CN107849061A - H3K9me3调控用于增强认知功能的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了H3K9me3调控用于增强认知功能和治疗焦虑相关病症的用途。将含有治疗有效量的SUV39H1抑制剂(包含ETP69的类似物)的组合物施用于对象。治疗有效量在治疗衰老和年龄相关疾病的认知功能障碍中是有效的。

Description

H3K9me3调控用于增强认知功能的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年6月8日提交的美国临时申请序列号62/172,690的利益，为了本公开的完整性而将所述美国临时申请通过应用并入本文。

关于在联邦政府赞助的研究和开发下作出的发明的权利的声明

本发明是有政府支持在由NIH国家老年研究所授予的资助AG012694和AG000538下进行的。政府对本发明享有一定的权利。

技术领域

本发明的实施方式涉及治疗在衰老的、年龄相关的和脑源性神经营养因子(BDNF)依赖性疾病中的认知功能障碍。更具体地，本发明涉及通过单独或与其他认知增强剂或增强手段组合地给药SUV39H1抑制剂来治疗认知功能障碍，所述SUV39H1称为ETP69(消旋-(3S,6S,7S,8aS)-6-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2,3,7-三甲基-1,4-二氧代六氢-6H-3,8a-桥二硫代吡咯并[1,2-a]吡嗪-7-甲腈)。

背景技术

已知表观遗传调控异常促成年龄相关记忆缺陷的几个方面。在过去几年中，许多研究已经鉴定出衰老过程中组蛋白甲基化状态的变化。组蛋白尾部的甲基化通常发生在特定赖氨酸残基处，例如H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79和H4K20，并且可以激活或抑制转录。特别地，H3K9的三甲基化(H3K9me3)是重要的抑制性组蛋白标记，并涉及基因沉默。H3K9me3的建立取决于在围绕中心的异染色质处调节H3K9三甲基化的组蛋白甲基转移酶SUV39H1的活性。

虽然H3K9甲基化的变化已经被暗示是几种年龄相关变化如持续血管炎症、糖尿病和代谢记忆的潜在表观遗传学机制，但之前还没有探索过衰老对脑中组蛋白赖氨酸调节的直接作用。也没有过任何研究直接说明SUV39H1抑制和相应的H3K9me3下调对记忆和认知功能的影响。在调节促成组蛋白甲基化的酶的功能的甲基转移酶和去甲基酶的小分子抑制剂的开发中的最近进展因此可以是抵消年龄相关缺陷的有力手段。

迫切需要鉴定认知功能障碍如与衰老、老年相关病症和阿尔茨海默氏病相关的认知缺陷的疗法和治疗方案。

发明内容

本发明的一种或多种实施方式涉及H3K9me3调节用于增强衰老中的认知功能以及治疗年龄相关疾病如痴呆以及与脑和神经功能相关的其他缺陷的用途。

一些最近的研究已经揭示出，组蛋白甲基转移酶和去甲基酶牵涉衰老和长寿。甲基转移酶催化特定基因组位点的组蛋白甲基化。然而，人们从来没有探索过组蛋白甲基化怎样贡献于衰老中的学习和记忆。H3K9的三甲基化(H3K9me3)是重要的抑制性组蛋白标记，并通常涉及基因沉默。本发明的实施方式首次鉴定出H3K9me3及其组蛋白甲基转移酶(SUV39H1)在介导海马体的记忆功能中的重要作用。使用新颖和选择性抑制剂的SUV39H1的药理学抑制，降低老年动物的海马体中的H3K9me3水平并且改善了在物体位置记忆任务、恐惧条件任务以及复杂空间环境学习任务中的表现。SUV39H1的抑制诱导老年动物海马体中细的和粗短的树突棘密度的增加不是蘑菇棘的增加，并增加为长时程增强(LTP)的关键指标的脊柱表面处含有GluR1的AMPA受体的水平。

此外，与对照动物相比，在药物处理的动物的海马体中有与总BDNF蛋白水平一致的BDNF基因启动子区域处的变化。BDNF是神经营养因子家族的关键成员，除衰老以外，还涉及广泛的神经退行性疾病，包括情绪障碍、抑郁症、双相情感障碍和神经精神病如精神分裂症。通过树突分枝，突触巩固，强化TrkB信号传导等多种过程，BDNF为神经元可塑性、神经元健康和脑内存活服务。这里提供的数据显示，SUV39H1抑制介导脑中的BDNF调节。因此，所述化合物可以用于除了与年龄相关认知缺陷相联系的这些疾病之外的疾病，这所述疾病中BDNF水平不足以维持正常表现，包括抑郁症、精神分裂症、情感障碍及其他。总之，这些数据表明，SUV39H1抑制和伴随的H3K9me3下调介导海马体中的基因转录并且逆转海马体记忆中的缺陷，而且能够有助于逆转其他BDNF-依赖性疾病如上面提及的但不限于上面这些。

使用已知为海马体依赖性的被称为物体位置记忆(OLM)的空间记忆任务评估H3K9me3操纵在老年动物中的效果。这样做是为了确定ETP69治疗是否在试验前与试验后的施用范例中差异地影响了在OLM任务中的表现准确性。对于OLM任务的实验前范例与试验后范例允许测试空间记忆形成的两个不同部分。特别地，训练前药物施用评估记忆的获得和回想，而训练后药物施用靶向于记忆巩固和回想。发现，在获得阶段之前约30分钟(试验前)或获得后立即(试验后)施用的10mg/kg的药物的腹膜内注射(“i.p.”)改善了在OLM任务中的表现。

所述化合物对学习和记忆的作用的另一个测试利用称为无监督学习任务(USL)的任务的使用。所述USL任务是行为范例，其中允许小鼠在特定的时间段内自由探索四隔间环境。这段时间内的整体活动和对测试区的探索的减少被认为是对学习和短期记忆的一种测定。如果这在两组中的发生率相似，则表明在短期学习和记忆中没有显著性差异。我们发现，使用ETP 69(10mg/kg；i.p.)进行治疗的动物在治疗后24小时在习惯/探索(以行进的距离测定)中表现出显著下降。单因素方差分析显示显著性组间差异(F_3,19＝4.05，p<0.05)，并且事后检验证实，用ETP 69处理的动物在第1天和第2天的表现之间的差异(p<0.05)，但未在年龄匹配的控制组中发现此差异。

在另一个测试中，使用情境恐惧条件化测试，该化合物有效改善海马体依赖性学习和记忆。我们发现，用ETP69处理的老年动物(n＝7只/组)与老年对照相比表现出改善的表现(p≤0.01)。

总之，这些行为数据表明，施用ETP69改善一系列测试中的海马体-依赖性学习和记忆。所述数据还表明，衡量记忆和认知表现的其他任务也可以受到ETP69施用的积极影响。

由于OLM、恐惧条件化和USL都是海马体特异性任务，所以还测试了在海马体组织样本中进行药物处理之后海马体中的H3K9me3总水平。结果表明了药物处理在从药物处理动物的海马中获得的组蛋白提取物中的显著效果。T-测试分析显示用ETP69处理的动物中H3K9me3水平的下降(试验前，p<0.05)。

