CN105861716B - 一种用于抑郁症诊断的circRNA标志物、试剂盒及基因芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于抑郁症诊断和疗效评估的circRNA标志物及试剂盒。本发明提供了一种用于抑郁症诊断的circRNA标志物，包括hsa_circRNA_002143、hsa_circRNA_103636、hsa_circRNA_100679和hsa_circRNA_104953四种circRNA的组合，上述四种circRNA的引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示；还提供了用于上述四种circRNA的探针，探针序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示。本发明还提供了于一种评估抗抑郁症药物疗效的circRNA标志物。本发明的有益效果在于首次提供了抑郁症生物标记物和评估抗精神病药物疗效的circRNA生物标记物。经临床验证之后，具有较高的特异性和敏感值，有较高的诊断参考价值，circRNA作为抑郁症特异性生物标记物将带来抑郁症诊断及治疗的革命性改变。

Description

一种用于抑郁症诊断的circRNA标志物、试剂盒及基因芯片
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于抑郁症诊断的circRNA标志物、试剂盒及基因芯片。
背景技术
抑郁症的核心症状是情绪低落、兴趣减退、精力缺失，在全球范围内有超过3.5亿人患有抑郁症。世界卫生组织预测，到2020年，抑郁症将占据世界疾病负担的第二位。重症抑郁障碍是一种常见的精神疾病，其终生患病率约为2％～14％。重症抑郁障碍者自杀占所有自杀的1/3-1/2，其共病心血管疾病、心肌梗塞的机会明显高于正常人，严重威胁人类的心身健康。不仅严重影响患者生活质量，还会对其社会、职业功能造成明显影响，使社会背负沉重的经济负担，甚至可成为社会不安定因素。其原因有发病率高、发病年轻化、呈慢性发展、损害社会功能和认知能力。因此，研究抑郁症发病机理及可以体现其严重程度的生物标志物，并及时针对病因进行干预与治疗是治疗疾病、减轻社会负担的关键因素。
关于抑郁症的发病机制及治疗原理目前尚不明确，既往认为遗传因素、生物学因素、心理社会因素对抑郁症的发生有一定的影响，后来学术界开展了神经生化、神经内分泌、神经可塑性、神经电生理以及神经影像学等多方面研究，提出了多种病因假说、可能有关的内分泌轴、脑结构及功能的异常、神经环路以及信号通路的变化等；抑郁症可能是由突触可塑性受损致使大脑不能恰当地适应环境导致，有证据显示抑郁症与学习和记忆功能受损相关，这些研究提示抑郁症存在大脑功能和神经元突触可塑性改变的证据，但导致抑郁症的确切分子和细胞机制尚不清楚。但目前仍然无单一的理论即可完全解释抑郁症的发病原因。现代分子遗传学认为很多社会环境或自身经历等因素可引起基因表达的变化，可导致某些特定的基因发生表观遗传改变，这些变化可引起神经元的可塑性和功能异常，而这些异常表现可以被遗传下来，即表观遗传机制，基于基因水平的MDD发病机理及生物标志物的研究逐步引起学者们的关注。
环状RNA(circRNA)是区别于传统线性RNA的一类新型RNA，具有闭合环状结构，大量存在于真核转录组中。大部分的环状RNA是由外显子序列构成，在不同的物种中具有保守性，同时存在组织及不同发育阶段的表达特异性。由于环状RNA对核酸酶不敏感，所以比线性RNA更为稳定，这使得环状RNA在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。此外，近期研究显示，环状RNA在不同物种中起到miRNA海绵的作用，称之为竞争性內源RNA(ceRNA)，能竞争性结合miRNA，从而调控靶基因的表达，例如有研究发现的一个环状RNA-CDR1as(也称为ciRS-7)，在其序列上有超过60个保守的miR-7结合位点，因此，起到有效的miR-7海绵作用，能够影响miR-7靶标基因活性。在斑马鱼实验中，该环状RNA的表达能够损害中脑发育，与敲除miR-7效果一致。此外，Sry也被证实起到miR-138的海绵作用。通过高通量测序和生物信息学分析手段，研究者们在哺乳动物转录组中发现了数以千计的环状RNA，说明环状RNA很有可能就是一类新的调控型內源竞争性RNA(ceRNA)。这说明，环状RNA可能通过竞争性结合疾病相关的miRNA在疾病调控中发挥着非常重要的作用。虽然很多circRNA是由蛋白编码基因产生，但是还没有结果显示circRNA在细胞中编码蛋白，环状RNA也因此被定义为一类新型非编码RNA。其主要通过“1个以上的外显子反向剪接成环”形成，是非线性的、自我环化的非编码RNA分子，常定位于细胞质中。circRNA分位于细胞质中富含miRNA结合位点，能结合并抑制miRNA，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平。