CN105524997A - 一种用于抑郁症诊断的lncRNA标志物、试剂盒及基因芯片 - Google Patents

一种用于抑郁症诊断的lncRNA标志物、试剂盒及基因芯片 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于抑郁症诊断的lncRNA标志物及试剂盒。本发明提供了一种用于抑郁症诊断的lncRNA标志物，包括TCONS_l2_00001212、NONHSAT102891、TCONS_00019174、ENST00000566208、NONHSAG045500、ENST00000517573、NONHSAT034045和NONHSAT142707，上述八种lncRNA的引物序列如SEQ？ID？NO.1～SEQ？ID？NO.16所示；还提供了用于上述八种lncRNA的探针，探针序列如SEQ？ID？NO.17～SEQ？ID？NO.24所示。本发明的有益效果在于首次提供了抑郁症生物标记物和评估抗精神病药物疗效的生物标记物。经临床验证之后，具有较高的特异性和敏感值，有较高的诊断参考价值，lncRNA作为抑郁症特异性生物标记物将带来抑郁症诊断及治疗的革命性改变。

Description

一种用于抑郁症诊断的lncRNA标志物、试剂盒及基因芯片
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于抑郁症诊断的lncRNA标志物、试剂盒及基因芯片。
背景技术
抑郁症的核心症状是情绪低落、兴趣减退、精力缺失，在全球范围内有超过3.5亿人患有抑郁症。世界卫生组织预测，到2020年，抑郁症将占据世界疾病负担的第二位。
抑郁症对社会造成的重大负担，其原因有发病率高、发病年轻化、呈慢性发展、损害其社会功能和认知能力，及非自然死亡，抑郁症患者中自杀死亡与自杀未遂的比例远远高于在普通人群中的比值。因此研究抑郁症发病机理及可以体现其严重程度的生物标志物，并及时针对病因进行干预与治疗是治疗疾病、减轻社会负担的关键因素。
关于抑郁症的发病机制及治疗原理目前尚不明确，既往认为遗传因素、生物学因素、心理社会因素对抑郁症的发生有一定的影响，后来学术界开展了神经生化、神经内分泌、神经可塑性、神经电生理以及神经影像学等多方面研究，提出了多种病因假说、可能有关的内分泌轴、脑区结构及功能的变化、脑区环路以及信号通路的变化等，均取得了相应的进展，但目前仍然无单一的理论即可完全解释抑郁症的发病原因。现代分子遗传学认为很多社会环境或自身经历等因素可引起基因表达的变化，可导致某些特定的基因发生表观遗传改变，这些变化可引起神经元的可塑性和功能异常，而这些异常表现可以被遗传下来，即表观遗传机制，基于基因水平的MDD发病机理及生物标志物的研究逐步引起学者们的关注。
非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)即不编码蛋白质的RNA，按照其长短分为长非编码RNA(>200bp)和短非编码RNA(<200bp)，广义上包括mRNA、tRNA、rRNA、小干扰RNA、miRNA以及功能尚未明确的长链非编码RNA。很多学者研究了miRNA在抑郁症患者中的差异表达，提示miRNA可能通过不同方式参与抑郁症的发生发展，例如神经可塑性、神经内分泌、心理社会因素、抗抑郁药等，而且认为miRNA-26b、miRNA-1972、miRNA-4485、miRNA-4498和miRNA-4743等可以作为抑郁症的生物标志物。后来学者们发现LncRNA可以作为人类基因组中一类非常重要的表观遗传调控因子，通过表观遗传、转录调控及转录后调控等多种机制调控DNA甲基化、组蛋白修饰或染色质重构，使基因沉默或激活，LncRNA还广泛地参与中枢神经系统的各种生物学进程，如海马发育、少突胶质细胞髓鞘形成、脑老化、CREB和PGC1-α转录调控、GABA能神经元和G蛋白偶联受体等信号转导通路相关.LncRNA除了直接参与基因的表达调控外，可作为一种竞争性内源性RNA(CompetingendogenousRNA,ceRNA)与miRNA相互作用，从而实现相互间的交流与调节。LncRNAs与很多的人类疾病有关，比如癌症、共济失调及心血管疾病，但是关于LncRNA在抑郁症患者中差异表达的研究极少。
越来越多的研究证明，在大脑的发育、神经发生、神经元成熟及突触形成过程中，lncRNA起关键的调控作用。进一步的研究表明，抑郁症症的发生、发展中，lncRNA亦起重要作用，并与抗抑郁药物的疗效有相关性。因此，某些lncRNA可成为抑郁症诊断和预测抗抑郁药物治疗效果的生物标记物。
