CN102271763A - 抑制hdac2以促进记忆 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于增强且改善恢复丧失记忆的方法和产物。特别地，该方法通过抑制HDAC2和或选择性抑制HDAC1/2或HDAC1/2/3来完成。

Description

抑制HDAC2以促进记忆
联邦赞助研究
本发明在NIH NS051874下由政府支持进行。因此，政府在本发明中拥有一定权利。
相关申请
本申请根据35USC§119要求于2008年12月3日提交的美国临时申请号61/119,698的优先权，其完整内容通过引用在此合并。
发明背景
脑萎缩在正常衰老过程中发生，并且是与学习和记忆受损相关的神经变性疾病的早期特点。仅到最近才报道了在前脑中具有广泛神经变性的小鼠模型(1-3)。这些模型之一是双转基因CK-p25Tg小鼠，其中牵涉多种神经变性疾病的蛋白质(4)p25的表达在启动子CamKII的控制下，并且可以由多西环素饮食开启或关闭(3，5)。出生后诱导p25表达6周引起学习损害，这伴随前脑中的严重突触和神经元丧失。然而，临床前研究尚未探究在大量神经元丧失已发生后恢复丧失记忆的策略。
牵涉记忆形成和贮存的神经元适应应答涉及功能和结构性突触改变，这要求基因表达中的变化(West，A.E.等人Proc Natl Acad Sci USA98(20)，11024-11031(2001)；Guan，Z.等人Cell 111(4)，483-493(2002))。这个过程潜在的机制仍不明了。特别通过组蛋白尾部乙酰化的染色质重建，这改变紧密的染色质结构且改变DNA对调节蛋白质的易接近性，作为用于调节发育和成人期中的基因表达的基础机制出现(Kurdistani，S.K.&Grunstein，M.Nat Rev Mol CellBiol 4(4)，276-284(2003)；Goldberg，A.D.，Allis，C.D.，&Bernstein，E.Cell 128(4)，635-638(2007))。
发明概述
中枢神经系统的神经变性疾病通常与学习和记忆受损相关，最终导致痴呆。临床前研究中未广泛解决的重要方面是长期记忆的丧失和重建对这些记忆的存取(access)的策略探究。在某些实施方案中，本发明提供了在突触和神经元丧失已发生后用于恢复对长期记忆的存取的方法。已显示环境富集(EE)在显著脑萎缩和神经元丧失已发生后，恢复学习行为且重建对长期记忆的存取。本文还显示的是EE和后生变化之间的联系。EE增强组蛋白尾部乙酰化且改变甲基化水平。乙酰化中的增加和甲基化水平中的变化在海马和皮质组蛋白3(H3)和组蛋白4(H4)中观察到。依次，升高的H3和H4乙酰化起始神经网络的重新布线(rewiring)。
在某些方面，本发明是通过给受试者施用以有效增强受试者中记忆的量的HDAC2抑制剂，用于增强受试者中的记忆的方法。HDAC2抑制剂可以是选择性HDAC2抑制剂。在其他实施方案中，HDAC2抑制剂是非选择性的，但不是HDAC1、HDAC5、HDAC6、HDAC7和/或HDAC10抑制剂。在另外其他的实施方案中，HDAC2抑制剂是HDAC1/HDAC2选择性抑制剂或HDAC1/HDAC2/HDAC3选择性抑制剂。
在某些实施方案中，本发明提供了用于已减少对长期记忆的存取的受试者中对的长期记忆的存取的方法，其包括以有效重建对受试者中的长期记忆的存取的量增加组蛋白乙酰化。
在本发明的某些方面，长期记忆受损。在某些实施方案中，损害可以是年龄相关或损伤相关的。在本发明的某些实施方案中，受试者中的突触网络是重建的。在某些实施方案中，重建突触网络包括活跃脑突触数目中的增加。在某些实施方案中，重建突触网络包括神经元丧失的逆转。在某些实施方案中，受试者具有选自下述的病症：MCI(轻度认知损害)、阿尔茨海默氏病、记忆丧失、与阿尔茨海默病相关的注意缺陷症状、与阿尔茨海默病相关的神经变性、混合血管起源的痴呆、变性起源的痴呆、早老性痴呆、老年性痴呆、与帕金森氏病相关的痴呆、血管性痴呆、进行性核上麻痹或皮质基底节变性。
该方法任选涉及另外化合物的施用。例如，在某些实施方案中，施用HDAC3抑制剂。在其他实施方案中，施用HDAC11抑制剂。在另外其他的实施方案中，施用DNA甲基化抑制剂例如5-氮杂胞苷、5-氮杂-2′脱氧胞苷、5，6-二氢-5-氮杂胞苷、5，6-二氢-5-氮杂-2′脱氧胞苷、5-氟胞苷、5-氟-2′脱氧胞苷，以及包含5-氮杂-2′脱氧胞苷、5，6-二氢-5-氮杂-2′脱氧胞苷和5-氟-2′脱氧胞苷的短寡核苷酸，以及普鲁卡因胺、Zebularine和(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯。可以施用另外的治疗剂例如ARICEPT或多奈哌齐、COGNEX或他克林、EXELON或利斯的明、REMINYL或加兰他敏、抗淀粉样蛋白疫苗、Aβ-降低疗法、智力训练或刺激。
在其他实施方案中，HDAC2抑制剂是HDAC2RNAi例如siRNA、shRNA、miRNA、dsRNA或核酶或其变体。
HDAC2抑制剂可以经口、静脉内、皮肤、皮下、经鼻、肌内、腹膜内、颅内或脑室内施用。
该方法还可以包括在施用HDAC2抑制剂后评估受试者的认知功能的步骤。此外，该方法可以涉及通过评估脑血流量或血脑屏障功能来监控治疗。
根据本发明的其他方面提供了通过给具有阿尔茨海默氏病的受试者施用以有效治疗阿尔茨海默氏病量的HDAC2抑制剂，用于治疗阿尔茨海默氏病的方法。在一个实施方案中，HDAC2抑制剂是选择性HDAC2抑制剂。
在某些实施方案中，HDAC2抑制剂是选择性HDAC1/HDAC2抑制剂。在其他实施方案中，HDAC2抑制剂是选择性HDAC1/HDAC2/HDAC3抑制剂。在某些实施方案中，HDAC2抑制剂是选择性HDAC1/HDAC2/HDAC10抑制剂。在某些实施方案中，选择性HDAC1/HDAC2/HDAC10抑制剂是BRD-6929。在其他实施方案中，HDAC2抑制剂是选择性HDAC1/HDAC2/HDAC3/HDAC10抑制剂。
在另外其他的实施方案中，HDAC2抑制剂是式(IV)的化合物
Figure BDA0000072501070000041
其中R1和R2独立地选自H和-C(O)-C1-6烷基；R3是任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、或芳基-C1-6烯基(alkylene)。
在某些实施方案中，R1是H；R1和R2是H；R1是-C(O)-C1-6烷基；R1是-C(O)-甲基；R1是-C(O)-甲基并且R2是H；R3是任选取代的芳基；R3是甲苯基；R3是任选取代的杂芳基；R3是噻吩基；R3是芳基-C1-6烯基；或R3是苯乙烯。
在其他实施方案中，式IV是
Figure BDA0000072501070000042
在其他实施方案中，式IV是
Figure BDA0000072501070000043
在其他实施方案中，式IV是
Figure BDA0000072501070000044
在其他实施方案中，式IV是
Figure BDA0000072501070000051
在其他实施方案中，HDAC2抑制剂是式(VI)的化合物
Figure BDA0000072501070000052
其中R1和R2独立地选自H，取代或未取代、分支或未分支、环状或无环C1-6烷基，杂环基，杂芳基，芳基和芳基-C1-6烯基。
在某些实施方案中，R1是H；R1和R2是H：R1是甲基、乙基、丙基或丁基；R1是芳基-C1-6烯基；R1是苯乙烯；或R2是H。
在其他实施方案中，式VI是
Figure BDA0000072501070000053
在其他实施方案中，HDAC2抑制剂是式(I)的化合物
Figure BDA0000072501070000054
其中R1和R2独立地选自H，取代或未取代、分支或未分支、环状或无环C1-6烷基，杂环基，C1-6烯基，杂芳基，杂亚芳基和杂亚芳基-烯基；并且R3是芳基或杂芳基。
在某些实施方案中，R1是未取代的无环C1-6烷基；R1选自甲基、乙基、丙基和丁基；R1是杂亚芳基-烯基；R1是杂亚芳基-C1-6烯基；R1是吡啶基-乙烯；R2是氢；R3是杂芳基；或R3是噻吩基。
在另外其他的实施方案中，式I是
Figure BDA0000072501070000061
在某些实施方案中，HDAC2抑制剂是式(II)的化合物
Figure BDA0000072501070000062
其中R1和R2独立地选自H，取代或未取代、分支或未分支、环状或无环C1-6烷基，杂环基，C1-6烯基，杂芳基，杂亚芳基，杂亚芳基-烯基，亚芳基-烯基；和任选取代的杂环基-烯基；并且R3是芳基或杂芳基。
在某些实施方案中，R1是未取代的无环C1-6烷基；R1选自甲基、乙基、丙基和丁基；R1是杂亚芳基-烯基；R1是杂亚芳基-C1-6烯基；R1是吡啶基-乙烯；R1是亚芳基-烯基；R1是亚芳基-C1-6烯基；R1是苯乙烯；R1是杂环基-烯基；R1是未取代的杂环基-C1-6烯基；R1是哌嗪-乙烯；R1是取代的杂环基-C1-6烯基；R1是取代的哌嗪-乙烯；R1是C1-6烯基取代的哌嗪-乙烯；R1是甲基取代的哌嗪-乙烯；R2是氢；R3是杂芳基；R3是噻吩基；或R3是吡啶基。
在其他实施方案中，式II是
Figure BDA0000072501070000063
在其他实施方案中，式II是
Figure BDA0000072501070000071
在其他实施方案中，式II是
在其他实施方案中，式II是
Figure BDA0000072501070000073
在其他实施方案中，式II是
Figure BDA0000072501070000074
在某些实施方案中，HDAC2抑制剂是式(III)的化合物
Figure BDA0000072501070000075
其中X是-C(O)-N(R1)(R2)、C1-6亚烷基(alkylene)-N(H)-C1-6烯基-N(R1)C(O)(R2)；或-N(R1)C(O)R2；R1和R2独立地选自H、和取代或未取代、分支或未分支、环状或无环C1-6烷基；并且R3是炔基、芳基或杂芳基。
在某些实施方案中，X是-C(O)-N(R1)(R2)；R1和R2独立地选自H、未取代、未分支、无环C1-6烷基；R1和R2独立地选自H、甲基、乙基、丙基和丁基；R1是H；R1和R2是H；X是-C(O)-NH2；X是C1-6亚烷基-N(R1)-C1-6烯基-N(R1)C(O)(R2)；R1是H；X是C1-6亚烷基-N(H)-C1-6烯基-N(H)C(O)(R2)；X是-N(R1)C(O)R2；R1是H；R1是未取代的无环C1-6烷基；R1选自甲基、乙基、丙基和丁基；R2是未取代的无环C1-6烷基；R2选自甲基、乙基、丙基和丁基；R3是杂芳基；R3是噻吩基；R3是芳基；R3是炔基；R3是C1-6炔基；或R3是乙炔基。
在某些实施方案中，式III是
Figure BDA0000072501070000081
在某些实施方案中，式III是
Figure BDA0000072501070000082
在某些实施方案中，式III是
Figure BDA0000072501070000083
在其他实施方案中，HDAC2抑制剂是式(V)的化合物
Figure BDA0000072501070000084
其中R1和R2独立地选自H，和取代或未取代、分支或未分支、环状或无环C1-6烷基；并且R3是芳基或杂芳基。
在某些实施方案中，R1是H；R1和R2是H；R1是甲基、乙基、丙基或丁基；R3是芳基；R3是杂芳基；或R3是噻吩基。
在其他实施方案中，式V是
Figure BDA0000072501070000091
在某些实施方案中，该方法特别排除式IV的分子的使用。
还提供了在用于递送至脑组织的制剂中的HDAC2抑制剂和药学上可接受的载体的药物组合物。在某些实施方案中，HDAC2抑制剂配制为用于跨过血脑屏障。
在其他方面，本发明是HDAC2抑制剂的组合物，其中HDAC2抑制剂选自式I、II和III的化合物。
本发明的限制各自可以包括本发明的各种实施方案。因此，预期涉及任何一种元件或元件组合的本发明的限制各自可以包括在本发明的每个方面中。本发明并不使其应用限制于下述说明书中所述或附图中举例说明的组分构建和安排细节。本发明能够具有其他实施方案并且以各种方式实践或执行。此外，本文使用的措辞和术语用于描述的目的并且不应被视为限制性的。“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其在本文中的变化的使用意欲包含其后列出的项目及其等价物以及另外项目。
附图简述
附图不预期按比例描绘。在图中，在各个图中举例说明的每个等同或几乎等同的组分由相似数字表示。为了明确起见，并非每一个组分可能在每一个图标记。在图中：
图1显示HDAC抑制剂经由HDAC2改善的联想性学习。a.用于具有情境恐惧条件化训练(足部电击1.0mA)的小鼠的记忆测试。在记忆测试前，HDAC2OE小鼠(SAHA组，n＝12；盐水组，n＝12)和WT同窝出生仔畜(SAHA组，n＝12；盐水组，n＝15)用盐水或SAHA(25mg/kg，i.p.)处理10天。b.来自WT和HDAC2OE小鼠的CA1区域(锥体神经元层；辐射层(s.r.))接受长期SAHA处理或盐水处理，并且通过免疫染色进行观察。在锥体神经元层上测量关于Ac-赖氨酸的平均光信号；由s.r测量SVP信号。c.来自海马的CA1区域的高尔基染色图像。对于WT，首次用于实验的，n＝23；WT，SAHA，n＝41；HDAC2OE，首次用于实验的，n＝21；HDAC2OE，SAHA，n＝32。比例条10μm。d.在10天SAHA注射(25mg/kg，i.p.)后，用于具有情境恐惧条件化训练(足部电击0.5mA)的小鼠的记忆测试。WT小鼠(SAHA，n＝10；盐水，n＝10)和HDAC2KO小鼠(SAHA，n＝8；盐水，n＝8)。e.来自HDAC2KO小鼠的CA1区域接受长期SAHA处理或盐水处理，并且通过免疫染色进行观察。在s.r中定量SVP-单一。盐水，n＝15；SAHA，n＝22.比例条＝50μm。f.来自HDAC2KO小鼠海马的CA1区域的高尔基染色图像。HDAC2KO，SAHA，n＝24；HDAC2KO，首次用于实验，n＝27。＊，p＜0.05；＊＊，p＜0.005；＊＊＊，p＜0.001，不配对斯氏t检验误差条指示s.e.m。
图2起因于HDAC6抑制的α-微管蛋白(K40)乙酰化增加不促进小鼠中的联想性学习。a.显示了WT-161的结构。b.在处理16小时的人MM1.S细胞中测量WT-161(2μM)用于增加乙酰化α-微管蛋白(K40)超过总乙酰化赖氨酸(Ac-赖氨酸)的选择性，并且使用定量免疫荧光成像评估高乙酰化组蛋白和/或α-微管蛋白(K40)。呈现的数据衍生自对于脱乙酰基酶功能偏倚的化合物文库的初步筛选。c.显示了来自用WT-161或SAHA(2种条件都以25mg/kg，i.p.，10天)或盐水处理的小鼠海马的区域CA1中乙酰化α-微管蛋白(K40)的免疫染色。定量在区域CA1中乙酰化α-微管蛋白(K40)免疫反应性强度信号(n＝9，用于每个组)。＊＊，p＜0.005。d.用SAHA(25mg/kg)或WT-161(25mg/kg)注射10天的WT小鼠的记忆测试。在测试前24小时，对小鼠实施情境恐惧条件化训练(WT，n＝20；SAHA，n＝20；WT-161，n＝10；＊＊＊，p＜0.0005，斯氏t检验)。
图3在HDAC1OE和HDAC2OE小鼠脑中的HDAC1和HDAC2表达和分布。a.提供了显示WT和HDAC1OE小鼠脑中的HDAC1表达的代表性免疫染色图像。在WT脑中，HDAC1表达水平在齿状回中相对高于脑的其他区域。在HDAC1OE脑中增加的HDAC1信号不仅在海马中还在皮质、扁桃体(由虚线指出)和基底前脑中检测出。b.呈现了显示WT和HDAC2OE小鼠脑中的HDAC2表达的代表性免疫染色图像。比例条，400μm。关于插入的比例条，100μm。
图4HDAC2KO小鼠显示行为任务中增强的记忆。a.WT、HDAC1OE和HDAC2OE小鼠在可见平台水迷宫测试中的逃避潜伏期。小鼠在具有可见平台的游泳池中训练3天，每个训练日具有2次试验。定量关于小鼠到达平台的潜伏期(n＝8用于每个组)。所有3个小鼠组在第一天时以相似的逃避潜伏期到达平台。在训练3天过程中在3个小鼠组之间未检测出在逃避潜伏期中的显著差异。b.显示了在水迷宫池中的游泳速度(n＝8用于每个组)。c-d.在情境和音调依赖性恐惧条件化范例中测试关于WT、HDAC1OE和HDAC2OE小鼠的短期记忆(WT，n＝9；HDAC2OE，n＝9；HDAC1OE，n＝8)。在WT组和HDAC1/2OE小鼠之间未检测出显著差异。e-f.在情境和音调依赖性恐惧条件化范例中测试关于HDAC2KO小鼠的短期记忆(WT，n＝8；HDAC2KO，n＝9)。HDAC2KO小鼠显示情境恐惧条件化中显著增加的僵立(freezing)(p＝0.0100，与WT同窝出生仔畜比较)，但在音调依赖性恐惧条件化中则不是(p＝0.1439)。g.显示了在升高的T形迷宫上在与场所不匹配空间的测试过程中关于WT(n＝8)和HDAC2KO小鼠(n＝10)的平均校正应答百分比。HDAC2KO小鼠显示在训练期过程中显著更高的准确度(块2，p＝0.044，块3，p＝0.0087，斯氏t检验；在基因型之间，p＝0.0252，两因素ANOVA)。h.显示了在升高的T形迷宫上在与场所不匹配空间的测试过程中关于WT(n＝8)、HDAC1OE(n＝7)和HDAC2OE(n＝9)的平均校正应答百分比。HDAC2OE小鼠显示在训练踪迹块2过程中在准确度中的显著缺陷(p＝0.0452，斯氏t检验)。
图5HDAC2KO小鼠的表征。a.显示了鼠类Hdac2基因组基因座的图示。灰色填充框指示外显子。黑色箭头指示loxP位置。P14F、P15R和P2是用于基因分型的寡核苷酸DNA引物。b.执行使用HDAC2特异性抗体由野生型、由载体(V)或Cre-重组酶表达逆转录病毒感染的Hdac2L/+和Hdac2L/L MEFs获得的蛋白质裂解产物的Western印迹分析。Cdk4充当装载对照。c.得自多重Hdac2+/-杂交的野生型、Hdac2+/-和Hdac2-/-小鼠的观察和预期数目和频率。d.执行在来自Hdac2-/-小鼠和WT同窝出生仔畜的脑裂解产物中的HDAC1和HDAC2表达水平的Western印迹分析。HDAC1表达水平在Hdac2-/-小鼠中增加。
图6SAHA处理促进WT中的LTP，但在HDAC2KO海马中则不是。a-b.一月龄HDAC2KO小鼠及其WT同窝出生仔畜用SAHA(25mg/kg，i.p.)或盐水注射10天。在处死前30分钟引入另外注射。通过Schaffer侧支的一次HFS刺激(1×100Hz，1s)诱导长期增强(LTP)。a.当与盐水组比较时，在SAHA处理的WT小鼠中观察到LTP量级中的显著增加。b.在SAHA和盐水处理的HDAC2KO小鼠之间未检测出LTP量级中的显著差异。(＊＊，p＜0.005，两因素ANOVA)。
图7是描述测试HDAC过表达对p25诱导毒性的保护作用的体外测定法结果的条形图。从E15.5皮质和海马中分离神经元，并且以DIV4用编码p25-GFP和Flag-HDACs的质粒转染。转染后24小时，使神经元固定且处理用于IHC。计数所有p25阳性神经元，假定大多数神经元由p25和HDACs转染。
图8是显示多重HDAC抑制剂针对几种已知HDAC同种型的酶促抑制活性的表。
图9显示在HeLa细胞裂解产物中HDAC抑制剂对组蛋白乙酰化标记的作用。使系列化合物与完整HEK293细胞以10uM温育6小时时间段。Western印迹显示超过DMSO对照增加的乙酰化水平，使用抗乙酰基H4K12抗体和辣根过氧化物酶缀合的二抗连同基于鲁米诺的底物。这证实这些类似物的细胞HDAC活性和特异性标记H4K12中的乙酰化中的增加。
图10是图9中所示的原始蛋白质数据的定量。相对于DMSO对照，多重选择性概况在增加H4K12乙酰化水平中是有效的。这证实HDAC1，2和HDAC1，2，3选择性抑制剂在全细胞中对特定组蛋白基因座(H4K12)具有强HDAC活性。BRD-9853显示这种细胞系中的最低限度活性。BRD-4097是阴性对照。这是具有最低限度HDAC抑制活性的苯甲酰胺。
图11是用于测量在HeLa细胞裂解产物中HDAC抑制剂对组蛋白乙酰化标记的作用的原始Western印迹的定量。相对于DMSO对照，存在不同程度的乙酰化。直方图证实HDAC1，2和HDAC1，2，3选择性化合物在增加H4K12基因座上的乙酰化方面是有效的。
图12显示在小鼠原代纹状体细胞中增加的H4K12乙酰化。A.从已用HDAC抑制剂处理的小鼠脑中分离的原代纹状体细胞的Western印迹。具有3个独立样品/组的2组数据。B.直方图代表小图A中所示的蛋白质的定量。
图13显示用BRD-6929和BRD-5298处理神经元细胞在体外增强H4和H2B组蛋白乙酰化。
图14证实在小鼠原代神经元培养物中增加的H4K12乙酰化的核强度。A.对照证实在脑区域特异性原代培养物(皮质和纹状体)中6小时温育后，以1和10uM的BRD-6929不引起的细胞总数目中的增加或减少。B.直方图显示在脑区域特异性原代培养物(纹状体)中6小时温育后，以10uM的BRD-6929引起H4K12乙酰化中的增加。因此，HDAC 1，2选择性化合物在培养纹状体神经元中增加在特定组蛋白基因座(H4K12)上的乙酰化方面是有效的。
图15证实HDAC 1，2选择性化合物可以显著增加从特异性脑区域中分离并且使用免疫荧光分析的神经元细胞中与记忆和学习有关的乙酰化标记。A.对照证实在脑区域特异性原代培养物(纹状体)中6小时温育后，以1和10uM的BRD-6929不引起的细胞总数目中的增加或减少。B.直方图显示在脑区域特异性原代培养物(纹状体)中6小时温育后，以1和10uM的BRD-6929引起H2B四乙酰化中的2-3倍增加。在所有情况下这种效应相对于DMSO对照是显著的。
图16证实HDAC1，2选择性化合物在增加特异性组蛋白基因座H2B上的乙酰化中是有效的。A.显微照片显示在6小时温育后，用DMSO或10uM BRD-5298--HDAC 1，2选择性抑制剂处理后在原代神经元细胞中增加的荧光。增加的品红色荧光与增加的H2B乙酰化水平对应。B.对照证实在原代神经元细胞培养物中6小时温育后，以1和10uM的BRD-6929和BRD-5298不引起的细胞总数目中的增加或减少。C.直方图显示在原代神经元细胞培养物中6小时温育后，以1和10uM的BRD-6929和BRD-5298(HDAC1，2选择性抑制剂)引起H2B乙酰化中的显著增加。
图17是在小鼠中单次45mg/kg i.p.剂量后在血浆和脑中BRD-6929的浓度-时间曲线。
图18是在成年雄性C57BL/6J小鼠的脑特异性区域中关于用BRD-6929的急性处理的实验方案和对组蛋白乙酰化的相应作用。
图19显示用BRD-6929的急性处理引起成年雄性C57BL/6J小鼠的皮质中的H2B(四)组蛋白乙酰化。在左侧上的直方图是在右侧上显示的蛋白质凝胶数据的定量。数据已针对组蛋白H3水平的水平标准化。BRD-6929引起关于这种标记在皮质中的1.5-2倍增加。这证实BRD-6929是在全身性给予单次剂量后在皮质中的HDACs功能抑制剂。
图20显示用BRD-6929的急性处理引起成年雄性C57BL/6J小鼠的皮质中增加的H2BK5组蛋白乙酰化。在1小时后在皮质中，BRD-6929引起关于H2BK5的乙酰化水平中的1.5-2倍增加。这种乙酰化标记已与增加的学习和记忆相关。
图21证实在BRD-6929的长期施用后在全脑中的乙酰化标记中的增加。
图22证实在WT C57/BL6小鼠中BD-6929增加联想性学习和记忆。
详述
通过组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACis)诱导的增加的组蛋白尾部乙酰化促进野生型小鼠中以及神经变性的小鼠模型中的学习和记忆。利用HDACis的治疗潜力要求与认知增强连接的特异性HDAC家族成员的知识。根据本发明的方面显示HDAC2而不是HDAC1的神经元特异性过表达减少树突棘密度、突触数目、突触可塑性和记忆形成。相反，HDAC2缺陷导致增加的突触数目和记忆促进，类似于小鼠中的长期HDAC抑制剂处理。值得注意的是，HDAC2过表达小鼠减少的突触数目和学习损害被长期HDACi处理完全改善。因此，HDACi处理未能进一步促进HDAC2缺陷小鼠中的记忆形成。此外，启动子占据的分析揭示HDAC2与牵涉突触可塑性和记忆形成的基因启动子相关。我们的结果暗示HDAC2在调节突触的长效改变中起作用，这依次负面调节学习和记忆。