本发明的实施方式提供了H3K9me3在增强记忆和认知功能中的作用的第一项证据，并且显示可以通过药理学干预逆转这种组蛋白甲基化标记。所述研究还提供证据证明，通过操纵调节组蛋白甲基化的酶，有可能改变对象的染色质状态并恢复衰老大脑中的记忆功能。最后，可以单独地或与多种生活方式或药理学干预一起使用该化合物来增强认知表现。认知功能可以被细分为并包括子域如记忆(包括工作和情景记忆)、学习、执行功能、注意、处理速度和总体认知功能如日常生活活动等。使用组合干预的方法可以增强超过任一单独干预的认知能力。

附图说明

从结合以下附图给出的下文更具体的描述来看，本发明的上述和其它方面、特征和优点将变得更加明显，所述附图中：

图1示出了ETP69(消旋-(3S,6S,7S,8aS)-6-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2,3,7-三甲基-1,4-二氧代六氢-6H-3,8a-桥二硫代吡咯并[1,2-a]吡嗪-7-甲腈)的结构。

图2是在小鼠的新地点位置任务中的获得阶段之前30分钟以10mg/kg和20mg/kg(i.p.)施用所述药物的效果的图形化展示。

图3是显示以赋形剂或10mg/kg的ETP69进行处理的小鼠之间的探索差异的OLM测试结果的图形化展示。

图4A-B是在老年小鼠的新物体位置任务中的获得阶段之前30分钟(试验前)或获得之后立即(试验后)以10mg/kg(i.p.)施用所述药物的效果的图形化展示。

图5A-B是在年轻小鼠的新物体位置任务中的获得阶段之前30分钟(试验前)或获得之后立即(试验后)以10mg/kg(i.p.)施用所述药物的效果的图形化展示。

图6A是ETP69在无监督学习任务中的效果的图形化展示。

图6B是ETP69在无监督学习任务中的效果的图形化展示。

图7是ETP69在恐惧条件化任务中的效果的图形化展示。

图8A是年轻小鼠与老年小鼠的海马提取物中的H3K9的三甲基化水平的图形化展示。

图8B是年轻小鼠与老年小鼠的小脑提取物中的H3K9的三甲基化水平的图形化展示，n＝3只/组，p<0.05。

图8C是给药10mg/kg的药物(i.p.)或赋形剂的老年小鼠中的给药24小时后的H3K9的三甲基化水平的图形化展示，n＝7只/组，*p<0.05。

图9A-C是ETP69处理对在海马体的CA1区域中的棘计数(细、蘑菇、粗短)的作用的图形化展示，*p<0.05，与年龄匹配对照相比显著不同(学生的不成对t检验)。**p<0.01，与年龄匹配对照相比显著不同(学生的不成对t检验)。

图10呈现了显示ETP69处理对海马体的CA1中的棘的作用的代表性图像。

图11(A)显示尺寸门控突触体的代表性密度图；(B)显示ETP69处理后突触体的PSD-95阳性亚群增加的代表性直方图；(C)在从老年小鼠获得的突触体中进行ETP 69处理后PSD-95阳性事件增加；(D)显示尺寸门控突触体中表面GluR1和PSD-95表达的代表性密度图；(E)在从老龄小鼠获得的突触体中进行ETP69处理后GluR1和PSD-95双阳性事件(右上象限)增加(p＝0.05，与老年对照小鼠相比)；(F)显示尺寸门控突触体中pAkt和PSD-95的代表性密度图。ETP69处理后pAkt和PSD-95双阳性事件(右上象限)增加；(G)在从老龄小鼠获得的突触体中进行ETP 69处理后pAkt和PSD-95双阳性事件增加(p<0.05，与对照老年对照小鼠相比)。

图12A是与对照相比，在OLM任务中的获得阶段之前30分钟或刚好在获得阶段之后给药10mg/kg药物(i.p.)的组中海马体内BDNF蛋白水平增加的图解说明。p<0.01，与对照相比显著不同。

图12B是显示与对照相比，在用ETP69处理的动物中BDNF的外显子1处的H3K9me3水平显著较低(p＝0.056)的图形化表示。对于对照n＝7，且对于用ETP69处理的动物n＝9。

图13是在氧-葡萄糖剥夺(OGD)后ETP69对神经元存活的作用的图解说明。

图14A-B是ETP69对14DIV海马神经元中H3K9me3水平的作用的说明(A，凝胶图像；B，定量，n＝3，*p<0.05)。

图15A是显示ETP69处理(20nM，24小时)增加的PSD-95免疫反应性14DIV海马神经元的图像。

图15B是显示ETP69处理(20nM，24小时)增加的树突状F-肌动蛋白染色(树突棘的标记)的图像。

图16是说明通过蛋白质印迹法测定的在Ser133处ETP69增加的CREB磷酸化的图像。

具体实施方式

本发明包含H3K9me3调控用于增强认知功能的的用途，现在将对此进行描述。在下列示例性描述中，提出多种具体细节以提供本发明的实施方式的更深入理解。然而，将显然易见的是，对于本领域的普通技术人员来说，可以不采用本文所述的所有方面的特定细节而实践本发明。此外，虽然以示例性顺序提出步骤或程序以提供一种或多种系统和方法的理解，但所述示例性顺序并不意味着是限制性的。本领域的普通技术人员将认识到，可以以不同的顺序进行所述步骤或程序，并且在不偏离本发明的精神或范围的情况下，一个或多个步骤或程序可以同时或在多重程序流中进行。在其他情况下，没有详细描述本领域普通技术人员已公知的具体特征、定量或测量，以免使本发明模糊不清。读者应该注意，尽管本文提出了本发明的实施例，权利要求以及任何等同物的全部范围才限定本发明的界限和范围。

为了更好地理解所公开的实施方式、其操作优点以及通过其使用达到的特定目的，应该参考其中说明了示例性公开的实施方式的附图和描述性内容。所公开的实施方式并非旨在限于本文提出的特定形式。要理解，等同的各种省略和替代是在预期内的，因为情况可能暗示或提供变通，但是这些旨在涵盖应用或实施。

本文中的术语“第一”、“第二”等不表示任何顺序、数量或重要性，而是用于区分一个元件与另一个元件，并且本文中的术语“一”和“一个”不表示数量的限制，而是表示存在至少一个所提及的项目。

如本文所用，术语“剂量单位”是指适合作为动物的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有预定量的活性物质，所述活性物质经计算与所需的稀释剂例如载体或赋形剂结合产生期望的治疗效果。本发明的单位剂量的规格受支配于和直接取决于(a)活性物质的独特特征和(b)配制这种用于动物治疗用途的活性物质的领域中固有的限制。

本文使用的术语“治疗有效量”是指所施用的组合物中所含的本发明的SUV39H1抑制剂化合物的量是足以达到预期目的的量，所述预期目的在这种情况下例如是为了改善与衰老、阿尔茨海默病和其他BDNF依赖性疾病相关的认知缺陷。为了本发明的目的，可以通过组蛋白甲基化标记的逆转或去除来测定年龄相关认知缺陷的治疗。例如，通过有效调节有助于组蛋白甲基化的酶的功能，可以逆转年龄相关的认知缺陷。

