CN103189069A

CN103189069A - 以miRNA为靶的神经退行性疾病的治疗

Info

Publication number: CN103189069A
Application number: CN2011800535097A
Authority: CN
Inventors: 卢宰圭; 李相建; 金万镐; 朱键; 郑槿和; 李舜泰
Original assignee: Seoul National University Industry Foundation
Current assignee: Seoul National University Industry Foundation; SNU R&DB Foundation
Priority date: 2010-09-13
Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2031-09-09
Also published as: WO2012036433A2; WO2012036433A3; US9301969B2; EP2617433A4; US20130184331A1; CN103189069B; KR101235256B1; EP2617433B1; JP5710001B2; EP2617433A2; KR20120088009A; JP2013542921A

Abstract

本发明涉及以特定miRNA作为靶的神经退行性疾病的预防或治疗用药剂学组合物。并且，本发明涉及神经退行性疾病的诊断用试剂盒。本发明中所表达的miR-206靶在阿尔茨海默动物模型及人的大脑试样中共同进行高表达，因此，是在没有实验误差的情况下所选择的实质性的治疗靶。作为miR-206的抑制剂，本发明的反义寡核苷酸在以miRNA作为靶的神经退行性疾病治疗中，首次提示成功的结果。本发明的反义寡核苷酸对miR-206的功能进行抑制，大大增加脑源性神经营养因子及胰岛素样生长因子的等级，并增加突触的再生，最终能治疗神经退行性疾病，尤其是能治疗阿尔茨海默病。

Description

以miRNA为靶的神经退行性疾病的治疗

【技术领域】

本发明涉及神经退行性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，该组合物以特定的miRNA（微型核糖核酸）为靶。并且，本发明还涉及神经退行性疾病的诊断用试剂盒。

【背景技术】

阿尔茨海默病（AD）是由于逐步的认知功能降低，神经退化，淀粉样蛋白在细胞外沉着（老年斑）和细胞内封入（神经纤维；神经纤维瘤（NFT））的增加而引起的抹去特征性的老年人中痴呆症最常见的形态（Braak and Braak,1996；Querfurth and LaFerla，2010）。目前，对阿尔茨海默病没有治疗方法。阿尔茨海默病的主要分子机制包括错折叠蛋白质、氧化损伤、炎症性损伤及能源衰竭，并且，这些最终会引起突触功能异常（Querfurth and LaFerla，2010）。突触是阿尔茨海默病发病的初期靶，而突触素（synaptophysin）的变化与识别功能的降低有关（Selkoe，2002）。阿尔茨海默病的大脑显示脑源性神经营养因子（BDNF，brain-derived neurotrophic factor）的低等级，并且，脑源性神经营养因子是突触弹性、突触生成及神经生成的主要调节因子（Phillips et al.，1991；Bramham and Messaoudi，2005；Ernfors and Bramham，2003）。为此，虽然正在努力通过对脑源性神经营养因子的调节来治疗阿尔茨海默病（Nagahara et al.，2009），但安全有效的治疗方法仍未研发。

miRNA（MicroRNAs，miRNA）是21-至23-核苷酸的微小核糖核酸（RNA）分子，并通过靶信使核糖核酸（mRNA）的破碎或解读步骤中的抑制，来调节基因的表达（Kim et al.，2009）。miRNA干预多种多样的生理学现象及疾病（Kim et al.，2009）。中枢神经系统中，随着作为miRNA生成的主要调节因子的Dicer酶的消失，会引起神经退化，而这表示均衡的miRNA的表达在神经系统中起到重要的作用（Schaefer et al，2007；Cueller et al.，2008）。众所周知，几个miRNA，例如，miR-8，9/9*或133b对神经退化进行干预（Karreset al.，2007Kim et al.，2007；Packer et al.，2008）。对于阿尔茨海默病的研究而言，几个miRNA的表达变化及它们对阿尔茨海默病的干预也是众所周知的（Maes et al.，2009；Hebert and De Strooper，2009）。虽然，此类研究扩大了对阿尔茨海默病的理解，但miRNA的对阿尔茨海默病的直接治疗用途还未进行尝试。

在本说明书全文中参照多个论文及专利文献，其引用由括号来表示。这些论文及专利文献的公开内容，作为参照全部包括在本说明书中，因此能够更加明确地说明本发明所属的技术领域的水准及本发明的内容。

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

本发明人对治疗神经退行性疾病，尤其是阿尔茨海默病的靶分子进行发掘，并为了研发以此为靶的药物而努力。结果，本发明人实质上确认miRNA-206（miR-206）在患有神经退行性疾病的大脑中实现特异性的高表达，并且，以此为靶的反义寡核苷酸能使突触再生，并恢复记忆力等，来治疗神经退行性疾病，由此完成本发明。

本发明的目的在于，提供一种神经退行性疾病的预防或治疗用药剂学组合物。

本发明的另一目的在于，提供一种神经退行性疾病的诊断用试剂盒。

本发明的另一目的及优点通过发明内容、权利要求书及附图，会变得更加明确。

【解决课题的技术方案】

根据本发明的一实施方式，本发明提供一种神经退行性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，该药剂学组合物包含：

（a）具有与序列表第一序列的核苷酸序列中的第二核苷酸序列至第七核苷酸序列互补的序列的反义寡核苷酸的药剂学有效量；以及

（b）药剂学上能接受的载体。

根据本发明的一实施方式，本发明提供一种神经退行性疾病的预防或治疗方法，其特征在于，包括将药剂学组合物给药到实验对象（subject）的步骤，上述药剂学组合物包含：（a）具有与序列表第一序列的核苷酸序列中的第二核苷酸序列至第七核苷酸序列互补的序列的反义寡核苷酸的药剂学有效量；以及（b）药剂学上能接受的载体。

本发明人对治疗神经退行性疾病，尤其是阿尔茨海默病的靶分子进行发掘，并为了研发以此为靶的药物而努力。结果，本发明人实质上确认miRNA-206（miR-206）在患有神经退行性疾病的大脑中实现特异性的高表达，并且，以此为靶的反义寡核苷酸能使突触再生，并恢复记忆力等，来治疗神经退行性疾病。

