CN105163741A

CN105163741A - 包含dna甲基化抑制剂的常染色体显性多囊肾改善或治疗用药学组合物

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Publication number: CN105163741A
Application number: CN201480024153.8A
Authority: CN
Inventors: 朴钟勋; 禹俞美; 金永峻; 裴宰范; 朴恩荣; 李善英; 辛裕彬
Original assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of SWU
Current assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of SWU
Priority date: 2013-04-29
Filing date: 2014-04-21
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2034-04-21
Also published as: WO2014178555A1; KR20140128657A; KR101486248B1; CN105163741B

Abstract

本发明人为了决定常染色体显性多囊肾表观遗传突变和其功能关联性在多囊肾及非多囊肾个体的基因组全体中随机以甲基化剖面法分析与其表现数据相比较。有趣的是与离子传送及细胞结合关联的PKD1及其他基因在基因体超甲基化，其表现在多囊肾向下调整。特别是PKD1是在多囊肾基因体部分超甲基化，这是与MBD2(methyl-CpG-binding？domain？2)蛋白质结合有关。不仅如此，DNA甲基化抑制剂处理伴随着PKD1表现的向上调整且延迟MDCK(Madin-Darby？Canine？Kidney)细胞的囊肿形成。因此，本发明的PKD1和囊中形成关联的调节基因的超甲基化对囊肿形成起决定性作用且揭示可以用为常染色体显性多囊肾的治疗。

Description

包含DNA甲基化抑制剂的常染色体显性多囊肾改善或治疗用药学组合物

技术领域

本发明是涉及改善常染色体显性多囊肾疾病的药学组合物，其特征在于该组合物包含DNA甲基化抑制剂。

背景技术

常染色体显性多囊肾(Autosomaldominantpolycystickidneydisease:ADPKD)发病率是每500-1000名中至少有1名的较常见遗传病。常染色体显性多囊肾与健康的人相比较时两边肾脏会形成较多充满液体的囊肿，肾脏会大4-8倍为特点。目前为止因没有有效的多囊肾临床治疗方法大部分的多囊肾病会发展成终末期肾病(Gabow,1993；Grantham,1996)。人类多囊肾中囊肿的形成伴随着囊肿的表皮细胞的细胞繁殖、增加及细胞的自我灭亡。

尽管以常染色体显性方式遗传，但常染色体显性多囊肾的特征是个别囊肿的形成以病灶的(focal)、散发(sporadical)性质，管状表皮细胞中只有1-5％才会形成囊肿(Qian,etal.,1996)。近来的研究提出了常染色体显性多囊肾囊肿形成对2-HIT模型的强有力的证据。在老鼠的囊肿发育时以全部的Pkd1对立基因的损耗为需要(Jiang,etal.,2006)。在人类常染色体显性多囊肾中往往观察到异型结合性(heterozygosity)损耗或者PKD1的附带细胞质的突变(Badenas,etal.,2000；BrasierandHenske,1997；Koptides,etal.,1998；Pei,etal.,2001；Qian,etal.,1996)。不仅如此，因人类PKD1突变被诱导的囊肿显示出肾脏表皮分化基因表达损耗及与有丝分裂信号传导路径关联的基因集反常的向上调整(Songetal.2009)。但是其他研究结果是利用受遗传形变的小鼠模型显示野生型Pkd1表现标准减少在肾脏中可以诱导囊肿形成(Leeuwen,etal.,2004)。这样的结果显示在多囊肾对个别囊肿形成必要的因子未充分披露，像表观遗传(epigenetic)形变的另一个分子式机制干扰囊肿的形成。

据悉表观遗传(epigenetic)形变是各种各样的疾病发生的主要原因。例如肿瘤细胞是包含全体表观基因组(epigenome)的染色体结构中显示出广泛的变化，与细胞再生关联的全部路径会受到表观遗传的调整障碍(JonesandBaylin,2007)。近来几项研究结果是表观遗传的突变与包括常染色体显性多囊肾的肾脏发病相关，变化的表观遗传的因子的可逆恢复使副作用最小化且对治疗肾脏疾病成为强有力的方法(Li,2011；Park,etal.,2011a；VasyutinaandTreier,2010)。然而，还没有对全体表观基因组或常染色体显性多囊肾关联的DNA甲基化剖面法(profiling)分析。