相应地，通过测定患者中回忆的增加，本领域技术人员可以容易地确定本发明的化合物的量是否是治疗有效的。在一种实施方式中，本发明的化合物EPT69的治疗有效量可以是，例如5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg及其他合适的值。

本发明的一种或多种实施方式提供了使用组蛋白甲基转移酶SUV39H1的体内抑制和随后的衰老大脑中组蛋白H3K9的三甲基化(H3K9me3)下调从而有效地改善与衰老、阿尔茨海默病和其他BDNF依赖性疾病相关的认知缺陷的方法。H3K9me3是重要的抑制性组蛋白标记，并涉及基因沉默。H3K9me3的建立取决于在围绕中心的异染色质处调节H3K9三甲基化的组蛋白甲基转移酶SUV39H1的活性。调节促成组蛋白甲基化的酶的功能因此可以是抵消年龄相关认知缺陷的有力手段。与衰老、BDNF调节障碍和其他年龄相关疾病相关的认知缺陷涉及处理感官信息、注意、记忆的获得和巩固、信息回忆以及执行功能例如计划、问题解决、抑制性控制、自我监控和其他与全局功能相关的认知的其他方面的缺陷。

根据本发明的一种或多种实施方式，使用新开发的如图1所示的称为ETP69的桥二硫二酮哌嗪生物碱毛壳素A的类似物，在动物衰老模型中研究了H3K9me3在学习和记忆中的作用。该化合物，即ETP69，组蛋白甲基转移酶SUV39H1的选择性抑制剂，与第一种报道的SUV39H1抑制剂毛壳素A相比，显示出对一组17种人组蛋白甲基转移酶更大的选择性。另外，ETP69对组蛋白乙酰转移酶p300和DNA甲基转移酶DNMT1不显示抑制性活性。

海马体对哺乳动物的记忆极为重要，并且已知在衰老的大脑中受损。数据明确表明，海马体损伤导致空间记忆的严重缺陷。也有人认为，这些发现可能意味着空间记忆在海马功能方面具有独特的地位。因此，本发明的研究使用空间记忆任务来评估老年动物中H3K9me3操纵的作用。此外，这项研究采用被称为无监督学习任务的自发活动任务以扩展和证实这些发现。该任务测量海马依赖性学习，已知与海马中的突触变化高度相关，并且易受年龄相关的缺陷的影响。此外，用于测量所述化合物功效的另一个测试是恐惧条件化任务。这个任务测量学习和记忆的一种形式，其中厌恶的刺激(例如电击)与特定的中性情景(例如房间)相关联，导致对原本中立的刺激或背景表现出恐惧反应。也预计探测学习和记忆的其他此类任务也将受益于这种药物。

然后为了鉴定在通过H3K9me3抑制的记忆改善之下的下游细胞/分子事件，本研究使用高尔基体染色和流式突触术评估了ETP69对海马棘形成的影响。根据BDNF对活性依赖性棘重构的重要作用，关于ETP69对海马中bdnf外显子的H3K9三甲基化和蛋白水平的作用以及突触中为一种BDNF下游效应物的Akt活化的研究数据揭示了H3K9me3在记忆功能中的新颖作用，并显示出在海马依赖性记忆和学习中的具体作用。

材料和方法

动物：

将老年(18-20个月，n＝34只)或年轻(3-4个月，n＝18只)C57B1/6J雄性小鼠分组圈养，并随意喂食食物和水，并在实验程序之前适应饲养箱一周。在12:12的光照/黑暗循环下维持灯光，并且所有的行为测试都在循环的光照阶段内进行。

化合物

ETP69(消旋-(3S,6S,7S,8aS)-6-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2,3,7-三甲基-1,4-二氧代六氢-6H-3,8a-桥二硫代吡咯并[1,2-a]吡嗪-7-甲腈)，桥二硫二酮哌嗪生物碱例如毛壳素A的消旋类似物，制备如Overman LE,Baumann M,S.,Nam D,Horne R,Jove LJ,Xie C,Kwolik(2014)“Preparation of Epipolythiodioxopiperazine ETPDerivatives for Treatment of Cancer(用于癌症治疗的桥二硫二酮哌嗪ETP衍生物的制备),”PCT Int.,卷2014066435,(Int,P.,ed),USA[现在也发布于:M.Baumann,A.P.Dieskau,B.M.Loertscher,M.C.Walton,S.Nam,J.Xie,D.Horne和Larry E.Overman“Tricyclic Analogues of Epidithiodioxopiperazine Alkaloids with Promising InVitro and In Vivo Antitumor Activity(具有潜在体外和体内抗肿瘤活性的桥二硫二酮哌嗪生物碱的三环类似物),”Chemical Science,2015,6,DOI:10.1039/C5SC01536G中所述，所述文献通过引用以整体并入本文，并从甲醇中重结晶。也参见Overman等的PCT专利申请第PCT/US2013/066252号，标题为“ETP衍生物”，其也通过引用以整体并入本文。将所述化合物溶解在50％DMSO基盐水溶液的混合物中。对照组的对象接受DMSO基盐水溶液。

ETP69的类似物包括下式的化合物：

符号p是2、3或4。R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R¹⁶和R¹⁸独立地是氢、卤原子、-N₃、-CF₃、-CCl₃、-CBr₃,-CI₃、-CN、-CHO、-OH、-NH₂、-COOH、-CONH₂、-NO₂、-SH、-SO₂、-SO₂Cl、-SO₃H、-SO₄H、-SO₂NH₂、NHNH₂、-ONH₂、-NHC(O)NHNH₂,、取代或非取代烷基、取代或非取代杂烷基、取代或非取代环烷基、取代或非取代杂环烷基、取代或非取代杂芳基。

测试

物体位置记忆(OLM)：使用标准OLM方案进行训练和测试程序。简要地，将22只老年小鼠和18只年轻小鼠每天处理约2-3分钟，持续5天，然后在训练之前连续5天每天5分钟适应实验装置(尺寸为30×23×21.5cm的白色矩形开放场地)。

OLM中的剂量响应：在测试日，给小鼠3分钟的习惯时间(在空的测试场地)，然后i.p.注射ETP69(10mg/kg(n＝8)或20mg/kg(n＝7))或媒介物(n＝7)。然后在i.p.注射药物或媒介物后30分钟给小鼠3分钟的获得试验(使用被放置在场地内的彼此相对的2个相似物体)，然后将所有的动物返回它们的主笼中以维持24小时试验间间隔。24小时之后，施用3分钟的保留测试，其中一个物体被移到新地点，记录动物在探索新位置与熟悉位置的时间量，以评估OLM任务中的剂量响应。由于已接受10mg/kg的动物在OLM任务中表现优于其他组，将10mg/kg用于研究的其余部分。以前已经表明这种OLM范式是学习的亚阈值。

