ES2559859T3 - Tratamiento de sinucleinopatías - Google Patents

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Abstract

Uso de uno o ambos de entre: un polipéptido de b-glucocerebrosidasa ácida (GBA) y un polinucleótido que codifica un polipéptido de b-glucocerebrosidasa ácida (GBA), en la preparación de un medicamento para su uso en un método de tratamiento de un sujeto con una sinucleinopatía, pero no una enfermedad relacionada con el almacenamiento lisosomal diagnosticada clínicamente, en donde el polipéptido o el polinucleótido se administran en una cantidad eficaz para reducir un nivel de a-sinucleína en el sistema nervioso central o periférico, o en ambos, de un sujeto, o en el compartimiento lisosomal de un sujeto.

Description

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Descripción detallada
En general, la divulgación se refiere a métodos de reducción de los niveles de αS en células de sujetos humanos o animales que tienen una sinucleinopatía que no es un trastorno relacionado con el almacenamiento lisosomal, por
5 ejemplo, sujetos que tienen sinucleinopatía primaria (o invariable). Estos métodos incluyen, por ejemplo, la administración de polipéptidos de enzima lisosomal de tipo no proteasa, tales como polipéptidos de GBA, o polipéptidos de enzima lisosomal de tipo proteasa tales como polipéptidos de catepsina D, o moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos, ya sea solos o en combinación con agentes que potencien o induzcan la autofagia, tales como rapamicina o un análogo de la rapamicina. Además, se pueden administrar otros agentes de activación de GBA, tales como polipéptidos de prosaposina y/o polipéptidos de saposina C, o se pueden administrar polipéptidos de prosaposina y/o polipéptidos de saposina C solos (para mejorar la activación de la actividad de GBA endógena) para facilitar una reducción de los niveles de proteína αS en estado estacionario in vivo.
Por lo tanto, la presente divulgación implica la modulación de la degradación fisiológica de la α-sinucleína (αS)
15 mediante la mejora del procesamiento dentro de los lisosomas y/o del citoplasma, y, en algunos aspectos, mediante la mejora de la cantidad de αS absorbida por los lisosomas (autofagia). Aunque sin el deseo de quedar ligado a teoría operativa alguna, el procesamiento degradativo de los agregados de αS es un sistema que funciona a un nivel de estado estacionario. Mediante la aplicación de la ley de acción de masas en el procesamiento degradativo en estado estacionario de las proteínas αS, formas oligoméricas, agregados y/o complejos, se puede modular el proceso degradativo con respecto a sus productos finales mediante el aumento de la abundancia de sus productos de partida. Al modificar las reacciones de los componentes de la vía, se puede impulsar el procesamiento general hacia mayores niveles de producto. Por lo tanto, bien mediante el aumento de la entrada de αS en los lisosomas o el aumento de la propia eficiencia de degradación, es posible impulsar la hidrólisis y el procesamiento posterior de αS a un nivel de producto superior. El aumento tanto del componente autofágico como del componente lisosomal de la
25 vía puede conducir a una mayor protección del daño de la proteína αS, y dichas combinaciones pueden lograr más que efectos aditivos.
Algunos aspectos descritos en el presente documento son métodos de tratamiento o retraso de la progresión o del desarrollo de una sinucleinopatía que no sea una enfermedad relacionada con el almacenamiento lisosomal, por ejemplo, mediante la administración de uno o varios agentes que aumenten la actividad o el nivel de GBA y/o de prosaposina/saposina C. En algunos aspectos, los agentes pueden ser polipéptidos de GBA y/o prosaposina/saposina C o fragmentos activos de los mismos, o ácidos nucleicos que codifiquen dichos polipéptidos
o fragmentos activos. En algunos aspectos, el agente es una forma competente en la unión, pero catalíticamente inactiva de GBA, o una molécula de ácido nucleico que la codifica.
35 Otros aspectos descritos en el presente documento son métodos de tratamiento o retraso de la progresión o del desarrollo de una sinucleinopatía, por ejemplo, mediante la administración de uno o varios agentes que aumenten la actividad o el nivel de catepsina D o catepsina F y/o preprocatepsina D o preprocatepsina F. En algunos aspectos, los agentes pueden ser polipéptidos de GBA y/o prosaposina/saposina C/catepsina D/catepsina F o fragmentos activos de los mismos, o ácidos nucleicos que codifiquen dichos polipéptidos o fragmentos activos. En algunos aspectos, el agente es una forma competente en la unión, pero catalíticamente inactiva de GBA, catepsina D o catepsina F, o una molécula de ácido nucleico que la codifica.