常规存在于线性RNA分子中的3’和5’端在环状RNA中被连接形成了闭合环状结构。而经典的RNA检测方法只能分离具有PolyA“尾巴”结构的RNA分子，所以环转RNA在以往的研究中通常被忽略了。大部分环状RNA在细胞浆中富集，其丰度有时甚至比相应的线性mRNA高10余倍，这可能是由于环状RNA比线性RNA更稳定造成的。核酸酶往往通过识别线性RNA分子末端发挥作用，环状RNA是一个闭合结构，因此对核酸酶具有高耐受性。环状RNA在细胞质中富集，同时与对应的线性RNA具有相同的转录序列，说明环状RNA很有可能是通过影响miRNA的结合来行使功能。更为重要的是，由于环状RNA的高表达和稳定特性，它在与其它的线性內源竞争性RNA共同作用过程中能够显示异常突出的ceRNA活性。除了ceRNA活性，环状RNA也有可能与RNA结合蛋白RBPs结合，或与其它RNA碱基互补结合甚至结合RNA的翻译蛋白，从而影响基因的正常功能。
近来研究开始关注于circRNA可能在疾病病理方面起到的作用。例如，环状ANRIL(cANRIL)是长链非编码RNA ANRIL的环状拼接形式，其在人类细胞中的表达与该位点上几个可能影响ANRIL拼接的SNP有关，能调节INK4/ARF的水平并增加动脉粥样硬化的风险。这项研究充分证明circRNA与疾病的发生存在关联，并能很好地作为疾病新型生物标记。而与疾病关联miRNA的相互作用则说明环状RNA能够参与疾病调节，例如，环状RNAciRS-7在人脑组织中丰富表达，与脑特异性microRNA miR-7相互作用；而ciRS-7含有多个串联的miR-7结合位点，因此可以作为内源性的miRNA海绵，抑制miR-7活性。考虑到miR-7是各种不同癌症相关通路的重要调节因子，同时也因能直接调节a-突触核蛋白和泛素蛋白连接酶A(UBE2A)的表达而可能与帕金森和阿兹海默疾病的发生相关，所以ciRS-7有可能作为神经性系统疾病和癌症发生的重要调节因子。
更多的证据显示，cirRNA在miRNA水平的微调上起着非常重要的作用，通过竞争结合miRNA来调控基因的表达，而已有的研究证实，miRNA在抑郁症的发病机制中起到重要的调节作用，因此，cirRNA可能进一步参与抑郁症的病理调控过程；而且缺乏特异性的生物标记物，造成临床诊断缺乏客观指标，增加了诊断误诊率，因此，探讨抑郁症诊断和疗效观察的特异性生物标记物cirRNA，对于抑郁症的诊断、治疗、预防等均具有重要的意义和价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种用于抑郁症诊断的circRNA标志物。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种用于抑郁症诊断的circRNA标志物，所述标记物包括hsa_circRNA_002143、hsa_circRNA_103636、hsa_circRNA_100679和hsa_circRNA_104953四种circRNA的组合。所述hsa_circRNA_002143、hsa_circRNA_103636、hsa_circRNA_100679和hsa_circRNA_104953为相关数据库中的RNA代号，可以在数据库中检索得到。
优选的，所述用于抑郁症诊断的circRNA标志物为hsa_circRNA_103636。
在本发明的第二方面，提供了一种抑郁症诊断试剂盒，其能够测定血液中的hsa_circRNA_002143、hsa_circRNA_103636、hsa_circRNA_100679和hsa_circRNA_104953这四种circRNA的含量。
优选的，所述抑郁症诊断试剂盒能够测定血液中的hsa_circRNA_103636的含量。
在本发明的一个优选例中，提供了hsa_circRNA_002143、hsa_circRNA_103636、hsa_circRNA_100679和hsa_circRNA_104953四种circRNA在制备抑郁症诊断试剂盒中的应用。
在本发明的一个优选例中，提供了hsa_circRNA_103636在制备抑郁症诊断试剂盒中的应用。
在本发明的一个优选例中，上述试剂盒含有hsa_circRNA_002143、hsa_circRNA_103636、hsa_circRNA_100679和hsa_circRNA_104953的引物和探针。
优选的，所述试剂盒含有hsa_circRNA_10363的引物和探针。
在本发明的一个优选例中，上述hsa_circRNA_002143的正向引物如SEQ ID NO.1所示，hsa_circRNA_002143的反向引物如SEQ ID NO.2所示；hsa_circRNA_103636的正向引物如SEQ ID NO.3所示，hsa_circRNA_103636的反向引物如SEQ ID NO.4所示；hsa_circRNA_100679的正向引物如SEQ ID NO.5所示hsa_circRNA_100679的反向引物如SEQ IDNO.6所示；hsa_circRNA_104953的正向引物如SEQ ID NO.7所示，hsa_circRNA_104953的反向引物如SEQ ID NO.8所示。
