PT2154969E - Tratamento das sinucleinopatias - Google Patents

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PT2154969E
PT2154969E PT87557997T PT08755799T PT2154969E PT 2154969 E PT2154969 E PT 2154969E PT 87557997 T PT87557997 T PT 87557997T PT 08755799 T PT08755799 T PT 08755799T PT 2154969 E PT2154969 E PT 2154969E
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PT
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disease
synuclein
gba
polypeptide
parkinsonism
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PT87557997T
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Lamya Shihabuddin
Seng H Cheng
Michael Schlossmacher
Valerie Cullen
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Brigham & Womens Hospital
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Description

DESCRIÇÃO
TRATAMENTO DAS SINUCLEINOPATIAS
CAMPO TÉCNICO
Esta invenção refere-se geralmente ao tratamento de sinucleinopatias que não são doenças de depósito lisossomal em indivíduos. Também são divulgados os métodos de rastreio associados.
ANTECEDENTE A evidência genética, neuropatológica e bioquímica implicou um aumento da abundância de estado estacionário, assim como o processamento aberrante de α-sinucleína (aS) no desenvolvimento de vários distúrbios neurodegenerativos, incluindo a doença de Parkinson (DP), demência com corpos de Lewy (DLB), e outros (Dawson et al. , (2003) Science 302, 819-22; Vila et al., (2004) Nat Med., 10 Suppl:S58-62). A evidência genética demonstra que as mutações pontuais no gene que codifica α-sinucleína estão ligadas a uma forma de DP com inicio precoce grave, dominantemente herdada, (Krueger et al., (1997) Nat. Genet., 18, 106-108; Zarranz et al., (2004) Ann. Neurol., 55 (2) : 164-73; Polymeropoulos et al., (1997) Science, 276:2045-7), que implica uma patogénese "ganho de função toxica" . Estas mutações causam as seguintes alterações de aminoácidos: alanina 30 -► prolina (A30P) , glutamina 46 -► lisina (E46K) e alanina 53 -► treonina (A53T) . Além disso, a duplicação e triplicação da sinucleína que codifica o α-sinucleína, o gene alfa (componente não A4 do precursora amiloide) (SNCA) tem sido associado ao parkinsonismo familiar com um fenótipo combinado DP/DLB, o que demonstra que taxas de expressão aumentadas, mesmo do gene de tipo selvagem (wt), podem causar doença (Chartier-Harlin et al., (2004) Lancet, 364, 1167-9; Singleton et al., (2003) Science, 302, 841).
Intrigantemente, certos polimorfismos na região promotora do gene SNCA também têm sido associados ao risco aumentado para DP de início tardio, esporádica (Pais et al., (2004) Ann. Neurol., 56, 591-5; Maraganore et al. , (2006) JAMA, 296, 661-70) . A evidência neuropatológica indica que as inclusões intra-neuronais denominadas corpos de Lewy e neurites de Lewy, da proteína α-sinucleína (relacionados possivelmente com eventos pós-translacionais, tais como a hiperfosforilação (Anderson et al., (2006), J. Biol. Chem., 281, 29739-29752) e a acumulação intracelular de ambos os oligómeros tóxicos solúveis e fibrilas insolúveis (Sharon et al., (2001), P.N.A.S., 98, 9110-9115) .
Além disso, a evidência bioquímica sugere que a sobre-expressão de α-sinucleína em sistemas celulares ou animais pode causar stress celular e/ou eventual morte por meio de uma variedade de mecanismos, incluindo - entre outros - o excesso de concentração de dopamina e geração de espécies reativas de oxigénio (Tabner et al., (2002), Free Radie. Biol. Med., 32 (11) :1076-83; Fahn et al., (1992), Ann. Neurol., 32, 804-12) bem como a disfunção mitocondrial (Lee (2003), Antioxid. Redox Signal, 5:337-48; Hashimoto et al., (2003), Neuromolecular Med., 4(1-2):21-36). O pedido de patente PCT publicado em WO 07084737 divulga o tratamento de distúrbios de depósito lisossomal que têm implicações no sistema nervoso central com enzimas lisossomais. A técnica anterior também inclui PNAS, volume 101, 2004, 17510-17515 (Lo Bianco et al). Isto revela que a entrega da proteína Parkin (uma ubiquitina ligase E3) mediada pelo vetor lentiviral reduz a neuropatologia associada a uma forma mutante de alfa-sinucleína num modelo de ratazana da doença de Parkinson.