本说明书中的术语“反义寡核苷酸”包含具有与作为靶的miRNA，尤其是与miRNA的种子序列互补的序列，由此能形成miRNA和二聚体（duplex）的基于核酸的分子。因此，本说明书中的术语“反义寡核苷酸”可记载为“基于互补的核酸的抑制剂”。

序列表第一序列表示miRNA-206的成熟序列。序列表第一序列中的第二核苷酸序列至第七核苷酸序列是miRNA-206的种子序列。一般来说，miRNA的种子序列是在靶认知方面非常重要的序列（Krenz，M.et al.，J.Am.Coll.Cardiol.44：2390-2397（2004）；H.Kiriazis，et al.，Annu.Rev.Physiol.62：321（2000）），对多种多样的种类具有保存性（conserved）。因此，本发明的反义寡核苷酸具有与作为miRNA-206的种子序列的序列表第一序列的第二核苷酸序列至第七核苷酸序列互补的序列，并且，只通过上述互补的序列，也能对miRNA-206进行抑制。

本说明书中，在提及反义寡核苷酸时使用的术语“互补的”意味着在预定的杂交或退火条件，优选的，意味着在生理学条件下，以反义寡核苷酸与miRNA-206靶进行选择性的杂交的程度地充分互补，并且，具有包括实质上互补的（substantially complementary）及完全互补的（perfectly complementary）的意思，优选的，意味着完全互补的意思。

根据本发明的优选实例，本发明中作为有效成分利用的反义寡核苷酸具有与在序列表第一序列的核苷酸序列（即，miRNA-206的成熟序列）中的第1-第8、第2-第8或第2-第7核苷酸序列互补的序列。最优选的，本发明中作为有效成分利用的反义寡核苷酸具有与序列表第一序列的整个核苷酸序列（即，miRNA-206的成熟序列）互补的序列。

本发明的反义寡核苷酸包括多种分子。反义寡核苷酸为DNA（DNA）分子或核糖核酸（RNA）分子，更优选为RNA分子。选择性地，本发明所利用的反义寡核苷酸是核糖核酸（RNA）、DNA（DNA）、2’-0-改性寡核苷酸、硫代磷酸-主链DNA、肽核酸（PNA，peptidenucleic acid）或锁核酸（LNA,locked nucleic acid）。2’-0-改性寡核苷酸优选为2’-0-烷基寡核苷酸，更优选为2’-0-C_1-3烷基寡核苷酸，最优选为2’-0-C_1-3甲基寡核苷酸。

如上所述，本发明的反义寡核苷酸具有包含基于核酸的抑制剂，上述基于核酸的抑制剂具有与miRNA-206互补的序列。本发明的反义寡核苷酸中，例如，包含狭义的反义寡核苷酸、拮抗剂（antagomir）及抑制RNA分子。

术语“拮抗剂”作为单链化学-改性核糖核酸，具有与miRNA-206至少有一部分互补的序列，优选地具有与miRNA-206完全互补的序列。拮抗剂包含一个或一个以上的改性核苷酸（例如，2’-0-甲基-糖改性）。根据一些实例，拮抗剂只包含改性核苷酸。拮抗剂包含一个或一个以上的硫代磷酸键，具有部分或完全的硫代磷酸主链。为了改善体内运输及稳定性，拮抗剂在其3’-末端可结合胆固醇或其他部位。为了抑制miRNA-206，适合的拮抗剂的长度为7-50核苷酸，优选为10-40核苷酸，更优选为15-30核苷酸，最优选为20-25核苷酸。

miRNA-206功能的抑制能通过给药典型的反义寡核苷酸来达成。反义寡核苷酸是核糖核酸或DNA。优选的，反义寡核苷酸包含至少一个化学改性。反义寡核苷酸能包含一个或一个以上的锁核酸（LNAs，Locked nucleic acids）。锁核酸为改性核糖核酸，在核糖部位的2’至4’碳之间包含额外的桥键，来具有锁定（locked）形态，并以此具有锁核酸的寡核苷酸具有改善的热稳定性。择一性地，反义寡核苷酸可包含肽核酸（PNA，peptide nucleic acids），并且反义寡核苷酸包含基于肽的主链来代替糖-磷酸主链。反义寡核苷酸能包含的其他化学改性包括：如2’-0-烷基（例如，2’-0-甲基，2’-0-甲氧基乙基）、2’-氟及4’-硫氧改性一样的糖改性；硫代磷酸、吗啉代或磷羧酸键之类的主链改性（例如，美国专利第6693187号及第7067641号）。在其他实例中，适合的反义寡核苷酸是2’-0-甲氧基乙基的“裂隙”，这在5’-末端及3’-末端包含2’-0-甲氧基乙基-改性核糖核酸，并在中央具有至少10个DNA。这“裂隙”能促发核糖核酸靶的miRNA酶I（RNase I）依赖性破碎机制。反义寡核苷酸的长度为7-50核苷酸，优选为10-40核苷酸，更优选为15-30核苷酸，最优选为20-25核苷酸。

对miRNA-206的功能进行抑制的其他接近方式是抑制RNA分子的给药，并且，上述抑制RNA分子包含与miRNA-206的成熟序列互补的序列。此类抑制RNA分子包含双链的小干扰miRNA（siRNA，small interfering RNA）、短发夹状核糖核酸（shRNA，short hairpinRNA）及核酶。

能够通过本发明的药剂学组合物来治疗的疾病包括多种神经退行性疾病，优选的是阿尔茨海默病、痴呆症、亨廷顿氏病、帕金森氏病或肌萎缩侧索硬化症，最优选的是阿尔茨海默病。

如下列实施例论证，本发明的反义寡核苷酸对miRNA-206的功能进行抑制，大大增加脑源性神经营养因子（BDNF，brain derivedneurophic factor）及胰岛素样生长因子-1（IGF-1，insulin-like growthfactors-1）的等级，并增加突触的再生，最终治疗神经退行性疾病，尤其是对阿尔茨海默病进行治疗。

包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上许可的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖（lactose）、右旋糖（dextrose）、蔗糖（sucrose）、山梨醇（sorbitol）、甘露醇（mannitol）、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐（alginate）、凝胶（gelatin）、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone）、纤维素（cellulose）、水、糖浆、甲基纤维素（methyl cellulose）、羟基苯甲酸甲酯（methyl hydroxybenzoate）、丙基羟基苯甲酸丙酯（propylhydroxybenzoate）、滑石、硬脂酸镁（stearic acid magnesium）及矿物油（mineral oil）等，但并非局限于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上许可的适合的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书（Remington’s Pharmaceutical Sciences19th ed.，1995）。