Métodos de tratamiento de sinucleinopatías
45 El término “sinucleinopatía” se usa en el presente documento para nombrar a un grupo de trastornos neurodegenerativos caracterizados por la presencia de mayores niveles, por ejemplo, niveles en estado estacionario, de uno cualquiera o más de entre variantes solubles no fibrilares, isoformas oligoméricas solubles, variantes insolubles no fibrilares, complejos y agregados fibrilares insolubles de proteína α-sinucleína (αS) dentro de los compartimentos celulares de poblaciones selectivas de neuronas y glía. Por lo tanto, se entiende que el nivel en estado estacionario de αS engloba todas las formas solubles, así como insolubles e intermedias (metaestables) del producto del gen SNCA.
Dichos trastornos incluyen uno cualquiera de los siguientes agrupados como sinucleinopatías "invariables" (o
55 "primarias") (Schlossmacher M. G. “α-synuclein and synucleinopathies. The Dementias 2 Blue Books of Practical Neurology”; Editores: Growdon JH & Rossor MN. Butterworth Heinemann, Inc., Oxford. 2007; Capítulo 8: pág. 184213): enfermedad de Parkinson (EP), por ejemplo, la enfermedad de Parkinson/parkinsonismo esporádicos y la enfermedad de Parkinson/parkinsonismo familiares; demencia esporádica o hereditaria con cuerpos de Lewy (DLB) (también conocida como enfermedad difusa de cuerpos de Lewy); insuficiencia autonómica pura (PAF) con deposición de sinucleína; atrofia multisistémica (MSA) (del cerebelo, parkinsoniana o de tipo mixto); neurodegeneración hereditaria con acumulación de hierro en el cerebro (también conocida como enfermedad de Hallervordern Spatz o neurodegeneración ligada a la pantotenato quinasa 2); y enfermedad fortuita de cuerpos de Lewy a edad avanzada.
65 Además, se han identificado sinucleinopatías "variables" (o "secundarias") en las que se reconoce la desregulación
7
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para la mutación son candidatos para el tratamiento mediante los nuevos métodos.
Administración o activación de polipéptidos de enzima lisosomal de tipo no proteasa
5 Los nuevos métodos incluyen administrar polipéptidos de enzima lisosomal de tipo no proteasa, por ejemplo, polipéptidos de GBA, bien directamente o mediante la administración de moléculas de ácido nucleico que codifiquen polipéptidos de GBA, a pacientes que los necesitan, por ejemplo, a sujetos que han sido diagnosticados de una sinucleinopatía que no es una enfermedad de depósito lisosomal.
La GBA también se conoce como glucosidasa β ácida; β-glucosidasa ácida; glucocerebrosidasa; glucosilceramidasa; y GBAP. Este gen normalmente codifica una proteína de membrana lisosomal que escinde el enlace β-glucosídico de glucosilceramida (también conocida como glucocerebrosidasa), un producto intermedio del metabolismo de glicolípidos. También puede escindir glucosilesfingosina como sustrato secundario para generar glucosa y esfingosina (Sidransky, Mol Genet Met, 2004, pág. 6-15). Las mutaciones en este gen pueden causar la enfermedad
15 de Gaucher, una enfermedad relacionada con el almacenamiento lisosomal que se caracteriza por una acumulación de glucocerebrósidos y glucosilesfingosinas. El corte y empalme alternativo genera múltiples variantes de transcripción que codifican la misma proteína. Hay cinco variantes de ARNm (que varían en la UTR 5'), la más larga de los cuales se establece en la base de datos GenBank con los números de acceso NM_001005749.1 (ARNm) y NP_001005749.1 (aminoácido). La información relativa a GBA se puede encontrar en la base de datos Entrez Gene con el GenelD: 2629.
Los métodos también pueden incluir el aumento de la activación de los polipéptidos de GBA administrados o cualquier GBA endógena mediante la administración de polipéptidos de activación de GBA tales como prosaposina (PS) y/o sus derivados, saposina A (SA), saposina B (SB), saposina C (SC) y saposina D (SD).