SUMÁRIO A invenção é a seguinte: 1. Utilização de um ou ambos de: um polipéptido de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA) e um polinucleótido que codifica um polipéptido de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA), na preparação de um medicamento para utilização num método de tratamento dum indivíduo com uma sinucleinopatia, mas não uma doença de depósito lisossomal diagnosticada clinicamente, em que o polipéptido ou polinucleótido é administrado numa quantidade eficaz para reduzir um nível de a-sinucleína no sistema nervoso central ou periférico do indivíduo, ou em ambos, ou no compartimento lisossomal do indivíduo. 2. A utilização da reivindicação 1, em que a sinucleinopatia é uma sinucleinopatia primária. 3. A utilização da reivindicação 2, em que a sinucleinopatia compreende qualquer uma ou várias de: doença de Parkinson (DP); demência com corpos de Lewy (DLB) esporádica ou herditária; falência autonômica pura (PAF) com deposição de α-sinucleína; atrofia multissistémica (MSA); neurodegeneração hereditária com acumulação de ferro no cérebro e doença com corpos de Lewy incidental de idade avançada. 4. A utilização da reivindicação 1, em que a sinucleinopatia é uma sinucleinopatia secundária. 5. A utilização da reivindicação 4, em que a sinucleinopatia compreende qualquer uma ou várias de: doença de Alzheimer da variante com corpos de Lewy; síndrome de Down; paralisia supranuclear progressiva; tremor essencial com corpos de Lewy; parkinsonismo familiar com ou sem demência; demência ligada ao gene tau e ao gene progranulina com ou sem parkinsonismo; doença de Creutzfeldt Jakob; encefalopatia espongiforme bovina; doença de Parkinson secundária; parkinsonismo resultante de exposição a neurotoxina; parkinsonismo induzido por um fármaco com deposição de α-sinucleína; ataxia espinocerebelar esporádica ou hereditária; esclerose lateral amiotrófica (ELA) e distúrbio comportamental do sono de movimento rápido dos olhos idiopático. 6. A utilização da reivindicação 1, compreendendo ainda a administração de um ou mais agentes que melhoram a autofagia dos complexos α-sinucleína ou um polipéptido que melhora o processo de degradação de complexos de α-sinucleína dentro dos lisossomos. 7. A utilização da reivindicação 6, em que o agente compreende um inibidor de mTOR. 8. A utilização da reivindicação 6, em que o agente compreende rapamicina ou um análogo de rapamicina. 9. A utilização da reivindicação 6, em que o agente compreende um ou mais de everolimus, ciclosporina, FK506, hsc70, N-octil-4-epi-p-valienamine e glicerol. 10. A utilização da reivindicação 6, em que o agente compreende uma molécula pequena, uma molécula grande, um péptido, um anticorpo, um ácido nucleico ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo. 11. Um ou ambos de um polipéptido de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA) e um polinucleótido que codifica um polipéptido de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA), para utilização num método de tratamento duma sinucleinopatia que não é uma doença de depósito lisossomal diagnosticada clinicamente. 12. Utilização de um ou ambos de: um polipéptido de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA) e um polinucleótido que codifica um polipéptido de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA), na preparação de um medicamento para utilização num método de tratamento dum indivíduo com qualquer uma ou várias de: doença de
Parkinson (DP); demência com corpos de Lewy (DLB) esporádica ou herditária; falência autonômica pura (PAF) com deposição de α-sinucleína; atrofia multissistémica (MSA); neurodegeneração hereditária com acumulação de ferro no cérebro; doença com corpos de Lewy incidental de idade avançada; doença de Alzheimer da variante com corpos de Lewy; síndrome de Down; tremor essencial com corpos de
Lewy; parkinsonismo familiar com ou sem demência; demência ligada ao gene tau e ao gene progranulina com ou sem parkinsonismo; doença de Creutzfeldt Jakob; encefalopatia espongiforme bovina; doença de Parkinson secundária; parkinsonismo resultante de exposição a neurotoxina; parkinsonismo induzido por um fármaco com deposição de α-sinucleína; ataxia espinocerebelar esporádica ou hereditária; esclerose lateral amiotrófica (ELA) e distúrbio idiopático comportamental do sono de movimento rápido dos olhos, em que o polipéptido ou polinucleótido é administrado numa quantidade eficaz para reduzir um nível de α-sinucleína no sistema nervoso central ou periférico do indivíduo, ou em ambos, ou no compartimento lisossomal do indivíduo. 13. Um ou ambos de um polipéptido de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA) e um polinucleótido que codifica um polipéptido de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA), para utilização num método de tratamento da doença de Parkinson (DP) ; demência com corpos de Lewy (DLB) esporádica ou herditária; falência autonômica pura (PAF) com deposição de α-sinucleína; atrofia multissistémica (MSA); neurodegeneração hereditária com acumulação de ferro no cérebro; doença com corpos de Lewy incidental de idade avançada; doença de Alzheimer da variante com corpos de Lewy; síndrome de Down; tremor essencial com corpos de Lewy; parkinsonismo familiar com ou sem demência; demência ligada ao gene tau e ao gene progranulina com ou sem parkinsonismo; doença de Creutzfeldt Jakob; encefalopatia espongiforme bovina; doença de Parkinson secundária; parkinsonismo resultante de exposição a neurotoxina; parkinsonismo induzido por um fármaco com deposição de α-sinucleína; ataxia espinocerebelar esporádica ou hereditária; esclerose lateral amiotrófica (ELA) ou distúrbio comportamental do sono de movimento rápido dos olhos idiopático. A divulgação é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que determinados agentes, incluindo os polipéptidos de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA) e membros selecionados da família de proteases de catepsina (por exemplo, a catepsina D) podem reduzir os níveis intracelulares de alfa- sinucleína (aS) dentro dos elementos do sistema nervoso central e/ou periférico. Como resultado, a divulgação inclui, entre outros, novos métodos de tratamento de sinucleinopatias, por exemplo, sinucleinopatias primárias, em indivíduos sem um distúrbio de depósito lisossomal clássico conhecido, por exemplo, por administração de um polipéptido enzima lisossomal tipo não protease, por exemplo, uma enzima que metaboliza lípidos, tal como um polipéptido de GBA, ou uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido de GBA, ou agentes que ativam a atividade de GBA, ou uma enzima lisossomal do tipo protease que tem a atividade de diminuição de alfa-sinucleína (atividade "sinucleínase").
