KR20170026896A - 타닌산을 유효성분으로 함유하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 - Google Patents
타닌산을 유효성분으로 함유하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 타닌산을 유효성분으로 함유하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것으로서, 상기와 같은 본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 구강암 세포의 증식을 억제하고, 구강암 세포에서 Jak2/STAT3 신호전달 경로를 억제하며, 세포주기의 G1기 정지를 유도함으로써 세포사멸에 관여하여 구강암 및 구강 전암병소를 비롯한 다양한 구강 내 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 구강암 세포에서 Bcl-2, Bcl-xL 단백질의 발현을 감소시키고, 카스파제-3를 활성화시킴으로써, 미토콘드리아 의존 경로를 통한 세포사멸을 유도하여 구강암 및 구강 전암병소를 비롯한 다양한 구강 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 타닌산을 유효성분으로 함유하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
현대사회로 접어들면서 생활 패턴과 생활 습관이 다양해짐에 따라 과거에는 알려진 바 없는 희귀한 질환들이 많이 발견되고 있다. 암 또한 그 호발 부위가 다양해지고 발병률이 늘어남에 따라 희귀암으로 투병 중인 환자들이 늘어나고 있는데, 그 중 하나로서 증상이 악화되더라도 눈에 잘 띄지 않는 구강암을 들 수 있다. 구강암은 단순히 입 속에 생긴 염증으로 오인하는 경우가 많기 때문에 악화된 후에발견되고 있다. 구강암은 입술, 혀와 밑바닥, 입천장, 입 안의 점막, 잇몸 등에 발생하는 악성 종양을 말한다. 대부분은 입 안의 점막을 구성하는 편평상피세포에서 발생한다.
또한, 구강 전암병소는 정상적인 구강 조직보다 구강암으로 진행될 수 있는 가능성이 명백하게 높은 형태학적으로 변화된 조직이라고 정의하고 있다. 일반적으로 구강 전암병소에 해당하는 대표적인 질환의 예로서 구강 백반증과 홍반증을 들 수 있다. 이러한 구강 전암병소는 일반적인 구강 검진이나 치과 치료시 육안으로도 쉽게 발견될 수 있음에도 불구하고, 치과의사들의 무관심 속에 간과되는 경우가 많다.
구강 전암병소를 비롯한 구강암의 치료에는 일반적인 종양의 치료와 마찬가지로 방사선 치료와 항암요법에 의한 치료가 적용될 수 있다. 그러나, 방사선 치료를 받는 경우 방사선 조사 부위가 입안과 목 부위로서, 방사선 치료를 시작하여 2~3주가 지나면 입안이 점점 헐고, 목의 피부가 검게 그을리는 방사선 피부염 등이 발생되며, 침샘이 방사선에 노출되면 침샘의 섬유화, 침샘세포의 괴사나 위축이 일어나 침 분비량이 감소되며 입안이 마르는 구강 건조증 등의 만성적인 부작용이 동반된다. 또한, 항암 요법에 의한 치료 후 입안이 허는 구내염 등이 합병증으로 나타나고, 이로 인하여 섭식 장애가 유발되기도 한다. 더불어, 구강암 치료의 경우 치료시기가 늦어질 경우 치료 후에도 얼굴 추형, 언어 장애는 물론 이에 따르는 우울증과 대인기피증으로 진행되는 등 질병 자체의 완치는 가능 하더라도 이후 일상 생활에 어려움을 줄 수 있는 부작용이 수반되며, 대인관계까지도 영향을 미칠 수 있다. 즉, 구강 전암병소, 구강암 등의 구강 질환의 치료는 환부가 안면에 해당하는바, 다른 질병의 치료에 비해 부작용과 후유증을 최소할 수 있는 천연물신약에 의한 약물요법이 더욱 절실히 필요한 실정이다.
관련 종래 기술로는, 대한민국 공개특허 제10-2014-0089728호(강황 및 천년초 추출물을 유효 성분으로 함유하는 구강 질환 예방, 개선 및 치료를 위한 조성물), 대한민국 등록특허 제10-0871627호(파래 추출물을 포함하는 구강질환 예방 또는 치료용 조성물) 등이 있다.
본 발명은 상기의 필요성에 의해 안출된 것으로서, 구강암 및 구강 전암병소를 비롯하여 구강 내에 발생하는 다양한 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 일 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 구강암 및 구강 전암병소를 비롯하여 구강 내에 발생하는 다양한 구강 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 타닌산(tannic acid, TA)을 유효성분으로 함유하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
바람직하게, 상기 타닌산은 하기 화학식 1로 표시되는 갈로타닌 화합물(gallotannic compound)일 수 있다.
[화학식 1]
바람직하게, 상기 구강 질환은 구강암 또는 구강 전암병소일 수 있다.
바람직하게, 상기 구강암은 치은암, 구순암, 구개암, 구강저암, 협점막암 및 설암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
바람직하게, 상기 구강 전암병소는 구강 백반증, 구강 홍반증, 구강 캔디다증 및 구강 편평유두종으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
바람직하게, 상기 조성물은 구강암 세포에서 Jak2, p-Jak2, STAT3, p-STAT3, CDK-4, cyclin-D1, cyclin-E, Bcl-xL 및 Bcl-2 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 감소시킬 수 있다.
바람직하게, 상기 조성물은 구강암 세포에서 Bax, p53, 시토크롬 c(cytochrome c) 및 카스파제-3(caspase-3) 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 타닌산(tannic acid, TA)을 유효성분으로 함유하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
바람직하게, 상기 건강기능식품은 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 본 발명의 약학 조성물은 구강암 세포의 증식을 억제하고, 구강암 세포에서 Jak2/STAT3 신호전달 경로를 억제하며, 세포주기의 G1기 정지를 유도함으로써 세포사멸에 관여하여 구강암 및 구강 전암병소를 비롯한 다양한 구강 내 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 구강암 세포에서 Bcl-2, Bcl-xL 단백질의 발현을 감소시키고, 카스파제-3(caspase-3)를 활성화 시킴으로써, 미토콘드리아 의존 경로를 통한 세포사멸을 유도함여 구강암 및 구강 전암병소를 비롯한 다양한 구강 내 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있다.