25 El gen de la prosaposina codifica una glicoproteína altamente conservada que bien es secretada como una proteína de longitud completa con actividades neurotróficas o es procesada proteolíticamente en compartimientos endosomales/lisosomales por la catepsina D y otras proteasas en las 4 saposinas A, B, C y D (Leonova et al., J. Biol. Chem, 1996, 271:17312-17320; Hiraiwa et al., Arch. Biochem. Biophys., 1997, 341:17-24). Las saposinas A-D se encuentran principalmente en el compartimiento lisosomal, en el que facilitan el catabolismo de los glicoesfingolípidos con grupos de oligosacáridos cortos. La saposina C funciona para anclar la proteína GBA en condiciones de pH bajo al lado interno de la membrana lisosomal, permitiendo así que la GBA se pliegue correctamente para la correcta interacción con el sustrato (Salvioli et al., 2000, FEBS. Lett. 472:17-21). Además, la saposina C protege a la proteína GBA de la degradación proteolítica por parte de las proteasas lisosomales (Sun et
35 al., J. Biol. Chem., 2003, 278:31918-31923). La importancia biológica de esta proteína se pone de relieve por el hecho de que las mutaciones nulas en el gen de la prosaposina y/o las mutaciones puntuales en la región de la saposina C del gen pueden conducir a la enfermedad de Gaucher clínica, a pesar de la presencia de GBA de tipo silvestre (Pamplos et al., Acta. Neuropathol., 1999, 97:91-97; Tylki-Szymanska, 2007, Clin. Genet., 72:538-542; Rafi et al., 1993, Somat. Cell Mol. Genet., 19:1-7).
Por otro lado, la baja actividad in vivo de la mutación de la GBA más común, N370S, se puede explicar por su incapacidad para interaccionar con la saposina C y los fosfolípidos aniónicos (Salvioli et al., Biochem. J., 2005, 390:95-103). El corte y empalme alternativo de la prosaposina genera múltiples variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas. La prosaposina (variante de la enfermedad de Gaucher y variante de la leucodistrofia
45 metacromática) se describe en la base de datos de Entre Gene en el GenelD: 5660. Las secuencias de sus isoformas se encuentran disponibles en GenBank como sigue: preproteína de isoforma de prosaposina a: NM_002778.2 (ARNm) y NP 002769.1 (aminoácido); preproteína de isoforma de prosaposina b: NM_001042465.1 (ARNm) y NP_001035930.1 (aminoácido); y preproteína de isoforma de prosaposina c NM_001042466.1 (aminoácido) y NP_001035931.1 042465.1 (ARNm).
Tanto los polipéptidos de GBA como las moléculas de ácido nucleico que codifican la GBA, así como los polipéptidos de activación de GBA y las correspondientes moléculas de ácido nucleico, se pueden administrar usando técnicas conocidas, entre las que se incluyen las técnicas descritas en el presente documento. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido de GBA se pueden administrar usando la terapia génica
55 descrita en el presente documento.
Administración de polipéptidos de enzima lisosomal de tipo proteasa
En un método alternativo, un sujeto diagnosticado de una sinucleinopatía que no es una LSD se puede tratar con un polipéptido de proteasa lisosomal tal como un polipéptido de catepsina D. Dichas proteasas se pueden administrar directamente o mediante la administración de una molécula de ácido nucleico que codifique la proteasa deseada.
En general, las enzimas lisosomales de tipo proteasa pertenecen a las categorías de las aspartil proteasas tales como una catepsina D (o catepsina E) y las cisteinil proteasas (por ejemplo, la catepsina F y la catepsina L). Por lo 65 tanto, la invención incluye, entre otros, nuevos métodos de tratamiento de sinucleinopatías con enzimas lisosomales de tipo proteasa relacionadas con el polipéptido de procatepsina D o procatepsina E, o, como alternativa, con
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de la población). La proporción de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la proporción de DL50/DE50. Se prefieren los compuestos que presentan altos índices terapéuticos. Aunque se pueden usar compuestos que presenten efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado al diseñar un sistema de administración que dirija dichos compuestos a la zona de tejido afectada con el fin
5 de reducir al mínimo el posible daño a las células no infectadas y, de ese modo, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar para formular un intervalo de dosis para su uso en seres humanos. La dosis de dichos compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluye la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de dicho intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la vía de administración usada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentraciones en circulación en plasma que incluya la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logra una inhibición media máxima de los síntomas) según lo determinado en cultivo
15 celular. Dicha información se puede usar para determinar con mayor exactitud las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución.
A continuación, se describe información más específica sobre las dosis.
Administración de polipéptidos y moléculas pequeñas
Si se desea, se pueden administrar agentes que atraviesan la barrera hematoencefálica sistémicamente. Como alternativa, los agentes tales como los polipéptidos y las moléculas pequeñas descritos en el presente documento se pueden administrar directamente en un sitio del organismo en el que las células muestren acumulación de αS.
25 Dichos agentes que no atraviesan la barrera hematoencefálica se pueden administrar en el cerebro, por ejemplo, usando inyección directa facilitada por una guía estereotáctica. Dichos agentes también se pueden administrar por vías intraventricular o intraparenquimatosa.