在某些方面，本发明涉及用于增强和/或寻回记忆以及促进学习和记忆的治疗剂。如本文使用的，“记忆”指恢复关于过去事件或知识的信息的能力。记忆包括短期记忆(也称为工作或近期记忆)和长期记忆。短期记忆涉及近期事件，而长期记忆涉及更遥远过去事件的回想。增强或寻回记忆不同于学习。然而，在某些情况下学习被称为记忆。本发明区分学习和记忆，并且集中于增强记忆。与记忆增强不同，学习指创造以前不存在的新记忆的能力。在某些情况下，本发明还涉及用于增强学习的方法。因此，为了测试治疗试剂影响受试者学习而不是回想旧记忆的能力的能力，治疗剂应在记忆创造前或同时施用。为了测试治疗剂实现先前创造记忆的回想的能力，治疗剂应在记忆创造后且优选记忆丧失后施用。
在某些情况下，本发明涉及用于重获受试者中的记忆的方法。为了重获记忆，记忆必须丧失。丧失的记忆是如果没有帮助例如本发明的治疗剂无法由受试者寻回的记忆。换言之，受试者无法回想记忆。如本文使用的，术语“重获”指受试者回想受试者先前不能回想的记忆的能力。一般地，此类受试者具有称为记忆丧失的病状。具有记忆丧失的受试者是无法回想一次或多次记忆的受试者。记忆可以是短期记忆或长期记忆。用于评估回想记忆的能力的方法是本领域技术人员已知的，并且可以包括常规认知测试。
在其他情况下，本发明涉及用于在已减少对长期记忆的存取的受试者中存取长期记忆的方法。已减少对长期记忆的存取的受试者是已经历一次或多次长期记忆差错的受试者。长期记忆差错可以是间歇或连续的。因此，已减少对长期记忆的存取的受试者包括但不限于具有记忆丧失的受试者，就长期记忆而言。
在某些情况下，“已减少存取的受试者”的长期记忆可能受损。受损的长期记忆是其中受试者的生理条件与长期记忆丧失相关的那种。与长期记忆丧失相关的病状包括但不限于年龄相关的记忆丧失和损伤相关的记忆丧失。
如本文使用的，“年龄相关的记忆丧失”指特征在于未升高至痴呆水平的神经系统功能变性的病状连续体(continuum)中的任何，如本文进一步定义的和/或如由Diagnostic and Statistical Manual ofMental Disorders：4th Edition of the American PsychiatricAssociation(DSM-IV，1994)定义的。这个术语特别排除年龄相关的痴呆例如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病，和智力低下病状例如唐氏综合征。年龄相关的记忆丧失特征在于与他或她更年轻时比较，在老年受试者中的客观记忆丧失，而不是在对于受试者的年龄的正常限制内的认知测试表现。年龄相关的记忆丧失受试者在关于痴呆的标准化诊断测试上得分在正常范围内，如由DSM-IV所示。此外，DSM-IV提供了用于称为年龄相关的认知减退的病状的分开诊断标准。在本发明的背景中，以及术语“年龄有关的记忆损害”和“年龄一致的记忆减退”应理解为与年龄相关的记忆丧失同义。年龄相关的记忆丧失可以包括减少的脑重量、脑回萎缩、心室扩张和在不同脑区域内的神经元的选择性丧失。为了本发明的某些实施方案的目的，更进行性形式的记忆丧失也包括在年龄相关的记忆病症的定义下。因此，具有超过年龄正常的记忆丧失和认知损害，然而评分低于关于直接(frank)痴呆的诊断阈值的人，可以被称为具有轻度神经认知病症、轻度认知损害、晚年健忘、良性老年健忘、初始痴呆、暂时性痴呆等。此类受试者在晚年中可以对发展直接痴呆略微更敏感(还参见通过引用合并的美国专利申请2006/008517)。与年龄相关的记忆丧失相关的症状包括但不限于与衰老脑相关的生物化学标记中的改变，例如IL-1β、IFN-γ、p-JNK、p-ERK、由长期增强中的减少证明的突触活性或功能例如突触可塑性中的减少、记忆减少和认知减少。
如本文使用的，“损伤相关的记忆丧失”指对脑发生并且可以导致神经学损伤的损伤。脑损伤来源包括外伤性脑损伤例如震荡损伤或穿通性头部创伤、脑瘤、酒精中毒、阿尔茨海默氏病、中风、心脏病发作和剥夺脑的氧的其他病状、脑膜炎、AIDS、病毒性脑炎和脑积水。
受试者应意指人或脊椎动物或哺乳动物，包括但不限于犬、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、火鸡、鸡和灵长类例如猴。受试者是否则不需要HDAC抑制剂的那些。受试者特别排除具有阿尔茨海默氏病的受试者，除在其中具有阿尔茨海默氏病的受试者被明确提及的情况下。
本发明的方法一般涉及用于增强记忆的方法。用于增强记忆的方法包括重建对记忆的存取以及重获记忆。如本文使用的，术语重建存取指增加记忆的寻回。尽管申请人不受作用机制束缚，但认为本发明的化合物通过重建突触网络在增加记忆寻回中是有效的。重建突触网络的过程可以包括活跃脑突触数目中的增加和或神经元丧失的逆转。
如本文使用的，术语重建对长期记忆的存取当就包括记忆丧失或记忆差错的病症而言使用时，指增加受试者回想记忆的能力的治疗。在某些情况下，本发明的治疗剂还减少记忆丧失或无法寻回的发生率和/或频率。
需要增强记忆的受试者是具有记忆丧失或记忆差错的受试者。记忆丧失可以通过任何机制发生，例如它可以是年龄相关的或由与认知损害相关的损伤或病症引起。与认知损害相关的病症包括例如MCI(轻度认知损害)、阿尔茨海默氏病、记忆丧失、与阿尔茨海默病相关的注意缺陷症状、与阿尔茨海默病相关的神经变性、混合血管起源的痴呆、变性起源的痴呆、早老性痴呆、老年性痴呆、与帕金森氏病相关的痴呆、血管性痴呆、进行性核上麻痹或皮质基底节变性。
阿尔茨海默氏病是特征在于认知和非认知性神经精神性症状的变性脑病症，这占关于超过65岁患者的所有痴呆病例的约60％。在阿尔茨海默氏病中，控制记忆的认知系统已受损。通常长期记忆保留，而短期记忆丧失；相反，记忆可以变得混淆，导致识别应熟悉的人或场所中的错误。精神症状在阿尔茨海默氏病中是共有的，具有在许多患者中存在的精神状态(幻觉和幻想)。可能阿尔茨海默氏病的精神病症状涉及多巴胺或乙酰胆碱浓度中的转变，这可以加强多巴胺能/胆碱能平衡，从而导致精神病行为。例如，已提出增加的多巴胺释放可以负责精神分裂症的阳性症状。这可以导致多巴胺能/胆碱能平衡的阳性破坏。在阿尔茨海默氏病中，胆碱能神经元中的减少有效减少乙酰胆碱释放，导致多巴胺能/胆碱能平衡的负面破坏。事实上，用于减轻精神分裂症的精神状态的抗精神病剂也在缓和阿尔茨海默氏患者中的精神状态中有用，并且可以与本文描述的用于在本发明的方法中使用的组合物组合。
根据本发明还提供了通过施用HDAC抑制剂用于重获具有阿尔茨海默氏病的受试者中的记忆的方法。此类方法任选施用抑制剂且监控受试者，以鉴定先前丧失的记忆的重获。受试者可以通过本领域已知的常规测试进行监控。例如，某些在书本例如上文描述的DSM或医学文献中描述。
血管性痴呆也称为“多发梗塞性痴呆”，指由不同机制引起的症状群，所述不同机制全都导致脑中的血管病变。血管性痴呆的主要亚型是例如血管性轻度认知损害、多发梗塞性痴呆、由于要害单梗塞的血管性痴呆(影响丘脑、大脑前动脉、顶叶或扣带回)、由于出血性损伤的血管性痴呆、小血管病(包括例如由于腔隙(lacunar)病变宾斯旺格(Binswanger)病的血管性痴呆和)、和混合型阿尔茨海默氏病伴血管性痴呆。
HDACs与其他染色质修饰酶和共调节剂相互作用，并且在使后生景观(landscape)成形中起关键作用(Goldberg，A.D.，Allis，C.D.，&Bernstein，E.Cell 128(4)，635-638(2007).)。在哺乳动物基因组中存在总共18种HDAC酶，这一般分成4个类别，包括I、II、III和IV类。这些酶已知具有组蛋白和非组蛋白底物。除II类HDAC5外，其近期已牵涉对抗抑郁药作用(Tsankova，N.M.等人Nat Neurosci9(4)，519-525(2006).)和长期情绪刺激(Renthal，W.等人Neuron56(3)，517-529(2007).)的应答，关于HDACs在脑中的功能知之甚少。在HDACs中，I、II和IV类HDACs是锌依赖性水解酶。I类HDACs包括1、2、3和8，这已充分证明对组蛋白底物以及非组蛋白底物发挥脱乙酰基酶活性。这些家族成员全被非选择性HDAC抑制剂丁酸钠抑制。II类HDACs可以分成包括HDAC 4、5、7和9的IIa类成员，和包括HDAC6和10的IIb类成员。在HDAC5的情况下，在脑中的作用已响应抗抑郁药作用和长期情绪刺激得到鉴定。然而，IIa类HDACs其自身是否具有功能组蛋白(或其他非组蛋白)脱乙酰基酶活性，而不是由共纯化I类HDACs贡献的活性，目前仍不明了。IIb类家族成员HDAC6和10主要集中于细胞质。HDAC6在家族中在其具有2个脱乙酰基酶结构域中是独特的。已显示HDAC6充当α-微管蛋白(K40)脱乙酰基酶，且通过蛋白酶体调节泛素依赖性蛋白质降解。相比之下，III类HDACs(sirtuins；SIRT1-7)是非典型的、NAD(+)-依赖性酶，这显示对锌依赖性HDACs包括SB的大多数抑制剂结构类别的非重叠敏感性。后面一个发现暗示sirtuins不是HDACi诱导的记忆增强的相关靶。
根据本发明有用的化合物是HDAC2抑制剂。如本文使用的，HDAC2抑制剂是减少HDAC2活性和/或表达的任何化合物，包括蛋白质、小分子和核酸。在某些实施方案中，HDAC2抑制剂可以是选择性HDAC2抑制剂。选择性HDAC2抑制剂是抑制HDAC2的活性或表达，但不显著抑制至少2种其他HDAC酶的活性或表达的化合物，所述其他HDAC酶例如HDAC1、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDA C7、HDA C8、HDA C9、HDA C10、HDA C11、HDA C12、HDA C13、HDAC14、HDAC15、HDAC16、HDAC17或HDAC18。在某些实施方案中，选择性HDAC2抑制剂是抑制HDAC2的活性或表达，但不显著抑制任何其他HDAC酶的活性或表达的化合物。在其他实施方案中，选择性HDAC2抑制剂不显著抑制任何其他I类HDAC酶的活性或表达。HDAC1/HDAC2选择性抑制剂是抑制HDAC1和HDAC2的活性或表达，但不显著抑制至少一种非I类HDAC酶的活性或表达的化合物。在某些实施方案中，HDAC1/HDAC2选择性抑制剂不显著抑制任何非I类HDAC酶的活性或表达。在其他实施方案中，HDAC1/HDAC2选择性抑制剂不显著抑制HDAC3酶的活性或表达。HDAC1/HDAC2/HDAC3选择性抑制剂是抑制HDAC1和HDAC2和HDAC3的活性或表达，但不显著抑制至少一种非I类HDAC酶的活性或表达的化合物。在某些实施方案中，HDAC1/HDAC2/HDAC3选择性抑制剂不显著抑制任何非I类HDAC酶的活性或表达。显著抑制指例如在体外可检测地改变细胞中的HDAC活性的量。在某些实施方案中，非限制性HDAC2抑制剂可以是部分选择性的。例如，它可以充当HDAC1-HDAC18中的一种或多种其他酶但并非全部的抑制剂。优选地，HDAC抑制剂不充当HDAC1、HDAC5、HDAC6、HDAC7和HDAC10的抑制剂。在某些实施方案中，HDAC2抑制剂是选择性HDAC1/HDAC2/HDAC10抑制剂。在某些实施方案中，选择性HDAC1/HDAC2/HDAC10抑制剂是BRD-6929。在其他实施方案中，HDAC2抑制剂是选择性HDAC1/HDAC2/HDAC3/HDAC10抑制剂。
HDAC2抑制剂包括与组蛋白脱乙酰基酶特异性反应的结合肽例如抗体，优选单克隆抗体、抗体片段、scFv等，小分子抑制剂(通常常规被称为HDAC抑制剂)、和表达抑制剂例如反义和siRNA。
下文实施例中描述的研究也应理解为测定11种组蛋白脱乙酰基酶中的哪种负责所观察到的功能，且鉴定用于增强记忆的选择性HDAC抑制剂。已发现尽管与对照小鼠相比HDAC1Tg小鼠未显示学习行为中的任何差异，但如通过巴甫洛夫恐惧条件化和莫里斯水迷宫测试评估的，HDAC2Tg小鼠具有受损的学习。值得注意的是，HDAC2神经元特异性敲除小鼠(功能丧失)展示增强的学习。相反，MS-275，1类HDAC抑制剂(HDAC1/HDAC3特异性)不促进小鼠中的联想性学习，并且与盐水处理组比较，在恐惧条件化训练后，MS-275处理的小鼠显示较低数目的c-fos阳性细胞。另外数据还证实HDAC5、HDAC6、HDAC7和HDAC10对于增强记忆无用。这些观察暗示HDAC2参与学习和记忆，并且它可能是通过一般性HDAC抑制剂的抑制靶。甚至更令人惊讶的是，发现HDAC1/HDAC2和HDAC1/HDAC2/HDAC3选择性抑制剂在增强学习和记忆中也是有用的。由本发明人中的一些的先前研究已证实HDAC1激活物促进神经发生。因此，出乎意料的是HDAC1/HDAC2抑制剂对于增强记忆将是有用的。
HDAC抑制剂包括但不限于下述化合物、其功能类似物和盐：曲古菌素A(TSA)、曲古菌素B、曲古菌素C、trapoxin A、trapoxinB、chlamydocin、丁酸钠盐、丁酸、丁酸苯酯钠盐、苯丁酸、scriptaid、FR901228、depudecin、oxamflatin、pyroxamide、apicidin B、apicidinC、碳色长蠕孢菌毒素、2-氨基-8-氧代-9，10-环氧-癸酰、3-(4-芳酰基-1H-吡咯-2-基)-N-羟基-2-丙烯酰胺、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸、FK228或m-羧基肉桂酸二羟基酰胺。在优选实施方案中，HDAC抑制剂是HDAC2抑制剂例如丁酸钠、SAHA或TSA。显示增加的药理学半衰期的抑制剂衍生物根据本发明也是有用的(Brettman和Chaturvedi，J.Cli.Pharmacol.36(1996)，617-622)。
泛或通用HDAC抑制剂的例子是SAHA。如本文使用的，“SAHA”指辛二酰苯胺异羟肟酸、类似物、衍生物和多形体。SAHA的多形体在通过引用合并的美国公开专利申请号20040122101中描述。
本发明的HDAC2抑制剂包括HDAC2选择性抑制剂、HDAC1/HDAC2选择性抑制剂和HDAC1/HDAC2/HDAC3选择性抑制剂，包括小分子以及抑制核酸例如反义和siRNA。小分子HDAC2抑制剂包括例如下式的化合物：
Figure BDA0000072501070000221
其中R1和R2独立地选自H，取代或未取代、分支或未分支、环状或无环C1-6烷基，杂环基，C1-6烯基，杂芳基，杂亚芳基和杂亚芳基-烯基；并且R3是芳基或杂芳基。在某些实施方案中，R1是未取代的无环C1-6烷基；R1选自甲基、乙基、丙基和丁基；R1是杂亚芳基-烯基；R1是杂亚芳基-C1-6烯基；R1是吡啶基-乙烯；R2是氢；R3是杂芳基；或R3是噻吩基。
Figure BDA0000072501070000222
其中R1和R2独立地选自H，取代或未取代、分支或未分支、环状或无环C1-6烷基，杂环基，C1-6烯基，杂芳基，杂亚芳基，杂亚芳基-烯基，亚芳基-烯基；和任选取代的杂环基-烯基；并且R3是芳基或杂芳基。在某些实施方案中，R1是未取代的无环C1-6烷基；R1选自甲基、乙基、丙基和丁基；R1是杂亚芳基-烯基；R1是杂亚芳基-C1-6烯基；R1是吡啶基-乙烯；R1是亚芳基-烯基；R1是亚芳基-C1-6烯基；R1是苯乙烯；R1是杂环基-烯基；R1是未取代的杂环基-C1-6烯基；R1是哌嗪-乙烯；R1是取代的杂环基-C1-6烯基；R1是取代的哌嗪-乙烯；R1是C1-6烯基取代的哌嗪-乙烯；R1是甲基取代的哌嗪-乙烯；R2是氢；R3是杂芳基；R3是噻吩基；或R3是吡啶基。
Figure BDA0000072501070000223
其中X是-C(O)-N(R1)(R2)，C1-6亚烷基-N(H)-C1-6烯基-N(R1)C(O)(R2)；或-N(R1)C(O)R2；R1和R2独立地选自H，和取代或未取代、分支或未分支、环状或无环C1-6烷基；并且R3是炔基、芳基或杂芳基。在某些实施方案中，X是-C(O)-N(R1)(R2)；R1和R2独立地选自H、未取代、未分支、无环C1-6烷基；R1和R2独立地选自H、甲基、乙基、丙基和丁基；R1是H；R1和R2是H；X是-C(O)-NH2；X是C1-6亚烷基-N(R1)-C1-6烯基-N(R1)C(O)(R2)；R1是H；X是C1-6亚烷基-N(H)-C1-6烯基-N(H)C(O)(R2)；X是-N(R1)C(O)R2；R1是H；R1是未取代的无环C1-6烷基；R1选自甲基、乙基、丙基和丁基；R2是未取代的无环C1-6烷基；R2选自甲基、乙基、丙基和丁基；R3是杂芳基；R3是噻吩基；R3是芳基；R3是炔基；R3是C1-6炔基；或R3是乙炔基。
Figure BDA0000072501070000231
其中R1和R2独立地选自H和-C(O)-C1-6烷基；R3是任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、或芳基-C1-6烯基。在某些实施方案中，R1是H；R1和R2是H；R1是-C(O)-C1-6烷基；R1是-C(O)-甲基；R1是-C(O)-甲基并且R2是H；R3是任选取代的芳基；R3是甲苯基；R3是任选取代的杂芳基；R3是噻吩基；R3是芳基-C1-6烯基；或R3是苯乙烯。
Figure BDA0000072501070000232
其中R1和R2独立地选自H，和取代或未取代、分支或未分支、环状或无环C1-6烷基；并且R3是芳基或杂芳基。在某些实施方案中，R1是H；R1和R2是H；R1是甲基、乙基、丙基或丁基；R3是芳基；R3是杂芳基；或R3是噻吩基。
Figure BDA0000072501070000241
其中R1和R2独立地选自H，取代或未取代、分支或未分支、环状或无环C1-6烷基，杂环基，杂芳基，芳基和芳基-C1-6烯基。在某些实施方案中，R1是H；R1和R2是H：R1是甲基、乙基、丙基或丁基；R1是芳基-C1-6烯基；R1是苯乙烯；或R2是H。
“烷基”一般而言指脂肪族烃基团，其可以是在链中具有1-约10个碳原子的直链、分支或环状的，以及在这范围的所有组合和亚组合。术语“烷基”包括“未取代烷基”和“取代烷基”，其中后者指具有替换主链的一个或多个碳上的氢的取代基的烷基部分。在优选实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有12个或更少的碳原子(例如，C1-C12用于直链，C3-C12用于支链)，并且更优选6个或更少，且更加优选4个或更少。同样地，优选环烷基在其环结构中具有3-10个碳原子，并且更优选在环结构中具有5、6或7个碳。除非碳数目另有说明，否则如本文使用的，“低级烷基”意指如上文定义的烷基基团，但在其主链结构中具有1-10个碳，更优选1-6个碳原子，并且更加优选在其主链结构中1-4个碳原子。同样地，“低级烯基”和“低级炔基”具有相似链长。优选烷基基团和低级烷基。在优选实施方案中，本文指定为烷基的取代基是低级烷基。烷基基团包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、环戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、环己基、环辛基、金刚烷基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基和2，3-二甲基丁基。烷基取代基可以包括例如烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸盐、phosphonato、phosphinato、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰和脲基)、脒基、亚氨基、硫氢基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸盐、烷基亚磺酰基、sulfonato、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷芳基或芳香族或杂芳香族部分。
术语“烯基”指在长度和可能取代中与上文所述烷基类似，但包含至少一个双键的不饱和脂肪族基团。
如本文使用的，术语“卤素”指示-F、-Cl、-Br或-I；术语“硫氢基”意指-SH；并且术语“羟基”意指-OH。
术语“芳基”单独或组合意指包含一个、两个或三个环的碳环芳香族系统，其中此类环可以以悬垂方式附着在一起或可以是稠合的。术语“芳基”包含芳香族原子团例如苯基、萘基、四氢萘基、茚满和联苯基，并且包括碳环芳基、杂环芳基和联芳基基团，所有这些可以是任选取代的。如本文使用的，术语“芳基”包括5-、6-和7-成员的单环芳香族基团，其可以包括零到4个杂原子，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。在环结构中具有杂原子的那些芳基基团还可以被称为“芳基杂环”或“杂芳香族”。芳环可以在一个或多个环位置上由如上所述的此类取代基取代，例如卤素、叠氮基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、硫氢基、亚氨基、氨基、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、亚磺酰氨基、酮、醛、酯、杂环基、芳香族或杂芳香族部分、-CF3、-CN等。术语“芳基”还包括具有2个或更多个环的多环系统，其中2个或更多个碳对于2个相邻环是共同的(环是“稠环”)，其中至少一个环是芳香族的，例如其他环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环基。
术语“联芳基”代表具有包含超过一个芳环包括稠环系统的5-14原子的芳基基团，和由其他芳基基团取代的芳基基团。此类基团可以是任选取代的。合适的联芳基包括萘基和联苯基。术语“碳环”指其中所有环成员都是碳原子的环状化合物。此类环可以是任选取代的。化合物可以是单环或联芳基环。术语“环烷基”包含具有3-10个碳原子的原子团，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和norboryl。此类基团可以是取代的。
“杂环”芳基或“杂芳基”基团是具有5-14个环原子的基团，其中1-4个杂原子是芳环中的环原子，并且环原子的其余部分是碳原子。合适杂原子包括氧、硫和氮。合适的杂芳基基团包括全部任选取代的呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低级烷基吡咯基、吡啶基-N-氧化物、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、吲哚基等。术语“杂环”指具有至少2种不同元件作为环成员原子的环状化合物。化合物可以是单环或联芳基。杂环基团包括例如噻吩、苯并噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、异苯并呋喃、色烯、咕吨基、吩噻噁、吡咯、咪唑、吡唑、异噻唑、异噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘啶、喹噁啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩吡嗪、吩噻嗪、呋咱、吩噁嗪、吡咯烷、oxolane、thiolane、噁唑、哌啶、哌嗪、吗啉、内酯、内酰胺例如氮杂环丁酮和吡咯烷酮、sultams、磺内酯等。杂环可以在一个或多个位置上由如上所述的此类取代基取代，如例如卤素、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、硫氢基、亚氨基、氨基、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、酮、醛、酯、杂环基、芳香族或杂芳香族部分、-CF3、-CN等。
应当理解“取代”或“由......取代”包括暗示条件，此类取代与被取代原子和取代基的允许效价一致，并且取代导致例如不会自发经历例如通过重排、环化、消除等的转变的稳定化合物。
如本文使用的，术语“取代的”考虑包括有机化合物的所有允许取代基。在一个广泛方面，允许取代基包括有机化合物的无环和环状、分支和未分支、碳环和杂环、芳香族和非芳香族取代基。举例说明性取代基包括例如本文上文描述的那些。允许取代基对于合适有机化合物可以是一个或多个以及相同或不同的。为了本发明的目的，杂原子例如氮可以具有氢取代基和/或本文描述的有机化合物的任何允许取代基，这满足杂原子的效价。本发明并不预期以任何方式受有机化合物的允许取代基限制。
