KR20140128657A

KR20140128657A - Ｄｎａ 메틸화 저해제를 포함하는 상염색체 우성 다낭신 개선 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20140128657A
Application number: KR1020130047338A
Authority: KR
Inventors: 박종훈; 우유미; 김영준; 배재범; 박은영; 이선영; 신유빈
Original assignee: 숙명여자대학교산학협력단
Priority date: 2013-04-29
Filing date: 2013-04-29
Publication date: 2014-11-06
Also published as: KR101486248B1; CN105163741B; CN105163741A; WO2014178555A1

Abstract

상염색체 우성 다낭신은 양쪽 신장에 액체가 든 여러 개의 낭포가 형성되는 것을 특징으로 하는 흔한 인간 유전병이다. 비록 PKD1 (polycystic kidney disease 1)의 변이가 상염색체 우성 다낭신을 일으키는 주요 원인이지만 개별 낭포형성의 국소적이고 산발적인 특성은 후성적 변이와 같은 또 다른 분자 메카니즘을 암시한다. 상염색체 우성 다낭신의 후성적 변이와 그들의 기능적 관련성을 결정하기 위해 다낭신 및 비-다낭신 개체를 게놈 전체에서 무작위적으로 메틸화 프로파일링하여 분석하고 그들의 발현 데이타와 비교하였다. 흥미롭게도 이온전달 및 세포접합과 관련된 PKD1 및 다른 유전자들은 유전자 몸체 부분에서 과메틸화되었고, 그들의 발현은 다낭신에서 하향조절되었는데, 이는 후성적 침묵화가 낭포형성에 관여하는 주요 메카니즘임을 암시하는 것이다. 특히, PKD1은 다낭신 유전자 몸체 부분에서 과메틸화되었고 이것은 MBD2 (methyl-CpG-binding domain 2) 단백질 결합과 연관되어 있었다. 뿐만 아니라, DNA 메틸화 저해제 처리는 Pkd1 발현의 상향조절을 수반하며 MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) 세포의 낭포 형성을 지연시켰다. 이러한 결과들은 PKD1 녹다운이 낭포형성의 충분조건이라는 선행연구들과도 일치한다. 따라서, 본 발명은 PKD1과 낭포형성과 관련된 조절 유전자들의 과메틸화가 낭포 형성에 있어서 결정적인 역할을 수행함을 보여주며, 상염색체 우성 다낭신의 치료용도로 이용할 수 있음을 제시한다.

Description

ＤＮＡ 메틸화 저해제를 포함하는 상염색체 우성 다낭신 개선 또는 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition containing DNA methylation inhibitors for treating autosomal dominant polycystic kidney disease}

본 발명은 상염색체 우성 다낭신 질환 개선용 약학 조성물에 관한 것으로서, DNA 메틸화 저해제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상염색체 우성 다낭신 (Autosomal dominant polycystic kidney disease : ADPKD)은 500~1,000명당 최소 1명의 발병률을 나타내는 가장 흔한 유전병이다. 상염색체 우성 다낭신은 건강한 사람과 비교할 때 양쪽 신장에 액체가 찬 낭포가 많이 형성되고 신장이 4~8배 커지는 것으로 특징지을 수 있다. 현재까지는 다낭신에 효과적인 임상 치료방법이 없어 대부분의 다낭신은 말기 신장질환으로 진행된다 (Gabow, 1993; Grantham, 1996). 인간 다낭신에서 낭포 형성은 낭포 표피세포의 세포증식 증가 및 자기세포사멸을 수반한다.

상염색체 우성 방식으로 유전됨에도 불구하고 상염색체 우성 다낭신의 특징은 개별 낭포 형성의 국소적인 (focal) 그리고 산발적인 (sporadical) 성질인데, 관상표피세포 중 단지 1-5%만이 낭포를 형성한다 (Qian, et al., 1996). 최근 연구는 상염색체 우성 다낭신 낭포형성의 2-히트 모델에 대한 강력한 증거를 제시하고 있다. 마우스에서 낭포 발달은 Pkd1 대립유전자 모두의 손실을 필요로 한다 (Jiang, et al., 2006). 인간 상염색체 우성 다낭신에서는 이형접합성 (heterozygosity) 손실 또는 PKD1의 부가적인 세포질 돌연변이가 종종 관찰되었다 (Badenas, et al., 2000; Brasier and Henske, 1997; Koptides, et al., 1998; Pei, et al., 2001; Qian, et al., 1996). 뿐만 아니라, 인간 PKD1 돌연변이에 의해 유도되는 낭포는 신장 표피 분화 유전자 발현 손실 및 유사분열 신호전달경로와 관련된 유전자 셋트의 비정상적인 상향조절을 보여준다 (Song et al. 2009). 그러나, 다른 연구결과는 야생형 Pkd1 발현수준 감소가 신장에서 낭포형성을 유도할 수 있음을 유전적으로 변형된 마우스 모델을 이용하여 보여주었다 (Leeuwen, et al., 2004). 이러한 결과들은 다낭신에서 개별 낭포형성에 필요한 인자들이 충분히 밝혀지지 않았고, 후성 변형과 같은 또다른 분자적 기작이 낭포형성에 관여하고 있음을 보여준다.

후성적 변형은 다양한 질병의 발생에서 주요 원인인 것으로 밝혀져 왔다. 예컨대, 종양세포는 전체 후성유전체 (epigenome)를 포함하는 염색질 구조에서 광범위한 변화를 나타내며, 세포 재생과 관련된 전체 경로가 후성적 조절장애를 받게 된다 (Jones and Baylin, 2007). 최근 몇몇 연구결과들은 후성적 돌연변이가 상염색체 우성 다낭신을 비롯한 신장 발병과 관련되어 있으며, 변화된 후성인자의 가역적 회복이 부작용을 최소화하면서 신장질환을 치료하는 강력한 방법이 될 수 있음을 밝혔다 (Li, 2011; Park, et al., 2011a; Vasyutina and Treier, 2010). 그렇지만, 전체 후성유전체 또는 상염색체 우성 다낭신 관련 DNA 메틸화 프로파일링은 분석된바 없었다.

또한, 지금까지 많은 다낭신 치료약제들이 개발되고 있지만, 부정적인 피드백 저해로 인해 실망스러운 임상결과들이 보고되었다.