获得(训练前)或巩固(训练后)：在其他测试中，为了确定所述化合物在训练范例之前和之后的功效，在第一次测试之后3周，将同一组的22只老年动物在OLM任务上重新测试。为了确定所述药物是否影响获得机制或巩固机制，小鼠被注射10mg/kg化合物(i.p.n＝7)或媒介物(n＝8)。在保留测试之后立即(即注射后24小时)将动物处死，将海马体移出，迅速在干冰上冷冻，并储存在-80℃直到进行关于三甲基化水平和BDNF测定的处理。图2是在小鼠的新地点位置任务中的获得阶段之前30分钟以10mg/kg和20mg/kg(i.p.)施用所述药物的效果的图形化展示。显示，在OLM中的获得阶段之前30分钟以10mg/kg和20mg/kg(i.p.)用所述ETP69进行处理的小鼠在获得阶段的物体探索(以秒测量)中没有显示出差异。数据是平均值±SEM；n＝7或8只/组。

18只年轻小鼠也在如上所述的相同OLM范例中进行测试。为了确定药物是否影响获得机制或巩固机制，在获得试验之前或之后立即向年轻小鼠注射10mg/kg化合物或媒介物(i.p.，n＝6只/组)，并进行24小时获得后测试。图3是OLM测试结果的图示，显示用媒介物或10mg/kg的ETP69处理的小鼠之间在探索中的差异。数据显示，在所述任务的保留阶段(给药后24小时)，用10mg/kg的ETP69(i.p.)处理的小鼠探索新物体显著多于熟悉的物体(**p≤0.01，邦费罗尼(Bonferroni)t检验)。用20mg/kg的ETP69处理的小鼠表现与老年对照相似。数据是平均值±SEM；n＝7或8只/组。

无监督学习任务：新的一组12只老年动物用于无监督学习任务。程序改编于已发表的作品。无监督学习(USL)行为仪器由一个大的开放式的场地组成，所述场地被墙分隔为4个小室，每个分隔墙的小入口都可以进出。动物也可以通过一个开放的入口进入一个较小的封闭暗室。处理5天后，给动物注射ETP69(10mg/kg，i.p.)或媒介物，并置于视频监控的USL箱中30分钟，然后返回到主笼。24小时后，将动物再次放入USL盒中并立即安乐死。迅速将其大脑取出，迅速解剖海马体，在干冰上冷冻，并在-80℃储存直至进一步处理

恐惧条件化：将14只老年(18-20个月)雄性小鼠放置于恐惧条件化小室，并在接受一个脚部电击(2秒，0.2mA)之前允许探索两分钟。在脚部电击之后2分钟将动物返回主笼。24小时之后，观察在条件化小室中的行为5分钟，并随后进行僵立行为分析，所述僵立行为被定义为除了呼吸之外没有一切活动。

组蛋白三甲基化：使用EpiQuik提取试剂盒(OP-0006-100)按照制造商的方案从3只年轻小鼠和3只老年小鼠的冷冻海马体中提取出总组蛋白。简要地，将组织称重并切为小块并在1×预裂解缓冲液中匀化，转移到2ml试管中，在4℃下10,000g离心1分钟。除去上清液；将组织沉淀物重悬于3倍体积的裂解缓冲液中，在冰上孵育30分钟，并在4℃下12,000g离心5分钟。将平衡二硫苏糖醇(DTT)缓冲液(0.3体积)加入到上清液中，将其储存在-80℃。使用BSA作为标准，使用Bradford蛋白质检测试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)估计经洗脱的组蛋白的蛋白质浓度。根据制造商的信息(ab115064)进行组蛋白(H3K9)三甲基化分析。简而言之，使用特异性抗体捕获三甲基化组蛋白，并用标记的检测抗体检测，然后用显色试剂检测。在450nm处读取吸光度，并按照制造商的说明使用标准曲线计算结果。

棘计数：在另一系列实验中，给10只老年小鼠(20-22个月)注射ETP69(10mg/kg；i.p.)或媒介物(i.p.)，24小时后将动物安乐死并将脑分离成两半球。右侧半球用于高尔基染色，左侧用流式突触术进行处理。根据制造商的信息(Golgi-Cox，Bioenna)进行染色。

流动突触术：使用我们长期的方案从全小鼠海马体获得新鲜的突触体P2级分。简而言之，通过在用冰冷却的蔗糖320mM中使组织匀化(1:10w/v)从所述海马体中获得所述级分。所有步骤均在4℃下进行；蔗糖缓冲液、研磨机、杵和微量离心管都在冰上预冷。快速从单个小鼠中解剖出海马体，并在含有HEPES[10mM]和蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物的pH7.4的320mM蔗糖(1.5ml)中均化。均化由在玻璃-聚四氟乙烯研磨机中的6-8个手动冲程组成，间隙(柱塞与玻璃之间)：0.15-0.25mm。在冲程中轻轻旋转柱塞，同时将研磨机保持在冰上。将匀浆以1200g离心10分钟。将上清液(S1，包含线粒体和突触体)转移到两个干净的微量离心管中，并以12,000g离心20分钟。使用塑料枪头和真空小心去除上清液(S2)。通过在1.5ml的PBS中轻轻地上下移液来重新悬浮沉淀物(P2，对应于粗突触体级分)，使用以牛血清白蛋白(BSA)作为标准的BCA测定来测定蛋白质浓度。在免疫标记之前，使用PBS作为稀释剂将所有样品调整至相同的蛋白质浓度。使用200μl突触体级分(50-100μg蛋白质)根据染色细胞外/细胞内抗原的方法进行用于流式突触术分析的免疫标记。抗体：GluR1(细胞外)(Millipore，ABN241，DIL＝1:400)，p-Akt-ser473(Cell Signaling，4060，DIL＝1:400)，PSD-95(Millipore，MAB1598，DIL＝1:400)，抗兔IgG Alexa-488和抗小鼠IgG Alexa 647(Life Science，DIL＝1：400)。使用配备有氩488nm和氦氖635nm激光器的FACS Calibur流式细胞仪(BD Biosciences)获取数据。相对尺寸和粒度由正向(FSC)和侧向散射(SSC)属性确定。使用对数放大收集FSC、SSC、FL1和FL4信号。分别用FL1和FL4检测器检测Alexa 488和Alexa 647荧光染料。使用FSC-SSC图，利用校准珠子选择与突触体大小(0.5-3.0μm)匹配的颗粒(图6A)。使用相同的FSC设置来获取珠子标准品和样品的数据。通过建立FSC-H阈值排除小碎片和杂屑(325)。对于每个样品收集和分析一万个尺寸门控粒子。使用CellQuestPro软件(BD Biosciences)进行分析。

BDNF的ELISA

使用BDNF Emax免疫测定系统(G7610，Promega)根据制造商的说明进行ELISA。从每只动物的海马体中制备两套样品，并且所有反应重复进行两次。

第一系列实验确立了BDNF为ETP69的靶标，然后使用从第二套实验(USL task)获得的大脑检测哪些BDNF外显子被甲基化以及BDNF的哪些下游靶标在ETP69处理之后显示出变化。