在本发明的方法中有用的HDAC2抑制剂的非限制性例子是：
Figure BDA0000072501070000271
Figure BDA0000072501070000281
本发明的化合物可以任选与其他化合物例如DNA甲基化抑制剂一起施用。DNA甲基化抑制剂是直接或间接引起核酸分子的甲基化水平中的减少的试剂。DNA甲基化抑制剂是本领域众所周知且常规利用的，并且包括但不限于甲基化酶例如甲基酶和甲基转移酶的抑制剂。DNA甲基化抑制剂的非限制性例子包括5-氮杂胞苷、5-氮杂-2′脱氧胞苷(在欧洲也称为地西他滨)、5，6-二氢-5-氮杂胞苷、5，6-二氢-5-氮杂-2′脱氧胞苷、5-氟胞苷、5-氟-2′脱氧胞苷，以及包含5-氮杂-2′脱氧胞苷、5，6-二氢-5-氮杂-2′脱氧胞苷和5-氟-2′脱氧胞苷的短寡核苷酸，以及普鲁卡因胺、Zebularine和(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯。
除上文描述的常规小分子HDAC抑制剂外，HDAC2还可以通过基于核酸或表达抑制剂例如反义和RNAi进行抑制。因此，本发明包含与编码HDAC2的核酸分子选择性结合的抑制核酸例如反义寡核苷酸，以降低这种蛋白质的表达和活性。
如本文使用的，术语“反义寡核苷酸”或“反义”描述其为寡核糖核苷酸、寡脱氧核糖核苷酸、经修饰寡核糖核苷酸或经修饰寡脱氧核糖核苷酸的寡核苷酸，其在生理条件下与包括特定基因的DNA或那种基因的mRNA转录物杂交，并且从而抑制那种基因的转录和/或那种mRNA的翻译。反义分子这样进行设计，以便在与靶基因或转录物杂交后干扰靶基因的转录或翻译。与编码组蛋白脱乙酰基酶的核酸分子选择性结合的反义寡核苷酸是特别优选的。本领域技术人员应认识到反义寡核苷酸的确切长度及其与其靶的互补性程度将依赖于选择的特定靶，包括靶的长度和包括那种序列的特定碱基。
优选反义寡核苷酸这样进行构建且排列，以便在生理条件下与靶选择性结合，即在生理条件下与靶序列比与靶分子中的任何其他序列基本上更多杂交。基于编码组蛋白脱乙酰基酶的核酸分子的核苷酸序列，(例如，GenBank登记号NP_848512、NP_848510、NP_478057、NP_478056、NP_055522)或等位基因或同源基因组和/或cDNA序列，本领域技术人员可以容易地选择且合成用于依照本发明使用的许多合适反义分子中的任何。为了对于抑制是充分选择且有效的，此类反义寡核苷酸应包括与靶互补的至少约10个，且更优选至少约15个连续碱基，尽管在特定情况下在长度中短至7个碱基的经修饰寡核苷酸已成功用作反义寡核苷酸。参见Wagner等人，Nat.Med.1(11)：1116-1118，1995。最优选地，反义寡核苷酸包括20-30个碱基的互补序列。尽管可以选择对于基因或mRNA转录物的任何区域反义的寡核苷酸，但在优选实施方案中，反义寡核苷酸对应于N末端或5′上游位点，例如翻译起始、转录起始或启动子位点。此外，3′非翻译区可以由反义寡核苷酸靶向。靶向mRNA剪接位点也已在本领域中使用，但如果发生可变mRNA剪接，那么也可以是较不优选的。此外，反义优选靶向其中未预期mRNA二级结构(参见例如，Sainio等人，Cell Mol.Neurobiol.14(5)：439-457，1994)和未预期蛋白质在其上结合的位点。
在一组实施方案中，本发明的反义寡核苷酸可以由“天然”脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合组成。即，一个天然核苷酸的5′末端和另一个天然核苷酸的3′末端可以经由磷酸二酯核苷间键共价连接，如在天然系统中。这些寡核苷酸可以通过领域公认的方法进行制备，所述领域公认的方法可以手工或通过自动化合成仪执行。它们还可以通过载体重组产生。
然而，在优选实施方案中，本发明的反义寡核苷酸还可以包括“经修饰”寡核苷酸。即，寡核苷酸可以以许多方法进行修饰，所述方法不阻止其与其靶杂交，但增强其稳定性或靶向或以其他方式增强其治疗有效性。
如本文使用的，术语“经修饰寡核苷酸”描述了这样的寡核苷酸，其中(1)至少2个其核苷酸经由合成核苷间键共价连接(即，在一个核苷酸的5′末端和另一个核苷酸的3′末端之间除磷酸二酯键外的键)和/或(2)通常不与核酸分子结合的化学基团已与寡核苷酸共价附着。优选合成核苷间键是硫代硫酸酯、烷基膦酸酯、二硫代硫酸酯、磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、acetamidates、羧甲基酯和肽。
术语“经修饰寡核苷酸”也包含具有共价修饰的碱基和/或糖的寡核苷酸。例如，经修饰寡核苷酸包括具有主链糖的寡核苷酸，所述主链糖与除在3′位置上的羟基基团外和除在5′位置上的磷酸基外的低分子量有机基团共价附着。因此，经修饰寡核苷酸可以包括2’-O-烷基化核糖基团。此外，经修饰寡核苷酸可以包括糖例如阿拉伯糖代替核糖。
因此，本发明考虑了药物制剂，其包含与编码组蛋白脱乙酰基酶的核酸分子互补且在生理条件下可与之杂交的经修饰反义分子，连同药学上可接受的载体。反义寡核苷酸可以作为药物组合物的部分施用。在这个后面一种实施方案中，可以优选使用缓慢静脉内施用。此类药物组合物可以包括与本领域已知的任何标准生理学和/或药学上可接受的载体组合的反义寡核苷酸。组合物应是无菌的，且在适合于施用于受试者的重量或体积单位中包含治疗有效量的反义寡核苷酸。
本发明的方法还包含分离的短RNA的使用，其通过称为RNA干扰(RNAi)的过程指导组蛋白脱乙酰基酶mRNA的序列特异性降解。该过程已知在广泛多样的生物体中发生，包括哺乳动物和其他脊椎动物的胚胎。已证实dsRNA加工为长度21-23个核苷酸(nt)的RNA区段，并且此外，它们在不存在更长dsRNA的情况下介导RNA干扰。因此，这些21-23nt片段是RNA降解的序列特异性介质，并且在本文中被称为siRNA或RNAi。本发明的方法包含这些片段(或相同或相似性质的重组产生或化学合成的寡核苷酸)的使用，以使得能够靶向组蛋白脱乙酰基酶mRNAs，用于在本文讨论的治疗应用中有用的哺乳动物细胞中的降解。
HDAC2的核苷酸序列是本领域众所周知的，并且可以通过本领域技术人员使用，使用领域公认的技术与下文所述指导组合，以产生合适的siRNA分子。此类方法在下文更详细地描述。
在一个实施方案中，本发明的特征在于具有针对靶HDAC2 RNA(例如编码或非编码RNA)的RNAi活性的siNA分子，其中siNA分子包括与任何HDAC2 RNA序列互补的序列，例如具有对于智人HDAC2 GenBank登记号：mRNA NM_001527的序列。化学修饰可以应用于本发明的任何siNA构建体。如GenBank登记号：mRNANM_001527中所示，HDAC2的蛋白质序列是：
MRSPPCGLLRWFGGPLLASWCRCHLRFRAFGTSAGWYRAFPAPP
PLLPPACPSPRDYRPHVSLSPFLSRPSRGGSSSSSSSRRRSPVAAVAGEPMAYSQGGG
KKKVCYYYDGDIGNYYYGQGHPMKPHRIRMTHNLLLNYGLYRKMEIYRPHKATAEEMT
KYHSDEYIKFLRSIRPDNMSEYSKQMQRFNVGEDCPVFDGLFEFCQLSTGGSVAGAVK
LNRQQTDMAVNWAGGLHHAKKSEASGFCYVNDIVLAILELLKYHQRVLYIDIDIHHGD
GVEEAFYTTDRVMTVSFHKYGEYFPGTGDLRDIGAGKGKYYAVNFPMRDGIDDESYGQ
IFKPIISKVMEMYQPSAVVLQCGADSLSGDRLGCFNLTVKGHAKCVEVVKTFNLPLLM
LGGGGYTIRNVARCWTYETAVALDCEIPNELPYNDYFEYFGPDFKLHISPSNMTNQNT
PEYMEKIKQRLFENLRMLPHAPGVQMQAIPEDAVHEDSGDEDGEDPDKRISIRASDKR
IACDEEFSDSEDEGEGGRRNVADHKKGAKKARIEEDKKETEDKKTDVKEEDKSKDNSG
EKTDTKGTIKSEQLSNP(SEQ ID NO：1)
核酸序列是：
   1 atgcgctcac ctccctgcgg cctcctgagg tggtttggtg gccccctcct cgcgagttgg
  61 tgccgctgcc acctccgatt ccgagctttc ggcacctctg ccgggtggta ccgagccttc
 121 ccggcgcccc ctcctctcct cccaccggcc tgcccttccc cgcgggacta tcgcccccac
 181 gtttccctca gcccttttct ctcccggccg agccgcggcg gcagcagcag cagcagcagc
 241 agcaggagga ggagcccggt ggcggcggtg gccggggagc ccatggcgta cagtcaagga
 301 ggcggcaaaa aaaaagtctg ctactactac gacggtgata ttggaaatta ttattatgga
 361 cagggtcatc ccatgaagcc tcatagaatc cgcatgaccc ataacttgct gttaaattat
 421 ggcttataca gaaaaatgga aatatatagg ccccataaag ccactgccga agaaatgaca
 481 aaatatcaca gtgatgagta tatcaaattt ctacggtcaa taagaccaga taacatgtct
 541 gagtatagta agcagatgca gagatttaat gttggagaag attgtccagt gtttgatgga
 601 ctctttgagt tttgtcagct ctcaactggc ggttcagttg ctggagctgt gaagttaaac
 661 cgacaacaga ctgatatggc tgttaattgg gctggaggat tacatcatgc taagaaatca
 721 gaagcatcag gattctgtta cgttaatgat attgtgcttg ccatccttga attactaaag
 781 tatcatcaga gagtcttata tattgatata gatattcatc atggtgatgg tgttgaagaa
 841 gctttttata caacagatcg tgtaatgacg gtatcattcc ataaatatgg ggaatacttt
 901 cctggcacag gagacttgag ggatattggt gctggaaaag gcaaatacta tgctgtcaat
 961 tttccaatga gagatggtat agatgatgag tcatatgggc agatatttaa gcctattatc
1021 tcaaaggtga tggagatgta tcaacctagt gctgtggtat tacagtgtgg tgcagactca
1081 ttatctggtg atagactggg ttgtttcaat ctaacagtca aaggtcatgc taaatgtgta
1141 gaagttgtaa aaacttttaa cttaccatta ctgatgcttg gaggaggtgg ctacacaatc
1201 cgtaatgttg ctcgatgttg gacatatgag actgcagttg cccttgattg tgagattccc
1261 aatgagttgc catataatga ttactttgag tattttggac cagacttcaa actgcatatt
1321 agtccttcaa acatgacaaa ccagaacact ccagaatata tggaaaagat aaaacagcgt
1381 ttgtttgaaa atttgcgcat gttacctcat gcacctggtg tccagatgca agctattcca
1441 gaagatgctg ttcatgaaga cagtggagat gaagatggag aagatccaga caagagaatt
1501 tctattcgag catcagacaa gcggatagct tgtgatgaag aattctcaga ttctgaggat
1561 gaaggagaag gaggtcgaag aaatgtggct gatcataaga aaggagcaaa gaaagctaga
1621 attgaagaag ataagaaaga aacagaggac aaaaaaacag acgttaagga agaagataaa
1681 tccaaggaca acagtggtga aaaaacagat accaaaggaa ccaaatcaga acagctcagc
1741 aacccctgaa tttgacagtc tcaccaattt cagaaaatca ttaaaaagaa aatattgaaa
1801 ggaaaatgtt ttctttttga agacttctgg cttcatttta tactactttg gcatggactg
1861 tatttatttt caaatggctt tttcgttttt gtttttcttg gcaagtttta ttgtgagttt
1921 ttctaattat gaagcaaaat ttcttttctc caccatgctt tatgtgatag tatttaaaat
1981 tgatgtgagt tattatgtca aaaaaactga tctattaaag aagtaattgg cctttctgag
2041 ctgatttttc catcttttgt aattatcttt attaaaaaat tgtacttgga ttatctttt2
2101 tctgtttatt actacaatat gaagtcttgt ttcagtggct aatgacatca tttctgtaga
2161 cttacaatac actctaggtg aaagataatg attacagctt gaaagataac tatttgctgt
2221 ttctttggga agagtattta tagtaattat tacttatctt tgcaatagaa attctaccac
2281 cttgccctct atagcttagc cagttagtat cagtgaagat taacatccca ttacaattta
2341 tgaaataata cagactctgc aattgagatg taggagttct ttgagttgac ccaaagattc
2401 tcaaaattga aatggaaatt ctgaattgaa agaagaaact gaccagaact tgtattgacc
2461 agacttgcct atagtatatt gctggtttaa aatggaacct gcagacaaaa cctgtttctt
2521 ttactgcatt tacatggcat ccaggttcca ttattattta cgtgacatcc aggtttctaa
2581 ctcaaggaaa taaacacaac tgatttatca ttcagcaact acttattgtg tgtctgccca
2641 ttttaagact gtaggagtgt aactgaatat aatggaaaaat gctttcact cagagcttac
2701 actcagagct tacattctag tagcaggaag cagacaaatg ggggtaactc ctgctactaa
2761 gatgtgcaaa gaagacaaaa cattttagga acttgccaaa atcagtgaaa tctccctttt
2821 tgtcaggccc acattgattc ttttgagatt aaaaattaca gaatgccaga agataattca
2881 gtcaaaagta tttctcttca gtgcagtaaa atattaaaag aaaaaatatt tctctacaag
2941 cctcttaaat gtttcagaca ttcacaatag cacctagact tttgtaatga acagctgtgc
3001 acccaccccg acttaacaaa tattttactt ttgctatatt tgcttcggtg tttttttctt
3061 aaaatacacc gaaattgaag ctctctttgt gtactttgtc gtttgtaatc ctccctccct
3121 cccagcctta agaagtaatc accattgtga ttattttatc catgtttttg tgaatatttt
3181 acccatgttt ttgtactttt gctacatatt tgttatcaat ctgtaaacct ttatgacatt
3241 aggaactaag aaacttagtc ccttcgttag ggggataatg aaatgtattt agtgtttgtg
33O1 aaacatagat ggtatgtatt tggacaattc tgtaactttg ctttttttat ttttattttt
3361 ccatagctta ttggggaaca ggtggtgttt ggttacatga ttaagttctt tagtggtgat
3421 ttgtgggatt ttggtggacc catcacccaa gcagtgtaca ctgcacccta tttgtaatct
3481 tttatccctc gcccccctcc caccatgcct cccgtctacc atgatgatcc tgttttaaat
3541 aagaaaatac catttcgcag gctccagatg ttctggcatc ctccctgtgg atttcccagt
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因此，本发明的特征在于被称为小干扰核酸(siNA)的小核酸分子的用途，其包括例如：微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)和小发夹RNA(shRNA)分子。本发明的siNA可以是未修饰或化学修饰的。本发明的siNA可以是化学合成的，由载体表达的或酶促合成的，如本文讨论的。本发明的特征还在于各种化学修饰的合成小干扰核酸(siNA)分子，能够通过RNA干扰(RNAi)调节细胞中的基因表达或活性。化学修饰的siNA的使用改善天然siNA分子的各种性质，通过例如在体内对核酸酶降解的抗性增加和/或通过改善的细胞摄取。此外，具有多重化学修饰的siNA可以保留其RNAi活性。本发明的siNA分子提供用于各种治疗应用的有用试剂和方法。
化学合成具有阻止其被血清核糖核酸酶降解的修饰(碱基、糖和/或磷酸盐)的核酸分子可以增加其效力(参见例如，Eckstein等人，国际公开号WO 92/07065；Perrault等人，1990Nature 344，565；Pieken等人，1991，Science 253，314；Usman和Cedergren，1992，Trendsin Biochem.Sci.17，334；Usman等人，国际公开号WO 93/15187；和Rossi等人，国际公开号WO 91/03162；Sproat，美国专利号5,334,711；和Burgin等人，同上；所有这些描述了可以对本文的核酸分子的碱基、磷酸盐和/或糖部分进行的各种化学修饰)。增强其在细胞中的功效，和从核酸分子中去除碱基以缩短寡核苷酸合成时间且减少化学要求的修饰是希望的。(所有这些出版物通过引用在此合并入本文)。
本领域存在描述糖、碱基和磷酸盐修饰的几个例子，其可以引入核酸分子内伴随其核酸酶稳定性和功效中的显著增强。例如，通过用核酸酶抗性基团修饰来修饰寡核苷酸，以增强稳定性和/或增强生物活性，所述核酸酶抗性基团例如2′氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-H、核苷酸碱基修饰(关于综述参见Usman和Cedergren，1992，TIBS.17，34；Usman等人，1994，Nucleic Acids Symp.Ser.31，163；Burgin等人，1996，Biochemistry，35，14090)。核酸分子的糖修饰已在本领域中得到广泛描述(参见Eckstein等人，国际公开PCT号WO 92/07065；Perrault等人Nature，1990，344，565568；Pieken等人Science，1991，253，314317；Usman和Cedergren，Trends inBiochem.Sci.，1992，17，334339；Usman等人国际公开PCT号WO93/15187；Sproat，美国专利号5,334,711和Beigelman等人，1995，J.Biol.Chem.，270，25702；Beigelman等人，国际PCT公开号WO97/26270；Beigelman等人，美国专利号5,716,824；Usman等人，molecule comprises one or more chemical modifications。
在一个实施方案中，双链siNA分子的链之一包括与靶RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，并且双链siNA分子的第二条链包括与靶RNA的核苷酸序列或其部分等同的核苷酸序列。在另一个实施方案中，双链siNA分子的链之一包括与靶RNA的核苷酸序列或其部分基本上互补的核苷酸序列，并且双链siNA分子的第二条链包括与靶RNA的核苷酸序列或其部分基本上相似的核苷酸序列。在另一个实施方案中，siNA分子的每条链都包括约19-约23个核苷酸，并且每条链包括与另一条链的核苷酸互补的至少约19个核苷酸。
在某些实施方案中，siNA是由基因组整合的转基因或基于质粒的表达载体编码且表达的shRNA、shRNA-mir或微小RNA分子。因此，在某些实施方案中，能够抑制mRNA表达或微小RNA活性的分子是基于转基因或质粒的表达载体，其编码小干扰核酸。此类转基因和表达载体可以采用聚合酶II或聚合酶III启动子，以驱动这些shRNAs的表达且导致细胞中的功能siRNAs。前面一种聚合酶允许使用常规蛋白质表达策略，包括诱导型和组织特异性表达系统。在某些实施方案中，转基因和表达载体受组织特异性启动子控制。在其他实施方案中，转基因和表达载体受诱导型启动子控制，例如四环素诱导型表达系统。
在某些实施方案中，本发明的小干扰核酸使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。重组哺乳动物表达载体可以能够指导核酸优先在特定细胞类型中的表达(例如组织特异性调节元件用于表达核酸)。组织特异性调节元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性例子包括肌球蛋白重链启动子、白蛋白启动子、淋巴样特异性启动子、神经元特异性启动子、胰腺特异性启动子、和乳腺特异性启动子。还包含发育调节的启动子，例如鼠类hox启动子和甲胎蛋白启动子。
可以使用的其他抑制分子包括针对一种或多种基因、RNA转录物或蛋白质中的序列的核酶、肽、脱氧核酶(DNAzymes)、肽核酸(PNAs)、三螺旋形成寡核苷酸、抗体、适体及其修饰形式。反义和核酶抑制策略已导致通过减少基因产物的表达或通过在突变位点上切割突变型转录物的肿瘤表型逆转(Carter和Lemoine Br.J.Cancer.67(5)：869-76，1993；Lange等人，Leukemia.6(11)：1786-94，1993；Valera等人，J.Biol.Chem.269(46)：28543-6，1994；Dosaka-Akita等人，Am.J.Clin.Pathol.102(5)：660-4，1994；Feng等人，CancerRes.55(10)：2024-8，1995；Quattrone等人，Cancer Res.55(1)：90-5，1995；Lewin等人，Nat Med.4(8)：967-71，1998)。例如，使用靶向膀胱癌细胞中的H-Ras突变的核酶获得赘生物逆转(Feng等人，Cancer Res.55(10)：2024-8，1995)。也已提议核酶作为抑制突变基因的基因表达且通过靶向反式剪接校正突变型的方法(Sullenger和Cech Nature 371(6498)：619-22，1994；Jones等人，Nat.Med.2(6)：643-8，1996)。核酶活性可以通过使用例如非特异性核酸结合蛋白或促进物寡核苷酸得到增强(Herschlag等人，Embo J.13(12)：2913-24，1994；Jankowsky和Schwenzer Nucleic Acids Res.24(3)：423-9,1996)。已提出多靶核酶(连接的或鸟枪)作为改善核酶用于基因抑制的效率的方法(Ohkawa等人，Nucleic Acids Symp Ser.(29)：121-2，1993)。