在本发明的一个优选例中，上述hsa_circRNA_002143的探针序列如SEQ ID NO.9所示；hsa_circRNA_103636的探针序列如SEQ ID NO.10所示；hsa_circRNA_100679的探针序列如SEQ ID NO.11所示；hsa_circRNA_104953的探针序列如SEQ ID NO.12所示。
在本发明的第三方面，提供了一种抑郁症诊断基因芯片，包括探针和固相支持物组成，所述探针序列如SEQ ID NO.9～12所示，所述固相支持物包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯膜。
优选的，抑郁症诊断基因芯片，包括探针和固相支持物组成，所述探针序列如SEQID NO.10所示。
在本发明的第四方面，提供了一种用于评估抗抑郁症药物疗效的circRNA标志物，所述标记物为hsa_circRNA_103636。
在本发明的一个优选例中，提供了hsa_circRNA_103636在制备评估抗抑郁症药物疗效试剂盒中的应用。
在本发明的第五方面，提供了一种评估抗抑郁症药物疗效的试剂盒，其能够测定血液中的hsa_circRNA_103636的含量。
在本发明的一个优选例中，上述试剂盒含有hsa_circRNA_103636的引物及探针。
在本发明的一个优选例中，上述hsa_circRNA_100364的正向引物如SEQ ID NO.3所示；hsa_circRNA_100364的反向引物如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一个优选例中，上述hsa_circRNA_100364的探针序列如SEQ ID NO.10所示。
所述诊断试剂盒和评估抗抑郁症药物疗效的试剂盒中还可以包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2和DEPC水等；还可以含有标准品和/或对照品；在本发明的一个优选例中，选用了β-Actin作为内参。
上述人类抑郁症诊断试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是定量PCR扩增试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的；所述的试剂例如(但不限于)：阴性对照品、阳性对照品；还可以包括荧光定量PCR反应板、PCR反应板封口膜等。
可使用本领域技术人员所熟知的多种技术(例如定量或半定量RT-PCR，RNA印迹分析，溶液杂交检测等)测定相关circRNA在抑郁症患者和健康人群中的水平；在本发明的具体实施方案中，使用了定量PCR的方法。
在本发明的第六方面，提供了一种评估抗抑郁症药物疗效的基因芯片，包括探针和固相支持物，所述探针序列如SEQ ID NO.10所示，所述固相支持物包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯膜。
本发明的有益效果在于：circRNA具有高度稳定性、特异性和敏感性，本发明提供了抑郁症生物标记物和预测抗抑郁药物疗效的circRNA标记物。经临床验证之后，具有较高的特异性和敏感值，有较高的诊断参考价值，circRNA作为抑郁症特异性生物标记物将带来抑郁症诊断及治疗的革命性改变。
1、抑郁症的诊断将不依靠主观经验判断，而是可以通过circRNA表达水平这种客观指标检查，进行确诊，提高诊断准确率，简化诊断过程；
2、有望通过circRNA模拟物和拮抗物(修饰寡核苷酸)改变特定circRNA表达水平能够使异常的基因调控网络和信号通路正常化，进而治疗抑郁症；
3、有望通过检测特定circRNA表达水平对抗焦虑药物的疗效进行预测；
4、有望通过检测特定circRNA表达水平对抑郁症患者转归及预后情况进行预测；
5、有望通过circRNA模拟物和拮抗物对特定抑郁症某种特定症状进行针对性治疗。
附图说明
图1基因芯片筛查差异表达lncRNA火山图(说明：X轴是差异倍数以2为底取对数的值，Y轴是p-value值以10为底取负对数的值。灰色点：Fold change绝对值＜2，P值＞0.05的基因。黑色点：Fold change绝对值≥2，P值≤0.05的基因，这些为显著性差异基因)。
图2为抑郁症患者与对照者存在差异性表达的circRNA的RT-PCR分析图。
图3为hsa_circRNA_103636的ROC曲线图。
具体实施方式