Em geral, enzimas lisossomais do tipo protease caem nas categorias de proteases aspartilo (tais como uma catepsina D ou uma catepsina E) e proteases cisteinilo (por exemplo, a catepsina F e a catepsina G) . Assim, a divulgação inclui também, entre outros entre outros, novos métodos de tratamento de sinucleinopat ias com enzimas lisossomais do tipo protease, bem como polipéptidos de procatepsina D, E, F e L ou moléculas de ácido nucleico que codifica catepsina D, E, F ou L , ou aqueles que codificam as suas formas de polipéptido pro e pre pró-proteína.
Além disso, enzimas não protease, por exemplo, polipéptido de GBA ou enzimas protease, tais como polipéptidos de catepsina D, podem ser co-administradas com agentes que aumentam ou induzem autofagia, tais como rapamicina ou análogos de rapamicina.
Além disso, dado o papel central que a prosaposina (PS) e seus derivados, saposina A (SA), saposina B (SB), saposina C (SC) e saposina D (SD), desempenham como cofatores na atividade de GBA in vivo, outros métodos terapêuticos incluem a administração de polipéptidos de GBA em conjunto com polipéptidos ativadores de GBA, tais como polipéptidos de PS e/ou polipéptidos de SC ou administrar polipéptidos de PS e/ou polipéptidos de SC sozinhos (para ativar ou melhorar GBA endógeno) para facilitar uma redução nos níveis da proteína aS estado estacionário in vivo.
Em geral, a divulgação caracteriza métodos de tratamento de indivíduos, por exemplo, seres ser humano os ou animais, tais como animais domésticos, por exemplo, cães, gatos, cavalos, cabras, vacas e porcos, com uma sinucleinopatia, por exemplo, uma sinucleinopatia primária ou secundária, mas não uma doença de depósito lisossomal diagnosticada clínicamente ou diagnosticável clinicamente. Estes métodos incluem a administração a um indivíduo de qualquer um ou vários dos seguintes: um polipéptido de enzima lisossomal (por exemplo, um polipéptido do tipo não protease tal como GBA ou um polipéptido de enzima do tipo protease, tal como a catepsina D) , um polinucleótido que codifica um ou mais polipéptidos de enzima do lisossoma, um agente de ativação da enzima lisossomal e um polinucleót ido que codifica um agente de ativação da enzima lisossomal, numa quantidade eficaz para reduzir um nível de α-sinucleína no sistema nervoso central ou periférico do indivíduo, ou em ambos ou no compartimento lisossomal do indivíduo. A sinucleinopatia pode ser qualquer uma ou várias de: doença de Parkinson (DP); demência com corpos de Lewy (DLB) esporádica ou herditária; falência autonômica pura (PAF) com deposição de α-sinucleína; atrofia multissistémica (MSA); neurodegeneração hereditária com acumulação de ferro no cérebro; doença com corpos de Lewy incidental de idade avançada. Em outros aspetos, a sinucleinopatia pode ser qualquer uma ou várias de: doença de Alzheimer da variante com corpos de Lewy; síndrome de Down; tremor essencial com corpos de Lewy; parkinsonismo familiar com ou sem demência; demência ligada ao gene tau e ao gene progranulina com ou sem parkinsonismo; doença de Creutzfeldt Jakob; encefalopatia espongiforme bovina; doença de Parkinson secundária; parkinsonismo resultante de exposição a neurotoxina; parkinsonismo induzido por um fármaco com deposição de α-sinucleína; ataxia espinocerebelar esporádica ou hereditária; esclerose lateral amiotrófica (ELA) e distúrbio idiopático comportamental do sono de movimento rápido dos olhos.