BDNF启动子区的ChIP：用1％甲醛交联后，将染色质剪切成200-500bp的片段。用抗组蛋白H3K9me3(H3K9me3；Millipore)的抗体在4℃过夜实现免疫沉淀。洗涤后，从珠子中洗脱，逆转交联，纯化免疫沉淀的DNA，并利用从混合的输入样品制备的内标准曲线通过qRT-PCR一式三份地进行分析。每个样品用相应的输入值标准化。用于外显子I、IV和VI的bdnf启动子的引物对应于每个独特的外显子序列。使用罗氏通用探针库检测设计中心(RocheUniversal Probe Library Assay Design Center)设计RT-qPCR引物组并从IntegratedDNA Technologies(Coralville，IA)获得RT-qPCR引物组。RT-qPCR反应在StratageneMX3005P热循环仪中于95℃下进行3分钟，然后是95℃10秒和58℃ 15秒的45个循环。每个RT-qPCR运行包括以一式三份运行的所有样品以及标准曲线。如前所述，在用输入样品标准化后，使用2^-ΔΔCt.方法分析数据并表示为对照的倍数变化。

统计学分析

Mann-Whitney检验分别用作配对和非配对数据的非参数t检验，学生检验用于参数数据。单项方差分析之后是事后杜凯氏(Tukey)检验，用于三组或更多组的平均比较；而双向方差分析后接邦费罗尼事后检验。使用GraphPad Prism 6进行所有统计学检验和图6B的非线性拟合。数据以平均值±SEM表示。认为p值<0.05是显著性的。

结果

在物体位置记忆(OLM)任务中的ETP69

进行在空间OLM任务中腹膜内施用的ETP69的紧急作用的剂量反应研究。剂量范围包括已知在小鼠中耐受性良好的量。我们的结果表明是10mg/kg而不是20mg/kg在老年小鼠的OLM任务中引起记忆改善。利用双向方差分析(相互作用，(F(2,19)＝10.25，p<0.01，n＝7-8只/组))证实了这一点，事后检验显示，接受10mg/kg药物的组表现显著好于对照(p<0.05，邦费罗尼t检验)。在获得试验分析中也反映了这一点。测试的获得阶段没有显示出显著性相互作用效应(F(2,19)＝0.139，p＝NS，n＝7-8/组)或物体位置的主效应(F(1,19)＝0.19，p＝NS)。然而，给予较高剂量药物(20mg/kg)的动物显示出总探索时间的减少(p<0.05，邦费罗尼t检验)，具有显著的治疗效果(F(2,19)＝3.18，p<0.05)。这表明较高剂量的H3K9me3可以损害整体的探索，并可能损害老年动物的运动行为，因此应该仔细确定最佳剂量。

接下来，研究试图确定ETP69治疗是否在试验前与试验后的给药范例中差异地影响OLM任务中的表现准确度。OLM任务的试验前和试验后范例允许测试记忆形成的两种不同部分。具体来说，培训前给药评估记忆的获得和回忆，而培训后给药则针对记忆巩固和回忆。因此，我们在OLM测试的获得阶段之前30分钟或之后立即施用药物。我们发现在获得阶段之前30分钟(试验前，n＝6只/组)或获得之后立即(试验后，n＝8只/组)给药的10mg/kg(i.p.)药物，改善了在OLM的任务中的表现(相互作用效应(F(2,19)＝9.81，p<0.01，图4b)。进一步的事后检验显示，在试验前的组中和试验后的组中均有显著效果(p<0.001，邦费罗尼t检验)。测试的获得阶段没有显示显著性组差异(相互作用(F＝2,19)＝0.26，药物主效应为F2,19＝0.01，物体位置的主效应F(1,19)＝0.01，p＝NS，图4a)。

图4A-B是在老年小鼠的新物体位置任务中的获得阶段之前30分钟(实验前)或获得之后立即(试验后)以10mg/kg(i.p.)施用所述药物的效果的图形化展示。在获得阶段(A)的物体探索中没有差异。在任务的保留阶段(24小时±30分钟，给药后)，经药物处理的动物探索新物体显著多于熟悉的物体(B)p<0.001，在探索新物体与熟悉物体所花费的时间上有显著性差异。

为了测试H3K9me3抑制积极地影响年轻和老年小鼠中的记忆这种假设，将行为测试扩展至年轻小鼠。与在老年动物中不同，ETP69的施用在年轻小鼠中不改善OLM表现。与年轻对照相比，在获得阶段之前30分钟(试验前)或获得之后立即(试验后)给药的10mg/kg(i.p.)药物没有显示出任何统计学差异(相互作用效应(F(2,15)＝0.32，p＝NS，药物主效应F2,15＝2.21，物体位置的主效应F(2,15)＝6.02，p<0.05，图5B，n＝6只/组)。测试的获得阶段也没有显示显著的组差异(相互作用效应(F(2,15)＝0.44，药物的主效应F(2,15)＝25.01，p<0.01，n＝6只/组)，但是在位置1和位置2之间没有差异(通过邦费罗尼t检验测定，p＝NS，物体位置的主效应F(2,15)＝1.56，图5A)。这说明在年轻和老年大脑中H3K9me3操纵可以有相当不同的作用。

图5A-B是在年轻小鼠的新物体位置任务中的获得阶段之前30分钟(试验前)或获得之后立即(试验后)以10mg/kg(i.p.)施用所述药物的效果的图形化展示。在任务的获得阶段(A)或保留阶段(B)(24小时±30分钟，给药后)中的物体探索均没有差异。

无监督学习任务(USL)中的ETP69

为了评价H3K9me3是否涉及空间学习的测量以及为了评价分子末端，使用USL任务作为行为末端进行第二系列实验。USL任务是简单的行为范例，其中允许小鼠在特定的时间段内自由探索四室环境。在这一时间内的总体活动和对测试场地的探索被认为是学习和短期记忆的量度。如果两组中的发生率相似，则说明在短期学习和记忆中没有显著性差异。小鼠的运动模式反映出他们显示的习惯和学习，并且与海马体中的突触变化高度相关。

图6A是ETP69在无监督学习任务中的效果的图形化展示。虽然老年小鼠在两天内继续探索测试场地，但是与第1天相比，用ETP69进行处理的老年小鼠在第2天显示出在习惯/探索(通过行进距离进行测定)中的显著下降。老年对照小鼠在第1天和第2天均花费相同的时间探索测试场地。习惯的测定历时30分钟，以5分钟的区段显示数据*p<0.05，在特定时间点上在第1天和第2天的习惯/探索之间的显著性差异(杜凯氏t检验)。n＝5或6只/组。

图6B是ETP69在无监督学习任务中的效果的图形化展示。图形显示在施用ETP69(10mg/kg，i.p.)或媒介物之后的第1天和第2天在30分钟内行进的总距离。*p<0.05，在第1天和第2天之间30分钟内行进总距离显著降低(杜凯氏t检验)。数据是平均值±SEM；n＝5或6只/组。

在测试期间，在第1天将充分处理的小鼠放置在四室测试盒内并监测他们的活动30分钟，然后24小时之后在第2天再次进行。据确定，用ETP69(10mg/kg；i.p.)处理的动物在处理后24小时显示出习惯/探索(通过行进距离进行测量)的显著降低，但在第1天的前30分钟内不显示(图6A)。单向方差分析揭示了显著的组差异(F3,19＝4.05，p<0.05)，且在用ETP69处理的动物中事后检验证实了在第1天和第2天之间的表现差异(p<0.05)，而在年龄匹配的对照组则未证实(图6B，n＝5/组)。在第1天的30分钟的探索足以在小鼠中引起测试场地的一些长期记忆，并且可以在测试的第2天被测量。即使当组之间的学习保持不变时，我们也发现在第2天的活动水平有所不同，并且将其解释为在ETP69处理的动物中改善的保留和回忆。