越来越多的研究证明，在大脑的发育、神经发生、神经元成熟及突触形成过程中，lncRNA起关键的调控作用。进一步的研究表明，抑郁症的发生、发展中，lncRNA亦起重要作用，并与抗精神病药物的疗效有相关性。因此，某些lncRNA可成为抑郁症诊断和预测抗精神病药物治疗效果的生物标记物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种用于抑郁症诊断的lncRNA标志物。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种用于抑郁症诊断的lncRNA标志物，所述标记物包括TCONS_l2_00001212(PY1)、NONHSAT102891(PY2)、TCONS_00019174(PY3)、ENST00000566208(PY4)、NONHSAG045500(PY6)、ENST00000517573(PY8)、NONHSAT034045(PY9)和NONHSAT142707(PY10)。所述TCONS_l2_00001212、NONHSAT102891、TCONS_00019174、ENST00000566208、NONHSAG045500、ENST00000517573、NONHSAT034045、NONHSAT142707为数据库中的RNA代号，可以在数据库中检索得到，各lncRNA的具体来源数据库见表4。
在本发明的第二方面，提供了一种抑郁症诊断试剂盒，其能够测定血液中的TCONS_l2_00001212(PY1)、NONHSAT102891(PY2)、TCONS_00019174(PY3)、ENST00000566208(PY4)、NONHSAG045500(PY6)、ENST00000517573(PY8)、NONHSAT034045(PY9)和NONHSAT142707(PY10)这八种lncRNA的含量。
在本发明的一个优选例中，上述试剂盒含有TCONS_l2_00001212(PY1)、NONHSAT102891(PY2)、TCONS_00019174(PY3)、ENST00000566208(PY4)、NONHSAG045500(PY6)、ENST00000517573(PY8)、NONHSAT034045(PY9)和NONHSAT142707(PY10)的引物和探针。
在本发明的一个优选例中，上述TCONS_l2_00001212的正向引物如SEQIDNO.1所示，TCONS_l2_00001212的反向引物如SEQIDNO.2所示；NONHSAT102891的正向引物如SEQIDNO.3所示，NONHSAT102891的反向引物如SEQIDNO.4所示；TCONS_00019174的正向引物如SEQIDNO.5所示，TCONS_00019174的反向引物如SEQIDNO.6所示；ENST00000566208的正向引物如SEQIDNO.7所示，ENST00000566208的反向引物如SEQIDNO.8所示；NONHSAG045500的正向引物如SEQIDNO.9所示，NONHSAG045500的反向引物如SEQIDNO.10所示；ENST00000517573的正向引物如SEQIDNO.11所示，ENST00000517573的反向引物如SEQIDNO.12所示；NONHSAT034045的正向引物如SEQIDNO.13所示，NONHSAT034045的反向引物如SEQIDNO.14所示；NONHSAT142707的正向引物如SEQIDNO.15所示，NONHSAT142707的反向引物如SEQIDNO.16所示。
在本发明的一个优选例中，上述TCONS_l2_00001212的探针序列如SEQIDNO.17所示；NONHSAT102891的探针序列如SEQIDNO.18所示；TCONS_00019174的探针序列如SEQIDNO.19所示；ENST00000566208的探针序列如SEQIDNO.20所示；NONHSAG045500的探针序列如SEQIDNO.21所示；ENST00000517573的探针序列如SEQIDNO.22所示；NONHSAT034045的探针序列如SEQIDNO.23所示；NONHSAT142707的探针序列如SEQIDNO.24所示。
在本发明的第三方面，提供了一种抑郁症诊断基因芯片，包括探针和固相支持物组成，所述探针序列如SEQIDNO.17～24所示，所述固相支持物包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯膜。
在本发明的第四方面，提供了一种用于评估抗抑郁症药物疗效的lncRNA标志物，所述标记物包括TCONS_l2_00001212(PY1)、TCONS_00019174(PY3)、ENST00000566208(PY4)、NONHSAG045500(PY6)、ENST00000517573(PY8)、NONHSAT034045(PY9)和NONHSAT142707(PY10)。