病例组(MDD)为2014年4月到2015年1月，在解放军102医院和常州妇幼保健院的患者，共入组100例。入组患者均满足美国精神疾病诊断与统计手册第四版(DSM-IV-TR)中MDD的诊断标准。诊断是由2名精神科医师根据the Chinese version of the modifiedStructured Clinical Interview for DSM-IV,patient version(SCID-I/P)(First etal.,1995)上的诊断标准对患者分别进行测评，这两名精神科医师间的可信度是0.87，最后使用HAMD量表中的24条目来评估焦虑症患者的严重程度。入组标准：1.入组前三个月内未使用抗抑郁药物；2.汉族，年龄18岁到60岁；3.无严重器质性疾病史(例如心脏病，糖尿病，帕金森综合症)，入组前6个月未发生过严重的生活创伤事件；4.没有其它的精神疾病(精神分裂症，人格障碍)。
健康对照组(NC)为同期临近机构的103名健康体检人员，汉族，无严重器质性疾病史(例如心脏病，糖尿病，老年痴呆)，入组前1个月未发生过严重的生活创伤事件。正常对照组经过HAMD和structured clinical interview for DSM-IV,nonpatient edition(SCID--I/P)检查确认没有患MDD或其它精神疾病。在男女比例及年龄配比上与病例组一致。
本研究获得中国人民解放军第102医院医学伦理委员会和常州妇幼保健院批准，所有受试者或受试家属(监护人)均签署知情同意书。
在开展研究前，首先对参加本课题的精神专科医师和研究生进行培训。采用汉密顿抑郁量表(HAMD)、大体评定量表(GAS)、临床疗效总评量表(CGI)在病例入组前、药物治疗4周后、药物治疗8周后分别进行评估。由两位精神科主治医师根据DSM-IV-TR对患者进行诊断，如果出现不一致情况，则请一位精神科主任医师共同讨论后确定诊断。
入组时记录一般情况(姓名、性别、年龄、民族、文化程度、职业、收入水平、婚姻状况、药物成瘾史及精神疾病家族史等)。同样，记录正常对照组一般情况。
二、研究方法
①评估工具
汉密尔顿抑郁量表(HAMA)：由心理学家Hamilton于1960年编制，是目前临床评定抑郁状态时应用最为普遍的量表。本研究采用24项中国版本，分为7个因子，分别是焦虑/躯体化,体重,认知症状,日夜变化,阻滞,睡眠障碍和无助,其信度和效度已经得到验证。本研究中使用HAMA量表的中文版本进行评估，该版本经信效度检验分析，达到心理测量学标准。
大体评定量表(GAS)：大体评定量表是评价各类精神疾病症状的量表，在同类量表中是应用最广泛的一种。本研究使用的是美国心理卫生研究所(NIMH)1976年的Spitzer版本，共有10级评定分(1～10分)，根据患者临床症状进行评定。总分越高，说明病情越轻。本研究中使用GAS量表的中文版本进行评估，该版本经信效度检验分析，达到心理测量学标准。
临床疗效总评量表(CGI)：临床疗效总评量表由WHO设计，用于国际精神疾病试点调查(IPSS)的研究，现用以评定临床疗效，适用于任何精神科治疗和研究对象。量表分为病情严重程度(severity of illness，SI)，疗效总评(global improvement，GI)和疗效指数(efficacy index，EI)三个分量表。本研究中使用CGI量表的中文版本进行评估，该版本经信效度检验分析，达到心理测量学标准。本研究中使用疾病严重程度分(severity ofillness，SI)和疗效总评分(global improvement，GI)进行统计分析。
②资料收集
入组时记录一般情况(姓名、性别、年龄、民族、文化程度、职业、收入水平、婚姻状况、药物成瘾史及精神疾病家族史等)。由3名精神科主治医师或医师使用汉密尔顿抑郁量表(HAMA)和临床疗效总评量表(CGI)于用药前及用药8周以上对病例组被试进行评定。评定前，所有参与研究人员进行统一培训，统一方法学等，保证施测过程标准化。其中HAMA使用总分和因子分统计，CGI使用疗效总评分(global improvement,GI)统计。
③药物干预
在GAD组中，对入组患者采用每日口服舍曲林(起始剂量50mg,平均剂量100mg,剂量范围50～150mg)、米氮平(起始剂量7.5mg,平均剂量15mg,剂量范围7.5～22.5mg)、西酞普兰(起始剂量20mg,平均剂量30mg,剂量范围20～40mg)、氟伏沙明(起始剂量50mg,平均剂量100mg,剂量范围50～150mg)治疗，并分别在初诊(治疗前，GAD0)、第4周(6wk)和第8周(8wk)采血和HAMD评定。根据复诊情况，连续选择自研究起始治疗前、第8周均有记录的病例共30例。
④主要试剂和耗材
