器进行训练。为了在将类别指标全部组合在一起时评估计算模型的准确性，运行测试以针对每个类别的参考样品评估模型的鉴定预测能力。发现所述模型的准确率为98％。图2示出了一张热图，其显示出疾病类别的准确预测相对于其真实参考身份的比例。这些结果也显示在下文的矩阵中：

参考文献

1.Santa-Maria I，Alaniz ME，Renwick N，Cela C et al.Dysregulation ofmicroRNA-219promotes neurodegeneration through post-transcriptionalregulation of tau.J Clin Invest 2015Feb；125(2)：681-6.PMID：25574843

2.Lau P，Bossers K，Janky R，Salta E et al.Alteration ofthe microRNAnetwork during the progression of Alzheimer′s disease.EMBO Mol Med 2013Oct；5(10)：1613-34PMID：24014289

3.Hébert SS，Wang WX，Zhu Q，Nelson PT.A study of small RNAs fromcerebral neocortex of pathology-verified Alzheimer′s disease，dementia withlewy bodies，hippocampal sclerosis，frontotemporal lobar dementia，and non-demented human controls.J Alzheimers Dis 2013；35(2)：335-48.PMID：23403535

4.Hoss AG，Labadorf A，Beach TG，Latourelle JC et al.microRNA Profilesin Parkinson′s Disease Prefrontal Cortex.Front Aging Neurosci 2016；8：36PMID：269735I1

5.Hoss AG，Labadorf A，Latourelle JC，Kartha VK et al.miR-10b-5pexpression in Huntington′s disease brain relates to age of onset and theextent of striatal involvement.BMC Med Genomics 2015Mar 1；8：10.PMID：25889241

6.Burgos K，Malenica I，Metpally R，Courtright A，et al.Profiles ofextraceIlular miRNA in cerebrospinal fluid and serum from patients withAlzheimer′s and Parkinson′s diseases correlate with disease status andfeatures of pathology.PLoS One.2014；9(5)：e94839.PMID：24797360

Claims (90)

1.一种用于评估受试者中的阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括：

提供来自表现出一种或多种阿尔茨海默氏病症状的受试者的生物样品，或提供从所述样品中提取的RNA，

确定所述样品中一个或多个阳性sRNA预测因子的存在或不存在，其中所述一个或多个阳性sRNA预测因子的存在指示阿尔茨海默氏病活动。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述sRNA预测因子包括来自表2A、表4A和/或表7A(SEQ ID NO:1-403)的一个或多个sRNA预测因子。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述阳性sRNA预测因子包括来自表2A(SEQ ID NO:1-46)的一个或多个sRNA预测因子。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述阳性sRNA预测因子包括来自表4A(SEQ ID NO:47-254)的一个或多个sRNA预测因子。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述阳性sRNA预测因子包括来自表7A(SEQ ID NO:255-403)的一个或多个预测因子。

6.如权利要求2所述的方法，其中所述阳性sRNA预测因子包括来自表5(SEQ ID NO:58、189、78、172、193、97、122、215、248、164、120、93、126、253，112、144、213、244、123、222、150、240、52、220、221、169、165和212)的一个或多个预测因子。

7.如权利要求2所述的方法，其中所述阳性sRNA预测因子包括来自表8(SEQ ID NO:257、270、272、273、279、286、288、314、319、325、332、341，374、391和393)的一个或多个预测因子。

8.如权利要求1所述的方法，其中确定至少十个sRNA预测因子的存在或不存在。

9.如权利要求8所述的方法，其中确定来自表2A、表4A和/或表7A(SEQ ID NO:1-403)的至少两个sRNA的存在或不存在。

10.如权利要求9所述的方法，其中确定来自表2A、表4A和/或表7A的至少五个sRNA的存在或不存在。

11.如权利要求9所述的方法，其中确定来自表2A、表4A和/或表7A的至少十个sRNA的存在或不存在。

12.如权利要求1所述的方法，其中确定至少一个阴性sRNA预测因子的存在或不存在。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述样品是生物流体。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述生物流体选自血液、血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液。