Nestes métodos, a enzima lisossomal do tipo protease pode ser um polipéptido de protease de aspartilo, tal como um polipéptido de catepsina D, um polipéptido de procatepsina D, um polipéptido de catepsina E e um polipéptido de procatepsina E ou um polipéptido de protease cisteinilo, tal como um polipéptido de catepsina F, um polipéptido de procatepsina F, um polipéptido de catepsinas L e um polipéptido de procatepsina L.
Em certos aspetos, o agente de ativação da enzima lisossomal é ou inclui um agente de ativação de polipéptido de GB A, tal como isofagomina (IFG) ou polipéptido de ativação, tal como qualquer uma ou várias de um polipéptido de prosaposina, um polipéptido de saposina A, um polipéptido de saposina B, um polipéptido de saposina C e um polipéptido de saposina D. Claro que também pode ser utilizado um polinucleótido que codifica qualquer um ou vários de um polipéptido de prosaposina, um polipéptido de saposina A, um polipéptido de saposina B, um polipéptido de saposina C e um polipéptido de saposina D.
Num outro aspeto, a divulgação caracteriza métodos de tratamento de sinucleinopatias, como descrito no presente documento e pela administração adicional de um ou mais agentes que melhoram a autofagia da α-sinucleína. Por exemplo, o agente pode ser ou incluir um inibidor de mTOR, rapamicina, um análogo de rapamicina, everolimus, ciclosporina, FK506, hsc70, N-octil-4-epi-p-valienamine ou glicerol.
Nos métodos descritos no presente documento, o agente pode ser uma molécula pequena, uma molécula grande, um péptido, um anticorpo, um ácido nucleico ou um fragmento biologicamente ativo dos mesmos.
Num outro aspeto, a divulgação inclui a utilização de qualquer um ou vários de um polipéptido de enzima lisossomal, um polinucleótido que codifica um ou mais polipéptidos de enzima lisossomals, um agente de ativação da enzima lisossomal e um polinucleót ido que codifica um agente de ativação da enzima lisossomal, como descrito no presente documento, em métodos para a preparação de medicamentos para o tratamento duma sinucleinopatia, utilizando métodos bem conhecidos de fabrico.
Por "polipéptido" é entendido qualquer cadeia de aminoácidos, independentemente do comprimento ou modificação pós-translacional (por exemplo, glicosilação ou fosforilação) e, assim, inclui proteínas, polipéptidos e péptidos.
Por um " polipéptido substancialmente puro" é entendido um polipéptido que foi separado de componentes que o acompanham in vivo. Um polipéptido é substancialmente puro quando é pelo menos 60%, por peso, livre das proteínas e moléculas orgânicas de ocorrência natural com as quais está naturalmente associado. Preferivelmente, a preparação é pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 90% e mais preferivelmente pelo menos 99%, por peso, do polipéptido desejado.
Um "polipéptido de GBA" é qualquer proteína ou polipéptido de GBA que tem pelo menos 50 por cento da atividade biológica do correspondente GBA de tipo selvagem na redução de um nível de aS num modelo de células dopaminérgicas como descrito no presente documento.
Um "polipéptido de catepsina" tal como um polipéptido de catepsina D é qualquer proteína ou polipéptido de catepsina que tem pelo menos 50 por cento da atividade biológica da correspondente catepsina de tipo selvagem na redução de um nível de aS num modelo de células dopaminérgicas como descrito no presente documento.
Uma proteína ou polipéptido "alfa-sinucleína" (aS ou proteína aS) , como utilizado no presente documento, inclui uma única proteína ou polipéptido monomérico, bem como tais proteínas aS e na forma de oligómeros, por exemplo, na forma de dímeros ou trímeros ou na forma de complexos associados a lípidos ou formas livres de lípidos ou na forma de agregados e qualquer uma destas formas pode ser solúvel ou insolúvel. Os termos também incluem as proteínas aS encontradas em complexos com outras moléculas.
Num outro aspeto, a divulgação caracteriza métodos para a identificação de compostos candidatos para o tratamento duma sinucleinopatia que inclui (a) obter um sistema modelo, por exemplo, um sistema celular tal como um modelo de células dopaminérgicas, por exemplo, como descrito no presente documento, que facilita a quantificação de complexos α-sinucleína; (b) contactar o sistema modelo com um composto teste para incubação e (c) comparar um nível de a-sinucleína na presença e na ausência do composto teste; em que uma diminuição no nível dos complexos α-sinucleína na presença do composto teste indica que o composto teste é um composto candidato para o tratamento duma sinucleinopatia. Em alguns aspetos, a quantificação precisa da proteína α-sinucleína é realizada pelo emprego dum ELISA específico e sensível, tipo sanduíche, por exemplo, como descrito no presente documento. 0 sistema modelo α-sinucleína pode ser, por exemplo, uma célula que expressa a proteína ou um modelo animal. A divulgação também caracteriza métodos de tratamento de sinucleinopatias, em que o número ou concentração de glucosilceramida e glicoesfingolipidos contendo glucosilceramida é reduzido dentro de células neurais e não neurais direcionando glucosilceramida e glicoesfingolipidos contendo glucosilceramida com proteínas, sequências de péptido, enzimas, anticorpos, lípidos naturais, lípidos semi-sintéticos e lípidos sintéticos bem como derivados dos mesmos. Por exemplo, o número ou concentração de glucosilceramida e glicoesfingolipidos contendo glucosilceramida pode ser reduzido dentro das células neurais e não neurais por hidrólise enzimática ou não enzimática glucosilceramida e glicoesfingolipidos contendo glucosilceramida. Tais métodos podem ser catarisados por GBA numa forma de tipo selvagem ou numa forma mutante que é competente para ligação mas cataliticamente inativo. Nestes métodos também pode ser administrada prosaposina e/ou os seus derivados, tais como saposina C, como descrito no presente documento. Em alguns aspetos a proteína ou o polipéptido desejado, tal como GBA, é obtido expressão dum polinucleótido que codifica a enzima ou um derivado do mesmo.