본 발명은 상염색체 우성 다낭신 질환 개선에 좀 더 효과적인 약제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 다낭신 환자 및 다낭신을 앓고 있지 않은 사람들로부터 얻은 신장조직에서 게놈-전체의 메틸화 상태를 분석하였다. 이 분석은 메틸화된-CpG-결합 도메인 (Methylated-CpG-binding Domain; MBD) 단백질 친화 컬럼을 이용한 메틸화 DNA 축적에 의존적인 MIRA-seq (methylated-CpG island recovery assay with parallel sequencing)를 이용하여 수행한 후 정제된 조각들을 확인하고 정량하기 위해 딥 시퀀싱하였다. 또한 본 발명자들은 다르게 메틸화된 유전자들의 발현 변화를 시험하였고, 후성적 침묵화 (epigenetic silencing)가 세포 수송, 접합 및 세포분화를 제어하는 주요경로 즉, Notch, Wnt 및 mTOR 신호전달경로에 관여하는 유전자들에서 중요함을 마이크로어레이 분석을 통해 밝혔다. 좀 더 특이하게는, 본 발명자들은 비다낭신과 비교하여 다낭신 환자의 PKD1 유전자 몸체가 과메틸화 (hypermethylation)됨을 발견하였다. 이 과메틸화는 MBD 단백질의 결합을 유도하였고, 이는 PKD1 유전자의 후성적 침묵화가 신장 낭포 발달에 관여함을 가리킨다. 인비트로 낭포형성 모델은 DNA 메틸화 저해제들이 후성적 침묵화를 효과적으로 제거하여 낭포 형성을 저해함을 보여주었고, 상염색체 우성 다낭신 진행에서 이러한 후성적 기작의 역할을 확인해 주었다. 본 발명자들은 게놈 전체에 걸친 메틸화 상태 변화와 다낭신의 낭포형성과의 관계를 밝혔고, 이는 다낭신 치료에 응용할 수 있을 것으로 사료된다.

본 발명은 DNA 메틸화 저해제를 포함하는 상염색체 우성 다낭신 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 DNA 메틸화 저해제로는 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 5-aza-dC (5-aza-2'-deoxycytidine) 또는 제뷸라린임을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물은 하나 또는 그 이상의 다낭신 치료제 또는 개선제와 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 유효 성분 외에도 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 포함할 수 있으며, 이러한 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 가용화제 등이 있다.

또한 본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

다낭신 개선을 위해 사용되는 본 발명의 약제는 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함한 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 하나 이상의 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 이러한 조성물은 투여 후 활성 성분의 빠른 방출, 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.

본 발명의 조성물은 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 복강 내, 흉골 내, 경피, 비측 내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구 내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 치료 방법에 있어서, "유효량"은 다낭신을 개선하거나 낭포형성을 억제하는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 본 발명의 유효 성분의 "유효량"은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, DNA 메틸화 저해제 화합물은 0.1ng/㎏~10㎎/㎏의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명자들이 실험한 결과, 이온전달 및 세포접합과 관련된 PKD1 및 다른 유전자들은 유전자 몸체 부분에서 과메틸화되었고, 그들의 발현은 다낭신 환자의 신장조직에서 하향조절되었다. 특히, PKD1은 다낭신 유전자 몸체 부분에서 과메틸화되었고 이것은 MBD2 (methyl-CpG-binding domain 2) 단백질 결합과 연관되어 있었다. 뿐만 아니라, DNA 메틸화 저해제 처리는 Pkd1 발현의 상향조절을 수반하며 MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) 세포의 낭포 형성을 지연시켰다.

따라서, 본 발명은 DNA 메틸화 저해제를 이용하면, PKD1 유전자 몸체의 과메틸화를 억제함으로써 상염색체 우성 다낭신의 치료 또는 개선이 가능함을 제시한다.