En otros aspectos, se pueden administrar moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos deseados, por ejemplo, en forma de un vector viral que contenga un gen que codifique el polipéptido. La administración viral puede ser en condiciones que favorezcan la expresión del transgén en las células nerviosas centrales o periféricas específicas, tales como células ependimarias u otras células gliales que recubren los ventrículos del cerebro. Las células ependimarias se pueden transducir para expresar el transgén y secretar el producto proteico codificado en el líquido cefalorraquídeo (LCR).
35 Los polipéptidos descritos en el presente documento se pueden incorporar a una composición farmacéutica útil para tratar, por ejemplo, inhibir, atenuar, prevenir o mejorar, una sinucleinopatía. La composición farmacéutica se puede administrar a un sujeto que padezca una sinucleinopatía o alguien que se encuentre en riesgo de desarrollar dicha deficiencia. Las composiciones deben contener una cantidad terapéutica o profiláctica del polipéptido, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéutico puede ser cualquier sustancia compatible, no tóxica, adecuada para administrar los polipéptidos al paciente. Se pueden usar agua estéril, alcohol, grasas y ceras como vehículo. También se pueden incorporar adyuvantes farmacéuticamente aceptables, agentes de tamponamiento, agentes dispersantes y similares a las composiciones farmacéuticas. El vehículo se puede combinar con el polipéptido en cualquier forma adecuada para su administración por inyección o infusión intraventricular (cuya forma
45 también puede ser adecuada para la administración intravenosa o intratecal) o de otra manera.
Los vehículos adecuados incluyen, por ejemplo, solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ) o tampón de fosfato salino (PBS), otras soluciones salinas, soluciones de dextrosa, soluciones de glicerol, emulsiones de agua y aceites tales como las preparadas con aceites de petróleo, y de origen animal, vegetal o sintético (aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral o aceite de sésamo). En algunas realizaciones, se usa un LCR artificial como vehículo. En general, el vehículo será estéril y estará exento de pirógenos. La concentración del polipéptido en la composición farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, del al menos aproximadamente 0,01 % en peso al 0,1 % en peso, al aproximadamente el 1 % en peso, al tanto como el 20 % en peso o más de la composición total.
55 Para la administración intraventricular de los polipéptidos descritos en el presente documento, u otros agentes, la composición debe ser estéril y debe estar en estado líquido. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será útil incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro de sodio.
La velocidad de administración es tal que la administración de una sola dosis se puede administrar en forma de bolo.
65 También se puede infundir una sola dosis durante aproximadamente 1-5 minutos, aproximadamente 5-10 minutos, aproximadamente 10-30 minutos, aproximadamente 30-60 minutos, aproximadamente 1-4 horas, o consumir más de
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95/27071. Los adenovirus son fáciles de cultivar y no requieren la integración en el genoma de la célula hospedadora. También se han construido vectores derivados de adenovirus recombinantes, particularmente aquellos que reducen el potencial para la recombinación y la generación de virus de tipo silvestre. Véase la solicitud PCT internacional n.º WO 95/00655 y el documento WO 95/11984. Los AAV de tipo silvestre tienen una alta
5 infectividad y especificidad en la integración en el genoma de la célula hospedadora. Véase, Hermonat y Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 81:6466-6470 y Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol., 8:3988-3996.
Los vectores virales neurotróficos adecuados para administrar las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento incluyen, pero sin limitación, vectores virales adeno-asociados (AAV), vectores del virus del herpes simple (patente de EE.UU. n.º 5.672.344) y vectores lentivirales.
En los nuevos métodos, se pueden usar AAV de cualquier serotipo o pseudotipo. El serotipo del vector viral usado en ciertas realizaciones de la invención se selecciona del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 y AAV8 (véase, por ejemplo, Gao et al. (2002) PNAS, 99:11854 11859; y “Viral Vectors for Gene
15 Therapy: Methods and Protocols”, ed. Machida, Humana Press, 2003). Se pueden usar otros serotipos además de los enumerados en el presente documento. Además, en los métodos descritos en el presente documento, también se pueden utilizar vectores de AAV pseudotipados. Los vectores de AAV pseudotipados son aquellos que contienen el genoma de un serotipo de AAV en la cápside de un segundo serotipo de AAV; por ejemplo, un vector de AAV que contiene la cápside de AAV2 y el genoma de AAV1 o un vector de AAV que contiene la cápside de AAV5 y el genoma de AAV2 (Auricchio et al., (2001) Hum. Mol. Genet., 10(26):3075-81).