在恐惧条件化中的ETP69

在另一个测试中，使用情景恐惧条件化测试，所述化合物有效改善海马依赖性学习和记忆。我们发现用ETP69治疗的老年动物(n＝7只/组)与老年对照相比表现出改善的表现(p≤0.01)。已经在许多物种中研究了恐惧条件化，并且通常以僵立(一段时间的警惕不动)进行测量。许多研究表明，条件性恐惧与临床焦虑症的机制基本一致。对条件性恐惧的获得、巩固和消失的研究表明，除了学习和记忆之外，这可能是治疗一系列病理状况的手段，例如分裂、恐慌发作障碍、恐惧症，甚至创伤后应激障碍。此外，据了解，内侧前额叶皮质(mPFC)-基底侧杏仁核(BMA)投影实现焦虑状态和习得性僵立的自上而下控制，在基线处和应激诱发的焦虑中，定义广泛相关的与所有上述病症都相关的新的自上而下的行为调控路径。

为了确认我们在OLM和USL任务中的发现，我们使用情景恐惧条件化来测试H3K9me3下调在海马依赖性学习和记忆中的作用。恐惧条件化也指示杏仁核和相关功能是否也受到管制。我们发现用ETP69处理的老年动物(n＝7只/组)与老年对照相比在任务中表现出改善的表现(p≤0.01)。总的来说，通过一系列的测试，这些行为数据表明施用ETP69改善海马依赖性学习和记忆。

图7是ETP6在恐惧条件化任务中的图形化展示。当测验情景恐惧条件化时，使用ETP69处理的老年小鼠显示出改善的表现。*p＝0.01，邦费罗尼t检验，数据以平均值±SEM示出；n＝7只每组。

海马体中的K3K9me3水平

我们首先比较了年轻小鼠和老年小鼠的海马体和小脑中的H3K9me3水平，发现在老年小鼠海马体中的H3K9me3的水平显著更高，但在小脑中却不是如此(图8A，p<0.05，n＝3只/组)。由于OLM和USL都是海马特异性任务，并且我们发现年轻小鼠和老年小鼠的海马体中的H3K9me3水平存在差异，因此我们测试了在对来自OLM任务中的上述动物队列的海马体组织样品进行药物处理后海马体中的H3K9me3的总水平。我们的结果显示药物在经药物处理的动物的海马的组蛋白提取物中具有显著的作用。t检验分析显示用ETP69处理的动物中H3K9me3的水平降低(p<0.05，n＝7只/组，图8B)。相比之下，在ETP69处理的和未经处理的小鼠的小脑中的H3K9me3的水平之间没有显著性差异。

H3K9me3抑制增加海马突触体中的棘密度和GLuR1受体表面表达

据报道，新的记忆形成可与海马中棘密度的瞬时增加相关联。特别是，OLM和USL任务中改善的表现与兴奋性谷氨酸能突触的结构和/或功能改变有关。因此，我们研究了组蛋白甲基转移酶(SUV39H1)的药理学抑制是否足以诱导海马中树突棘形成的增加。

具体而言，我们对CA1锥体神经元上的棘突进行计数和分类。通过共聚焦显微镜对来自海马CA1中的神经元的树突节段进行成像，并且使不知情的研究者根据其形态对树突棘进行计数和分类。根据先前描述的标准，对棘手动计数并将其分类为细的、蘑菇状的或粗短的。

对于每只动物，分析至少3个锥体神经元和200μm总树突长度和250-500个棘(n＝5只动物/组)。所有的神经元都选自CA1海马区的背侧部分(根据它在空间记忆中的重要作用)，并沿着基底和顶端树突完全染色。图10呈现了显示ETP69处理对海马CA1中的棘的作用的代表性图像。在该图中，上图显示来自对照动物的海马神经元，下图显示在ETP69处理的动物中观察到的棘。

进行分离分析以区分相同神经元中的基底与顶端树突。平均而言，与对照组相比，经ETP69处理的小鼠的每树突长度(μm)具有多45％的棘总数。对棘密度的形态学分析显示出在ETP69处理的小鼠中的与对照小鼠相比显著更高密度的细棘(p<0.001，学生t-检验)和粗短棘(p<0.05，学生t-检验)(图9A-C)。测出的蘑菇棘的数量/树突的长度没有差异(图9A-C)。

然后，我们使用流式突触术研究了ETP69对突触的影响，流式突触术是从分子角度表征分离的突触体(与突触后树突棘相连的突触前末端)的创新性方法。我们专注于PSD95(支架蛋白)和GluR1(AMPA受体的亚基)的表达，因为活性依赖性棘生长依赖于PSD富集区域处AMPA受体的吸收，并且该过程将棘生长与增加的突触传递效率相关联。药物处理后，将海马突触体级分进行免疫染色并通过流式突触术进行分析。如前所述，通过流式突触术的样品采集首先通过使用校准的珠子按照尺寸将突触体进行鉴定。正如在大多数(>70％)尺寸门控颗粒中的高水平的突触泡蛋白和PSD95所指示，已经表明，0.5-3.0μm之间的颗粒子集高度富集在突触体中。与ETP69诱导的棘数目增加一致(图9A-C)，我们对尺寸门控颗粒的分析显示ETP69增加了表达PSD95的突触体的比例(p<0.05，图11C)，因此反映了突触数目的增加。通过平均荧光强度测定，在每颗粒PSD95水平上没有观察到可检测到的变化。然后，我们测试ETP69是否增加表达表面GluR1-AMPA受体的棘的相对水平。我们通过组合细胞外(无透化作用)和细胞内免疫检测的双重标记在细胞内定量共表达表面GluR1的尺寸门控突触体的比例和PSD95。我们发现，与媒介物处理的对照相比，在ETP69-处理的小鼠中共表达表面GluR1的PSD95-阳性(PSD95+)事件的数量增加(p＝0.05，图11E)。然后，我们分析了ETP69对Akt活化(在丝氨酸-473处的Akt磷酸化，p-Akt)的作用，所述活化是在NMDA受体激活后PSD95活性依赖性转运至树突的重要步骤。根据ETP69处理后PSD95+GluR1+事件的比例增加，相对于来自媒介物处理的小鼠的样品，通过ETP69的SUV39H1抑制也增加表达p-Akt和PSD-95(p-Akt+PSD95+)二者的事件的比例(p<0.05，图11G)。总的来说，这些结果表明H3K9me3抑制至少部分地通过促进棘生成和可塑性的正调节分子过程发挥作用。