虽然目前为止研制了很多多囊肾治疗药品，但是因负面反馈的阻碍得到了失望的临床结果。

发明内容

发明要解决的问题

本发明是以提供对常染色体显性多囊肾疾病更有效的药剂组合物为目的的。

解决问题的技术方案

本发明人是从多囊肾患者及未受多囊肾困扰的人的肾脏组织中分析了整个基因组的甲基化状态。此分析是利用甲基化-CpG-结合域(Methylated-CpG-bindingDomain；MBD)蛋白质亲和柱的利用依存于甲基化DNA存储MIRA-seq(甲基化CpG岛methylated-CpGislandrecoveryassaywithparallelsequencing)执行后为了确定及定量精炼的碎块做了深度排序。再者，本发明人对不同的甲基化的基因表达变化做了实验，表观遗传沉默(epigeneticsilencing)是抑制细胞输送、结合及细胞分化的主要路径，即通过微阵列的分析说明干预Notch,Wnt及mTOR信号传导路径的基因中的重要性。特别是本发明人发现与非多囊性患者相比多囊性患者的PKD1基因体会超甲基化。此超甲基化(hypermethylation)诱导MBD蛋白质的结合这是指PKD1基因的表观遗传沉默干预肾脏囊肿的发育。体外(invitro)囊肿形成模型是DNA甲基化抑制剂有效的清除了表观遗传沉默表现出对囊肿形成的抑制性，常染色体显性多囊肾进行中确定了这类的表观遗传的机制的作用。本发明人揭示了全体基因组连接的甲基化状态变化和多囊肾的囊肿形成之间的关系，这认为是在多囊肾治疗中可以应用。

发明的效果

本发明人实验结果表明与离子传导和细胞结合关联的PKD1及其他基因在基因体的部分被超甲基化，他们的表现在多囊肾患者的肾脏组织中向下调整。特别是PKD1在多囊肾基因体部分被超甲基化这与MBD2(methyl-CpG-bindingdomain2)蛋白质结合有关联。不仅如此DNA甲基化抑制剂的处理是伴随PKD1表现的向上调整且延迟MDCK(狗肾传代细胞,Madin-DarbyCanineKidney)细胞的囊肿形成。

因此，本发明如利用DNA甲基化抑制剂可以压制PKD1基因体的超甲基化，以此来揭示常染色体显性多囊肾的治疗与改善的可能性。

附图说明

图1是确认非多囊肾和多囊肾肾脏组织中被选择的基因表达标准。(A)基因体部分中表现完全不同的甲基化标准的基因的表现标准以定量的实时RT-PCR来确认。利用了非多囊肾(n＝3)和多囊肾(n＝5)的肾脏组织。被选择的基因的DNA甲基化标准是对催化剂和基因体部分以MIRA-seq分析用CMES来表示。被选择的Notch/Wnt/mTOR信号传导路径基因集中基因表达及DNA甲基化发生了变化。(B)基因本体组:表现传送(SLC6A19),钙信号(CACNA1H,LAT),形态形成(SALL1,COL6A3),组蛋白形变(JMJD3)。各条形的高度表示平均值，误差条形表示±标准偏差。β-肌动蛋白被利用为内部对照群。实验各进行了3次。P<0.05,GB:基因体(gene-body),PR(promoter):引物。

图2是表现PKD1基因体部分的超甲基化与其表现调整有关联。(A)PKD1DNA甲基化概况(profiles)以dCMES图来表示。(B)总甲基化质量是以3人的非多囊肾及7-8人的多囊肾患者的基因体及引物的探针中CpG部位附近的甲基化标准的百分比(以焦磷酸测序决定)相加来计算(A的红色箭头)。(C)8人的多囊肾患者样本(赤色圆)和3人的非多囊肾肾脏样本(青色圆)中表现PKD1表现和基因体DNA甲基化之间的关系。(D)表示囊肿表皮细胞中PKD1基因体甲基化和表现标准消极的相关关系。WT9-12细胞中脱甲基酶5-aza-dC处理时(2μM和4μM,72小时期间)有代表性的PKD1基因体(探针1)及引物CpG岛部位(探针2)的DNA甲基化变化以重亚硫酸盐焦磷酸测序来确认。用定量实时RT-PCR显示PKD1mRNA标准由5-aza-dC处理恢复。各条形的高度表示平均值，误差条形表示±标准偏差。β-肌动蛋白被利用为内部对照群。虽然PKD1基因体甲基化标准因5-aza-dC的处理恢复了一点，但是会对PKD1基因表达有所影响。两次实验均执行了三次。P<0.05。

图3是DNA甲基化抑制剂处理对体外囊肿形成表现抑制性。(A)DNA甲基化抑制剂5-aza-dC2μM及折布拉林(zeb)100μM来处理的MDCK细胞是在3D胶原凝胶中培养10日。MDCK细胞中囊肿形成是从第4日开始。虽然对照群细胞囊肿内腔变大，但是在处理DNA甲基化抑制剂的细胞中时就不一样了。(B)囊肿内腔大小的扩张是在9-10日期间显微镜3个领域(field)中随机选择的31-38个MDCK细胞中测定。***,P<0.001(C)第10日5-aza-dC及以折布拉林(zebularine)的处理PKD1基因体部位中DNA甲基化清除以3次焦磷酸测序来确定。P<0.05(D)3DMDCK细胞培养液中因DNA甲基化抑制剂的处理DNA脱甲基恢复了PKD1基因表达。PKD1表现标准是定量的实时RT-PCR(三次)来测定，将β-肌动蛋白利用为内部装载(loading)对照群而标准化。***,P<0.001。

