KR20140048106A - 전립선암의 치료를 위한 안드로겐 수용체 길항제와 항클러스테린 올리고뉴클레오타이드의 병용 - Google Patents

Abstract

전립선암에 걸린 포유류 대상체를 치료하는 방법은, i) 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및 ii) 하기 구조 (I)을 지니는 안드로겐 수용체 길항제 또는 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을, 서로 병용할 경우 각각 상기 포유류 대상체를 치료하는데 유효한 양으로 상기 포유류 대상체에 투여하는 단계를 포함한다:

Description

전립선암의 치료를 위한 안드로겐 수용체 길항제와 항클러스테린 올리고뉴클레오타이드의 병용{COMBINATION OF ANTI-CLUSTERIN OLIGONUCLEOTIDE WITH ANDROGEN RECEPTOR ANTAGONIST FOR THE TREATMENT OF PROSTATE CANCER}

본 출원은 미국 특허 가출원 제61/452,583호(출원일: 2011년 3월 14일), 제61/453,309호(출원일: 2011년 3월 16일), 제61/453,885호(출원일: 2011년 3월 17일) 및 제61/493,336호(출원일: 2011년 6월 3일)의 우선권을 주장하며, 이들 기초 출원의 내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.

본 출원을 통하여, 괄호 속에 인용된 것을 포함하여 각종 문헌이 인용되어 있다. 괄호 속에 인용된 문헌에 대한 전체 인용은 특허청구범위 바로 앞에 있는 본 명세서의 말미에 알파벳 순서로 열거된 것을 찾을 수 있다. 모든 인용된 문헌의 그들의 전체의 개시내용은 본 발명이 속하는 분야의 상황을 더욱 완전히 기술하기 위하여 본 출원 내에 참조로 본 명세서에 병합된다.

발명의 분야

본 발명은 전립선암을 치료하기 위한 병용 요법에 관한 것이다.

전립선암은 남성에서 발생하는 가장 흔한 암이며, 서양에서 암에 의한 남성 사망원인의 두 번째를 차지한다. 전립선암은 안드로겐에 감수성인(sensitive) 종양이기 때문에, 예를 들어, 거세를 통한 안드로겐의 제거가, 진행된 전립선암 환자를 위한 몇몇 치료 요법에서 사용되고 있다. 안드로겐의 제거는 전립선 종양에서 광범위한 아폽토시스(apoptosis)를 가져오고, 따라서 이 질병의 퇴화를 가져온다. 그러나, 거세-유도 아폽토시스는 완전하지 않고, 살아있는 암세포들의 안드로겐-비의존형으로의 진행이 궁극적으로 발생한다. 이 진행은 삶의 질과 생존을 개선하는데 주된 장애이며, 따라서, 안드로겐-비의존형으로의 진행 전과 후 양쪽 모두에서 전립선암을 치료할 수 있는 요법이 필요하다.

다수의 단백질이 안드로겐 제거를 수반하는 전립선 종양 세포에 의해 증가된 양으로 발현되는 것이 관찰되었다. 이들 단백질의 적어도 일부는 안드로겐 제거 시 관찰되는 아폽토시스 세포 사멸과 관련되는 것으로 추정된다(Raffo et al., 1995; Krajewska et al., 1996; McDonnell et al., 1992). 그러나, 많은 단백질의 기능이 완전히 알려져 있지 않다. 클러스테린(clusterin)(황산화 당단백-2(SGP-2) 또는 TRPM-2로서도 알려짐)은 이 후자의 범주 내이다.

클러스테린

클러스테린은 세포 생존을 촉진시키고 암 치료에 대한 광범위 저항을 부여하는 세포보호성 샤페론 단백질(cytoprotective chaperone protein)이다(Chi et al. 2005). 문헌[Sensibar et al., Cancer Research 55: 2431-2437, 1995]에서, 저자는 유전자 암호화 클러스테린으로 형질주입된(transfected) LNCaP 세포를 보고하고 있으며, 이 단백질의 발현이 종양 괴사 인자 α(TNFα)의 효과를 변화시키는지의 여부를 보기 위하여 관찰되었으며, 이 인자에 대해서 LNCaP 세포는 매우 민감하다. TNFα에 의한 형질주입된 LNCaP 세포의 치료는 수 시간의 기간 동안 클러스테린 수준의 과도적 증가를 초래하는 것으로 나타났지만, 이들 수준은 세포 사멸 전에 DNA 단편화가 관찰될 때마다 소멸되었다.

미국 특허 제7,534,773호(그 전체 내용은 참조로 병합됨)에 기재된 바와 같이, 거세-유도 종양 세포 사멸의 증대 및 안드로겐-감수성 암세포의 안드로겐-비의존형으로의 진행의 지연은 세포에 의한 클러스테린의 발현을 저해시킴으로써 달성될 수 있다.

커스터센(Custirsen)

커스터센은 클러스테린 발현을 저해하는 제2세대 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 커스터센은 클러스테린 mRNA의 일부에 특이적으로 결합하도록 설계되어 있어, 클러스테린 단백질의 생산의 저해를 초래한다. 커스터센의 구조는, 예를 들어, 미국 특허 제6,900,187호(이 문헌의 내용은 참조로 본 명세서에 병합됨)에서 이용가능하다. 광범위한 연구는, 커스터센이 클러스테린의 발현을 강력하게 규제하고, 아폽토시스를 용이하게 하며, 암성 인간 전립선, 유방, 난소, 폐, 신장, 방광 및 흑색종 세포를 화학요법에 대해 감수성으로 하는 것으로 밝혀졌고(Miyake et al. 2005), 이에 대해서는, 미국 특허 출원 공개 제2008/0119425 A1호를 또한 참조할 수 있다. 안드로겐-의존형 전립선암에 대한 임상 시험에 있어서, 약물인 플루타마이드 및 부세렐린은 커스터센과 병용하여 함께 이용되어 전립선암 세포 아폽토시스를 증가시킨다(Chi et al. 2004; Chi et al., 2005).

안드로겐 수용체 길항제

안드로겐 수용체(AR) 길항제는, 안드로겐-AR 결합, AR 전사 활성, 또는 세포질로부터 핵으로의 전좌(translocation) 등과 같은 AR의 세포 수송을 비롯하여, AR의 기능을 교란 혹은 감소시킴으로써 전립선암 세포의 자극을 저감시킨다. 커스터센은, 클러스테린의 항아폽토시스 효과를 저감시킴으로써 전립선암의 안드로겐 비의존형으로의 진행을 저해시켜, 안드로겐 신호전달 경로에 영향을 미치는 것으로 여겨지지 않는다.

병용 요법

전립선암 등과 같은 주어진 병태를 치료하기 위하여 두 약물의 투여는 다수의 잠재적인 문제를 야기한다. 두 약물 간의 생체내 상호작용은 복잡하다. 임의의 단일 약물의 효과는 그의 흡수, 분포 및 제거와 관련된다. 두 약물이 신체 내로 도입될 경우, 각 약물은 다른 쪽 약물의 흡수, 분포 및 제거에 영향을 미칠 수 있고, 따라서, 다른 쪽 약물의 효과를 변화시킨다. 예를 들어, 하나의 약물은 다른 쪽 약물의 제거의 대사 경로에 관여된 효소의 생산을 저해, 활성화 또는 유도할 수 있다(Guidance for Industry. In vivo drug metabolism/drug interaction studies - study design, data analysis, and recommendations for dosing and labeling). 따라서, 두 약물이 동일 병태를 치료하기 위하여 투여될 경우, 각각이 인간 대상체에서 다른 쪽 약물의 치료 활성을 보완할지, 영향을 미치지 않을지 혹은 간섭할지의 여부는 예측할 수 없다.

이 두 약물 간의 상호작용이 각 약물의 의도된 치료 활성에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 그 상호작용은 독성 대사산물의 수준을 증가시킬 수 있다(Guidance for Industry. In vivo drug metabolism/drug interaction studies - study design, data analysis, and recommendations for dosing and labeling). 상호작용은 또한 각 약물의 부작용을 고조시키거나 완화시킬 수 있다. 그러므로, 질환을 치료하기 위하여 두 약물의 투여 시, 각 약물의 프로파일에 어떠한 변화가 일어날지는 예측불가능하다.

또한, 두 약물 간의 상호작용의 효과가 분명해질 경우 정확하게 예측하는 것은 곤란하다. 예를 들어, 약물들 간의 대사 상호작용은, 제2약물의 초기 투여 시, 두 약물이 정상 상태 농도에 도달한 후에 혹은 약물들 중 한쪽의 중단 시에 명백해질 수 있다(Guidance for Industry. In vivo drug metabolism/drug interaction studies - study design, data analysis, and recommendations for dosing and labeling).

이와 같이 해서, 시험관내 모델, 동물 모델 혹은 인간 모델에서 하나의 약물 혹은 각 약물 단독의 성과는 두 약물이 인간에게 투여된 경우의 효능과 상관 관계가 없을 수도 있다.

본 발명은 전립선암에 걸린 포유류 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 i) 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및 ii) 하기 구조:

를 지니는 안드로겐 수용체 길항제 또는 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을, 서로 병용할 경우 각각 상기 포유류 대상체를 치료하는데 유효한 양으로 상기 포유류 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 몇몇 실시형태는 안드로겐-비의존형 전립선암에 걸린 포유류 대상체를 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은, i) 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및 ii) 안드로겐 수용체 길항제를, 서로 병용할 경우 각각 상기 포유류 대상체를 치료하는데 유효한 양으로 상기 포유류 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 양상은 안드로겐-비의존형 전립선암에 걸린 포유류 대상체를 치료하기 위한 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및 안드로겐 수용체 길항제의 양을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 양상은 안드로겐-비의존형 전립선암에 걸린 포유류 대상체를 치료함에 있어서 안드로겐 수용체 길항제와 병용하여 이용하기 위한 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명의 일 양상은, i) 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및 ii) 하기 구조:

를 지니는 안드로겐 수용체 길항제 또는 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 전립선암에 걸린 포유류 대상체를 치료하기 위한 조성물을 제공한다.

도 1. 1μM AR1 및 10nM siRNA 표적화 클러스테린(CLU) 또는 10nM SCR에 의한 처치 시의 LNCaP 세포 증식의 저해. SCR은 스크램블링된(scrambled) 서열 siRNA 대조군이다. (A) FBS 상태는 FBS로 보충된 배지이다. (B) CSS 상태는 차콜 혈청 스트리핑된 배지(charcoal serum stripped media)이다.
도 2. 1μM AR1 및 500nM 커스터센 또는 500nM SCRB에 의한 처치 시의 LNCaP 세포 증식의 저해. SCRB는 스크램블링된 서열 안티센스 올리고뉴클레오타이드 대조군이다. (A) FBS 상태는 FBS로 보충된 배지이다. (B) CSS 상태는 차콜 혈청 스트리핑된 배지이다.
도 3. 1μM AR1 및 500nM 커스터센 또는 500nM SCBR에 의한 처치 시의 C4-2 세포 증식의 저해. (A) FBS 상태는 FBS로 보충된 배지이다. (B) CSS 상태는 차콜 혈청 스트리핑된 배지이다.
도 4. 1μM AR1 및 10nM siRNA 표적화 클러스테린 또는 10nM SCR에 의한 처치 시의 PC-3(AR-음성) 세포 증식(A). 1μM AR1 및 500nM 커스터센 또는 500nM SCRB에 의한 처치 시의 PC-3(AR-음성) 세포 증식(B).
도 5. AR1 및 10nM siRNA 표적화 클러스테린 또는 10nM SCR에 의한 처치 시의 LNCaP 세포의 세포독성(A). 1μM AR1 및 500nM 커스터센 또는 500nM SCRB에 의한 처치 시의 LNCaP 세포의 세포독성(B). 세포는 FBS로 보충된 배지 중에서 성장되었다. X-축은 AR1 농도이다.
도 6. LNCaP 세포에서의 AR1 및 커스터센 병용 요법의 역가(potency). (A) 크리스탈 바이올렛 검정법(crystal violet assay)에 의한 각 약물 혹은 그의 병용에 의한 처치 후의 세포 성장 저해. X-축은 [AR1]/[커스터센]이다. P-값은 프리드만 테스트(Friedman test)에 의해 산출되었다. (B) 각 처치에 대한 용량 효과 곡선. (C) 수회의 유효 용량에서의 병용 지수(combination index: CI). CI = 1, 부가 효과; CI < 1, 병용 효과; CI > 1, 길항 효과.
도 7. LNCaP 세포에서의 AR1, siRNA 표적화 클러스테린, 또는 이들의 조합물의 처치 시의 세포 주기 분포(Cell Cycle Distribution). OTR은 커스터센 혹은 siRNA의 부재 시 올리고펙타민 형질주입 시약(oligofectamine transfection reagent)(인비트로젠 라이프 테크놀로지즈사(Invitrogen Life Technologies, Inc.))에 의해 처치된 세포를 지칭한다.
도 8. LNCaP 세포에서 AR1, 커스터센 또는 이들의 조합물의 처치 시의 세포 주기 분포의 FACS 분석.
도 9. LNCaP 세포에서의 AR 및 클러스테린 단백질 발현에 대한 AR1 투여 효과. (A) 10μM AR1. (B) 표시된 농도에서 AR1 처치 48시간 후.
도 10. LNCaP 세포에서의 AKT 및 ERK 인산화 및 단백질 수준에 대한 AR1 투여 효과. (a) 10μM AR1. (b) 표시된 농도에서 AR1 처치 48시간 후. (c) AR1에 의한 처치 후 AKT 또는 ERK의 발현 수준의 용량 의존적 변화. (d) AR1에 의한 처치 후 AKT 또는 ERK의 발현 수준의 용량 의존적 변화.
도 11. LNCaP 세포에서의 AR 및 클러스테린 mRNA 발현에 대한 AR1 투여 효과. (A) 각 농도에서 AR1을 첨가한 후 48시간째의 AR mRNA 발현. (B) 10μM AR1 첨가 후의 표시된 시점에서의 AR mRNA 발현. (C) 각 농도에서 AR1을 첨가한 후 48시간째의 클러스테린 mRNA 발현. (D) 10μM AR1 첨가 후의 표시된 시점에서의 클러스테린 mRNA 발현.
도 12. siRNA 표적화 클러스테린, 커스터센 또는 표시된 대조군의 처치 후의 LNCaP 세포에서의 단백질 발현 변화(a 및 c). (b) 바이칼루타마이드 및 AR1에 의한 클러스테린 상향조절의 비교. (d) AR1 및 커스터센(ASO)에 의한 처치에 의한 AR 공-샤페론(co-chaperone)의 발현.
도 13. LNCaP 세포(A), 또는 AR mRNA 발현(B)에서의 PSA에 대한 10μM AR1 및 10nM siRNA 표적화 클러스테린의 효과.
도 14. AR(A) 또는 PSA mRNA 발현(B)에 대한 10μM AR1 및 500nM 커스터센 병용 요법의 효과.
도 15. AR1 및 10nM siRNA 표적화 클러스테린에 의한 LNCaP 세포의 처치 후의 단백질 발현 및 PARP 절단의 웨스턴 블롯 분석. FBS 상태는 FBS로 보충된 배지이다. CSS 상태는 차콜 혈청 스트리핑된 배지이다.
도 16. LNCaP 세포에서의 안드로겐 자극 시의 단백질에 대한 AR1 및 10μM siRNA 표적화 클러스테린의 효과. R1881은 메트리볼론(metribolone)으로서도 알려진 강력한 안드로겐이다.
도 17. AR1 및 커스터센 또는 대조군에 의한 LNCaP 세포의 처치 시의 단백질 발현 및 PARP 절단의 웨스턴 블롯 분석. 세포(1×10⁶)를 5% FBS 함유 RPMI 배지를 구비한 10㎝ 접시에 파종하였다. 그 다음날, 세포에 48시간 동안 500nM 커스터센 또는 대조군으로 형질주입시켰다. 10μM AR1을 이어서 세포에 48시간 동안 첨가하고 나서 웨스턴 블롯 분석을 위하여 수확하였다. AR 및 PSA 발현은 커스터센 및 AR1 병용 요법에 의해 고도로 억제되었다.
도 18. AR1 및 10nM siRNA 표적화 클러스테린 또는 대조군에 의한 LNCaP 세포의 처치 시 단백질 발현 및 인산화의 웨스턴 블롯 분석. 포스포-AKT 및 포스프(phosph)-ERK는 AR1 처치에 의해 활성화되지만; AR1 및 Clu siRNA 병용 요법은 인산화 AKT 및 ERK 단백질의 수준을 저감시킨다. 병용 치료는 단일요법보다 더욱 강력하게 AKT-mTOR-p70S6K 경로를 억제한다.
도 19. AR1 및 커스터센 또는 siRNA 표적화 클러스테린의 병용에 의한 LNCaP 세포의 처치 시의 AR 프로테아좀 분해(proteasome degradation)의 웨스턴 블롯 분석. MG132는 프로테아좀 저해제이고, CHX는 단백질 생합성의 저해제인 사이클로헥시미드이다. AR 단백질 분해는 AR1 및 커스터센 병용 요법에 강력하게 증가된다.
도 20. AR 전사 활성에 의한 AR1 및 커스터센 병용 요법의 효과. 이중 루시페라제 검정법; LNCaP 세포를 CSS 중 500nM 커스터센으로 2일 동안 형질주입시켰다. AR1(1uM) 또는 DMSO를 이어서 24시간 동안 R1881(1nM)과 함께 혹은 없이 첨가하고 나서, 분석을 위하여 수확하였다.
도 21. 단일요법에 비해서 10nM siRNA 표적화 클러스테린의 10μM AR1과의 병용 시 세포질에서 핵으로의 AR 전좌의 증가된 저해. LNCaP 세포가 사용되었다.
도 22. 단일요법에 비해서 10nM siRNA 표적화 클러스테린의 10μM AR1과의 병용 시 세포질에서 핵으로의 AR 전좌의 증가된 저해. LNCaP 세포가 사용되었다.
도 23. 단일요법에 비해서 10μM AR1 및 10nM siRNA 표적화 클러스테린의 병용 치료 시 유비퀴틴에 의한 AR의 증가된 연합(association)(A). MG132의 존재 하에 10μM AR1 및 10nM siRNA 표적화 클러스테린, 또는 대조군의 병용 치료 시의 유비퀴틴에 의한 AR의 증가된 연합(B). LNCaP 세포가 사용되었다.
도 24. LNCaP 세포에서의 커스터센(ASO) 또는 대조군의 병용 시의 바이칼루타마이드 혹은 AR1의 처치 간의 클러스테린 넉다운의 비교.
도 25. LNCaP 세포에서의 AR 분해 및 클러스테린 넉다운에 대한 (FKBP52) 과발현 효과.
도 26. 마우스에서의 AR1 및 커스터센의 병용 치료 시의 감소된 거세-저항성(castration-resistant) 전립선암 종양 성장 및 증가된 생존. 수컷 무흉선 누드 마우스에게 마트리겔 내 LNCaP 세포를 지닌 두 부위에 피하주사하였다. 일단 종양이 150㎣에 도달하였거나 혹은 PSA 수준이 50ng/㎖ 이상으로 증가하면 이들 마우스를 거세시켰다. 일단 종양이 거세 저항으로 진행되면(PSA 수준이 거세 전과 같은 수준까지 증가되면), 10마리의 마우스를 AR1 + 스프램블링된 안티센스 올리고뉴클레오타이드(SCRB) 또는 AR1 + 커스터센의 각각에 무작위로 할당하였다. 커스터센(10㎎/㎏/각 용량) 또는 SCRB(10㎎/㎏/각 용량)는 첫번째 주 동안 1일 1회 이어서 주당 3회 복강내 주사하였다. AR1(10㎎/㎏/각 용량)은 8 내지 12주 동안 주당 7일 1일 1회(아침에) 경구 투여하였다.
도 27. 마우스에서 AR1 및 커스터센의 병용 치료에 대한 증가된 생존. 수컷 무흉선 누드 마우스에 마트리겔 내 LNCaP 세포를 지니는 두 부위에 피하주사하였다. 일단 종양이 150㎣에 도달하였거나 혹은 PSA 수준이 50ng/㎖ 이상으로 증가하면 이들 마우스를 거세시켰다. 일단 종양이 거세 저항으로 진행되면(PSA 수준이 거세 전과 같은 수준까지 증가되면), 10마리의 마우스를 AR1 + 스프램블링된 안티센스 올리고뉴클레오타이드(SCRB) 또는 AR1 + 커스터센의 각각에 무작위로 할당하였다. 커스터센(10㎎/㎏/각 용량) 또는 SCRB(10㎎/㎏/각 용량)는 첫번째 주 동안 1일 1회 이어서 주당 3회 복강내 주사하였다. AR1(10㎎/㎏/각 용량)은 8 내지 12주 동안 주당 7일 1일 1회(아침에) 경구 투여하였다.
도 28. 마우스에서 AR1 및 커스터센의 병용 치료 시의 감소된 PSA 단백질 발현. 수컷 무흉선 누드 마우스에 마트리겔 내 LNCaP 세포를 지니는 두 부위에 피하주사하였다. 일단 종양이 150㎣에 도달하였거나 혹은 PSA 수준이 50ng/㎖ 이상으로 증가하면 이들 마우스를 거세시켰다. 일단 종양이 거세 저항으로 진행되면(PSA 수준이 거세 전과 같은 수준까지 증가되면), 10마리의 마우스를 AR1 + 스프램블링된 안티센스 올리고뉴클레오타이드(SCRB) 또는 AR1 + 커스터센의 각각에 무작위로 할당하였다. 커스터센(10㎎/㎏/각 용량) 또는 SCRB(10㎎/㎏/각 용량)는 첫번째 주 동안 1일 1회 이어서 주당 3회 복강내 주사하였다. AR1(10㎎/㎏/각 용량)은 8 내지 12주 동안 주당 7일 1일 1회(아침에) 경구 투여하였다.
도 29. 마우스에서의 AR1 및 커스터센의 병용 치료(처치) 시의 감소된 PSA 단백질 발현. 수컷 무흉선 누드 마우스에 마트리겔 내 LNCaP 세포를 지니는 두 부위에 피하주사하였다. 일단 종양이 150㎣에 도달하였거나 혹은 PSA 수준이 50ng/㎖ 이상으로 증가하면 이들 마우스를 거세시켰다. 일단 종양이 거세 저항으로 진행되면(PSA 수준이 거세 전과 같은 수준까지 증가되면), 10마리의 마우스를 AR1 + 스프램블링된 안티센스 올리고뉴클레오타이드(SCRB) 또는 AR1 + 커스터센의 각각에 무작위로 할당하였다. 커스터센(10㎎/㎏/각 용량) 또는 SCRB(10㎎/㎏/각 용량)는 첫번째 주 동안 1일 1회 이어서 주당 3회 복강내 주사하였다. AR1(10㎎/㎏/각 용량)은 8 내지 12주 동안 주당 7일 1일 1회(아침에) 경구 투여하였다.
도 30. 클러스테린 발현이 AR1 저항성 종양에서 유도되었다. (A) AR1 처치 후의 증가된 클러스테린 발현. (B) AR1 저항성 종양에서의 AR1 처치 후의 증가된 클러스테린 발현. (C) 클러스테린 발현은, 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정된 바와 같이, AR1 처치 후의 시간 및 용량 의존적 방식으로 상향 조절된다.
도 31. 커스터센 및 AR1의 병용 치료는 CRPC LNCaP 이종이식물(xenograft)에서의 커스터센 혹은 AR1 단일요법보다 더 유효하다. AR1 + 커스터센 처치는 CRPC 이종이식물에서 AR 및 PSA 발현을 감소시켰다.
도 32. 클러스테린 녹다운은 AR-의존형 유전자의 AR 전사 활성 및 발현을 감소시킨다. 경막 프로테아제 세린 2(TMPRSS2) mRNA 수준은 AR1 처치, 클러스테린 넉다운 및 AR1 처치 + 클러스테린 넉다운 후 감소되었다.
도 33. 클러스테린 넉다운은 AR1과 병용한 경우 AR 단백질 수준을 감소시킨다. AR 전사 활성, PSA 발현 및 세포 생존에 기여하는 열 충격 단백질 27(Hsp27)과 AR 간의 가능한 상호작용이 묘사되어 있다.
도 34. 클러스테린 넉다운은 열 충격 단백질의 단백질 1(HSF-1) 전사 활성 및 발현의 열 충격 인자를 감소시킨다.
도 35. 클러스테린 과발현은 HSF-1 활성를 증가시킨다.
도 36. 종양 세포에서의 AR1 처치 + 커스터센 처치에 대한 작용의 가능한 기전.
도 37. 클러스테린 및 자가포식(autophagy)은 스트레스 및 암에 있어서 역할할 수 있다. 세포질 세망(endoplasmic reticulum: ER) 스트레스, 화학자극(chemo-stress) 및 안드로겐 결핍(deprivation) 후의 증가된 클러스테린 발현이 묘사되어 있다.
도 38. AR1 처치는 LNCaP 세포에서 자가포식을 유발시킨다.
도 39. 처치 스트레서는 아그레솜(aggresome) 내 LC3B와 공동 위치되는 클러스테린을 유발시킨다.
도 40. ER 스트레스-유도 자가포식은 클러스테린 침묵(silencing)에 의해 저해된다.
도 41. CLU는 AR1에 의해 유도되고, AR1 저항성 세포에서 고도로 발현된다. c CLU의 용량 및 시간 의존적 AR1 유도. d CLU는 또한 AR 넉다운에 의해 AR1 저항성 세포에서 유도된다. AR ASO는 또한 수개의 AR1 저항성 MR49F 세포에서 CLU를 유도시킨다. CLU는 AR1 저항성 세포, 예컨대, MR49F에서 높다.
도 42. pAKT 및 MAPK의 크로스토크뿐만 아니라 스트레스 반응(ER, YB-1)의 유도.
도 45. AR 트랜스활성화(transactivation) 및 전좌에 대한 병용 치료 효과. A AR1 처치와 병용된 커스터센은 커스터센 또는 AR1 단일요법보다 더욱 AR 트랜스활성화를 감소시킨다. LNCaP 세포는 연속 2일 동안 커스터센 또는 SCRB 대조군 500 n㏖/ℓ로 형질주입되었고, 2일째에, PSA-루시페라제 및 레닐라(Renilla)-루시페라제 1㎍으로 과도적으로 공형질주입되었다. 그 다음 날, 세포를 AR1 10 μ㏖/ℓ로 처치하고, 이어서 24시간 동안 R1881 또는 비히클 1 n㏖/ℓ를 첨가하였다. 세포를 수확하고, 루시페라제 활성을 결정하였다. 열(column)은 세 벌로 행한 적어도 3개의 독립된 실험 수단을 나타낸다. PSA 활성화는 레닐라-루시페라제 활성을 정규화시켰다. B 병용 치료에 의한 AR 전좌 효과. CLU siRNA 또는 SCR siRNA 대조군 10 n㏖/ℓ에 의한 형질 주입 후 24시간에, LNCaP 세포를 30분 동안 DMSO, AR1 10 μ㏖/ℓ 및 R1881 1n㏖/ℓ로 처치하고, 항-AR 항체를 이용한 면역형광 염색을 위하여 메탄올/아세톤으로 고정시켰다. 핵은 DAPI로 염색되었다. AR1은 세포질에서 핵으로의 AR 전좌를 저지하였다. AR1과 조합된 CLU 넉다운은 AR 전좌의 증가된 저해 효과를 나타낸다.