本发明的药剂学组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮给药等方式进行给药。

本发明的药剂学组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。根据本发明的优选实例，本发明的药剂学组合物的1天的给药剂量为0.001mg/kg-100mg/kg。

本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。

本发明的反义寡核苷酸作为miRNA-206的抑制剂，在对以miRNA作为靶的神经退行性疾病的治疗方面，首次揭示成功的结果。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供神经退行性疾病的诊断用试剂盒，该试剂盒包含miR-424^*、miR-18b^*、miR-135a^*、miR-1228、miR-320、miR-296-5p、miR-557、miR-338-5p、miR-206,miR-92a、miR-1238、miR-513a-5p、miR-423-5p,miR-188-5p、miR-140-3p、miR-575、miR-640、miR-1237、miR-191^*或miR-134的核苷酸序列，以及它的互补性序列或上述序列的片段。

根据本发明的又一实施方式，本发明为了提供神经退行性疾病的诊断或预后所需的信息而提供对神经退行性剂型标志物进行检测的方法，该方法通过对人类生物学试样中的miR-424^*、miR-18b^*、miR-135a^*、miR-1228、miR-320、miR-296-5p、miR-557、miR-338-5p、miR-206、miR-92a、miR-1238、miR-513a-5p、miR-423-5p、miR-188-5p、miR-140-3p、miR-575、miR-640、miR-1237、miR-191^*或miR-134的表达进行检测的方法来进行。

上述miRNA分子的核苷酸序列能在基因银行（GenBank）确认。

最优选的，上述miRNA分子为miR-206（miRNA-206）。

本发明的诊断试剂盒用于多种神经退行性疾病的诊断，优选的是阿尔茨海默病,、痴呆症、亨廷顿氏病、帕金森氏病或肌萎缩侧索硬化症，最优选的是阿尔茨海默病的诊断。

本发明的试剂盒除了上述成分之外，还可包含其他成分。例如，本发明的试剂盒适用于聚合酶链式反应（PCR，Polymerase ChainReaction）扩增过程的情况下，本发明的试剂盒选择性地可包含聚合酶链式反应扩增所需的试剂，例如，缓冲液、DNA聚合酶（例如，水生栖热菌（Taq，Thermus aquaticus）、嗜热栖热菌（Tth，Thermusthermophilus）、Thermus filiformis、Thermis flavus、Thermococcusliteralis或Pyrococcus furiosus（Pfu）中获得的热稳定性DNA聚合酶）、DNA聚合酶辅助因子及脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）。本发明的试剂盒能以包含上述试剂成分的多个其他包装或区室形态来制备。

根据本发明的优选实例，本发明的试剂盒可以是微陈列。根据本发明的优选实例，本发明的试剂盒是基因扩增试剂盒。

本发明的试剂盒为微陈列的情况下，在微陈列的固体的表面固定探针。本发明的试剂盒为基因扩增试剂盒的情况下，包括引物。

用于本发明的诊断用试剂盒的探针或引物具有与过氧化物还原酶1（PRDX1，Peroxiredoxin-1）核苷酸序列互补的序列。本说明书中的术语“互补的（complementary）”意味着在某些特定的杂交（hybridization）或退火条件下引物或者探针以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分地互补。因此，术语“互补的”与术语“完全互补的（perfectly complementary）”具有相互不同的意思，并且，本发明的引物或探针只要是对上述的核苷酸序列能进行选择性杂交的程度时，能具有一个或一个以上的错配（mismatch）碱基序列。

制备引物或探针时，需要参照的本发明的miRNA的核苷酸序列能在基因银行（GenBank）进行确认，并且，能参照该序列对引物或探针进行设计。

通过本发明的试剂盒或方法进行分析的上述miRNA的表达程度，例如，通过反转录酶-聚合酶链式反应（RT-PCR，reversetranscriptase-PCR）或实时聚合酶链式反应（real-time-PRC）方法（参照：Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，3rd ed.Cold Spring Harbor Press（2001））检测到的表达程度呈现出与对照组相比，达到1.5倍以上，优选地达到2倍以上，最优选地达到3倍以上的表达率的情况下，判断采集分析试样的实验对象（subject）患有神经退行性疾病，尤其患有阿尔茨海默病，或者发病危险度高。

【发明效果】

对本发明的特征及优点进行归纳如下：

（a）作为神经退行性疾病尤其是阿尔茨海默病的治疗靶，本发明提供miRNA-206。

（b）本发明发掘的miRNA-206靶是在患有阿尔茨海默病动物模型及人类大脑试样中共同实现高表达的靶，是一种在没有实验误差（artifact errors）的情况下选择的实质性治疗靶。

（c）作为miRNA-206的抑制剂，本发明的反义寡核苷酸在以miRNA作为靶的神经退行性疾病的治疗中，首次揭示成功的结果。

（d）本发明的反义寡核苷酸对miRNA-206的功能进行抑制，大大增加脑源性神经营养因子（BDNF）及胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的等级，增加突触的再生，最终治疗神经退行性疾病，尤其是治疗阿尔茨海默病。

【附图说明】

图1是阿尔茨海默大脑中表示miRNA-206的向上调节的附图。（a）微陈列中7-及12-月龄的野生型及Tg2576小鼠显示相互不同地进行调节的miRNA。比起绿色，红色显示更高的表达（Z-score）。miRNA以相对性表达量依次进行排序。右侧的热图显示通过左侧的正方形来表示的图像的放大率（Mmu,Mus musculus）。（b）实时的聚合酶链式反应（图表）及反转录酶-聚合酶链式反应（RT-PRC）（凝胶）显示与12-月龄的野生型小鼠相比，12-月龄Tg2576小鼠的miRNA-206的等级更高（每组n=4）。sno202核糖核酸作为内部控制来利用。（c）原位的miRNA-206杂交在12-月龄的Tg2576小鼠上显示增加miRNA-206的表达（Scale bar，25μm）。（d）实时的聚合酶链式反应显示在细胞培养中添加Aβ42肽时，脑神经瘤（Neuro-2a）细胞的miRNA-206的等级会增加，或者在人脐静脉内皮细胞中并非如此。（e）人类颞皮层中，实时的聚合酶链式反应与控制大脑相比，在阿尔茨海默大脑中显示miRNA-206的向上调节（每组n=4）。*P＜0.05，及**＜0.01。条表示平均±标准平均误差。