图4是表示PKD1超甲基化部位诱导MBD2和抑制组蛋白标记物的结合。(A)PKD1基因体部位中表现MBD2的积累。以3D培养的MDCK细胞核提取物来指示的基因部位中执行MBD2及MECP2ChIP-qPCRs。(B)表示从hL1-5'UTR中分化的MECP2的积累。(C)从甲基化的CGI部位中表现MBD2的积累。核提取物在刚开始是以HinP1来传送取得未甲基化的CGI分划，剩余沉淀分划是以MspI稍微切断来得到甲基化的CGI分划。各CGIDNA分划使用RT-qPCR的模板。为了定量利用了以IgG对照群对ChIP-qPCR的比率。(D)以犬Mbd2为目标的siRNA妨碍了3D-培养的MDCK细胞中PKD1mRNA的标准下降。对照群及犬Mbd2siRNA是以15nM浓度为MDCK细胞中转染48小时。β-肌动蛋白被利用为内部对照群实验各进行了3次。**,P<0.01(E)犬Mbd2siRNA在被转染的细胞中对照群siRNA被转染的细胞相比较使囊肿形成减少。犬Mbd2siRNA和对照群siRNA在MDCK细胞中转染，处理毛喉素(5μM)后6日期间执行了3D培养。囊肿内腔大小是在第六天在显微镜视野中随机选择的46-48MDCK细胞中测定。***,P<0.001(F)被指示的组蛋白抗体及以PCR引物位置在MDCK细胞的PKD1基因体部位中执行组蛋白ChIP-qPCR。Y轴表示与未经处理的对照群比较的5-aza-dC处理群的PKD1mRNA标准的比例。所有的实验反复实施了3次以上。

图5是表示从肾细胞癌和多囊肾患者中取得的肾脏的组织病理学。表示具有代表性的H&E染色肾脏截面(扩大率1000x及200x,大小条形100μm)(A)从肾细胞癌中取得的正常肾脏截面表现出正常的肾脏组织且找不出肿瘤或者囊肿的证据。(B-D)在多囊肾中取得的肾脏中观察到大量的囊肿。G:肾小球(glomerulus),Cy:囊肿。

图6是表示非多囊肾肾脏组织及肾细胞癌细胞株中的推定肿瘤压制基因的表现标准。利用3个非多囊肾肾脏组织及肾细胞癌细胞株，786-O及ACHN以定量实时RT-PCR来测定6个基因表达标准。mRNA标准是将β-肌动蛋白利用为内部载入对照群而正常化。P<0.01。

图7是因对于囊肿成长的DNA甲基化抑制剂而显示出PKD1再表现阻碍的效果。(A)MDCK细胞在3D胶原凝胶中培养了12日且在第4日时开始形成囊肿构造。DNA甲基化抑制剂的5-aza-dC2μM及折布拉林(zebularine)(zeb)100μM从第5日起加在3D胶原内的MDCK细胞里。(B)DNA甲基化抑制剂是恢复了PKD1表现标准，并且囊肿构造早已形成但抑制了囊肿的成长。PKD1mRNA标准以定量实时RT-PCR来测定，β-肌动蛋白利用为内部载入对照群而正常化。*,P<0.05；***,P<0.001。

本发明的最佳实施方式

接下来以实施例更详细的说明本发明的构成。但是本发明的范围不仅限于实施例的记载范围，本发明在其技术领域的一般技术人员中是显而易见的。

实施例1：肾脏组织样本和基因组DNA分离

本研究是根据赫尔辛基宣言得到了首尔大学医院临床研究审议委员会的承认(H-0701-033-195)而执行且经过所有患者的同意。本发明人是从接受肾脏切除手术的常染色体显性多囊肾患者的肾脏皮质周边囊肿中清除的肾脏囊肿组织中取得。以接受透明肾细胞癌(clearcellrenalcellcarcinoma)手术的患者中取得的非肿瘤性，非多囊肾的肾脏组织为对照群且恶性细胞浸润以组织学分析除外。样本的详细内容记录在表1。

实施例2:MIRA

MIRA是以现有的内容来执行的(Rauch,etal.,2006)。对现有技术稍微的应变制造了在GST-标注的MBD2b和在His-标注的MBD3L1蛋白质。基因组DNA(15μg)是以声波处理100-500bp而成碎块28μg精炼出的GST-MBD2b蛋白质,28μg的His-MBD3L1蛋白质及与7μg的JM110细菌RNA一起培养了整夜。以JM110细菌DNA预先将阻塞的MagneGSTbeads(30μl,Promega,USA)加在样本后最终体积600μl的MIRA接合缓冲液(10mMTris-HCl,pH7.5,50mMNaCl,1mMEDTA,1mMDTT,3mMMgCl2,0.1％TritonX-100,5％乙二醇,25μg/mlBSA)中循环2个小时，并且以4℃来培养。beads是以1ml的清洗缓冲液(10mMTris-HCl,pH7.5,300mMNaCl,1mMEDTA,3mMMgCl2,0.1％TritonX-100)来清洗3次，装有RNaseA(100μg,Qiagen)及蛋白质分解酵素K(15μg,Qiagen)的TE30μl一起在56℃下培养30分钟。然后在温室中培养5分钟后洗脱出甲基化的碎块。洗脱的DNA碎块利用QIAquickPCR纯化试剂盒(QIAquickPCRpurificationkits)(Qiagen)变得更精炼。