도 1은 비 다낭신 및 다낭신 신장조직에서 선택된 유전자의 발현 수준을 확인한 것이다. (A) 유전자 몸체 부분에서 극적으로 다른 메틸화 수준을 나타내는 유전자들의 발현 수준을 정량적 실시간 RT-PCR로 확인한 것이다. 비 다낭신 (n=3) 및 다낭신 (n=5) 신장 조직을 이용하였다. 선택된 유전자의 DNA 메틸화 수준은 프로모터와 유전자 몸체 부분에 대하여 MIRA-seq 분석으로 CMES로 나타내었다. 선택된 Notch/Wnt/mTOR 신호전달경로 유전자 셋트에서 유전자 발현 및 DNA 메틸화는 변화하였다. (B) 유전자 온톨로지 셋트; 전달 (SLC6A19), 칼슘 신호 (CACNA1H, LAT), 형태형성 (SALL1, COL6A3), 히스톤 변형 (JMJD3)을 나타낸다. 각 막대의 높이는 평균값을 나타내고, 오차막대는 ± 표준편차를 나타낸다. β-액틴은 내부 대조군으로 이용되었다. 실험은 세 번씩 수행하였다. P < 0.05, GB: 유전자 몸체 (gene-body), PR: 프로모터.
도 2는 PKD1 유전자 몸체 부분의 과메틸화가 그 발현 조절과 관련있음을 나타낸다. (A) PKD1 DNA 메틸화 프로파일은 dCMES 도표로 나타내었다. (B) 총 메틸화 질량은 3인의 비다낭신 및 7-8인의 다낭신 환자의 유전자 몸체 및 프로모터 부위를 표시하는 프로브에서 CpG 부위 근처의 메틸화 수준 백분율 (파이로시퀀싱으로 결정된 것)을 더함으로써 계산하였다 (A의 붉은 화살표). (C) 8인의 다낭신 환자 시료 (적색 원)와 3인의 비다낭신 신장 시료 (청색 원) 중 PKD1 발현과 유전자 몸체 DNA 메틸화의 관계를 나타낸다. (D) 낭포 표피세포에서 PKD1 유전자 몸체 메틸화와 발현 수준의 음의 상관관계를 나타낸다. WT9-12 세포에서 탈메틸화제인 5-aza-dC를 처리 (2 μM 및 4 μM, 72시간 동안)하였을 때 대표적인 PKD1 유전자 몸체 (프로브 1) 및 프로모터 CpG 아일랜드 부위 (프로브 2)의 DNA 메틸화 변화를 중아황산염 파이로시퀀싱으로 확인하였다. PKD1 mRNA 수준이 5-aza-dC 처리로 회복되었음을 정량적 실시간 RT-PCR로 나타내었다. 각 막대의 높이는 평균값을 나타내고, 오차막대는 ± 표준편차를 나타낸다. β-액틴은 내부 대조군으로 이용되었다. 비록 PKD1 유전자 몸체 메틸화 수준이 5-aza-dC 처리로 약간 회복되었지만, 이는 PKD1 유전자 발현 수준에 영향을 미친다. 양 실험은 모두 세 번씩 수행하였다. P < 0.05.
도 3은 DNA 메틸화 저해제 처리가 인비트로 낭포형성을 저해함을 나타낸다. (A) DNA 메틸화 저해제 5-aza-dC 2 μM 및 제뷸라린 (zeb) 100 μM로 처리한 MDCK 세포를 3D 콜라센 젤에서 10일간 배양하였다. MDCK 세포에서 낭포 형성은 4일째부터 시작되었다. 대조군 세포에서 낭포 내강 크기는 커졌으나, DNA 메틸화 저해제를 처리한 세포에서는 그렇지 않았다. (B) 낭포 내강 크기의 확장은 9-10일 동안 현미경의 3개 필드에서 무작위로 선택한 31-38개의 MDCK 세포에서 측정하였다. ***, P < 0.001 (C) 10일째 5-aza-dC 및 제뷸라린 처리로 Pkd1 유전자 몸체 부위에서 DNA 메틸화 제거를 세 번 파이로시퀀싱하여 확인하였다. P < 0.05 (D) 3D MDCK 세포 배양액에서 DNA 메틸화 저해제 처리로 인한 DNA 탈메틸화는 Pkd1 유전자 발현을 회복시켰다. Pkd1 발현 수준은 정량적 실시한 RT-PCR (세 번)로 측정하였고, β-액틴을 내부 로딩 대조군으로 이용하여 표준화하였다. ***, P < 0.001
도 4는 Pkd1 과메틸화 부위가 MBD2와 억제성 히스톤 마커의 결합을 유도함을 보여준다. (A) Pkd1 유전자 몸체 부위에서 MBD2의 축적을 나타낸다. 3D 배양된 MDCK 세포 핵 추출물로 지시된 유전자 부위에서 MBD2 및 MECP2 ChIP-qPCRs를 수행하였다. (B) hL1-5'UTR에서 분화된 MECP2의 축적을 나타낸다. MECP2 IP의 효율을 확인하기 위해 MECP2 특이적 타겟 부위인 hL1-5'UTR에서 ChIP-qPCR을 수행하였다. (C) 메틸화된 CGI 부위에서 MBD2 축적을 나타낸다. 핵 추출물은 처음에는 HinP1으로 절단하여 메틸화되지 않은 CGI 분획을 얻었고, 남은 침전 분획은 MspI으로 좀더 절단하여 메틸화된 CGI 분획을 얻었다. 각 CGI DNA 분획은 RT-qPCR의 주형으로 이용하였다. 정량을 위해 IgG 대조군 ChIP-qPCR에 대한 비율을 이용하였다. (D) 개 Mbd2를 타겟으로 하는 siRNA는 3D-배양된 MDCK 세포에서 Pkd1 mRNA 수준 저하를 방해하였다. 대조군 및 개 Mbd2 siRNA는 15 nM 농도로 MDCK 세포 내로 48시간 동안 트랜스펙션시켰다. β-액틴은 내부 대조군으로 이용하였다. 실험은 세 번씩 수행하였다. **, P < 0.01 (E) 개 Mbd2 siRNA 트랜스펙션된 세포에서는 대조군 siRNA가 트랜스펙션된 세포와 비교하여 낭포 형성이 감소하였다. 개 Mbd2 siRNA와 대조군 siRNA를 MDCK 세포 내로 트랜스펙션하고, 포스콜린 (5 μM)을 처리하고 6일간 3D 배양을 수행하였다. 낭포 내강 크기는 6일째 현미경의 필드에서 무작위로 선택한 46-48 MDCK 세포에서 측정하였다. ***, P < 0.001 (F) 지시된 히스톤 항체 및 PCR 프라이머 위치로 MDCK 세포의 Pkd1 유전자 몸체 부위에서 히스톤 ChIP-qPCR을 수행하였다. y축은 무처리 대조군과 비교한 5-aza-dC 처리군의 Pkd1 mRNA 수준의 비를 나타낸다. 모든 실험은 세 번 이상 반복 실시하였다.
도 5는 신세포암종 및 다낭신 환자에서 얻은 신장의 조직병리학을 나타낸다. 대표적인 H&E 염색 신장 절편 (확대율 100x 및 200x, 크기막대 100 ㎛)을 나타낸다. (A) 신세포암종에서 얻은 정상 신장절편은 정상적인 신장조직을 나타내며, 종양 또는 낭포의 증거를 찾아볼 수 없었다. (B-D) 다낭신에서 얻은 신장에서는 수많은 낭포가 관찰되었다. G: 신사구체 (glomerulus), Cy: 낭포.
도 6은 비다낭신 신장조직 및 신세포암종 세포주에서 추정 종양억제유전자의 발현수준을 보여준다. 세 개의 비다낭신 신장조직 및 신세포암종 세포주, 786-O 및 ACHN을 이용하여 정량적 실시간 RT-PCR로 6개의 유전자 발현수준을 측정하였다. mRNA 수준은 β-액틴을 내부 로딩 대조군으로 이용하여 정상화하였다. P < 0.01.
도 7은 낭포 성장에 대한 DNA 메틸화 저해제에 의한 Pkd1 재발현 저해효과를 나타낸다. (A) MDCK 세포는 3D 콜라겐 젤에서 12일간 배양하였고 4일째 낭포 구조 형성을 시작하였다. DNA 메틸화 저해제인 5-aza-dC 2 μM 및 제뷸라린 (zeb) 100 μM를 5일째부터 3D 콜라겐 내의 MDCK 세포에 가하였다. (B) DNA 메틸화 저해제는 Pkd1 발현 수준을 회복시켰고, 낭포구조 형성이 이미 시작되었지만 낭포성장을 저해하였다. Pkd1 mRNA 수준은 정량적 실시간 RT-PCR로 측정하였고, β-액틴을 내부 로딩 대조군으로 이용하여 정상화하였다. *, P < 0.05; ***, P < 0.001.