본 발명은 전립선암에 걸린 포유류 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, i) 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및 ii) 하기 구조:

를 지니는 안드로겐 수용체 길항제 또는 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을, 서로 병용할 경우 각각 상기 포유류 대상체를 치료하는데 유효한 양으로 상기 포유류 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 암은 안드로겐-비의존형 전립선암이다.

몇몇 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오타이드의 양과 안드로겐 수용체 길항제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은, 함께 취해질 경우, 각 제제를 단독으로 투여한 경우보다 대상체를 치료하는데 더 유효하다.

몇몇 실시형태에 있어서, 안드로겐 수용체 길항제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 양과 병용 시의 올리고뉴클레오타이드의 양은, 단독으로 투여한 경우 임상적으로 유효한 것보다 적다.

몇몇 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오타이드의 양과 병용 시의 안드로겐 수용체 길항제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 양은 단독으로 투여한 경우 임상적으로 유효한 것보다 적다.

몇몇 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오타이드의 양과 안드로겐 수용체 길항제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 양은, 함께 취해질 경우, 대상체의 전립선암의 임상 증상을 저감시키는데 유효하다.

몇몇 실시형태에 있어서, 포유류 대상체는 인간이다.

몇몇 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.

몇몇 실시형태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 클러스테린-암호화 mRNA의 번역 개시 부위(translation initiation site) 혹은 종결 부위에 걸쳐 있다.

몇몇 실시형태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 동일 서열의 비변성 올리고뉴클레오타이드에 대하여 생체내 안정성을 증대시키기 위하여 변성된다.

몇몇 실시형태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드로 주로 구성된다.

몇몇 실시형태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 3으로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 주로 구성된다.

몇몇 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 커스터센이다.

몇몇 실시형태에 있어서, 커스터센의 양은 640mg 미만이다.

몇몇 실시형태에 있어서, 커스터센의 양은 480㎎ 미만이다.

몇몇 실시형태에 있어서, 커스터센의 양은 7일 기간에 한번 정맥내로 투여된다.

몇몇 실시형태에 있어서, 안드로겐 수용체 길항제의 양은 240㎎ 미만이다.

몇몇 실시형태에 있어서, 안드로겐 수용체 길항제의 양은 150㎎ 내지 240㎎이다.

몇몇 실시형태에 있어서, 안드로겐 수용체 길항제의 양은 30㎎ 내지 150㎎이다.

몇몇 실시형태에 있어서, 안드로겐 수용체 길항제의 양은 80㎎이다.

몇몇 실시형태에 있어서, 안드로겐 수용체 길항제의 양은 1일당 1회 경구 투여된다.

본 발명의 몇몇 실시형태는 안드로겐-비의존형 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법을 제공하되, 해당 방법은 i) 안드로겐 수용체 길항제 및 ii) 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드를, 서로 병용할 경우 각각 상기 포유류 대상체를 치료하는데 유효한 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

몇몇 실시형태에 있어서, 안드로겐 수용체 길항제는 비스테로이드성 항안드로겐이다.

몇몇 실시형태에 있어서, 안드로겐 수용체 길항제는 AR1이다.

몇몇 실시형태에 있어서, 안드로겐-비의존형 전립선암은 AR1에 대해 저항성이다.

몇몇 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오타이드와 안드로겐 수용체 길항제의 병용은, 종양 세포의 세포질에서 핵으로의 안드로겐 수용체 전좌를 감소시키는데 유효하다.

몇몇 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오타이드와 안드로겐 수용체 길항제의 병용은, 종양 세포 내 안드로겐 수용체 단백질의 프로테아좀 분해를 증가시키는데 유효하다.

몇몇 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오타이드와 안드로겐 수용체 길항제의 병용은, 종양 세포 내 안드로겐 수용체의 전사 활성을 감소시키는데 유효하다.

몇몇 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오타이드와 상기 안드로겐 수용체 길항제의 병용은, 종양 세포 내 인산화 AKT의 양을 감소시키는데 유효하다.

몇몇 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오타이드와 안드로겐 수용체 길항제의 병용은, 종양 세포 내 인산화 ERK의 양을 감소시키는데 유효하다.

몇몇 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오타이드와 상기 안드로겐 수용체 길항제의 병용은, 전립선암 세포의 증식을 저해하는데 유효하다.

본 발명의 몇몇 실시형태는, AR1 저항성 전립선암 세포를 커스터센에 의한 동시 치료에 의해 AR1에 대해 감수성으로 만드는 방법을 제공한다.

본 발명의 몇몇 실시형태는, AR1 저항성 전립선암 세포를 커스터센으로 치료하는 단계를 포함하는, AR1 저항성 전립선암 세포의 AR1에 대한 감수성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 몇몇 실시형태는 AR1에 대해 저항성이 있는 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법을 제공하되, 해당 방법은, i) AR1 및 ii) 커스터센을, 서로 병용할 경우, 각각 포유류 대상체를 치료하는데 유효한 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 커스터센은 전립선암의 AR1에 대한 감수성을 증대시킨다.

본 발명의 일 양상은, 안드로겐-비의존형 전립선암에 걸린 포유류 대상체를 치료하는데 이용하기 위한 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및 안드로겐 수용체 길항제의 양을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 양상은 안드로겐-비의존형 전립선암에 걸린 포유류 대상체를 치료함에 있어서 안드로겐 수용체 길항제와 병용하여 이용하기 위한 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명의 일 양상은 전립선암에 걸린 포유류 대상체를 치료하기 위한 조성물을 제공하되, 해당 조성물은, i) 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및 ii) 하기 구조:

를 지니는 안드로겐 수용체 길항제 또는 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

본 발명의 양상들은 올리고뉴클레오타이드 또는 AR 길항제 단일요법에 비해서 전립선암의 치료에 있어서 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드와 AR 길항제의 병합의 증가된 역가를 내포한다. 증가된 역가는 전립선암 세포의 감소 증식, 암세포의 아폽토시스의 증가, 세포질에서 핵으로의 AR의 전좌의 저감, AR의 전자 활성의 저감, PARP 절단의 증가, AKT 인산화의 저감, ERK 인산화의 저감 및 AR 단백질 분해의 증가를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. AKT 및/또는 ERK 인산화가 저감되는 실시형태에 있어서, AKT 및 ERK의 모든 아이소폼(isoform)이 상정된다. 이것은 AKT1, AKT2, AKT3, ERK1 및 ERK2를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 몇몇 실시형태에 있어서, AR의 프로테아좀 분해의 증가는 AR의 유비퀴틴과의 연합 증가에 연루된다.

본 명세서에 개시된 각 실시형태는 다른 개시된 실시형태의 각각에 적용가능한 것으로 상정된다. 이와 같이 해서, 본 명세서에 기재된 각종 요소의 모든 조합은 본 발명의 범위 내이다.

파라미터 범위가 제공되는 경우, 그 범위 내의 모든 정수 및 그의 십분의 일도 또한 본 발명에 의해 제공된다. 예를 들어, "0.2 내지 5 ㎎/㎏/일"은 0.2 ㎎/㎏/일, 0.3 ㎎/㎏/일, 0.4 ㎎/㎏/일, 0.5 ㎎/㎏/일, 0.6 ㎎/㎏/일 등에서 5.0 ㎎/㎏/일까지 포함한다.

용어

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 또한 달리 기술되어 있지 않는 한, 이하의 용어의 각각은 이하에 기재된 정의를 지닐 것이다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 수치 혹은 범위의 맥락에서 "약"이란 인용된 혹은 청구된 수치 혹은 범위의 ±10%를 의미한다.

본 출원의 본 명세서 및 특허청구범위에서 이용된 바와 같이, "클러스테린"이란 용어는, 인간, 및 인간으로 지칭되는 바와 같은 것을 포함하는 포유동물에 존재하는 당단백질을 지칭한다. 다수의 클러스테린 종의 서열이 공지되어 있다. 예를 들어, 인간 클러스테린의 서열은 문헌[Wong et al., Eur. J. Biochem. 221 (3), 917-925 (1994)]에 그리고 NCBI 서열 등록 번호 NM_001831(서열번호 43)로 기재되어 있다. 이 인간 서열에 있어서, 암호화 서열은 염기 48 내지 1397에 걸쳐 있다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드"란 세포에서 클러스테린 발현을 저감시키는데 유효한 서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드이다. 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 RNA 개입 유도 분자(interference inducing molecule)일 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "안티센스 올리고뉴클레오타이드"란 클러스테린 mRNA에 상보적인 서열을 지니는 동시에 클러스테린 발현을 저감시키는 비-RNAi 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드(oligodeoxynucleotide: ODN)일 수 있다. 본 발명에서 안티센스 분자로서 이용될 수 있는 예시적인 서열은 PCT 특허 공개 공보 제WO 00/49937호, 미국 특허 공개 제US 2002-0128220 A1호, 및 미국 특허 제6,383,808호에 개시되어 있으며, 이들 문헌은 모두 참조로 본 명세서에 병합된다. 구체적인 안티센스 서열은 서열번호 1 내지 18로서 본 출원에 기술되며, 이하의 표 1에서 찾을 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대한 서열 동정 번호
서열번호	서열
1	GCACAGCAGG AGAATCTTCA T
2	TGGAGTCTTT GCACGCCTCG G
3	CAGCAGCAGA GTCTTCATCA T
4	ATTGTCTGAG ACCGTCTGGT C
5	CCTTCAGCTT TGTCTCTGAT T
6	AGCAGGGAGT CGATGCGGTC A
7	ATCAAGCTGC GGACGATGCG G
8	GCAGGCAGCC CGTGGAGTTG T
9	TTCAGCTGCT CCAGCAAGGA G
10	AATTTAGGGT TCTTCCTGGA G
11	GCTGGGCGGA GTTGGGGGCC T
12	GGTGTAGACG CCGCACG
13	GCAGCGCAGC CCCTGG
14	GCAGCAGCCG CAGCCCGGCT CC
15	AGCCGCAGCC CGGCTCCT
16	CAGCAGCCGC AGCCCGGCTC
17	CAGCAGCCGC AGCCCGGCTC
18	AGCAGCCGCA GCCCGGCTCC

이용되는 ODN은 생체내에서 ODN의 안정성을 증가시키기 위하여 변성될 수 있다. 예를 들어, ODN은 뉴클레아제 분해(nuclease digestion)에 대한 증가된 저항성을 지니는 포스포로티오에이트 유도체(비가교 포스포릴 산소 원자를 황 원자로 치환)로서 이용될 수 있다. MOE(2'-O-(2-메톡시에틸)) 변성물(ISIS 골격)이 또한 유효하다. 이러한 변성된 ODN의 구조는 미국 특허 제6,900,187 B2호(이 문헌의 내용은 참조로 본 명세서에 병합됨)에 상세히 기재되어 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, ODN은 커스터센이다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "커스터센"이란 서열 CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT(서열번호 3)를 지니는 클러스테린 발현을 저감시키는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 지칭하며, 여기서 항-클러스테린 올리고뉴클레오타이드는, 전체를 통해서 포스포로티오에이트 골격을 지니며, 2'-O-메톡시에틸 변성물을 보유하는 뉴클레오타이드 1-4 및 18-21의 당 부분을 지니고, 2'-데옥시뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드 5-17을 지니며, 또한 뉴클레오타이드 1, 4 및 19에서 5-메틸사이토신을 지닌다. 커스터센은 또한 TV-1011, OGX-011, ISIS 112989 및 커스터센 나트륨으로도 알려져 있다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "RNA 개입 유도 분자"란 클러스테린 발현의 RNA 개입 혹은 "RNAi"를 유도할 수 있는 분자를 지칭한다. RNAi는 mRNA 분해와 관련되지만, 이 개입을 기저로 하는 생화학적 기전의 다수는 알려져 있지 않다. RNAi의 사용은 문헌[Fire et al., 1998, Carthew et al., 2001 및 Elbashir et al., 2001]에 기재되어 있으며, 이들 문헌의 내용은 참조로 본 명세서에 병합된다.