在本发明的第五方面，提供了一种评估抗抑郁症药物疗效的试剂盒，其能够测定血液中的TCONS_l2_00001212(PY1)、TCONS_00019174(PY3)、ENST00000566208(PY4)、NONHSAG045500(PY6)、ENST00000517573(PY8)、NONHSAT034045(PY9)和NONHSAT142707(PY10)七种lncRNA的含量。
在本发明的一个优选例中，上述试剂盒含有TCONS_l2_00001212(PY1)、TCONS_00019174(PY3)、ENST00000566208(PY4)、NONHSAG045500(PY6)、ENST00000517573(PY8)、NONHSAT034045(PY9)、NONHSAT142707(PY10)的引物及探针。
在本发明的一个优选例中，上述TCONS_l2_00001212的正向引物如SEQIDNO.1所示，TCONS_l2_00001212的反向引物如SEQIDNO.2所示；TCONS_00019174的正向引物如SEQIDNO.5所示，TCONS_00019174的反向引物如SEQIDNO.6所示；ENST00000566208的正向引物如SEQIDNO.7所示，ENST00000566208的反向引物如SEQIDNO.8所示；NONHSAG045500的正向引物如SEQIDNO.9所示，NONHSAG045500的反向引物如SEQIDNO.10所示；ENST00000517573的正向引物如SEQIDNO.11所示，ENST00000517573的反向引物如SEQIDNO.12所示；NONHSAT034045的正向引物如SEQIDNO.13所示，NONHSAT034045的反向引物如SEQIDNO.14所示；NONHSAT142707的正向引物如SEQIDNO.15所示，NONHSAT142707的反向引物如SEQIDNO.16所示。
在本发明的一个优选例中，上述TCONS_l2_00001212的探针序列如SEQIDNO.17所示；TCONS_00019174的探针序列如SEQIDNO.19所示；ENST00000566208的探针序列如SEQIDNO.20所示；NONHSAG045500的探针序列如SEQIDNO.21所示；ENST00000517573的探针序列如SEQIDNO.22所示；NONHSAT034045的探针序列如SEQIDNO.23所示；NONHSAT142707的探针序列如SEQIDNO.24所示。
所述诊断试剂盒和评估抗抑郁症药物疗效的试剂盒中还可以包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2和DEPC水等；还可以含有标准品和/或对照品；在本发明的一个优选例中，选用了β-Actin作为内参。
上述人类抑郁症诊断试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是定量PCR扩增试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的；所述的试剂例如(但不限于)：阴性对照品、阳性对照品；还可以包括荧光定量PCR反应板、PCR反应板封口膜等。
可使用本领域技术人员所熟知的多种技术(例如定量或半定量RT-PCR，RNA印迹分析，溶液杂交检测等)测定相关lncRNA在抑郁症患者和健康人群中的水平；在本发明的具体实施方案中，使用了定量PCR的方法。
在本发明的第六方面，提供了一种评估抗抑郁症药物疗效的基因芯片，包括探针和固相支持物，所述探针序列如SEQIDNO.17和SEQIDNO.19～24所示，所述固相支持物包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯膜。
本发明的有益效果在于：本发明的有益效果在于提供了抑郁症生物标记物和预测抗抑郁药物疗效的生物标记物。经临床验证之后，具有较高的特异性和敏感值，有较高的诊断参考价值，lncRNA作为抑郁症特异性生物标记物将带来抑郁症诊断及治疗的革命性改变。
1、抑郁症的诊断将不依靠主观经验判断，而是可以通过lncRNA表达水平这种客观指标检查，进行确诊，提高诊断准确率，简化诊断过程，且便于早期预测；
2、有望通过lncRNA模拟物和拮抗物(修饰寡核苷酸)改变特定lncRNA表达水平能够使异常的基因调控网络和信号通路正常化，进而治疗抑郁症；
3、有望通过检测特定lncRNA表达水平对抗抑郁药物的疗效进行预测；
4、有望通过检测特定lncRNA表达水平对抑郁症患者转归及预后情况进行预测；
5、有望通过lncRNA模拟物和拮抗物对特定抑郁症某种特定症状进行针对性治疗。
附图说明
图1为抑郁症病例组与健康对照组基因表达筛选的火山图；
图2为RT-PCR分析证实抑郁症病例组与健康对照组间8个LncRNA差异性表达图；
图3为8种差异性表达LncRNA的抑郁症诊断ROC曲线及其联合ROC曲线。
具体实施方式
一、研究对象