15.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述样品是实体组织，所述实体组织任选地是脑组织。

16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述sRNA的存在或不存在通过定量或定性PCR测定来确定。

17.如权利要求16所述的方法，其中sRNA的存在或不存在使用荧光染料或荧光标记的探针来确定。

18.如权利要求17所述的方法，其中sRNA的存在或不存在使用荧光标记的探针来确定，所述探针还包含淬灭剂部分。

19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中sRNA使用茎环RT引物进行扩增。

20.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中sRNA的存在或不存在使用杂交测定来确定。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述杂交测定采用包含sRNA特异性探针的杂交阵列。

22.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述sRNA的存在或不存在通过核酸测序来确定，并且所述样品中的sRNA通过包括从单个sRNA序列中修剪3’测序衔接子的方法来鉴定。

23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述受试者尚未被诊断为患有AD。

24.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述受试者具有Braak I/II阶段。

25.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述受试者具有Braak III/IV阶段。

26.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述受试者具有Braak V/VI阶段。

27.如权利要求22至26中任一项所述的方法，其中重复所述方法。

28.如权利要求27所述的方法，其中以每年至少约一次，或每六个月至少约一次，或每月至少一次，或每周至少一次的频率对受试者进行评估。

29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述受试者正经历用于AD或AD症状的疗法或候选疗法。

30.一种用于评估受试者中的阿尔茨海默氏病的方法，其包括：

提供来自受试者的生物样品，所述受试者具有与阿尔茨海默氏病进展相关的一种或多种突变，或提供从所述样品中提取的RNA；

确定一个或多个阳性sRNA预测因子的存在、不存在或水平，作为阿尔茨海默氏病活动和/或进展的指示。

31.如权利要求30所述的方法，其中至少一个sRNA预测因子来自表2A、表4A或表7A(SEQID NO:1-403)。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述sRNA预测因子的存在或不存在使用选自以下的方法来确定：具有sRNA特异性引物和/或探针的定量或定性PCR；杂交测定sRNA特异性探针；或使用3’测序衔接子的计算修剪的核酸测序。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述sRNA预测因子的存在或不存在使用实时PCR来确定。

34.如权利要求30至33中任一项所述的方法，其中sRNA的存在或不存在使用荧光染料或荧光标记的sRNA特异性探针来确定。

35.如权利要求34所述的方法，其中sRNA的存在或不存在使用荧光标记的sRNA特异性探针来确定，所述探针还包含淬灭剂部分。

36.如权利要求30至35中任一项所述的方法，其中sRNA使用茎环RT引物进行扩增。

37.如权利要求36所述的方法，其中sRNA的存在或不存在使用具有sRNA特异性探针的杂交测定来确定。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述杂交测定采用包含sRNA特异性探针的杂交阵列。

39.如权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述sRNA的存在或不存在通过核酸测序来确定，并且所述样品中的sRNA通过包括修剪3’测序衔接子的方法来鉴定。

40.如权利要求30至39中任一项所述的方法，其中所述阳性sRNA预测因子包括来自表2A(SEQ ID NO:1至46)的一个或多个sRNA预测因子。

41.如权利要求30至39中任一项所述的方法，其中所述阳性sRNA预测因子包括来自表4A(SEQ ID NO:47-245)的一个或多个sRNA预测因子。

42.如权利要求30至39中任一项所述的方法，其中所述阳性sRNA预测因子包括来自表7A(SEQ ID NO:255-403)的一个或多个sRNA预测因子。

43.如权利要求30至39中任一项所述的方法，其中所述阳性sRNA预测因子包括来自表5(SEQ ID NO:58、189、78、172、193、97、122、215、248、164、120、93、126、253，112、144、213、244、123、222、150、240、52、220、221、169、165和212)的一个或多个预测因子。