단리된 RNA 분자는 RNAi를 매개할 수 있다. 즉, 본 발명의 단리된 RNA 분자는 표적 유전자라고도 지칭되는 유전자의 전사 산물인 mRNA의 분해를 매개하거나 발현을 차단한다. 편의상, 이러한 mRNA는 본 명세서에서 분해될 mRNA라고도 지칭될 수 있다. RNA, RNA 분자(들), RNA 세그먼트(들) 및 RNA 단편(들)은 RNA 개입을 매개하는 RNA와 호환적으로 이용될 수 있다. 이들 용어는 이중 가닥 RNA, 소 간섭 RNA(small interfering RNA: siRNA), 헤파린 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA(부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합으로 생산된 RNA)뿐만 아니라, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 천연 발생 RNA와는 다른 변경된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은 RNA의 말단(들)에 혹은 (RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드에서) 내부적으로 등과 같이 비-뉴클레오타이드 물질의 부가를 포함할 수 있다. 본 발명의 RNA 분자 내의 뉴클레오타이드는 또한 비천연 발생 뉴클레오타이드 혹은 데옥시리보뉴클레오타이드를 비롯한 비표준 뉴클레오타이드를 포함한다. 일괄적으로, 이러한 변경된 RNAi 분자는 모두 천연-발생 RNA의 유사체 혹은 유사체들이라 지칭된다. 본 발명의 RNA는 RNAi를 매개하는 능력을 지니는 천연 RNA와 충분히 유사할 필요가 있다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "RNAi를 매개하는"이란 mRNA 분자가 RNAi 기구(machinery) 혹은 공정으로 피해를 입게 되는 것과 구별하는 능력을 지칭하거나 이를 나타낸다. RNAi를 매개하는 RNA는 RNAi 기구가 특정 mRNA를 분해시키거나 혹은 다르게는 표적 단백질의 발현을 저감시키게 하도록 해당 RNAi 기구와 상호작용한다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명은 서열이 대응하게 되는 특정 mRNA의 절단을 유도하는 RNA 분자를 지칭한다. 서열의 완전한 대응이 있을 수 있지만, 그 대응은 RNA가 표적 mRNA의 발현을 차단하거나 절단에 의해 RNAi 저해를 유도시키기에 충분해야 하는 것은 필요하지 않다.

위에서 주지된 바와 같이, 본 발명의 RNA 분자는 일반적으로 RNA 부분과 몇몇 추가적인 부분, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드 부분을 포함한다. RNA 분자 내의 뉴클레오타이드의 총 수는 RNAi의 효과적인 매개체로 되도록 적절하게 보다 적다. 바람직한 RNA 분자에 있어서, 뉴클레오타이드의 개수는 16 내지 29개, 더욱 바람직하게는 18 내지 23개, 가장 바람직하게는 21 내지 23개이다. 적절한 서열은 서열번호 19 내지 42(표 2)로서 본 출원에 기재되어 있다.

RNA 개입 유도 분자에 대한 서열 동정 번호
서열번호	서열
19	CCAGAGCUCG CCCUUCUACT T
20	GUAGAAGGGC GAGCUCUGGT T
21	GAUGCUCAAC ACCUCCUCCT T
22	GGAGGAGGUG UUGAGCAUCT T
23	UAAUUCAACA AAACUGUTT
24	GACAGUUUUA UUGAAUUAGT T
25	UAAUUCAACA AAACUGUTT
26	ACAGUUUUGU UGAAUUATT
27	AUGAUGAAGA CUCUGCUGCT T
28	GCAGCAGAGU CUUCAUCAUT T
29	UGAAUGAAGG GACUAACCUG TT
30	CAGGUUAGUC CCUUCAUUCA TT
31	CAGAAAUAGA CAAAGUGGGG TT
32	CCCCACUUUG UCUAUUUCUG TT
33	ACAGAGACUA AGGGACCAGA TT
34	ACAGAGACUA AGGGACCAGA TT
35	CCAGAGCUCG CCCUUCUACT T
36	GUAGAAGGGC GAGCUCUGGT T
37	GUCCCGCAUC GUCCGCAGCT T
38	GCUGCGGACG AUGCGGGACT T
39	CUAAUUCAAU AAAACUGUCT T
40	GACAGUUUUA UUGAAUUAGT T
41	AUGAUGAAGA CUCUGCUGC
42	GCAGCAGAGU CUUCAUCAU

본 발명의 siRNA 분자는 암 또는 치료 혜택이 표적화된 단백질의 발현의 저해에 의해 얻어지는 유형의 기타 질환을 가진, 인간 환자를 비롯한 환자를 치료하는 요법에서 이용된다. 본 발명의 siRNA 분자는 표적화된 mRNA 및 단백질의 조절을 위하여 적합한 플라즈마 및 조직 농도에 도달하도록 1회 이상의 치료 주기에 대해서 하루 한번 이상의 주사(정맥내, 피하 혹은 척추강내)에 의해 또는 연속적인 정맥내 혹은 척추강내 투여에 의해 환자에게 투여된다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "전립선암을 앓고 있는 포유류 대상체"란 포유류 대상체가 전립선암으로 확정적으로 진단된 것을 의미한다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "안드로겐-비의존형 전립선암"이란 안드로겐-의존형이 아닌(안드로겐 감수성이 아닌) 세포 및 세포를 주로 포함하고 있는 종양을 망라한다. 종종 안드로겐-의존형 세포는 안드로겐-의존형에서 안드로겐-비의존형으로 진행한다. 부가적으로, 몇몇 실시형태에 있어서, 안드로겐-비의존형 전립선암은 성장을 위하여 전반적으로 안드로겐-의존형이 아닌(안드로겐 감수성이 아닌) 종양을 망라할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 안드로겐 비의존형 전립선암은 호르몬 절제 요법(hormone ablation therapy)의 투여 및/또는 (호르본 봉쇄 요법(hormone blockade therapy)으로서) AR 길항제의 투여로 인해 진행되었다. 몇몇 실시형태에 있어서, 안드로겐-비의존형이 아닌 전립선암에 비해서 안드로겐-비의존형 전립선암의 AR 발현의 증가가 있다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "거세-저항성 전립선암"은 호르몬 절제 요법 혹은 호르몬 봉쇄 요법에 저항성이 있는 어떠한 안드로겐-비의존형 전립선암도 망라한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 거세-저항성 전립선암은 호르몬 절제 및/또는 호르몬 봉쇄 요법의 투여로 인해 진행되었다. 몇몇 실시형태에 있어서, 거세 저항성이 아닌 전립선암에 비해서 거세-저항성 전립선암의 AR 발현의 증가가 있다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "안드로겐-제거"는 전립선암을 앓고 있는 환자에서 안드로겐의 수준의 저감을 망라한다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "호르몬 봉쇄 요법"이란 안드로겐에 반응하는 수용체 혹은 세포 경로의 기능의 저감을 의미한다. 호르몬 봉쇄 요법의 비제한적인 예는 AR 길항제이다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "안드로겐 절제 요법"은 전립선암에 걸린 포유류 대상체에서 안드로겐-제거를 유발할 수 있는 임의의 요법이다. 안드로겐 절제 요법과 동의어인 본 명세서에서 이용되는 용어는 "안드로겐 제거" 및 "호르몬 절제 요법"이다. 안드로겐 절제 요법의 비제한적인 예는, 수술적(양쪽 고환의 제거) 거세와 의학적(테스토스테론의 약물 유도 억제 혹은 테스토스테론 유도 신호전달) 거세의 양쪽 모두를 포함한다. 의학적 거세는, LHRH 제제, 및 부신 등과 같은 샘으로부터 안드로겐 발현을 저감시키는 제제를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 각종 요법에 의해 달성될 수 있다(Gleave et al., 1999; Gleave et al., 1998).

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "AR 길항제"란, 안드로겐 결합, AR 신호 전달, 세포질에서 핵으로의 전좌 등과 같은 AR의 세포 수송, AR 단백질 수준, 또는 AR 단백질 발현을 포함하는, AR의 기능을 교란시키거나 저감시키는 제제를 지칭한다. AR 길항제는 AR-특이적 모노클로날 항체, AR 발현을 표적화하는 올리고뉴클레오타이드(예컨대 AR-표적화 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 RNA 유도 분자 등), AR에 특이적인 펩타이드 제제, 및 AR에 특이적인 소 분자 저해제를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. AR 길항제는 AR1, 바이칼루타마이드, 플루타마이드, 닐루타마이드, RD162 및 ZD4054 등과 같은 비스테로이드성 항안드로겐일 수 있다.

AR1은 하기 구조를 지니는 본 발명의 AR 길항제이다:

.

AR1을 위한 합성 방법은 미국 특허 제7,709,517 B2호에 기재되어 있으며, 이 문헌의 내용은 참조로 본 명세서에 병합된다. 대안적으로, AR1은 메디베이션사(Medivation, Inc.)(미국 캘리포니아주의 샌프란시스코시에 소재)로부터 입수할 수 있다. AR1에 대한 CAS 등록 번호는 915087-33-1이고, 그의 PubChem 번호는 15951529이다. AR1은 화학식 C₂₁H₁₆F₄N₄O₂S를 지니고, 또한 MDV3100 및 4-(3-(4-사이아노-3-(트라이플루오로메틸)페닐)-5,5-다이메틸-4-옥소-2-티옥소이미다졸리딘-1-일)-2-플루오로-N-메틸벤즈아마이드로 지칭된다. AR1은 AR에 대한 안드로겐 결합을 차단하고, 세포질로부터의 AR의 핵 전좌를 방해하며, 또한 AR-DNA 결합을 저해함으로써 작용하는 제2세대 경구 입수가능한 AR 길항제이다(Tran et al. 2009). AR1은 진행된 전립선암의 치료를 위한 임상 시험에서 현재 평가 중에 있다(Scher et al., 2010).

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "전사 활성"이란 1개 이상의 유전자의 발현 수준에 대한 영향을 초래하는 세포에서 DNA의 일부와 결합되거나 그렇지 않으면 직접 혹은 간접적으로 연합되게 되는 단백질의 능력을 지칭한다.

클러스테린 발현의 저해는 과도적(즉, 일시적)일 수 있고, 또한 AR 길항제의 투여 혹은 안드로겐 절제 요법과 병용하여 일어날 수 있다. 안드로겐-비의존형이 아닌 전립선암을 지닌 인간에 있어서, 이것은, 발현의 저해가 AR 길항제의 투여 혹은 안드로겐 제거의 1일 혹은 2일 내에 시작되어 그후 약 3 내지 6개월 동안에 이르기까지 유효하게 되어야 하는 것을 의미한다. 이것은 달성하기 위하여 다회 용량을 필요로 할 수 있다. 그러나, 그 시간의 기간은 본 발명의 범위로부터 벗어나는 일 없이 거세 전에 시작되어 그후 상당한 시가나에 이르기까지 더욱 연장될 수 있는 것임을 이해해야 할 것이다.

본 발명의 양상들은 안드로겐-비의존형 전립선암의 치료에 또한 전립선암이 안드로겐-비의존형으로 되는 것을 방지하는데 적용될 수 있다.

본 발명의 양상들은 거세-저항성 전립선암의 치료에 또는 전립선암이 거세-저항성으로 되는 것을 방지하는데 적용될 수 있다.

"병용"이란, 단일 치료 계획의 일부로서, 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드와 동일한 시간 및 빈도로, 또는 더욱 통상적으로, 상기 올리고뉴클레오타이드와 상이한 시간 및 빈도로 행해지는 것을 의미한다. 본 발명의 양상들은 AR 길항제의 투여 전, 후 및/또는 동안 올리고뉴클레오타이드의 투여를 포함한다. 따라서, AR 길항제는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드와 함께 이용될 수 있지만, 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드와는 상이한 시간, 상이한 용량 및 상이한 빈도로 투여될 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 밀리그램으로 측정되는 올리고뉴클레오타이드의 "양" 또는 "용량"이란, 약물 제품의 형태에 관계없이, 약물 제품에 존재하는 올리고뉴클레오타이드의 밀리그램을 지칭한다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드, AR 길항제, 또는 그들의 임의의 조합물의 양을 지칭할 때 "유효한"이란 본 발명의 방식에서 이용될 경우 합리적인 유익/유해비에 상응하는 과도한 부작용(독성, 자극 혹은 알레르기 반응 등) 없이 소망의 치료 반응을 수득하는데 충분한 올리고뉴클레오타이드, AR 길항제, 또는 그들의 임의의 조합물의 양을 지칭한다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "치료(혹은 처치)하는"이란, 예컨대, 전립선암의 진행의 저해, 퇴행 혹은 정체를 망라한다. 치료하는은 또한 전립선암의 임의의 증상 혹은 증상들의 예방 혹은 개선을 망라한다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 대상체의 질환 진행 혹은 질환 합병증의 "저해"란 대상체의 질환 진행 및/또는 질환 합병증을 예방 혹은 저감시키는 것을 의미한다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 전립선암과 관련된 "증상"으로는, 전립선암과 관련된 임의의 임상적 혹은 실험실적 징후를 포함하며, 대상체가 느끼거나 관찰할 수 있는 것으로 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 담체"란 합리적인 유익/유해비에 상응하는 과도한 부작용(독성, 자극 혹은 알레르기 반응 등) 없이 인간 및/또는 동물에 사용하기에 적합한 담체 혹은 부형제를 지칭한다. 이것은 본 발명의 화합물 및/또는 조합물을 대상체에게 전달하기 위한, 약제학적으로 허용가능한 용매, 현탁제 혹은 비히클일 수 있다.

투약 단위(dosage unit)

클러스테린 발현을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드의 투여는, 네이키드(naked) 투여 혹은 약제학적으로 허용가능한 지질 담체 중 투여를 비롯하여, 당업계에 공지된 각종 기전을 이용해서 수행될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 전달을 위한 지질 담체는 미국 특허 제5,855,911호 및 제5,417,978호에 개시되어 있으며, 이들 공보는 참조로 본 명세서에 병합된다. 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드는 정맥내(i.v.), 복강내(i.p.), 피하(s.c.) 혹은 경구 경로 또는 직접적인 로컬 종양 주사에 의해 투여된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 클러스테린 발현을 표적화하는 올리고뉴클레오타이드는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 투여된 올리고뉴클레오타이드의 양은 640㎎이다.

투여된 올리고뉴클레오타이드의 양은 전립선 세포 내의 클러스테린의 발현을 저해하는데 유효한 것이다. 이 양은 이용된 올리고뉴클레오타이드의 효과 및 사용된 임의의 담체의 속성 양쪽 모두에 따라서 변화될 것이라는 것을 이해할 수 있을 것이다.

투여된 클러스테린 발현을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 양은 40 내지 640㎎ 또는 300 내지 640㎎일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 투여는 7일 기간에 1회, 1주에 3회, 또는 7일의 기간 중 1, 3 및 5일째에, 또는 3, 5 및 7일째에 행할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 투여는 7일 기간에 1회보다 적은 빈도일 수 있다. 용량은 환자 체중에 의해 산출될 수 있고, 따라서 약 1 내지 20 ㎎/㎏, 또는 약 2 내지 10 ㎎/㎏, 또는 약 3 내지 7 ㎎/㎏, 또는 약 3 내지 4 ㎎/㎏의 용량 범위가 이용될 수 있었다. 이 용량은 필요에 따라서 소정 간격으로 반복된다. 하나의 임상적 개념은 1주의 치료 동안 3회 장입 용량으로 주 1회 투약하는 것이다. 투여된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 양은 암세포 내에서 클러스테린의 발현을 저해하기 위하여 인간 환자에 있어서 유효하게 되는 것으로 입증된 바 있다.

본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 전립선암의 치료를 위하여 요구되는 클러스테린의 발현을 표적화하는 올리고뉴클레오타이드의 양은 올리고뉴클레오타이드 단일요법에서 요구되던 것보다 AR 길항제와 병용 시 적어진다.

커스터센은 정맥내 투여용의 등장성의 인산염 완충 식염 용액으로서 20 ㎎/㎖의 농도로 제형화될 수 있고, 또한 단일의 바이알 중에 커스터센 나트륨 160㎎을 함유하는 8㎖ 용액으로서 공급될 수 있다.

커스터센은 0.9% 염화나트륨(정상 식염수) 250㎖에 첨가될 수 있다. 용량은 2시간에 절친 주입으로서 정맥내에 주변 혹은 중앙 유치 카테터를 이용해서 투여될 수 있다. 부가적으로, 주입 펌프가 이용될 수 있다.

AR 길항제의 투여는 경구, 비강, 폐, 비경구, 정맥내, 복강내, 관절내, 경피, 피부내, 피하, 국소, 근육내, 직장, 척추강내, 안구내 및 구강내(buccal)일 수 있다. AR1을 위한 바람직한 투여 경로는 경구이다. 당업자라면, 보다 높은 용량은 AR 길항제의 정맥내 주사보다는 경구 투여를 필요로 할 수 있다는 것을 인식할 것이다.

AR 길항제의 용량은 30㎎, 35㎎, 40㎎, 45㎎, 50㎎, 55㎎, 60㎎, 65㎎, 70㎎, 75㎎, 80㎎, 85㎎, 90㎎, 95㎎, 100㎎, 150㎎, 240㎎, 360㎎, 480㎎ 또는 600㎎일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, AR 길항제의 용량은 30㎎ 미만이다. 이들 실시형태에 있어서, 용량은 25㎎, 20㎎, 15㎎, 10㎎, 5㎎ 혹은 그 이하로 낮을 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, AR 길항제의 용량은 매일 투여된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 용량은 경구로 투여된다.

클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드의 투약 단위는 각각 단독의 것 혹은 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드와 AR1의 조합물은 정제, 캡슐, 환제, 분말, 과립, 엘릭시르, 팅크제, 현탁제, 시럽 및 에멀전으로서 경구 투약 형태로 투여될 수 있다. 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및/또는 AR 길항제는 또한 정맥내(구강 혹은 주입), 복강내, 피하, 혹은 근육내 형태로 투여되거나, 또는 직접, 예컨대, 주입 혹은 기타 방법에 의해, 전립선 암 병변 내로 혹은 상에 도입될 수 있고, 이들은 모두 약제학 분야의 당업자에게 충분히 공지된 투약 형태를 이용한다.

본 발명의 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및/또는 AR 길항제는 통상의 약제학적 관행에 따라서 그리고 의도된 투여 형태에 관하여 적절하게 선택된 적절한 약제학적 희석제, 증량제, 부형제 혹은 담체(일괄적으로 여기서는 약제학적으로 허용가능한 담체라 칭함)와 혼합하여 투여될 수 있다. 이 단위는 경구, 직장, 국소, 정맥내 또는 직접 주입 혹은 비경구 투여를 위한 적절한 형태일 것이다. 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및/또는 AR 길항제는 단독으로 혹은 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 투여될 수 있다. 이 담체는 고체 혹은 액체일 수 있고, 담체의 유형은 일반적으로 이용 중인 투여 형태에 의거해서 채택된다. 캡슐 혹은 정제는 용이하게 제형화될 수 있고, 삼키거나 씹기 용이하게 만들어질 수 있으며; 그외 고체 형태로는 과립, 및 벌크 산제를 포함한다. 정제는 적절한 결착제, 윤활제, 희석제, 붕해제, 착색제, 향미제, 유동 유도제 및 용융제를 함유할 수 있다. 적절한 액체 투약 형태의 예로는, 수중 용액 혹은 현탁제, 약제학적으로 허용가능한 지방 및 오일, 알코올 및 기타 유기 용매, 예컨대, 에스터, 에멀전, 시럽 혹은 엘릭시르, 현탁제, 비발포 과립으로부터 재구성된 용액 및/또는 현탁제 및 발포 과립으로부터 재구성된 발포 제제를 포함한다. 이러한 액체 투약 형태는, 예를 들어, 적절한 용매, 방부제, 유화제, 현탁제, 희석제, 향미제, 증점제 및 용융제를 함유할 수 있다. 경구 투약 형태는 선택적으로 향료 및 착색제를 함유한다. 비경구 및 정맥내 형태는 또한 이들을 주입 형태 혹은 채택된 전달 시스템과 적합하게 하는 미네랄 및 기타 물질을 포함할 수 있다.

클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및/또는 AR 길항제는 또한, 예컨대, 소형 단층 소포, 대형 단층 소포 및 다층 소포 등과 같은 리포솜 전달 시스템의 형태로 투여될 수 있다. 리포솜은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린 등과 같은 각종 인지질로부터 형성될 수 있다. 이 화합물은 조직-표적화된 에멀전의 성분으로서 투여될 수 있다.