Los vectores de AAV se derivan de parvovirus de ADN monocatenarios (mc) que no son patógenos para los mamíferos (revisado en Muzyscka (1992) Curr. Top. Microb. Immunol., 158:97-129). En resumen, los vectores basados en AAV tienen genes virales rep y cap que representan el 96 % del genoma viral eliminado, dejando las dos
25 repeticiones terminales invertidas (ITR) de 145 pares de bases (pb) flanqueantes, que se usan para iniciar la replicación, el empaquetamiento y la integración del ADN viral. En ausencia de virus auxiliar, el AAV de tipo silvestre se integra en el genoma de la célula hospedadora humana con especificidad de sitio preferencial en el cromosoma 19q13.3 o se puede mantener episomalmente. Una sola partícula de AAV puede alojar hasta 5 kb de ADNmc, dejando, por tanto, aproximadamente 4,5 kb para un transgén y elementos reguladores, lo que suele ser suficiente. Sin embargo, los sistemas de trans-corte y empalme descritos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.º 6.544.785 pueden casi duplicar este límite.
En un aspecto ilustrativo, el AAV es AAV2. Se han estudiado ampliamente virus adeno-asociados de muchos serotipos, especialmente AAV2, y se han caracterizado como vectores de terapia génica. Los expertos en la materia
35 están familiarizados con la preparación de vectores de terapia génica basados en AAV funcionales. Numerosas referencias a diversos métodos de producción, purificación y preparación de AAV para la administración a sujetos humanos se pueden encontrar en el extenso conjunto de material publicado (véase, por ejemplo, “Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols”, ed. Machida, Humana Press, 2003). Además, la terapia génica basada en AAV dirigida a las células del SNC se ha descrito en la patente de EE.UU. n.º 6.180.613 y 6.503.888. Son vectores de AAV ilustrativos adicionales los vectores de serotipos AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/7 y AAV2/8 recombinantes que codifican proteína humana.
En ciertos métodos descritos en el presente documento, el vector incluye un transgén ligado operativamente a un promotor. El transgén codifica una molécula biológicamente activa, tal como un polipéptido de GBA, cuya expresión
45 en el SNC produce la corrección al menos parcial de una sinucleinopatía.
El nivel de expresión de los transgenes en las células eucariotas está determinado en gran medida por el promotor de la transcripción del casete de expresión del transgén. En algunas realizaciones, se usan promotores que muestran actividad a largo plazo y que son específicos de tejidos e incluso de células. Los ejemplos de promotores incluyen, pero sin limitación, el promotor de citomegalovirus (CMV) (Kaplitt et al. (1994) Nat. Genet., 8:148-154), el promotor de globina β3 de CMV/humana (Mandel et al. (1998) J. Neurosci., 18:4271-4284), el promotor de GFAP (Xu et al. (2001) Gene Ther., 8:1323-1332), el promotor de la enolasa específica de las neuronas de 1,8 kb (NSE) (Klein et al. (1998) Exp. Neurol., 150:183-194), el promotor de la β-actina de pollo (CBA) (Miyazaki (1989) Gene, 79:269-277), el promotor de la β-glucuronidasa (GUSB) (Shipley et al. (1991) Genetics, 10:1009-1018) y los
55 promotores de la ubiquitina, tales como los aislados de la ubiquitina A humana, la ubiquitina B humana y la ubiquitina C humana, como se describe en la patente de EE.UU. n.º 6.667.174. Para prolongar la expresión, también se pueden ligar operativamente al transgén otros elementos reguladores tales como, por ejemplo, elemento postregulador del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE) (Donello et al. (1998) J. Virol., 72:5085-5092) o el sitio de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina (BGH).
Para algunas aplicaciones de terapia génica del SNC, puede ser necesario controlar la actividad de la transcripción. Con este fin, se puede obtener la regulación farmacológica de la expresión génica con vectores virales mediante la inclusión de diversos elementos reguladores y promotores que respondan a fármacos como se describe, por ejemplo, en Haberma et al. (1998) Gene Ther., 5:1604-16011; y Ye et al. (1995) Science, 283:88-91.
65 Se pueden producir preparados de AAV de título elevado usando técnicas conocidas en la materia, por ejemplo,
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encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la inyección pueden incluir soluciones acuosas estériles (cuando sean hidrosolubles) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o 5 dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser líquida en la medida en que exista una fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y de almacenamiento, y debe conservarse contra la acción contaminante de los microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos,
15 clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida a un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según lo necesario, seguido de la esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y el resto de ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones
25 inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización, que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada estéril del mismo.