图2表示miRNA-206的脑源性神经营养因子的调节。（a）脑源性神经营养因子3’-非翻译区（UTR）（脑源性神经营养因子#1，#2和#3）的三处位置预想为miRNA-206的靶。在miRNA-206的种子序列（seed sequence）的下方标有下划线。（b）在利用海拉（Hela）细胞的萦光素酶实验中，miRNA-206的转染会减少脑源性神经营养因子#3及具有脑源性神经营养因子的整体3’-非翻译区（tBDNF）的载体的萦光素酶的活性（n=6复制）。（c）从蛋白印迹法（左侧）及光密度测定法（densitometry）（右侧）的结果能看出，从脑神经瘤（Neuro-2a）细胞及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）向miRNA-206的转染会减少脑源性神经营养因子蛋白质的等级。减少与AM206（对miRNA-206的反义寡核苷酸）进行共同-转染，从而成为一般化（Scr，scrambled sequence）。（d）脑神经瘤（Neuro-2a）细胞的Aβ低聚物处理在脑源性神经营养因子信使核糖核酸不会明显减少的情况下，增加miRNA-206的等级（每组n=6）。（e）Aβ低聚物在细胞中减少脑源性神经营养因子的等级，而AM206的转染恢复脑源性神经营养因子蛋白质的等级（Scr,scrambled sequence）。（f）小鼠原代海马神经元中，Aβ低聚物引发了树突棘密度的减少，并通过AM206处理来恢复（Scale bar，10μm）。（g）12-月龄的Tg2576小鼠通过Cy3-标记的AM206向三处脑室进行注入。24小时后，Cy3-AM206的萦光向海马及周边组织分布（Scale bar，100μm）。（h）微管相关蛋白2（MAP2）-阳性神经，荆豆属（Ulex）-外源凝集素-阳性内皮细胞及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）-阳性神经胶质细胞中检测到Cy3-AM206（Scale bar，20μm）。（i）蛋白印迹法（左侧）及光密度测定法（右侧）中，向脑室注入AM206的Tg2576小鼠（Tg2576-AM206）与注入一周后的控制（Tg2576-control）相比较时，能发现整体大脑的脑源性神经营养因子的等级有明显增加（每组n=6）。*P＜0.05及**P＜0.01.ns，not significant。条表示平均±标准平均误差。

图3是表示AM206的治疗效果的图。（a）脉络性恐怖条件化测试实施12个月，并在测试1周前或3周前注入争夺反义寡核苷酸的控制Tg2576小鼠（Tg-ctr-1w及Tg-ctr-3w）的冻结时间比野生型小鼠要短。Tg2576小鼠的AM206处理在测试前1周（g-AM206-1w）或前3周的所有处理组的冻结时间都增加（每组n=6，通过Mann-WhitneyU测试的Kruskall-Wallis分析）。这表示海马的记忆功能增加。（b）线索性恐怖条件化测试中，每组之间未显示任何差异（每组n=6）。虚线表示声学线索。（c）Y-迷宫测试中显示Tg-AM206-1w小鼠比Tg-ctr-1w小鼠能进行更好的循环行动。Tg-AM206-3w小鼠与Tg-ctr-3w小鼠相比，显示相似的循环行动（每组n=6）。（d）突触素（Synaptophysin）的表达比起控制Tg2576小鼠，在Tg-AM206-1w及Tg-AM206-3w小鼠显示的更高，这表示AM206增加突触密度（每组n=6）（Scale bar，200μm）。（e）颗粒下层齿状回的微管相关蛋白-阳性细胞（doublecortin（Dcx））的数量（箭头）也在Tg-AM206-1w及Tg-AM206-3w小鼠中显示比控制Tg2576小鼠高，这表示增加神经的产生（每组n=6）（Scale bar，50μm）。*P＜0.05.**P＜0.01.ns，not significant。条表示平均±标准平均误差。

图4是表示拮抗剂的鼻腔传达的图。（a）通过鼻腔传达24小时后，Cy3-标记的AM206向嗅球、皮质及海马分散。赋形剂-给药控制大脑在任何Cy3萦光都未表达（Scale bar，50μm）。（b）向Tg2576小鼠的AM206的鼻腔传达（Tg-IND-AM206）在1周后，如蛋白印迹法（左侧）及光密度测定法（右侧）所示，与对赋形剂进行处理的Tg2576控制（Tg-IND-ctr）相比，增加小鼠的整体大脑的脑源性神经营养因子的等级。（c）处理一周后进行脉络性条件化测试（每组n=5），与Tg-IND-ctr相比，Tg-IND-AM206的冻结时间更长。（d）线索性条件化测试中，每组之间未显示任何差异（每组n=5）。虚线表示声学线索。（d）Y-迷宫测试将AM206的鼻腔传达与控制小鼠相比较，显示循环行动的增加（每组n=5）。*P＜0.05。条表示平均±标准平均误差。

【实施方式】

下面，通过实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅仅是为了更加具体地说明本发明，根据本发明的主旨，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

【实施例】

【实验材料及实验方法】

【阿尔茨海默病模型】

本实验是接受国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC，Association for the Assessment and Accreditation of LaboratoryAnimal Care International）认可的首尔大学附属医院的实验动物护理和使用委员会（IACUC，Institutional Animal Care and UseCommittee）的许可后实施的。将包括瑞典双重变异（瑞典变异；Lys670→Asn,Met671→Leu）的人类淀粉样蛋白前驱体蛋白质（APP，amyloid precursor protein）的695-氨基酸异构体在朊蛋白启动子的调节下进行表达的Tg2576小鼠（太康，哈德森，纽约，美国）（Hsiaoet al.,1996）用作阿尔茨海默病转基因模型。将转基因及野生型小鼠在独立的笼子及室温（25℃）下，自由接触饮水，并在12小时光-暗周期条件下维持，并将7个月龄或12个月龄的小鼠用于miRNA的分析。