Nestes métodos os agentes, tais como prosaposina, saposina A, saposina B, saposina C, saposina D, péptidos derivados dos mesmos, moléculas pequenas ou grandes, anticorpos, fragmentos de anticorpos ou polinucleótidos pequenos ou grandes que melhoram a função biológica natural de GBA, por exemplo, agentes de ativação de GBA, são entregues ao sistema nervoso central e/ou periférico numa quantidade eficaz para diminuir um nível da proteína aS.
Salvo definido em contrário, todas as técnicas e termos científicos utilizados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por um perito na especialidade à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos no presente documento possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Em caso de conflito, incluindo definições, a presente especificação controlará. Além disso, os materiais, os métodos e os exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos.
Características e vantagens da invenção serão aparentes da descrição detalhada seguinte e das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIGURA 1 é uma representação dum Western Blot, que demonstra a formação dependente do tempo dum complexo (aS/G) de 19 - 20 kDa estável entre gangliosídeos de cérebro humano e α-sinucleína in vitro. A FIGURA 2A é uma representação dum Western Blot, da proteína α-sinucleína expressa em células MES23.5 transfetadas transitoriamente com níveis indicados dum plasmídeo de ADNc de a-sinucleína. A FIGURA 2B é uma representação dum Western Blot que indica os efeitos da transfeção de ADNc de GBA, transfeção de ADNc +/- prosaposina nos níveis da proteína a-sinucleina intracelular em células MES23.5-sin. Os níveis da última proteína são mostrados no painel inferior do Western blot. A FIGURA 2C é um gráfico de barras de medições de ELISA que indica os níveis da proteína a-sinucleína intracelular detetados em células MES-sin em presença ou ausência de prosaposina e dependente da quantidade de ADN GBA co-transfetado. A FIGURA 3A é um gráfico do desempenho de um ELISA sanduíche que detecta especificamente quantidades crescentes da proteína α-sinucleína recombinante (eixo do x) , como monitorizado por DO leitura de absorvâncias (eixo do y) . A FIGURA 3B é um gráfico de barras de medições de ELISA que indica os níveis da proteína a-sinucleína intracelular detetados em células MES23.5-sin na presença de quantidades crescentes de SNCA (sinucleína, alfa (componente não A4 do precursor de amilóide) ) ADNc (eixo dos x) , que foi transfetado para estas células, em que os lisados foram diluídos em série de 1 em 200 a 1 em 4.000. A FIGURA 3C é uma análise de regressão da concentração da proteína α-sinucleína intracelular depois de uma dada quantidade de ADNc SCNA transfetado, como medido por ELISA sanduíche e como interpolado dos dados obtidos na FIGURA 3A e na FIGURA 3B. A FIGURA 3D é um gráfico de barras que mostra os resultados de lactato desidrogenase (LDH) e ensaios MTT que confirmam a viabilidade celular completa da proteína a-sinucleína expressando células MES-syn, 24 horas após a transfeção. A FIGURA 4 é uma representação dos resultados de ELISA sanduíche de cinco experiências separadas, as quais indicam um aumento de 20 a > 270 por cento em níveis da proteína α-sinucleína intracelular em células MES23.5 seguindo a expressão de polipéptido de GBAs mutante que carregam uma das várias mutações de sentido errado que foram recentemente ligadas à doença de Parkinson e demência com corpos de Lewy ou as quais carregam mutações prejudiciais ao local ativo do GBA. O nível da proteína α-sinucleína é expresso em relação à concentração de células MES-sin transfetadas sem GBA ectópica, mas apenas ADNc vetor vazio. A FIGURA 5 é um gráfico de barras de medições de ELISA sanduíche de atividade de redução de nível da proteína α-sinucleína do ser ser humano o e de ratazana de catepsina D de ser ser humano o quando expressa conjuntamente em células MES23.5-sin (MES-aS). A FIGURA 6 é uma representação dum Western Blot que indica a atividade de redução de nível da proteína a-sinucleína dependente da dose de catepsina D humana quando expressa conjuntamente em células MES23.5-sin (MES-aS).