实施例3：总RNA分离与微阵列的混合化

从非多囊肾与多囊肾患者的肾脏组织中利用NucleoRNAKit(MACHEREY-NAGEL,Germany)分离出总RNA。根据制作者治疗方案以AffimetrixGeneChipHumanGene1.0STArray来利用300ng的各RNA样本。(http://www.affymetrix.com)。微阵列组GEO认证号为GSE35831。

实施例4：细胞株与药物处理

MDCK细胞是从10％(v/v)牛胎血清与含有青霉素、链霉素的DMEM/F12(Welgene,Korea)培养基中培养。常染色体显性多囊肾囊肿内层(lining)皮质表皮细胞WT9-12(Loghman-Adham,etal.,2003)是10％(v/v)牛胎血清及含有青霉素、链霉素的DMEM/F12(Welgene,Korea)培养基中培养。这些细胞是在37℃的5％CO2及95％空气的潮湿环境下培养的。这些细胞2～4μM的5-aza-dC(5-氮杂-2'-脱氧胞苷,5-aza-2'-deoxycytidine,Sigma-Aldrich,StLouis,MO,USA)或者100μM折布拉林(zebularine)(zebularine；Calbiochem,SanDiego,California,USA)来处理了14日。每1-2天更换培养基且加上新的5-aza-dC或者折布拉林(zebularine)。

实施例5：siRNA转染

以犬Mbd2为目标的siRNA(正义5'-GAGAUGAGGCCUAAGAGUAtt-3',反义5'-UACUCUUAGGCCUCAUCUCtt-3')是因BioneerInc.设计而供应。对照群siRNA是在SantaCruzBiotechnology(sc-37007)获得的。siRNA是把细胞接种在100cm²培养皿中过一天后利用LipofectamineRNAiMAX试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)转染到MDCK细胞中。之后的实验是转染24小时后执行。

实施例6：重亚硫酸盐处理与焦磷酸测序

基因组DNA是人类肾脏皮质组织及MDCK细胞中的DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂处理前后利用NucleoTriPrepExtractkit(MACHEREY-NAGEL)依照制作者协议来进行分离。基因组DNA的重亚硫酸盐处理EZDNAMethylation-Goldkit^TM(ZYMOResearch,USA)是按照制作者的指示来利用。处理的DNA是利用HotStarPlusDNA聚合酶(Qiagen)来PCR增幅。引物是以Pyrosequencing^TMAssayDesignSoftwareversion1.0(BiotageAB,Uppsala,Sweden)为设计。PCR条件如下:以95℃5分钟；以94℃30秒,以55℃1分钟及以72℃45秒44频率；以72℃7分钟。PCR产物是利用PyroMark^TMMD(BiotageAB)(TostandGut,2007)来焦磷酸测序。表4中有对各基因的焦磷酸测序的引物目录。包含在增幅部分的全部CpG部位的甲基化的推定值是为了得到分析后的部分甲基化的单一推定值(百分比)而进行平均。

实施例7：定量实时RT-PCR

如上所述分离的RNA(3μg)是利用M-MLV逆转录酶(Promega),100nMoligo-dT,1mMdNTP混合物与RNase抑制剂而逆转。使用人类GAPDH(正5'-ATCGTGGAAGGACTCATGACCACA-3',负5'-AGAGGCAGGGATGATGTTCTGGA-3'),人类β-actin(正5'-AAGGCCAACCGCGAGAAGAT-3',负5'-CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC-3')与犬β-actin(正5'-GAGCGAGCATCCCCCAAAG-3',负5'-GCAAGGGACTTCCTGTAAC-3')为良性对照群。使用的其他引物的目录标示在序列表4。定量实时RT-PCR是按照制造者的指示利用real-timeSensiMixPlusSYBRkit试剂盒(Quantance,London,UK)来执行。

实施例8：Illumina基因组分析仪序列分析

为了Illumina基因组分析仪序列分析使用了洗脱的MIRADNA100ng。一双Solexaadapter结合(ligation)后,175bp及300bp结合产物2％琼脂糖凝胶中精炼后PCR增幅。聚集形成与36周期的排序是按照制作者的指示来执行。本发明人以连接2-4pM的适配蛋白,按照大小分划的DNA以Illumina基因组分析仪上的柱形混合物120μl中排序。利用SolexaAnalysisPipeline(version0.3.0)对序列标签人类基因组(UCSChg18database,basedonNCBIBuild36.1assembly)进行了排序。获得了34bp(开始到结束除核苷酸以外)的序列线。