액체 투약 형태의 경구 투여를 위하여, AR1은 임의의 경구, 비독성, 약제학적으로 허용가능한 비활성 담체, 예컨대, 에탄올, 글라이세롤, 물 등과 배합될 수 있다. 적절한 액체 투약 형태의 예로는, 수중 용액 혹은 현탁제, 약제학적으로 허용가능한 지방 및 오일, 알코올 및 기타 유기 용매, 예컨대, 에스터, 에멀전, 시럽 혹은 엘릭시르, 현탁제, 비발포 과립으로부터 재구성된 용액 및/또는 현탁제 및 발포 과립으로부터 재구성된 발포 제제를 포함한다. 이러한 액체 투약 형태는, 예를 들어, 적절한 용매, 방부제, 유화제, 현탁제, 희석제, 향미제, 증점제 및 용융제를 함유할 수 있다.

본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 전립선암의 치료를 위하여 요구되는 AR 길항제의 양은, AR 길항제 단일요법에 요구되던 것보다, 클러스테린의 발현을 표적화하는 올리고뉴클레오타이드와 병용 시 적어진다.

투약 단위는 단일 화합물 혹은 화합물들의 혼합물을 포함할 수 있다. 투약 단위는 경구 혹은 주사 투약 형태를 위하여 제조될 수 있다.

본 발명의 일 양상에 따르면, 투약 단위 형태로 포장된 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드-함유 약제학적 조성물이 제공되되, 여기에서, 각 투약 단위 중의 올리고뉴클레오타이드의 양은 640㎎ 이하이다. 상기 약제학적 조성물은 AR 길항제를 포함할 수 있고, 또한 추가로 나트륨 이온을 함유할 수도 있는, 주사 용액 혹은 현탁액일 수 있다.

본 발명의 다른 양상에 따르면, 암의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 클러스테린 발현을 표적화하는 올리고뉴클레오타이드 및 AR 길항제의 사용을 제공하되, 여기에서, 약제는 올리고뉴클레오타이드 640㎎ 이하의 용량을 환자에게 전달하도록 제형화된다. 약제는, 나트륨 이온을 함유할 수 있고/있거나, 주사가능한 용액의 형태일 수 있다.

본 발명에 유용한 투약 형태를 제조하는 일반적인 수법 및 조성은 이하의 문헌들에 기재되어 있다: 7 Modern Pharmaceutics, Chapters 9 and 10 (Banker & Rhodes, Editors, 1979); Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (Lieberman et al., 1981); Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 2nd Edition (1976); Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985); Advances in Pharmaceutical Sciences (David Ganderton, Trevor Jones, Eds., 1992); Advances in Pharmaceutical Sciences Vol 7. (David Ganderton, Trevor Jones, James McGinity, Eds., 1995); Aqueous Polymeric Coatings for Pharmaceutical Dosage Forms (Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Series 36 (James McGinity, Ed., 1989); Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol 61 (Alain Rolland, Ed., 1993); Drug Delivery to the Gastrointestinal Tract (Ellis Horwood Books in the Biological Sciences. Series in Pharmaceutical Technology; J. G. Hardy, S. S. Davis, Clive G. Wilson, Eds.); Modern Pharmaceutics Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol. 40 (Gilbert S. Banker, Christopher T. Rhodes, Eds.). 이들 문헌은 그들의 전체로서 본 명세서에서 본 출원 내에 참조로 병합된다.

본 발명은 이하의 실험 상세를 참조하여 더욱 잘 이해될 것이지만, 당업자라면, 구체적인 실험 상세는 본 발명을 단지 예시한 것에 불과하며 이는 후술하는 특허청구범위에 더욱 충분히 기재되어 있음을 용이하게 이해할 것이다.

실험 상세

실시예 1. 클러스테린 저해제 커스터센은 AR 길항제 AR1과 함께 거세-저항성 전립선암 모델에서 강력한 병용 요법이다.

서론 및 목적

AR 및 종양내 안드로겐 합성은 거세-저항성 전립선암(castrate-resistant prostate cancer: CRPC)의 종양 세포 생존 및 발달을 촉진시키는 것에 연류된다. AR1은 임상전 및 임상 연구에서 활성을 표시하였다. 이전의 연구는 안드로겐 절제 요법을 클러스테린 상향조절 및 거세 저항성과 연계시킨다. 안티센스 저해제인 커스터센은, 전립선암(CaP) 모델에서 거세 혹은 화학요법과 병용할 때 세포 사멸을 증가시킨다. 이하에, 거세-저항성 LNCaP 모델에서 진행을 지연시키는 커스터센 및 AR1 병용 요법의 능력이 테스트되었다.

방법

AR-양성 LNCaP 세포 증식(도 1 내지 4 및 도 6 내지 7) 및 생존(도 5)뿐만 아니라, 단백질(도 9, 도 11 및 도 13 내지 15) 및 유전자 발현(도 13 및 도 14)에 대한 AR1 및 커스터센 요법의 개별 대 병용의 효과는 크리스탈 바이올렛 검정법, 유세포 분석, 웨스턴 블로팅 및 RT-PCR을 이용해서 각각 분석되었다. AR 전사 활성은 PSA-루시페라제 리포터 검정법에 의해 측정된 반면, AR 분해는 사이클로헥시미드 추적 검정법에 의해 평가되었다. 실험에 이용된 LNCaP 세포주는 AR 양성이었다.

거세-저항성 LNCaP 종양 성장에 대한 병용 치료 효과는 거세된 수컷 무흉선 누드 마우스에서 평가되었다. 수컷 무흉선 누드 마우스는 마우스 옆구리 병변의 두 측면에서 마트리겔 내 LNCaP 세포로 배양시켰다. 일단 종양이 150㎣에 도달하였거나 혹은 PSA 수준이 50ng/㎖ 이상으로 증가하면 이들 마우스를 거세시켰다. 일단 종양이 거세 저항으로 진행되면(PSA 수준이 거세 전과 같은 수준까지 증가되면), 10마리의 마우스를 AR1 + 스프램블링된 안티센스 올리고뉴클레오타이드(SCRB) 또는 AR1 + 커스터센 처치군의 각각에 무작위로 할당하였다. 커스터센(10㎎/㎏/각 용량) 또는 SCRB(10㎎/㎏/각 용량)를 첫번째 주 동안 1일 1회, 이어서 주당 3회 정맥내 주사하였다. AR1(10㎎/㎏/각 용량)을 8 내지 12주 동안 주 당 7일 1일 1회(아침) 경구 투여하였다. 종양 체적을 주당 1회 측정하였다. 혈청 PSA를 주마다 결정하였다. PSA 배가시간(doubling time)(PSAdt) 및 속도를 로그-슬로프 방법(log-slope method)(PSA_t - PSA_초기 × e^mt)에 의해 계산하였다. 모든 동물 절차는, 적절한 기관 인증 및 동물 보호에 대한 캐나다 협회의 지침에 따라서 수행하였다.

결과

커스터센과 AR1의 병용은 커스터센 또는 AR1 단일요법에 비해서 용량 및 시간 의존적 방식으로 LNCaP 세포 성장 속도를 더욱 강력하게 억제하였다(도 1 내지 도 8). 놀랍게도, PARP 절단(도 15), 서브 G0/G1 아폽토시스 분율(도 7 및 도 8) 및 억제된 AKT 인산화(도 10 및 도 18)은 병용 요법으로 가장 증가되었다. 부가적으로, 커스터센은 AR1과 병용하여 AR 분해(도 15 내지 도 19 및 도 22)를 촉진시켰고, AR 전사 활성(도 20 내지 도 22)을 억제시켰다. 생체내, 커스터센 및 AR1의 병용은 스크램블링된 올리고뉴클레오타이드 대조군 및 AR1에 비해서 거세-저항성 LNCaP 종양 진행 및 PSA 진행(도 26 내지 도 29)을 상당히 지연시켰다(각각 12주에 p<0.05 및 p<0.05).

결론

AR1과 병용된 커스터센은 AR 수준 및 활성을 하향 조절하였고, 시험관내 및 생체내에서 거세-저항성 LNCaP 세포 성장을 억제하였으며, 이는 CRPC에서 AR-표적화 요법에 대한 촉망받는 접근법으로서 임상전 원리 증명을 제공한다.

실시예 2. 물질 및 방법

전립선암 세포주 및 시약

LNCaP 세포는 Leland W.K. Chung 박사(1992, MDACC, 텍사스주의 휴스턴시에 소재)에 의해 호의적으로 제공되었으며, 2009년 7월에 일루미나 게놈 어날라이저 IIx 플랫폼(Illumina Genome Analyzer IIx platform) 상에서 전체-게놈 및 전체-전사체 서열결정에 의해 테스트되고 증명되었다. LNCaP 세포는 5% 소 태아 혈청 및 2m㏖/ℓ L-글루타민으로 보충한 RPMI 1640(인비트로젠 라이프 테크놀로지즈사)에 유지하였다. 세포를 37℃에서 가습된 5% CO₂/대기 분위기에서 배양하였다. 사이클로헥시미드 및 MG-132는 칼바이오켐(Calbiochem), R1881(퍼킨-엘머사(Perkin-Elmer)), AR1(MDV-3100; 하오유안 케멕스프레스 유한회사(Haoyuan Chemexpress Co., Limited))로부터 구입하였다. 항체들: 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)로부터 항-GRP78, 항-CREB2(ATF4), CLU C-18, AR N-20, AR 441, PSA C-19, 유비퀴틴, pERK, β-튜불린 및 빈쿨린(vinculin); 인비트로젠 라이프 테크놀로지즈사로부터의 항-포스포-eIF2α; 임제넥스사(Imgenex Corp)로부터의 항-ATF6; 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)로부터의 Atg3, LC3, pAkt/Akt, pmTOR/mTOR, pp70S6K/p70S6K, 폴리(ADP 리보스)폴리메라제(PARP) 형태; 및 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터의 항-빈쿨린 및 항-β-액틴.

CLU siRNA 및 안티센스 처치

siRNA는, 앞서 기재된 바와 같은(Lamoureux et al., 2011) 스크램블 대조군 및 엑손 2에서의 인간 CLU 개시 부위에 대응하는 siRNA 서열을 이용해서, 다마콘 리서치사(Dharmacon Research, Inc.)로부터 구입하였다. 2'-O-(2-메톡시)에틸 변성을 지니는 제2세대 안티센스(커스터센) 및 스크램블링된(ScrB) 올리고뉴클레오타이드는 온코제넥스 파마슈티컬즈(OncoGenex Pharmaceuticals)로부터 공급되었다. 커스터센 서열(5'-CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT-3'; 서열번호 3)은 인간 CLU의 엑손 II에서 개시 부위에 상당한다. ScrB 대조 서열은 5'-CAGCGCTGACAACAGTTTCAT-3'(서열번호 44)였다. 전립선 세포는, 앞서 기재된 프로토콜(Lamoureux et al., 2011)을 이용해서 siRNA 혹은 올리고뉴클레오타이드로 처리하였다.

웨스턴 블로팅 분석 및 면역침강

총 단백질은 RIPA 완충액(50mM Tris, pH 7.2, 1% NP-40, 0.1% 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 100mM NaCl, 로슈 컴플리트 프로테아제 저해제 칵테일)을 이용해서 추출하고, 앞서 기재된 바와 같은 웨스턴 블롯(Zoubeidi et al., 2007)을 실시하였다. 면역침강을 위하여, 총 단백질(500㎍)은 4℃에서 1시간 동안 단백질-G 세파로스(인비트로젠 라이프 테크놀로지즈사)로 사전 세척하고, 대조군으로서 4℃에서 하룻밤 2㎍ 항-AR, 또는 면역글로불린 G(IgG)로 면역침강을 실시하였다. 면역 복합체는 2시간 동안 단백질-G 세파로스로 회수하고 나서, 방사선 면역침강 검정 완충액(RIPA)으로 적어도 3회 세척하고, 원심분리 후, SDS-PAGE를 실시하고 나서 웨스턴 블로팅을 실시하였다.

정량적 역방향 전사-PCR

총 RNA는 TRIzol 시약(인비트로젠 라이프 테크놀로지즈사)을 이용해서 48시간 처리 후 배양된 세포로부터 추출하였다. 총 RNA 2㎍은 트랜스크립터 퍼스트 스트랜드 cDNA 합성 키트(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit)(로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science))를 이용해서 역방향 전사시켰다. 상보적 DNA(cDNA)의 PCR 증폭의 실시간 모니터링은, SYBR PCR 매스터 믹스(Master Mix)(어플라이드 바이오시스템즈)를 구비한 ABI PRISM 7900 HT 서열 검출 시스템(어플라이드 바이오시스템즈) 상에서 DNA 프라이머(보충 테이블)를 이용해서 수행하였다. 표적 유전자 발현 5'-TACCAGCTCACCAAGCTCCT-3'(순방향; 서열번호 45) 또는 5'-GCTTCACTGGGTGTGGAAAT-3'(역방향; 서열번호 46) 표적화 인간 AR, 5'-CACAGCCTGTTTCATCCTGA-3'(순방향; 서열번호 47) 또는 5'-AGGTCCATGACCTTCACAGC-3'(역방향; 서열번호 48) 표적화 인간 PSA는, 내부 표준으로서 5'-AAATCTGGCACCACACCTTC-3'(순방향; 서열번호 49) 또는 5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'(역방향; 서열번호 50)를 이용해서 b-액틴 수준으로 정규화시키고, 경쟁적 사이클 역치(cycle threshold: Ct) 방법을 이용해서 표적 mRNA의 상대 정량화를 산출하였다. 각 검정법은 세벌로 수행하였다.

면역형광법

LNCaP 세포는 커버슬립 상에서 성장시키고, CLU siRNA 혹은 대조군으로 형질주입시켰다. 형질 주입 48시간 후의 세포를 6시간 동안 10uM AR1 ± 1nM R1881로 처리하였다. 처리 후, 세포를 3% 아세톤으로 완성된 빙냉 메탄올 중에서 -20℃에서 10분 동안 고정시켰다. 세포를 PBS로 3회 세척하고, 0.2% 트리톤(Triton)/PBS로 10분 동안 인큐베이팅하고 나서, 세척하고 30분 동안 3% 무지방 우유 중에서 차단시킨 후 항체를 하룻밤 첨가하여 AR(1:250)을 검출하였다. 항원은 FITC에 결합된 항-마우스 항체(1:500; 30분)를 이용해서 가시화하였다. 현미경사진은 제이스 액시오플란 II 형광 현미경(Zeiss Axioplan II fluorescence microscope)을 이용해서 20배 배율로 촬영한 후, 이미징 소프트웨어(imaging software)(Northern Eclipse, Empix Imaging, Inc.)로 분석하였다.

AR 전사 활성

LNCaP 세포를 12-웰 플레이트에 5×10⁴의 밀도로 파종하고, 다음 날 커스터센 혹은 SCRB로 형질 주입시켰다. 그 다음 날, 세포에, 앞서 설명된 바와 같이(Sowery et al., 2008), 리포펙틴(Lipofectin) 시약(웰당 1.5㎕; 인비트로젠)을 이용해서 레닐라-루시페라제 플라스미드 및 PSA-루시페라제(PSA-Luc) 레포터(-6,100 내지 +12)와 함께 커스터센 혹은 SCRB로 형질 주입시켰다. 24시간 후, 배지를, 48시간 동안 1 n㏖/ℓ R1881 혹은 에탄올 비히클 및 10 μ㏖/ℓ의 AR1 혹은 DMSO로 보충된 5% 차콜-스트립핑 혈청(charcoal-stripped serum: CSS)을 함유하는 RPMI(인비트로젠)로 교체하였다. 세포를 수확하고, 앞서 기재된 바와 같이(Sowery et al., 2008), 루시페라제 활성을 측정하였다. 리포터 검정은 임의 광 단위로 반딧불이 대 레닐라 비로 표현되는 레닐라 및 루시페라제 활성으로 정규화시켰다. 모든 실험은 세벌의 웰에서 수행하였고, 상이한 플라스미드 제제를 이용해서 5회 반복하였다.

세포 증식 및 세포 주기 검정법

배양된 세포에 CLU 혹은 SCR siRNA, 커스터센 혹은 SCRB로 형질 주입하고 나서, 형질 주입 24시간 후에 AR1 혹은 DMSO 대조군으로 처리하였다. 시간 과정 노출 후, 세포 성장은 앞서 기재된 바와 같이(Gleave et al., 2005) 크리스탈 바이올렛 검정법으로 측정하였다. 아폽토시스 세포 주기 모집단의 검출 및 정량화는, 앞서 기재된 바와 같이(Lamoureux et al., 2011), 2N 및 4N DNA 내용물에 기초하여 유세포분석기(Beckman Coulter Epics Elite; Beckman, Inc.)에 의해 분석하였다. CSS 상태에 대해서, LNCaP 세포는 그 다음 날 CSS로 교체되는 5% FBS를 지니는 RPMI에서 평판배양하고, FBS 상태와 동일하게 처리를 개시하였다. 각 검정은 세벌로 3회 실시하였다.

단백질 안정성 및 분해

AR 단백질 안정성에 대한 병용 치료의 효과를 평가하기 위하여, 커스터센 또는 SCRB로 치료된 LNCaP 세포를, 사이클로헥시미드 10 μ㏖/ℓ 및 AR1 10 μ㏖/ℓ를 함유하는 RPMI + 5% 혈청으로 48시간 후 교체하고, 2 내지 6 또는 16시간 동안 37℃에서 인큐베이팅한 후, Ar 및 빈쿨린 항체를 이용해서 웨스턴 블롯을 실시하였다. 분해는 MG132 10 μ㏖/ℓ 및 AR1 10 μ㏖/ℓ를 함유하는 RPMI+5% FBS 배지에서 6시간 인큐베이션하고, 24시간 후 siRNA 또는 ASO 형질 주입하여 LNCaP 세포에서 테스트하였다. AR 및 빈쿨린 항체를 이용해서 웨스턴 블롯을 실시하였다.

병용 요법의 증가된 효능의 결정

크리스탈 바이올렛 검정법은 각각의 단일 약물 혹은 그들의 조합에 대해서 세포 성장 저해를 분석하기 위하여 적용되었다. LNCaP 세포는 AR1의 용량 증가와 함께 병용된 10 n㏖/ℓ CLU siRNA 혹은 SCR siRNA 및 500 n㏖/ℓ 커스터센 혹은 SCRB 역시 이용해서 처리하였다. 다음에, 세포를 커스터센 혹은 올리고펙타민 단독을 용량 증가시켜 2일 연속하여 처리하고, 그 1일 뒤에 48시간 동안 표시된 농도의 AR1 또는 DMSO로 처리하였다. 이 데이터를 CalcuSyn(등록상표) 소프트웨어에 입력하고, 용량 효과 곡선을 각 처리에 대해서 그려, 수개의 유효 용량에서 병용 지수(CI)를 산출하였다(CI=1; 부가 효과, CI<1; 병용 효과, CI>1; 길항 효과).

동물 치료

수컷 무흉선 마우스(Harlan Sprague-Dawley, Inc.)에 1×10⁶ LNCaP 세포를 피하 주사하였다. 종양이 150㎣로 성장하고, 혈청 PSA가 50ng/㎖를 초과하면, 마우스를 거세시켰다. 일단 종양이 거세 저항성으로 진행하면, 마우스를 무작위로 할당하여 7일 동안 1일 1회, 이어서 그 후 주당 3회 정맥내로 AR1 + 10 ㎎/㎏ 커스터센 또는 SCRB를 투여하였다. 각 실험군은 13마리의 마우스로 구성되었다. 동시에, 마우스에 주당 7일 동안 10㎎/㎏/각 용량의 AR1을 1일 1회 복강내로 처치하였디. 종양 체적 및 혈청 PSA를 앞서 기재한 바와 같이(Sowery et al., 2008) 측정하였다. 모든 동물 절차는 동물 보호에 대한 캐나다 협의회의 지침에 따라 수행하였다. 각 3마리의 이종이식 마우스를 처치 개시 후 7일째에 희생시키고, 그 나머지는 연구의 말기에 채취하여 액체 질소 중에 스냅 동결(snap-frozen)시켰다. 단백질 추출은 프로테아제 저해제를 지닌 RIPA 완충액 중에 종양을 솔리시팅(soliciting)하여 행하였으며, 전체 세포 용해물은 웨스턴 블로팅에 대한 부문에서 기재된 바와 같이 β-튜뷸린을 참조하여 이종이식물 내에서 AR 및 클러스테린 발현을 평가하는데 이용하였다.