ETP69增加老年小鼠的海马体中BDNF启动子处的H3K9me3水平和BDNF蛋白水平

按道理说，如果用SUV39H1抑制剂刺激海马中的棘形成，那么它应该也会产生对应于记忆的不同信号传导级联中的基因特异性变化。在成人大脑中，BDNF对突触形成和可塑性起主要作用，在突触前和突触后位点均发挥作用。因此，我们测试了H3K9me3下调对BDNF的影响，BDNF对海马依赖性学习和记忆的巩固至关重要。bdnf基因由多个非编码外显子组成，每个外显子由其自身的启动子调控并响应不同的刺激。因此我们评估ETP69处理是否降低bdnf启动子I、IV和VI处的H3K9的三甲基化。发现处理对在bdnf I处的H3K9me3的显著作用(p＝0.05，Mann-Whitney t检验，对照的n＝7，ETP69，n＝9，图12B)。重要地，在BDNF启动子处由ETP69诱导的表观遗传学变化与海马体中BDNF蛋白水平的增加有联系。我们发现了在ETP69处理的小鼠的海马体中与对照相比显著升高的BDNF水平(p<0.01，F(2,16)＝8.09，方差分析随之事后邦费罗尼t检验；图12A)。

在这项研究中，我们测试了急性体内SUV39H1抑制和随后的H3K9me3下调对缓解衰老中学习和记忆缺陷的潜力。我们还评价了可能有助于在H3K9me3操纵后观察到的认知受益的潜在机制。在H3K9me3下调之后改善了在物体位置任务、恐惧条件化和无监督学习任务中的表现。这与海马体中锥体神经元的树突棘密度的增加以及表达含有表面GluR1的AMPA受体的突触的增加相对应。在施用SUV39H1抑制剂的动物的海马体中BDNF的水平也上调，并且从这些动物的海马体中获得的突触体提取物显示出磷酸化Akt水平的增加。因此，这些结果为改善认知缺陷提供了支持，并且表明H3K9me3下调触发涉及BDNF、棘重塑和生长的级联事件。

据我们所知，尚无研究评估H3K9me3抑制对学习和/或记忆功能的影响。在这里，我们提出第一个证据表明，减少海马体中的H3K9me3改善老年小鼠的空间记忆。在OLM任务的训练前和训练后范例中，ETP69处理的动物在测试期间、24小时获得后试验均表现良好。这导致这样的结论：用ETP69进行紧急处理在老年动物中引起H3K9me3水平的海马特异性变化。来自USL任务的数据证实，当学习在组间保持相同时，ETP69处理的动物在药物处理后24小时但不是30分钟显示出改善的保留和回忆。由H3K9me3募集的抑制因子和辅助因子包括组蛋白脱乙酰酶(HDACs)和异染色质蛋白-1α(HP1α)。事实上，HP1直接与SUV39H1相关联，并导致自我维持的抑制性循环，并可能需要超过30分钟才能显示出任何行为表现。因此，结果与下面的假设是一致的：分子水平(以及因而行为水平)的变化没有迅速衔接、但需要时间来形成支持改善的保留和回忆的机制。

棘密度的瞬时增加已经与改善的学习和记忆相关联，特别是在老年小鼠的海马体中，但是H3K9me3操纵对突触功能和棘的作用目前尚未被探索。在此，我们报告，ETP69增加经ETP69处理的动物的CA1区域中细棘和粗短棘计数。细棘对于形成新的突触是灵活和关键的，这使得它们非常适合于促进伴随ETP69处理所观察到的认知的紧急改善。按照常理，H3K9me3阻滞后观察到的行为变化是部分地由于棘密度的变化而导致的。此外，重构棘要求在PSD富集区域加入AMPA受体(Park等，2004)。先前已经表明，突触连接可以通过将AMPA受体添加到突触而得到加强，并且实际上其棘的重塑需要在突触表面上加入AMPA受体。我们的数据显示，在经ETP69处理的动物的海马体样品的突触末端中表达表面GluR1的PSD+突触体和PSD95+突触体的水平增加，因此支持了H3K9me3介导海马体中突触网络/信号转导的改变并导致衰老中改善的认知功能的假说。除了其对海马的作用之外，H3K9me3的拮抗作用也导致了来自海马体的尺寸门控的含有PSD95的突触体中的p-AKT的上调。BDNF是服务于突触可塑性和神经元活性的关键分子。我们以前已经表明老年大脑中的HDAC抑制以BDNF依赖性方式改善空间记忆。由于HDAC是由H3K9me3募集的辅助因子之一，我们测试了SUV39H1抑制对老年脑中BDNF蛋白水平的作用。我们的数据显示，H3K9me3调节学习和记忆，并且这种效应可能是由BDNF依赖性机制介导的。此外，我们的研究结果表明，EXON 1单独驱使老龄小鼠中的ETP69处理后的BDNF上调。有人认为，BDNF转录本的差异性产生可能影响蛋白质的功能，或者提供手段用于在不同大脑区域中产生BDNF的特定调节机制。H3K9me3抑制似乎可能选择性地参与BDNF转录物1的调节，但是这种选择性的下游结果仍然是未知的。然而，我们没有观察到弧(Arc)的变化(数据未显示)。我们不能完全排除因为弧快速被诱导和衰减所以我们没有观察到弧变化的可能性，但是同样可能的是，在H3K9me3下调之后在突触中有多个变化并且弧诱导可以不是其中之一。这项研究只提供了由H3K9me3抑制直接或间接调节的可能性级联的第一种看法。有可能的是，在去除H3K9me3抑制性标记之后，某些分子途径的活化激活海马-记忆途径，这又可以产生额外的维持老年动物中改善的记忆功能所需的转录和翻译。

SUV39H1抑制剂ETP69对神经元存活和功能的影响

我们试图确定ETP69可以直接作用于神经元。与癌细胞不同，神经元是非分裂细胞，因此是不同的细胞靶标。我们使用原代神经元细胞培养物，所述培养物没有其他细胞类型并且其中的药物的浓度可以严格控制。神经元存活和突触生长是评估化合物的常用方法。

通过类似于Newcomb-Fernandez等(2001)所述的方法诱导14DIV海马体神经元中的OGD。用PBS代替正常培养基，并将培养板置于密封室中。所述室用N₂和CO₂冲洗3分钟，密封，置于37℃培养箱中2小时。用DMEM(不含血清)代替PBS，并使培养物回到常氧环境。培养物恢复到正常环境后的48小时收集培养基。通过LDH测定(Thermo-Fisher)测量细胞毒性。为了计算％细胞毒性，从化学处理样品的LDH活性中减去自发LDH的LDH活性，释放对照(水处理)，除以总LDH活性[(最大LDH释放控制活性)–(自发LDH释放控制活动)]，并乘以100：

最初我们测试了ETP69对氧-葡萄糖剥夺(OGD)-诱导的细胞毒性的作用。在存在或不存在ETP69的情况下，用OGD处理成熟的海马神经元(14DIV)2小时。在OGD后48小时通过LDH测定法测量细胞毒性。4nM而不是100nM的ETP69将神经元从OGD诱导的细胞毒性中拯救出来。图13是ETP69对氧-葡萄糖剥夺(OGD)后神经元存活的作用的图解。在存在或不存在ETP的情况下，用OGD处理14DIV海马神经元2小时。在OGD后48小时通过LDH测定法测量细胞毒性。结果是4个样品的平均值±SEM。*，p<0.05。