实施例9：数据处理与MES(methylationenrichment score)计算

为了确认甲基化的DNA碎块的实际位置以现有技术类似的方式来分析了数据(Choi,2010；Choi,etal.,2009)。根据sizefractionation(最大200bp)将34-bp线从3'末端延长。结果为了在UCSCgenomebrowser(http://genome.ucsc.edu)中视觉化将以BED(browserextensibledata)文件来变换。我们是以200-bp长度的断片中重叠的序列标签来计数。MES(甲基化富集数，methylationenrichmentscore)是(目标线数/目标大小)/(总线数/基因组大小)的log2来计算且利用了DNA甲基化标准的推定值(Choi,2010；Park,etal.,2011b)。CMES值是MES除以目标内CpG部位数来获得。CpG数显示为0的话CMES值为0。为了此研究引物转录起始部位定位为基准以从-1000到+600bp或者-1000到+1的bp部分定义。

实施例10：数据整合

Solexa序列数据和微阵列数据是利用statisticalprogrammingenvironmentR(version2.11.0)以annotatedmRNAaccessionidentifiers为基础导出。对重要调查列表京都基因及基因组百科辞典(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes；KEGG)路径分析是利用DAVIDFunctionalAnnotationtool(Dennis,etal.,2003)来执行。

实施例11：3次元细胞培养

3次元胶原Ⅰ凝胶是为了取得凝胶浓度3.8㎎/ml以相同量的10×重组缓冲液(262mM重碳酸钠,20mMHEPES,pH7.6)和充分的培养基相加从大白鼠尾巴胶原(CollaborativeBiomedicalProducts,Bedford,MA)中制造。MDCK细胞以2.5×10⁵至3×10⁶cells/ml浓度立即加入到溶液中。溶液是35-mm盘移开后上升到37℃。24小时后形成凝胶时加入含有1％(v/v)牛胎血清的DMEM/F12(Welgene)。为了用siRNA转染细胞或者促进囊肿形成直接在腺苷酸环化酶活性剂的毛喉素5mM存在下以同样的方式培养3D。

实施例12：获得位相差图像

胶原凝胶内MDCK囊肿构造的位相差图像是利用具备10×及40×物镜的OlympusIX70显微镜进行摄影培养后1,4,6,8及第10日。个别囊肿的大小以现有研究记载来评价(Park,etal.,2009)。

实施例13：染色质免疫沉淀(ChIP)

染色质免疫沉淀是按照现有技术稍微应变执行(Thomson,etal.,2010)。细胞在碟中培养,用1％的多聚甲醛固定后保存在-80℃。收集的细胞是用3RIPA缓冲液(20mMTris-HCl[pH7.5],150mMNaCl,1mMNa₂EDTA,1mMEGTA,1％NP-40,1％脱氧的胆酸钠,2.5mM焦磷酸钠,1mMNa₃VO₄,蛋白质抑制剂混合物)每10分钟激烈的搅拌且涡旋30分钟。核分划是用13000×g来离心过滤30分钟取得。此分划利用为MspI分解酵素为甲基化岛(Me-CGIs)制造，接下来未甲基化的CGIs是以HinP1分解孝素取得。染色质是根据在先论文制造(Thomson,etal.,2010)。MBD2独特抗体(SantaCruzBiotechnology,sc-9397),MECP2独特抗体(Abcam,ab2828),H3K4me3独特抗体(Upstate,17-614),H3K9me3独特抗体(Abcam,ab8898),H3K27me3独特抗体(Abcam,mAbcam6002),H3K36me3独特抗体(Abcam,ab9050)与H3KAc独特抗体(Upstate,06-599)均为购买。

实施例14：组织学的分析

用福尔马林固定的人类肾脏组织植入到链烷烃以5μm厚度截断。截面为了组织学的分析根据标准的方法再水化后H&E(苏木精和伊红，hematoxylinandeosin)染色。

实施例15：人类肾细胞癌细胞株

786-O及ACHN人类肾细胞癌细胞株是淑明女子大学的任钟晳教授提供。细胞10％(v/v)牛胎血清及含有青霉素、链霉素RPMI1640(Welgene,Korea)培养基中在37℃，5％CO₂及95％空气的条件下培养。