44.如权利要求30至39中任一项所述的方法，其中所述阳性sRNA预测因子包括来自表8(SEQ ID NO:257、270、272、273、279、286、288、314、319、325、332、341，374、391和393)的一个或多个预测因子。

45.如权利要求30至44中任一项所述的方法，其中确定至少五个sRNA预测因子的存在或不存在。

46.如权利要求45所述的方法，其中确定来自表2A、表4A或表7A的至少两个sRNA的存在或不存在。

47.如权利要求46所述的方法，其中确定来自表2A、表4A或表7A的至少5个sRNA的存在或不存在。

48.如权利要求46所述的方法，其中确定来自表2A、表4A或表7A的至少10个sRNA的存在或不存在。

49.如权利要求30至48中任一项所述的方法，其中确定至少一个阴性sRNA预测因子的存在或不存在。

50.如权利要求30至49中任一项所述的方法，其中样品来自作为AD动物模型的受试者或是尸检样品。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述样品是脑组织样品。

52.如权利要求30至50中任一项所述的方法，其中所述样品是生物流体。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述生物流体选自血液、血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述受试者正经历用于AD的候选疗法。

55.一种用于评估阿尔茨海默氏病样品的试剂盒，其包含：

被配置用于检测表2A、表4A或表7A(SEQ ID NO:1-403)中列出的多个sRNA的sRNA特异性探针和/或引物。

56.如权利要求55所述的试剂盒，其包含：被配置用于检测表2A、表4A或表7A 5(SEQ IDNO:1-403)中列出的至少5个sRNA的sRNA特异性探针和/或引物。

57.如权利要求55所述的试剂盒，其包含：被配置用于检测表2A、表4A或表7A(SEQ IDNO:1-403)中列出的至少10个sRNA的sRNA特异性探针和/或引物。

58.如权利要求55所述的试剂盒，其包含：被配置用于检测表2A、表4A或表7A(SEQ IDNO:1-403)中列出的至少18个sRNA的sRNA特异性探针和/或引物。

59.如权利要求55所述的试剂盒，其包含：被配置用于检测表2A、表4A或表7A(SEQ IDNO:1-403)中列出的至少40个sRNA的sRNA特异性探针和/或引物。

60.如权利要求55至59中任一项所述的试剂盒，其包含适用于定量或定性PCR测定的探针和/或引物。

61.如权利要求55至60中任一项所述的试剂盒，其包含荧光染料或荧光标记的探针。

62.如权利要求61所述的试剂盒，其包含荧光标记的探针，所述探针还包含淬灭剂部分。

63.如权利要求55至62中任一项所述的试剂盒，其包含茎环RT引物。

64.如权利要求55所述的试剂盒，其包含sRNA特异性杂交探针的阵列。

65.一种用于评估受试者的一种或多种疾病病状的方法，其包括：

提供所述受试者的生物样品，并确定sRNA套组中多个sRNA的存在或不存在；

使用疾病分类器在一种或多种疾病病状之间对所述受试者的病状进行分类；

其中基于一组训练样品中sRNA套组中所述sRNA的存在和不存在来训练所述疾病分类器；所述训练样品被注释为对所述一种或多种疾病病状呈阳性或阴性。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述套组中所述sRNA的存在或不存在是在所述训练集中从sRNA序列数据确定的，并且其中通过修剪5’和/或3’测序衔接子并且在不将sRNA序列变体整合到参考序列或遗传基因座的情况下，在所述sRNA序列数据中鉴定sRNA序列。