A FIGURA 7 é um gráfico de barras de medições de ELISA sanduíche de atividade de redução de nível da proteína α-sinucleína humana de catepsina D quando expressa conjuntamente em células MES23.5-sin (MES-aS). Note-se que tanto a proteína α-sinucleína de tipo selvagem pode ser reduzida por catepsina D bem como várias isoformas de α-sinucleína mutantes que carregam mutações de sentido errado e foram previamente ligadas a formas familiares da doença de Parkinson e confirmadas pela autópsia. DESCRIÇÃO DETALHADA
Em geral, a divulgação refere-se aos métodos de redução dos níveis de aS em células em indivíduos humanos ou animais que têm uma sinucleinopatia que não é um distúrbio de depósito lisossomal, por exemplo, indivíduos que têm sinucleinopatia primária (ou invariável). Estes métodos incluem, por exemplo, a administração de polipéptidos de enzima lisossomal do tipo não protease, tais como polipéptido de GBA, polipéptidos de enzima lisossomal do tipo protease, tais como polipéptidos de catepsina D ou moléculas de ácido nucleico que codificam tais polipéptidos, quer sozinhos ou em combinação com agentes que melhoram ou induzem autofagia, tal como rapamacina ou um análogo de rapamacina. Além disso, outros agentes de ativação de GBA, tais como polipéptidos de prosaposina e/ou polipéptidos de saposina C podem ser administrados ou polipéptidos de prosaposina e/ou polipéptidos de saposina C podem ser administrado sozinhos (para melhorar a ativação da atividade endógena de GBA) para facilitar uma redução nos níveis da proteína aS estado estacionário in vivo.
Assim, a presente divulgação envolve modular a degradação fisiológica de α-sinucleína (aS) pela melhoria do processamento dentro dos lisossomas e/ou do citoplasma e, em alguns aspetos, pela melhoria da quantidade de aS absorvido pelos lisossomas (autofagia). Embora não desejando ser vinculado por qualquer teoria de funcionamento, o processamento de degradação na forma de agregados de aS é um sistema de funcionamento a um nível de estado estacionário. Ao aplicar a lei de ação da massa ao estado constante do processamento de degradação das proteínas aS, formas oligoméricas, agregados e/ou complexos, pode-se modular o processo de degradação em relação aos seus produtos finais, aumentando a abundância dos seus eductos. Ao alterar as reações da componente da via pode-se empurrar o processamento geral para níveis mais elevados de produto. Assim, tanto aumentando a entrada de aS para os lisossomos ou melhorando a própria eficiência da degradação, pode-se empurrar a hidrólise e o processamento subsequente de aS para um nível mais elevado do produto. 0 aumento de ambos, o componente autofágico e o componente lisossomal da via, pode levar a um aumento da proteção de danos da proteína aS e tais combinações podem alcançar um maior efeito do que os efeitos aditivos.
Alguns aspetos descritos no presente documento são métodos de tratamento ou de retardar a progressão ou o desenvolvimento dum distúrbio sinucleinopatia que não é uma doença de depósito lisossomal, por exemplo, pela administração dum agente ou agentes que aumenta a atividade ou nível de GBA e/ou prosaposina/saposina C. Em alguns aspetos, os agentes podem ser GBA e/ou polipéptidos de prosaposina/saposin C ou fragmentos ativos dos mesmos ou ácido nucleico que codifica tais polipéptidos ou fragmentos ativos. Em alguns aspetos o agente é uma forma competente para ligação mas cataliticamente inativo de GBA ou uma molécula de ácido nucleico que codifica os mesmos.
Outros aspetos descritos no presente documento são métodos de tratamento ou de retardar a progressão ou desenvolvimento dum distúrbio sinucleinopatia, por exemplo, pela administração dum agente ou agentes que aumenta a atividade ou nível de catepsina D ou catepsina F e/ou preprocatepsina D ou preprocatepsina F. Em alguns aspetos, os agentes podem ser GBA e/ou polipéptidos de prosaposina/saposin C/catepsina D/catepsina F ou fragmentos ativos dos mesmos ou ácido nucleico que codificam tais polipéptidos ou fragmentos ativos. Em alguns aspetos o agente é uma forma competente para ligação mas cataliticamente inativo de GBA, catepsina D ou catepsina F ou uma molécula de ácido nucleico que codifica os mesmos. Métodos de Tratamento de Distúrbios Sinucleinopatia 0 termo sinucleinopatia é utilizado no presente documento para nomear um grupo de distúrbios neurodegenerativos caracterizados pela presença de níveis aumentados, por exemplo, níveis de estado estacionário, de qualquer uma ou várias das variantes não fibrilares solúveis, isoformas oligoméricas solúveis, variantes não fibrilares insolúveis, complexos e agregados fibrilares insolúveis da proteína α-sinucleína (aS) dentro de compartimentos celulares de populações seletivas de neurónios e glia. Assim, o nível de estado estacionário de aS é entendido a abranger todas as formas solúveis, bem como insolúveis e intermediárias (metaestáveis) do produto do gene SNCA.