【miRNA微陈列】

使用小鼠或人类用miRNA微陈列试剂盒来执行miRNA微陈列（Agilent miRNA Microarray 815K kits，Agilent，Santa Clara，CA）。收集从每两只小鼠大脑中提取的核糖核酸为一个。冷冻的人类的颞皮层（temporal cortex）试样从波士顿大学阿尔茨海默病中心（BostonUniversity Alzheimer’s Disease Center,Boston,MA）的脑库（brainbank）中获得。本发明人所利用的小鼠试样符合以下的核糖核酸质量标准。即，260/280比率＞1.8，260/230比率＞2.0，28S/18S核糖体核糖核酸（rRNA）比率＞1.6以及核糖核酸完整数（integrity number）＞8.0。由于人类验尸试样经历核糖核酸的死后退化（post-mortemdegradation），因此，阿尔茨海默与控制试样对准了死后差异。

【实时聚合酶链式反应】

miRNA的实时聚合酶链式反应利用miRNA检测试剂盒（mirVana qRT-PCR miRNA Detection Kit）及引物套组（美国应用生物系统公司，福斯特城，加利福尼亚州）来执行。使用内生的核仁小核糖核酸202（snoRNA202）检测试剂盒（endogenous snoRNA202detection kit,美国应用生物系统公司）测定等级，并用于miRNA等级的正常化。miRNA以35周期进行扩增后，以0.1%琼脂糖凝胶电泳实现可视化。用于脑源性神经营养因子信使核糖核酸表达的实时聚合酶链式反应使用基因表达试剂盒（TaqMan gene expression assay，美国应用生物系统公司）的引物及探针来执行。

【miRNA的原位杂交】

利用锁核酸（LNAs）对miRNA的原位表达进行分析。上述锁核酸对miRNA的检测所需的短探针大大增加杂交温度，从而利用强化的严格条件（stringency）的双环核糖核酸类似物（Obernosterer et al.，2007）。用于miRNA检测的锁核酸探针从丹麦Exiqon公司购买，并利用DIG30end标记的试剂盒（罗氏公司）对冷冻-切片化组织进行了标记（Obernosterer et al.,2007）。

【miRNA的靶基因预测】

miRNA成熟序列数据库从miRBase（http://www.mirbase.org）中获得。为了追究小鼠基因3’-非翻译区（UTR，Untranslated Regions）的miRNA靶位置，利用三种靶预测程序。即，TargetScan（http://www.targetscan.org）、（Lewis,2005）、PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/）、（Krek，2005）及microT（http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/）（Kiriakidou,2004）。

【阿尔茨海默病小鼠的拮抗剂（antagomirs）处理】

向小鼠的腹腔注射1%克他命（ketamine，30mg/kg）及盐酸塞拉嗪（xylazine hydrochloride，4mg/kg），来进行麻醉。使用30-口径汉密尔顿注射器，将包含0.5nmol的拮抗剂AM206（2’-O-甲基化-5’-ccacac acu ucc uua cau ucc a-3’）或争夺的序列控制拮抗剂（2’-O-甲基化-5’-aag gca agc uga ccc uga agu u-3’）（柏业公司，大田，韩国）的1μl的磷酸盐缓冲液（PBS,phosphate-buffered saline）按以下坐标向三处脑室注入5分钟。即，从前囱（bregma）到前后方向（antero-posterior），-1.06mm；左右方向（medio-lateral），0.00mm；背腹方向（dorso-ventral），-2.4mm。注入注射针后，追加性地在坐标维持5分钟后慢慢清除。为了对AM206的扩散进行可视化，向小鼠注入Cy3-标记AM206（Cy3-2’-O-甲基化-5’-cca cac acu ucc uua cau ucc a-3’，柏业公司）来代替AM206。为了AM206的鼻腔给药，对小鼠进行麻醉后，以端正头部的垂直姿势（upright position）仰卧。每隔2分钟利用吸液管将包含5nmol的AM206或Cy3-标记AM206的0.1%v/v焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）处理的蒸馏水24μl向每个外鼻孔滴入4μl，来进行给药（共计6分馏（fractions））。控制Tg2576小鼠按其周龄以同量的赋形剂（vehicle）进行处理。

【脉络性及线索性恐怖条件化（Contextual and cued fearconditioning）】

恐怖条件化根据现有方法（Jeon et al.,2008），在恐怖-条件化冲击试验箱系统（Coulbourn仪器，怀特霍尔公司，宾夕法尼亚州，美国）中实施。为了实现条件化，将小鼠放置在恐怖-条件化装置试验箱5分钟后，然后给予28-s听觉的条件化刺激，然后以非条件化刺激，向地面格施加2秒钟的0.7-mA冲击。上述过程以60秒钟的间距反复进行3次。为了评价脉络性记忆，经过24小时条件化之后，将小鼠重新移至没有听觉刺激的训练装置之后，观察萎缩行动5分钟。为了评价线索性记忆，经过24小时条件化后，向具有其他味道、地面及视觉的试验箱内移送小鼠，并对其行动进行5分钟监控。上述实验的最终3分钟内，将动物裸露在听觉刺激中。测定以表示除了呼吸运动之外的运动缺乏的蹲伏位置来定义的萎缩行动的长度，对恐怖反应进行定量化（Jeon et al.,2008）。

【Y迷宫测试】

根据现有方法实施了Y-迷宫测试（Sarter et al.，1988）。利用黑色塑料制备迷宫，将每个臂以35cm的长度、15cm的高度、5cm的宽度进行制备，并位于相同角度。将小鼠位于一个臂的末端，并通过迷宫进行5分钟的自由移动。视觉性地对臂的进入系列进行记录，并将小鼠的脚后跟完全位于臂内的情况评价为臂的进入。交叉次数（Alternation）是定义为向三组重叠套组的三个臂连续进入。%交叉次数是以实际可能性（actual to possible）的比来计算。