本研究获得中国人民解放军第二军医大学临床医院第102医院医学伦理委员会批准，所有受试者或受试家属(监护人)均签署知情同意书。
1.病例组：病例组研究对象为2014年5月至2015年2月，在解放军102医院精神科门诊和住院的符合抑郁症诊断标准的患者共138例，均为汉族，所有患者符合下列入组标准：1.满足美国精神疾病诊断与统计手册第四版(DSM-IV-TR)中抑郁症发作的诊断标准；2.两名主治医师对其进行汉密尔顿量表(24项版)评分≧20分；3.汉族，年龄18岁-60岁；4.右利手；5.本次发病前1年内无重大负性生活事件；6.近3个月未用过任何抗抑郁药物、抗精神病药物。排除标准为：1.既往有严重器质性疾病或药物继发的情感障碍、精神障碍或人格障碍；曾有酒精或其它物质滥用史；2.妊娠或哺乳期女性；3.近6个月内进行过无抽搐电休克治疗(MECT)，或长期使用过抗精神病药物；需长期合并使用可能影响情绪的药物者；近期需长期使用中枢神经系统作用的药物；对所用研究药物(米氮平、舍曲林、艾斯西酞普兰)过敏。
2.对照组：健康对照组为同期体检的63例健康志愿者，要求汉族，年龄在20岁-60岁之间，与病例组年龄、性别和民族相匹配。经过structuredclinicalinterviewforDSM-IV,nonpatientedition(SCID-I/NP)检查以确认他们没有患抑郁症和其它精神疾病，而且本人及两系亲属中无精神疾病史，本人无严重神经系统疾病或其它严重躯体疾病、严重脑外伤史，近3个月内无严重应激事件，右利手，采血前1个月内未患疾病或服用任何药物。
在开展研究前，首先对参加本课题的精神专科医师和研究生进行培训。采用汉密尔顿抑郁量表(HAMD)、大体评定量表(GAS)、临床疗效总评量表(CGI)在病例入组前、药物治疗4周后、药物治疗8周后分别进行评估。由两位精神科主治医师根据DSM-IV-TR对患者进行诊断，如果出现不一致情况，则请一位精神科主任医师共同讨论后确定诊断。
入组时记录一般情况(姓名、性别、年龄、民族、文化程度、职业、收入水平、婚姻状况、药物成瘾史及精神疾病家族史等)。同样，记录正常对照组一般情况。
二、研究方法
①使用量表
汉密尔顿抑郁量表(HAMD)：由心理学家Hamilton于1960年编制，是目前临床评定抑郁状态时应用最为普遍的量表。本研究采用24项中国版本，分为7个因子，分别是焦虑/躯体化,体重,认知症状,日夜变化,阻滞,睡眠障碍和无助,其信度和效度已经得到验证。
大体评定量表(GAS)：大体评定量表是评价各类精神疾病症状的量表，在同类量表中是应用最广泛的一种。本研究使用的是美国心理卫生研究所(NIMH)1976年的Spitzer版本，共有10级评定分(1～10分)，根据患者临床症状进行评定。总分越高，说明病情越轻。本研究中使用GAS量表的中文版本进行评估，该版本经信效度检验分析，达到心理测量学标准。
临床疗效总评量表(CGI)：临床疗效总评量表由WHO设计，用于国际精神疾病试点调查(IPSS)的研究，现用以评定临床疗效，适用于任何精神科治疗和研究对象。量表分为病情严重程度(severityofillness，SI)，疗效总评(globalimprovement，GI)和疗效指数(efficacyindex，EI)三个分量表。本研究中使用CGI量表的中文版本进行评估，该版本经信效度检验分析，达到心理测量学标准。本研究中使用疾病严重程度分(severityofillness，SI)和疗效总评分(globalimprovement，GI)进行统计分析。
②资料收集
入组时记录一般情况(姓名、性别、年龄、民族、文化程度、职业、收入水平、婚姻状况、药物成瘾史及精神疾病家族史等)。由3名精神科主治医师或医师使用汉密尔顿抑郁量表(HAMD)和临床疗效总评量表(CGI)于用药前及用药6周以上对病例组被试进行评定。评定前，所有参与研究人员进行统一培训，统一方法学等，保证施测过程标准化。其中HAMD使用总分和因子分统计，CGI使用疗效总评分(globalimprovement,GI)统计。
③药物干预
在138例病例中，随机选取30例进行临床药物干预随访观察。对其中10例服用米氮平(剂量范围7.5-45mg，起始剂量7.5mg，平均剂量30mg)联合艾司西酞普兰(剂量范围20-40mg，起始剂量20mg，平均剂量30mg)，8例采用每日服舍曲林(剂量范围50-150mg，起始剂量50mg，平均剂量100mg)联合米氮平，12例服用氟伏沙明(剂量范围50-150mg，起始剂量50mg，平均剂量100mg)联合米氮平。
④主要试剂和耗材
LowInputQuick-AmpLabelingKit，one-color(24*)(Agilent，货号：5190-2305)；GeneExpressionWashPack(Agilent，5188-5327)；GeneExpressionHybridizationKit(5188-4242)；RNASpikeInKit，one-color(5188-5327)；荧光定量PCR引物：CustomPlusTQMNRNAAssays(美国ABI公司)；荧光定量PCR试剂：TaqMan通用混合试剂盒Ⅱ(美国ABI公司，货号：4440047)；反转录试剂盒：QuantiTectRev.TranscriptionKit(QIAGEN，货号：205311)。