Estes distúrbios incluem qualquer uma das seguintes sinucleinopatias agrupadas como "invariável" (ou "primária") (Schlossmacher MG. α-sinucleina and sinucleinaopathies. The Dementias 2 Blue Books of Practical Neurology; Editores: Growdon JH e Rossor MN. Butterworth Heinemann, Inc., Oxford. 2007; Capítulo 8: páginas 184-213) : doença de Parkinson (DP) por exemplo, doença de Parkinson esporádica/parkinsonismo e doença de Parkinson familiar/parkinsonismo; demência com corpos de Lewy (DLB) esporádica ou hereditária (também conhecida como demência com corpos de Lewy difusa); falência autonômica pura (PAF) com deposição de sinucleina; atrofia multissistémica (MSA) (de tipo cerebelar, parkinsoniana ou mista); neurodegeneração hereditária com acumulação de ferro no cérebro (também conhecida como doença de Hallervordern Spatz ou neurodegeneração ligada a pantotenato quinase 2) e doença com corpos de Lewy incidental de idade avançada.
Além disso, sinucleinopatias "variável" (ou "secundária") foram identificadas onde a desregulação do metabolismo da alfa-sinucleína é reconhecida por ser um evento secundário (dada a abundância da proteína no sistema nervoso), o qual, contudo, contribuie significantemente para o decurso, a penetração, a idade-de-inicio, a gravidade e a expressividade da enfermidade primária. Distúrbios com sinucleinopatia variável (Schlossmacher MG. a-sinucleína and sinucleinaopathies. The Dementias 2 Blue Books of Practical Neurology; Editores: Growdon JH e Rossor MN. Butterworth Heinemann, Inc., Oxford. 2007; Capítulo 8: páginas 184-213) incluem, mas não estão limitados a, doença de Alzheimer da variante com corpos de Lewy; síndrome de Down; paralisia supranuclear progressiva; tremor essencial com corpos de Lewy; parkinsonismo familiar com ou sem demência resultante de um gene mutante e loci e onde nenhuma mutação do gene ainda foi identificada; doença de Creutzfeldt Jakob e doenças de prião relacionadas tais como encefalopatia espongiforme bovina (doença da vaca louca); doença de Parkinson secundária/parkinsonismo resultante de exposição a neurotoxina/parkinsonismo induzido por um fármaco com deposição de α-sinucleina; ataxia espinocerebelar esporádica ou hereditária; esclerose lateral amiotrófica (ELA); distúrbio idiopático comportamental do sono de movimento rápido dos olhos e outras condições associadas com acumulação de a-sinucleína central e/ou peripheral central e/ou periférica em mamíferos que acompanha um processo de doença primária.
Clinicamente, todos estes distúrbios relacionados são caracterizados por uma diminuição crónica e progressiva das funções motora, cognitiva, comportamental e/ou autonômica, dependendo da distribuição das anomalias de alfa-sinucleína.
Uma sinucleinopatia pode ou não estar associada com sintomas da doença. Também pode ser o produto do envelhecimento normal. Por exemplo, pessoas com mais de 55, 60, 65, 70, 75, ou 80 anos, podem acumular as tais proteínas aS, por exemplo, na forma de agregados, sem associação óbvia com uma patologia, sintoma ou estado da doença. Esta condição é referida como doença do corpo de Lewy incidental (ver acima) e as pessoas com essa condição são consideradas estar em alto risco para DP/parkinsonismo.
Em geral, indivíduos com os tipos de sinucleinopatias contemplados no presente documento não têm um distúrbio de depósito lisossomal (LSD) primário diagnosticado clinicamente (ou não diagnosticável clinicamente) primary, tal como a doença de Gaucher ou a doença de Tay-Sachs; estas síndromes de LSD demonstram muitas vezes um padrão de herança autossómica recessiva. No entanto, os indivíduos com mutações alélicas única num gene que tem sido de outra forma ligado a um fenótipo LSD clássico também podem desenvolver sinucleinopatia e sofrer com as suas consequências (como DP/parkinsonismo ou demência com corpos de Lewy) mas sem evidência de um LSD sistémica (Eblan et al., N. Engl. J. Med., 2005). LSDs são um grupo de distúrbios metabólicos que incluiem cerca de quarenta distúrbios genéticos, muitos dos quais envolvem defeitos genéticos em várias hidrólases lisossomais que são normalmente causadas por mutações em ambos os alelos do gene que codifica para a enzima lisossomal. A marca característica de DDL é a perda de 90 por cento (ou mais) na atividade enzimática da hidrólase lisossomal em questão e a acumulação anormal resultante de metabolitos dentro dos lisossomos, que leva à formação de um grande número de lisossomos distendidos no pericário.