아래에서는 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀더 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재범위 내로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

실시예 1: 신장조직 시료와 게놈 DNA 분리

본 연구는 헬싱키 선언에 따라 서울대학교 병원 임상연구 심의위원회의 승인 (H-0701-033-195)을 받아 수행되었고, 모든 환자의 동의를 받았다. 본 발명자들은 신장절제수술을 받은 상염색체 우성 다낭신 환자들의 신장 피질 주변부 낭포로부터 제거된 신장 낭포 조직을 얻었다. 대조군으로 투명 신세포암종 (clear cell renal cell carcinoma) 수술을 받은 환자에게서 비종양성, 비-다낭신 신장 조직을 얻었고, 악성 세포침윤은 조직학적으로 분석하여 제외하였다. 시료의 자세한 내용은 표 1에 요약되어 있다.

실시예 2: MIRA

MIRA는 종래 개시된 것과 같이 수행하였다 (Rauch, et al., 2006). 종래 기술을 약간 변형하여 GST-표지된 MBD2b 및 His-표지된 MBD3L1 단백질을 제조하였다. 게놈 DNA (15 ㎍)는 음파처리로 100-500 bp로 조각내고 28 ㎍의 정제된 GST-MBD2b 단백질, 28 ㎍의 His-MBD3L1 단백질 및 7 ㎍의 JM110 박테리아 RNA와 함께 오버나잇 배양하였다. JM110 박테리아 DNA로 미리 블로킹된 MagneGST 비드 (30 ㎕, Promega, USA)를 시료에 가한 후 최종 부피 600 ㎕의 MIRA 결합 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 3 mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 5% 글라이콜, 25 ㎍/㎖ BSA) 내에서 두 시간 동안 회전하며 4 ℃로 배양하였다. 비드는 1 ㎖의 세척 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100)으로 세 번 세척하고, RNase A (100 ㎍, Qiagen) 및 단백질 분해효소 K (15 ㎍, Qiagen)이 들어있는 TE 30 ㎕와 함께 30 분간 56 ℃에서 배양한 다음 실온에서 5분 배양한 후 메틸화된 조각을 용출시켰다. 용출된 DNA 조각들은 QIAquick PCR purification kits (Qiagen)를 이용하여 더 정제하였다.

실시예 3: 총 RNA 분리 및 마이크로어레이 혼성화

비-다낭신 및 다낭신 환자의 신장조직으로부터 NucleoSpin® RNA Kit (MACHEREY-NAGEL, Germany)를 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 Affimetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST Array로 300 ng의 각 RNA 시료를 이용하였다 (http://www.affymetrix.com). 마이크로어레이 셋 GEO 승인번호는 GSE35831이었다.

실시예 4: 세포주 및 약물 처리

MDCK 세포는 10% (v/v) 우태혈청 및 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 DMEM/F12 (Welgene, Korea) 배지에서 배양하였다. 상염색체 우성 다낭신 낭포 라이닝 피질 표피세포 WT9-12 (Loghman-Adham, et al., 2003)는 10% (v/v) 우태혈청 및 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 DMEM/F12 (Welgene, Korea) 배지에서 배양하였다. 이 세포들은 37 ℃에서 5% CO₂ 및 95% 공기의 습한 조건에서 배양하였다. 이 세포들은 2~4 μM의 5-aza-dC (5-aza-2'-deoxycytidine, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 또는 100 μM 제뷸라린 (zebularine; Calbiochem, San Diego, California, USA)으로 14일간 처리하였다. 배지는 하루 또는 이틀마다 갈아주었고, 새로운 5-aza-dC 또는 제뷸라린을 가해주었다.

실시예 5: siRNA 트랜스펙션

개의 Mbd2를 타켓으로 하는 siRNA (sense 5'-GAGAUGAGGCCUAAGAGUAtt-3', antisense 5'-UACUCUUAGGCCUCAUCUCtt-3')가 Bioneer Inc.에 의해 디자인되어 공급되었다. 대조군 siRNA는 Santa Cruz Biotechnology (sc-37007)에서 입수하였다. siRNA는 세포를 100 ㎠ 배양접시에 시딩한 후 하루가 지나서 Lipofectamine RNAiMAX reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 MDCK 세포 내로 트랜스펙션되었다. 이후의 실험은 트랜스펙션 24시간 후 수행하였다.

실시예 6: 중아황산염 처리 및 파이로시퀀싱

게놈 DNA는 인간 신장 피질조직 및 MDCK 세포에서 DNA 메틸트랜스퍼레이즈 (DNMT) 저해제를 처리하기 전과 후에 NucleoSpin^®TriPrep Extract kit (MACHEREY-NAGEL)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 분리하였다. 게놈 DNA의 중아황산염 처리에 EZ DNA Methylation-Gold kit™ (ZYMO Research, USA)를 제조자의 지시에 따라 이용하였다. 처리한 DNA는 HotStar Taq^® Plus DNA polymerase (Qiagen)를 이용하여 PCR 증폭하였다. 프라이머는 Pyrosequencing™ Assay Design Software version 1.0 (Biotage AB, Uppsala, Sweden)으로 디자인하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 95 ℃로 5분; 94 ℃로 30초, 55 ℃로 1분 및 72 ℃로 45초를 44사이클; 72 ℃로 7분. PCR 산물은 PyroMark™ MD (Biotage AB) (Tost and Gut, 2007)를 이용하여 파이로시퀀싱하였다. 표 S6에는 각 유전자에 대한 파이로시퀀싱 프라이머 목록이 있다. 증폭된 부분에 포함된 모든 CpG 부위의 메틸화 추정치는 분석된 부분별 메틸화의 단일 추정값 (백분율)을 얻기 위해 평균을 내었다.

실시예 7: 정량적 실시간 RT-PCR

위와 같이 분리된 RNA (3 ㎍)는 M-MLV 역전사효소 (Promega), 100 nM oligo-dT, 1 mM dNTP 혼합물 및 RNase 저해제를 이용하여 역전사되었다. 인간 GAPDH (forward 5'-ATCGTGGAAGGACTCATGACCACA-3', reverse 5'-AGAGGCAGGGATGATGTTCTGGA-3'), 인간 β-actin (forward 5'-AAGGCCAACCGCGAGAAGAT-3', reverse 5'-CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC-3') 및 개 β-actin (forward 5'-GAGCGAGCATCCCCCAAAG-3', reverse 5'-GCAAGGGACTTCCTGTAAC-3')을 양성 대조군으로 이용하였다. 사용된 다른 프라이머의 서열은 표 S5에 나타내었다. 정량적 실시간 RT-PCR은 제조자의 지시에 따라 real-time SensiMixPlus SYBR kit(Quantance, London, UK)를 이용하여 수행하였다.