도 1은 구강암 세포(YD-38 cells)에서 타닌산의 세포 증식 억제, G1기 정지 및 세포사멸 유도 효과를 나타내는 그림. (a) 구강암 세포주에 타닌산을 농도에 따라(0, 20, 40, 60, 80, 100 μM) 48시간 동안 처리하고, 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 분석법을 사용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프. (b) 구강암 세포의 G1기 정지를 나타냄. (c) 구강암세포에서 타닌산에 의해 유도되는 G1기 정지 효과를 나타냄. (d) 타닌산 처리된 구강암 세포에서 Annexin V-FICT 분석법을 통한 세포사멸 유도 확인. (e) 세포사멸이 유도된 세포의 백분율을 나타냄. 캠토세신(camptothecin)은 양성 대조군으로서 사용됨. 데이터는 적어도 세 번의 독립적인 실험들 중 하나의 대표값. 별표는 ANOVA 테스트에 의한 G1기 정지 또는 세포사멸의 유의적인 유도를 나타냄(**P<0.01; 및 ***P<0.001).
도 2는 구강암 세포(YD-38 cells)에서 타닌산의 Jak2/STAT3 경로 억제 효과를 나타낸 그림. (a) 구강암 세포주에 타닌산을 농도에 따라(0, 40, 60 μM) 24시간 동안 처리하고, 전체 세포 용해물을 가지고 웨스턴 블롯을 수행한 결과. Jak2 및 STAT3의 발현과 인산화 억제를 보여줌. β-actin 은 로딩 컨트롤(loading control)로서 사용됨. (b) 타닌산이 처리된 조건 하에서 단백질의 발현 정도를 나타내는 그래프. 별표는 ANOVA 테스트에 의한 Jak2 및 STAT3 의 인산화 뿐만 아니라 발현의 유의적인 억제를 나타냄(**P<0.01; 및 ***P<0.001). (c) 핵 추출물의 웨스턴 블롯을 통하여 STAT3 및 p-STAT3의 핵내 전위의 감소를 보여줌. TATA binding protein(TBP)은 로딩 컨트롤로서 사용됨. (d) STAT3의 DNA 결합 활성의 감소를 보여주는 EMSA 분석 결과. 데이터는 적어도 세 번의 독립적인 실험들 중 하나의 대표값.
도 3은 구강암 세포(YD-38 cells)에서 타닌산의 G1기 정지 효과를 나타낸 그림. (a) 구강암 세포에 타닌산을 24시간 동안 처리한 후, 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR을 수행한 결과. 18S는 로딩 컨트롤로서 사용됨. (b) 세포주기의 음성 조절인자들의 mRNA 수준의 발현 정도를 나타내는 그래프. 데이터는 로딩 컨트롤인 18S로 조절되고 노멀라이즈드된 백분율 결과. (c) 구강암 세포주의 웨스턴 블롯 결과로서, 세포주기의 양성 조절인자들의 억제 효과를 보여줌. β-actin은 로딩 컨트롤로서 사용됨. (d) 세포주기의 양성 조절자들의 단백질 발현 정도를 나타내는 그래프. 데이터는 β-actin 으로 노멀라이즈드됨. 데이터는 적어도 세 번의 독립적인 실험 중 하나의 대표값. 별표는 ANOVA에 의한 세포주기의 양성 및 음성 조절인자들의 전사 또는 번역 조절에 있어서 유의적인 증가 또는 감소를 나타냄(***P<0.001).
도 4는 구강암 세포(YD-38 cells)에서 미토콘드리아 의존 경로를 통한 타닌산의 세포사멸 유도 효과를 나타내는 그림. (a) 타닌산이 농도(0, 40, 60 μM)에 따라 처리된 구강암 세포로부터 분리된 전체 RNA를 이용한 RT-PCR 결과. (b) 타닌산이 농도(0, 40, 60 μM)에 따라 처리된 구강암 세포로부터 분리된 전체 세포 용해물을 이용한 세포사멸 조절인자의 웨스턴 블롯 분석. (c) 세포사멸 조절 단백질의 발현 정도를 나타내는 그래프. 데이터는 β-actin에 의해서 조절되고 노멀라이즈드됨. 별표는 ANOVA 테스트에 의한 세포사멸 조절인자들의 번역 조절에 있어서 유의적인 증가 또는 감소를 나타냄(**P<0.01; 및 ***P<0.001). (d) 타닌산이 처리된 구강암 세포 용해물의 세포질 프랙션과 미토콘드리아 프랙션의 웨스턴 블롯 분석 결과.
도 5는 구강암 세포(YD-38 cells)에서 타닌산에 의한 미토콘드리아 막 전위 감소 효과를 나타내는 그림. (a) 타닌산이 농도(0, 40, 60 μM)에 따라 처리된 구강암 세포에서 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석 결과로서, 시토크롬 c(cytochrome c)의 농도 의존적 증가를 보여줌. β-actin은 로딩 컨트롤로서 사용됨. (b) 웨스턴 블롯을 이용한 미토콘드리아와 세포질에서 시토크롬 c의 발현 분석. (c) DiOC6 염색 및 FACS 분석을 이용한 타닌산이 처리된 구강암 세포에서 미토콘드리아 막 전위(MMP) 감소 효과. (d) 미토콘드리아 막 전위 감소의 백분율 값을 나타내는 그래프. 캠토세신은 양성 대조군으로서 사용됨. 별표는 ANOVA 테스트에 의한 미토콘드리아 막 전위에 있어서 유의적인 감소를 나타냄(***P<0.001). 데이터는 적어도 세 번의 독립적인 실험 중 하나의 대표값을 나타냄.