⑤主要仪器
扫描仪(仪器来源：Affymetrix，型号：Scanner3000)；杂交炉(仪器来源：Affymetrix，型号：HybridizationOven640)；洗涤工作站(仪器来源：Affymetrix，型号：FluidicsStation450)；2100(仪器来源：Agilent，型号：G2939A)；2100振荡器(仪器来源：Agilent，型号：9600)；NanoDrop(Thermo，2000)；PCR仪(ABI，9700)；离心机(eppendorf，5418)；浓缩仪(eppendorf，5301)；离心机(其林贝尔，LX-200)；离心机-1(其林贝尔，LX-300)；振荡器-1(其林贝尔，GL-88B)；磁力搅拌器(其林贝尔，GL-3250B)；金属浴-2(博日，HB-100)；金属浴-3(博日，CHB-100)；电热恒温培养箱(精宏实验设备，XMTD-8222)；冰箱(荣事达，BCD-265F)；ABI9700型PCR仪(美国ABI公司)；天美CT14RD型台式高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)；NanoDrop1000超微量紫外分光光度计(附电脑1套)(美国Thermo公司)；ABI7900HTFastRead-TimePCRSystem(附电脑1套)(美国ABI公司)；WH-2微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；JS-400A恒温金属浴(上海培清科技有限公司)；DK-8D数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；SW-CJ-IFD型单人单面净化工作台(苏净净化设备有限公司)；-81℃超低温冰箱(日本三洋公司)。
⑥基因芯片筛查
用AgilentHumanlncRNA芯片,对精神分裂症患者5人，正常对照5人共10个样本检测和分析。样品总RNA利用NanoDropND-2000(ThermoScientific)定量并经AgilentBioanalyzer2100(AgilentTechnologies)检测RNA完整性。RNA质检合格后，样本的标记、芯片的杂交以及洗脱参照芯片标准流程。首先，总RNA反转录成双链cDNA，再进一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记的cRNA。标记好的cRNA和芯片杂交，洗脱后利用AgilentScannerG2505C(AgilentTechnologies)扫描得到原始图像。数据分析：采用FeatureExtraction软件(version10.7.1.1,AgilentTechnologies)处理原始图像提取原始数据。接着利用Genespring软件(version12.5；AgilentTechnologies)进行quantile标准化和后续处理。标准化后的数据进行过滤，用于比较的每组样本中至少有一组100％标记为“P”的探针留下进行后续分析。利用T检验的p值和倍数变化值进行差异基因和差异lncRNA筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0且P值≤0.05。
⑦总RNA抽提与荧光定量PCR
对芯片筛查结果中的10种差异表达的lncRNA进行后续的PCR验证。所有被试使用EDTA抗凝管采肘静脉血5ml，采血后轻轻摇动抗凝管使抗凝剂与血液混匀，所有血样在采血后2小时内进行RNA提取。先将Ficoll-PaquePLUS液室温(15-20℃)放置，所有离心过程也应在室温完成。取2mlEDTA抗凝血与等体积平衡液在15ml离心管中用移液管(或移液器)充分混匀(总体积4ml)。用针管抽取3mlFicollPaquePLUS溶液到新的15ml离心管中，轻轻用移液管(或移液器)沿管壁缓慢滴加准备好的样品(4ml)于分层液面上，注意保持清楚的液面。室温(18-20℃)以400×g离心30-40分钟。用新移液管(或移液器)吸取最上层的血浆与血小板。将单核淋巴细胞置于冻存管中，-80℃保存备用。由实验员每天定时记录冰箱温度。TRIzol(USA)法提取出血液单核淋巴细胞中的总RNA(包括lncRNA)，具体操作按照试剂盒说明书进行。按照RNA逆转录试剂盒(TaqManRNA反转录试剂盒，美国ABI公司)说明书进行逆转录反应。