통계학적 분석

모든 결과는 평균 ± 표준 오차(SE)로서 표현된다. 투-테일드 t-테스트(Two-tailed t-test), 1방향 ANOVA 또는 윌곡슨 정합쌍 테스트(Wilcoxon matched-pairs test)를 통계학적 분석을 위하여 이용하였다. 병용 효과는 CalcuSyn 소프트웨어에 의해 산출하였다. 단일 처치와 병용 처치 간의 차이는 프리드만 테스트(Freidman test)에 의해 분석하고 JMP 버전 4를 이용해서 행하였다; *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001은 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 3. CLU는 AR1 저항성 세포 및 이종이식물에서 고도로 발현된다.

AR1은 AR LBD에 결합하여, 거세-저항성 이종이식물의 성장을 저해하는 신규한 항-안드로겐이다(Tran et al., 2009). 제II상 및 제III상 시험으로부터의 데이터는, AR1이 화학요법치료 전 및 후 양쪽 모두의 환자에서 활성이고, PSA 및 순환 종양 세포의 수준을 저감시키는 것을 나타낸다(Scher et al., 2010)(Sher, GU-ASCO, 2012). 불행하게도, 제1라인 호르몬 요법과 마찬가지로, CRPC-LNCaP 이종이식물은 AR1 첨가 후의 거세에 대한 저항성 기전을 발달시켰다. CLU는, 웨스턴 블롯(도 41a, 좌측 패널) 및 면역조직화학(도 41a 우측 패널, 도 30A)에 의해 비히클 처치된 종양에 비해서 AR1 저항성 종양에서 상향조절된 것으로 판명되었고, 이것은, AR1 처치가 거세 감수성 종양에서 거세에 의해 보여지는 것과 유사한 CRPC 종양 내의 스트레스 활성화 분자 샤페론 CLU를 유발하는 것을 시사한다. AR1 재발 기전의 연구를 용이하게 하기 위하여, AR1에 대해 저항성이었던 AR1 처치 하에 유지된 이종이식 종양으로부터 상이한 세포주를 생성하고, 이들 AR1 저항성 세포가 또한 CRPC 종양에 비해서 보다 높은 수준의 CLU를 발현하는 것으로 판명되었다(도 30B). 이들 데이터는, 증가된 CLU가 AR1 재발 표현형의 발달과 연관되는 것을 나타낸다.

실시예 4. AR 경로 저해는 CLU를 유발시킨다

두 AR1 안티센스 접근법은 CLU가 AR 경로 저해에 의해 유도되는지의 여부를 확인하는데 이용되었다. CSS를 이용한 바이칼루타마이드 및 안드로겐 결핍에 비해서, AR1은, PSA 발현 감소에 의해 표시되는 AR 활성화 저감과 병행하여, 시간- 및 용량-의존적 방식의 둘 모두로 CLU를 유발시킨다. CLU의 AR1 유도가 AR 의존적인지의 여부를 더욱 평가하기 위하여, AR 내 제1엑손을 표적화하는 2개의 상이한 안티센스 서열은, CLU의 유도와 병행하여, LNCaP 세포에서 용량-의존적 및 서열-특이적 방식으로 AR을 강력하게 하향 조절하였다(도 41c). 종합하면, 이들 데이터는, 안드로겐 결핍, AR LBD 길항작용 또는 안티센스 넉다운에 의한 AR 경로 저해가 가능하게는 적응성 스트레스 반응의 일부로서 CLU를 유도하는 것을 시사한다.

클러스테린 발현은 AR1 처치에 의해 상향 조절된다. 클러스테린 발현은 시간 및 용량 의존적 방식으로 AR1 처치 후 상향 조절된다. LNCaP 세포는 5% FBS를 지니는 RPMI1640 배지에서 AR1의 상이한 농도에서 상이한 기간 동안 처치되었다. 세포를 수확하고, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 클러스테린 단백질 발현은 시간 및 용량 의존적 방식으로 상향조절된다. 안드로겐 결핍 처치는 특히 AR1에서 클러스테린 발현을 증대시킨다. LNCaP 세포는 5% FBS 혹은 5% CSS(챠콜 스트리핑 혈청; 테스토스테론 결핍 배지)를 지니는 RPMI1640 배지에서 48시간 동안 바이칼루타마이드 혹은 AR1 10 μ㏖/ℓ로 처치하였다. 클러스테린 발현은 항-안드로겐 처치 혹은 CSS 상태에 의해 강력하게 유도된다. 부가적으로, 클러스테린 단백질 발현은 웨스턴 블롯 분석에서 바이칼루타마이드 처리에 비해서 AR1 처치에서 강력하게 증가한다. AR1과 커스터센의 병용은 바이칼루타마이드와 커스터센의 병용보다 전립선암 세포 증식 저감에 더욱 유효하다.

실시예 5. AR1은 ER 스트레스를 유발시킨다

AR1이 CLU의 증가와 함께 ER 스트레스를 유발시키는지의 여부가 평가되었고, CLU와 같은 분자 샤페론이 잘못 접힌 단백질 및 세포질 세망(ER) 스트레스 반응을 조절함에 있어서 중요하므로(Nizard et al., 2007), 많은 항암제가 ER 스트레스를 유발하는 것으로 공지되어 있다. ER 스트레스는, 단백질 번역을 저해하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS)을 통해서 ER-관련 단백질 분해를 촉진시킴으로써 단백질 호메오스타시스(항상성)를 재확립시키도록 맞춤화된, 접히지 않은 단백질 반응(unfolded protein response: UPR)이라 불리는 복합 세포내 신호전달 경로를 활성화시킨다. AR1은, ER 스트레스 및 UPR 활성화와 일치하는, GRP78, ATF4, IRE1, CHOP 및 절단된-ATF6 등과 같은 ER 스트레스 마커의 상향 조절에 따라서 CLU 발현을 유발하는 것으로 판명되었다.

실시예 6. AR1-유도 CLU는 p90Rsk-YB-1 신호전달 경로에 의해 매개된다.

YB-1은 ER 스트레스 후에 CLU 발현 증가를 유도하는 CLU 프로모터에 결합한다(Shiota et al., 2011). AR1은 AKT 및 ERK 신호전달을 활성화할 수 있으므로(Carver et al., 2011), Akt(Evdokimova et al., 2006) 및 Erk(Stratford et al., 2008) 경로의 AR1 매개 활성화가, 스트레스-유도 아폽토시스의 저해 및 CLU의 상향 조절과 함께, YB-1의 포스포-활성화 및 핵 전좌를 초래하는 것이 상정되었다(Evdilomova et al., 2006). 도 42b는 AR1 처치가 Akt 및 p90Rsk 인산화를 증가시키고, 포스포-YB-1 수준 증가를 수반하는 것을 확인해준다(도 42b). AR1 처치와 병용하여 siRNA를 이용하는 YB-1 넉다운은 단백질 및 mRNA 수준 둘 모두에서의 AR1-유도 CLU를 없애며(도 42c), 이는 AR1-유도 CLU가 YB-1에 의해 매개되는 것을 시사한다.

YB-1은 Akt 및 p90Rsk 둘 모두에 의해 인산화될 수 있으므로(Evdilomova et al., 2006)(Stratford et al., 2008), LY294002는 Akt를 저해하는데 이용되었고, SL0101은 p90Rsk를 저해하여, CLU의 AR1 유도 상향 조절을 매개하는 우세한 경로를 더욱 규정하는데 이용되었으며(도 42d); 이와 대조적으로, SL101을 이용하는 p90Rsk의 저해는 AR1-유도 CLU를 없앤다(도 42e). 어떠한 과학적 이론에도 얽매이기 원치 않지만, 총괄하여. 이들 데이터는 p90Rsk-YB-1 경로가 AR1 유도 CLU 발현을 필요로 하는 것을 나타낸다.

실시예 7. CLU 저해와 AR1의 병용은 CLU 저해 또는 AR1 단일요법에 비해서 LNCaP 세포 성장의 저해를 증가시킨다.

CLU 넉다운이 AR1의 항암 활성을 강력하게 하는지가 평가되었는데, 그 이유는 AR1과 마찬가지로(도 30 및 41) 항-AR 약물(July et al., 2002)이 처치 저항(treatment resistance)에서 매개체로서 CLU의 상향 조절 및 CLU 기능을 유도하기 때문이다(Zoubeidi et al., 2010b; Gleave et al., 2005). LNCaP 세포는 커스터센으로 처치하고, 이어서 AR1의 표시된 농도로 처치하였다. 커스터센은 AR1 활성을 상당히 증대시켜, 시간-(도 43a 좌측 패널) 및 용량-(도 43a 우측 패널) 의존적 방식의 둘 모두에서 ScrB + AR1 대조군에 비해서 세포 생존능(viability)을 저감시켰다. 이 효과가 부가적인지 혹은 병용 효과인지를 결정하기 위하여, 일정한 비율 설계를 지니는 용량-의존 효과 및 CI 값을 Chou 및 Talalay 중앙 효과 원리(Chou et al., 1984)에 따라서 산출하였다. 도 6B는 CI 플롯 측면을 따른 용량-반응 곡선(커스터센 또는 AR1에 의한 병용 또는 단일요법)을 나타내며, 이는 커스터센과 AR1의 병용이 종양 세포 성장에 대해 증강된 효과를 지니는 것을 나타낸다(도 6C, 우측 패널). 커스터센과 AR1의 병용은 또한 AR1 혹은 커스터센 단일요법에 비해서 AR 양성 거세 저항성 C4-2 및 커스터센-저항성 세포의 생존능 저감에서 증가된 효능을 지녔지만 AR 음성 PC3 세포에서는 그러하지 않았다.

유세포 분석은, 커스터센이 대조군 ScrB(15.2%), 커스터센(20%), 대조군 ScrB + AR1(18.3%)에 비해서 AR1(30%)과 병용할 경우 AR1 유발 아폽토시스(서브-G₁ 분율)를 상당히 증가시키는 것(P < 0.001)을 나타낸다(도 43c). 또한, 커스터센 + AR1의 병용은, 절단된 PARP 및 카스파제-3 활성에 의해 표시된 바와 같이, AR1 혹은 커스터센 단일요법에 비해서 카스파제-의존적 아폽토시스를 증가시킨다. 총괄하여, 이들 데이터는, 커스터센과 AR1의 병용이 커스터센 또는 AR1 단일요법보다 더욱 아폽토시스를 유발하는 것을 나타낸다.

실시예 8. AR1 처치와 병용된 클러스테린 넉다운은 대부분 AR 양성 LNCaP 세포에서 세포 성장 저해 및 아폽토시스를 증대시킨다.

LNCaP 세포를, 5% FBS 혹은 5% CSS 함유 RPMI 배지에서 웰 당 5×10⁴ 세포로 12-웰 배양 플레이트에 파종하였다. 다음 날, 세포에 2일 동안 CLU siRNA 혹은 SCR siRNA 대조군 10n㏖/ℓ로 한번, 또한 커스터센 또는 SCRB 대조군 500 n㏖/ℓ로 매일 형질주입하였다. 다음 날, siRNA 혹은 안티센스 올리고로 형질 주입 후, LNCaP 세포를 AR1 10μ㏖/ℓ로 처리하고, 세포 성장 검정을 크리스탈 바이올렛 검정에 의해 0, 1, 2, 3, 4일(100%로 규정된 AR1 처치 일)에 수행하였다. CLU 넉다운 + AR1 병용 처치는 세포 성장을 가장 유의하게 억제하였다. AR1 10 μ㏖/ℓ를 CLU siRNA 10 n㏖/ℓ와 병용하고; AR1 10 μ㏖/ℓ를 커스터센 500 n㏖/ℓ와 병용하였다.

병용 처치는 유세포 분석에서 LNCaP 아폽토시스를 증대시킨다. 세포를 5% FBS 함유 RPMI 배지에서 2일 동안 CLU siRNA 혹은 SCR siRNA 대조군 10n㏖/ℓ로 한번 그리고 또한 커스터센 또는 SCRB 대조군 500 n㏖/ℓ로 매일 처리하였다. 다음 날 siRNA 혹은 안티센스 올리고로 형질 주입 후, LNCaP 세포를 AR1 10μ㏖/ℓ로 처리하고, 48시간 처리 후 FACS 분석을 수행하였다. 서브-G0, G0-G1, S, G2-M 중의 세포의 비율은 요오드화프로피듐 염색에 의해 결정하였다. 병용 처치는 LNCaP 세포에서 서브-G0/1 세포사멸 분획 아폽토시스를 증가시켰다. 올리고펙타민 및 DMSO 대조군에 대해서 CLU siRNA와 AR1의 병용 시 p<0.01이었고, 커스터센과 AR1의 병용 시 p<0.001이었다. P값은 처치 부문과 그들의 각각의 대조군 간에 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001(윌콕슨 정합쌍 테스트)을 나타낸다.

병용 처치는 아폽토시스를 증대시켰다. LNCaP 세포는 CLU 혹은 SCR siRNA 및 커스터센 또는 SCRB 대조군으로 처리하기 전에 48시간 동안 AR1 10 μ㏖/ℓ로 전처리하였다. PARP 절단 발현 수준은 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. 모든 실험은 적어도 3회 반복되었다.

실시예 9. 커스터센의 AR1 처치와의 병용은 커스터센 또는 AR1 단일요법에 비해서 증가된 효능을 보인다.

성장의 저해는 시험관내에서 AR1과 병용된 CLU siRNA 혹은 커스터센으로 처리된 LNCaP 세포에서 관찰된다. 세포에는 5% FBS RPMI 배지에서 2일 동안 10n㏖/ℓ의 CLU siRNA 혹은 SCR siRNA 대조군으로 한번 그리고 또한 500 n㏖/ℓ의 커스터센 또는 SCRB 대조군으로 매일 형질 주입하였다. 다음 날 siRNA 혹은 안티센스 올리고로 형질 주입 후, LNCaP 세포를 각종 농도의 AR1로 처리하였다. 처리 이래로 3일 후, 세포 생존능을 크리스탈 바이올렛 검정법에 의해 결정하였다. 살아있는 세포 밀도는 DMSO 대조군에서 처리된 세포의 밀도로 정규화시켰다(AR1 화합물은 DMSO에 용해시키고 표시된 농도로 조절하였다). 커스터센과 AR1의 병합은 커스터센 또는 AR1 단일요법에 비해서 세포 생존능을 저감시킴에 있어서 증가된 효능을 보였다. 데이터 포인트는 세벌 분석 수단이다. P값은 처치 부문과 그들의 각각의 대조군 간에 *p<0.05, **p<0.01(스튜던트의 t-테스트)을 나타낸다.

세포 성장 저해는 크리스탈 바이올렛 검정법에 의해 각각의 단일 약물 혹은 그들의 병용에 대해 평가되었다. LNCaP 세포는 AR1 혹은 커스터센의 가변 농도에서 처리하였다. 각 단일 처치와 이들 병용 간에 유의한 차이가 있었다. P값은 프리드만 테스트에 의해 산출되었다. 데이터는, CalcuSyn 소프트웨어(등록상표)에 의해 입력하여 산출하였다. 바닥부는 수회의 유효 용량에서의 병용 지수(CI)이다. CI=1; 부가 효과, CI<1; 병용 효과, CI>1; 길항 효과. 이들 데이터는 병용 처치에서 병용 효과를 나타낸다.

실시예 10. 병용 치료에서의 AR 및 PSA 발현

AR 단백질 발현은 AR1과 병용된 커스터센을 이용해서 CLU 넉다운 후에 감소되었다. LNCaP 세포에는 5% FBS RPMI 배지에서 2일 동안 CLU siRNA 혹은 SCR siRNA 대조군 10n㏖/ℓ로 한번 그리고 커스터센 또는 SCRB 대조군 500 n㏖/ℓ로 매일 형질 주입시켰다. 다음 날 siRNA 혹은 안티센스 올리고로 형질 주입 후, LNCaP 세포를 AR1 10μ㏖/ℓ로 처리하였다. 48시간 후, 세포를 단백질 및 mRNA에 대해서 수확하였다. 단백질 발현은 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. AR1 처치와 조합된 CLU 넉다운은 단일요법에 비해서 AR 발현 감소에 있어서 증대된 역가를 지닌다. AR 발현은 AR1에 의한 CLU 넉다운에 의해 강력하게 억제되었다. 세포를 AR1 혹은 바이칼루타마이드 10μ㏖/ℓ와 병용된 CLU siRNA 혹은 SCR siRNA 10n㏖/ℓ로 처리하였다. AR 발현은 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다 병용 처치(즉, 병용 치료)는 AR mRNA 수준에 영향을 미치지 않는다. mRNA 발현은 정량적 RT-PCR에 분석되고, AR 및 PSA 수준을 β-액틴 mRNA의 수준으로 정규화하고, 평균 ± SE로서 표현하였다. **P<0.01 ***p<0.001(윌콕슨 정합쌍 테스트). "OTR"이란 올리고펙타민 단독으로 처리된 세포를 의미한다. OTR 및 DMSO 처리된 세포는 100%로 규정하였다.

실시예 11. AR1 + 커스터센의 병용은 CRPC LNCaP 종양 성장을 지연시키는 증가된 효능을 지닌다.

커스터센과 AR1을 병용한 스트레스 반응과 AR을 공-표적화(co-targeting)하는 생체내 효과를 평가하였다. LNCaP 이종이식물을 보유하는 수컷 누드 마우스는, 혈청 PSA가 75ng/㎖에 도달하였을 때 거세하였고, 그후 혈청 PSA 및 종양 성장 속도가 거세전 수준으로 다시 증가할 때까지 이어졌으며, 이는 거세 저항성으로 진행된 것을 나타낸다. 그 후 마우스를 AR1 + 대조군 ScrB(n = 10) 또는 커스터센(n=10)으로 치료를 위하여 무작위로 할당하였다. 기준선에서, 평균 LNCaP 종양 체적 및 혈청 PSA 수준은 양쪽 그룹에서 유사하였다. 커스터센은 AR1의 항종양 효과를 유의하게 증대시켰고, 대조군 ScrB에 비해서, 평균 종양 체적을 12주에 1600 ㎣에서 650 ㎣로 저감시켰다(**; p=0.05)(도 44A). 총 생존율(체중의 10%를 초과하는 종양 체적에 대해서 안락사로서 규정됨)은 AR1 + SCRB 대조군에 비해서 AR1 + 커스터센 병용에 의해서 유의하게 연장되었다(16주에 각각 90% 대 30%; *; p=0.05). 혈청 PSA 수준은, 또한 유의하게 낮았으며(대략 4배)(도 44C), PSA 배가시간은 AR1 대조군에 비해서 커스터센 + AR1 군(***, p<0.001)에서 유의하게 연장되었다(*, p<0.05). 표적 단백질 수준에 대한 병용 치료의 약동학 효과를 평가하기 위하여, 종양 조직(각각 3마리의 동물)으로부터의 웨스턴 블롯 분석을 AR, PSA 및 CLU에 대해서 수행하였다. 도 44D는, AR 및 CLU 발현 수준이 AR1 대조군에 비해서 병용-치료 종양 조직에서 저감된 것을 나타낸다. 총괄하여, 이들 데이터는 얻어진 CLU-조절된 스트레스 반응 및 AR의 공-표적화가 인간 CRPC 이종이식물 모델에서 AR1의 효과를 강화시키는 것을 입증한다.

커스터센과 AR1 병용 요법의 효능은 CRPC 이종이식물 모델에서 AR1 혹은 커스터센 단일요법에 비해서 증대되었다. 도 44A 내지 도 44B는 병용 처치에 의한 종양 체적 및 혈청 PSA 수준에 대한 효과를 나타낸다.

실시예 12. AR1 + 커스터센의 병용은 CRPC 이종이식 모델에서 증가된 효능을 지닌다.