도 6은 구강암 세포(YD-38 cells)에서 타닌산의 카스파제-3(caspase-3) 활성화 유도 효과를 나타낸 그림. (a) 타닌산이 처리된 구강암 세포에 FAM-FLICA poly caspase로 염색한 후, FACS 분석한 결과. (b) 활성화된 전체 카스파제의 백분율값을 나타내는 그래프. (c) 타닌산 처리된 구강암 세포의 웨스턴 블롯 분석 결과로 카스파제-3 및 절단된 카스파제-3의 발현 증가를 보여줌. (d) 구강암 세포에 카스파제-3 억제제를 처리한 후 타닌산을 처리한 경우와 처리하지 않은 경우에 있어서 FITC-DEVD-FMK로 1시간 동안 염색 후, FACS 분석을 수행한 결과. (e) 활성화된 카스파제-3의 백분율 값은 나타내는 그래프. 별표는 t-test를 사용하여 카스파제-3의 유의적인 활성을 나타냄(***P<0.001). 데이터는 적어도 세 번의 실험 중 하나의 대표값.
도 2는 구강암 세포(YD-38 cells)에서 타닌산의 Jak2/STAT3 경로 억제 효과를 나타낸 그림. (a) 구강암 세포주에 타닌산을 농도에 따라(0, 40, 60 μM) 24시간 동안 처리하고, 전체 세포 용해물을 가지고 웨스턴 블롯을 수행한 결과. Jak2 및 STAT3의 발현과 인산화 억제를 보여줌. β-actin 은 로딩 컨트롤(loading control)로서 사용됨. (b) 타닌산이 처리된 조건 하에서 단백질의 발현 정도를 나타내는 그래프. 별표는 ANOVA 테스트에 의한 Jak2 및 STAT3 의 인산화 뿐만 아니라 발현의 유의적인 억제를 나타냄(**P<0.01; 및 ***P<0.001). (c) 핵 추출물의 웨스턴 블롯을 통하여 STAT3 및 p-STAT3의 핵내 전위의 감소를 보여줌. TATA binding protein(TBP)은 로딩 컨트롤로서 사용됨. (d) STAT3의 DNA 결합 활성의 감소를 보여주는 EMSA 분석 결과. 데이터는 적어도 세 번의 독립적인 실험들 중 하나의 대표값.
도 3은 구강암 세포(YD-38 cells)에서 타닌산의 G1기 정지 효과를 나타낸 그림. (a) 구강암 세포에 타닌산을 24시간 동안 처리한 후, 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR을 수행한 결과. 18S는 로딩 컨트롤로서 사용됨. (b) 세포주기의 음성 조절인자들의 mRNA 수준의 발현 정도를 나타내는 그래프. 데이터는 로딩 컨트롤인 18S로 조절되고 노멀라이즈드된 백분율 결과. (c) 구강암 세포주의 웨스턴 블롯 결과로서, 세포주기의 양성 조절인자들의 억제 효과를 보여줌. β-actin은 로딩 컨트롤로서 사용됨. (d) 세포주기의 양성 조절자들의 단백질 발현 정도를 나타내는 그래프. 데이터는 β-actin 으로 노멀라이즈드됨. 데이터는 적어도 세 번의 독립적인 실험 중 하나의 대표값. 별표는 ANOVA에 의한 세포주기의 양성 및 음성 조절인자들의 전사 또는 번역 조절에 있어서 유의적인 증가 또는 감소를 나타냄(***P<0.001).
도 4는 구강암 세포(YD-38 cells)에서 미토콘드리아 의존 경로를 통한 타닌산의 세포사멸 유도 효과를 나타내는 그림. (a) 타닌산이 농도(0, 40, 60 μM)에 따라 처리된 구강암 세포로부터 분리된 전체 RNA를 이용한 RT-PCR 결과. (b) 타닌산이 농도(0, 40, 60 μM)에 따라 처리된 구강암 세포로부터 분리된 전체 세포 용해물을 이용한 세포사멸 조절인자의 웨스턴 블롯 분석. (c) 세포사멸 조절 단백질의 발현 정도를 나타내는 그래프. 데이터는 β-actin에 의해서 조절되고 노멀라이즈드됨. 별표는 ANOVA 테스트에 의한 세포사멸 조절인자들의 번역 조절에 있어서 유의적인 증가 또는 감소를 나타냄(**P<0.01; 및 ***P<0.001). (d) 타닌산이 처리된 구강암 세포 용해물의 세포질 프랙션과 미토콘드리아 프랙션의 웨스턴 블롯 분석 결과.
도 5는 구강암 세포(YD-38 cells)에서 타닌산에 의한 미토콘드리아 막 전위 감소 효과를 나타내는 그림. (a) 타닌산이 농도(0, 40, 60 μM)에 따라 처리된 구강암 세포에서 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석 결과로서, 시토크롬 c(cytochrome c)의 농도 의존적 증가를 보여줌. β-actin은 로딩 컨트롤로서 사용됨. (b) 웨스턴 블롯을 이용한 미토콘드리아와 세포질에서 시토크롬 c의 발현 분석. (c) DiOC6 염색 및 FACS 분석을 이용한 타닌산이 처리된 구강암 세포에서 미토콘드리아 막 전위(MMP) 감소 효과. (d) 미토콘드리아 막 전위 감소의 백분율 값을 나타내는 그래프. 캠토세신은 양성 대조군으로서 사용됨. 별표는 ANOVA 테스트에 의한 미토콘드리아 막 전위에 있어서 유의적인 감소를 나타냄(***P<0.001). 데이터는 적어도 세 번의 독립적인 실험 중 하나의 대표값을 나타냄.