然后，我们检查了在培养的海马神经元中ETP69对H3K9me3水平的影响。ETP69处理24小时导致神经元H3K9me3水平的剂量依赖性降低。图14A-B是ETP69对14DIV海马神经元中H3K9me3水平的影响的说明(图14A-凝胶图像；图14B-定量，＝3，*，p<0.05)。如图所示，ETP69处理(24小时)降低了通过蛋白质印迹法测量的H3K9me3水平。

由于20nM的ETP69导致H3K9me3水平的最大降低，我们检查了20nM的ETP69对突触蛋白PSD-95表达和树突棘形态的影响。ETP69处理增加PSD-95免疫反应性。图15A是显示ETP69处理(20nM，24小时)增加PSD-95免疫反应性(制造突触的树突棘的标记)14DIV海马神经元的图像。神经元用抗PSD-95(红色)和MAP2(绿色)的抗体染色。比例尺：10μm，上图；2μm，下图。

图15B是显示ETP69处理(20nM，24小时)增加的树突状F-肌动蛋白染色(树突棘的标记)的图像。注意，标记着存在许多棘的许多斑点的存在。上图：对照，下图：ETP处理的神经元。比例尺：2μm。此图显示ETP69也增加了F-肌动蛋白染色标记的树突棘。

此外，ETP69处理增加了Ser133处转录因子CREB的磷酸化。图16是说明通过蛋白质印迹法测量的ETP69增加在Ser133处的CREB磷酸化的图像。CREB是一种转录因子，其活化涉及突触可塑性和记忆形成。

这些数据区分开ETP对神经系统和来自癌症应用的神经元的用途，因为它们证明ETP69作用于为非分裂细胞类型的神经元以促进其存活、生长和突触可塑性。

这些研究提供了H3K9me3在增强记忆和认知功能如年龄相关的记忆下降中的作用的证据，并表明这种组蛋白甲基化标记可以通过药理干预逆转。这些研究还提供了证据证明，通过操纵调节组蛋白甲基化的酶，有可能改变对象的染色质状态并恢复衰老大脑中的记忆功能。最后，该化合物可单独使用或与各种生活方式干预或药物干预(即认知增强剂或增强手段)一起使用以增强认知表现，例如记忆、学习、执行功能、注意、处理速度、总体认知功能、日常生活活动等。这些双重方法可以增强超过任一单独干预所达到的认知。这也将导致功能结果如睡眠、疼痛和生活质量的改善。

在一种或多种实施方式中，药理学认知增强剂可以包括胆碱酯酶抑制剂，例如他克林，多奈哌齐，卡巴拉汀(rivastigmine)和加兰他敏。药理学认知增强剂也可以是NMDA拮抗剂或NMDA激动剂，安帕金，BZD/GABA受体复合物调控剂，血清素拮抗剂，烟碱类化合物，毒蕈碱类化合物，PDE抑制剂，G蛋白类化合物，通道调节剂，免疫治疗类化合物，抗淀粉样蛋白或淀粉样蛋白降低剂，他汀类或PPARS调节剂。

在一种或多种实施方式中，生活方式认知增强手段可包括身体和心理锻炼，膳食补充剂如抗氧化剂、线粒体功能增强剂、咖啡因、ω-3和二十二碳六烯酸(DHA)。

在一种或多种实施方式中，认知增强剂或增强手段可包括生活方式和药理学干预的组合。

虽然本文公开的发明已通过其具体实施方式和应用的方式进行描述，但是在不偏离权利要求中所提出的本发明的范围的情况下，本领域的技术人员可以对其进行多种修改和变化。

Claims (27)

1.一种在有需要的动物对象中逆转认知损失的方法，所述方法包含：

选择具有认知损失的动物对象；以及

将治疗有效量的SUV39H1抑制剂化合物施用于所述动物对象，其中所述治疗有效量包含用于紧急治疗的单次给药和用于长期治疗的重复给药。

2.一种在有需要的患者中逆转认知损失的方法，所述方法包含：

选择具有记忆功能损失的患者；以及

将治疗有效量的SUV39H1抑制剂化合物与药理学认知增强剂一起施用于所述患者，其中所述治疗有效量包含用于紧急治疗的单次给药和用于长期治疗的重复给药。

3.权利要求2所述的方法，其中所述认知增强剂为胆碱酯酶抑制剂。

4.权利要求3所述的方法，其中所述胆碱酯酶抑制剂选自他克林、多奈哌齐、卡巴拉汀和加兰他敏。

5.权利要求2所述的方法，其中所述认知增强剂为NMDA拮抗剂或NMDA激动剂。

6.权利要求2所述的方法，其中所述认知增强剂为安帕金。

7.权利要求2所述的方法，其中所述认知增强剂为BZD/GABA受体复合物调控剂。

8.权利要求2所述的方法，其中所述认知增强剂为血清素拮抗剂。

9.权利要求2所述的方法，其中所述认知增强剂为烟碱类化合物。

10.权利要求2所述的方法，其中所述认知增强剂为毒蕈碱类化合物。

11.权利要求2所述的方法，其中所述认知增强剂为PDE抑制剂。

12.权利要求2所述的方法，其中所述认知增强剂为G蛋白类化合物。

13.权利要求2所述的方法，其中所述认知增强剂为通道调节剂。

14.权利要求2所述的方法，其中所述认知增强剂为免疫治疗类化合物。

15.权利要求2所述的方法，其中所述认知增强剂为抗淀粉样蛋白剂或淀粉样蛋白降低剂。

16.权利要求2所述的方法，其中所述认知增强剂为他汀类或PPARS调节剂。

17.一种在有需要的对象中增强认知的方法，所述方法包含：

选择需要增强记忆的对象；以及

将治疗有效量的SUV39H1抑制剂化合物与生活方式认知增强手段一起施用于所述对象。

18.权利要求17所述的方法，其中所述认知增强手段是身体锻炼。

19.权利要求17所述的方法，其中所述认知增强手段是心理锻炼。

20.权利要求17所述的方法，其中所述认知增强手段是膳食补充剂。

21.权利要求20所述的方法，其中所述补充剂是抗氧化剂。

22.权利要求20所述的方法，其中所述补充剂是线粒体功能增强剂。

23.权利要求20所述的方法，其中所述补充剂是咖啡因。

24.权利要求20所述的方法，其中所述补充剂是ω-3。

25.权利要求20所述的方法，其中所述补充剂是二十二碳六烯酸(DHA)。

26.一种治疗、预防和缓解包括人在内的活的动物对象的认知功能障碍的方法，所述方法包含：

选择具有认知损失迹象的活的动物对象；以及

将治疗有效量的SUV39H1抑制剂化合物施用于这种活的动物对象。

27.一种治疗和缓解有需要的动物对象的焦虑相关疾病的方法，所述方法包含：

选择具有焦虑相关疾病的动物对象；以及

将治疗有效量的SUV39H1抑制剂化合物施用于所述动物对象，其中所述治疗有效量包含用于紧急治疗的单次给药和用于长期治疗的重复给药。