三螺旋方法也已就序列特异性基因抑制进行研究。已在某些情况下发现三螺旋形成寡核苷酸以序列特异性方式结合(Postel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88(18)：8227-31，1991；Duval-Valentin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89(2)：504-8，1992；Hardenbol和VanDyke Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(7)：2811-6，1996；Porumb等人，Cancer Res.56(3)：515-22，1996)。类似地，已显示肽核酸抑制基因表达(Hanvey等人，Antisense Res.Dev.1(4)：307-17，1991；Knudsen and Nielson Nucleic Acids Res.24(3)：494-500，1996；Taylor等人，Arch.Surg.132(11)：1177-83，1997)。小沟结合聚酰胺可以以序列特异性方式与DNA靶结合，并且从而可以代表用于在DNA水平上的未来抑制的有用小分子(Trauger等人，Chem.Biol.3(5)：369-77，1996)。此外，抑制已通过使用显性失活突变型肽和抗体在蛋白质水平上的干扰获得(Herskowitz Nature 329(6136)：219-22，1987；Rimsky等人，Nature 341(6241)：453-6，1989；Wright等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(9)：3199-203，1989)。在某些情况下，抑制策略已导致RNA水平中的减少而无蛋白质中的伴随减少，而在其他中，RNA中的减少已通过蛋白质中的减少反映。
可以采用的广泛多样的抑制策略包括DNA和/或RNA适体的使用，其可以选择为靶向例如HDAC2。使用与对基于适体的抑制是抗拒或部分抗拒的修饰替换基因和编码蛋白质结合的适体用于抑制，在本发明中可以使用抑制和替换。
用于设计介导RNAi的RNA的方法和用于将RNAs转染到细胞和动物内的方法是本领域众所周知的，并且是可容易商购获得的(Verma N.K.等人，J.Clin.Pharm.Ther.，28(5)：395-404(2004)、Mello C.C.等人Nature，431(7006)338-42(2004)、Dykxhoorn D.M.等人，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.4(6)：457-67(2003)Proligo(Hamburg，德国)、Dharmacon Research(Lafayette，CO，USA)、Pierce Chemical(part of Perbio Science，Rockford，IL，USA)、Glen Research(Sterling，VA，USA)、ChemGenes(Ashland，MA，USA)和Cruachem(Glasgow，UK))。RNAs优选使用合适保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成仪进行化学合成。最方便地，siRNAs得自本文列出的商业RNA寡核苷酸合成供应商。一般而言，RNAs并不难以合成且容易以适合于RNAi的数量提供。一般0.2μmol规模的RNA合成提供约1毫克RNA，这足够用于使用24孔组织培养平板形式的1000次转染实验。
组蛋白脱乙酰基酶cDNA特异性siRNA优选通过选择序列进行设计，所述序列不在起始密码子和终止密码子的50-100bp内，避开内含子区域，避开4个或更多个碱基例如AAAA、CCCC的段，避开GC含量＜30％或＞60％的区域，避开重复和低复杂序列，并且它避开单核苷酸多态性位点。组蛋白脱乙酰基酶siRNA可以通过搜索23-nt核苷酸基序AA(N19)进行设计。如果未发现合适序列，那么可以使用23-nt核苷酸基序NA(N21)，具有对于TT的有义siRNA3′末端的倒转。备选地，组蛋白脱乙酰基酶siRNA可以通过搜索NAR(N17)YNN进行设计。靶序列可以具有约50％的GC含量。siRNA靶向序列可以使用BLAST同源性搜索进行进一步评估，以避免对其他基因或序列的靶效应。阴性对照通过使靶向siRNA序列混乱进行设计。对照RNA优选具有与siRNA相同的长度和核苷酸组成，但具有与siRNA错配的至少4-5个碱基。本发明的RNA分子可以包括3′羟基基团。RNA分子可以是单链或双链的；此类分子可以是平头末端的或包括长度约1-约6个核苷酸(例如嘧啶核苷酸、嘌呤核苷酸)的突出末端(例如5′，3′)。为了进一步增强本发明的RNA的稳定性，3′突出端可以针对降解进行稳定。RNA可以通过包括嘌呤核苷酸例如腺苷或鸟苷核苷酸进行稳定。备选地，嘧啶核苷酸由修饰类似物的置换例如由2′-脱氧胸苷置换尿苷2核苷酸3′突出端是耐受的并且不影响RNAi效率。2′羟基的不存在显著增强突出端在组织培养基中的核酸酶抗性。
在本发明的方法中使用的RNA分子可以使用本领域技术人员已知的许多技术获得。例如，RNA可以使用本领域已知的方法进行化学合成或重组产生。此类方法在美国公开专利申请号US2002-0086356A1和US2003-0206884A1中描述，其通过引用在此整体合并。
任何RNA都可以在本发明的方法中使用，前提是它与HDAC2基因具有足够同源性以介导RNAi。用于在本发明中使用的RNA可以对应于完整HDAC2基因或其部分。对于可以使用的RNA长度没有上限。例如，RNA可以范围为基因的约21个碱基对(bp)到基因全长或更多。在特定实施方案中，本发明RNA的优选长度是21-23个核苷酸。
进一步地，组蛋白脱乙酰基酶DNA甲基化酶还可以通过结合肽例如抗体进行抑制。众多组蛋白脱乙酰基酶抗体可从来源例如Sigma、Vinci Biochem、Cell Signaling Technologies商购获得。此类抗体可以进行修饰，以产生抗体片段或人源化形式。备选地，治疗上有用的抗体可以使用本领域普通技术人员已知的技术产生，因为HDACs是可获得的。
本发明的治疗化合物可以直接施用于受试者或可以与递送装置或媒介物结合施用。用于将治疗化合物递送至表面的递送媒介物或递送装置已得到描述。本发明的治疗化合物可以单独(例如在盐水或缓冲液中)或使用本领域已知的任何递送媒介物进行施用。例如，下述递送媒介物已得到描述：Cochleates；Emulsomes，ISCOMs；脂质体；活细菌载体(例如，沙门菌属(Salmonella)、大肠埃希杆菌(Escherichiacoli)、卡介苗(Bacillus calmatte-guerin)、志贺氏菌属(Shigella)、乳杆菌属(Lactobacillus))；活病毒载体(例如痘苗、腺病毒、单纯疱疹)；微球体；核酸疫苗；聚合物；聚合物环；蛋白酶体；氟化钠；转基因植物；病毒体；病毒样颗粒。其他递送媒介物是本领域已知的，并且某些另外例子在下文提供。
术语本发明的治疗化合物的有效量指实现所需生物效应必需或足够的量。例如，如上文讨论的，本发明的治疗化合物的有效量是足以重建对记忆的存取的量。与本文提供的教导组合，通过在各种活性化合物中选择且权衡因素例如效力、相对生物利用度、患者体重、不利副作用的严重性和优选施用方式，可以计划有效预防或治疗性处理方案，其不引起显著毒性，并且对于治疗特定受试者仍是完全有效的。对于任何特定应用的有效量可以依赖于此类因素而变，如待治疗的疾病或病状、待施用的特定治疗化合物、受试者大小、或疾病或病状的严重性。本领域普通技术人员可以凭经验决定本发明的特定治疗化合物的有效量，而无需过度实验。本发明的组合物包括如本文描述的化合物、或其药学上可接受的盐或水合物。
本文描述的化合物用于递送的受试者剂量一般范围为约0.1μg到10mg/施用，这依赖于应用可以每天、每周或每月和其中的任何其他时间量给予。用于这些目的的剂量可以范围为约10μg到5mg/施用，并且最一般约100μg到1mg，在分开的间隔日或周中具有2-4次施用。然而，在某些实施方案中，用于这些目的的肠胃外剂量可以在高于上文描述的一般剂量5-10,000倍的范围中使用。
在一个实施方案中，组合物以约200-600mg的剂量每天施用一次。在另一个实施方案中，组合物以约200-400mg的剂量每天施用二次。在另一个实施方案中，组合物间歇地例如每周3、4或5天，以约200-400mg的剂量每天施用二次。在另一个实施方案中，组合物以约100-250mg的剂量每天施用三次。在一个实施方案中，日剂量是200mg，这可以每天施用一次、每天二次或每天三次。在一个实施方案中，日剂量是300mg，这可以每天施用一次或每天二次。在一个实施方案中，日剂量是400mg，这可以每天施用一次或每天二次。HDAC抑制剂可以以高达800mg的日总剂量每天施用一次、二次或三次，连续(即每天)或间歇地(例如每周3-5天)。
对于本文描述的任何化合物，治疗有效量可以最初由动物模型进行测定。治疗有效剂量也可以由关于已在人中测试(例如用于治疗癌症)的HDAC抑制剂和关于已知显示相似药理学活性的化合物的人数据进行测定。可能需要更高剂量用于肠胃外施用。应用剂量可以基于施用化合物的相对生物利用度和施用化合物的效力进行调整。基于上文描述的方法和如本领域众所周知的其他方法调整剂量以达到最大限度功效完全在普通技术人员的能力内。
本发明的预防和/或治疗方案的毒性和功效可以通过标准药学操作在细胞培养或实验动物中进行测定，例如用于测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效应之间的剂量比是治疗指数，并且它可以表示为LD50/ED50比。显示大治疗指数的预防和/或治疗试剂是优选的。虽然可以使用显示毒性副作用的预防和/或治疗试剂，但应小心设计将此类试剂靶向受累组织部位的递送系统，以便使对未感染细胞的潜在损伤降到最低，并且从而减少副作用。
得自细胞培养测定法和动物研究的数据可以用于配制用于在人中使用的预防和/或治疗试剂的剂量范围。此类数据的剂量优选位于循环浓度的范围内，所述循环浓度包括具有很少毒性或无毒性的ED50。剂量可以在这个范围内改变，依赖于采用的剂型和利用的施用途径。对于在本发明的方法中使用的任何试剂，治疗有效剂量可以最初由细胞培养测定法进行估计。剂量可以在动物模型中配制，以达到循环血浆浓度范围，其如在细胞培养中测定的包括IC50(即达到症状的半最大限度抑制的测试化合物浓度)。此类信息可以用于更准确地测定在人中的有用剂量。可以通过例如高效液相层析测量血浆中的水平。
在特定实施方案中，药物组合物可以包括例如至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物可以包括约2％-约75％单位重量，或例如约25％-约60％，或其中可衍生的任何范围。
还考虑了本发明的分子的多重剂量。在某些情况下，当本发明的分子与另一种治疗剂一起施用时，使用任一试剂的亚治疗剂量或两者的亚治疗剂量。如本文使用的，“亚治疗剂量”指这样的剂量，其如果在不存在其他试剂的情况下，那么小于在受试者中将产生治疗结果的剂量。因此，例如抗阿尔茨海默氏试剂的亚治疗剂量是在不存在本发明的化合物施用的情况下在受试者中不会产生所需治疗结果的那种。
本发明的制剂在药学上可接受的溶液中施用，这可以照常规包含药学上可接受浓度的盐、缓冲试剂、防腐剂、相容载体和任选地其他治疗成分。
对于在治疗中的使用，本发明的治疗化合物的有效量可以通过任何方式施用于受试者，所述任何方式将治疗试剂或化合物递送至所需表面，例如粘膜、全身性的。施用本发明的药物组合物可以通过技术人员已知的任何方法完成。优选施用途径包括但不限于经口、肠胃外、肌内、鼻内、舌下、气管内、吸入、眼睛、阴道、直肠和脑室内。
对于经口施用，本发明的治疗化合物可以通过使一种或多种活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体组合容易地配制。此类载体使得本发明的化合物能够配制为片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆、悬浮液等，用于通过待治疗受试者的经口摄入。用于经口使用的药物制剂可以作为固体赋形剂获得，任选地使所得到的混合物磨碎，并且需要时在加入合适助剂后，加工颗粒混合物，以获得片剂或糖锭剂核。合适的赋形剂特别是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时，可以加入崩解试剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。任选地经口制剂还可以在盐水或缓冲液即EDTA中配制用于中和内部酸条件，或可以无需任何载体而施用。
还特别考虑的是一种或多种上述组分的经口剂型。一种或多种组分可以这样进行化学修饰，使得衍生物的经口递送是有效的。一般地，考虑的化学修饰是至少一个部分与组分分子其自身的附着，其中所述部分允许(a)抑制蛋白酶解；和(b)从胃或肠摄取到血流内。还希望的是一种或多种组分的总稳定性中的增加，和在体内的循环时间中的增加。此类部分的例子包括：聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski和Davis，1981，″Soluble Polymer-Enzyme Adducts″In：Enzymes as Drugs，Hocenberg和Roberts，编辑，Wiley-Interscience，New York，NY，第367-383页；Newmark，等人，1982，J.Appl.Biochem.4：185-189。可以使用的其他聚合物是聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-三氧八环。如上所述，对于药物用途优选的是聚乙二醇部分。
释放位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或大肠。技术人员具有可用的制剂，其在胃中不溶解，然而在十二指肠或肠中的其他地方释放材料。优选地，释放将避免胃环境的有害作用，通过治疗试剂的保护或通过生物学活性材料超过胃环境例如在肠中的释放。
为了确保完全胃抗性，对于pH5.0至少不透性的包衣是重要的。用作肠包衣的更常见惰性成分的例子是乙酸纤维素偏苯三酸酯(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP50、HPMCP 55、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、苯二甲酸乙酸纤维素(CAP)、Eudragit L、Eudragit S和Shellac。这些包衣可以作为混合膜使用。
包衣或包衣混合物也可以在片剂上使用，所述片剂不预期用于针对胃保护。这可以包括糖包衣或使得片剂更易于吞咽的包衣。胶囊可以由用于递送干燥治疗剂即粉剂的硬壳(例如明胶)组成；对于液体形式，可以使用软明胶壳。扁囊剂的壳材料可以是稠淀粉或其他可食性纸。对于丸剂、锭剂、模制片或模印片，可以使用湿块化(moistmassing)技术。
治疗剂可以在制剂中包括作为以颗粒大小约1mm的颗粒剂或团块形式的精制多颗粒。用于胶囊施用的材料的配制也可以作为粉剂、轻微压缩塞或甚至作为片剂。治疗剂可以通过压缩进行制备。
着色剂和调味剂可以全部包括。例如，治疗试剂可以进行配制(例如通过脂质体或微球体封装)且随后包含在食用产物内，例如包含着色剂和调味剂的冷藏饮料。
可以用惰性材料稀释或增加治疗剂的体积。这些稀释剂可以包括碳水化合物，特别是甘露糖醇、a-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、经修饰右旋糖酐和淀粉。特定无机盐也可以用作填充剂，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。某些商购可得的稀释剂是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。
在治疗剂配制为固体剂型中可以包括崩解剂。用作崩解剂的材料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商业崩解剂Explotab。淀粉羟乙酸钠、Amberlite、羧甲基纤维素钠、超支链淀粉(ultramylopectin)、海藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和皂粘土可以全部使用。另一种形式的崩解剂是不溶性阳离子交换树脂。粉状树胶可以用作崩解剂和粘合剂，并且这些可以包括粉状树胶例如琼脂、刺梧桐树胶或黄蓍胶。海藻酸及其钠盐也用作崩解剂。
粘合剂可以用于使治疗试剂保持在一起，以形成硬片剂，并且包括来自天然产物的材料例如阿拉伯胶、黄蓍胶、淀粉和明胶。其他包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)可以在醇溶液中用于使治疗剂形成颗粒。
抗摩擦剂可以包括在治疗剂的配制中，以预防在配制过程期间的粘着。润滑剂可以用作治疗剂和模具壁之间的层，并且这些可以包括但不限于；硬脂酸包括其镁和钙盐；聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、蔬菜油和蜡。还可以使用合适的润滑剂，例如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、各种分子量的聚乙二醇、Carbowax 4000和6000。
可以加入在配制过程中可以改善药物的流动性质且在压缩过程中帮助重排的助流剂。助流剂可以包括淀粉、滑石、热解硅石和水化硅铝酸盐。
为了帮助治疗剂溶解到水环境内，可以加入表面活性剂作为湿润剂。表面活性剂可以包括阴离子去污剂例如十二烷基硫酸钠、二辛基硫代琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。可以使用阳离子去污剂，并且可以包括苯扎氯铵或苄索氯铵。可以包括在制剂中作为表面活性剂的潜在非离子去污剂的列表是聚桂醇400，聚氧乙烯40硬脂酸酯，聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60，单硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯40、60、65和80，蔗糖脂肪酸酯，甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可以单独或作为以不同比的混合物存在于治疗试剂的配制中。
可以经口使用的药物制剂包括由明胶制成的推入配合(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂例如甘油和山梨糖醇制成的软的、密封胶囊。推入配合胶囊可以包含与填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉、和/或润滑剂例如滑石或硬脂酸镁和任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以在合适液体中溶解或悬浮，所述合适液体例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。还可以使用配制用于经口施用的微球体。此类微球体已在本领域中得到充分定义。用于经口施用的所有制剂应以适合于此类施用的剂量。
对于经颊施用，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过吸入施用，用于根据本发明使用的化合物可以以来自增压包或喷雾器的气溶胶喷雾呈现的形式常规递送，使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体。在增压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀进行测定以递送测定量。可以配制用于在吸入器或吹入器中使用的例如明胶胶囊和药液筒，其包含化合物和合适粉基例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文还考虑的是本发明的治疗化合物的肺递送。治疗试剂在吸入时递送至哺乳动物的肺，并且穿过肺上皮内衬至血流。吸入分子的其他报道包括Adjei等人，1990，Pharmaceutical Research，7：565-569；Adjei等人，1990，International Journal of Pharmaceutics，63：135-144(乙酸亮丙瑞林)；Braquet等人，1989，Journal of CardiovascularPharmacology，13(suppl.5)：143-146(内皮素-1)；Hubbard等人，1989，Annals of Internal Medicine，第III卷，第206-212页(a1-抗胰蛋白酶)；Smith等人，1989，J.Clin.Invest.84：1145-1146(a-1-蛋白酶)；Oswein等人，1990，″Aerosolization of Proteins″，Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II，Keystone，Colorado，March，(重组人生长激素)；Debs等人，1988，J.Immunol.140：3482-3488(干扰素-g和肿瘤坏死因子α)和Platz等人，美国专利号5,284,656(粒细胞集落刺激因子)。用于药物的肺递送用于全身效应的方法和组合物在1995年9月19日颁给Wong等人的美国专利号5,451,569中描述。
考虑用于在本发明的实践中使用的是设计用于治疗产物的肺递送的广泛范围机械装置，包括但不限于喷雾器、定量吸入器和干粉吸入器，所有这些是本领域技术人员熟悉的。
适合于本发明实践的商购可得装置的某些特定例子是由Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Missouri制造的Ultravent喷雾器；由Marquest Medical Products，Englewood，Colorado制造的Acorn II喷雾器；由Glaxo Inc.，Research Triangle Park，North Carolina制造的Ventolin定量吸入器；和由Fisons Corp.，Bedford，Massachusetts制造的Spinhaler干粉吸入器。
所有此类装置要求使用适合于分配治疗试剂的制剂。一般地，每种制剂对于采用的装置类型是特异的，并且可以涉及合适推进剂材料的使用，加上在治疗中有用的通常稀释剂和/或载体。此外，考虑了脂质体、微胶囊或微球体、包含络合物或其他类型载体的使用。化学修饰的治疗试剂还可以以不同制剂进行制备，依赖于采用的化学修饰类型或装置类型。
适合于与喷射或超声波喷雾器一起使用的制剂，一般将包括以约0.1-25mg生物学活性化合物/mL溶液的浓度在水中溶解的治疗试剂。制剂还可以包括缓冲剂和简单糖(例如用于稳定作用和调节渗透压)。喷雾器制剂还可以包含表面活性剂，以减少或预防通过在形成气溶胶中的溶液雾化引起的表面诱导的化合物聚集。
用于与定量吸入器装置一起使用的制剂一般将包括精细分开的粉剂，其包含借助于表面活性剂在推进剂中悬浮的治疗试剂。推进剂可以是为了这个目的采用的任何常规材料，例如氟氯化碳、含氯氟烃、氢氟碳或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷或其组合。合适的表面活性剂包括三油酸脱水山梨醇酯和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性剂。