反应总体积为15μL(总RNA5μL，TaqManMicroRNAAssay3μL,核酸酶free水4.16ul，RNase抑制剂0.19μL，缓冲液1.5μL，Multiscribe逆转录酶1μL和dNTP0.15μL)，在不同温度下(16℃，42℃，85℃，4℃)进行不同时长(30mins，30mins，5mins，10mins)反应。实时荧光定量PCR按照TaqMan试剂盒(TaqMan通用混合试剂盒II，美国ABI公司)说明书进行。PCR扩增体系总体积为10μL，反应共40个循环。PCR反应Ct值通过7900实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)测定，每个反应重复三次。使用SDS2.4和DataAssistv3.0软件进行数据读取和分析，选择β-Actin为内参进行数据标准化。
⑧统计学处理
全部数据使用SPSSv19.0统计软件进行统计分析。用独立样本t检验和四格表资料的Fisher确切概率法(Fisherexactprobabilitiesin2×2table)检测两组在年龄和性别有无显著性差异。采用随机方差模型(Randomvariancemodel,RVM)校正后进行两分类差异基因筛选(Twoclassificationdifferencegeneticscreening,TwoclassDif)，得到显著差异表达的lncRNA。以LncRNA与内参β-Actin之间阈值环(thresholdcycle,Ct)之差计算ΔCT值。使用Wilcoxonranksumtest分别对比分析抑郁症组与对照组间10种lncRNA的差异，用非参数检验分析对筛选到的8种差异lncRNA在治疗前、治疗4周和治疗8周的前后表达变化，以及抑郁症组与对照组不同性别、不同年龄段间的差异。
三、研究结果
1、基因芯片分析发现，抑郁症组5例患者与对照组5名正常人其LncRNA经芯片扫描后均可呈现高低表达2大趋势，说明抑郁症组和对照组间LncRNA可能存在差异性表达。以P<0.05为差异有统计学意义，误判率(FDR)为校正后P值，经RVMt-test分析共筛选出2649条差异表达的LncRNA，其中534条表达上调，2115条表达下调,如图1所示，以log2(foldchange)为横坐标，表示2倍的基因上调或下调；以T检验显著性检验P值的负对数-log10(P-value)为纵坐标，因此黑色区域代表统计学上有显著性差异的基因表达，结果见图1。
2、采用qRT-PCR验证基因芯片分析结果，就芯片筛查到的2649个LncRNAs，经过充分研究，我们选择TCONS_l2_00001212、NONHSAT102891、TCONS_00019174、ENST00000566208、ENST00000414201、NONHSAG045500、ENST00000591189、ENST00000517573、NONHSAT034045、NONHSAT142707等10个LncRNA在大样本进行验证，见表2所示，其中1个表达上调，9个表达下调，筛选标准为FoldChange≥2.0，且P<0.05。选择上述10个LncRNA的依据是：1、选择芯片筛查结果中FoldChanged较大的LncRNA；2.根据聚类分析的结果，在不同的cluster中选取LncRNA；3、在每个样本中都能检测出的LncRNA。我们选择β-Actin做为RT-PCR实验的内参。经过测试，β-Actin在所有样本中可以稳定地检测到。结果见表1。
表1芯片分析筛查中差异表达的10种LncRNA
注：所有基因在以下部分用PY1-PY10表示，其中PY1＝TCONS_l2_00001212,PY2＝NONHSAT102891,PY3＝TCONS_00019174,PY4＝ENST00000566208,PY5＝ENST00000414201,PY6＝NONHSAG045500,PY7＝ENST00000591189,PY8＝ENST00000517573,PY9＝NONHSAT034045,PY10＝NONHSAT142707
3、共送检抑郁症组138例和健康对照组63例，结果如表2所示，抑郁症组患者PBMC中LncRNA的ΔCt值较对照组为高，提示其实际表达水平均较对照组降低，但其中PY5未达到显著性差异，而PY7表达趋势与芯片筛查结果的趋势相反，故最终两组间表达水平有显著性差异的有PY1、PY2、PY3、PY4、PY6、PY8、PY9、PY10，结果见表2、图2。
表2抑郁症组和健康对照组差异基因的ΔCt值比较
表3抑郁症组治疗前、4w、8w时8个差异性lncRNA分子的ΔCt值变化
注：治疗8w时与治疗前相比，*P<0.05；治疗4w与治疗8w相比，ΔP<0.05；与治疗前相比，P<0.001。