실시예 8: 일루미나 게놈 분석기 서열분석

일루미나 게놈 분석기 서열분석을 위해 용출된 MIRA DNA 100 ng을 사용하였다. 한 쌍의 Solexa 어댑터 접합 (ligation) 이후, 175 bp 및 300 bp 접합 산물을 2% 아가로즈 젤 상에서 정제한 후 PCR 증폭하였다. 클러스터 형성 및 36 사이클의 시퀀싱을 제조자의 지시대로 수행하였다. 본 발명자들은 2-4 pM의 어댑터가 연결된, 크기에 따라 분획된 DNA를 일루비나 게놈 분석기 상의 주형 혼합물 120 ㎕에서 시퀀싱하였다. Solexa Analysis Pipeline (version 0.3.0)을 이용하여 서열 태크를 인간 게놈 (UCSC hg18 database, based on NCBI Build 36.1 assembly)에 대해 맵핑하였다. 34 bp (처음과 끝 뉴클레오타이드는 제외함)의 시퀀스 리드가 얻어졌다.

실시예 9: 데이타 프로세싱 및 MES (methylation enrichment score) 계산

메틸화된 DNA 조각의 실제 위치를 확인하기 위해 데이타를 종래 기술과 유사한 방법으로 분석하였다 (Choi, 2010; Choi, et al., 2009). size fractionation (최대 200 bp)에 따라 34-bp 리드를 3' 말단 쪽으로 연장하였다. 결과는 UCSC genome browser (http://genome.ucsc.edu)에서 시각화하기 위해 BED (browser extensible data) 파일로 변환하였다. 우리는 200-bp 길이의 단편들에서 겹치는 서열 태그를 계수하였다. MES (methylation enrichment score)는 (타겟 리드 수/타겟 크기)/(총 리드 수/게놈 크기)의 log₂로 계산하였고, DNA 메틸화 수준의 추정치로 이용되었다 (Choi, 2010; Park, et al., 2011b). CMES 값은 MES를 타겟 내의 CpG 부위 수로 나누어 얻었다. 나타난 CpG 수가 0이면, CMES 값은 0이다. 이 연구를 위해 프로모터는 전사개시부위를 기준으로 -1000부터 +600 bp까지 또는 -1000부터 +1까지의 bp의 부분으로 정의하였다.

실시예 10: 데이타 통합

Solexa 시퀀싱 데이타와 마이크로어레이 데이타는 statistical programming environment R (version 2.11.0)을 이용하여 annotated mRNA accession identifiers에 기초하여 도출되었다. 중요한 프로브 리스트에 대한 교토 유전자 및 게놈 백과사전 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; KEGG) 경로분석은 DAVID Functional Annotation tool (Dennis, et al., 2003)을 이용하여 수행하였다.

실시예 11: 3차원 세포배양

3차원 콜라겐 Ⅰ젤은 최종 젤 농도 3.8 ㎎/㎖를 얻기 위해 같은 양의 10× 재구성 완충액 (262 mM 중탄산나트륨, 20 mM HEPES, pH 7.6)과 충분한 배양배지를 가하여 랫트 꼬리 콜라겐 (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA)으로부터 제조하였다. MDCK 세포는 2.5 × 10⁵ 내지 3 × 10⁶ cells/㎖ 농도로 용액에 즉시 가하였다. 용액은 35-mm 디쉬로 옮긴 다음 37 ℃까지 올려주었다. 24시간 후 젤이 형성되었을 때, 1% (v/v) 우태혈청을 함유한 DMEM/F12 (Welgene)를 가하였다. siRNA로 트랜스펙션된 세포 또한 낭포 형성을 촉진하기 위해 직접 아데닐레이트 사이클레이즈 활성화제인 포스콜린 (forskolin) 5 μM의 존재 하에 같은 방식으로 3D 배양하였다.

실시예 12: 위상차 이미지 획득

콜라겐 젤 내 MDCK 낭포 구조의 위상차 이미지는 10× 및 40× 대물렌즈를 갖춘 Olympus IX70 현미경을 이용하여 배양 후 1, 4, 6, 8 및 10일째 촬영하였다. 개별 낭포의 크기는 선행 연구에 기재된 대로 평가하였다 (Park, et al., 2009).

실시예 13: 염색질 면역침전 (ChIP)

염색질 면역침전은 종래기술에 따라 약간 변형하여 수행하였다 (Thomson, et al., 2010). 세포는 플레이트에서 배양하였고, 1% 파라포름알데하이드로 고정시킨 다음 -80℃에서 보관하였다. 모은 세포는 RIPA 완충액 (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1 mM Na₂EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% 데옥시콜린산나트륨, 2.5 mM 소듐 파이로포스페이트, 1 mM Na₃VO₄, 단백질 저해제 칵테일)로 3매 10분마다 격렬하게 교반하며 30분간 용균하였다. 핵 분획은 13000×g로 30분간 원심분리하여 얻었다. 이 분획은 MspI 효소 분해로 메틸화된 CpG 아일랜드 (Me-CGIs)를 제조하는데 이용하였고, 다음으로 메틸화되지 않은 CGIs는 HinP1 효소 분해로 얻었다. 염색질은 선행 논문에 따라 제조하였다 (Thomson, et al., 2010). MBD2 특이적 항체 (Santa Cruz Biotechnology, sc-9397), MECP2 특이적 항체 (Abcam, ab2828), H3K4me3 특이적 항체 (Upstate, 17-614), H3K9me3 특이적 항체 (Abcam, ab8898), H3K27me3 특이적 항체 (Abcam, mAbcam6002), H3K36me3 특이적 항체 (Abcam, ab9050) 및 H3KAc 특이적 항체 (Upstate, 06-599)는 구입하였다.

실시예 14: 조직학적 분석

포르말린으로 고정시킨 인간 신장조직은 파라핀에 포매하고 5 ㎛ 두께로 절단하였다. 절편들은 조직학적 분석을 위해 표준 방법에 따라 재수화하고 H&E (hematoxylin and eosin) 염색하였다.

실시예 15: 인간 신세포암종 세포주

786-O 및 ACHN 인간 신세포암종 세포주는 숙명여대 임종석 교수가 제공하였다. 세포들은 10% (v/v) 우태혈청 및 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 RPMI1640 (Welgene, Korea) 배지에서 37 ℃, 5% CO2 및 95% 공기 조건에서 배양하였다.