用于从干粉吸入器装置中分配的制剂将包括包含治疗试剂的精细分开的干燥粉剂，并且还可以包括膨胀剂，例如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露糖醇，其量促进粉剂从装置中的分配，例如50-90重量％的制剂。治疗试剂应最有利地以具有小于10mm(或微米)平均颗粒大小的颗粒形式进行制备，最优选0.5-5mm，用于最有效递送至远侧肺。
还考虑了本发明的药物组合物的鼻递送。鼻递送允许本发明的药物组合物在将治疗产物施用于鼻后直接经过血流，而无需产物在肺中的沉积。用于鼻递送的制剂包括具有右旋糖酐或环右旋糖酐的那些。
对于鼻施用，有用装置是定量喷雾器与之附着的小型硬瓶。在一个实施方案中，定量通过将本发明溶液的药物组合物提取到限定体积的室内进行递送，所述室具有合适大小的小孔以使气溶胶制剂雾化，通过当室中的液体被压缩时形成喷雾。室被压缩以施用本发明的药物组合物。在一个特定实施方案中，室是活塞安排。此类装置是商购可得的。
备选地，使用通过当挤压时形成喷雾的塑料挤瓶，其具有合适大小的小孔或开口以使气溶胶制剂雾化。开口通常在瓶顶部中发现，并且顶部一般逐渐变细，以部分配合鼻道用于有效施用气溶胶制剂。优选地，鼻吸入器将提供定量的气溶胶制剂，用于施用定量药物。
希望将其全身性递送的化合物可以配制用于通过注射肠胃外施用，例如通过弹丸注射或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型例如在安瓿或多剂量容器中呈现，伴随加入的防腐剂。组合物可以采取此类形式如在油或水媒介物中的悬浮液、溶液或乳状液，并且可以包含配制试剂例如悬浮、稳定和/或分散剂。
用于肠胃外施用的药物制剂包括以水溶性形式的活性化合物水溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备为合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油，或合成脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水注射悬浮液可以包含增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。任选地，悬浮液还可以包含合适稳定剂或增加化合物溶解性的试剂，以允许制备高度浓缩溶液。
备选地，活性化合物可以以粉剂形式用于在使用前用合适媒介物例如灭菌无热原水构建。
化合物还可以在直肠或阴道组合物例如栓剂或保留灌肠剂中配制，例如包含常规栓剂基质例如可可脂或其他甘油酯。
除先前描述的制剂外，化合物还可以配制为储库制剂(depotpreparation)。此类长效制剂可以用合适聚合或疏水材料(例如作为在可接受的油中的乳状液)或离子交换树脂，或作为略溶衍生物例如作为略溶盐进行配制。
药物组合物还可以包括合适固体或凝胶态载体或赋形剂。此类载体或赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。
合适的液体或固体药物制剂形式是例如用于吸入的水或盐水溶液，微胶囊化、encochleated、包被在微型金颗粒上的，包含在脂质体中的，喷雾状的，气溶胶、用于植入皮肤内的团块，或在待抓到皮肤内的锋利物体上干燥的。药物组合物还包括具有活性化合物的延长释放的颗粒剂、粉剂、片剂、包衣片、(微)胶囊、栓剂、糖浆剂、乳状剂、悬浮液、乳膏剂、滴剂或制剂，在其制备中赋形剂和添加剂和/或助剂例如崩解剂、粘合剂、包被剂、溶胀剂、润滑剂、调味剂、甜味剂或增溶剂如上所述照常规使用。药物组合物适合于在各种药物递送系统中使用。对于用于药物递送的方法的简短概述，参见通过引用合并入本文的Langer，Science249：1527-1533，1990。
本发明的治疗化合物和任选地其他治疗剂可以本身(净)或以药学上可接受的盐的形式施用。当在医学中使用时，盐应是药学上可接受的，但非药学上可接受的盐可以方便地用于制备其药学上可接受的盐。此类盐包括但不限于由下述酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。此外，此类盐可以制备为碱金属或碱土金属盐，例如羧酸基团的钠、钾或钙盐。
合适的缓冲试剂包括：乙酸和盐(1-2％w/v)；柠檬酸和盐(1-3％w/v)；硼酸和盐(0.5-2.5％w/v)；以及磷酸和盐(0.8-2％w/v)。合适的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03％w/v)；三氯叔丁醇(0.3-0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25％w/v)和硫柳汞(0.004-0.02％w/v)。
本发明的药物组合物包含任选包括在药学上可接受的载体中的有效量的本发明的治疗化合物。术语药学上可接受的载体意指一种或多种相容性固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质，其适合于施用于人或其他脊椎动物。术语载体指示活性成分与之组合的天然或合成的有机或无机成分，以促进应用。药物组合物的组分还能够与本发明的化合物并且彼此混合，以使得不存在将基本上损害所需药物效率的相互作用的方式。
治疗试剂可以使用能够将治疗试剂递送跨越血脑屏障的制剂递送至脑。将治疗剂递送至脑的一个障碍是脑的生理学和结构。血脑屏障由衬有单层内皮细胞的专门毛细血管构成。细胞之间的区域由紧密连接密封，因此从血液对脑的唯一接近是通过内皮细胞。屏障仅允许特定物质例如亲脂分子通过，且使其他有害化合物和病原体在外。因此，亲脂载体对于将非亲脂化合物递送至脑是有用的。例如，已发现DHA，一种在人脑中天然存在的脂肪酸，对于将与之共价附着的药物递送至脑是有用的(例如美国专利6407137中所述的那些)。美国专利5,525,727描述了用于药物种类特异性和持续递送至脑的二氢吡啶吡啶盐载体氧化还原系统。美国专利5,618,803描述了具有膦酸酯衍生物的靶向药物递送。美国专利7119074描述了与PEG寡聚物/聚合物缀合的治疗化合物的两亲药物前体，用于递送化合物跨越血脑屏障。本文描述的化合物可以通过与亲脂载体共价附着或与亲脂载体共配制进行修饰。其他是本领域技术人员已知的。
本发明的治疗试剂可以与其他治疗剂一起递送，用于增强记忆寻回或治疗与记忆丧失相关的病症的其他症状或原因。例如，环境富集(EE)已用于增强记忆。EE涉及在受试者周围创造刺激环境。其他治疗剂也可以组合，以治疗潜在病症或增强记忆回想。
本发明的化合物与其他药物以单位剂量或试剂盒形式组合的例子包括与下述的组合：抗阿尔茨海默氏试剂，β-分泌酶抑制剂，γ-分泌酶抑制剂，HMG-CoA还原酶抑制剂，NSAID包括布洛芬，N-甲基-D-天冬氨酸盐(NMDA)受体拮抗剂例如美金刚，胆碱酯酶抑制剂例如加兰他敏、利斯的明、多奈哌齐和他克林，维生素E，CB-1受体拮抗剂或CB-1受体反激动剂，抗生素例如多西环素和利福平，抗淀粉样蛋白抗体，或影响增加本发明化合物的功效、安全、方便，或减少不希望有的副作用或毒性的受体或酶的其他药物。本发明的化合物还可以在多重HDAC抑制剂的混合物(cocktail)中递送。前述组合列表仅是举例说明性的，并且不预期以任何方式是限制性的。
本发明还包括物品，这指任何一种组分或组分集合。在某些实施方案中，物品是试剂盒。物品包括在一个或多个容器中的本发明的药学或诊断级别化合物。物品可以包括促进或描述本发明化合物的用途的说明书或标签。
如本文使用的，“促进的”包括与认知病症例如阿尔茨海默氏病治疗结合的与本发明的组合物有关的经营商业的所有方法，包括教育、医院和其他临床指导的方法，医药工业活动包括药物销售，和任何广告或其他促进活动包括任何形式的书面、口头和电子通信。
“说明书”可以限定促进组分，并且一般涉及在本发明组合物的包装上或与之结合的书面说明书。说明书还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明书。
因此，在某些实施方案中，本文描述的试剂可以装配成药物或诊断或研究试剂盒，以促进其在治疗、诊断或研究应用中的用途。试剂盒可以包括容纳本发明的组分和使用说明书的一个或多个容器。特别地，此类试剂盒可以包括本文描述的一种或多种试剂，连同描述这些试剂的预期治疗应用和合适施用的说明书。在特定实施方案中，试剂盒中的试剂可以以适合于特定应用和试剂的施用方法的药物制剂和剂量。
试剂盒可以设计为促进本文描述的方法由医生的使用，并且可以采取许多形式。试剂盒的每种组合物在可应用时，可以以液体形式(例如在溶液中)、或以固体形式(例如干燥粉剂)提供。在特定情况下，一些组合物可以是可构建的或可以其他方式加工的(例如至活性形式)，例如通过加入合适溶剂或其他种类(例如，水或细胞培养基)，这可以与试剂盒一起或不一起提供。如本文使用的，“说明书”可以限定指导和/或促进的组分，并且一般涉及在本发明的包装上或与之结合的书面说明书。说明书还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明书，从而使得用户将明确认识到说明书与试剂盒结合，例如视听(例如录像带、DVD等)、因特网和/或基于网络的通信等。书面说明书可以以由管理药物或生物产品制造、使用或销售的政府机构规定的形式，所述说明书还可以反映由用于人施用的制造、使用或销售机构的批准。
试剂盒可以包含在一个或多个容器中的本文描述的任何一种或多种组分。作为例子，在一个实施方案中，试剂盒可以包括用于使试剂盒的一种或多种组分混合和/或分离且混合样品且应用于受试者的说明书。试剂盒可以包括容纳本文描述的试剂的容器。试剂可以无菌制备，在注射器中包装且冷藏运送。备选地，它可以容纳在小瓶或其他容器中用于贮存。第二个容器可以具有无菌制备的其他试剂。备选地，试剂盒可以包括在注射器、小瓶、管或其他容器中预混合且运送的活性剂。
试剂盒可以具有各种形式，例如起泡小袋、收缩包装小袋、可真空密封的小袋、可密封的热成型托盘、或相似小袋或托盘形式，伴随在小袋、一个或多个管、容器、盒或袋中松散包装的配件。试剂盒可以在加入配件后灭菌，从而允许容器中的个别配件以其他方式打开。试剂盒可以使用任何合适的灭菌技术进行灭菌，例如辐射灭菌、加热灭菌或本领域已知的其他灭菌方法。试剂盒还可以包括其他组分，依赖于特定应用，例如容器、细胞介质、盐、缓冲剂、试剂、注射器、针、用于应用或去除消毒试剂的织品例如纱布、一次性手套、在施用前用于试剂的载体等。
试剂盒的组合物可以作为任何合适形式提供，例如作为液体溶液或作为干燥粉剂。当提供的组合物是干燥粉剂时，粉剂可以通过添加合适溶剂进行重构，所述合适溶剂也可以提供。在其中寻求组合物的液体形式的实施方案中，液体形式可以是浓缩或即用型的。溶剂将依赖于化合物和使用或施用方式。用于药物组合物的合适溶剂是众所周知的并且可在文献中获得的。溶剂将依赖于化合物和使用或施用方式。
在一组实施方案中，试剂盒可以包括区室化的载体工具，以在紧密限制中接受一种或多种容器工具例如小瓶、管等，容器各自意欲包括待在方法中使用的分开元件之一。例如，容器之一可以包括用于测定法的阳性对照。另外，试剂盒可以包括用于其他组分例如在测定法中有用的缓冲剂的容器。
本发明还包含最终包装且加上标签的药物产品。这种制造物品包括在密封封闭的合适器皿或容器例如玻璃小瓶或其他容器中的合适单位剂型。在适合于肠胃外施用的剂型的情况下，活性成分是无菌且适合于作为无颗粒溶液施用。换言之，本发明包含各自无菌的肠胃外溶液和冻干粉剂，并且后面一种适合于在注射前重构。备选地，单位剂型可以是适合于经口、经皮、局部或粘膜递送的固体。
在一个优选实施方案中，单位剂型适合于静脉内、肌内或皮下递送。因此，本发明包含用于每种递送途径的优选无菌的溶液。
在另一个优选实施方案中，本发明的组合物贮存于容器中，所述容器具有生物相容性去污剂，包括但不限于卵磷脂、牛磺胆酸和胆固醇；或具有其他蛋白质，包括但不限于丙种球蛋白和血清白蛋白。更优选地，本发明的组合物与用于人用途的人血清白蛋白一起贮存，并且与用于兽医学用途的牛血清白蛋白一起贮存。
与任何药物产品一样，包装材料和容器设计为保护产品在贮存和运送过程中的稳定性。进一步地，本发明的产品包括使用说明书或其他信息材料，其告知医生、技术员或患者关于如何适当地预防或治疗所讨论的疾病或病症。换言之，制造物品包括指示或暗示给药方案的说明书工具，所述给药方案包括但不限于实际剂量、监控程序和其他监控信息。
更具体而言，本发明提供了制造物品，其包括包装材料例如盒、瓶、管、小瓶、容器、喷雾器、吹入器、静脉内(i.v.)袋、封套等；和在所述包装材料内包含的药物试剂的至少一种单位剂型。本发明还提供了制造物品，其包括包装材料例如盒、瓶、管、小瓶、容器、喷雾器、吹入器、静脉内(i.v.)袋、封套等；和在所述包装材料内包含的每种药物试剂的至少一种单位剂型。本发明进一步提供了制造物品，其包括包装材料例如盒、瓶、管、小瓶、容器、喷雾器、吹入器、静脉内(i.v.)袋、封套等；和在所述包装材料内包含的每种药物试剂的至少一种单位剂型。本发明进一步提供了制造物品，其包括优选以无菌形式包装、用于注射制剂的针或注射器，和/或包装乙醇垫。
在一个特定实施方案中，制造物品包括包装材料和药物制剂和在所述包装材料内包含的说明书，其中所述药物制剂是HDAC2抑制剂和药学上可接受的载体，并且所述说明书指出用于预防、治疗或管理具有认知病症例如阿尔茨海默氏病的受试者的给药方案。
治疗监控：通过用于监控记忆的常规方法测定所选择的治疗参数的合适性，例如剂量、时间表、佐剂选择等。此外，患者的临床病状可以就所需效应进行监控，例如认知功能中的增加。如果达到不足够的效应，那么患者可以用进一步治疗加强，并且治疗参数可以进行修饰，例如通过增加本发明的组合物和/或其他活性剂的量，或改变施用途径。
本发明通过下述实施例进一步举例说明，所述实施例决不应解释为进一步限制的。具有重叠发明人身份(inventorship)的美国专利申请11/998,834以及美国临时专利申请61/119,698的实施例、数据和图通过引用在此合并。
实施例
方法
环境富集：最多4只小鼠在笼中连续饲养，所述笼包含2个轮子用于自动运转和各种玩具(得自Petco)以创造隧道和攀登装置。食物和水是无限制地。食物藏在垫层内。每天更换玩具和转轮。
套管插入术和注射：将微导管插入侧面脑室内。使丁酸钠(Sigma；St.Louis，MO)溶解于人工脑脊液(aCSF)中。使TSA(Sigma)母液溶解于DMSO中，并且在注射前用aCSF稀释。
HDAC过表达动物的生成将小鼠HDAC1或HDAC2编码序列置于Tau基因的外显子1内，与内源起始密码子在框内，从而制备包含Tau的前31个氨基酸的融合蛋白。HDAC2KO在R.A.D.实验室中产生，并且进行改造以包含loxP重组位点，从而使得Cre介导的重组缺失外显子5和6，这编码HDAC蛋白质的关键催化核心。
化学递送使丁酸钠(sigma)溶解于盐水中。使HDAC抑制剂以50mg/ml溶解于DMSO中，并且在注射(100ul-150ul，i.p.)前立即用盐水稀释。
免疫印迹和染色用于免疫印迹的裂解产物如本文所述进行制备(还参见Fischer，A.等人Recovery of learning and memory isassociated with chromatin remodeling.Nature 447(7141)，178-182(2007).)。简言之，为了分离组蛋白，使脑组织在TX-缓冲液(50mMTris HCl、150mM NACl、2mM EDTA、1％Triton-100)中匀浆化，并且在以2,000r.p.m.(400g)离心10分钟前在4℃下温育15分钟。在TX-缓冲液中的洗涤步骤后，使团块溶解于包含0.2M HCl的TX-缓冲液中，并且在以10,000r.p.m.(9,300g)第二次离心10分钟前在冰上温育30分钟。上清液用于免疫印迹。通过使用NIH成像软件和UN-SCAN-it凝胶数字化软件(Silk Scientific)测量条带强度来定量免疫印迹数据。免疫染色如本文所述执行(还参见Fischer，A.等人Recovery of learning and memory is associated with chromatinremodeling.Nature 447(7141)，178-182(2007).)，使用LSMeta10软件和共焦显微镜(Zeiss)。
用于HDAC1过表达(OE)小鼠的基因靶向构建体。从脑cDNA文库中扩增～1200nt长的小鼠HDAC1cDNA，并且通过测序加以证实。随后用SpeI平端连接将cDNA克隆到pC8N2的多腺苷酸化(pA)信号上游，随后将HDAC1-pA克隆到pBSK(Stratagene)内。将pGKneoLoxP序列定向插入pBSK中HDAC1-pA下游的XhoI-Kpn1位点内。用XmaI-Acc65释放HDAC1-pA-neo，并且在框内克隆到Tau基因的外显子1内。从pTauKR中获得Tau靶向臂，并且通过在独特的NcoI位点中插入XmaI和BsiWI接头进行修饰。通过测序证实包含HDAC1编码序列与Tau外显子1的框内融合物的所得到的靶向载体(pTH1)。3-6月龄的小鼠用于行为测试和进一步分析。
用于HDAC2过表达(OE)小鼠的基因靶向构建体。使用RT PCR从小鼠脑组织中获得小鼠HDAC2 cDNA。对其测序且亚克隆到Topo-TA载体(Invitrogen)的XhoI-EcoR1位点内。用SmaI-SalI切开pTH1靶向载体(上文描述)，以释放HDAC1。用EcoRI-XhoI从Topo-TA中切掉HDAC2cDNA，并且克隆到pTH1的SmaI-SalI位点内，以制备pTH2靶向载体。通过pTH2的测序验证HDAC2与Tau外显子1的框内融合物。
用SacI使靶向载体pTH1和pTH2线性化，并且电穿孔到V6.5(129XC57BL/6)F1胚胎干(ES)细胞系内。我们挑选96个新霉素抗性克隆，其中46个通过southern印迹进行分析。我们仅使用在用BamHI(左)和EcoRI(右)消化后的3′外部探针。野生型克隆展示8.8-kb条带。正确靶向事件导致对于靶向等位基因至13kb的带移。5个克隆是正确靶向的。通过注射到(DBA/2XC57BL/6)F1胚泡内，2个克隆用于生成嵌合体。使嵌合体与C57BL/6雌性交配，并且就种系传递分析后代。使杂合敲入品系维持在混合背景中，并且交配以获得纯合动物。3-6月龄小鼠用于行为测试和进一步分析。
Hdac2KO小鼠的生成通过用loxP重组位点侧接外显子5和外显子6生成Hdac2 floxed等位基因，保证在Cre重组介导的缺失后蛋白质的HDAC催化核心的缺失。在ES细胞的成功靶向和嵌合小鼠的后续衍生后，我们建立了携带Hdac2(Hdac2L)(FVB)的floxed等位基因的小鼠品系。用表达Cre重组酶的逆转录病毒转染小鼠胚胎成纤维细胞导致仅在携带2个Hdac2等位基因的MEFs中Hdac2的完全取消。这指出floxed Hdac2等位基因是功能的，并且在Cre重组表达后导致Hdac2无效基因型。使用EIIa-Cre或巢蛋白-Cre转基因小鼠缺失种系中的Hdac2导致有活力和能育的Hdac2+/-小鼠，而无明显组织学异常直到1岁。使Hdac2+/-小鼠杂交产生有活力的Hdac2缺陷小鼠，但这些小鼠以比由正常孟德尔比预期的低2倍的频率出生(79只同窝出生仔畜中的9只Hdac2-/-小鼠，与预期的79只中的20只比较；尽管Hdac2-/-小鼠是有活力的且能够产生其生育率妥协的后代(数据未显示)。与野生型和杂合同窝出生仔畜比较，Hdac2-/-小鼠(雄性和雌性)小约25％(数据未显示)。用于行为测试的动物在FVBxC57/BL6背景中，并且彼此交配以获得纯合动物。3-6月龄小鼠用于行为测试和进一步分析。在雄性和雌性之间在行为测试中不存在差异。
恐惧条件化测试情境依赖性恐惧条件化。训练由小鼠3分钟暴露于条件化盒(情境)随后为足底电击(2秒，0.5/0.8/1.0mA，恒定电流)组成。24小时后通过使小鼠再暴露到条件化情境内3分钟执行记忆测试。在3分钟过程中(总共18个取样间隔)通过2个受过训练的观察者(1个不知道实验条件)每10秒记录僵立，其定义为与下蹲姿势相关的除心跳和呼吸外的活动缺乏。指出作为来自2个观察者的方法获得的僵立的观察数目表示为观察总数目百分比。
对于短时间记忆测试，记忆测试在足部电击训练后3小时执行。
音调依赖性恐惧条件化。训练由小鼠3分钟暴露于条件化盒(情境)，随后为音调[30秒，20kHz，75dB声压级(SPL)]和足部电击(2秒，0.8mA，恒定电流)组成。24小时后通过使小鼠3分钟暴露于新情境，随后为另外3分钟暴露于音调(10kHz，75dB SPL)，执行记忆测试。如上所述通过2个无偏见观察者每10秒记录僵立。
莫里斯水迷宫测试水迷宫范例在充满不透明水的圆形槽(直径1.8m)中执行。使平台(11×11cm)浸没在水表面下在靶象限中心。通过摄像机记录小鼠的游泳路径，并且通过Videomot 2软件(TSE)分析。对于每个训练期间，将小鼠置于迷宫内连续地来自槽的4个随机点。允许小鼠搜索平台60秒。如果小鼠在60秒内未发现平台，那么将它们轻轻导向其。允许小鼠在平台上逗留15秒。每天给予2次训练试验；记录关于每个试验的潜伏期用于分析。在记忆测试(探测测试)过程中，从槽中取出平台，并且允许小鼠在迷宫中游泳60秒。
在升高T形迷宫上的空间工作记忆使小鼠维持在以85％的其自由进食重量的限饲时间表上。首先在升高的塑料T形迷宫上评估空间工作记忆。这由起始臂(47×10cm)和2个等同目标臂(35×10cm)组成，由10cm高的壁围绕。塑料食物孔定位距离每个目标臂末端3cm。迷宫定位在孔照亮的实验室中的地板上1m，所述实验室包含各种突出的远侧迷宫外暗示。在与场所不匹配空间的测试前经过数天，使小鼠习惯于迷宫，并且饮用甜炼乳。
每个试验由样品运行和选择运行组成。在样品运行时，根据伪随机顺序(具有相等数目的左和右转/期间，并且在相同方向中具有不超过2次连续转动)，通过塑料块的存在迫使小鼠向左或右。在臂末端处在食物孔中可获得由0.07ml甜炼乳(用水50/50稀释)组成的奖赏。随后去除块，并且将小鼠面向实验者放置在起始臂末端处，且允许任一臂的自由选择。样品运行和选择运行之间的时间间隔是约15秒。由于选择先前未访问的臂(即用于交替)奖赏动物。小鼠以约10分钟的试验间隔(ITI)每次运行一次试验。每天时期由4次试验组成，并且小鼠接受总共24次试验。
化学制品施用辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)如先前在WO93/07148 PTC/US92/08454中所述合成。丁酸钠购自Sigma(目录B5887)。使SAHA和WT-161溶解于DMSO中作为母液，并且仅在注射前在盐水中稀释。丁酸钠在盐水中进行制备。小鼠每天接受用SAHA或盐水的腹膜内注射共10天或21天。
高尔基浸渍用vibratome将高尔基-Cox染色的脑切成200μm厚的横切片，并且使用Zeiss 200Axiovert显微镜和Openlab软件进行分析。对基因型不知情地计数在海马CA1锥体神经元上的顶端和基底棘数目。对于每个实验组，分析最低限度10个细胞/切片(动物数目n＝3)。包括在区域-1.4mm到-1.6mm内(相对于前卤位置)的CA1海马神经元用于分析。
病毒介导的棘标记。表达HSV(0.5μl，来自Rachael Neve的礼物)的番茄以0.05μl/分钟速率立体注射到区域CA1或齿状回的两侧内。在注射后48小时处死小鼠。用4％PFA固定脑并且用vibratome切片(50μm，Leica)。用共焦显微镜扫描海马切片。重构获得的图像栈且使用图像J分析。
免疫组织化学免疫组织化学分析如先前所述执行(Guan、J.S.，等人，Cell，2005.122(4)：第619-31.页)。抗体以1∶1000浓度使用。抗HDAC1和抗HDAC2抗体购自Abcam。抗Ac-赖氨酸、抗Ac-H4K5、抗-Ac-H4K12、抗Ac-H3K16、抗CREB、抗AKT和抗CaMKIIα抗体购自Cell Signaling。抗Ac-α-微管蛋白(K40)、抗肌动蛋白和抗突触囊泡蛋白(SVP-38)抗体购自Sigma。抗NR2A和抗NR2B购自BD Biosciences。抗β-连环蛋白、抗EGR1、抗c-FOS、抗Brn1、抗TLE4、抗CDP、抗ER81和抗GAPDH抗体购自Santa Cruz。抗NeuN抗体购自Chemicon。扫描共焦图像(1μm)且实施三维重构。LSMeta10软件(Zeiss)用于计算平均突触囊泡蛋白强度。首先扫描具有最强强度的脑切片。使用相同设置扫描在分析中包括的所有其他图像。使用LSMeta10软件(Zeiss)定量染色。