4、ROC曲线分析提示RT-PCR验证的差异性表达的8个LncRNAs具有抑郁症的诊断价值。其中PY1的AUC为0.645(95％CI：0.545-0.744)，PY2的AUC为0.625(95％CI：0.526-0.723)，PY3的AUC为0.646(95％CI：0.545-0.748)，PY4的AUC为0.596(95％CI：0.493-0.698)，PY6的AUC为0.601(95％CI：0.499-0.703)，PY8的AUC为0.621(95％CI：0.521-0.720)，PY9的AUC为0.603(95％CI：0.502-0.703)，PY10的AUC为0.627(95％CI：0.524-0.729)，8个LncRNA的联合ROC曲线的AUC为0.716，敏感值为0.824，特异值为0.720，见图3。
5、在138例抑郁症患者中，随机选择30例进行为期4周、8周的抗抑郁药物治疗，参与治疗前后8种LncRNAs表达水平差异分析。采用qRT-PCR法测定其外周血LncRNA在治疗前、治疗4w和治疗8w后的表达水平，并进行非参数检验分析，结果显示除了PY2，其余7个基因的表达水平均明显上调(P<0.05)；结果进一步显示，在治疗4w时基因表达水平与治疗前无明显差异，而治疗8w时与治疗前和治疗4w相比，均出现显著表达上调的差异(P<0.01-0.05)；而MDD患者的HAMD评分在治疗4周时有显著下降，治疗8周与治疗4周相比，无显著性差异。治疗8周时与健康对照组比较，PY1和PY2表达显著上调，而PY3、PY4、PY6、PY8、PY9、PY10无明显差异。见表3。
表3抑郁症组治疗前、4w、8w时8个差异性lncRNA分子的ΔCt值变化
注：治疗8w时与治疗前相比，*P<0.05；治疗4w与治疗8w相比，ΔP<0.05；与治疗前相比，P<0.001。
表4LncRNA及其来源数据库
四、用于抑郁症诊断的基因芯片的制备
采用序列如SEQIDNO.17～24所示的八种探针，该部分的核苷酸的平均长度为25个碱基，它的3’端与共有序列1的5’端相接，在它的5’端接上15个碱基组成的无义链寡核苷酸(“CCGGCCTATTATGGCCGG”)，使得每一条核苷酸探针的总长度约为50个碱基。将每条探针的3’端进行氨基修饰，使之能够和玻璃板上的聚合硅发生共价反应从而固定到芯片表面。然后将这些探针分别在用于制备芯片的玻璃板上平行点样三次，每张芯片上共含4080个探针点样点。
芯片的制备采用涂有有机硅的CorningGAPS-2玻璃板(目录号：#40003，供应商：CorningInc.，美国)为支持材料，并用SmartArray点样机(型号SmartArray-48，供应商：CapitalBioCorp，中国)点样，每个探针点的直径为150μm，相邻探针点中心间的距离为240μm，点完探针样品后让玻璃片在室温下干燥24小时，然后按下述方法清洗掉未共价结合的DNA和点样缓冲液：把玻璃片放在一个烧杯中并在烧杯中放一个搅拌子，在25℃用0.2％的SDS洗涤两次，每次5分钟，然后在50℃用蒸馏水洗两次，每次5分钟，再在25℃用0.1M四氢硼二钠溶液洗涤5分钟，用0.2％SDS洗涤三次，每次1分钟，用蒸馏水洗2次，每次1分钟。将玻璃片室温下于空气中彻底晾干后用于杂交检测。
本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (10)

1.一种用于抑郁症诊断的lncRNA标志物，其特征在于所述标记物包括TCONS_l2_00001212、NONHSAT102891、TCONS_00019174、ENST00000566208、NONHSAG045500、ENST00000517573、NONHSAT034045和NONHSAT142707。
2.一种抑郁症诊断试剂盒，其特征在于能够测定血液中的TCONS_l2_00001212、NONHSAT102891、TCONS_00019174、ENST00000566208、NONHSAG045500、ENST00000517573、NONHSAT034045和NONHSAT142707八种lncRNA的含量。
3.如权利要求2所述的抑郁症诊断试剂盒，其特征在于上述试剂盒含有TCONS_l2_00001212、NONHSAT102891、TCONS_00019174、ENST00000566208、NONHSAG045500、ENST00000517573、NONHSAT034045和NONHSAT142707的引物及探针。