【蛋白印迹法】

将麻醉的小鼠以断头方式处死，将大脑直接提取。根据现有的方法对每个大脑的匀浆进行处理，从而能够实施蛋白印迹法（Lee et al.,2009），在此情况下，利用对脑源性神经营养因子（brain-derivedneurotrophic factor，艾美捷公司）、胰岛素样生长因子（insulin-likegrowth factor-1，艾美捷公司）、Notch3（艾美捷公司）、MEOX2（艾美捷公司）或β-肌动蛋白（圣克鲁斯生物技术）的抗体。利用增强的化学发光试剂（皮尔斯公司，罗克福德，伊利诺伊州，美国）来扩散多个污渍，并进行数码扫描（GS-700；伯乐公司，赫告斯，加利福尼亚，美国）。利用分子分析TM软件（伯乐公司）测定每个带子的β-肌动蛋白的相对性光学密度。在大脑匀浆中，Aβ40及Aβ42的等级利用Aβ超灵敏酶联免疫吸附测定（AβUltrasensitive ELISA）试剂盒（英杰公司）来测定。

【Tg2576小鼠的组织学分析】

将小鼠进行麻醉，并在该小鼠的心脏灌流包含10ml的冷盐水及10m的4%多聚甲醛（paraformaldehyde）的0.1M磷酸盐缓冲溶液。将20-μm厚度的切片作为对4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole）、乌乐树（Ulex europaeus）凝集素（lectin）（埃克特实验室，伯灵格姆，加利福尼亚州）或微管相关蛋白2（MAP2，microtubule-associated protein2）（Chemicon-密理博公司,比尔里卡,马赛诸塞州）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP，glial fibrillary acidicprotein）（圣克鲁斯生物技术，圣克鲁斯，加利福尼亚州）、突触素（synaptophysin）及双皮层蛋白（doublecortin，艾美捷公司，剑桥，马赛诸塞州）的抗体来进行染色。为了获得海马的突触素染色的最佳密度，从每个小鼠采集的三个依次性冠状面组织切片（500-μm间隔，从前囱大约前后方向-1.5mm至-2.5mm）使用图像-J（Image-J）（国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州）与控制Tg2576小鼠以相对性的值来进行分析。相邻的三个海马切片（500-μm间隔）在齿状回（dentate gyrus）的果粒层（subgranular layer）测定微管相关蛋白-免疫反应细胞的数量，并通过齿状化的长度（1200μm）来形成一般化。

【双重萦光素酶实验（Dual luciferase assay）】

在可能的靶基因的3’-非翻译区（3’-UTR）位置的寡核苷酸，在5’-末端及3’-末端包含限制性内切酶SacI及XbaI来进行设计。之后，利用pmirGLO双重萦光素酶miRNA靶表达载体（普洛麦格公司，麦迪逊，威斯康辛州）进行亚克隆。并使用了具有脑源性神经营养因子的整体3’-非翻译区（3’-UTR）序列（Swith DB公司，门洛帕克市，加利福尼亚州）的转染萦光素酶报告基因的构建。将海拉（Hela）细胞（每孔5×10⁴细胞）在24-孔板上培养24小时后，以30pmol的miRNA-206复式（duplexes）（或争夺的miRNA复式；柏业公司，大田，韩国）及50ng的萦光素酶表达载体，利用脂质体（Lipofectamine2000，英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）对细胞进行转染。萤火虫（Firefly）及雷尼利亚（Renilla）萦光素酶活性在48小时之后使用萦光素酶1000检测实验系统（1000Assay System,普洛麦格公司）来进行评价，并为了进行分析而使用一般值（萤火虫英冠素酶活性/雷尼利亚萦光素酶活性）

【树突棘（dendritic spine）密度的分析】

从E17C57BL/6小鼠胚芽中培养了原代海马神经元。神经元在形状细胞（astrocyte）饲养层上的多熔素（polylysine）-编码的盖玻片中培养，并维持N2培养基（英杰公司）。为了产生Aβ低聚物，将包含5mM Aβ42肽或争夺Aβ肽（密理博公司）的二甲基亚砜（DMSO，dimethylsulfoxide）利用冷培养基稀释成100μm后，进行10分钟的破碎，并在4℃中放置24小时。在培养3周后，将神经元处理成5μmAβ低聚物。与此同时，向培养基加入500nm的AM206或争夺拮抗剂。48小时后，神经元在40分钟内固定在4%多聚甲醛，并通过若丹明（rhodamine）-标记鬼笔环肽（Phalloidin，英杰公司）进行染色，利用共聚焦激光扫描显微镜（LSM510Meta Confocal microscope，卡尔蔡司）观察树突棘。从每组30个细胞中随机选择的100个树突节片中计算棘数。密度以10μm的树突长度进行计算。

【数据分析及统计】

为了miRNA的表达而设的热图（Heat maps）利用Z-分数（Z-score）来制备。为了两组之间的组间比较而利用了曼-惠特尼U检验，并为了三组以上的比较而利用了非参数变化分析。并且，为了事后进行每组间的比较，利用了曼-惠特尼U检验。所有统计性分析通过统计产品与服务解决方案（SPSS，Statistical Product and ServiceSolutions）（17.0版,SPSS公司,萨默斯,纽约）来执行。双尾概率p值（two-tailed p-value）小于0.05时，认为统计上才有意义。

【实验结果】

【阿尔茨海默模型中miRNA-206的向上调节】

将阿尔茨海默模型中变化的miRNA中的一个是脑源性精神营养因子的调节中重要的miRNA的假设作为基础，本发明人首先利用微陈列对7-及12-月龄的野生型（WT）及作为阿尔茨海默的转基因模型的Tg2576小鼠之间的miRNA进行比较（图1a）。Tg2576小鼠在7-月龄时，呈现增加的Aβ42表达，并在12-月龄呈现在记忆方面有障碍。在7月龄及12月龄小鼠中，呈现最为向上调节的miRNA是miRNA-206。实时聚合酶链式反应在12月龄Tg2576小鼠中确认miRNA-206的向上调节（图1b）。