实施例16：3次元细胞培养基药物处理

3次元胶原Ⅰ凝胶是为了取得最终凝胶浓度3.8㎎/ml以相同量的10×重组缓冲液(262mM重碳酸钠,20mMHEPES,pH7.6)和充分的培养基相加从大白鼠尾巴胶原(CollaborativeBiomedicalProducts,Bedford,MA)中制造。MDCK细胞以2.5×10⁵至3×10⁶cells/ml浓度立即加入到溶液中。溶液用35-mm盘移开后上升到37℃。24小时后形成凝胶时将加入含有1％(v/v)牛胎血清的DMEM/F12(Welgene)。每天换培养基。5日后新鲜的5-aza-dC(5-aza-2'-deoxycytidine；Sigma-Aldrich,StLouis,MO,USA)2～4μM或者折布拉林(zebularine)(zebularine；Calbiochem,SanDiego,California,USA)100μM相加在3D胶原内的MDCK细胞中14日。胶原凝胶内MDCK囊肿构造的位相差图像是利用具备10×及40×物镜的OlympusIX70显微镜进行培养后3,5,8,10及第12日的拍摄。个别囊肿的大小以在先研究记载来评价(Park,etal.,2009)。

实施例17：定量实时RT-PCR

3D培养的MDCK细胞中mRNA的表现是用定量实时的RT-PCR来确认。3D培养2周后3D胶原凝胶内的MDCK细胞为了得到MDCK囊肿细胞以胶原酶(最终浓度2㎎/ml)处理后在37℃的5％CO2与95％空气潮湿的环境下培养2小时。总RNA是以胶原酶处理的MDCK细胞中利用NucleoRNAKit(MACHEREY-NAGEL,Germany)按照制造者的指示进行分离。利用M-MLV逆转录酶(Promega),100nMoligo-dT,1mMdNTP混合物及RNase抑制剂逆转总RNA5μg。利用Rotor-Gene(CorbettRobotics,SanFrancisco,CA)至real-timeSensiMixPlusSYBRkit试剂盒(Quantance)按照制造者的指示执行实时PCR。使用犬的β-肌动蛋白(正5'-GAGCGAGCATCCCCCAAAG-3',负5'-GCAAGGGACTTCCTGTAAC-3')作为良性对照群。非多囊肾组织及肾细胞癌细胞株之间6个肿瘤抑制基因的mRNA标准确认为上述定量实时RT-PCR。使用的引物序列显示在表4。PCR条件如下:以95℃15分钟；以95℃10秒,以60℃15秒及以72℃20秒40频率。

结果1：肾脏囊肿的基因组全部DNA甲基化状态

从3个多囊肾患者中取得的囊肿肾脏皮质样本及3人的非多囊肾，利用对从透明肾细胞癌患者中取得的非多囊肾肾脏皮质组织(表1)的MIRA-seq分析，分析了基因组全部的DNA甲基化变化。非多囊肾肾脏组织是从肾细胞癌患者中取得的正常肾脏的一部分。虽然在非多囊肾肾脏组织中未发现囊肿形成，但是多囊肾肾脏组织中发现了很多囊肿(图5)。不仅如此，肾细胞癌细胞株786-O及ACHN作比较时非多囊肾肾脏样本的定量实时RT-PCR分析未表现出明确的肿瘤关联基因表达征兆。非多囊肾肾脏样本中没有肿瘤细胞污染的事实在透明肾细胞癌中以已知沉默的6个基因表达标准确认(Dalgin,etal.,2008)。全部肾细胞癌细胞株中与此基因强烈的沉默为相反的被本发明利用的透明肾细胞癌患者由来非多囊肾肾脏组织中此基因显示出较高的表现标准(图6)，这是对照群样本中明确显示无异常。从此结果来看本发明使用的从透明肾细胞癌患者中取得的非多囊肾肾脏组织是可以利用为多囊肾样本的正常对应物。

结果2：细胞分划及移送关联路径的转录沉默

为了研究在多囊肾中不同甲基化的基因中的作用，本发明人执行了基因本体论分析。我们为了钙信号转送、轴索突起诱导(axonguidance)、细胞结合、电离子输送、Notch及GnRH信号转送关联的基因超甲基化存储的反面，少数的低甲基化的基因中发现不能明确的以功能性来聚集(表3)。细胞输送关联的基因(ZFAT,OSTalpha,P2RX4,ATP4B,TRPV1及SLC22A18),钙信号转送关联的基因(LCK,CHRNA10,CLDN9,TRPC3,CLDN19及CACNA1H),细胞形态形成关联的基因(BCL2,LIG1,SALL1,SOX10,FOXI1及THEM176B),细胞结合关联的基因(SYMPK,SPG7,SEMA4D,LGALS4,DSG4及MUC5B)的表观遗传(epigenetic)突变在肾脏囊肿中表现出主要功能的非正常化的反映。特别是，被清除时已知为常染色体显性多囊肾是主要原因的基因PKD1是在多囊肾中发现多数为甲基化但这是指PKD1的表观遗传(epigenetic)沉默在囊肿形成时会产生影响。干预细胞分划路径调整的基因(NOTCH1,NOTCH2,DTX1,CCDC88C,CSNK1G2,WNT4,WNT7,WNT9,WNT11及DVL)也被超甲基化(表2)。并且，干预染色质重塑的几个基因(HDAC1,DOT1L,JMJD3,EHMT1,MBD3L1及EHMT2)也是在多囊肾囊肿肾脏中被超甲基化。这些基因的超甲基化与发现向下调整的关系确认为实时qRT-PCR(图1a,1b)。重要的是这个数据里暗示此基因的基因体超甲基化会对基因沉默涉及影响。基因体超甲基化对转录因子的功能涉及影响，会诱发非正常的囊肿形成。综上所述，对正常肾脏的发育所需要的基因的基因体甲基化是囊肿形成中起到重要作用。