蛋白质提取和免疫印迹。收集海马和前脑且在RIPA缓冲液中裂解。使裂解产物在冰上温育15分钟，并且以15,000×g在4℃下离心15分钟。收集作为细胞溶质蛋白质提取物的上清液。对裂解产物实施10％SDS-PAGE，随后为免疫印迹。
组蛋白蛋白质的提取。收集海马样品，并且在400μl TX-缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.5，5mM丁酸钠)中匀浆化。使团块重悬浮于0.2M HCl/TX缓冲液，并且在冰上温育30分钟。使样品以14000rpm向下旋转，对包含组蛋白的上清液实施蛋白质分析。
电生理学分析。通过颈椎脱臼杀死3-6月龄HDAC2OE、HDAC2KO或其同窝出生仔畜，并且通过在冰冷的氧合人工CSF(ACSF)中快速解剖海马。将400μm厚的横向海马切片置于室中，并且用氧合ACSF连续灌注。置于放线层中的双极刺激电极(直径0.002英寸的镍铬线；A-M Systems)用于引发在CA3轴突中的动作电位。将具有0.5-3MΩ电阻的ACSF填充的玻璃微电极置于CA1的放线层区域中，并且用于记录场兴奋性突触后电位(fEPSP)。使用HEKA EPC10获得数据，并且通过patchmaster(HEKA)分析。来自刺激器的峰fEPSP振幅要求是至少2mV，并且刺激强度设为产生40％的最大限度应答。记录基线应答20分钟。通过以低频率(2次/分钟)刺激Schaffer侧支，在CA1突触处引起fEPSP，以建立稳定基线。在用高频率刺激(HFS，100Hz，1秒)的LTP诱导后立即，来自HDAC2OE和对照小鼠的切片显示fEPSP斜率和振幅中的增加，暗示短期增强(STP)在所有组中发生。对于HDAC2KO及其对照WT切片，通过以100Hz应用一串刺激1秒诱导LTP。对于HDAC2OE及其对照WT切片，通过以100Hz应用二串刺激1秒诱导LTP，具有20秒的间隔。
用于培养神经元的基于成像的EGR-1表达测定法使用标准程序分离EGR1-GFP BAC转基因小鼠(Genesat Project)的胚胎cortici(E17)，并且用胰蛋白酶/DNA酶消化研磨。24小时后皮质神经元以10,000细胞/孔的密度在黑色/澄清底部平板中铺平板，所述平板用在神经基础(neurobasal)培养基(1.6％B27、2％glutamax、1％pen/strep和5％热灭活胎牛血清)和不含血清的神经基础培养基中的聚-D-赖氨酸(Costar)包被。在这些培养条件下，神经胶质百分比估计在5-25范围中。在第6天时，HDAC抑制剂或DMSO对照(一式三份或一式四份)加入培养物中约30小时。在第7天时，将BDNF、KCl或福司克林加入培养物中8小时。
使细胞固定在PBS中的4％PFA/4％蔗糖中。用PBS洗掉固定剂(3个洗涤循环)，并且加工用于EGR1-GFPimaging。使细胞(3,000-5,000/孔)成像，并且使用Cellomics ArrayScan Image系统用5X物镜分析。使内置TargetActivation算法最佳化，以测量平均EGR1-GFP表达/细胞(平均荧光强度/细胞/孔)，使用Hoechst染料以标记细胞。使数据针对对照(培养基添加)标准化。
在成像后，使细胞加工用于抗体染色：用0.25％TritonX100(10-15分钟)使细胞渗透化。通过3个PBS洗涤循环洗掉Triton，细胞在包含10％山羊或马血清的PBS中封闭(1小时，37℃)。使细胞暴露于抗乙酰-赖氨酸-组蛋白H3或H4抗体。随后用PBS洗涤5次，随后为与Alexa594和Hoechst(1小时，RT)缀合的二抗。用PBS将二抗洗涤5次，并且在Cellomics ArrayScan Image系统上分析。
染色质免疫沉淀(ChIP)使用由4％PFA溶液固定且在使用前贮存于-80℃的小鼠前脑执行ChIP。通过加入十分之一体积的新鲜11％甲醛溶液在室温下15分钟，使脑化学交联，匀浆化，重悬浮，在裂解缓冲液中裂解，并且超声处理以溶解且剪切交联DNA。超声处理条件依赖于细胞、培养条件、交联和装备而改变。我们使用MisonixSonicator 3000，并且在4℃下以功率7超声处理10×30秒脉冲(在脉冲之间的90秒脉冲)，而样品浸没在冰浴中。所得到的全细胞提取物与100μl Dynal Protein G磁珠在4℃下温育过夜，所述磁珠已与10μg合适抗体预温育。用RIPA缓冲液将珠洗涤5次，并且用包含50mMNaCl的TE洗涤1次。通过在65℃下加热伴随偶然涡旋从珠中洗脱结合复合物，并且通过在65℃下过夜温育逆转交联。还处理全细胞提取的DNA(由超声处理步骤保留的)用于交联逆转。随后通过用RNA酶A、蛋白酶K和多次苯酚：氯仿：异戊醇提取处理，纯化免疫沉淀的DNA和全细胞提取的DNA。使纯化的DNA样品标准化且实施PCR分析。用于下拉(pull downs)的抗体是：来自Abcam的抗HDAC1(#31263)、抗HDAC2(#12169)；来自Upstate的抗AcH4(#06-866)、抗AcH3(#06-599)。在IP后，对回收的染色质片段实施半定量PCR或实时PCR共32-40个循环，使用对于与小鼠基因启动子区(起始密码子上游的区域，接近第一个外显子)对应的150-250bp区段特异性的引物对。
实时PCR：使用CFX96实时PCR Detection系统(BioRad)，用基于SYBR-Green的试剂(Invitrogen，表达SYBR GreenER)执行实时PCR。使用比较CT方法计算免疫沉淀的DNA片段的相对数量。使结果与通过输入DNA的连续稀释生成的标准曲线比较。数据衍生自3次独立扩增。误差条代表标准差。
用于PCR的引物序列：
BDNF PI：5′-TGATCATCACTCACGACCACG-3′(SEQ IDNO：3)5′-CAGCCTCTCTGAGCCAGTTACG-3′(SEQ ID NO：4)
BDNF PII：5′-TGAGGATAGTGGTGGAGTTG-3’(SEQ IDNO：5)5′-TAACCTTTTCCTCCTCC-3’(SEQ ID NO：6)
BDNF  PIV：5′-GCGCGGAATTCTGATTCTGGTAAT-3′(SEQ ID NO：7)5′GAGAGGGCTCCACGCTGCCTTGACG-3′(SEQID NO：8)
CREB：5′-CTACACCAGCTTCCCCGGT-3′(SEQ ID NO：9)5′-ACGGAAACAGCCGAGCTC-3(SEQ ID NO：10)
PKMζ(PKMzeta mRNA起始位点上游100bp[15]，这包含cAMP应答元件(CRE)共有序列)：5’-TGTTGAGTCTGGGCCCTC-3’(SEQ ID NO：11)5’-CCTGGCCTCCGGACC-3’(SEQ ID NO：12)
Creb结合蛋白(CBP)：5’-CGGGCAGGGGATGAG-3′(SEQID NO：13)5’-GCGAGCCAGCGAGGA-3′(SEQ ID NO：14)
Neurexin I：5’-CAGGGCCTTTGTCCTGAATA-3’(SEQ ID NO：15)5’-GCTTTGAATGGGGTTTTGAG-3’(SEQ ID NO：16)
Neurexin III：5’-ACTGAGAGCTAGCCACCCAGAC-3’(SEQ IDNO：17)5’-TTGCCCATTTGTGAATTTGA-3’(SEQ ID NO：18)
PGK1：5’-ACATTTTGGCAACACCGRGAG-3’(SEQ ID NO：19)5’-GAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTG-3’(SEQ ID NO：20)
ATF4：5’-GTGATAACCTGGCAGCTTCG-3’(SEQ ID NO：21)5’-GGGGTAACTGTGGCGTTAGA-3’(SEQ ID NO：22)
CaMKIIA：5’-GACCTGGATGCTGACGAAG-3’(SEQ ID NO：23)5’-AGGTGATGGTAGCCATCCTG-3’(SEQ ID NO：24)
p21(WAP/CIP1)：5’-CCACAGTTGGTCAGGGACAG-3’(SEQID NO：25)5’-CCCTCCCCTCTGGGAATCTA-3’(SEQ ID NO：26)
EGR-1：5’-GTGCCCACCACTCTTGGAT-3’(SEQ ID NO：27)5’-CGAATCGGCCTCTATTTCAA-3’(SEQ ID NO：28)
聚集蛋白：5’-TTGTAACCAACAGGGGTTGC-3’(SEQ ID NO：29)5’-AGTTGTGGCTAGGGGAGCAC-3’(SEQ ID NO：30)
EGR-2：5’-GGCTGCAAATCGTTCCTG-3’(SEQ ID NO：31)5’-TCGGAGTATTTATGGGCAGGT-3’(SEQ ID NO：32)
GLUTAMATE RECEPTOR 1PRECURSOR(GLUR-1/AMPA1)5’-GGAGGAGAGCAGAGGGAGAG-3’(SEQ ID NO：33)5’-TTCCTGCAATTCCTTGCTTG-3’(SEQ ID NO：34)
GLUR-25’-GCGGTGCTAAAATCGAATGC-3’(SEQ ID NO：35)5’-ACAGAGAGGGGCAGGCAGT-3’(SEQ ID NO：36)
PSD95：5’-CCCCTACCCCTCCTGAGAAT-3’(SEQ ID NO：37)5’-GAGGGGAAGGAGAAGGTTGG-3’(SEQ ID NO：38)
HOMER1：5’-CTGCCTGAGTGTCGTGGAAG-3’(SEQ IDNO：39)3’-ATGATTTCACTCGCGCTGAC3’(SEQ ID NO：40)
P35：5’-GAGGGAGGGCGCTGAGG-3’(SEQ ID NO：41)5’-GCAGCTAGGGAGCTTCTGTCC-3’(SEQ ID NO：42)
CDK5：5’-CGCAGCCTGTTGGACTTTGT-3’(SEQ ID NO：43)3’-GCGTTGCAGAGGAGGTGGTA-3’(SEQ ID NO：44)
SHANK3：5’-TTTTCCAGGTCCCAGTGGTG-3’(SEQ ID NO：45)5’-CCTGCCCACAGTGTCACTCC-3’(SEQ ID NO：46)
SVP：5’-CTAGCCTCCCGAATGGAATG-3’(SEQ ID NO：47)5’-CAGCAGCAGCATCAGCAATG-3’(SE Q ID NO：48)
SYNAPSIN25’-GGCTTTCCTTCCCTCCACAC3’(SEQ IDNO：49)5’TGTTAGCGAGGGAGCAGTGG3’(SEQ ID NO：50)
BETA-ACTIN：5’-CCCATCGCCAAAACTCTTCA3’(SEQ IDNO：51)5’GGCCACTCGAGCCATAAAAG3’(SEQ ID NO：52)
GAPDH：5’-CTCCCAGGAAGACCCTGCTT-3’(SEQ ID NO：53)5’-GGAACAGGGAGGAGCAGAGA-3’(SEQ ID NO：54)
ARC：5’-CAGCATAAATAGCCGCTGGT-3’(SEQ ID NO：55)5’-GAGTGTGGCAGGCTCGTC-3’(SEQ ID NO：56)
FOS：5’-GAAAGCCTGGGGCGTAGAGT-3’(SEQ ID NO：57)5’-CCTCAGCTGGCGCCTTTAT-3’(SEQ ID NO：58)
CPG15：5’-GCGAGATTTCGTTGAGATCG-3’(SEQ ID NO：59)5’-GGGATGACACGGATTGATTTT-3’(SEQ ID NO：60)
SNK：5’-TTTCCCACGTCCAAAGTCAG-3’(SEQ ID NO：61)5’-GCAGCGAAGCTTTAAATACGC-3’(SEQ ID NO：62)
NR2A：5’-TCGGCTTGGACTGATACGTG-3’(SEQ ID NO：63)5’-AGGATAGACTGCCCCTGCAC-3’(SEQ ID NO：64)
NR2B：5’-CCTTAGGAAGGGGACGCTTT-3’(SEQ ID NO：65)5’-GGCAATTAAGGGTTGGGTTC-3’(SEQ ID NO：66)
微管蛋白：5’-TAGAACCTTCCTGCGGTCGT-3’(SEQ ID NO：67)5’-TTTTCTTCTGGGCTGGTCTC-3’(SEQ ID NO：66)
统计分析：通过不配对斯氏t检验和单因素ANOVA(ANalyis OfVAriance)分析数据。采用单因素ANOVA随后为事后Scheffe氏检验，以比较来自几个组的平均值。误差条呈现S.E.M。
结果
实施例1：在情境恐惧条件化训练和记忆测试前，通过以25mg/kg腹膜内(i.p.)注射10天每天施用SAHA。值得注意的是，SAHA而不是盐水处理显著增加HDAC2OE小鼠的僵立行为(66.7±5.1％，n＝12；26.9±5.9，n＝12，p＜0.0001，SAHA组与盐水组比较，图1A)。应当指出，在相同训练范例中，SAHA处理使WT对照小鼠的僵立行为从44.8±4.7％(n＝15，盐水对照)增加到63.9±4.2％(n＝12，SAHA处理)。因此，在SAHA处理后HDAC2OE小鼠的僵立水平与用SAHA处理的对照小鼠的那些可比较，尽管盐水处理的HDAC2OE小鼠显示更低的僵立行为的事实。一致地，SAHA处理完全取消在HDAC2OE小鼠中减少的树突棘和突触表型(图1B，C)。
接下来，我们研究了SAHA对HDAC2KO小鼠的作用。因为与无处理的WT同窝出生仔畜比较，HDAC2KO小鼠显示显著增加的僵立行为，所以我们通过使足底电击强度从1.0mA降低到0.5mA，使测定法致敏，以阻止记忆测试中可能的天花板效应。使用这个范例，我们发现与WT对照小鼠中的盐水处理(n＝10)比较，SAHA处理(n＝10)诱导明显更高的僵立行为(p＝0.0383)(45.0±6.9％与25.0±5.8％比较，图1D)。然而，与盐水处理比较，SAHA处理不改变HDAC2KO小鼠的僵立行为(52.1±9.8％与49.3±8.4％比较，p＝0.8324，n＝8用于每个组)(图1D)。此外，在HDAC2KO小鼠中的放线层中的CA1神经元和突触囊泡蛋白染色的树突棘强度不受SAHA处理显著影响(图1E，F)。一致地，尽管SAHA处理适当地增加WT海马中的LTP，但它对HDAC2KO海马中的LTP不具有可检测作用(图6)。因此，HDAC2KO小鼠对由SAHA诱导的突触发生和突触可塑性和记忆形成的促进是抗拒性的。这些结果强烈暗示HDAC2是主要的，如果不是SAHA在引发记忆增强中的唯一靶的话。
最初报道SAHA为泛-HDACi，尽管使用重组HDACs和体外脱乙酰基酶测定法用合适的类别特异性底物的近期研究已揭示SAHA是更有效的I类HDACs和HDAC6抑制剂，对于IIa类HDACs例如HDAC4、5和7具有极弱抑制或无抑制。尽管SB在体外不抑制HDAC6活性，但为了直接解决这个IIb类HDAC的潜在重要性，我们测试使用HDACi WT-161选择性抑制HDAC6对记忆形成是否具有任何作用(图2A，B)。α-微管蛋白(K40)脱乙酰基是HDAC6的已知非组蛋白底物，其充当这些实验中的特异性对照。尽管WT-161增加海马锥体神经元中的α-微管蛋白(K40)水平(图2C)，但在记忆形成中不存在相关增加(图2D)。这个结果和观察到的SB和WT-161的细胞选择性暗示通过SAHA的HDAC6抑制可能不涉及HDACi诱导的记忆增强。与这些一致，基于SAHA的亲和探针的广泛蛋白质组研究将HDAC1和HDAC2鉴定为主要细胞靶。因此，I类HDACs特别是HDAC1和HDAC2，可能是用于HDACi诱导的记忆增强的潜在靶。
为了直接评估HDAC1和HDAC2在脑中的生理学作用，我们生成了其中HDAC1或HDAC2在神经元中过表达的2种小鼠品系。将小鼠HDAC1或HDAC2编码序列置于Tau基因的外显子1内，与内源起始密码子在框内，从而制备包含Tau的前31个氨基酸的融合蛋白。先前，关于Tau的纯合动物突变体显示在记忆测试中在表型上与野生型同窝出生仔畜无法区分。在脑的海马和其他区域中观察到与WT小鼠比较，在纯合动物的脑中HDAC1或HDAC2蛋白质表达中的2-3倍增加(图3)。一致地，总体乙酰化赖氨酸水平在纯合HDAC1(HDAC1OE)和HDAC2过表达小鼠(HDAC2OE)中是减少的，特别是在海马结构的锥体神经元中。我们发现乙酰化H4K12、H4K5而不是H3K14在HDAC2OE小鼠的脑中是降低的(数据未显示)。相比之下，乙酰化的α-微管蛋白(K40)水平在HDAC1OE或HDAC2OE小鼠中不改变。因此，与野生型(WT)同窝出生仔畜的那种比较，HDAC1/2过表达动物显示在脑中增加的组蛋白脱乙酰基。重要的是，在HDAC1/2过表达小鼠中在肉眼脑解剖学或神经元定位中不存在可区分差异，暗示增加的HDAC1/2对于脑发育或神经元存活不是明显有害的。
执行来自脑裂解产物的Western印迹，并且显示分别在HDAC1或HDAC2纯合过表达小鼠中的HDAC1和HDAC2上调(数据未显示)。观察到在HDAC1OE和HDAC2OE小鼠的海马中降低的组蛋白乙酰化。来自海马组蛋白制剂的样品也显示在HDAC1OE小鼠和HDAC2OE小鼠中赖氨酸乙酰化(以～16KDa)的减少。
有趣的是，在短期记忆测试中，在训练后3小时的情境和音调依赖性恐惧学习中，在HDAC1OE、HDAC2OE和WT对照中无法检测出显著差异(图4B)。这些观察暗示在神经系统中HDAC2而不是HDAC1功能的获得导致联想性学习中的损害。在可见平台测试中在组中逃避潜伏期和游泳速度并无不同(图4A和B)，指出在各种品系中可比较的运动和视觉功能。这些结果揭示HDAC2OE小鼠的空间学习的显著减少。此外，HDAC2OE小鼠而不是HDAC1OE小鼠显示在T形迷宫与场所不匹配的任务中的空间工作记忆损害(图4H)。因此，HDAC2而不是HDAC1功能的获得损伤海马依赖性记忆形成。
HDAC 2基因敲除增强联想性学习。为了进一步研究HDAC2在联想性学习中的作用，通过使携带floxed Hdac2等位基因的小鼠与巢蛋白-Cre转基因小鼠杂交，生成HDAC2缺陷小鼠(HDAC2KO)。Hdac2的种系缺失导致有活力和能育的Hdac2+/-小鼠，而无明显组织学异常直到1岁(图5)。使Hdac2+/-小鼠杂交产生有活力的Hdac2缺陷小鼠，其中HDAC2表达在脑中被取消。
检查在情境依赖性记忆测试过程中HDAC2敲除(KO)小鼠和对照小鼠(HDAC2KO n＝10；对照，n＝10)的僵立行为。HDAC2KO小鼠显示增强的恐惧条件化。
HDAC2的丧失不导致脑中的解剖学或细胞定位中的可检测改变。H4K5、H4K12和H2B乙酰化在HDAC2KO小鼠的海马中显著增加。然而，在组蛋白制剂中赖氨酸残基的总体乙酰化轻微降低，如使用乙酰化赖氨酸抗体的Western印迹分析揭示的。这可能是HDAC1在HDAC2KO小鼠中的补偿增加的后果(图5D)。值得注意的是，HDAC2KO小鼠(n＝9)显示明显增加的僵立行为，如通过当与WT同窝出生仔畜(n＝11)比较时，在训练后24小时的情境和音调依赖性恐惧条件化范例(p＝0.0036，p＝0.0047，图12A)评估的。在短期记忆测试中，在情境依赖性条件化中，与WT同窝出生仔畜(n＝8)比较，HDAC2KO小鼠(n＝9)显示增加的僵立行为(p＝0.010图4E)。在这2个小鼠组之间未检测出运动活性或痛觉中的差异。因此，HDAC2功能的丧失增强联想性学习。此外，HDAC2KO小鼠显示在T形迷宫与场所不匹配的任务中的显著空间工作记忆改善(p＝0.025，两因素ANOVA，图4G)。这些数据加上功能获得研究，暗示HDAC2可能负面调节小鼠中的记忆形成。
实施例2：体外测定法用于测试HDAC过表达对p25诱导毒性的保护作用。从E15.5皮质和海马中分离神经元。以DIV4用编码p25-GFP和Flag-HDACs的质粒转染它们。转染后24小时，使神经元固定且处理用于IHC。HDAC1、5、6、7和10显示保护(图7)。
总之，使用小鼠遗传模型，我们描绘了HDAC同种型的功能，包括I类HDACs例如HDAC1和HDAC2，并且显示HDAC2在调节记忆功能中起负面作用。值得注意的是，我们将HDAC2鉴定为促进学习和记忆中HDACi的主要靶。我们的观察支持HDAC1和HDAC2差别调节牵涉可塑性和记忆的一种或多种活性调节基因亚组的意见。这是出乎意料的，考虑到据报道HDAC1和HDAC2形成功能异二聚体的事实(Grozinger，C.M.&Schreiber，S.L. ChemBiol9(1)，3-16(2002))。可能这是由于如本文描述的HDAC1和HDAC2在脑中的差别分布。备选地，神经元HDAC1和HDAC2可能与转录辅阻遏物形成不同复合物，并且因此在染色质的不同区域中富集。另外，HDAC2可以差别地靶向另外的非组蛋白蛋白质，这可能涉及记忆形成。其他可能性例如转录后修饰中的差异也可能促成HDAC1和HDAC2之间的生物化学/功能解离。应当指出HDAC1缺陷在小鼠中是有害的，导致胚胎致死率。我们已发现在神经元中HDAC1功能的丧失引起DNA损伤和细胞死亡。相反，HDAC2缺陷小鼠是有活力的，并且显示增强的记忆形成。这些结果不仅揭示HDAC同种型的重要不同功能，并且因此其靶基因或非组蛋白底物，它们还支持HDAC2是用于记忆增强的合适靶的发现。
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实施例3：体外酶促抑制测定法数据
多重HDAC抑制剂的酶促抑制活性针对已知HDAC同种型中的几种进行测定，并且显示于图8中。包括SAHA作为参考混合I类-II类抑制剂。BRD-6929证实这类化合物不抑制HDAC8或II类HDAC酶。所有BRD编号的化合物都衍生自邻酰苯胺类化合物。并非来自这个类别的化合物都预期结合II类HDACs。
实施例4：在非神经元细胞系中的体外细胞数据
标准Western印迹方法用于测量HDAC抑制剂对HeLa细胞裂解产物中的组蛋白乙酰化标记的作用。使系列化合物与完整HEK293细胞以10uM温育6小时时间段。Western印迹显示超过DMSO对照增加的乙酰化水平，使用抗乙酰H4K12抗体和辣根过氧化物酶缀合的二抗连同基于鲁米诺的底物(图9)。这证实这些类似物的细胞HDAC活性和特异性标记H4K12中的乙酰化中的增加。原始蛋白质数据的定量(图10)确定相对于DMSO对照，多重选择性概况在增H4K12乙酰化水平中是有效的，并且HDAC 1，2和HDAC 1，2，3选择性抑制剂在全细胞中对特异性组蛋白基因座(H4K12)具有强HDAC活性。
BRD-9853显示在这种细胞系中的最低限度活性。BRD-4097是阴性对照。这是具有最低限度HDAC抑制剂活性的苯甲酰胺。
标准Western印迹方法也用于测量HDAC抑制剂在HeLa细胞裂解产物中对组蛋白乙酰化标记的作用。在HeLa细胞中Western印迹的定量和化合物处理对H4K12乙酰化水平的作用显示于图11中。相对于DMSO对照，观察到各种程度的乙酰化。发现HDAC1，2和HDAC1，2，3选择性化合物在增加H4K12基因座上的乙酰化方面是有效的。
实施例5BRD-6929细胞HDAC活性的功能测量。
图12证实从已用HDAC抑制剂处理的小鼠脑中分离的原代纹状体细胞的Western印迹。呈现了具有3个独立样品/组的2组数据。还显示了代表蛋白质的定量的直方图。相对于DMSO对照，BRD-6929对组蛋白基因座H4K12的乙酰化水平具有显著作用。BRD-6929处理导致在1和10uM时的5-10倍增加。BRD-6929是HDAC1，2选择性化合物，并且与HDAC3比较，对于HDAC1，2具有200x选择性。这证实HDAC1，2选择性化合物可以有效增加与HDAC2抑制和记忆相关的乙酰化标记H4K12。在这种情况下，使数据与对照比较：SAHA和BRD-3696(CI-994)。HDAC1，2选择性化合物在增加乙酰化方面与HDAC1，2，3抑制剂和泛抑制剂(即SAHA)一样有效。抑制HDAC1，2足以实现在这个组蛋白基因座上增加的乙酰化。