En general, las composiciones orales incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo líquido para su uso como un enjuague bucal. Se pueden incluir agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, las píldoras, las cápsulas, los trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o
35 compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes®; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos se pueden administrar en forma de una pulverización de aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contenga un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador. Dichos métodos incluyen los descritos en la patente de EE.UU. n.º
6.468.798.
45 La administración sistémica de un compuesto terapéutico como el descrito en el presente documento también puede ser por vía transmucosa o transdérmica. Para la administración por vía transmucosa o transdérmica, en la formulación, se usan penetrantes apropiados para la barrera que se vaya a atravesar. Dichos penetrantes se conocen, en general, en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa se puede realizar mediante el uso de pulverizados nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, pomadas, geles o cremas como se conoce en la técnica en general.
Las composiciones farmacéuticas también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de
55 supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para la administración rectal.
Los compuestos terapéuticos que son o incluyen ácidos nucleicos se pueden administrar mediante cualquier método adecuado para la administración de agentes de ácido nucleico, tal como una vacuna de ADN. Dichos métodos incluyen pistolas génicas, bioinyectores y parches cutáneos, así como métodos exentos de agujas tales como la tecnología de vacuna de ADN de micropartículas desvelada en la patente de EE.UU. n.º 6.194.389, y la vacunación sin aguja transdérmica de mamíferos con la vacuna en forma de polvo como se describe en la patente de EE.UU. n.º
6.168.587. Además, es posible la administración intranasal, como se describe en, entre otros, Hamajima et al., (1998) Clin. Immunol. Immunopathol., 88(2), 205-10. También se pueden usar los liposomas (por ejemplo, como los
65 descritos en la patente de EE.UU. n.º 6.472.375) y la microencapsulación. También se pueden usar sistemas de administración de micropartículas dirigibles biodegradables (por ejemplo, como los descritos en la patente de
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modificación sistemática de la estructura de un primer compuesto de ensayo, por ejemplo, un primer compuesto de ensayo que sea estructuralmente similar a una pareja de unión natural conocida del polipéptido diana, o una primera molécula pequeña identificada como capaz de unirse al polipéptido diana, por ejemplo, usando métodos conocidos en la técnica o los métodos descritos en el presente documento, y correlacionar dicha estructura con una actividad
5 biológica resultante, por ejemplo, un estudio de la relación entre estructura y actividad. Como un experto en la materia apreciará, hay varios métodos convencionales para la creación de dicha relación de estructura y actividad. Por lo tanto, en algunos casos, el trabajo puede ser en gran medida empírico, y en otros, se puede usar la estructura tridimensional de un polipéptido endógeno o parte del mismo como punto de partida para el diseño racional de un compuesto o compuestos de molécula pequeña. Por ejemplo, en una realización, se explora una biblioteca general de moléculas pequeñas, por ejemplo, usando los métodos descritos en el presente documento.
En algunos aspectos, se aplica un compuesto de ensayo a una muestra de ensayo, por ejemplo, se evalúa una célula o un tejido vivo o un órgano, y uno o más efectos del compuesto de ensayo. En una célula cultivada o primaria por ejemplo, se puede determinar la capacidad del compuesto de ensayo para aumentar los niveles y/o la actividad
15 de GBA o PS/SC. Se pueden usar los modelos basados en células MES descritos en el presente documento para dichos ensayos de detección. Por ejemplo, mediante el uso de placas de cultivo de células MES (de 96 o 384 pocillos), se aplican bibliotecas químicas a base de moléculas pequeñas a una concentración de ensayo de 1 µM durante un período de 36 a 48 horas. Las células se lisan y se analizan por ELISA de tipo sándwich, por ejemplo, como se indica en las Fig. 3A a 3D del presente documento para determinar el efecto neto de estos compuestos sobre la concentración de proteína α-sinucleína en cada pocillo.
En algunos aspectos, la muestra de ensayo es, o se deriva de (por ejemplo, una muestra tomada de) un modelo in vivo de una sinucleinopatía como se describe en el presente documento. Se puede usar, por ejemplo, un modelo animal, por ejemplo, un modelo de roedor tal como un modelo de ratón o de rata. En concreto, el modelo de
25 sinucleinopatía de ratón de Masliah es adecuado (disponible en el mercado en JSW Research en Graz, Austria) (véase, Masliah et al., Science, 18 de febrero de 2000; 287(5456):1265-9.