结果3：PKD1基因体部分的超甲基化

进一步，多囊肾中对于诱导囊肿形成的主要原因的基因PKD1本发明人分析了涉及囊肿发育的PKD1超甲基化的影响。本发明人对被基因组全体分析使用的2人样本外再加5个人的多囊肾患者样本对于PKD1基因的引物和对3'位在末端两处被选择的部分(探针1及探针2)以重亚硫酸盐处理的DNA的焦磷酸测序来执行(图2a)。根据基因组全体甲基化数据，本发明人虽然所有多囊肾患者的PKD1基因体部分超甲基化但是发现实验对象的所有非多囊肾及多囊肾患者的样本中引物部分未甲基化而存留(图2b)。

PKD1表现标准的实验是表现标准和甲基化标准间表现出分明的消极相关关系(图2c)。多囊肾中为了确认PKD1基因体DNA甲基化的效果作为DNA甲基化抑制剂的5-aza-dC处理到不减化的人类常染色体显性多囊肾囊肿内里表皮细胞(WT9-12)中。PKD1基因体脱甲基对引物部位中未有任何影响但可以观察到PKD1mRNA标准增加(图2d)。这样的结果表明与基因体甲基化关联的PKD1表现调整与囊肿发育相关联。

结果4：因DNA甲基化抑制剂在体外压制囊肿形成

为了试验囊肿形成中的超甲基化作用本发明人利用在体外的囊肿形成模型。犬的肾脏细胞株MDCK被植入到胶原I型母体时是进行一时的囊肿形成的囊肿肾脏疾病模型但此模型中PKD1基因超表现延迟了囊肿形成(Boletta,etal.,2000)。我们实验了在3DMDCK培养液中的涉及囊肿发育的2个DNA甲基化抑制剂5-aza-dC(5-aza-2'-deoxycytidine)及折布拉林(zebularine)的影响。焦磷酸测序中探知的PKD1基因体的甲基化标准被利用为甲基化变化的代表性标记。DNA甲基化抑制剂的处理明显压制囊肿成长(图3A,3B)，此是DNA甲基化标准明确的变化及PKD1表现标准增加的同时发生(图3D)。不仅如此，MDCK细胞3D培养体制中囊肿形成开始时4日后DNA甲基化抑制剂处理使诱导囊肿成长速度延迟(图7)。这样的结果是MDCK细胞中PKD1的较高表现标准因细胞繁殖减少及自我细胞消灭而压制囊肿成长的报告(Boletta,etal.,2000)相一致。因此，这样的结果表明DNA甲基化的变化包括PKD1在内的干预表皮细胞中囊肿发育的基因调解中起重要的作用。

结果5：对于PKD1基因体的超甲基化诱导MBD2的结合

在试管中囊肿形成的期间为了研究PKD1调整基础的分子式机制本发明人确认在超甲基化的PKD1基因部位结合的因子。我们是利用ChIP-qPCR(chromatinimmune-precipitationquantitativePCR)进行PKD1基因体部位的2个具代表性的MBD(Methylated-CpG-bindingDomain)蛋白质的MBD2和MECP2(methylCpGbindingprotein2)是否会结合。我们发现是MBD2在PKD1基因体部位特异结合，而不是MECP2(图4A)。然而，此蛋白质未在转录活跃的β-肌动蛋白基因的引物部位中发现。在对照群实验中MECP2表现出强烈的附着于对已知MECP2的主要目标的hL1-UTR重复部分(Muotri,etal.,2010)，因而在ChIP结果中排除实验的错误可能性(图4B)。为了更加确认对于甲基化的DNA对MBD2的结合的特殊性与现有技术(Thomsonetal.2010)一起对甲基化的敏感/不敏感酵素依次分解后精炼甲基化/未甲基化CGIENA的碎块且进行了以ChIP-qPCR来结合MBD2的实验(图4C)。不仅如此，PKD1的甲基化的基因体结合MBD2的实际责任在于PKD1沉默，为了确认执行囊肿形成的作用，对于犬Mbd2的siRNA处理在MDCK细胞中。结果Mbd2降低了阻碍PKD1转录组向下调整及囊肿发育(图4D,4E)。这样的结果是在甲基化的PKD1基因体部位结合MBD2引起PKD1的向下调整，因此说明对多囊肾的进行起了决定性的作用。