图13显示代表检查在原代纹状体细胞中的另外乙酰化标记的蛋白质凝胶分析的定量。测试了4种化合物，包括CI-994(BRD-3696)和SAHA。相对于DMSO对照，BRD-6929和BRD-5298具有显著增加的四乙酰化H4。2种化合物还显示朝向增加的四乙酰化H2B的趋势。BRD-6929和BRD-5298处理导致在1和10uM时2种标记中的2-5倍增加。这个数据证实HDAC1，2特异性化合物(BRD-6929，5298)在增加与HDAC2抑制以及学习和记忆相关的特异性乙酰化中是有效的。
实施例6：在神经元细胞系中用BRD-6929的体外数据(免疫荧光分析)。
材料与方法：
第1天：
1)使用不接触底部的方案，使用185nl针工具将化合物从384孔板(Abgene)中针转移。
第2天：在～24小时化合物处理后-
1)使用平板洗涤器(Tecan)方案抽吸培养基，这留下～5ul残留体积且不接触平板的底部)；或备选地，用12通道抽吸器棒(wand)轻轻抽吸孔，以取出培养基。
2)多通道移液管或使用液体处理系统(例如Combi，标准管道；慢速)用于加入75ul甲醛(在PBS中的4％)，并且使孔在室温下温育10分钟。
3)抽吸甲醛，并且用100ul PBS将细胞冲洗3次；
4)抽吸PBS，并且加入100ul封闭/渗透化缓冲液(在PBS中的0.1％Triton-X100、2％BSA)，并且使孔在室温下温育1小时。
5)抽吸封闭缓冲液，并且加入在封闭缓冲液中1∶500稀释的50ul一抗，并且使平板在4℃下温育过夜。
第3天：
1)抽吸一抗，并且用100ul封闭缓冲液将细胞冲洗3次
2)加入用Hoeschst(来自10mg/mL(16mM)原液的1∶1000)1∶500稀释的50ul二抗，并且使孔在箔中覆盖在室温下温育1.5小时，以预防光漂白。
3)用100ul PBS将孔冲洗3次，并且加入100ul PBS，并且使平板密封
4)随后在Acumen/IX Micro上阅读平板
5)使平板贮存于4℃下。
结果：
在脑区域特异性原代培养物(皮质和纹状体)中6小时温育后，以1和10uM的BRD-6929不引起总体细胞数目中的增加或减少。在脑区域特异性原代培养物(纹状体)中6小时温育后，以10uM的BRD-6929引起H4K12乙酰化中的增加(图14)。在原代神经元细胞培养物中6小时温育后，以1和10uM的BRD-6929和BRD-5298(HDAC1，2选择性抑制剂)引起H2B乙酰化中的显著增加(图15，16)。这证实HDAC 1，2选择性化合物在增加特异性组蛋白基因座H2B上的乙酰化中是有效的。这个组蛋白基因座增加的乙酰化与HDAC2的抑制或调节以及学习和记忆有关。就我们所知，不存在具有这种HDAC抑制选择性的化合物在这个特异性细胞类型中引起这些特异性标记的报道。
实施例7：BRD-6929在血浆和脑中的浓度-时间曲线
图17代表在经由腹膜内注射全身性施用的45mg/kg BRD-6929单次剂量后的药代动力学数据概括。显示了在C-57小鼠的血浆和脑中从5分钟到24小时关于BRD-6929的浓度时间曲线。这个数据证实BRD-6929跨过血脑屏障，并且达到在全脑中以其HDAC1和2IC50过量的浓度。脑Cmax(0.83uM)和AUC(3.9uM)水平完全超过对于酶促抑制所需的有效体外浓度。
实施例8：在小鼠中的急性给药后在与学习和记忆有关的脑特异性区域中的乙酰化标记中的增加。
在成年雄性C57BL/6J小鼠的脑特异性区域中关于用BRD-6929急性处理的实验方案和对组蛋白乙酰化的相应作用显示于图18中。关于特异性脑切片的Western印迹分析的粗蛋白质裂解方案。
1.对于分离，冷冻脑组织：
a.在冰上，解冻冷冻组织，并且立即在250uL冰冷的悬浮缓冲液中小心匀浆化。
(100uL用于约2-3mm3的组织；根据需要调节)
1.5mL一次性研棒(Fisher目录#03-392-100)
b.尽快加入等体积的2x SDS凝胶上样缓冲液，上下吸液以混合。
2.将样品置于95℃下5分钟。
3.通过平滑地经过23-25号皮下针头(2-3x)或通过短暂超声处理(Al使用针方法，并且它工作良好)剪切粘稠染色体DNA。避免发沫/起泡。
4.使样品以10,000g在室温下离心10分钟，将上清液转移至新鲜管。
5.根据需要基于蛋白质浓度使样品等分。
悬浮缓冲液：
0.1M NaCl、0.01M TrisCl(pH 7.6)、0.001M EDTA(pH 8.0)(可以提前制备至这个点的缓冲液，室温贮存)仅在使用前，加入：1x磷酸盐/蛋白酶抑制剂混合物(例如ThermoFisher“HALT，”目录#78440)
5mM丁酸钠(HDAC抑制剂)。
2x SDS凝胶加样缓冲液：
100mM TrisCl(pH 6.8)、4％SDS、20％甘油(可以提前制备至这个点的缓冲液，室温贮存)仅在使用前，加入：200mM二硫苏糖醇(来自1M原液)5mM丁酸钠(HDAC抑制剂)。
结果：BRD-6929引起在小鼠皮质中四乙酰化的H2B水平中的显著增加(图19)。这证实在全身性给予的单次剂量后BRD-6929是皮质中HDACs的功能抑制剂。BRD-6929引起关于H2BK5的乙酰化水平中的1.5-2倍增加(图20)。这个乙酰化标记已与增加的学习和记忆相关。这些实验证实BRD-6929，HDAC1，2选择性抑制剂已进入脑，和位于与学习和记忆相关的特异性脑区域中的细胞核。此外，BRD-6929引起特异性乙酰化标记中的增加，这已与学习和记忆效应相关。就我们所知，仍未证实具有这种高水平的HDAC1，2选择性抑制的化合物在增加脑中的乙酰化水平中是有效的。
实施例9：在BRD-6929的长期施用后在全脑中的乙酰化标记中的增加。
Western凝胶分析证实即使在BRD-6929的长期施用后，每天共10天，BRD-6929仍可以对小鼠脑中的乙酰化水平发挥作用。Western印迹显示相对于媒介物对照在四乙酰化H2B中的增加(图21)。这证实HDAC1，2选择性化合物可以有效增加在长期注射后在脑中的特异性乙酰化标记(四乙酰化H2B)的乙酰化水平。
实施例10：在小鼠中的行为数据：对应于改善的记忆和认知的表型
C57/BL6WT小鼠用媒介物或BRD-6929注射10天。在第11天时，小鼠在情境恐惧条件化范例中进行训练(训练由小鼠3分钟暴露于条件化盒(情境，TSE)随后为足底电击(2秒，0.8mA，恒定电流)组成)。在训练后1小时，小鼠用媒介物或BRD-6929进行注射。在第12天时，使小鼠回到训练盒且监控且记录僵立行为。
结果：每天给予的45mg/kg剂量的BRD-6929共10天改善了在情境恐惧条件化范例中的小鼠记忆，如通过％时间僵立测量的(图22)。就我们所知，对于HDAC1，2选择性化合物或对于这类化合物在任何条件下先前未报道这种效应。完全出乎意料这种HDAC1，2选择性抑制剂将是有效的。
Figure BDA0000072501070000791
实施例11：
(E)-3-(4-((2-乙酰胺基乙基氨基)甲基)苯基)-N-(2-氨 基-5-(噻吩2-基)苯基)丙烯酰胺(BRD-9460)的合成
Figure BDA0000072501070000801
使乙酸乙酯(3.0g，34.1mmol，1.0当量)和乙二胺(6.14g，102mmol，3.0当量)的混合物在室温下搅拌4天。随后使反应混合物在真空中浓缩。通过快速层析(硅胶，1％铵/49％CH2Cl2/50％MeOH)纯化产物，以提供作为黄色油的所需产物(2.0g，57％得率)。
Figure BDA0000072501070000802
使4-溴苯甲醛(9.25g，50.0mmol，1.0当量)、丙烯酸叔丁酯(8.01g，62.5mmom，1.25当量)、三乙胺(10.12g，100mmol，2.0当量)、三乙酰氧基钯(0.14g，0.5mmol，0.01当量)和三邻-甲苯基膦(0.609g，2.0mmol，0.04当量)的混合物在100℃下在氮大气下加热2小时。随后用水稀释反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取。用1M HCl水溶液将水层调整至pH～3。用乙酸乙酯萃取产物。使组合的有机层过滤，在硫酸钠上干燥，并且在真空中浓缩，以获得作为黄色固体的所需产物(10.3g，89％得率)。
Figure BDA0000072501070000803
使溶于三氟乙酸(100mL)中的肉桂酸叔丁酯(10.3g，44.3mmol)混合物在室温下搅拌过夜。随后通过在减压下蒸发去除溶剂。使所获得的黄色残渣溶解于碳酸钠的饱和水溶液中。使悬浮液过滤，并且用3M HCl水溶液处理滤液，以获得白色沉淀物。随后过滤掉沉淀物并且干燥，以获得作为白色固体的所需产物(5.3g，67％得率)。
Figure BDA0000072501070000804
在0℃下向溶于DMF(800mL)中的4-溴-2-硝基苯胺(50g，230.4mmol，1当量)的搅拌溶液中加入溶于DMF(200mL)中的60％NaH(6.1g，253.4mmol，1.1当量)和(Boc)2O(60.3g，276mmol，1.2当量)。使反应混合物在室温下搅拌5小时。随后将反应倾入冰冷的水中，并且搅拌1小时。使所获得的固体过滤且在减压下干燥。通过柱层析(硅胶，1％EtOAc/己烷)纯化粗材料，以获得所需产物(41.0g，56％得率)。
Figure BDA0000072501070000811
向溶于DME(7mL)中的化合物4-溴-2-硝基苯基氨基甲酸叔丁酯(1g，3.15mmol，1当量)的搅拌溶液中加入噻吩-2-基硼酸(0.48g，3.78mmol，1.2当量)、Na2CO3(1.0g，9.46mmol，3.0当量)、四(三苯基膦)钯(0)(0.36g，0.31mmol，0.1当量)和水(3mL)。使反应混合物在90℃下加热18小时。用EtOAc和水稀释反应。使有机层分离，在硫酸钠上干燥，过滤且浓缩。通过柱层析(硅胶，10％EtOAc/己烷)纯化粗材料，以提供所需产物(0.51g，50％得率)。
向溶于甲醇(200mL)中的2-硝基-4-(噻吩-2-基)苯基氨基甲酸叔丁酯(12.0g，37.5mmol，1当量)溶液中加入单水合肼(80mL)和氯化铁(III)(0.37g，2.24mmol，0.06当量)。使反应80℃搅拌1小时。随后在硅藻土上热过滤反应，并且在减压下浓缩。用水(500mL)稀释所获得的残渣且充分搅拌。使所获得的固体过滤，用水随后为己烷洗涤，并且干燥(10.5g，97％得率)。
用HATU(2.2g，9.13mmol，1.0当量)和DIPEA(1.8g，25.3mmol，4.46当量)处理溶于THF中的(E)-3-(4-甲酰基苯基)丙烯酸(1.0g，5.68mmol，1.0当量)、2-氨基-4-(噻吩-2-基)苯基氨基甲酸叔丁酯(1.48g，5.11mmol，0.9当量)混合物。使所得到的混合物在室温下搅拌20小时。通过蒸发去除溶剂。用乙酸乙酯稀释残渣，并且用水随后为卤水进行洗涤。使有机层分离，在Na2SO4上干燥，并且在减压下浓缩。通过柱层析(硅胶，50％石油醚/50％CH2Cl2)纯化产物，以提供作为黄色固体的粗产物(2.2g，86％得率)。
向溶于二氯乙烷中的(E)-2-(3-(4-甲酰基苯基)丙烯酰胺)4-(噻吩-2-基)苯基氨基甲酸叔丁酯(0.15g，0.33mmol，1.0当量)和N-(2-氨乙基)乙酰胺(0.07g，0.67mmol，2.0当量)混合物中加入NaBH(OAc)3(0.43g，2.01mmol，6.0当量)。使反应在室温下搅拌20小时。使反应浓缩，并且加入乙酸乙酯(30mL)。用碳酸氢钠的饱和水溶液(10mL)随后为卤水(10mL)洗涤有机溶液，在真空中浓缩有机层，并且通过制备型TLC(5％MeOH/CH2Cl2)纯化残渣，以提供作为白色固体的所需产物(0.04g，22％得率)。
Figure BDA0000072501070000822
用三氟乙酸(1mL)处理溶于二氯乙烷(4mL)中的(E)-2-(3-(4-((2-乙酰胺基乙基氨基)甲基)苯基)丙烯酰氨基)-4-(噻吩-2-基)苯基氨基甲酸叔丁酯(0.04g，0.08mmol)混合物，并且在室温下搅拌1小时。用碳酸氢钠的饱和水溶液猝灭反应混合物，并且用乙酸乙酯萃取。使有机层分离，在硫酸钠上干燥，过滤且浓缩。用DCM/己烷洗涤所获得的黄色固体，并且在减压下干燥(0.02g，55.4％得率)。ESI+MS：m/z(rel强度)435(100，M+H)，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)：δ9.45(s，1H)，7.87-7.78(m，1H)，7.70(s，1H)，7.63-7.52(m，3H)，7.45-7.32(m，3H)，7.28-7.20(m，2H)，7.08-7.02(m，1H)，6.89(d，J＝15.5Hz，1H)，6.79(d，J＝8Hz，1H)，5.22(s，2H)，3.74(s，2H)，3.14(d，J＝6Hz，2H)，2.60-2.42(m，2H)，1.79(s，3H)。
Figure BDA0000072501070000831
N1-(2-氨基-5-(吡啶-3-基)苯基)-N4-(2-(4-甲基哌嗪-1-基) 乙基)对苯二酰胺(BRD-6551)的合成
Figure BDA0000072501070000832
使溶于吡啶(5mL)中的2-氨基-4-(吡啶-3-基)苯基氨基甲酸叔丁酯(0.50g，1.74mmol，1当量)[这以与2-氨基-4-(噻吩-2-基)苯基氨基甲酸叔丁酯相似的方式制备]、4-(甲氧羰基)苯甲酸(0.47g，2.62mmol，1.5当量)和BOP(1.4g，3.16mmol，1.8当量)混合物在室温下搅拌20小时。通过蒸发去除溶剂。随后用碳酸氢钠的饱和水溶液稀释残渣。使所获得的固体过滤。通过柱层析纯化粗产物(硅胶，2％MeOH/CH2Cl2)，以获得所需产物(0.68g，87％得率)。
用溶于水(10mL)中的氢氧化锂溶液(0.18g，7.60mmol，5.0当量)处理溶于THF(10mL)中的4-(2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(吡啶-3-基)苯基氨基甲酰)苯甲酸甲酯(0.68g，1.52mmol，1当量)溶液。使反应在室温下搅拌2小时。使反应浓缩，随后用水稀释，并且用柠檬酸调整至pH～3。使所获得的固体过滤，并且在接下来的反应中直接使用(0.61g，93％粗得率)。
Figure BDA0000072501070000841
用HATU(0.35g，0.92mmol，2.0当量)和DIPEA(0.20mL，1.15mmol，2.5当量)处理溶于DMF(4mL)中的4-(2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(吡啶-3-基)苯基氨基甲酰)苯甲酸甲酯(0.20g，0.46mmol，1.0当量)、2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙胺(0.13g，0.92mmol，2.0当量)混合物。使反应在室温下搅拌20小时。加入水。使所获得的固体过滤且干燥。通过柱层析(硅胶，30％EtOAc/己烷)纯化粗产物，以提供所需产物(0.19g，77％得率)。
Figure BDA0000072501070000842
在0℃下将溶于1，4-二噁烷(2mL)中的4M HCl溶液加入溶于甲醇(2mL)中的2-(4-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基氨基甲酰)苯甲酰氨基)-4-(吡啶-3-基)苯基氨基甲酸叔丁酯(0.10g，0.18mmol，1当量)的搅拌溶液中。随后使反应加温至室温，并且搅拌2小时。通过蒸发去除溶剂，并且加入碳酸氢钠的饱和水溶液。使所获得的固体在真空下过滤且干燥，以获得所需化合物(0.05g，60％得率)。ESI+MS：m/z(rel强度)459(96.6，M+H)，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)：δ9.84(s，1H)，8.79(d，J＝1.5Hz，1H)，8.53(t，J＝5.5Hz，1H)，8.44(dd，J＝4.0，1.5Hz，1H)，8.08(d，J＝8.5Hz，2H)，7.95(d，J＝8.5Hz，3H)，7.58(s，1H)，7.42-7.38(m，2H)，6.90(d，J＝8.5Hz，1H)，5.23(bs，1H)，3.42-3.36(m，2H)，2.55-2.20(m，10H)，2.15(s，3H)。
技术人员将认识到下文描述的其他化合物可以以与上文描述的程序相似的方式进行制备。
N1-(2-氨基-5-(噻吩-2-基)苯基)-N4-(2-(4-甲基哌嗪-1-基) 乙基)对苯二酰胺(BRD-5298)可以通过用噻吩-2-基硼酸代替吡啶-3-基硼酸进行制备。ESI+MS：m/z(rel强度)464(98.27，M+H)。
下述4种化合物可以通过用2-苯乙胺代替2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙胺且利用合适的硼酸进行制备。
Figure BDA0000072501070000852
N1-(2-氨基苯基)-N4-苯乙基对苯二酰胺(BRD-1783)，ESI+MS：m/z(rel强度)359(100，M)。
Figure BDA0000072501070000853
N1-(2-氨基-5-(噻吩-2-基)苯基)-N4-苯乙基对苯二酰胺 (BRD-8451)，ESI+MS：m/z(rel强度)442(99.34，M+H)。
Figure BDA0000072501070000854
N1-(2-氨基-5-(吡啶-3-基)苯基)-N4-苯乙基对苯二酰胺 (BRD-0984)，ESI+MS：m/z(rel强度)437(95.85，M+H)。
Figure BDA0000072501070000861
N1-(2-氨基-5-(噻吩-2-基)苯基)-N4-(2-(吡啶-4-基)乙基) 对苯二酰胺(BRD-6597)可以通过用2-(吡啶-4-基)乙胺代替2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙胺进行制备。ESI+MS：m/z(rel强度)443(97.68，M+H)。
(E)-N-(2-氨基-5-(噻吩-2-基)苯基)-4-(3-氧代-3-(2-(吡 啶-2-基)乙氨基)丙-1-烯基)苯甲酰胺(BRD-9853)的合成
使溶于THF(10mL)中的(E)-3-(4-(甲氧羰基)苯基)丙烯酸(0.25g，1.21mmol，1.0当量)、2-(吡啶-2-基)乙胺(0.30g，2.42，2.0当量)、HATU(0.46g，1.91，1.57当量)、DIPEA(0.31g，4.36mmol，3.6当量)混合物在室温下搅拌20小时。使反应浓缩且加入乙酸乙酯(30mL)。用水(20mL)洗涤有机层，在硫酸镁上干燥，过滤且浓缩。通过柱层析(硅胶，10％MeOH/CH2Cl2)纯化产物，以提供所需化合物(0.20g，52％得率)。ESI+MS：m/z(rel强度)311(98.7，M+H)。
Figure BDA0000072501070000864
向溶于THF(3mL)中的(E)-甲基4-(3-氧代-3-(2-(吡啶-2-基)乙氨基)丙-1-烯基)苯甲酸酯(0.20g，0.64mmol，1.0当量)溶液中加入溶于水(3mL)中的LiOH(0.05g，1.93mmol，3.0当量)溶液。使反应在室温下搅拌20小时。随后使反应浓缩且用水(5mL)稀释。用1N HCl水溶液将溶液酸化至pH～2。使所形成的沉淀物过滤且用水(3mL)冲洗，以提供白色固体(0.15g，79％粗得率)。ESI+MS：m/z(rel强度)297(63.8，M+H)。
Figure BDA0000072501070000871
使溶于THF(10mL)中的(E)-4-(3-氧代-3-(2-(吡啶-2-基)乙氨基)丙-1-烯基)苯甲酸(0.10g，0.34mmol，1.0当量)、2-氨基-4-(噻吩-2-基)苯基氨基甲酸叔丁酯(0.19g，0.68mmol，2.0当量)、HATU(0.46g，1.91mmol，5.6当量)和DIPEA(0.31g，4.36mmol，12.9当量)混合物在室温下搅拌20小时。使反应浓缩且加入乙酸乙酯(30mL)。用水(20mL)洗涤溶液。使组合的有机层在硫酸钠上干燥，过滤且浓缩。通过柱层析(硅胶，6％MeOH/CH2Cl2)纯化产物，以提供靶化合物(0.11g，56％得率)。ESI+MS：m/z(rel强度)569(98.5，M+H)。
Figure BDA0000072501070000872
向溶于二氯甲烷(4mL)中的(E)-2-(4-(3-氧代-3-(2-(吡啶-2-基)乙氨基)丙-1-烯基)苯甲酰氨基)-4-(噻吩-2-基)苯基氨基甲酸叔丁酯(0.11g，0.19mmol，1.0当量)溶液中加入三氟乙酸(1.5mL)。使反应在室温下搅拌1小时且浓缩。使残渣溶解于乙酸乙酯(20mL)中，用碳酸钠的饱和水溶液(10mL)、水(10mL)洗涤。使有机层在硫酸钠上干燥，过滤且浓缩。用乙醚(2mL)洗涤残渣，以获得黄色固体(0.07g，75％得率)。ESI+MS：m/z(rel强度)469(97.9，M+H)，ESl+MS：m/z(rel强度)469(97.9，M+H)，1HNMR(500MHz，d6-DMSO)：δ9.79(s，1H)，8.52(d，J＝4Hz，1H)，8.30-8.23(m，1H)，8.034(d，J＝7.5Hz，2H)，7.75-7.65(m，3H)，7.48(d，J＝15Hz，2H)，7.36(d，J＝5Hz，1H)，7.30(t，J＝8.5Hz，2H)，7.26-7.20(m，2H)，7.05(t，J＝4.5Hz，2H)，6.81(d，J＝8.5Hz，1H)，6.74(d，J＝15.5Hz，1H)，5.19(s，2H)，3.60-3.52(m，2H)，2.95(t，J＝7Hz，2H)。
Figure BDA0000072501070000881
(E)-3-(3-(2-氨基-5-(噻吩-2-基)苯基氨基)-3-氧代丙-1-烯 基)苯甲酰胺(BRD-3636)的合成
Figure BDA0000072501070000882
使3-溴苯甲酸甲酯(10.8g，50.2mmol，1.0当量)、丙烯酸叔丁酯(8.05g，62.8mmol，1.25当量)、三乙胺(10.16g，100mmol，2.0当量)、三乙酰氧基钯(0.14g，0.50mmol，0.01当量)和三邻-甲苯基膦(0.61g，2.0mmol，0.04当量)的混合物在100℃下在氮大气下加热2小时。随后用水稀释反应混合物。用乙酸乙酯萃取产物。用1M HCl水溶液将有机层调整至pH～3。使有机层分离，在硫酸钠上干燥，过滤且在真空中浓缩，以获得黄色固体(11g，84％得率)。
Figure BDA0000072501070000883
使溶于TFA(100mL)中的(E)-甲基3-(3-叔丁氧基-3-氧代丙-1-烯基)苯甲酸酯(12.0g，45.7mmol)混合物在室温下搅拌20小时。在减压下去除溶剂。用乙酸乙酯洗涤所获得的残渣，以获得白色固体(8.5g，90％得率)。
Figure BDA0000072501070000891
使溶于THF(80mL)中的(E)-3-(3-(甲氧羰基)苯基)丙烯酸(5.56g，27mmol，1.5当量)、2-氨基-4-(噻吩-2-基)苯基氨基甲酸叔丁酯(5.22g，17.98mmol，1.0当量)、HATU(10.30，42.7mmol，2.37当量)和DIPEA(6.96g，98mmol，5.45当量)混合物在室温下搅拌20小时。随后使反应浓缩。用乙酸乙酯稀释残渣，并且用水随后为卤水进行洗涤。使有机层分离，在硫酸钠上干燥，过滤并且在减压下浓缩。通过柱层析(硅胶，50％PE/CH2Cl2)纯化产物，以提供黄色固体(6.0g，64.9％得率)。
向溶于THF(60mL)中的(E)-甲基3-(3-(2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(噻吩-2-基)苯基氨基)-3-氧代丙-1-烯基)苯甲酸酯(5.5g，11.49mmol，1.0当量)溶液中加入溶于水(60mL)中的LiOH(0.69g，28.7mmol，2.5当量)溶液。使反应在室温下搅拌20小时。用乙酸乙酯萃取反应。使有机层分离，并且用1N HCl水溶液酸化至pH～2。使所形成的沉淀物过滤，并且用水(200mL)随后为甲醇(100mL)冲洗，以提供白色固体(4.2g，79％得率)。