LNCaP 세포를 무흉선 누드 마우스에 피하 접종하였다. 이종이식물이 대략 500 ㎣로 성장하거나 또는 PSA > 50 ng/㎖인 경우, 마우스를 거세시켰다. PSA 수준이 거세 전 수준으로 증가하면 처치를 시작하였다. 커스터센 또는 SCRB를 1주 동안 하루에 1회, 이어서 그 후 3회/주로 복강내 주사하였다. AR1은 하루 1회 투여하였다. 총 LNCaP 이종이식물 단백질은 AR1과의 커스터센 또는 SCRB 병용 처치(군당 3마리의 마우스) 후에 RIPA 완충액 중에서 추출하였고, AR, PSA 및 CLU 항체에 대해서 웨스턴 블롯을 수행하였으며; 빈쿨린은 장입 대조군으로서 이용하였다. AR/튜불린 비가 산출되었다. AR1 + 커스터센 병용은 CRPC 이종이식물 모델에서 연장된 생존에서 증가된 효능을 지닌다.

실시예 13. AR1 + CLU 침묵 병용은 AR1 혹은 CLU 침묵 단일요법보다 더 유효하게 AR 핵 전좌 및 전사 활성을 저감시킨다.

도 44에서의 생체내 연구는, AR1과 병용한 커스터센이 종양 체적의 변화가 명백해지기 전에 PSA의 급속한 감소를 유발한 것을 나타내고; 이에 부가해서, AR 단백질 수준은 AR1 단독 처치된 종양에 비해서 병용 처치된 종양에서 더 낮게 보였으며, 이것은 CLU 넉다운이 AR 표적화를 강화시키고 AR 신호전달 경로를 조정할 수 있었던 것을 시사한다. 안드로겐-유도된, AR-매개 유전자 활성화에 대한 병용 처치 효과가 평가되었다. LNCaP 세포는 AR1 혹은 커스터센 단독으로 또는 병용하여 처리하고, R1881 자극된 PSA 트랜스활성화의 변화에 대해 평가하였다(도 45A). 예상되는 바와 같이, AR1은, PSA 루시페라제 트랜스활성화 검정에 의해 측정된 바와 같이, R1881 유도 AR 전사 활성을 95%만큼 저감시켰고; 흥미롭게도 커스터센이 또한 AR 활성을 90%만큼 저감시켰으며, 이 효과는 AR1과의 병용 시 증대되었고, 이는 CLU 넉다운이 AR 활성의 AR1 저해를 강화시키는 것을 시사한다. CLU가 AR 전사 활성에 어떻게 영향을 미칠지를 규정하기 위하여, 리간드-유도 AR 핵 전좌에 대한 CLU 넉다운 ± AR1의 효과가 평가되었다. 예상되는 바와 같이, AR 핵 전좌가 AR1에 의해 감소되었지만, AR1과 조합된 CLU 넉다운은 R1881-유도 AR 핵 전좌를 최대로 저해하였다(도 45B). 이 공-표적화 저해 효과는 또한 분획 검정법(fractionation assay)에 의해 확인되었으며, 이는 AR1과 병용한 CLU 표적화가 R1881-유도 핵 AR 수준을 저해하는 것을 나타내었다(도 45C).

실시예 14. AR1 처치와 조합된 CLU 넉다운은 프로테아좀 경로를 통한 AR 분해를 촉진시킨다

병용 치료 후의 AR의 결말을 조사하기 위하여, AR 발현에 대한 AR1과 조합된 CLU 넉다운의 효과를 단백질 수준 및 mRNA 수준의 양쪽 모두에서 평가하였다. siRNA(도 46A 우측 상부 패널) 또는 커스터센(도 46A 좌측 상부 패널)을 이용한 CLU 침묵은 AR 단백질 감소를 초래하였지만, AR1과의 병용 시에 mRNA 수준만은 그러하지 않았는 바(도 46 하부 패널), 이는 AR1과 조합된 CLU 넉다운이 AR 안정성에 영향을 미칠 수 있는 것을 시사한다. AR 단백질 안정성은, 이어서 단백질 합성을 저해하는, 사이클로헥시미드를 이용해서 평가하였다. AR 단백질 수준은 커스터센이 AR1과 조합하여 CLU 넉다운을 저감시킨 후 신속한 분해를 상당히 감소시켰는 바(도 46B), 이것은 CLU 넉다운이 AR1과 복합체화된 경우 AR에 불안정성을 초래하는 것을 시사한다.

AR은 Hsp90과 헤테로다이머 복합체를 형성하여 리간드-미결합된 AR에 대해서 안정성을 제공한다. 실제로, Hsp90 결합이 없다면, 접히지 않은 단백질은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 인식되고 분해될 것이다(Solit et al., 2003; Zoubeidi et al., 2010c). AR1이 CLU 침묵과 병용된 경우 Hsp90에 대한 AR 결합, 그리고 그 후속 효과에 영향을 미치는지는 처음으로 평가되었다. AR1 처치는, 세포질 내에서 AR1이 AR을 봉쇄한다는 이전의 보고와 일치하여, AR-Hsp90 상호작용을 실제로 증가시킨다. 흥미롭게도, AR1과 조합된 CLU 넉다운은, 도 46C에 도시된 바와 같이, AR과 Hsp90 간의 연합을 감소시킨다. 어떠한 과학적 이론에도 얽매이는 일 없이, 이들 데이터는, AR1-AR-Hsp90 헤테로복합체가 CLU 침묵의 조건 하에 분해에 대해 더욱 취약하게 된다고 하는 관점과 일치한다. 이들 조건 하에 AR 분해가 유비퀴틴-프로테아좀 시스템과 연루되는지를 평가하기 위하여, 유비퀴틴화 AR의 수준은 단독 혹은 병용 요법 후의 조건 하에 측정되었으며, 도 46D에 도시된 바와 같이, AR 유비퀴틴화 수준은 공표적화된 병용 조건 하에 최고였다. AR 단백질 수준은 다음에 프로테아좀의 역할을 특성 규명하기 위하여 프로테아좀 저해제(MG132)의 존재 유무에서 평가되었으며, MG132는 CLU 넉다운 + AR1의 조건 하에 AR 분해를 없애는 것으로 판명되었고, 이는 프로테아좀을 통한 AR 분해를 의미한다(도 46E). 어떠한 과학적 이론에도 얽매이는 일 없이, 종합하면, 이들 데이터는, AR이 AR1에 결합될 경우, CLU 넉다운이 우선적으로 프로테아좀 매개 경로를 통해서 AR 분해를 촉진시키는 것을 시사한다.

실시예 15. AR 분해 속도는 병용 처리에 의해 촉진된다.

병용 처리는 AR 발현을 신속하게 감소시킨다. LNCaP 세포는 커스터센 또는 SCRB 대조군 500 n㏖/ℓ로 처리하고 나서, AR1 10 μ㏖/ℓ 및 사이클로헥시미드 10 μ㏖/ℓ를 각종 시간 주기에서 처리하였다. DMSO는 대조군으로서 이용하였다. AR 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였다. AR1에 의해 조합된 CLU 넉다운 AR의 프로테아좀 분해를 촉진시켰다. LNCaP 세포는 CLU siRNA 혹은 SCR siRNA 및 커스터센 또는 SCRB 대조군으로 처리하고, 이어서 AR1 10 μ㏖/ℓ 및 MG-132 10 μ㏖/ℓ로 6시간 동안 처리하였다. DMSO는 대조군으로서 이용하였다. AR 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였다.

실시예 16. 병용 처치는 AR 유비퀴틴화에 영향을 미친다.

LNCaP 세포는 FBS의 존재 하에 CLU siRNA 혹은 SCR siRNA 대조군 10 n㏖/ℓ로 처리하고 나서, AR1 10 μ㏖/ℓ 및 MG-132 10 μ㏖/ℓ로 처리하였다. 면역침강은 항-AR 항체(N-20)를 이용해서 행하고, 웨스턴 블롯 분석은 항-AR 항체(441) 또는 항-유비퀴틴 항체를 이용해서 행하였다. 입력은 AR (N-20) 항체로 블로팅하였다. 어떠한 과학적 이론에도 얽매이는 일 없이, 병용 처치는 AR의 유비퀴틴화를 통해서 AR의 프로테아좀 분해를 용이하게 하였다.

실시예 17. CLU 넉다운은 AR 안정성과 연루된 분자 공-샤페론의 수준을 감소시킨다.

어떠한 과학적 이론에도 얽매이는 일 없이, 여기서의 데이터는 AR1 단일요법이 세포질에서 AR-Hsp90 복합체를 봉쇄하는 것을 나타내지만; 그러나 CLU 넉다운과 조합되는 경우, AR-Hsp90-AR1 헤테로복합체는 불안정하게 되어, AR 유비퀴틴화 및 분해를 초래하여, AR 핵 수송 및 활성을 저감시켰다. 하나의 설명은 CLU 저해가 HSF-1 조절에 대한 그의 작용을 통하여 Hsp90 수준을 낮출 수 있다는 것이지만(Lamoureax et al. 2011); 그러나, 병용 요법은 Hsp90 수준을 상당히 낮추지 않았고, 도 42에 예시된 데이터는 주된 스트레스-활성화 전사 인자 매개 AR1가 CLU에서 증가됨에 따라서 YB-1을 연루시키고 있다. Hsp90이 클라이언트 단백질의 안정성을 부여하도록 공-샤페론과 협력하여 기능하므로, 편파적이지 않은 접근법이 CLU 발현에 의한 Hsp90 공-샤페론 작용을 확인하기 위하여 초기에 이용되었다. 본 명세서에 개시된 대조군 및 CLU siRNA로 처리된 LNCaP 세포 및 PC-3으로부터의 유전자 프로파일링 분석은 CLU 발현이 Hsp90 공-샤페론 FKBP52(Hsp56)와 상호관련되어 있는 것을 나타낸다. 웨스턴 블로팅은 CLU 넉다운이 FKBP52를 저감시키지만, FKBP51 혹은 Hsp90, 단백질 수준을 저감시키지 않는 것을 확인하는데 이용되었다(도 47A). AR1 처치 및 CLU 침묵 조건 하에 AR 안정성에서의 FKBP52의 역할을 확인하기 위하여, FKBP52는 CLU 넉다운 후에 과발현되었고, AR 발현이 평가되었다. 도 7B는 FKBP52가 CLU 넉다운 및 AR1 처치에 의해 유도된 분해로부터 AR을 저감시키는 것을 나타낸다. FKBP52 과발현은 또한 PSA 발현을 부분적으로 복구시키며, 이는 FKBP52 수준이 CLU 넉다운 조건 하에 복구될 경우 AR 활성을 증가시킨 것을 나타낸다. 이들 데이터는, AR1과 조합 시의 CLU 넉다운이 AR-공-샤페론 복합체의 안정성 및 FKBP52 수준에 영향을 미침으로써 AR 분해를 유도하는 것을 시사한다.

CLU가 AR1 유도 스트레스 조건 하에 FKBP52 수준을 어떻게 조절하는지를 더욱 규정하기 위하여, 공용 데이터베이스가 개발되었고, YB-1이 ChIP 분석에 대해 ChIP의 12개의 고도의 엄중함을 지니는 FKBP52에 결합하는 것을 지지하는 정보를 제공한다. 웨스턴 블로팅은 YB-1 넉다운이 FKBP52 발현 수준을 감소시키는 것을 확인해주었다(도 47C). AR1 처치는 CLU의 YB-1 트랜스활성화뿐만 아니라 Akt 및 p90rsk 활성 증가에 연루된 스트레스 반응을 활성화시킨다(도 42). YB-1 넉다운이 CLU 수준과 FKBP52 수준의 양쪽 모두를 감소시키고, CLU가 또한 p-AKT 활성을 증대시킬 수 있으므로, CLU 넉다운이 AR1 처치의 조건 하에 FKBP52 수준에 영향을 미치도록 YB-1, AKT 및 p90rsk 간의 상호활성에 어떻게 영향을 주는지는 다음에 연구되었다. 흥미롭게도, CLU가 AKT 인산화를 증대시킬 수 있다고 하는 이전의 보고와 마찬가지로, CLU 넉다운은, YB-1 및 p90Rsk의 AR1 유도 인산화를 없애는 것도 판명되었다(도 47D). 어떠한 과학적 이론에도 얽매이는 일 없이, p90Rsk-YB-1 경로는 AR1 유도 CLU 발현에 대한 주된 조절자이므로(도 42), 총괄적으로, 이들 데이터는 pYB-1, p90rsk, CLU, 및 AR 안정성, 핵 전좌 및 활성화에 대한 AR 공-샤페론 FKBP52와 연루된 AR1 처치-유도 순방향 공급 루프(AR1 treatment-induced feed forward loop)를 확인한다.

실시예 18. 병용 처리는 Akt/mTOR 신호전달 경로를 저해한다.

AR1은 AKT 및 ERK의 인산화를 활성화시킨다. LNCaP 세포를 각종 시간 주기 및 용량에서 5% FBS를 지니는 배지에서 AR1로 처리하였다. 웨스턴 블롯 분석은 포스포 Akt, 포스포 ERK, AKT 및 ERK 항체를 이용해서 행하였다. CLU 넉다운은 AR1 처리에 의한 포스포 Akt 활성화의 저해를 통해 Akt/mTOR 신호전달 경로를 약화시켰다. LNCaP 세포는 FBS의 존재 하에 CLU siRNA 혹은 SCR siRNA 대조군 10 n㏖/ℓ로 처리하고 나서, AR1 10 μ㏖/ℓ로 처리하였다. 처리 이래로 48시간 후, 포스포 Akt, 포스포 ERK, 포스포 mTOR, 포스포 P70S6K, Akt, ERK, mTOR 및 P70S6K 항체를 이용해서 웨스턴 블롯 분석을 행하였다.

실시예 19. AR 양성 상태에 대해서 AR1과 클러스테린 넉다운 간의 병용 효과의 가능한 설명.

AR에 대한 안드로겐 결합은 세포질에서 핵으로의 신속한 전좌를 초래하며, 이는 AR-조절된 유전자에 대한 활성화의 증대를 초래한다. 클러스테린은 AKT/mTOR 경로를 상향 조절하고, 이것은 세포 생존, 세포 증식 및 세포 성장을 초래한다. 커스터센 유도 클러스테린 넉다운은 AKT 인산화를 억제하고, 메갈린 발현의 억제를 통해서 세포 표면으로부터 안드로겐 수송을 약화시킨다. AR1은 AR에 강하게 결합하여, 핵으로의 그의 전좌를 저해한다. 어떠한 과학적 이론에도 얽매이는 일 없이, 이들 결과는 AR 프로테오좀 분해 및 하향 조절된 mTOR 신호전달 경로를 촉진시킨다.

실시예 20. AR1 처리와 병용된 클러스테린 넉다운은 C4-2 세포에서 세포 성장 저해 및 아폽토시스를 대부분 증대시키지만, AR 음성 PC-3 세포에서 병용 효과를 지니지 않는다.

C4-2 세포 성장은 병용 치료에 대해 평가하였다. C4-2 세포를 5% FBS 혹은 5% CSS 함유 RPMI 배지에서 웰당 3×10⁴ 세포로 12웰 배양 플레이트에 파종하였다. 다음 날, 세포를 CLU siRNA 혹은 SCR siRNA 대조군 10n㏖/ℓ로 형질 주입하였다. siRNA로 형질 주입 후 다음 날, C4-2 세포를 AR1 10 μ㏖/ℓ로 처리하고, 세포 성장 검정법을 크리스탈 바이올렛 검정법에 의해 0, 1, 2, 3, 4일(AR1 처리일은 100%로 규정됨)에 수행하였다. CLU 넉다운 및 AR1 병용 처리는 세포 성장을 가장 유의하게 억제하였다. PC-3 세포 성장은 병용 치료에 대해 평가하였다. PC-3 세포를 5% FBS 함유 DMEM 배지에서 웰당 3×10⁴ 세포로 12웰 배양 플레이트에 파종하였다. 다음 날, 세포를 2일 동안 CLU siRNA 혹은 SCR siRNA 대조군 10n㏖/ℓ로 한번 그리고 또한 커스터센 또는 SCRB 대조군 500 n㏖/ℓ로 매일 형질 주입하였다. 다음 날 siRNA 혹은 안티센스 올리고로 형질 주입 후, PC-3 세포를 AR1 10 μ㏖/ℓ로 처리하고, 세포 성장 검정법을 크리스탈 바이올렛 검정법에 의해 0, 1, 2, 3일(AR1 처리일은 100%로 규정됨)에 수행하였다. 병용 처리는 유세포 분석에서 LNCaP 아폽토시스를 증대시켰다. 세포를 5% FBS 함유 RPMI 배지에서 2일 동안 CLU siRNA 혹은 SCR siRNA 대조군 10n㏖/ℓ로 한번, 또 커스터센 또는 SCRB 대조군 500 n㏖/ℓ로 매일 처리하였다. 다음 날 siRNA 혹은 안티센스 올리고로 형질 주입 후, LNCaP 세포를 AR1 10μ㏖/ℓ로 처리하고, 처리 48시간 후 FACS 분석을 수행하였다. 서브-G0, G0-G1, S, G2-M에서의 세포의 비율은 요오드화프로피듐 염색에 의해 결정하였다. 병용 치료는 LNCaP 세포의 서브-G0/1 세포사멸 분획 아폽토시스를 증가시켰다. 1Ca: CLU siRNA와의 병용, 1Cb: 커스터센과의 병용.

실시예 21. 클러스테린 및 AR mRNA 발현은 AR1 처치 후 시간 및 용량 의존적 방식으로 상향 조절되었다

LNCaP 세포를 5% FBS를 지니는 RPMI1640 배지에서 AR1의 상이한 농도 및 상이한 시간에 처리하였다. AR1을 각종 농도 및 노출 시간에 처리하였다. 세포를 수확하여, 정량적 RT-PCR에 의해 mRNA 수준에 대해서 분석하였다. AR 및 CLU 수준은 β-액틴 mRNA의 수준에 대해서 정규화하고, 평균 ± SD로 표현하였다. 0시간의 AR1 노출 시간 및 0μ㏖/ℓ의 용량을 100%로 규정하였다. *P<0.05 **P<0.01 ***p<0.001(윌콕슨 정합쌍 테스트).

AR 단백질 발현은 안드로겐 결핍된 세포 및 안드로겐 자극된 세포의 양쪽 모두에서 CLU 넉다운을 AR1과 병용한 후에 감소되었다. LNCaP 세포에는 1 n㏖/ℓ의 R1881 함유 RPMI 배지에서 혹은 이것 없이 5% CSS에서 CLU siRNA 혹은 SCR siRNA 대조군 10n㏖/ℓ로 형질주입하였다. siRNA에 의한 형질 주입 후 다음 날, LNCaP 세포를 AR1 10μ㏖/ℓ로 처리하였다. 48시간 이후에, 세포는 단백질을 위하여 수확하였다. 단백질 발현은 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. AR1 처치와 병용된 CLU 넉다운은 CLU 넉다운 단독 혹은 AR1 단일요법보다 큰 효능으로 AR 발현을 감소시켰다.

논의

전립선암에서, 안드로겐 수용체(AR)는 거세 후 거세 저항성 진행을 계속해서 추진시켰다. AR1과 같은 새로운 AR 경로 저해제는 CRPC의 생존율을 연장시키지만, 저항성은 급속하게 진행되어, 종종 세포보호성 샤페론인 클러스테린(CLU)의 유도 및 AR 신호전달의 재활성화와 연관된다. 처치에 의해 활성화된 적응형 스트레스 경로는 획득된 처치 저항의 발달을 용이하게 할 수 있으므로, AR 저해에 의해 활성화되고 CLU를 통해 매개된 스트레스 반응의 공-표적화는, 조건 치사를 일으켜 성과를 향상시킬 수 있다. 여기에서의 데이터는, AR1을 커스터센과 병용함으로써 AR 및 스트레스-유도 CLU를 공-표적화하고, 거세 저항성 LNCaP 모델을 이용해서 병용 활성의 기전을 규정하는 것을 나타낸다.