4.如权利要求3所述的抑郁症诊断试剂盒，其特征在于所述TCONS_l2_00001212的正向引物如SEQIDNO.1所示，TCONS_l2_00001212的反向引物如SEQIDNO.2所示；NONHSAT102891的正向引物如SEQIDNO.3所示，NONHSAT102891的反向引物如SEQIDNO.4所示；TCONS_00019174的正向引物如SEQIDNO.5所示，TCONS_00019174的反向引物如SEQIDNO.6所示；ENST00000566208的正向引物如SEQIDNO.7所示，ENST00000566208的反向引物如SEQIDNO.8所示；NONHSAG045500的正向引物如SEQIDNO.9所示，NONHSAG045500的反向引物如SEQIDNO.10所示；ENST00000517573的正向引物如SEQIDNO.11所示，ENST00000517573的反向引物如SEQIDNO.12所示；NONHSAT034045的正向引物如SEQIDNO.13所示，NONHSAT034045的反向引物如SEQIDNO.14所示；NONHSAT142707的正向引物如SEQIDNO.15所示，NONHSAT142707的反向引物如SEQIDNO.16所示；
所述TCONS_l2_00001212的探针序列如SEQIDNO.17所示；NONHSAT102891的探针序列如SEQIDNO.18所示；TCONS_00019174的探针序列如SEQIDNO.19所示；ENST00000566208的探针序列如SEQIDNO.20所示；NONHSAG045500的探针序列如SEQIDNO.21所示；ENST00000517573的探针序列如SEQIDNO.22所示；NONHSAT034045的探针序列如SEQIDNO.23所示；NONHSAT142707的探针序列如SEQIDNO.24所示。
5.一种抑郁症诊断基因芯片，其特征在于包括探针和固相支持物，所述探针序列如SEQIDNO.17～24所示，所述固相支持物包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯膜。
6.一种用于评估抗抑郁症药物疗效的lncRNA标志物，所述标记物包括TCONS_l2_00001212、TCONS_00019174、ENST00000566208、NONHSAG045500、ENST00000517573、NONHSAT034045和NONHSAT142707。
7.一种评估抗抑郁症药物疗效的试剂盒，其特征在于所述试剂盒能够测定血液中的TCONS_l2_00001212、TCONS_00019174、ENST00000566208、NONHSAG045500、ENST00000517573、NONHSAT034045和NONHSAT142707七种lncRNA的含量。
8.如权利要求7所述的评估抗抑郁症药物疗效的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有TCONS_l2_00001212、TCONS_00019174、ENST00000566208、NONHSAG045500、ENST00000517573、NONHSAT034045和NONHSAT142707的引物和探针。
9.如权利要求8所述的评估抗抑郁症药物疗效的试剂盒，其特征在于所述TCONS_l2_00001212的正向引物如SEQIDNO.1所示，TCONS_l2_00001212的反向引物如SEQIDNO.2所示；TCONS_00019174的正向引物如SEQIDNO.5所示，TCONS_00019174的反向引物如SEQIDNO.6所示；ENST00000566208的正向引物如SEQIDNO.7所示，ENST00000566208的反向引物如SEQIDNO.8所示；NONHSAG045500的正向引物如SEQIDNO.9所示，NONHSAG045500的反向引物如SEQIDNO.10所示；ENST00000517573的正向引物如SEQIDNO.11所示，ENST00000517573的反向引物如SEQIDNO.12所示；NONHSAT034045的正向引物如SEQIDNO.13所示，NONHSAT034045的反向引物如SEQIDNO.14所示；NONHSAT142707的正向引物如SEQIDNO.15所示，NONHSAT142707的反向引物如SEQIDNO.16所示；
所述TCONS_l2_00001212的探针序列如SEQIDNO.17所示；TCONS_00019174的探针序列如SEQIDNO.19所示；ENST00000566208的探针序列如SEQIDNO.20所示；NONHSAG045500的探针序列如SEQIDNO.21所示；ENST00000517573的探针序列如SEQIDNO.22所示；NONHSAT034045的探针序列如SEQIDNO.23所示；NONHSAT142707的探针序列如SEQIDNO.24所示。
10.一种评估抗抑郁症药物疗效的基因芯片，其特征在于包括探针和固相支持物，所述探针序列如SEQIDNO.17和SEQIDNO.19～24所示，所述固相支持物包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯膜。
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