도 6은 구강암 세포(YD-38 cells)에서 타닌산의 카스파제-3(caspase-3) 활성화 유도 효과를 나타낸 그림. (a) 타닌산이 처리된 구강암 세포에 FAM-FLICA poly caspase로 염색한 후, FACS 분석한 결과. (b) 활성화된 전체 카스파제의 백분율값을 나타내는 그래프. (c) 타닌산 처리된 구강암 세포의 웨스턴 블롯 분석 결과로 카스파제-3 및 절단된 카스파제-3의 발현 증가를 보여줌. (d) 구강암 세포에 카스파제-3 억제제를 처리한 후 타닌산을 처리한 경우와 처리하지 않은 경우에 있어서 FITC-DEVD-FMK로 1시간 동안 염색 후, FACS 분석을 수행한 결과. (e) 활성화된 카스파제-3의 백분율 값은 나타내는 그래프. 별표는 t-test를 사용하여 카스파제-3의 유의적인 활성을 나타냄(***P<0.001). 데이터는 적어도 세 번의 실험 중 하나의 대표값.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 타닌산(tannic acid, TA)을 유효성분으로 함유하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
타닌(tannins)은 채소, 과일, 레드 와인, 차, 견과류, 콩 및 커피 등에서 발견되는 식물성 폴리페놀(polyphenol)이다. 타닌은 화학구조상 가수분해형(hydrolysable tannins)과 축합형(condensed tannins)의 2 종류로, 본 발명의 타닌산은 가수분해가 가능한 가수분해형 타닌에 해당하며, 상기 타닌산은 하기 화학식 1로 표시되는 갈로타닌 화합물(gallotannic compound)일 수 있다.
[화학식 1]
상기 구강 질환은 구강암 또는 구강 전암병소일 수 있다.
상기 구강암은 치은암, 구순암, 구개암, 구강저암, 협점막암 및 설암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이와 같은 구강암의 여러 종류는 발병 부위에 따른 것으로, 치은암은 잇몸에, 구순암은 입술에, 구개암은 입천장에, 구강저암은 혀밑의 바닥에, 협점막암은 볼점막에, 설암은 혀에 악성 종양이 발병하는 것이다.
상기 구강 전암병소는 구강 백반증, 구강 홍반증, 구강 캔디다증 및 구강 편평유두종으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
구강 전암병소는 정상적인 구강 조직보다 구강암으로 진행될 수 있는 가능성이 명백하게 높은 형태학적으로 변화된 조직으로 구강 전암병소에 해당하는 질병은 구강 백반증, 구강 홍반증, 구강 캔디다증 및 구강 편평유두종 등이 있다. 구강 백반증과 홍반증은 구강 점막 내 하얀 반점 또는 빨간 반점이 입 속 피부와 혀에 생기는 것이고, 구강 캔디다증은 원인균인 Candida albicans의 감염에 의해 발생하는 질병이며, 구강 편평유두종은 자궁경부암의 중요한 원인 인자로 알려져 있는 인유두종 바이러스(HPV)의 구강 내 감염을 의미한다.
상기 조성물은 구강암 세포에서 Jak2, p-Jak2, STAT3, p-STAT3, CDK-4, cyclin-D1, cyclin-E, Bcl-xL 및 Bcl-2 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 감소시킬 수 있다.
상기 조성물은 구강암 세포에서 Bax, p53, 시토크롬 c(cytochrome c) 및 카스파제-3(caspase-3) 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 타닌산(tannic acid, TA)을 유효성분으로 함유하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품은 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 타닌산의 준비 및 세포배양
본 발명에서 타닌산은 상업적으로 판매되고 있는 것을 구입(Sigma-Aldrich, T-3437) 하여 사용하였고, 본 발명에서 사용된 물질은 99%(w/w) 타닌산으로 이루어져 있다.
또한, 후술할 실시예들의 실험을 위한 세포를 준비하였는데 먼저, 구강암 세포주인 YD-38 세포(한국세포주은행, KCLB 60508)를 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco-BRL, USA ) 및 1% 페니실린/스트렙타비딘(penicillin/streptavidine)이 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco-BRL, USA)에서 배양하였다. 상기 세포를 10 cm의 페트리디쉬에서 80% 컨플루언스(confluence)가 될 때까지 배양하였고, 이후, 18 내지 24 시간 동안 무혈청 배지에서 배양한 뒤, 후술할 실험들의 조건에 따라 처리되었다. 구강암 세포주인 YD-38 세포는 구체적으로 치은 편평상피세포암종(gingival squamous cell carcinoma, GSCC)에서 유래하였다.
실시예 2. 타닌산의 구강암 세포 증식 억제 확인
타닌산의 처리에 의한 구강암 세포의 증식 억제 효과를 확인하기 위하여 크리스탈 바이올렛 분석법(crystal violet assay)을 수행하였다. 먼저 YD-38 세포를 6-웰 플레이트에 씨드(seed)한 후, 일반적인 조건 하에서 밤새 인큐베이션 시켰다. 24시간 인큐베이션 후에, 상기 세포에 타닌산을 농도별(0, 20, 40, 60, 80, 100 μM)로 48시간 동안 처리하였다. 이후, 세포들은 PBS로 세척하였고, 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 다음으로, 세포에 염색된 크리스탈 바이올렛을 1% SDS를 사용하여 용해한 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존능을 분석하였다.