LowInput Quick-Amp Labeling Kit，one-color(24*)(Agilent，货号：5190-2305)；Gene Expression Wash Pack(Agilent，5188-5327)；Gene ExpressionHybridization Kit(5188-4242)；RNA Spike In Kit，one-color(5188-5327)；荧光定量PCR引物：Custom Plus TQMN RNA Assays(美国ABI公司)；荧光定量PCR试剂：TaqMan通用混合试剂盒Ⅱ(美国ABI公司，货号：4440047)；反转录试剂盒：QuantiTectRev.Transcription Kit(QIAGEN，货号：205311)。
⑤主要仪器
扫描仪(仪器来源：Affymetrix，型号：Scanner 3000)；杂交炉(仪器来源：Affymetrix，型号：Hybridization Oven 640)；洗涤工作站(仪器来源：Affymetrix，型号：Fluidics Station 450)；2100(仪器来源：Agilent，型号：G2939A)；2100振荡器(仪器来源：Agilent，型号：9600)；NanoDrop(Thermo，2000)；PCR仪(ABI，9700)；离心机(eppendorf，5418)；浓缩仪(eppendorf，5301)；离心机(其林贝尔，LX-200)；离心机-1(其林贝尔，LX-300)；振荡器-1(其林贝尔，GL-88B)；磁力搅拌器(其林贝尔，GL-3250B)；金属浴-2(博日，HB-100)；金属浴-3(博日，CHB-100)；电热恒温培养箱(精宏实验设备，XMTD-8222)；冰箱(荣事达，BCD-265F)；ABI9700型PCR仪(美国ABI公司)；天美CT14RD型台式高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)；NanoDrop1000超微量紫外分光光度计(附电脑1套)(美国Thermo公司)；ABI 7900HT Fast Read-Time PCR System(附电脑1套)(美国ABI公司)；WH-2微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；JS-400A恒温金属浴(上海培清科技有限公司)；DK-8D数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；SW-CJ-IFD型单人单面净化工作台(苏净净化设备有限公司)；-81℃超低温冰箱(日本三洋公司)。
⑥RNA提取和circRNA芯片筛查
所有被试者使用EDTA抗凝管采肘静脉血5ml，在3000×g的转速下分别离心10分钟。用重力梯度离心机将外周血单核淋巴细胞分离出来后，将其置于冻存管中，-80℃保存备用。在抗抑郁症治疗后3周及6周时以同样的方法重复收集30名MDD患者的外周血单核淋巴细胞。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)从单核淋巴细胞中提取总RNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。并用NanoDrop ND-1000(Thermo Scientific,Delaware,ME,USA)进行扩增。血样取自5名MDD患者(23岁，31岁，33岁的男性各一名；45岁，52岁的女性各一名)和5名健康体检人员(20岁，33岁，35岁的男性各一名；63岁，43岁的女性各一名)，用来进行Arraystar Human circRNA Array analysis。RNA质检合格后，样本的标记、芯片的杂交以及洗脱参照芯片标准流程。首先，总RNA反转录成双链cDNA，再进一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记的cRNA。标记好的cRNA和芯片Arraystar Human circRNA Array(8x15K,Arraystar,USA)杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C(AgilentTechnologies)扫描得到原始图像。
⑦逆转录聚合酶链式反应
对芯片筛查结果中的10种差异表达明显的circRNA进行后续的RT-PCR验证。并用100名MDD患者和103名健康对照组的血液样本验证这10种差异性表达的circRNA。按照RNA逆转录试剂盒(TaqMan RNA反转录试剂盒，美国ABI公司)说明书进行逆转录反应，circRNA荧光扩增探针是由Invitrogen company(USA)合成的。实时荧光定量PCR按照TaqMan试剂盒(TaqMan通用混合试剂盒II，美国ABI公司)说明书进行。
⑧药物干预