Figure BDA0000072501070000893
使溶于THF(10mL)中的氢氧化铵(0.02g，0.43mmol，2.0当量)、(E)-3-(3-(2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(噻吩-2-基)苯基氨基)-3-氧代丙-1-烯基)苯甲酸(0.10g，0.21mmol，1.0当量)、HATU(0.08g，0.32mmol，1.5当量)、HOBt(0.043g，0.32mmol，1.5当量)和DIPEA(0.11g，0.86mmol，4.0当量)混合物在室温下搅拌20小时。随后使反应浓缩。用乙酸乙酯稀释残渣，并且用水随后为卤水进行洗涤。使有机层分离，在硫酸钠上干燥，过滤且在减压下浓缩。通过柱层析(硅胶，10％MeOH/CH2Cl2)纯化产物，以提供所需产物(0.08，80％得率)。
Figure BDA0000072501070000901
用三氟乙酸(1mL)处理溶于CH2Cl2中的(E)-2-(3-(3-氨基甲酰苯基)丙烯酰氨基)-4-(噻吩-2-基)苯基氨基甲酸叔丁酯(0.08g，0.17mmol，1.0当量)。使溶液在室温下搅拌1小时。使反应浓缩。使残渣溶解于乙酸乙酯(20mL)中。用碳酸氢钠的饱和水溶液(10mL)随后为水(10mL)洗涤溶液。使组合的有机层在硫酸钠上干燥，过滤且浓缩。用乙醚(2mL)洗涤产物，以获得靶化合物(0.05g，73％得率)。ESI+MS：m/z(rel强度)364(92.63，M+H)，1H NMR(500MHz，d6-DMSO)：δ9.48(s，1H)，8.18(s，1H)，8.09(s，1H)，7.90(d，J＝8Hz，1H)，7.80-7.70(m，2H)，7.62(d，J＝16Hz，1H)，7.54(t，J＝8Hz，1H)，7.49(s，1H)，7.36(d，J＝5Hz，1H)，7.29-7.19(m，2H)，7.10-6.59(m，2H)，6.79(d，J＝8Hz，1H)，5.24(s，2H)。
Figure BDA0000072501070000902
4-乙酰氨基-N-(4-氨基-2′-甲基联苯基-3-基)苯甲酰胺 (BRD-4029)的合成
Figure BDA0000072501070000911
使溶于DME/H2O(2∶1，5mL)中的4-溴-2-硝基苯基氨基甲酸叔丁酯(0.20g，0.62mmol)、邻-甲苯基硼酸(0.10g，0.74mmol)、碳酸钠(0.20g，0.93mmol)和Pd(PPh3)4(50mg，0.04mmol)混合物在氩大气下加热至110℃。在20小时剧烈搅动后，加入水。用乙酸乙酯萃取产物。用水洗涤组合的有机层，在硫酸钠上干燥，过滤且浓缩。通过柱层析(硅胶，10％EtOAc/PE)纯化残渣，以提供作为黄色固体的所需产物(0.13mg，95％得率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：1.46(s，9H)，2.25(s，3H)，7.26-7.32(m，4H)，7.667.70(m，2H)，7.85(d，J＝1.6Hz，1H)，9.67(s，1H)。
使溶于MeOH(5mL)中的2′-甲基-3-硝基联苯基-4-基氨基甲酸叔丁酯(0.13g，0.58mmol)、Pd/C(10％，0.06g)在氢大气下剧烈搅拌16小时。使反应通过硅藻土过滤。使滤液浓缩。通过柱层析(硅胶，2.5％EtOAc/PE)纯化产物，以获得作为黄色固体的所需产物(0.161g，92％得率)。1HNMR(400MHz，d6-DMSO)：1.47(s，9H)，2.22(s，3H)，4.90(s，2H)，6.48(dd，J＝8.0，1.6Hz，1H)，6.64(d，J＝1.6Hz，1H)，7.11-7.13(m，1H)，7.19-7.25(m，4H)，8.34(s，1H)。
Figure BDA0000072501070000913
使溶于DMF(5mL)中的3-氨基-2′-甲基联苯基-4-基氨基甲酸叔丁酯(0.15g，0.508mmol，1.0当量)、4-乙酰氨基苯甲酸(0.56g，3.06mmol，6当量)、DIPEA(0.7mL，4.08mmol，8当量)和HATU(0.39g，1.14mmol，2当量)在氩大气下搅拌16小时。加入水并且用EtOAc萃取产物。使组合的有机层在硫酸钠上干燥，过滤且浓缩。通过柱层析(硅胶，10％EtOAc/PE)纯化产物，以提供作为黄色固体的所需产物(0.10g，42％得率)。1HNMR(400MHz，d6-DMSO)：δ1.47(s，9H)，2.08(s，3H)，2.28(s，3H)，7.16-7.3(m，5H)，7.53(d，J＝1.2Hz，1H)，7.57(d，J＝8.4Hz，1H)，7.72(d，J＝8.8Hz，2H)，7.90-7.92(d，J＝8.8Hz，1H)，8.80(s，1H)，9.80(s，1H)，10.24(s，1H)。
Figure BDA0000072501070000921
在0℃下用TFA(0.7mL)处理溶于CH2Cl2(1.5mL)中的3-(4-乙酰氨基苯甲酰氨基)-2′-甲基联苯基-4-基氨基甲酸叔丁酯(0.06g，0.124mmol)溶液。在反应混合物在0℃下搅拌2小时后，用乙酸乙酯稀释反应，并且用碳酸氢钠的饱和溶液进行洗涤。使组合的有机层在硫酸钠上干燥，过滤且浓缩，以获得所需产物(0.03g，47％得率)。1HNMR(400MHz，d6-DMSO)：δ2.08(s，3H)，2.27(s，3H)，5.00(s，2H)，6.84(d，J＝8.4Hz，1H)，6.96(d，J＝8.0，2.0Hz，1H)，7.16-7.25(m，5H)，7.69(d，J＝8.8Hz，2H)，7.94(d，J＝8.8Hz，2H)，9.60(s，1H)，10.20(s，1H).MS：m/z(360，[M+H]+；382，[M+Na]+)。
技术人员将认识到下文描述的其他化合物可以以与上文描述的程序相似的方式进行制备。
4-乙酰氨基-N-(2-氨基-5-(吡啶-3-基)苯基)苯甲酰胺(BRD-9773)可以通过用吡啶-3-基硼酸代替邻-甲苯基硼酸进行制备。ESI+MS：m/z(rel强度)369(96.2，M+Na)。
Figure BDA0000072501070000932
4-乙酰氨基-N-(2-氨基-5-(噻吩-2-基)苯基)苯甲酰胺(BRD-6929)可以通过用噻吩-2-基硼酸代替邻-甲苯基硼酸进行制备。ESI+MS：m/z(rel强度)382(96.2，M+Na)。
Figure BDA0000072501070000933
N-(2-氨基-5-(噻吩-2-基)苯基)-4-氨磺酰基苯甲酰胺(BRD-7726) 的合成
Figure BDA0000072501070000934
使溶于DMF(5mL)中的2-氨基-4-(噻吩-2-基)苯基氨基甲酸叔丁酯(0.30g，1.03mmol，1当量)、4-氨磺酰基苯甲酸(0.42g，2.06mmol，2当量)、HATU(780mg，2.06mmol，2.0当量)和DIPEA(0.45mL，2.58mmol，2.5当量)溶液在室温下搅拌15小时。用碳酸氢钠的饱和溶液猝灭反应。使所获得的固体过滤且在减压下干燥。通过柱层析(硅胶，3％MeOH/CH2Cl2)纯化产物，以提供所需产物(0.25g，51％得率)。
在0℃下向溶于CH2Cl2(2mL)中的2-(4-氨磺酰基苯甲酰氨基)-4-(噻吩-2-基)苯基氨基甲酸叔丁酯(0.15g，0.32mmol，1当量)的搅拌溶液中加入TFA(1mL)。使反应在室温下搅拌2小时。随后使反应浓缩。使残渣溶解于EtOAc中。用碳酸氢钠的饱和溶液进行洗涤溶液。使组合的有机层在硫酸钠上干燥，过滤且浓缩。通过柱层析(硅胶，3％MeOH/CH2Cl2)纯化产物，以提供所需产物(0.03g，24.9％得率)。ESI+MS：m/z(rel强度)374(98.32，M+H)，1HNMR(500MHz，d6-DMSO)：δ8.15(d，J＝8.5Hz，2H)，7.94(d，J＝8Hz，2H)，7.49(s，1H)，7.36(d，J＝4.5Hz，1H)，7.31(dd，J＝8.5，2Hz，1H)，7.44(d，J＝2.5Hz，1H)，7.05(t，J＝3.5Hz，1H)，6.81(d，J＝8.5Hz，1H)，5.21(s，2H)。
4-乙酰氨基-N-(2-氨基-5-苯乙基苯基)苯甲酰胺(BRD-7050) 的合成
Figure BDA0000072501070000943
在0℃下向5-溴-2-硝基苯胺(4.0g，18.43mmol，1.0当量)、4-乙酰氨基苯甲酸(4.95g，27.6mmol，1.5当量)和BOP(10.60g，23.96mmol，1.3当量)的搅拌溶液中逐份加入氢化钠(2.96g，123.0mmol，6.7当量)。允许反应混合物加温至室温，并且搅拌60小时。使溶剂在减压下蒸发。用碳酸氢钠的饱和溶液稀释残渣。使所获得的沉淀物过滤。通过柱层析(硅胶，25％EtOAc/CH2Cl2)纯化产物，以提供所需产物(3.31g，40％得率)。
Figure BDA0000072501070000951
使溶于DME/H2O(30mL)中的2-(4-乙酰氨基苯甲酰氨基)-4-溴苯基氨基甲酸叔丁酯(0.50g，1.11mmol，1.0当量)、(E)-苯乙烯硼酸(0.33g，2.23mmol，2.0当量)、碳酸钾(0.46g，3.335mmol，3.0当量)、Pd(PPh3)4(0.09g，0.08mmol，0.07当量)和三甲苯基膦(0.10g，0.33mmol，0.3当量)混合物加热至回流20小时。用水稀释反应混合物。使所获得的固体过滤。通过柱层析(硅胶，2％MeOH/CH2Cl2)纯化粗产物，以提供纯产物(0.30g，57％得率)。
Figure BDA0000072501070000952
向溶于乙醇(10mL)中的(E)-2-(4-乙酰氨基苯甲酰氨基)-4-苯乙烯基苯基氨基甲酸叔丁酯(0.15g，0.32mmol，1.0当量)的溶液中加入在碳上的钯(0.02g，0.23mmol，0.7当量)。使反应混合物在H2大气下搅拌20小时。使反应混合物通过硅藻土过滤，用甲醇洗涤固体。随后使反应在减压下浓缩，以提供灰白色固体(0.14g，93％粗得率)，这无需进一步纯化在下一个步骤中使用。
Figure BDA0000072501070000961
在0℃下向溶于CH2Cl2(3mL)中的2-(4-乙酰氨基苯甲酰氨基)-4-苯乙基苯基氨基甲酸叔丁酯(0.14g，0.29mmol)溶液中逐滴加入TFA(2mL)。使反应混合物缓慢加温至室温，并且搅拌2小时。通过在减压下蒸发去除溶剂。用水稀释粗残渣，并且用碳酸氢钠的饱和水溶液猝灭。使所获得的固体过滤，用水洗涤且在真空下干燥，以提供所需产物(0.08h，68％得率)。ESI+MS：m/z(rel强度)374(95.0，M+H)。
Figure BDA0000072501070000962
(E)-3-(4-乙酰氨基苯基)-N-(2-氨基-5-乙炔基苯基)丙烯酰 胺(BRD-0063)的合成
Figure BDA0000072501070000963
使溶于三乙胺(3mL)中的N-(4-溴苯基)乙酰胺(2.14g，10mmol，1.0当量)、丙烯酸叔丁酯(1.6g，13mmol，1.3当量)、二乙酰氧基钯(0.05g，0.2mmol，0.02当量)、P(o-toD3(0.12g，0.4mmol，0.04当量)混合物在氮下加热至100℃2小时。使反应冷却至室温。加入乙酸乙酯(50mL)。用水(2×20mL)洗涤有机层。使组合的有机层在硫酸钠上干燥，过滤且浓缩，以获得作为黄色固体的所需产物(2.2g，76％粗得率)。
Figure BDA0000072501070000971
使溶于三氟乙酸(10mL)中的(E)-3-(4-乙酰氨基苯基)丙烯酸叔丁酯(2.2g，8.42mmol)在室温下搅拌10分钟。通过蒸发去除溶剂。使残渣溶解于含水碳酸钠(0.3N，30mL)中。用乙酸乙酯(2×20ml)洗涤水层，用1N盐酸水溶液酸化至pH～3。用乙酸乙酯(50mL)萃取产物。使组合的有机层在硫酸钠上干燥，过滤且浓缩，以获得所需产物(1.4g，77％粗得率)。
Figure BDA0000072501070000972
使溶于Et3N(35mL)中的4-溴-2-硝基苯基氨基甲酸叔丁酯(0.97g，3.08mmol，1.0当量)、乙炔基三甲基硅烷(0.45g，4.62mmol，1.5当量)、PdCl2(PPh3)2(0.11g，0.15mmol，0.05当量)和CuI(0.04g，0.18mmol，0.06当量)混合物在100℃下回流加热2小时。使反应冷却至室温，并且通过蒸发去除溶剂。使残渣在水(50mL)和乙酸乙酯(50mL)中吸收。使有机层在硫酸钠上干燥，过滤且浓缩，以获得作为黄色油的粗产物(1.2g，116％粗得率)，这无需进一步纯化在下一个步骤中使用。
Figure BDA0000072501070000973
使溶于乙醇(30mL)中的2-硝基-4-((三甲基硅烷基)乙炔基)苯基氨基甲酸叔丁酯(1.2g，3.59mmol，1.0当量)、SnCl2.2H2O(4.05g，17.94mmol，5.0当量)和Et3N(15mL)混合物加热至70℃1小时。随后使反应冷却至室温。通过蒸发去除溶剂。使残渣在水(50mL)和乙酸乙酯(50mL)中吸收。使有机层在硫酸钠上干燥，过滤且浓缩。通过柱层析(硅胶，25％EtOAc/PE)纯化粗产物，以提供作为黄色固体的所需产物(0.58g，53％得率)。
Figure BDA0000072501070000981
用K2CO3(0.45g，3.28mmol，5.0当量)处理溶于甲醇(10mL)中的2-氨基-4-((三甲基硅烷基)乙炔基)苯基氨基甲酸叔丁酯(0.20g，0.65mmol，1.0当量)溶液。使反应在室温下搅拌30分钟。使溶剂蒸发，并且使残渣在水(20mL)和乙酸乙酯(30mL)中吸收。使有机层在硫酸钠上干燥，过滤且浓缩，以获得所需产物(0.14g，89％得率)，这无需进一步纯化在下一个步骤中使用。
Figure BDA0000072501070000982
使溶于THF(10mL)中的(E)-3-(4-乙酰氨基苯基)丙烯酸(0.14g，0.70mmol，1.2当量)、2-氨基-4-乙炔基苯基氨基甲酸叔丁酯(0.13g，0.58mmol，1.0当量)、HATU(0.26g，0.70mmol，1.2当量)和DIPEA(0.23g，1.75mmol，3.0当量)混合物在室温下搅拌20小时。使溶剂在减压下蒸发。用水(20mL)稀释残渣。用乙酸乙酯(20mL)将产物萃取2次。用卤水洗涤组合的有机层，在硫酸钠上干燥，过滤且浓缩。通过柱层析(硅胶，6％MeOH/CH2Cl2)纯化产物，以提供所需产物(0.12g，49％得率)。
Figure BDA0000072501070000983
用溶于1，4二噁烷(1mL)中的H2SO4溶液(0.10g，7.15mmol，50当量)在室温下处理溶于1，4二噁烷(1mL)中的(E)-2-(3-(4-乙酰氨基苯基)丙烯酰氨基)-4-乙炔基苯基氨基甲酸叔丁酯(0.06g，0.14mmol)溶液。使所得到的混合物在室温下搅拌2小时。用碳酸氢钠的饱和水溶液猝灭反应混合物。用乙酸乙酯萃取产物。使组合的有机层在硫酸钠上干燥，过滤且浓缩。通过柱层析(硅胶，6％MeOH/CH2Cl2)纯化产物，以提供所需产物(0.01g，21％得率)。ESI+MS：m/z(rel强度)319(94.13，M+H)。
在本申请中叙述的所有参考文献、专利和专利出版物通过引用整体合并入本文。
因此已描述了本发明的至少一个实施方案的几个方面，应当理解各种改变、修饰和改善对于本领域技术人员是容易想到的。此类改变、修饰和改善预期是本公开内容的部分，并且预期在本发明的精神和范围内。因此，前述说明书和附图仅作为例子。
Figure IDA0000072501140000021
Figure IDA0000072501140000031
Figure IDA0000072501140000041
Figure IDA0000072501140000051
Figure IDA0000072501140000061
Figure IDA0000072501140000071
Figure IDA0000072501140000081
Figure IDA0000072501140000101
Figure IDA0000072501140000111
Figure IDA0000072501140000121
Figure IDA0000072501140000131
Figure IDA0000072501140000141
Figure IDA0000072501140000161

Claims (53)

1.增强受试者中的记忆的方法，其包括给所述受试者施用以有效增强所述受试者中的记忆的量的HDAC2抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中所述HDAC2抑制剂是选择性HDAC2抑制剂。
3.权利要求1或2的方法，其中所述记忆是长期记忆。
4.权利要求1或2的方法，其中所述受试者对长期记忆具有减少的存取。
5.权利要求4的方法，其中所述长期记忆是受损的。
6.权利要求5的方法，其中所述长期记忆的受损是年龄相关的。
7.权利要求5的方法，其中所述长期记忆的受损是损伤相关的。
8.权利要求1或2的方法，其中所述受试者中的突触网络是重建的。
9.权利要求1的方法，其中所述HDAC2抑制剂不是HDAC1抑制剂。
10.权利要求1的方法，其中所述HDAC2抑制剂不是HDAC5、HDAC6、HDAC7或HDAC10抑制剂。
11.权利要求1或2的方法，其进一步包括施用HDAC3抑制剂。
12.权利要求1或2的方法，其进一步包括施用HDAC11抑制剂。
13.权利要求2的方法，其中所述选择性HDAC2抑制剂是HDAC2RNAi，例如siRNA、shRNA、miRNA、dsRNA或核酶或其变体。
14.权利要求1或2的方法，其中所述记忆是重获的。
15.权利要求1或2的方法，其进一步包括施用DNA甲基化抑制剂。
16.权利要求15的方法，其中所述DNA甲基化抑制剂选自5-氮杂胞苷、5-氮杂-2′脱氧胞苷、5，6-二氢-5-氮杂胞苷、5，6-二氢-5-氮杂-2′脱氧胞苷、5-氟胞苷、5-氟-2′脱氧胞苷，以及包含5-氮杂-2′脱氧胞苷、5，6-二氢-5-氮杂-2′脱氧胞苷和5-氟-2′脱氧胞苷的短寡核苷酸，以及普鲁卡因胺、Zebularine和(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯。
17.权利要求1或2的方法，其中所述HDAC2抑制剂经口、静脉内、皮肤、皮下、经鼻、肌内、腹膜内、颅内或脑室内施用。
18.权利要求1或2的方法，其中所述受试者具有选自下述的病症：AMCI(轻度认知损害)、阿尔茨海默氏病、记忆丧失、与阿尔茨海默病相关的注意缺陷症状、与阿尔茨海默病相关的神经变性、混合血管起源的痴呆、变性起源的痴呆、早老性痴呆、老年性痴呆、与帕金森氏病相关的痴呆、血管性痴呆、进行性核上麻痹或皮质基底节变性。
19.权利要求1或2的方法，其进一步包括在所述HDAC2抑制剂施用后评估所述受试者的认知功能。
20.权利要求18的方法，其进一步包括通过评估脑血流量或血脑屏障功能监控治疗。
21.权利要求18的方法，其进一步包括给所述受试者施用另外治疗试剂。
22.权利要求21的方法，其中另外的治疗试剂是ARICEPT或多奈哌齐、COGNEX或他克林、EXELON或利斯的明、REMINYL或加兰他敏、抗淀粉样蛋白疫苗、Aβ-降低疗法、智力训练或刺激。
23.用于治疗阿尔茨海默氏病的方法，其包括，
给具有阿尔茨海默氏病的受试者施用以有效治疗阿尔茨海默氏病的量的HDAC2抑制剂。
24.权利要求23的方法，其中所述HDAC2抑制剂是选择性HDAC2抑制剂。
25.权利要求1或权利要求24的方法，所述HDAC2抑制剂是选择性HDAC1/HDAC2抑制剂。
26.权利要求25的方法，其中所述HDAC2抑制剂是式(IV)的化合物
其中
R1和R2独立地选自H和-C(O)-C1-6烷基；
R3是任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或芳基-C1-6烯基。
27.权利要求26的方法，其中式IV是
Figure FDA0000072501060000032
28.权利要求26的方法，其中式IV是
Figure FDA0000072501060000033
29.权利要求26的方法，其中式IV是
Figure FDA0000072501060000034
30.权利要求26的方法，其中式IV是
Figure FDA0000072501060000035
31.权利要求1或权利要求24的方法，所述HDAC2抑制剂是选择性HDAC1/HDAC2/HDAC3抑制剂。
32.权利要求31的方法，所述HDAC2抑制剂是式(VI)的化合物
Figure FDA0000072501060000041
其中
R1和R2独立地选自H，取代或未取代、分支或未分支、环状或无环C1-6烷基，杂环基，杂芳基，芳基和芳基-C1-6烯基。
33.权利要求32的方法，其中式VI是
Figure FDA0000072501060000042
34.权利要求1或24的方法，所述HDAC2抑制剂是式(I)的化合物
Figure FDA0000072501060000043
其中
R1和R2独立地选自H，取代或未取代、分支或未分支、环状或无环C1-6烷基，杂环基，C1-6烯基，杂芳基，杂亚芳基和杂亚芳基-烯基；和
R3是芳基或杂芳基。
35.权利要求34的方法，其中式I是
Figure FDA0000072501060000044
36.权利要求1或24的方法，所述HDAC2抑制剂是式(II)的化合物
Figure FDA0000072501060000051
其中
R1和R2独立地选自H，取代或未取代、分支或未分支、环状或无环C1-6烷基，杂环基，C1-6烯基，杂芳基，杂亚芳基，杂亚芳基-烯基，亚芳基-烯基；和任选取代的杂环基-烯基；和
R3是芳基或杂芳基。
37.权利要求36的方法，其中式II是
Figure FDA0000072501060000052
38.权利要求36的方法，其中式II是
39.权利要求36的方法，其中式II是
Figure FDA0000072501060000054
40.权利要求36的方法，其中式II是
Figure FDA0000072501060000061
41.权利要求36的方法，其中式II是
Figure FDA0000072501060000062
42.权利要求1或24的方法，所述HDAC2抑制剂是式(III)的化合物
Figure FDA0000072501060000063
其中
X是-C(O)-N(R1)(R2)，C1-6亚烷基-N(H)-C1-6烯基-N(R1)C(O)(R2)；或-N(R1)C(O)R2；
R1和R2独立地选自H、和取代或未取代、分支或未分支、环状或无环C1-6烷基；和
R3是炔基、芳基或杂芳基。
43.权利要求42的方法，其中式III是
Figure FDA0000072501060000064
44.权利要求42的方法，其中式III是
Figure FDA0000072501060000071
45.权利要求42的方法，其中式III是
Figure FDA0000072501060000072
46.权利要求1或24的方法，所述HDAC2抑制剂是式(V)的化合物
Figure FDA0000072501060000073
其中
R1和R2独立地选自H、和取代或未取代、分支或未分支、环状或无环C1-6烷基；和
R3是芳基或杂芳基。
47.权利要求46的方法，其中式V是
48.药物组合物，其包括用于递送至脑组织的制剂中的HDAC2抑制剂和药学上可接受的载体。
49.权利要求48的组合物，其中所述HDAC2抑制剂配制成用于跨过血脑屏障。
50.用于在增强受试者中的记忆中使用的组合物，其包括以有效增强所述受试者中的记忆的量的HDAC2抑制剂。
51.以有效增强受试者中的记忆的量的HDAC2抑制剂的用途。
52.权利要求1或24的方法，所述HDAC2抑制剂是选择性HDAC1/HDAC2/HDAC10抑制剂。
53.权利要求1或24的方法，所述HDAC2抑制剂是选择性HDAC1/HDAC2/HDAC3/HDAC10抑制剂。
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