실시예 16: 3차원 세포배양 및 약물처리

3차원 콜라겐 Ⅰ젤은 최종 젤 농도 3.8 ㎎/㎖를 얻기 위해 같은 양의 10× 재구성 완충액 (262 mM 중탄산나트륨, 20 mM HEPES, pH 7.6)과 충분한 배양배지를 가하여 랫트 꼬리 콜라겐 (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA)으로부터 제조하였다. MDCK 세포는 2.5 × 10⁵ 내지 3 × 10⁶ cells/㎖ 농도로 용액에 즉시 가하였다. 용액은 35-mm 디쉬로 옮긴 다음 37 ℃까지 올려주었다. 24시간 후 젤이 형성되었을 때, 1% (v/v) 우태혈청을 함유한 DMEM/F12 (Welgene)를 가하였다. 배지는 매일 갈아주었다. 5일 후 신선한 5-aza-dC (5-aza-2'-deoxycytidine; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 2~4 μM 또는 제뷸라린 (zebularine; Calbiochem, San Diego, California, USA) 100 μM을 3D 콜라겐 내의 MDCK 세포에 14일간 가하였다. 콜라겐 젤 내 MDCK 낭포 구조의 위상차 이미지는 10× 및 40× 대물렌즈를 갖춘 Olympus IX70 현미경을 이용하여 배양 후 3, 5, 8, 10 및 12일째 촬영하였다. 개별 낭포의 크기는 선행 연구에 기재된 대로 평가하였다 (Park, et al., 2009).

실시예 17: 정량적 실시간 RT-PCR

3D 배양한 MDCK 세포에서 mRNA의 발현은 정량적 실시간 RT-PCR로 확인하였다. 3D 배양 2주 후 3D 콜라겐 젤 내의 MDCK 세포는 MDCK 낭포세포를 얻기 위해 콜라제네이즈 (최종 농도 2 ㎎/㎖)로 처리하고 37 ℃, 5% CO2 및 95% 공기의 습한 조건에서 두 시간 동안 배양하였다. 총 RNA는 콜라제네이즈 처리한 MDCK 세포에서 NucleoSpin^®RNA Kit (MACHEREY-NAGEL, Germany)를 이용하여 제조자의 지시대로 분리하였다. M-MLV 역전사효소 (Promega), 100 nM oligo-dT, 1 mM dNTP 혼합물 및 RNase 저해제를 이용하여 총 RNA 5 ㎍을 역전사하였다. Rotor-Gene 3000^®(Corbett Robotics, San Francisco, CA) 내 real-time SensiMixPlus SYBR kit (Quantance)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 실시간 PCR을 수행하였다. 개의 β-액틴 (forward 5'-GAGCGAGCATCCCCCAAAG-3', reverse 5'-GCAAGGGACTTCCTGTAAC-3')을 양성 대조군으로 이용하였다. 비-다낭신 조직 및 신세포암종 세포주 간 여섯 개의 종양억제유전자들의 mRNA 수준은 상기 정량적 실시간 RT-PCR로 확인하였다. 사용된 프라이머 서열은 표 S6에 나타내었다. PCR 조건은 다음과 같다: 95 ℃로 15분; 95 ℃로 10초, 60 ℃로 15초 및 72 ℃로 20초를 40사이클.

결과 1: 신장 낭포의 게놈 전체 DNA 메틸화 상황

3인의 다낭신 환자에서 얻은 낭포 신장피질 시료 및 3인의 비다낭신, 투명 신세포암종 환자에서 얻은 비다낭신 신장 피질조직 (표 1)에 대한 MIRA-seq 분석을 이용하여 게놈 전체의 DNA 메틸화 변화를 분석하였다. 비다낭신 신장조직은 신세포암종 환자에서 얻은 정상적인 신장 일부였다. 비다낭신 신장조직에서는 낭포 형성이 발견되지 않았지만, 다낭신 신장조직에서는 많은 낭포가 발션되었다 (도 5). 뿐만 아니라, 신세포암종 세포주인 786-O 및 ACHN과 비교할 때 비다낭신 신장 시료의 정량적 실시간 RT-PCR 분석은 명확한 종양 관련 유전자 발현 징후를 나타내지 않았다. 비다낭신 신장시료에서 종양세포 오염이 없다는 사실은 투명 신세포암종에서 침묵하는 것으로 알려진 여섯 개의 유전자 발현 수준으로 확인하였다 (Dalgin, et al., 2008). 신세포암종 세포주 모두에서 이 유전자들이 강력하게 침묵하는 것과 대조적으로 본 발명에 이용된 투명신세포암종 환자 유래 비다낭신 신장조직에서는 이 유전자들이 높은 발현수준을 나타내었고 (도 6), 이는 대조군 시료에서 명확한 이상이 나타나지 않음을 확인해주는 것이다. 이 결과를 볼 때 본 발명에 사용한 투명 신세포암종 환자에서 얻은 비다낭신 신장조직은 다낭신 시료의 정상적인 대응물로 이용할 수 있음을 알 수 있다.

MIRA-seq 결과는 실시예에 기재된 대로 게놈 전체를 통하여 매 200 bp에 대하여 메틸화 수준으로 변환하였다. 한 부분에서 서열분석된 조각의 출현빈도는 그 부분의 CpG 메틸화 수준을 반영한다. 모아진 비다낭신 조직의 MIRA-seq는 백만 개 서열 리드당 1백만 개의 구분되는 CpG 부위로부터 서열결정된 3천4백만 개 CpGs를 얻은 반면, 3인의 다낭신 조직에 대한 모든 MIRA-seq는 백만 개 서열 리드당 약 700,000 개의 구분되는 CpG 부위로부터 평균 6천8백만 개 CpGs를 나타내었다 (표 2). 비다낭신 시료에 비하여 다낭신 조직에서 회수된 CpG 조각의 서열 빈도가 높았다는 사실은 다낭신 게놈에서 CpG 부위의 분획이 현저히 과메틸화되었음을 말해준다.