그 결과, 도 1의 (a)에서 보는 바와 같이, 타닌산은 농도 의존적으로 구강암 세포의 증식을 억제하는 것을 확인하였다. YD-38 세포에 대한 타닌산의 증식 억제 효과는 매우 천천히 일어나며, 60 μM의 타닌산이 처리되었을 때, 세포 생존능이 50%까지 감소하는 것을 확인하였다. 세포 생존능 분석 결과에서 보는 바와 같이, 타닌산은 24 시간 처리에 의해서는 세포 사멸이 유도되지 않고, 세포 주기 정지에 의한 증식 억제가 유도되었다.
실시예 3. 타닌산의 구강암 세포에서 G1기 정지 효과 확인
타닌산의 처리에 의한 구강암 세포의 세포 주기(cell cycle)를 분석하기 위하여, BD Cycletest Plus DNA reagent kit(BD Biosciences, CA, USA)를 제조사의 매뉴얼에 따라 사용하였다. 구체적으로, 약 5× 105 밀도의 YD-38 세포에 타닌산 또는 다른 화합물을 제시된 시간동안 처리하였다. 이후, 세포를 분리하고 PBS로 2회 세척한 후, 트립신 버퍼를 사용하여 회수하였다. 다음으로, 트립신 저해제(trypsin inhibitor)와 RNase 버퍼를 세포에 처리함으로써, RNA와 PI의 상호작용을 중화시켰다. 그리고 나서 이 샘플들을 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI)로 30분 동안 암실에서 염색하였고, FACSCalibur(BD FACSCalibur, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 1의 (b)에서 보는 바와 같이, 40 μM의 타닌산을 가지고 세포를 처리하였을 때, 세포 주기의 G2기에 있는 세포 집단의 비율(percentage)이 감소되었고, G1기에 있는 세포의 축적을 확인할 수 있었다. 60 μM의 타닌산을 처리한 경우, G1기에 있는 세포의 축적은 40 μM의 타닌산을 처리했을 때보다 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 1의 (c)에서 보는 바와 같이, 구강암 세포에서 G1기 정지는 타닌산의 처리 농도 의존적으로 유도됨을 확인할 수 있었다. 세포 주기 정지를 유도하는 타닌산의 이와 같은 농도는 타닌산 매개 G1기 정지와 관련된 신호 경로를 명확히 밝히는데 사용되었다.
실시예 4. 타닌산의 구강암 세포의 세포 사멸 유도 확인
타닌산이 구강암 세포의 세포 사멸을 유도하는 능력을 갖는지 확인하기 위해서, 세포 사멸을 겪은 세포의 비율을 정량하기 위해서 형광 접합된 아넥신 V(Fluorescein-conjugated Annexin V, Annexin V-FITC)를 사용하였다. 괴사된 세포는 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI)을 가지고 염색하여 계수하였다. 이후, 세포를 차가운 PBS로 두 번 세척하고, 1× 106 cells/ml 의 밀도로 하여 바인딩 버퍼에서 세포를 재현탁(resuspend) 시켰다. 이후, 상기 세포 현탁액에 Annexin V-FITC 및 PI 각각을 5 마이크로리터(microliters) 첨가하였다. 상온의 암실에서 15분 동안 인큐베이션 시킨 후, 사멸된 세포(apoptotic cells)를 flow cytometry(BD FACSCalibur)를 이용하여 분석하였다. 10 μM 캠토세신(camptothecin)이 처리된 YD-38 세포를 양성 대조군으로서 사용하였다.
그 결과, 도 1의 (d)에서 보는 바와 같이, 타닌산을 처리한 경우 사멸기에 있는 세포의 축적이 관찰되었다. 또한, 도 1의 (e)에서 보는 바와 같이, 60 μM 타닌산이 처리된 세포의 경우에 있어서, 세포 사멸의 비율은 양성 10 μM 캠토세신이 처리된 세포인 양성 대조군과 유사한 것이 확인되었다.
실시예 5. 구강암 세포에서 타닌산의 Jak2/STAT3 경로 억제 조사
STAT3는 세포 사멸 유도에 관여하는 것으로 알려져 있는 바, 타닌산의 STAT3의 인산화 및 발현 억제 효과를 확인하기 위해서 웨스턴 블롯(western blot)을 수행하였다. 먼저, YD-38 세포에 24 시간 동안 타닌산을 농도(0, 40, 60 μM)에 따라 처리하였고, 1X BD baculogold protease inhibitor cocktail(BD Bioscience)와 1X PhosSTOP phosphatase inhibitors(Roche, NJ, USA) 를 포함하는 radioimmunoprecipitation assay(RIPA) 용해 버퍼를 사용하여 수득한 세포 용해물을 SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 상에서 전개시키고 다시 니트로셀룰로스 막 위에 이동시킨 후, 분석하고자 하는 각각의 단백질에 대한 항체(Jak2, p-Jak2(Y1007/1008), p-STAT3(Y705), p-STAT3(S727) antibody, Cell Signaling Technologies, USA)를 사용하여 블롯팅하였고, Enhanced chemilumunescence(ECL) plus detection 키트를 사용하여 가시화하였다.
그 결과, 도 2의 (a)에서 보는 바와 같이, 구강암 세포에서 p-Jak2, Jak2, p-STAT3 tyr705, STAT3의 단백질의 발현 수준은 타닌산에 의해 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다. 즉, 타닌산은 Jak2의 인산화를 억제하고, Jak2는 STAT3의 주요 상위 조절자로서 STAT3의 인산화도 억제된다. 또한, 도 2의 (b)에서 보는 바와 같이, p-Jak2 (Phosphorylated janus kinase 2), Jak2 (Janus kinase 2), p-STAT3 (Phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3), STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) 단백질 발현이 모두 타닌산의 처리 농도 의존적으로 감소됨을 알 수 있다.