根据circRNA芯片普和RT-PCR的结果，选出4个差异表达明显的circRNA和30名MDD患者来进行进一步的抗抑郁症的研究。其中10例服用米氮平(起始剂量7.5mg，剂量范围7.5-22.5mg，平均剂量15mg)同时服用西肽普兰(起始剂量20mg，剂量范围20-40mg，平均剂量30mg)，8例服用舍曲林(起始剂量50mg，剂量范围50-150mg，平均剂量100mg)辅以米氮平，12例服用氟伏沙明(起始剂量50mg，剂量范围50-150mg，平均剂量100mg)辅以米氮平。由3名精神科医师使用HAMD对病例组被试的疾病严重程度和疗效进行评定，在治疗前，药物干预治疗后4周，8周时使用HAMD对患者分别进行评定并且利用RT-PCR技术检测此时30患者血样中circRNA的表达水平。同样，记录正常对照组一般情况。评定前，3名医师进行统一培训，熟练掌握标准化施测程序。
⑨统计学处理
使用χ2检验分析MDD组和NC组的性别差异；使用两独立样本t检验分析MDD组与NC组间年龄的差异。火山图用来分析两组间差异表达的circRNA(标准为P值≤0.05并且Foldchange值≥2.0，有统计学意义)。采用Mann-Whitney秩和检验病例组(SZ)和对照组(NC)之间circRNA的相对表达量。Univariate repeated measures analysis of variance用来检测三次(用药前，用药4周及8周后)之间circRNA的表达差异分析。作受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析；并作多变量观察值的ROC曲线，分析对应的灵敏度(敏感度)和特异度。全部数据用DataAssist v3.0Statistical Package for Social Sciences for Windows 20.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)统计软件进行统计分析。
三、研究结果
1、基因芯片分析发现，15种circRNAs在抑郁症病例组与对照组之间存在显著差异，其中4种上调，11种下调，见图1和表1。
表1抑郁症病例组与对照组10种差异表达的circRNA
Figure BDA0000998664920000071
Figure BDA0000998664920000081
2、MDD与NC的各circRNA表达水平比较，hsa_circRNA_002143表达上调，hsa_circRNA_103636,hsa_circRNA_100679,hsa_circRNA_104953表达下调(P＜0.05或P＜0.01)。结果见表2、图2。
表2MDD病例组与对照组ΔCT比较
Figure BDA0000998664920000082
Figure BDA0000998664920000083
3、30例MDD患者各circRNA在抗抑郁药治疗前、治疗4周、治疗8周的比较中，只有hsa_circRNA_103636显著上调，见表3。
表3抗抑郁药物治疗前后circRNAs的ΔCT差异比较
Figure BDA0000998664920000084
Figure BDA0000998664920000085
4、对hsa_circRNA_103636抑郁症诊断价值的接受者操作特征曲线(ROC)分析发现，hsa_circRNA_103636的AUC为0.632(95％CI:0.533-0.688),敏感度和特异度分别为0.73、0.65，见图3。
四、用于抑郁症诊断的基因芯片的制备
采用序列如SEQ ID NO.9～12所示的四种探针，该部分的核苷酸的平均长度为29个碱基，它的3’端与共有序列1的5’端相接，在它的5’端接上15个碱基组成的无义链寡核苷酸(“CCGGCCTATTATGGCCGG”)，使得每一条核苷酸探针的总长度约为50个碱基。将每条探针的3’端进行氨基修饰，使之能够和玻璃板上的聚合硅发生共价反应从而固定到芯片表面。然后将这些探针分别在用于制备芯片的玻璃板上平行点样三次。
芯片的制备采用涂有有机硅的Corning GAPS-2玻璃板(目录号：#40003，供应商：Corning Inc.，美国)为支持材料，并用SmartArray点样机(型号SmartArray-48，供应商：CapitalBio Corp，中国)点样，每个探针点的直径为150μm，相邻探针点中心间的距离为240μm，点完探针样品后让玻璃片在室温下干燥24小时，然后按下述方法清洗掉未共价结合的DNA和点样缓冲液：把玻璃片放在一个烧杯中并在烧杯中放一个搅拌子，在25℃用0.2％的SDS洗涤两次，每次5分钟，然后在50℃用蒸馏水洗两次，每次5分钟，再在25℃用0.1M四氢硼二钠溶液洗涤5分钟，用0.2％SDS洗涤三次，每次1分钟，用蒸馏水洗2次，每次1分钟。将玻璃片室温下于空气中彻底晾干后用于杂交检测。
本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
Figure IDA0000998664990000011
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Claims (1)