结果6：压制性组蛋白形变与PKD1中DNA甲基化有关联

因不正确的DNA甲基化变化对组蛋白形变有关联本发明人以DNA甲基化清除诱导的PKD1基因部分的组蛋白形变的变化来分析。我们MDCK细胞中以体外囊肿形成期间处理了5-aza-dC后测定PKD1基因体中五个具有代表性的组蛋白形变(H3K4me3,H3K9me3,H3K27me3,H3K36me3与H3KAc)的标准。组蛋白ChIP-qPCR结果是活性组蛋白甲基化标记物viz.,H3K36me3及H3KAc对PKD1基因体部分中明显增加的反面，表现出具有代表性的压制性组蛋白形变标记物(H3K27me3)的减少。反面引物活性标记物(H3K4me3)和其他基因压制标记物(H3K9me3)没有变化(图4F)。因而,DNA甲基化的变化体现在基因体部分中对基因组形变产生影响以及多囊肾肾脏发育中主要以调整基因的表观遗传沉默为媒介。

表1

(表2)

(表3)

(表4)

具体实施方式

本发明是提供包含DNA甲基化抑制剂的常染色体显性多囊肾的改善或者治疗用药学组合物。

上述DNA甲基化抑制剂无特别限制但有望以5-aza-dC(5-aza-2'-deoxycytidine)或者折布拉林(zebularine)为特征。

本发明的组合物是一个或者一个以上的多囊肾治疗剂或与改善剂一起使用。

本发明的组合物包含上述有效成份外适合药剂学、被生理学许可的助剂，这些助剂包含赋形剂、崩解剂、甜味剂、结合剂、涂层剂、膨胀剂、润滑剂、滑泽剂(Slipmodifiers)或者增溶剂等。

并且，本发明的组合物为了下药除了上述记载的有效成份外增加了一种以上包含在内的药剂学许可的载体可以制剂出令人满意的药剂学组合物。

为了改善多囊肾被使用的本发明的药剂含有增加了药剂学许可的载体的组合物形态而下药。药剂学中许可的载体包含，例如一个以上的水、食盐水、磷酸缓冲食盐水、糊精、甘油、乙醇以及其组合。此类组合物制剂下药后快速释放活跃成份或者提供持续性及迟延释放。以液状溶液制剂出的组合物，以被许可的药剂学载体适合杀菌及活体，食盐水、杀菌水、林格式溶液、缓冲食盐水、清蛋白注射溶液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇及这些成份中一种成份以上混合后使用，按照需要可添加抗氧化剂、缓冲液、抑真菌剂等其他普通的添加剂。并且将稀释剂、分散剂、界面活性剂、结合剂及润滑剂额外添加与水溶液、悬浊液、乳浊液等一样的注射用剂型、丸药、胶囊、颗粒或者精炼出制剂。进一步，以相关领域的适当的方法利用Remington'sPharmaceuticalScience,MackPublishingCompany,EastonPA中解释的方法根据各疾病或者成份做出令人满意的制剂。

本发明的组合物的药剂制剂形态是颗粒剂、散剂、包衣片、片剂、胶囊剂、栓剂、糖浆、汁、悬浊剂、乳剂、点滴剂或者可以注射的液剂及活性化合物的缓释制剂等。

本发明的组合物是可以通过静脉内、动脉内、腹腔内、肌肉内、胸骨内、经皮、鼻侧内、吸入、外用、直肠、口服、眼球内或者皮内路径以通常方式下药。

本发明的治疗方法，“有效量”是意味着达到改善多囊肾或者压制囊肿形成的效果的要求的量。并且，本发明的有效成份的“有效量”是根据含有疾病的种类、疾病的重症度、组合物的有效成份及其他成份的总类及含量、剂型的种类及喊着的年龄、体重、一般健康状态、性别及食物、下药时间、下药路径及组合物的分泌率、治疗时间、同时使用的药物等的多种因素调整。如是成人，以DNA甲基化抑制剂化合物0.1ng/㎏～10㎎/㎏的用量下药为宜。

工业上的利用性

本发明是包含DNA甲基化抑制剂的药学组合物是可用于常染色体显性多囊肾症状的改善剂治疗用途。

本发明是未来创造科学部园田技术开发项目课题“利用多囊肾动物模型关联囊肿形成疾病微RNA(microRNAs)大量发掘及揭示疾病目标”和未来创造科学部园田技术开发项目课题“查明因肾脏皮层细胞的CILIADISASSEMBLY内皮细胞损坏机理”来执行的特此声明。

Claims

1.一种常染色体显性多囊肾改善或治疗用药学组合物，其特征在于，该组合物包含DNA甲基化抑制剂。

2.根据权利要求1所述的常染色体显性多囊肾改善或治疗用药学组合物，其特征在于，所述DNA甲基化抑制剂是5-aza-dC(5-aza-2'-deoxycytidine)或折布拉林。