原位（In situ）杂交（hybridization）也在12月龄Tg2576小鼠的大脑中呈现miRNA-206的分散的表达增加（图1c）。与此相似的，实时聚合酶链式反应呈现出，在脑神经瘤（Neuro-2a）小鼠的神经母细胞瘤细胞中，Aβ42增加miRNA-206的等级，或在人脐静脉内皮细胞（HUVEC，human umbilical vein endothelial cells）中并非如此（图1d）。为了追究人类阿尔茨海默病和此类发现是否相关，对阿尔茨海默患者（Braak stage V,clinical dementia rating[CDR]3）及类似的性别和年龄的4名非-阿尔茨海默病控制组（Braak stage I，CDR0）的人类上颞皮层试样中检测miRNA-206的等级。验尸中，大约在3小时至3.5小时的死后检测是获得人类脑组织的最短时间。人类验尸会经历核糖核酸的死后衰退，并且，28S/18S核糖体核糖核酸比率及核糖核酸完整数（integrity numver）在小鼠的情况下，会在死后2小时后减少。阿尔茨海默及控制试样根据死后间隔来比较，在此类条件下，通过实时聚合酶链式反应，追究出患有阿尔茨海默病的大脑中miRNA-206进行向上调节（图1e）。

【阿尔茨海默病模型中的拮抗剂-206的治疗学应用】

阿尔茨海默模型中，miRNA-206的持续性向上调节能使利用它的靶基因探索成为可能，而实际上，TargetScan、PicTar及microT在小鼠及人类的3’-非翻译区（3’-UTRs）部位发现了对脑源性神经营养因子进行编码的三种推断miRNA-206的靶（图2a）。本发明人根据Tg2576小鼠的月龄发现miRNA-206的等级的增加及脑源性神经营养因子的蛋白质等级的减少，从而使其得到说明书的支持。

为了进行更多实验，包含推断为小鼠的脑源性神经营养因子信使核糖核酸的结合部位的部位及脑源性神经营养因子信使核糖核酸的3’-非翻译区（3’-UTRs），利用具有相关靶位置的miRNA-206及萦光素酶载体，使海拉（Hela）细胞转染（脑源性神经营养因子#1，#2，#3）。包含脑源性神经营养因子信使核糖核酸的整体3’-非翻译区（3’-UTRs）及具有脑源性神经营养因子#3的载体的细胞中，miRNA-206的转染减少萦光素酶的活性，并且，这呈现miRNA-206通过与3’-非翻译区（3’-UTRs）的结合直接抑制脑源性神经营养因子信使核糖核酸的翻译（图2b）。本发明人还发现，将拮抗剂AM206同时-转染（co-transfection）为一般化的miRNA-206的脑神经瘤细胞及人脐静脉内皮细胞中，脑源性神经营养因子的蛋白质等级会减少（图2c）。脑神经瘤细胞中Aβ低聚物的处理增加了miRNA-206，并且，在没有减少脑源性神经营养因子信使核糖核酸等级的情况下，减少脑源性神经营养因子蛋白质等级，而这表示脑源性神经营养因子的翻译抑制（图2d）。通过Aβ低聚物的脑源性神经营养因子蛋白质等级的减少对细胞处理AM206，从而进行恢复（图2e）。原代小鼠海马神经元中Aβ低聚物通过AM206处理，来减少恢复的树突的密度（图2f）。

这些结果由于脑源性神经营养因子的表达能通过miRNA-206来进行向上调节，因此，提示阿尔茨海默进行的可能性。为了在体内（invivo）追究miRNA-206的功能，将Cy-3标记的AM206（Cy3-AM206）向12-月龄Tg2576小鼠的三处脑室进行注入，并观察到Cy3-AM206在1周后向海马及周边组织扩散（图2g）。通过荆豆属（Ulex）-外源凝集素-阳性内皮细胞、胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP，glialfibrillary acidic protein）-阳性神经胶质细胞及微管相关蛋白（MAP2）-阳性神经细胞检测Cy3-AM206（图2h）。实际上与争夺拮抗剂相比，将AM206向脑室内进行注入的12-月龄Tg2576小鼠的脑源性神经营养因子大脑等级在1周后有相当的增加（图2i）。尤其，Tg2576小鼠的AM206注入对CREB（cAMP response element binding）进行活性化，对C-Jun氨基端激酶（c-JNK，Jun N-terminal kinase）及糖原合酶激酶（GSK-3β，glycogen synthase kinase3β）进行惰性化。这表示脑源性神经营养因子标记在增加。

【拮抗剂-206在阿尔茨海默小鼠中增加了记忆力及突触再生】

进行12个月的记忆测试前，各1周或3周向Tg2576小鼠的三处脑室注入AM206，来表示增加的脑源性神经营养因子，从而确认治疗效果。脉络性恐怖条件化测试中，为了Tg2576控制小鼠的冻结时间（freezing time）与野生型小鼠相比更低，这表示Tg2576小鼠的海马记忆具有障碍（图3a）。注入后1周至3周，冻结时间都是处理AM206的Tg2576小鼠比控制Tg2576小鼠高，这表示至少3周内AM206增加海马记忆功能。在线索性条件化测试中，扁桃体也起到核心作用，并且，多个组之间没有差异（图3b）。Y-迷宫测试中注入1周后，用AM206进行处理的Tg2576小鼠比Tg2576控制小鼠显示更好的行动（图3c）。相反，AM206对皮质或海马的整体标志物没有任何影响，这能通过硫磺素（Thioflavin）-S染色来确认，并且，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）进行检测的结果，发现对Aβ40或Aβ42的大脑等级未起到影响。因此，能了解的是，通过AM206小鼠的记忆提高并不是Aβ等级的变化引起的，而是机制引起的。

由于AM206增加脑源性神经营养因子表达，因此，对海马突触素等级中的效果及微管相关蛋白阳性细胞的数量进行了测试。Tg2576控制小鼠比野生型小鼠具有更低的突触素等级（图3d）。测试前1周或前3周向Tg2576小鼠注入AM206与Tg2576控制小鼠相比，增加突触素表达，并且，这表示增加突触的密度。尤其，Tg2576控制小鼠中，尽管海马齿状回的微管相关蛋白阳性细胞比野生型小鼠更少，但在染色前1周或前3周注入AM206的小鼠比Tg2576控制小鼠显示更多的微管相关蛋白阳性细胞（图3e），这表示海马的神经产生的增加。