AR1은 AKT 및 MAPK 시그날로솜(signalosome)뿐만 아니라 CLU를 비롯한, 샤페론 단백질 및 ER 스트레스 마커의 마커를 유도한다. 이 스트레스 반응은 p-YB-1, p90rsk 및 CLU에 연루된 순방향 공급 경로에 의해 조정되었다. CLU 넉다운 + AR1의 조합은 AR1 혹은 커스터센 단일요법에서 보여지던 것보다 아폽토시스 속도를 증대시킴으로써 LNCaP 세포 성장 속도를 억제시켰다. 생체내에서, 커스터센 + AR1의 병용은 거세-저항성 LNCaP 종양 진행 및 PSA 진행을 유의하게 지연시켰다. 기계론적으로, AR1은 AKT의 AR 크로스토크 활성화를 유도하고, MAPK 경로는 병용 요법으로 억제되었다. 흥미롭게도, CLU 넉다운은 또한, AR 공-샤페론 FKBP52의 감소된 HSF-1 및 YB-1 조절된 발현과 연루된 기전을 통해서, AR1과 병용될 경우 AR 분해를 촉진시켰고 또한 AR 전사 활성을 억제시켰다.

AR 경로 저해제에 의해 활성화되고 CLU를 통해 매개되는 공-표적화 적응형 스트레스 경로는, 조건 치사를 일으키고, 생물학적으로 합리적인 조합적인 임상 시험 설계를 안내하기 위한 기계론적 및 임상전 원리 증명을 제공한다.

전립선암은 가장 흔한 고형 악성 종양이고, 서구에서 남성의 암 사망 원인의 두번째를 차지한다(Siegel et al., 2011). 초기 단계 질환은 근치 수술 혹은 방사선요법으로 치료되지만, 국소적으로 진행되거나 재발성이거나 전이성인 전립선암에 대한 치료의 주축은 안드로겐 절제 요법이며, 이는 혈청 테스토스테론을 거세 수준까지 저감시켜 안드로겐 수용체(AR) 활성을 억제한다. 안드로겐 절제 후 높은 초기 반응 속도에도 불구하고, 거세 저항성 전립선암(CRPC)으로의 진행은 3년 내에 일어난다(Gleave et al., 2001; Bruchovsky et al., 2000; Goldenberg et al., 1999; Goldenberg et al., 1996; Gleave et al., 1998; Bruchovsky et al., 2006). CRPC 견본의 80% 이상이 AR 및 안드로겐-반응성 유전자를 발현하며(Chen et al., 2004), 이는 AR 축이 거세에도 불구하고 활성 상태로 유지되는 것을 나타낸다. 그러므로, AR은 CRPC의 주된 추진자이고, 치료-활성화 성장 인자 신호전달 경로(Miyake et al., 2000), 생존 유전자(Miyake et al., 1999) 및 세포보호성 샤페론 네트워크(Rocchi et al., 2004)에 의해 뒷받침된다. 도세탁셀 화학요법(Petrylak et al., 2004)은 CRPC의 생존을 연장시키는 제1요법이었으며, 이는 화학요법 전 및 후 상태로 치료 조망을 계층화시키고 있다. 더욱 최근에, 두가지 새로운 AR 경로 저해제인, CYP17 저해제 아비라테론(de Bono et al., 2011)과 AR 길항제 AR1(Tran et al., 2009)은, 유망한 생존 이득을 산출하였고, CRPC 조망을 신속하게 변화시키고 있다. 유의한 반응(Tran et al., 2009; Harris et al., 2009; Scher et al., 2010)에도 불구하고, 아비라테론 및 AR1은 처치 저항 및 재발성 CRPC 진행을 적응적으로 추진시키는 여분의 생존 경로를 활성화시킨다. 이들 신규한 AR 경로 저해제의 전체적인 가능성의 실현은 이들 스트레스-활성화 생존 반응 및 이들을 없애도록 설계된 합리적인 조합 공-표적화 전략의 특성규명을 필요로 할 것이다.

분자 샤페론은 신호전달 및 전사 조절 네트워크에서 현저한 역할을 하고 당백질 항상성을 유지함으로써 스트레스 반응에서 중추적인 역할을 한다. 클러스테린(CLU)은 거세후 억제되는 래트 전립선으로부터 "테스토스테론-억제된 전립선 메시지 2"(TRPM-2)(Montpetit et al., 1986)로서 본래 클로닝된 스트레스-활성화 샤페론이지만, 후속적으로 안드로겐-억제된 유전자보다 오히려 스트레스-활성화 및 아폽토시스-관련된 유전자로서 정의되었다(Cochrane et al., 2007). CLU는 HSF1(Lamoureux et al., 2011) 및 YB-1(Shiota et al., 2011)에 의해 번역 조절되어, 단백질 응집(Poon et al., 2002), p53-활성화 스트레스 신호(Trougakos et al., 2009) 및 입체 배치-변경된 Bax(Zhang et al., 2005; Trougakos et al., 2009)를 억제함으로써 스트레스-유도 아폽토시스를 저해하는 한편, NF-κB 및 HSF-1의 트랜스-활성화(Lamoureux et al., 2011; Shiota et al., 2011; Poon et al., 2002; Trougakos et al., 2009; Zhang et al., 2005; Ammar et al., 2008; Zoubeidi et al., 2010a) 및 Akt 인산화(Ammar et al., 2008)를 증대시킨다. CLU는 전립선을 비롯하여 많은 인간 암에서 발현되며(Yom et al., 2009; Kruger et al., 2007; Zhang et al., 2006), 이때 이것은 이후의 거세를 증가시키고, CRPC에서 고도로 발현되게 된다(July et al., 2002). CLU 과발현은 처치 저항을 부여하는 한편(Miyake et al., 2000), CLU 저해는 많은 임상전 모델에서 대부분의 항암 요법의 활성을 강화시킨다(Miyake et al., 2005; Sowery et al., 2008; Gleave et al., 2005; Zoubeidi et al., 2010b). CLU 저해제인 OGX-011(커스터센, OncoGenex Pharmaceuticals)은, CRPC에서 무작위 제II상 연구가 도세탁셀 화학요법과 병용될 경우 총 생존율의 7개월 이득 및 50% 감소된 사망속도(HR=0.50)를 보고한 후에(Chi et al., 2010) 현재 제III상 시험 중에 있다.

CLU는 거세를 비롯한 처치 스트레스에 의해 유발되고 스트레스 반응의 중요한 매개체로서 기능하므로, AR1 처치가 스트레스 반응과 CLU를 유발하는 것과, CLU에 의해 매개된 AR 및 스트레스-반응 경로를 공표적화하는 것이 조건 치사성을 형성하고 암 제어를 개선할 수 있다고 하는 여기서의 가설이 테스트되었다. 여기에 기재된 데이터는, AR1 처치 스트레스 및 저항을 CLU 유도와 상관시키고, CLU 활성화를 조절하는 경로를 확인하며, CRPC에서 CLU 저해가 항-AR 요법을 강화시키는 기전을 규정하려고 착수하였다.

암세포를 사멸시키는데 이용되는 많은 전략은 치료 저항의 발생과 생존을 촉진시키는 스트레스- 및 여분의 생존을 유도하며, 이는 대부분의 암 사멸을 위한 하부 기초이다. 이 치료적 저항은 치료의 선택적 압력에 의해 활성화된 선천적인 그리고 적용적인 생존 경로의 다윈의 상호작용으로부터 기인된다. 전립선암에서, 안드로겐 절제는 대부분의 환자에서 종양 세포 아폽토시스 및 임상적 반응을 유발하지만, 거세 저항성 전립선암(CRPC)에 대해서 2 내지 3년 내에 진행을 개시한다(Gleave et al., 2001; Bruchovsky et al., 2000; Goldenberg et al., 1999; Goldenberg et al., 1996; Gleave et al., 1998). 실험적으로, CRPC 진행은 생존 인자(Miyake et al., 2000; Culig et al., 2004; Craft et al., 1999) 및 생존 유전자(Miyake et al., 1999; Gleave et al., 1999; Miayake et al., 2000; Rocchi et al., 2004; Miyake et al., 2000) 네트워크에 의해 뒷받침되는 AR 축의 재활성화(Miyake et al., 2000; Miyake et al., 1999)에 연유한다. 아비라테론 및 AR1과 같은 최근의 새로운 AR 경로 저해제(Rocchi et al., 2004)는 생존을 연장시키고 CRPC의 주된 추진자로서 AR을 임상적으로 입증하는 것으로 나타났다(Miyake et al., 2000; Miyake et al., 1999). 모든 환자가 이들 저해제에 반응하는 것은 아니고, 저항은 많은 초기 반응자에서 전개되며(Petrylak et al., 2004); 게다가, 질환 진행은 빈번하게 상승하는 PSA 수준과 상관 관계가 있고, 이는 계속된 AR 신호전달을 나타내며, CRPC에서의 처치 저항의 분자 기반을 표적화하는 추가의 요법에 대한 필요를 강조한다. AR과 여분의 생존 경로 간의 상호작용을 규정하는 것은, 진행을 제어하고 성과를 개선하는 새로운 병용 전략을 구축할 것이다.

CRPC 내의 지속적인 AR 신호전달은, DHT 및 기타 스테로이드의 낮은 수준에 대한 감수성을 증가시키는 AR 증폭 및 돌연변이(Miyake et al., 2000; Miyake et al., 1999; Zoubeidi et al., 2007), 또는 LBD를 결여하는 보존적으로 활성인 절두된 수용체를 추진하는 AR 스플라이스 변이(Nizard et al., 2007; Carver et al., 2011; Evdokimova et al., 2006)를 일으키는 것으로 상정된다. 기타 AR-관련 기전은 AR 공활성제 혹은 공-샤페론(hsp27)의 변경된 수준 및 활성화된 src 혹은 EGFR과 같은 티로신 키나제 수용체를 통한 AR 인산화를 포함한다(Chi et al., 2010). 다른 더욱 동적인 기전은 AR 경로와 PI3K 경로 간의 왕복 피드백 조절에 연루됨으로써, AR 저해는 AKT 포스파타제 PHLPP의 수준을 저감시킴으로써 AKT 신호전달을 활성화시키고, PI3K 저해는 HER 키나제의 피드백 저해를 완화시킴으로써 AR 신호전달을 활성화시키며; 한쪽의 저해는 다른 쪽을 활성화시키고, 이에 따라서 생존을 증대시킨다. 이들 기계론적 통찰은, 히스톤 데아세틸라제(de Bono et al., 2011), src, AKT, 및 AR 샤페론 열-충격 단백질(Hsp)-90 및 Hsp27에 대한 저해제에 의한 AR 경로를 공표적화하는 병용 요법의 설계를 가이드하고 있다.

AR 경로 저해제에 의해 활성화된 스트레스 반응을 저해하는 것은 또 다른 병용 공-표적화 전략이다. 많은 항암제는 ER 스트레스를 유발하며(Rutkowski et al., 2007), 이는, 단백질 번역을 저해하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS)을 자극시켜 ER-관련 단백질 분해(ERAD)를 증대시킴으로써 단백질 항상성을 재확립시키도록 맞춤화된, 접히지 않은 단백질 반응(UPR)이라 불리는 복합 세포내 신호전달 경로를 활성화시킨다(Harding et al., 2002). CLU와 같은 샤페론은 ER 스트레스 반응의 주된 매개체이다. AR 경로 저해는 모두 거세 저항과 연루되는 ER 스트레스 및 AKT의 상호 경로 활성화를 지니는 CLU를 유도하는 것을 알려져 있다. 이들 이전의 보고와 일치하여, 여기에서의 데이터는, AR1이 ER 스트레스 및 UPR을 유도하고, 증대된 AKT 및 MAPK 신호전달과 병행하여, CLU 활성화에 대한 스트레스-유도 YB-1 활성 간에 순방향 공급 링크를 규정하도록 진행하고, 이는 총괄하여 AR1 처치 조건 하에 AR 안정성 및 활성을 뒷받침하는 것을 나타낸다. YB-1과 CLU는 둘 모두 항-암 치료 저항과 기능적으로 관련된 스트레스-활성화 생존 샤페론 단백질이다(Poon et al., 2002)(Zoubeidi et al., 2007). 스트레스 조건 하에, YB-1은 AKT(Evdokimova et al., 2006) 및 p90RSK(Gleave et al., 2005)에 의해 포스포-활성화되어, 표적 프로모터에의 결합 및 그의 핵 전좌를 자극시킨다. CLU는 스트레스-유도 YB-1 활성 및 파클리탁셀 저항성의 임계적인 하류 매개체에 의해 전사되고 또한 이 매개체로서 작용한다(Shiota). YB-1은 또한 소정의 스트레스-관련 전사물의 번역을 조절하는 mRNA 샤페론 단백질로서 기능할 수 있다(Law et al., 2010; Evdokimova et al., 2009). 상이한 플랫폼 기술에 의한 마이크로어레이에 혼성화된 YB1 RNA-IP를 이용한 바, YB1은 CLU mRNA에 결합하는 것으로 판명되었다. 여기에 개시된 데이터는, AR1이 ER 스트레스를 유발한 후에 YB1이 CLU mRNA에 우선적으로 결합하는 것을 나타내고, 또한, YB1이 상이한 폴리리보좀 분획(polysomal fraction)에서 CLU-mRNA와 관련되는 것을 나타낸다. 폴리리보좀 분획은 번역 기구의 리보좀 혹은 다른 요소에 의해 결합되는 번역 활성 mRNA를 나타내고, 폴리리보좀 후 mRNA이 리보좀 결합되며, 따라서 번역 불활성이므로(Evdokimova et al., 2009; Evdokimova et al., 2006a), CLU mRNA는 이들 분획으로부터 증폭될 것이다. 이들 데이터는, YB-1이 전사를 매개할 뿐만 아니라, AR1 유발 ER 스트레스에 응답하여 CLU의 번역 유도를 매개하는 것을 나타낸다.

CLU는 처치 저항 및 암 진행과 밀접하게 관련된 스트레스-활성화 분자 샤페론이며(Miyake et al., 2000; Gleave and Miyake, 2005; Trougakos and Gonos, 2009b), 여기서 그의 과발현은 광범위 처치 저항을 부여한다(Tran et al., 2009; Yom et al., 2009). 거세 및 기타 처치 스트레서와 마찬가지로, AR1은 CLU 발현 수준을 증가시키며; 게다가, CLU 수준은 AR1 저항성 종양에서 보다 높은데, 그 이유는, 이들이 거세 나이브 암에 비해서 CRPC 내에 있기 때문이다. CLU는 HSF-1에 의해 전사 조절될 뿐만 아니라, 순방향 공급 방식에서 HSF-1-매개 전사 활성을 증대시킨다(Lamoureax et al., 2011). CLU는 또한 (JAK/stat을 통한) IL-6 및 (Src-MEK-ERK-Erg-1을 통한) IGF-1R 신호전달 경로의 하류 및 AR을 포함하는 생존촉진 경로에 의해 활성화된다. CLU는 단백질 응집, p53-활성화 스트레스 신호, 및 입체 배치적으로 변화된 Bax를 저해함으로써 스트레스-유도 아폽토시스를 억제하는 한편(Zhang et al., 2005; Trougakos et al., 2009), NF-κB 및 HSF-1의 Akt 인산화(Sowery et al., 2008; Chou et al., 1984) 및 트랜스-활성화를 증대시킨다.

CLU에 대한 이 응력-활성화 항-아폽토시스 기능은 다수의 항암 요법에 대한 광범위 저항을 초래하고, 이를 잠재적인 항-암 표적으로서 확인해준다. CLU 안티센스 저해제인 커스터센은 많은 임상전 암 모델에서 치료 스트레서와 조합하여 암세포 사멸을 증대시킨다. 실제로, 무작위화된 제II상 연구가 커스터센이 도세탁셀에 첨가된 경우 상당한 생존 유익을 보고한 후에 도세탁셀 + 커스터센 병용 제III상 임상 시험이 CRPC에서 진행 중에 있다(Zoubeidi et al., 2010b; Culig et al., 2004). CLU 저해가 안드로겐-의존형 이종이식물에서 거세를 증대시키고 CRPC에 대한 시간을 지연시키는 것을 보고한 바 있었지만, 순수한 AR 길항제 AR1은 이제 CRPC 모델에서에서 시험관내 및 생체내에서의 처리 반응에서 AR 경로 저해 및 CLU의 효과의 연구를 가능하게 하고 있다. 여기에 개시된 데이터는, CLU가 AR1-감수성 및 저항성 LNCaP 세포에서 AR1 및 AR 넉다운 후에 각각 유도되고, CLU가 대부분의 AR1 저항성 LNCaP 이종이식물 및 세포주에서 고도로 발현된 채로 유지되는 것을 확립시켰다. AR1 + 커스터센을 이용해서 AR 및 CLU를 공-표적화하는 것은 단일요법에 걸쳐서 아폽토시스 속도를 증대시켰다. 기계론적으로, AR1은 AKT의 크로스토크 활성화를 유도하고, MAPK 경로는 병용 요법에 의해 억제되었다. 예상외로, 본 발명자들은, AR1이 CLU 넉다운과 조합된 경우 AR 유비퀴틴화 및 프로테아좀-매개 분해 속도가 촉진된 것을 발견하였다. AR1 단독이 AR 안정성을 변화시키지 않지만, CLU가 저해된 경우, YB-1 및 MAPK의 스트레스-활성화는 둔화되어, AR 공-샤페론인 Hsp56(FKBP52) 및 Hsp90의 감소된 YB-1 활성화 발현을 초래하여, AR의 유비퀴틴화 및 프로테오좀 분해를 유발하고, AR1 단일요법 및 심지어 AR1 저항성 세포주에서 관찰되던 것을 능가하여 AR 전사 활성을 저감시켰다.

이들 결과는, Hsp90 저해 후에 Hsp70 및 Hsp27의 HSF-1-매개 트랜스활성화를 증대시키는 그의 능력과 마찬가지로, 정황 의존적 스트레스 조건 하에 다른 분자 샤페론의 YB-1 매개 발현을 뒷받침함에 있어서 CLU의 역할을 강조한다(Lamoureax et al., 2011). CLU에 부가해서, HSF-1 및 YB-1은 AR 및 기타 스테로이드 수용체의 접힘, 트래킹 및 전사 활성화 과정과 연루된 다른 분자 샤페론의 발현을 조정한다. 리간드의 부재 시, AR은 Hsp90 및 Hsp70, 그리고 Hsp56과 같은 공-샤페론으로 구성된 거대한 동적 이종복합체에 의해 비활성이지만 고도로 반응성인 상태에서 현저하게 세포질 유지된다. 이들 Hsp AR 공-샤페론은 AR 안정성 및 활성화에 중요한 역할을 한다(Cheung-Flynn et al., 2005; Yang et al., 2006). 리간드 결합은 AR의 입체형태 변화 및 대형 Hsp 복합체로부터의 해리를 초래하여 표적 유전자의 핵 수송 및 전사 활성화를 위하여 Hsp27을 촉진시킨다(Zoubeidi et al., 2006; Abdul et al., 2001). AR 핵 수송을 저해하지 않는, 제1세대 AR 길항제 바이칼루타마이드에 비해서, 본 발명자들은 AR1-결합된 AR이 세포질을 유지하고 그의 Hsp 샤페론, Hsp90 및 FKBP52와 복합체화된 것을 나타내고 있다. Hsp 공-샤페론과 복합체화된 AR의 이 세포질 구속은 ER 스트레스 및 샤페론 억제의 조건 하에 분해에 대한 그의 감수성을 증가시킬 수 있다.

어떠한 과학적 이론에도 얽매이는 일 없이, 여기에서의 데이터는 AR 경로 저해 후에 활성화된 MAPK 및 Akt 신호전달 경로의 억제를 통해서, CLU 저해가 항-AR 요법을 강화시키는 다른 기전을 확인해준다. 여기서의 데이터는 AR1이 Akt 인산화를 유도한다고 하는 이전의 보고를 확인해주고, 또한, MAPK와 p90rsk가 AR1에 의해 활성화되어 YB-1 인산화를 매개하는 것을 보여준다. 여기서의 결과는 AR1과 조합된 CLU 넉다운이 Akt 및 p90rsk 활성화의 둘 모두를 없애는 것을 입증한다.