Los métodos de evaluación de cada uno de estos efectos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede evaluar la capacidad para modular la expresión de una proteína a nivel génico o de proteína, por ejemplo, usando métodos de PCR cuantitativa o de inmunoensayo. En algunos aspectos, se pueden usar métodos de alto rendimiento, por ejemplo, chips de proteínas o de genes como se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, capítulo. 12, “Genomics”, en Griffiths et al., Eds. Modem genetic Analysis, 1999,W. H. Freeman y Company; Ekins y Chu, 1999 Trends in Biotechnology, 17:217-218; MacBeath y Schreiber, 2000 Science, 289(5485):1760-1763; Simpson, “Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2002; Hardiman,
35 “Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts”, DNA Press, 2003), para detectar un efecto sobre dos, tres, cuatro, cinco o más de los polipéptidos descritos en el presente documento.
Un compuesto de ensayo que ha sido detectado mediante un método descrito en el presente documento y del que se ha determinado que aumenta los niveles y/o la actividad de GBA o PS/SC, o reduce los niveles de agregados de αS, se puede considerar un compuesto candidato. Un compuesto candidato que se ha detectado, posteriormente, por ejemplo, en un modelo in vivo de un trastorno, por ejemplo, un modelo animal de una sinucleinopatía, y sobre el que se ha determinado que tiene un efecto deseable en el trastorno, por ejemplo, en uno o más síntomas del trastorno, se puede considerar un agente terapéutico candidato. Los agentes terapéuticos candidatos, una vez detectados en un entorno clínico, son agentes terapéuticos. Los compuestos candidatos, agentes terapéuticos
45 candidatos y agentes terapéuticos, opcionalmente, se pueden optimizar y/o derivatizar, y formular con excipientes fisiológicamente aceptables para formar composiciones farmacéuticas.
Por lo tanto, los compuestos de ensayo identificados como "aciertos" (por ejemplo, los compuestos de ensayo que aumentan los niveles y/o la actividad de GBA o PS/SC) en una primera exploración se pueden seleccionar y modificar sistemáticamente, por ejemplo, usando un diseño racional para optimizar la afinidad de unión, la avidez, la especificidad u otro parámetro. Dicha optimización también se puede explorar para el uso de los métodos descritos en el presente documento. Por lo tanto, en un aspecto, la divulgación incluye la exploración de una primera biblioteca de compuestos usando un método conocido en la técnica y/o descrito en el presente documento, la identificación de uno o más aciertos en dicha biblioteca, la modificación estructural sistemática de dichos aciertos
55 para crear una segunda biblioteca de compuestos estructuralmente relacionados con el acierto, y la exploración de la segunda biblioteca usando los métodos descritos en el presente documento.
Los compuestos de ensayo identificados como aciertos pueden considerarse compuestos terapéuticos candidatos, útiles en el tratamiento de sinucleinopatías descritas en el presente documento. Se puede usar varias técnicas útiles para determinar las estructuras de los "aciertos" en los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, RMN, espectrometría de masas, cromatografía de gases dotada de detectores de captura de electrones, espectroscopia de fluorescencia y de absorción. Por lo tanto, la divulgación también incluye compuestos identificados como "aciertos" mediante los métodos descritos en el presente documento, y métodos para su administración y uso en el tratamiento, la prevención o el retraso del desarrollo o de la progresión de un trastorno
65 descrito en el presente documento.
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para aumentar la actividad de GBA y/o los niveles de PS/SC in vivo representan una nueva vía para el tratamiento neuroprotector de la enfermedad de Parkinson (EP) y las sinucleinopatías relacionadas.
Ejemplo 6: Establecimiento de un sistema de ELISA preciso, sensible e innovador para determinar 5 cuantitativamente las concentraciones de α-sinucleína en células MES23.5 transfectadas
Para los experimentos y las investigaciones posteriores, se deseaba reducir la dependencia de los métodos de transferencia Western, que son de bajo rendimiento y tienen un intervalo dinámico limitado y, en su lugar, crear un sistema de ELISA cuantitativo de tipo sándwich (ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas) para la cuantificación de medio rendimiento de αS con una mayor sensibilidad, especificidad optimizada e intervalo dinámico.