실시예 6. 구강암 세포에서 타닌산의 STAT3 유전자의 전사적 기능 억제 조사
STAT의 핵내 전위(nuclear translocation)는 세린 인산화(serine phosphorylation)보다는 타이로신 인산화(tyrosine phosphorylation)의 영향을 받는다. STAT의 핵으로의 전위 후, 타겟 유전자의 프로모터에 결합하게 되고, 타겟 유전자가 전사적으로 활성화 된다. 본 실시예에서는 타닌산의 STAT3 유전자의 전사적 기능 억제 효과를 조사하기 위해서, 타닌산이 48시간 동안 60μM의 농도로 처리된 YD-38 세포의 핵 추출물(nuclear extracts)을 이용하여 p-STAT3의 핵에서의 발현 수준을 확인하였다. 그 결과, 도 2의 (c)에서 보는 바와 같이, 타닌산이 처리된 핵 추출물의 경우 p-STAT3 tyr705와 STAT3 단백질의 발현 수준에 있어서, 타닌산이 처리되지 않은 대조군에 비하여 감소된 것을 확인하였다.
또한, STAT3의 전사적 기능은 타겟 유전자의 특정 반응 부위(specific response elememt)와의 결합을 통하여 발휘된다. 따라서, 본 실시예에서는 Electrophoretic mobility shift assay(EMSA) 분석을 수행하여 타닌산의 처리에 의한 STAT3의 전사적 기능 억제의 효과 즉, DNA 결합 활성을 확인하였다. EMSA 분석을 수행하기 위해서, YD-38 세포를 80% 컨플루언스 상태가 될 때까지 배양하였고, Nuclear Extraction 키트(Affymetrix, CA, USA)를 사용하여 핵 단백질 추출물을 준비하였다. EMSA 분석은 EMSA 젤 이동 키트(Redwood City, USA)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행되었다.
그 결과, 도 2의 (d)에서 보는 바와 같이, 48 시간 동안 60μM의 농도로 타닌산이 처리된 세포의 경우 타닌산이 처리되지 않은 세포보다, STAT3의 DNA 결합 활성이 감소되는 것을 확인하였다.
실시예 7. 구강암 세포에서 타닌산에 의한 p21 및 p27 유전자의 발현 증가 조사
상기 실시예 3을 통하여 타닌산의 처리에 의해 구강암 세포에서 G1기 정지가 유도됨을 확인하였다. G1/S기 전이의 억제에 관여하는 주요한 유전자는 p21Waf1/Cip1 및 p27Kip 이다. 본 실시예에서는 타닌산의 처리에 의한 p21Waf1/Cip1 및 p27Kip 유전자의 전사적 기능이 강화되는 것을 확인하기 위해서, Semi-quantitave reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)을 수행하였다. 타닌산이 농도(0, 40, 60 μM)에 따라 24 시간 동안 처리된 YD-38 세포로부터 RNeasy Mini kit(Quiagen, CA, USA)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 토탈 RNA를 분리하였다. 각각의 RNA 샘플을 동량으로 취하고, AccuPower RT-premix kit(Bioneer, Korea)와 올리고(dT) 프라이머(Bioneer, Korea)를 사용하여 역전사 시켰다. PCR은 변성온도 94-95 ℃, 어닐링 온도 56-60 ℃ 및 증폭온도 72 ℃로 하여 25 내지 30 사이클 수행하였다. p21Waf1/Cip1 및 p27Kip cDNA의 PCR 증폭에 사용된 프라이머 서열은 [표 1]의 6, 7번에 개시된 것과 같다. 증폭된 PCR 산물은 이티디움 브로마이드(ethidium bromide, EtBr)을 포함하는 1.2% 아가로스젤 상에서 가시화 되었다.
그 결과, 도 3의 (a)에서 보는 바와 같이, 타닌산이 처리된 세포에서 p21Waf1/Cip1 및 p27Kip 의 활성이 강화된 것을 확인하였다. 또한, 도 3의 (b)에서 보는 바와 같이, p21Waf1/Cip1 및 p27Kip 의 발현의 증가는 타닌산의 농도 의존적인 것을 알 수 있다.
[표 1] RT-PCR 프라이머
실시예 8. 구강암 세포에서 타닌산의 cyclin D1, cyclin E 및 CDK-4 유전자의 발현 억제 조사
cyclin D1, cyclin E 및 CDK-4 (Cyclin-Dependent Kinase 4)는 암세포의 세포주기에 관여하여 더욱 암화를 촉진하는 인자들이다. 타닌산의 처리에 따른 상기 유전자들의 발현 억제 효과를 확인하기 위해서 타닌산이 농도(0, 40, 60 μM)에 따라 24시간 동안 처리된 YD-38 세포를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
그 결과, 도 3의 (c), (d)에서 보는 바와 같이 타닌산의 처리에 의해 cyclin D1, cyclin E 및 CDK-4은 단백질 발현이 억제되었다. 그런데, CDK-4 유전자의 경우 도 3의 (b)를 살펴보면, mRNA 수준에서는 타닌산에 의한 억제 효과가 크게 발휘되지는 않는 것으로 확인되나, 도 3의 (d)에 따르면, 단백질 수준에서는 타닌산에 의한 강력한 억제 효과를 확인하였다.
실시예 9. 구강암 세포에서 타닌산에 의한 Bcl-2, Bcl-xL
유전자의 발현 억제 조사
상기 실시예 5, 6에서 타닌산의 처리에 의해 STAT3 및 pSTAT3의 발현과 이들의 DNA 결합 활성이 억제되는 것을 확인하였다. Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), Bcl-xL (B-cell lymphoma-extra large) 유전자는 STAT3의 타겟 유전자로서, 이들 유전자도 타닌산에 의해 발현이 억제되는지 확인하기 위해서 RT-PCR과 웨스턴 블롯을 수행하였다. RT-PCR은 실시예 7에서 역전사된 cDNA에 [표 1]에 개시된 9, 10번 서열의 프라이머를 사용하여 실시예 7과 동일한 조건으로 PCR을 수행하였고, 증폭된 PCR 산물을 이티디움 브로마이드(ethidium bromide, EtBr)을 포함하는 1.2% 아가로스젤 상에서 가시화 하였다.