어떠한 과학적 이론에도 얽매이는 일 없이, 여기에서의 데이터는 CLU의 AR1-유도 YB-1 트랜스활성화에 연루된 스트레스-유도 공급물-순방향 루프를 규정하며, CLU는 생존 촉진 AKT 및 p90rsk 신호전달, YB-1의 포스포-활성화, 그리고 AR1 처치의 조건 하에 AR을 안정화시키는 AR 공-샤페론의 발현을 용이하게 한다. AR 경로 저해제에 의해 활성화되고, CLU를 통해서 매개된, 공동-표적화 적응성 스트레스 경로는, AR1에 의해 유도된 Akt 및 MAPK 신호전달 경로의 활성화뿐만 아니라, AR 발현 수준 및 활성을 저감시킴으로써 항-AR 활성을 강화시켰다. 이들 결과는, AR1 및 커스터센에 의한 병용 임상 연구를 뒷받침하는 기계적 및 임상전 원리 증명을 제공한다.

본 발명의 양상들은, 커스터센 등과 같은 클러스테린 발현을 표적화하는 올리고뉴클레오타이드가, 병용으로서 AR 길항제와 함께, 전립선암의 치료를 위하여 어느 한쪽 제제의 단일요법보다 더욱 강력하다고 하는 예기치 않은 발견에 관한 것이다. 이 증가된 효능은, 암세포 사멸 증가에 부가해서, 암세포 증식의 저감, 세포질에서 핵으로의 AR의 전좌 저감, AR의 전사 활성의 저감, PARP 절단 증가, AKT 인산화 저감, ERK 인산화 저감 및 AR 단백질 분해 증가를 포함한다. 도 30은 AR1 저항성 전립선암 종양이 클러스테린 발현을 증가시키는 것을 나타낸다. 어떠한 과학적 이론에도 얽매이는 일 없이, 여기에서의 데이터는, AR1에 대한 이들 종양의 저항성이 클러스테린 발현 증가에 연유할 수 있고, 따라서, 클러스테린 발현 감소는 AR1 처치에 대한 AR1 저항성 종양의 감수성을 증대시키는 것을 반영할 수 있다. 이와 같이 해서, AR1 저항성 전립선암 세포는 커스터센과의 동시 치료에 의해 AR1에 대해 감수성으로 된다.

AR1은 전립선암 세포에서 자가포식을 유발하고(도 38), 클러스테린 침묵은 ER 스트레스-유도 자가포식을 저해할 수 있다. 자가포식은 악조건 하에서 스트레스 내성을 부여하고 세포 생존능을 지속시킬 수 있는 세포내 분해 동안 잘 보존된 라이소좀 분해 경로이다. 어떠한 과학적 이론에도 얽매이는 일 없이, AR1 처치 후의 자가포식 증가는, 전립선암 세포 생존을 증가시킬 수 있고, 클러스테린 발현의 저해는 이 증가된 자가포식을 저해하며, 이에 따라서 암세포 생존 감소와 AR1 활성 증대를 초래하는 것이 가능하다.

어떠한 과학적 이론에도 얽매이는 일 없이, 클러스테린 발현 감소는 FKBP52 및 Hsp27 등과 같은 AR 공-샤페론의 HSF-1 매개 조절의 억제를 통해서 AR 안정성을 감소시킴으로써 AR1의 활성을 증대시킬 수 있다.

어떠한 과학적 이론에도 얽매이는 일 없이, 클러스테린 발현 감소는 AR1 처치 후의 AKT 수준 및/또는 인산화의 유도를 저감시킴으로써 AR1의 활성을 증대시킬 수 있다.

AR1 단일요법은 인간에서 거세-저항성 전립선암을 치료할 수 있지만; 그러나, 커스터센 단일요법은 임의의 모델 시스템에서 안드로겐-비의존형으로 진행한 후에 전립선암의 진행을 저해하는 것으로 나타나지 않았다. 따라서, AR1과 커스터센의 병용 치료는 AR1 단독에 의한 치료보다 더 강력했다는 것은 놀라운 것이다. 게다가, AR1 및 커스터센 병용 요법은, 놀랍게도 강력하고, 시험관내 전립선암 세포 성장을 중지시킬 수 있는 반면, 어느 한 쪽의 제제만을 입수한 세포는 4일의 기간에 걸쳐서 200% 이상만큼 증식한다(도 2B). 놀랍게도, 또한, 커스터센과 AR1의 병용은 AR 단백질 발현을 80% 이상만큼 감소시킬 수 있는 반면, 커스터센 단독은 효과가 없으며, AR1 단독은 단지 약 40%만큼 발현을 저감시킨다(도 17). 마지막으로, 커스터센과 AR1의 병용은, AR1 단독에 대한 약 40%에 비해서, 치료 개시로부터 16주에 약 90%까지 거세-저항성 전립선암을 앓는 치료된 마우스의 생존을 증가시킨다.

부가적으로, AR1과 커스터센의 병용은 바이칼루타마이드와 커스터센의 병용보다 포유류에서 종양 성장 저감에 더욱 유효하다. AR1과 커스터센의 병용은 플루타마이드와 커스터센의 병용보다 포유류에서 종양 성장 저감에 더욱 유효하다. AR1과 커스터센의 병용은 바이칼루타마이드와 커스터센의 병용보다 포유류에서 종양 성장 저감에 더욱 유효하다. AR1과 커스터센의 병용은 플루타마이드와 커스터센의 병용보다 포유류에서 종양 성장 저감에 더욱 유효하다. AR1과 커스터센의 병용은 바이칼루타마이드와 커스터센의 병용보다 암세포 아폽토시스 증가에 더욱 유효하다. AR1과 커스터센의 병용은 플루타마이드와 커스터센의 병용보다 암세포 아폽토시스 증가에 더욱 유효하다.

항종양 역가의 증가에 부가해서, 병용 요법은 또한 독성을 저감시키는 용량 저감 전략을 허용할 수 있다. 예를 들어, AR1은 피로 등과 같은 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있고, 최대 내성 용량 240㎎/일을 지닌다(Scher et al., 2010). 그러나, 본 발명은 커스터센과 병용하여 10㎎/㎏/일만큼 낮은 AR1의 용량이 마우스에서 종양 크기를 감소시키고 생존을 연장시키는데 유효하다는 것을 개시한다. NIH는 등가 표면적 용량 전환 인자(Equivalent Surface Area Dosage Conversion Factors)(NIH Equivalent Surface Area Dosage Conversion Factors Guidance, Posted August 2007; Freidreich et al., 1966)에 기초하여 인간 이용을 위하여 적합한 것들에 대해서 마우스 연구에서 종양 크기를 감소시키고 생존을 연장시키는데 유효하다. NIH 전환 인자 테이블에 따르면, 본 명세서에서 마우스에서 사용하기 위하여 기재된 10㎎/㎏/일 용량은, 60㎏ 인간에 대해서 약 49.8㎎/일, 100㎏ 인간에 대해서 약 83㎎/일의 용량과 동등한, 60㎏ 인간에서 .83 ㎎/㎏/일과 등가이다. 이들 용량은 인간에서 제III상 시험을 위해 권장되는 240㎎/㎏의 용량보다 훨씬 낮다(Scher et al., 2009). 따라서, 본 발명의 양상은 전립선암을 치료하는데 유효한 AR 길항제와 항-클러스테린 올리고뉴클레오타이드의 병용을 제공하며, 여기서 AR 길항제의 병용량은 단일요법에서 사용되는 유효량보다 더 적다. 클러스테린 수준을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및 AR 길항제를 포함하는 병용 요법의 놀랄만한 역가는 인간에서 하나 혹은 두 제제의 용량을 감소시키는데 이용될 수 있고, 이는 적은 부작용을 지니는 치료 이득을 가능하게 한다.

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SEQUENCE LISTING <110> The University of British Columbia <120> COMBINATION OF ANTI-CLUSTERIN OLIGONUCLEOTIDE WITH ANDROGEN RECEPTOR ANTAGONIST FOR THE TREATMENT OF PROSTATE CANCER <130> WO2012/123820 <140> PCT/IB2012/000609 <141> 2012-03-14 <150> US61/452,583 <151> 2011-03-14 <150> US61/453,309 <151> 2011-03-16 <150> US61/453,885 <151> 2011-03-17 <150> US61/493,336 <151> 2011-06-03 <160> 50 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcacagcagg agaatcttca t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tggagtcttt gcacgcctcg g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cagcagcaga gtcttcatca t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 attgtctgag accgtctggt c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ccttcagctt tgtctctgat t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 agcagggagt cgatgcggtc a 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atcaagctgc ggacgatgcg g 21 <210> 8 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<210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 20 guagaagggc gagcucuggt t 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 21 gaugcucaac accuccucct t 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 22 ggaggaggug uugagcauct t 21 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 23 uaauucaaca aaacugutt 19 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 24 gacaguuuua uugaauuagt t 21 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 25 uaauucaaca aaacugutt 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 26 acaguuuugu ugaauuatt 19 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 27 augaugaaga cucugcugct t 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 28 gcagcagagu cuucaucaut t 21 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 29 ugaaugaagg gacuaaccug tt 22 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 30 cagguuaguc ccuucauuca tt 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 31 cagaaauaga caaagugggg tt 22 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 32 ccccacuuug ucuauuucug tt 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 33 acagagacua agggaccaga tt 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 34 acagagacua agggaccaga tt 22 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 35 ccagagcucg cccuucuact t 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 36 guagaagggc gagcucuggt t 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 37 gucccgcauc guccgcagct t 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 38 gcugcggacg augcgggact t 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 39 cuaauucaau aaaacuguct t 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> RNAi for human clusterin <400> 40 gacaguuuua uugaauuagt t 21 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 41 augaugaaga cucugcugc 19 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi for human clusterin <400> 42 gcagcagagu cuucaucau 19 <210> 43 <211> 2877 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 gctttccgcg gcattctttg ggcgtgagtc atgcaggttt gcagccagcc ccaaaggggg 60 tgtgtgcgcg agcagagcgc tataaatacg gcgcctccca gtgcccacaa cgcggcgtcg 120 ccaggaggag cgcgcgggca cagggtgccg ctgaccgagg cgtgcaaaga ctccagaatt 180 ggaggcatga tgaagactct gctgctgttt gtggggctgc tgctgacctg ggagagtggg 240 caggtcctgg gggaccagac ggtctcagac aatgagctcc aggaaatgtc caatcaggga 300 agtaagtacg tcaataagga aattcaaaat gctgtcaacg gggtgaaaca gataaagact 360 ctcatagaaa aaacaaacga agagcgcaag acactgctca gcaacctaga agaagccaag 420 aagaagaaag aggatgccct aaatgagacc agggaatcag agacaaagct gaaggagctc 480 ccaggagtgt gcaatgagac catgatggcc ctctgggaag agtgtaagcc ctgcctgaaa 540 cagacctgca tgaagttcta cgcacgcgtc tgcagaagtg gctcaggcct ggttggccgc 600 cagcttgagg agttcctgaa ccagagctcg cccttctact tctggatgaa tggtgaccgc 660 atcgactccc tgctggagaa cgaccggcag cagacgcaca tgctggatgt catgcaggac 720 cacttcagcc gcgcgtccag catcatagac gagctcttcc aggacaggtt cttcacccgg 780 gagccccagg atacctacca ctacctgccc ttcagcctgc cccaccggag gcctcacttc 840 ttctttccca agtcccgcat cgtccgcagc ttgatgccct tctctccgta cgagcccctg 900 aacttccacg ccatgttcca gcccttcctt gagatgatac acgaggctca gcaggccatg 960 gacatccact tccatagccc ggccttccag cacccgccaa cagaattcat acgagaaggc 1020 gacgatgacc ggactgtgtg ccgggagatc cgccacaact ccacgggctg cctgcggatg 1080 aaggaccagt gtgacaagtg ccgggagatc ttgtctgtgg actgttccac caacaacccc 1140 tcccaggcta agctgcggcg ggagctcgac gaatccctcc aggtcgctga gaggttgacc 1200 aggaaataca acgagctgct aaagtcctac cagtggaaga tgctcaacac ctcctccttg 1260 ctggagcagc tgaacgagca gtttaactgg gtgtcccggc tggcaaacct cacgcaaggc 1320 gaagaccagt actatctgcg ggtcaccacg gtggcttccc acacttctga ctcggacgtt 1380 ccttccggtg tcactgaggt ggtcgtgaag ctctttgact ctgatcccat cactgtgacg 1440 gtccctgtag aagtctccag gaagaaccct aaatttatgg agaccgtggc ggagaaagcg 1500 ctgcaggaat accgcaaaaa gcaccgggag gagtgagatg tggatgttgc ttttgcacct 1560 acgggggcat ctgagtccag ctccccccaa gatgagctgc agccccccag agagagctct 1620 gcacgtcacc aagtaaccag gccccagcct ccaggccccc aactccgccc agcctctccc 1680 cgctctggat cctgcactct aacactcgac tctgctgctc atgggaagaa cagaattgct 1740 cctgcatgca actaattcaa taaaactgtc ttgtgagctg atcgcttgga gggtcctctt 1800 tttatgttga gttgctgctt cccggcatgc cttcattttg ctatgggggg caggcagggg 1860 ggatggaaaa taagtagaaa caaaaaagca gtggctaaga tggtataggg actgtcatac 1920 cagtgaagaa taaaagggtg aagaataaaa gggatatgat gacaaggttg atccacttca 1980 agaattgctt gctttcagga agagagatgt gtttcaacaa gccaactaaa atatattgct 2040 gcaaatggaa gcttttctgt tctattataa aactgtcgat gtattctgac caaggtgcga 2100 caatctccta aaggaataca ctgaaagtta aggagaagaa tcagtaagtg taaggtgtac 2160 ttggtattat aatgcataat tgatgttttc gttatgaaaa catttggtgc ccagaagtcc 2220 aaattatcag ttttatttgt aagagctatt gcttttgcag cggttttatt tgtaaaagct 2280 gttgatttcg agttgtaaga gctcagcatc ccaggggcat cttcttgact gtggcatttc 2340 ctgtccaccg ccggtttata tgatcttcat acctttccct ggaccacagg cgtttctcgg 2400 cttttagtct gaaccatagc tgggctgcag taccctacgc tgccagcagg tggccatgac 2460 tacccgtggt accaatctca gtcttaaagc tcaggctttt cgttcattaa cattctctga 2520 tagaattctg gtcatcagat gtactgcaat ggaacaaaac tcatctggct gcatcccagg 2580 tgtgtagcaa agtccacatg taaatttata gcttagaata ttcttaagtc actgtccctt 2640 gtctctcttt gaagttataa acaacaaact taaagcttag cttatgtcca aggtaagtat 2700 tttagcatgg ctgtcaagga aattcagagt aaagtcagtg tgattcactt aatgatatac 2760 attaattaga attatggggt cagaggtatt tgcttaagtg atcataattg taaagtatat 2820 gtcacattgt cacattaatg tcacactgtt tcaaaagtta aaaaaaaaaa aaaaaaa 2877 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Control antisense oligonucleotide sequence. <400> 44 cagcgctgac aacagtttca t 21 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target gene expression forward primer <400> 45 taccagctca ccaagctcct 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target gene expression reverse primer <400> 46 gcttcactgg gtgtggaaat 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target gene expression forward primer <400> 47 cacagcctgt ttcatcctga 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target gene expression reverse primer <400> 48 aggtccatga ccttcacagc 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target gene expression forward primer <400> 49 aaatctggca ccacaccttc 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target gene expression reverse primer <400> 50 agcactgtgt tggcgtacag 20

Claims (34)

1. 전립선암에 걸린 포유류 대상체를 치료하는 방법으로서, i) 클러스테린 발현(clusterin expression)을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및 ii) 하기 구조:
   

   

   
   를 지니는 안드로겐 수용체 길항제 또는 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을, 서로 병용할 경우 각각 상기 포유류 대상체를 치료하는데 유효한 양으로 상기 포유류 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 암은 안드로겐-비의존형 전립선암인 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 양과 상기 안드로겐 수용체 길항제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 양은, 함께 취해질 경우, 각 제제를 단독으로 투여한 경우보다 상기 대상체를 치료하는데 더 유효한 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안드로겐 수용체 길항제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 양과 병용 시의 상기 올리고뉴클레오타이드의 양은, 단독으로 투여한 경우 임상적으로 유효한 것보다 적은 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 양과 병용 시의 상기 안드로겐 수용체 길항제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 양은 단독으로 투여한 경우 임상적으로 유효한 것보다 적은 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 양과 상기 안드로겐 수용체 길항제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 양은, 함께 취해질 경우, 상기 대상체의 전립선암의 임상 증상을 저감시키는데 유효한 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 대상체는 인간인 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 클러스테린-암호화 mRNA의 번역 개시 부위(translation initiation site) 혹은 종결 부위에 걸쳐 있는 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 11에 기재된 서열 내의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 3에 기재된 서열 내의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 동일 서열의 비변성 올리고뉴클레오타이드에 대하여 생체내 안정성을 증대시키기 위하여 변성된 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 커스터센(custirsen)인 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 커스터센의 양이 640㎎ 미만인 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 커스터센의 양은 480㎎ 미만인 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 커스터센의 양은 7일 기간에 한번 정맥내로 투여되는 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안드로겐 수용체 길항제의 양이 240㎎ 미만인 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안드로겐 수용체 길항제의 양은 150㎎ 내지 240㎎인 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안드로겐 수용체 길항제의 양은 30㎎ 내지 150㎎인 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안드로겐 수용체 길항제의 양은 80㎎인 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안드로겐 수용체 길항제의 양은 1일당 1회 경구 투여되는 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
22. 안드로겐-비의존형 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법으로서, i) 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및 ii) 안드로겐 수용체 길항제를, 서로 병용할 경우 각각 상기 포유류 대상체를 치료하는데 유효한 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 안드로겐-비의존형 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 안드로겐 수용체 길항제는 비스테로이드성 항안드로겐인 것인, 안드로겐-비의존형 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 안드로겐 수용체 길항제는 AR1인 것인, 안드로겐-비의존형 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드와 상기 안드로겐 수용체 길항제의 병용은, 종양 세포의 세포질에서 핵으로의 안드로겐 수용체 전좌를 감소시키는데 유효한 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드와 상기 안드로겐 수용체 길항제의 병용은, 종양 세포 내 안드로겐 수용체 단백질의 프로테아좀 분해를 증가시키는데 유효한 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
27. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드와 상기 안드로겐 수용체 길항제의 병용은, 종양 세포 내 안드로겐 수용체의 전사 활성을 감소시키는데 유효한 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
28. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드와 상기 안드로겐 수용체 길항제의 병용은, 종양 세포 내 인산화 AKT의 양을 감소시키는데 유효한 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
29. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드와 상기 안드로겐 수용체 길항제의 병용은, 종양 세포 내 인산화 ERK의 양을 감소시키는데 유효한 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
30. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드와 상기 안드로겐 수용체 길항제의 병용은, 전립선암 세포의 증식을 저해하는데 유효한 것인, 전립선암에 걸린 포유류 대상체의 치료방법.
31. AR1 저항성 전립선암 세포를 커스터센으로 치료하는 단계를 포함하는, AR1 저항성 전립선암 세포의 AR1에 대한 감수성(sensitivity)을 증가시키는 방법.
32. 안드로겐-비의존형 전립선암에 걸린 포유류 대상체를 치료하는데 이용하기 위한 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및 안드로겐 수용체 길항제의 양을 포함하는 약제학적 조성물.
33. 안드로겐-비의존형 전립선암에 걸린 포유류 대상체를 치료함에 있어서 안드로겐 수용체 길항제와 병용하여 이용하기 위한 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드.
34. 전립선암에 걸린 포유류 대상체를 치료하기 위한 조성물로서, i) 클러스테린 발현을 저감시키는 올리고뉴클레오타이드 및 ii) 하기 구조:
    

    

    
    를 지니는 안드로겐 수용체 길항제 또는 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 전립선암에 걸린 포유류 대상체를 치료하기 위한 조성물.

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