결과 2: 세포 분화 및 이송 관련 경로의 전사 침묵화

다낭신에서 다르게 메틸화된 유전자들의 역할을 연구하기 위해, 본 발명자들은 유전자 온톨로지 분석을 수행하였다. 우리는 칼슘 신호전달, 축색돌기 유도 (axon guidance), 세포 접합, 이온 수송, Notch 및 GnRH 신호전달과 관련된 유전자들이 과메틸화를 위해 많이 축적되어 있는 반면, 적은 수의 저메틸화된 유전자에서는 명확하게 기능적으로 그룹화를 할 수 없음을 발견하였다 (표 3). 세포 수송과 관련된 유전자들 (ZFAT, OSTalpha, P2RX4, ATP4B, TRPV1 및 SLC22A18), 칼슘 신호전달과 관련된 유전자들 (LCK, CHRNA10, CLDN9, TRPC3, CLDN19 및 CACNA1H), 세포 형태형성과 관련된 유전자들 (BCL2, LIG1, SALL1, SOX10, FOXI1 및 THEM176B), 세포접합과 관련된 유전자들 (SYMPK, SPG7, SEMA4D, LGALS4, DSG4 및 MUC5B)의 후성적 변형이 신장 낭포에서 주요 기능의 비정상화를 반영하는 것으로 보인다. 특히, 제거되었을 때 상염색체 우성 다낭신의 주요 원인이 되는 유전자로 알려진 PKD1은 다낭신에서 많이 메틸화된 것을 발견하였는데, 이는 PKD1의 후성적 침묵화가 낭포형성에 영향을 미칠 수 있음을 가리킨다. 세포분화경로의 조절에 관여하는 유전자들 (NOTCH1, NOTCH2, DTX1, CCDC88C, CSNK1G2, WNT4, WNT7, WNT9, WNT11 및 DVL) 또한 과메틸화되었다 (표 2). 또한, 염색질 리모델링에 관여하는 몇몇 유전자들 (HDAC1, DOT1L, JMJD3, EHMT1, MBD3L1 및 EHMT2)도 다낭신 낭포 신장에서 과메틸화되었다. 이들 유전자의 과메틸화와 발현 하향조절의 관계는 실시간 qRT-PCR로 확인되었다 (도 1a, 1b). 중요한 것은, 이 데이타들이 이 유전자들의 유전자 몸체 과메틸화가 유전자 침묵화에 영향을 미친다는 것을 암시한다는 점이다. 유전자 몸체 과메틸화는 이 전사인자들의 기능에 영향을 미치고 비정상적인 낭포 형성을 유발할 것이다. 종합하면, 정상적 신장 발달에 필요한 유전자의 유전자 몸체 메틸화는 낭포형성에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다.

결과 3: PKD1 유전자 몸체 부분의 과메틸화

나아가, 다낭신에서 낭포형성을 유도하는 주요 원인 유전자인 PKD1에 대하여 본 발명자들은 낭포 발달에 미치는 PKD1 과메틸화의 영향을 분석하였다. 본 발명자들은 게놈 전체 분석에 사용된 2인의 시료 외에 다섯 사람의 다낭신 환자 시료를 더하여 PKD1 유전자의 프로모터와 3'말단에 위치한 두 군데의 선택된 부분 (프로브 1 및 프로브 2)에 대하여 중아황산염 처리한 DNA의 파이로시퀀싱을 수행하였다 (도 2a). 게놈 전체 메틸화 데이타에 따라, 본 발명자들은 모든 다낭신 환자에서는 PKD1 유전자 몸체 부분이 과메틸화되었지만, 시험대상인 모든 비다낭신 및 다낭신 환자 시료에서 프로모터 부분은 메틸화되지 않은 채로 남아 있음을 발견하였다 (도 2b).

PKD1 발현 수준의 시험은 발현 수준과 메틸화 수준 간의 음의 상관관계를 분명히 보여주었다 (도 2c). 다낭신에서 PKD1 유전자 몸체 DNA 메틸화의 효과를 확인하기 위해 DNA 메틸화 저해제인 5-aza-dC를 불멸화된 인간 상염색체 우성 다낭신 낭포 라이닝 표피세포 (WT9-12)에 처리하였다. PKD1 유전자 몸체 탈메틸화는 프로모터 부위에는 아무런 영향이 없었으나 PKD1 mRNA 수준이 증가하였음을 관찰할 수 있었다 (도 2d). 이러한 결과는 유전자 몸체 메틸화와 관련된 PKD1 발현 조절이 낭포 발달과 관련되어 있음을 말해준다.

결과 4: DNA 메틸화 저해제에 의한 인비트로 낭포형성 억제

낭포형성에서 과메틸화의 역할을 시험하기 위해 본 발명자들은 인비트로 낭포형성 모델을 이용하였다. 개의 신장 세포주 MDCK는 콜라겐 I형 매트릭스에 포매되었을 때 일시적인 낭포형성을 진행하는 잘 알려진 낭포 신장질병 모델인데, 이 모델에서 Pkd1 유전자의 과발현이 낭포 형성을 지체시켰다 (Boletta, et al., 2000). 우리는 3D MDCK 배양액에서 낭포 발달에 미치는 두 개의 DNA 메틸화 저해제, 5-aza-dC (5-aza-2'-deoxycytidine) 및 제뷸라린의 영향을 시험하였다. 파이로시퀀싱에서 탐지된 Pkd1 유전자 몸체의 메틸화 수준은 메틸화 변화의 대표적 마커로 이용되었다. DNA 메틸화 저해제 처리는 낭포 성장을 현저히 억제하였고 (도 3A, 3B), 이는 DNA 메틸화 수준의 분명한 변화 및 Pkd1 발현 수준 증가와 동시에 일어난다 (도 3D). 뿐만 아니라, MDCK 세포 3D 배양 시스템에서 낭포 형성이 시작될 때 4일 후 DNA 메틸화 저해제 처리는 낭포 성장속도 지연을 유도하였다 (도 7). 이러한 결과들은 MDCK 세포에서 Pkd1의 높은 발현수준이 세포증식 감소 및 자기세포사멸로 인해 낭포 성장을 억제하였다는 보고 (Boletta, et al., 2000)와 일치한다. 따라서, 이러한 결과들은 DNA 메틸화의 변화가 Pkd1을 비롯하여 표피세포에서 낭포 발달에 관여하는 유전자들의 조절에 중요한 역할을 수행함을 말해준다.