【拮抗剂的鼻腔给药效果】

治疗上的鼻腔给药由于是沿着嗅觉神经通道从鼻腔迂回血脑屏障（blood-brain barrier）而直接向大脑传达，从而很容易使药物迅速接近大脑，因此，药物传达方法中，此类便利的非侵入式方法对阿尔茨海默患者是有效的。本发明人评价了拮抗剂经由这些路径后是否很好地传达。向鼻腔传达的Cy3-标记AM206在24小时之后能在小鼠的嗅球（olfactory bulb）、皮质及海马中能检测到（图4a）。多数的微管相关蛋白-阳性神经细胞，荆豆属（Ulex）-外源凝集素阳性内皮细胞及少数的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）-阳性神经胶质细胞用Cy3-AM206标记。鼻腔给药的AM206在1周后在Tg2576小鼠中与赋形剂给药相比较时，增加了脑源性神经营养因子的大脑等级（图4b）。尤其通过1周后的Y-迷宫测试（图4e）及恐怖条件化测试（图4c及4d）的检测结果，AM206的鼻腔传达增加了小鼠的记忆能力。此类结果表示通过鼻腔的拮抗剂向大脑的传达是能实现的。

【讨论】

在之前的研究中，对阿尔茨海默的大脑中的miRNA的作用及变化进行追究，并对调节BACE1/β-分泌酶（secretase）表达或NF-κB-诱导炎症的miR-29a/b-1、miR-107、miR-146a、miR-298及miR-328等多种miRNA进行区别。miRNA-206一般表达在肌肉组织，并参与肌肉发生及神经肌肉接合的再生。miRNA-206的等级在一般性的大脑中较低，但在阿尔茨海默中则显示非正常性的高表达，并且，实验性的大脑中的向上调节在脑缺血及神经毒性中裸露后才能观察。人类情况下，肌萎缩（amyotrophic lateral sclerosis）患者的额皮质中，增加了miRNA-206的表达，而在精神分裂症（schizophrenia）患者则观察到miRNA-206的遗传性变化。本发明的结果表示，miRNA-206也能抑制脑源性神经营养因子的等级，从而也对阿尔茨海默的发病进行干预。因此，本发明提供利用miRNA-206调节因子来接近阿尔茨海默的治疗的明确的理由。

阿尔茨海默模型中，通过慢病毒载体或利用蛋白质给药泵及神经干细胞的情况下，能够将脑源性神经营养因子向大脑传达，也能提高记忆能力及突触密度。但是，将神经营养性因子向大脑传达需要进行侵袭性的手术，也会因中和抗体的产生而受到痛苦。本发明表示AM206的鼻腔传达是为了提高大脑内脑源性神经营养因子的可实现的代替方法，并提示通过利用拮抗剂的类似的接近，也能用于其他大脑疾病的应用可能性。

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以上，对本发明的特定部分进行了详细记述，这些具体的记述仅仅是优选实例，本发明的范围并不局限于此，这对于本发明所属技术领域技术人员来说是显而易见的。因此，本发明的实质性范围应通过所附的权利要求书及其等同技术方案来定义。

Claims

1.一种神经退行性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，包含：

（b）药剂学上能接受的载体。

2.根据权利要求1所述的神经退行性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上述反义寡核苷酸具有与序列表第一序列的核苷酸序列互补的序列。

3.根据权利要求1所述的神经退行性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上述反义寡核酸为DNA分子或RNA分子。

4.根据权利要求3所述的神经退行性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上述反义寡核苷酸为RNA分子。

5.根据权利要求1所述的神经退行性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上述反义寡核苷酸为核糖核苷酸、DNA、2’-0-改性寡核苷酸、硫代磷酸-主链DNA、肽核酸或锁核酸。

6.根据权利要求1所述的神经退行性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上述神经退行性疾病为阿尔茨海默病、痴呆症、亨廷顿氏病、帕金森氏病或肌萎缩侧索硬化症。

7.一种阿尔茨海默病的诊断用试剂盒，其特征在于，包含选自由miR-424*、miR-18b*、miR-135a*、miR-1228、miR-320、miR-296-5p、miR-557、miR-338-5p、miR-206、miR-92a、miR-1238、miR-513a-5p、miR-423-5p、miR-188-5p、miR-140-3p、miR-575、miR-640、miR-1237、miR-191*及miR-134组成的组中的miRNA的核苷酸序列、上述miRNA的核苷酸序列互补性序列或上述互补性序列的片段。

8.根据权利要求7所述的阿尔茨海默病的诊断用试剂盒，其特征在于，上述miRNA为miR-206。

9.一种检测阿尔茨海默病标志物的方法，其特征在于，为了提供神经退行性疾病的诊断或预后所需的信息，通过对人类的生物学性试样中的miR-424*、miR-18b*、miR-135a*、miR-1228、miR-320、miR-296-5p、miR-557、miR-338-5p、miR-206、miR-92a、miR-1238、miR-513a-5p、miR-423-5p、miR-188-5p、miR-140-3p、miR-575、miR-640、miR-1237、miR-191*或miR-134的表达进行检测的方法来进行。

10.根据权利要求9所述的检测阿尔茨海默病标志物的方法，其特征在于，上述miRNA为miR-206。

11.一种神经退行性疾病的预防或治疗方法，其特征在于，

包括将药剂学组合物给药到实验对象的步骤；

上述药剂学组合物包含：

（b）药剂学上能接受的载体。

12.根据权利要求11所述的检测阿尔茨海默病标志物的方法，其特征在于，上述反义寡核苷酸具有与序列表第一序列的核苷酸序列互补的序列。

13.根据权利要求11所述的检测阿尔茨海默病标志物的方法，其特征在于，上述反义寡核酸为DNA分子或RNA分子。

14.根据权利要求13所述的检测阿尔茨海默病标志物的方法，其特征在于，上述反义寡核苷酸为RNA分子。

15.根据权利要求11所述的检测阿尔茨海默病标志物的方法，其特征在于，上述反义寡核苷酸为核糖核苷酸、DNA、2’-0-改性寡核苷酸、硫代磷酸-主链DNA、肽核酸或锁核酸。

16.根据权利要求11所述的检测阿尔茨海默病标志物的方法，其特征在于，上述神经退行性疾病为阿尔茨海默病、痴呆症、亨廷顿氏病、帕金森氏病或肌萎缩侧索硬化症。

17.根据权利要求11所述的检测阿尔茨海默病标志物的方法，其特征在于，上述给药方式为鼻腔内给药。