그 결과, 도 4의 (a)에서 보는 바와 같이, 타닌산의 처리에 의해 Bcl-2, Bcl-xL 유전자의 전사적 활성이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 타닌산의 처리에 의한 Bcl-2, Bcl-xL 단백질 발현 조절을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 도 4의 (b), (c)에서 보는 바와 같이 타닌산에 의해 Bcl-2, Bcl-xL 단백질 발현이 농도 의존적으로 감소한 것을 확인하였다.
또한, 세포주기에서 G1기의 정지는 p53 유전자 의존적이다. 따라서, 본 실시예에서는 타닌산이 p53 단백질의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해서 p53 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였고, 그 결과, 도 4의 (b), (c)에서 보는 바와 같이 p53 단백질의 발현이 농도 의존적으로 강력하게 증가하는 것을 확인하였다. 즉, 상기 실시예 3의 결과에서 보는 바와 같이, 타닌산은 G1기 정지를 유도하는 바, 이에 따라 G1기 정지에 관여하는 p53 단백질의 발현도 타닌산의 처리에 의해 증가함을 알 수 있다.
실시예 10. 구강암 세포에서 타닌산이 미토콘드리아 매개 인자들의 발현에 미치는 영향 조사
세포사멸은 사멸 수용체를 통하는 외인성 경로(extrinsic pathway) 및 미토콘드리아를 통한 내인성 경로(intrinsic pathway)의 두 가지 경로를 통해 활성화되어 세포사멸이 유도된다. 내인성 경로는 주로 미토콘드리아 경로(mitochondrial pathway)로 알려져 있다. 미토콘드리아가 매개하는 주요 인자로는 Bcl-2, Bcl-xL 및 Bax 가 있다. Bcl-2, Bcl-xL 은 항-포어 팩터(anti-pore factor)로서, 세포질로 시토크롬 c (cytochrome c)의 방출 및 세포사멸을 억제한다. 또한, Bax 유전자는 세포사멸 동안 발현이 증가되고, 미토콘드리아로 이동하여 위치하게 된다. 이와 같은 미토콘드리아 매개 인자들의 타닌산에 의한 영향을 조사하기 위해서 웨스턴블롯을 수행하였다.
그 결과, 도 4의 (d)에서 보는 바와 같이, 타닌산의 처리에 의해 Bax 단백질 발현이 세포질에서 증가된 것을 확인할 수 있고, 또한, Bax의 미토콘드리아로의 이동(localization)이 증가된 것을 확인하였다. 또한, 타닌산의 처리에 의해 세포질 및 미토콘드리아에서 Bcl-2, Bcl-xL 단백질의 발현이 감소된 것을 확인하였다.
실시예 11. 구강암 세포에서 타닌산의 처리에 의한 시토크롬 c 단백질의 발현 증가 및 세포질로의 시토크롬 c 방출 효과 확인
구강암 세포주인 YD-38 세포에서 타닌산의 처리에 의한 시토크롬 c 단백질의 발현 증가를 확인하기 위해, 실시예 5에서와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과, 도 5의 (a)에서 보는 바와 같이, 타닌산에 의해 시토크롬 c 단백질의 발현이 강력하게 증가된 것을 확인하였다.
또한, 타닌산에 의한 세포질로의 시토크롬 c 방출 효과를 확인하기 위해 YD-38 세포에 타닌산을 농도(0, 60 μM)에 따라 24 시간 동안 처리하여 준비하였다. 준비된 세포들로부터 미토콘드리아를 분리하기 위해서 미토콘드리아 분리 키트(mitochondria isolation kit, Thermo scientific, USA)를 제조사의 매뉴얼에 따라 사용하였다. 구체적으로 2× 106 cells/ml 밀도의 세포에 미토콘드리아 분리 시약을 처리하고, 아이스에 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 후에, 시약 B를 추가로 첨가한 후, 아이스에서 인큐베이션 시키고, 시약 C를 추가로 첨가한 후 아이스에서 인큐베이션 시킨다음, 혼합물을 700 xg에서 10 분 동안 원심분리 하였다. 이후, 상등액(supernatant)만을 분리하여 다시 한 번 원심분리 하였다. 이 과정에서 분리된 상등액은 세포질 분획이며, 펠렛(pellet)에 미토콘드리아가 포함되어 있다. 미토콘드리아 펠렛을 시약 C로 세척하여 사용하였다.
수득된 미토콘드리아 프랙션(mitochondria fraction)과 세포질 프랙션(cytosolic fraction)을 이용하여 실시예 5와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 시토크롬 c 단백질의 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 5의 (b)에서 보는 바와 같이, 미토콘드리아 프랙션에서는 타닌산이 처리되지 않은 대조군에 비하여 시토크롬 c 단백질 발현이 감소되었고, 사이토졸릭 프랙션에서는 증가된 것을 확인하였다. 이것은 세포질로의 시토크롬 c의 방출과 미토콘드리아 막 전위 감소를 의미한다.
실시예 12. 구강암 세포에서 타닌산에 의한 미토콘드리아 막 전위(ΔΨm)의 감소 조사
미토콘드리아에서 시토크롬 c의 방출은 일반적으로 미토콘드리아 막 전위의 감소에 의해서 야기된다. 본 실시예에서는 구강암 세포에서 타닌산이 미토콘드리아 막 전위에 미치는 영향을 조사하기 위해서, 타닌산에 의해 유도되는 포어인자(pore factor)에 있어서의 변화가 미토콘드리아 막 전위의 변화와 관련이 있는지 확인하였다.