1.一种抑郁症诊断基因芯片，其特征在于包括探针和固相支持物，所述探针序列如SEQID NO.9~12所示，所述固相支持物包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯膜。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108148903A (zh) * 2018-02-13 2018-06-12 广州市番禺区中心医院(广州市番禺区人民医院、广州市番禺区心血管疾病研究所) Ccl3l3在抑郁症的诊断、治疗及预后中的应用
CN108148904A (zh) * 2018-02-13 2018-06-12 广州市番禺区中心医院(广州市番禺区人民医院、广州市番禺区心血管疾病研究所) Elp5在抑郁症的诊断、治疗及预后中的应用
CN108410867A (zh) * 2018-02-13 2018-08-17 广州市番禺区中心医院(广州市番禺区人民医院、广州市番禺区心血管疾病研究所) 一种新的抑郁症的标记物
CN109100461B (zh) * 2018-07-23 2021-02-12 哈尔滨工业大学 一种利用蛋白组学技术区分有机大米和非有机大米的方法
CN109234394A (zh) * 2018-09-30 2019-01-18 深圳市南山区人民医院 一种肝癌诊断标志物及其筛选方法
CN111141863B (zh) * 2018-11-06 2021-08-10 中国科学院大连化学物理研究所 一种抑郁症诊断标志物的试剂在制备抑郁症诊断试剂盒中的应用
CN109637588B (zh) * 2018-12-29 2022-07-15 北京百迈客生物科技有限公司 一种基于全转录组高通量测序构建基因调控网络的方法
CN112924685B (zh) * 2019-12-05 2022-09-13 中国科学院大连化学物理研究所 抑郁症生物标志物和包括其的诊断试剂盒
CN112924684B (zh) * 2019-12-05 2022-07-29 中国科学院大连化学物理研究所 用于区分抑郁症和非抑郁症的生物标志物和包括其的诊断试剂盒
US20240200139A1 (en) * 2021-02-26 2024-06-20 Unm Rainforest Innovations Circular rnas for diagnosis of depression and prediction of response to antidepressant treatment
CN114457152B (zh) * 2022-03-14 2023-08-25 广东医科大学附属医院 用于检测circRNAs标志物的引物、检测产品及应用
CN116531506A (zh) * 2022-05-12 2023-08-04 东南大学 环状核糖核酸翻译蛋白在抑郁症诊断和治疗领域的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015034925A1 (en) * 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
CN105177117A (zh) * 2015-07-03 2015-12-23 张理义 重症抑郁障碍生物标记物、筛选方法及试剂盒
CN105524997A (zh) * 2016-01-14 2016-04-27 张理义 一种用于抑郁症诊断的lncRNA标志物、试剂盒及基因芯片

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015034925A1 (en) * 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
CN105177117A (zh) * 2015-07-03 2015-12-23 张理义 重症抑郁障碍生物标记物、筛选方法及试剂盒
CN105524997A (zh) * 2016-01-14 2016-04-27 张理义 一种用于抑郁症诊断的lncRNA标志物、试剂盒及基因芯片

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Microarray expression profile of circular RNAs in human pancreatic ductal adenocarcinoma;Shibin Qu等;《Genomics Data》;20150721;第5卷;385-387 *
Shibin Qu等.Microarray expression profile of circular RNAs in human pancreatic ductal adenocarcinoma.《Genomics Data》.2015,第5卷 *

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