결과 5: PKD1 유전자 몸체의 과메틸화에 대한 MBD2의 결합유도

인비트로 낭포형성 동안 PKD1 조절 기저의 분자적 기작을 연구하기 위하여 본 발명자들은 과메틸화된 PKD1 유전자 부위에 결합하는 인자들을 확인하여 보았다. 우리는 ChIP-qPCR (chromatin immune-precipitation quantitative PCR)을 이용하여 Pkd1 유전자 몸체 부위에 두 개의 대표적인 MBD (Methylated-CpG-binding Domain) 단백질인 MBD2와 MECP2 (methyl CpG binding protein 2)가 결합하는지 여부를 시험하였다. 우리는 MECP2가 아닌 MBD2가 Pkd1 유전자 몸체 부위에 특이적으로 결합됨을 발견하였다 (도 4A). 그렇지만, 이 단백질들은 활발하게 전사되는 β-액틴 유전자의 프로모터 부위에서는 발견되지 않았다. 대조군 실험에서, MECP2는 MECP2의 주요 타겟으로 알려진 hL1-UTR 반복 부분 (Muotri, et al., 2010)에 강하게 부착되는 것으로 나타났고, 그리하여 ChIP 결과에서 실험적 오류의 가능성을 배제하였다 (도 4B). 메틸화된 DNA에 대한 MBD2 결합의 특이성을 좀 더 확인하기 위해 종래 기술 (Thomson et al. 2010)과 같이 메틸화에 민감한/민감하지 않은 효소의 순차적 분해 이후 메틸화된/메틸화되지 않은 CGI ENA 조각들을 정제하였고, ChIP-qPCR로 MBD2 결합을 시험하였다 (도 4C). 뿐만 아니라, Pkd1의 메틸화된 유전자 몸체에 MBD2의 결합이 Pkd1 침묵화에 실제로 책임이 있고 낭포형성에 역할을 수행함을 확인하기 위하여, 개 Mbd2에 대한 siRNA를 MDCK 세포에 처리하였다. 그 결과, Mbd2 녹다운은 Pkd1 전사체 하향조절 및 낭포 발달을 저해하였다 (도 4D, 4E). 이러한 결과들은 메틸화된 Pkd1 유전자 몸체 부위에 MBD2가 결합하여 Pkd1 하향조절을 일으키며, 다낭신 진행에 결정적인 역할을 수행함을 말해준다.

결과 6: 억제성 히스톤 변형은 PKD1 에서 DNA 메틸화와 관련이 있다.

잘못된 DNA 메틸화 변화가 히스톤 변형과 관련되어 있기 때문에 본 발명자들은 DNA 메틸화 제거에 의해 유도되는 Pkd1 유전자 부분의 히스톤 변형의 변화를 분석하였다. 우리는 MDCK 세포에서 인비트로 낭포형성 동안 5-aza-dC를 처리한 후 Pkd1 유전자 몸체에서 다섯 개의 대표적인 히스톤 변형 (H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3, H3K36me3 및 H3KAc) 수준을 측정하였다. 히스톤 ChIP-qPCR 결과는 활성 히스톤 메틸화 마커, viz., H3K36me3 및 H3KAc가 Pkd1 유전자 몸체 부분에서 현저히 증가한 반면, 대표적인 억제성 히스톤 변형 마커인 (H3K27me3)가 감소하였음을 보여주었다. 반면, 프로모터 활성 마커 (H3K4me3)와 다른 유전자 억제 마커 (H3K9me3)는 변화가 없었다 (도 4F). 따라서, DNA 메틸화의 변화는 유전자 몸체 부분에서 히스톤 변형에 영항을 주고 다낭신 신장 낭포 발달에서 주요 조절 유전자의 후성적 침묵화를 매개하는 것으로 나타났다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Sookmyoung Woman's University <120> Pharmaceutical composition containing DNA methylation inhibitors for treating autosomal dominant polycystic kidney disease <130> SookmyoungU-jhPark-130426 <160> 67 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 1 gagaugaggc cuaagagua 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 2 uacucuuagg ccucaucuc 19 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atcgtggaag gactcatgac caca 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agaggcaggg atgatgttct gga 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aaggccaacc gcgagaagat 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ccagaggcgt acagggatag cac 23 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gagcgagcat 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<211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ttttttttgt gtggattta 19 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gccgcgccat ccctttctgt 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gctccggctg tccaccccat ac 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tgggagccgc aggactacga 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 agcggacttt gtggcggaac t 21 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 aagctgcgga ccctggatgt gttt 24 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 actgtggagc cggggttgtt ca 22 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 aagcgcaagc gggacgagtg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 cccgggcccc tggttttctt 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ctccgactcg cccccaatcc t 21 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 cgtcgccatc gcctgtcaag tc 22 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 cctcagttgg caaggtacc 19 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 ggcttcatct ccactgtcc 19 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 cgaaagccgg ggagtgtggt 20 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 tcttgcgctt cttgatgggg agta 24 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 ggagctgccc ccaccgtcac 20 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 ctcccactct ttccaattcc atagc 25 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gcagaagacc gaaaggatgg ataa 24 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 cggggtcgac gttgagcag 19 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 acacaagctc tgcacccatc ac 22 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 ttgctgtact cgctcttcct gttt 24 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 aacgcttcag acggtgccct cat 23 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gccggtggtc tgtctggtcg tc 22 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 tgggggtaat catggcaaaa cgaa 24 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 catcctgtcc cactggctca cga 23 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 cggccgcacg gacctcaagt 20 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 tttctcccca cgctccccac ag 22 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 acctgcttcg gggcgtgagt 20 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 ccaggtgtcg gggcaggtag tag 23 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 gacctgcccc cgcctcttga 20 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 actccgtgcc tgtctcgttg tcca 24 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 gcaacatcgc gcccaacatc tc 22 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 acccagccac gacggaaaaa cct 23 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 cgtccggatt ggcagtggtt ttg 23 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 ggcccgccgg tacaggttca 20 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 ggacgctcgg gagatcaaga agaa 24 <210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 gcagcgtggt ccagcaggtt tt 22 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 gtgccagcca gtgcgtcgtg 20 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 gctgtggctg agatgtgcgt gag 23 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 gctgaagggc gccaccaatg 20 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 cgaaggccag ggagaaggag aaga 24 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 cctgtcgccc gtctacttcg tga 23 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 ctcccgtgcc tccttgttgc tct 23 <210> 60 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 tggcgagcta cgagaacgag gaac 24 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 ctagtggccg gggtgctgtc a 21 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 aagaaggcca ctgaccccaa tgag 24 <210> 63 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 agcccggcca cagatcttac actt 24 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 ggtggagtcc cgttttgatg agca 24 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 tccagcgcgt agcccaggtt g 21 <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 tagccaagtt ccctccaccc tctc 24 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 tgctccagtc ccccgataac agta 24

Claims

DNA 메틸화 저해제를 포함하는 상염색체 우성 다낭신 개선 또는 치료용 약학 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 DNA 메틸화 저해제는 5-aza-dC (5-aza-2'-deoxycytidine) 또는 제뷸라린임을 특징으로 하는, 상염색체 우성 다낭신 개선 또는 치료용 약학 조성물.