먼저, 타닌산으로 처리한 YD-38 세포와 처리하지 않은 YD-38 세포 그리고 양성 대조군으로서 캠토세신(camptothecin)을 처리한 YD-38 세포를 준비하였다. 준비된 세포들로부터 미토콘드리아를 분리하기 위해서 미토콘드리아 분리 키트(mitochondria isolation kit, Thermo scientific, USA)를 사용하여 상기 실시예 11에서와 동일한 방법으로 미토콘드리아를 분리하였고, 각 세포에서 분리된 미토콘드리아 막 전위를 평가하기 위해서 세포 소기관의 잘 발달된 막을 염색하는 DiOC6(3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide, St. Louis, USA)으로 염색한 후, FACS 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 5의 (c), (d)에서 보는 바와 같이, 타닌산의 처리에 의해 YD-38 세포의 미토콘드리아 막 전위가 급격하게 감소된 것을 확인하였다. 이것은 YD-38 세포에 있어서, 타닌산에 의한 세포사멸 유도 메커니즘은 미토콘드리아 의존 경로를 통한 것임을 의미한다.
실시예 13. 구강암 세포에서 타닌산 매개 세포사멸에 의한 카스파제(caspase) 활성 조사
미토콘드리아 세포사멸 경로에서는 카스파제의 활성이 요구된다. 타닌산이 처리된 YD-38 세포에서 전체 카스파제 활성을 분석하기 위해서 폴리-카스파제 분석 키트(poly-caspase assay kit, Eugene, USA)를 사용하였고, FACS 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 6의 (a)에서 보는 바와 같이, 타닌산을 처리한 경우에 카스파제의 활성이 급격하게 증가되는 것을 확인하였다. 전체 카스파제 활성의 급격한 증가를 확인한 후에(도 6(b)), 카스파제-3의 활성을 분석하였다. 이를 위해서, YD-38 세포에 타닌산을 농도(0, 40, 60 μM)에 따라 처리한 후, 실시예 5와 동일한 방법에 의해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과, 도 6의 (c)에서 보는 바와 같이, 카스파제-3(Caspase-3)와 절단된(cleaved) 카스파제-3(c-Caspase-3) 단백질의 발현이 모두 증가된 것을 확인하였다.
또한, 구강암 세포에서 타닌산이 유도하는 세포사멸에 있어서 카스파제-3의 역할을 확인하기 위해서 YD-38 세포에 타닌산을 처리하기 전에 카스파제 특이적 억제제인 Z-VAD-FMK 를 처리하였고, FITC-DEVD-FMK 로 1 시간 동안 염색한 후, FACS 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 6의 (d), (e)에서 보는 바와 같이, 카스파제 특이적 억제제를 처리하면 카스파제의 활성이 억제되지만, 카스파제 특이적 억제제를 처리한 후 타닌산을 처리할 경우 카스파제 활성이 억제되지 않고 급격하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 타닌산은 카스파제 의존적 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였고, 타닌산에 의해 유도되는 세포사멸에 있어서, 카스파제-3의 활성은 필수적인 단계임을 알 수 있었다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의
지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (9)
- 타닌산(tannic acid, TA)을 유효성분으로 함유하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 타닌산은 하기 화학식 1로 표시되는 갈로타닌 화합물(gallotannic compound)인 것을 특징으로 하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
- 제 1 항에 있어서,
상기 구강 질환은 구강암 또는 구강 전암병소인 것을 특징으로 하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 3 항에 있어서,
상기 구강암은 치은암, 구순암, 구개암, 구강저암, 협점막암 및 설암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 3 항에 있어서,
상기 구강 전암병소는 구강 백반증, 구강 홍반증, 구강 캔디다증 및 구강 편평유두종으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 구강암 세포에서 Jak2, p-Jak2, STAT3, p-STAT3, CDK-4, cyclin-D1, cyclin-E, Bcl-xL 및 Bcl-2 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 구강암 세포에서 Bax, p53, 시토크롬 c(cytochrome c) 및 카스파제-3(caspase-3) 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 타닌산(tannic acid, TA)을 유효성분으로 함유하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제 8 항에 있어서,
상기 건강기능식품은 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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| KR1020150122724A KR20170026896A (ko) | 2015-08-31 | 2015-08-31 | 타닌산을 유효성분으로 함유하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 |
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| KR (1) | KR20170026896A (ko) |
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| KR20190110890A (ko) | 2018-03-21 | 2019-10-01 | 원광대학교산학협력단 | 갈로탄닌을 유효성분으로 한 전이성 대장암 억제 및 치료를 위한 약제학적 조성물 |
| KR102110568B1 (ko) * | 2018-12-31 | 2020-05-13 | 정동희 | 수용성 탄닌산을 함유하는 구강용 조성물 및 그 제조방법 |
| US20210290647A1 (en) * | 2020-03-20 | 2021-09-23 | Gr Biosystems, Inc. | Compositions for oral cancer or an oropharyngeal cancer |
-
2015
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| KR20190110890A (ko) | 2018-03-21 | 2019-10-01 | 원광대학교산학협력단 | 갈로탄닌을 유효성분으로 한 전이성 대장암 억제 및 치료를 위한 약제학적 조성물 |
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| WO2020141841A1 (ko) * | 2018-12-31 | 2020-07-09 | 정동희 | 수용성 탄닌산을 함유하는 식욕억제용 구강용 조성물 및 그 제조방법 |
| US20210290647A1 (en) * | 2020-03-20 | 2021-09-23 | Gr Biosystems, Inc. | Compositions for oral cancer or an oropharyngeal cancer |
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