Se generaron sueros de 6 conejos y se purificaron por afinidad en Open Biosystems, Inc. (http://www.openbiosystems.com) frente a αS humana de longitud completa, recombinante. La αS recombinante se había caracterizado por HPLC y MS, y sometido a los análisis de la composición de aminoácidos y de la
15 concentración de proteínas. Para el ELISA, se recubrieron placas de 384 pocillos MaxiSorp (Nunc, Inc) con 50 µl/pocillo de Ab policlonal de captura (hSA-2) diluido en tampón de recubrimiento (NaHCO3 con NaN3 al 0,2 %, pH 9,6). Tras lavar con PBS/Tween-20 al 0,05 % (PBS-T), se bloquearon las placas durante 2 horas a 37 ºC en tampón de bloqueo (gelatina de piel de pescado al 1,125 %; PBS-T). Después de 4 lavados, se cargaron las muestras y se incubaron a 4 ºC durante 12 horas. Se generó mAb Sin-1 biotinilado (como el Ab de ensayo) usando 200 µg de sulfo-NHS-Biotina LC (Pierce), se diluyó en tampón de bloqueo y se añadió a la placa durante 2 horas a 37 ºC. Tras 4 lavados, se aplicó fosfatasa ExtrAvidin (Sigma) diluida en tampón de bloqueo durante 1 h a 37 ºC. El desarrollo del color se llevó a cabo mediante el uso de Fast-p-nitrofenil-fosfato (Sigma) y se monitorizó cinéticamente a DO de 405 nm cada 5 min durante un máximo de 60 min.
25 Se usaron diversas concentraciones de αS humana, recombinante, altamente purificada (r-hαS) como patrones para establecer la sensibilidad y el intervalo de ensayo de ELISA, como se muestra en la FIG. 3A (r2 > 0,98).
Para optimizar una proporción de "ADN:Lipofectamine 2000” con baja toxicidad celular, se transfectaron las células MES23.5 con bien 0,25, 0,5 o 1 µg de ADNc de SNCA humano, de tipo silvestre, codificante de αS más ADNc de vector vacío hasta un total de 5,5 µg de ADN por placa de 10 cm. 24 horas después de la transfección, se recogieron los lisados de células como se ha descrito anteriormente. Para diluciones en serie de los lisados celulares, se usó tampón de bloqueo que contenía lisado al 0,5 % de los pocillos transfectados con vector como diluyente, que también se usó para crear el blanco y la curva patrón correspondiente de αS humana recombinante. Se examinó la cinética de saturación para la identificación del/de los punto/s temporal/es en los que los patrones y las diluciones de
35 muestras se encontraban en fase logarítmica.
Al analizar dichos lisados celulares mediante ELISA, se registraron concentraciones en las células MES-αS que mostraron el paralelismo esperado tras la dilución en serie, que eran dependientes de la dosis de ADNc de SCNA (ambos aspectos se demuestran en la gráfica de la Fig. 3B), y que permitieron, por primera vez, el cálculo exacto de la cantidad total de concentración de proteína αS expresada en las células vivas (como se muestra en la Fig. 3C).
También se confirmó que, en estas condiciones perfeccionadas de expresión celular, no se modificó la viabilidad de las células MES23.5 ni MES-sin, medida por LDH en medio acondicionado (lactato deshidrogenasa, una enzima normalmente citosólica), como marcador de la permeabilidad celular, y por la conversión celular de MTT ((3-(4,5
45 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) en formazán, como marcador del metabolismo celular intacto. Para estos ensayos de toxicidad convencionales, se realizó en paralelo un control positivo que conducía a una lisis celular del 100 % (tratamiento con Triton-X 100 al 0,1 %). Los resultados se muestran en la FIG. 3D. Se determinó que, para el intervalo de concentraciones de ADNc seleccionadas en todos los experimentos, las células MES-αS y MESvector fueron totalmente metabólicamente activas en el ensayo de MTT, y no mostraron ninguna liberación de LDH derivado del citosol en el medio acondicionado de las células transfectadas y no transfectadas. Por lo tanto, ambos ensayos demostraron integridad celular.
Ejemplo 7: Mutaciones relacionadas con las sinucleinopatías, así como dirigidas al sitio catalítico de la GBA potencian la acumulación de α-sinucleína en células MES dopaminérgicas
55 Se usó el sistema optimizado de expresión de células/lectura de ELISA descrito en el Ejemplo 6 para examinar los efectos de la sobreexpresión de proteínas GBA mutantes en los niveles de αS en células MES23.5.
Se transfectaron células MES con 0,5 µg por placa de 10 cm de plásmido portador de ADNc de SNCA codificante de αS, más 5 µg por placa de 10 cm de plásmido codificante de GBA humana de tipo silvestre o mutante. Las variantes de GBA usadas fueron de tipo silvestre, N370S, D409H, L444P, E235A y E340A. Estos 5 mutantes de GBA se crearon por mutagénesis dirigida, usando el kit Quickchange (Stratagene), y se verificaron secuencialmente. Se sabe que N370S, D409H y L444P tienen lugar (en el estado homocigoto o heterocigoto del compuesto) en la enfermedad de Gaucher y, en el estado heterocigoto, en los pacientes con la enfermedad de Parkinson y/o los 65 pacientes con demencia con cuerpos de Lewy. No se tiene conocimiento de la existencia de las proteínas GBA
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