67.如权利要求66所述的方法，其中所述样品中sRNA的存在或不存在通过定量RT-PCR测定来确定。

68.如权利要求65所述的方法，其中所述疾病分类器在至少三种疾病病状或至少五种疾病病状之间对样品进行分类。

69.如权利要求68所述的方法，其中所述疾病分类器在至少十种疾病病状之间对样品进行分类。

70.如权利要求65至69中任一项所述的方法，其中所述套组包含约4至约200个sRNA，或约4至约100个sRNA，或约4至约50个sRNA。

71.如权利要求65所述的方法，其中所述训练样品包含实体组织样品、生物流体样品或培养细胞中的一种或多种。

72.如权利要求65所述的方法，其中所述受试者的所述生物样品是血液、血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液。

73.如权利要求65所述的方法，其中所述受试者的生物样品是实体组织活检样品。

74.如权利要求65至73中任一项所述的方法，其中所述训练集具有至少100个样品，包括每种疾病病状的至少10个样品。

75.如权利要求65至74中任一项所述的方法，其中所述疾病分类器使用有监督、无监督、半监督的机器学习模型，诸如参数/非参数距离测量、逻辑回归、支持向量机、决策树、随机森林、神经网络、概率单位回归、费舍尔线性判别、朴素贝叶斯分类器、感知器、二次分类器、核估计、k最近邻、学习向量量化和主成分分析中的一种或多种进行训练。

76.如权利要求65至75中任一项所述的方法，其中所述疾病病状是中枢神经系统疾病。

77.如权利要求76所述的方法，其中至少两种疾病病状是涉及痴呆症状的神经退行性疾病。

78.如权利要求77所述的方法，其中至少两种疾病病状选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、轻度认知障碍、进行性核上性麻痹、额颞痴呆、路易体痴呆和血管性痴呆。

79.如权利要求76所述的方法，其中至少两种疾病病状是涉及运动控制丧失的症状的神经退行性疾病。

80.如权利要求79所述的方法，其中至少两种疾病病状是帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿氏病、多发性硬化和脊髓性肌萎缩。

81.如权利要求79或80所述的方法，其中至少两种疾病病状是脱髓鞘疾病，任选地包括多发性硬化、视神经炎、横贯性脊髓炎和视神经脊髓炎。

82.如权利要求65至81中任一项所述的方法，其中至少一种疾病病状选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化和脊髓性肌萎缩；并且训练样品被注释出疾病阶段、疾病严重性、药物反应性或疾病进展过程。

83.如权利要求65至75中任一项所述的方法，其中所述疾病病状是不同组织或细胞起源的癌症。

84.如权利要求65至75中任一项所述的方法，其中所述疾病病状是药物敏感性和耐药性癌症。

85.如权利要求83或84所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品是肿瘤或癌细胞活检样品。

86.如权利要求65至75中任一项所述的方法，其中所述疾病病状是炎性或免疫性疾病，并任选地包括系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、自身免疫性血管炎、糖尿病(1型或2型)、格雷夫斯病、艾迪生氏病、干燥综合征、甲状腺炎、类风湿性关节炎、重症肌无力、多发性硬化、纤维肌痛、银屑病、克罗恩病、溃疡性结肠炎和乳糜泻中的一种或多种。

87.如权利要求86所述的方法，其中所述生物样品是血液、血清或血浆。

88.如权利要求65至75中任一项所述的方法，其中所述疾病病状是心血管疾病，任选地包括针对急性事件风险的分层。

89.如权利要求88所述的方法，其中所述心血管疾病包括以下中的一种或多种：冠状动脉疾病(CAD)、心肌梗塞、中风、充血性心力衰竭、高血压性心脏病、心肌病、心律失常、先天性心脏病、瓣膜性心脏病、心脏炎、主动脉瘤、外周动脉疾病和静脉血栓形成。

90.如权利要求65至89中任一项所述的方法，其中所述套组中的至少一个或至少两个或至少五个或至少10个sRNA是阳性sRNA预测因子，所述阳性sRNA预测因子被鉴定为存在于所述训练集中被注释为对疾病病状呈阳性的多个样品中，并且不存在于所述训练集中被注释为对所述疾病病状呈阴性的所有样品中。

Images