Os métodos descritos no presente documento podem ser utilizados para tratar todas as pessoas com sinucleinopatias primárias e secundárias, incluindo aquelas sem mutações nos seus genes da enzima lisossomal, tais como o gene GBA (isto é, pacientes com doença de Parkinson esporádicos sem uma anormalidade de um único gene conhecida). Estes são pacientes onde envelhecimento/agressão tóxica/trauma na cabeça/influência de genes modificadores ou outras causas desconhecidas podem trabalhar em conjunto para causar ou promover a doença (Klein e Schlossmacher, Neurology, 2007, 69 (22) :2093-104) .
Os novos métodos descritos no presente documento também também podem ser utilizados para tratar uma sub-população de pacientes de sinucleinopatia com uma heterozigótica (isto é, um alelo único, em vez de dois alelos) mutação num ou mais dos genes de enzimas lisossomais, por exemplo, no gene GBA. Estes indivíduos não estão a sofrer duma LSD típica (porque não têm uma deficiência da enzima de 90 por cento ou maior, porque ainda expressam suficiente GBA do único alelo saudável restante) mas muitas vezes sofrem de uma sinucleinopatia primário. Os dados atualmente disponíveis sugerem que esta mutação heterozigótica em GBA serve como um fator de risco para a doença de Parkinson (e distúrbios relacionados) e como um alelo de risco para o desenvolvimento de uma sinucleinopatia primária no sistema nervoso (Clark et al.r Neurology, 2007, 69 (12) : 1270-7) . Intrigantemente, se ambas as cópias (alelos) do gene GBA são mutadas (por exemplo, em veículos variantes N370S, L444P, K198T e R329C de GBA), um subgrupo de pacientes com as características clássicas de LSD da doença de Gaucher irá desenvolver sinucleinopatia secundária (Lwin et ai., Mol. Genet. Metab., 2004, 81(1) :70-3) .
Em particular, os tratamentos podem ser aplicados profilaticamente àquelas pessoas que são genotipadas para mutações GBA conhecidas (que, por exemplo, já foram genotipadas devido a uma história familiar de Doença de Gaucher) para prevenir o desenvolvimento da doença de Parkinson ou terapeuticamente naquelas pessoas com mutações de GBA conhecidas que já desenvolveram um distúrbio de sinucleinopatia. Assim, o passo de genotipagem do paciente ou do indivíduo para uma mutação num gene de enzima lisossomal, por exemplo, o gene GBA, pode ser um primeiro passo nos métodos terapêuticos descritos no presente documento. Os pacientes que são heterozigóticos para a mutação, são candidatos para tratamento pelos novos métodos.
Administração ou Ativação de Polipéptidos de Enzima Lisossomal do Tipo Não Protease
Os novos métodos incluem a administração de polipéptidos de enzima lisossomal do tipo não protease, por exemplo, polipéptido de GBAs, quer diretamente ou por administração de moléculas de ácido nucleico que codificam polipéptido de GBAs, a pacientes com necessidade do mesmo, por exemplo, em indivíduos que tenham sido diagnosticados com uma sinucleinopatia que não é um distúrbio de depósito lisossomal. O GBA também é conhecido como glucosidase, beta, ácido; beta-glucosidase ácida; beta-glucosidase ácida; glucocerebrosidase; glucosilceramidase e GBAP. Este gene normalmente codifica uma proteína membrana lisossomal que cliva a ligação beta-glicosídica de glicosilceramida (conhecido também como glicocerebrosídeo) , um intermediário no metabolismo glicolípido. Também pode clivar glucosilesfingosina como um substrato secundário para gerar glicose e esfingosina (Sidransky, Mol Genet Met, 2004, ρρβ-15) . Mutações neste gene podem causar a doença de Gaucher, uma doença de depósito lisossomal caracterizada por uma acumulação de glicocerebrosídeos e glucosilesfingosinas. A união alternativa resulte em múltiplas variantes de transcrito que codificam a mesma. Existem cinco variantes de ARNm (que variam na UTR 5 ' ) , o mais longo dos quais é apresentado na base de dados GenBank com os números de acesso NM_001005749.1 (ARNm) e NP_001005749.1 (aminoácido). Informação sobre GBA pode ser encontrada na base de dados Entrez Gene em GenelD: 2629.
Os métodos também podem incluir aumento da ativação do polipéptido de GBAs administrado ou qualquer GBA endógeno por administração de polipéptidos de ativação de GBA, tais como prosaposina (PS) e/ou os seus derivados, saposina A (SA) , saposina B (SB), saposina C (SC) e saposina D (SD).
O gene da prosaposina codifica a uma glicoproteína altamente conservada que é ou segregada como uma proteína de comprimento completo com atividades neurotróficas ou processada proteoliticamente em compartimentos endossomal/lisossomal por catepsina D e outras proteases nas 4 saposinas A, B, C e D (Leonova et al., J. Biol. Chem, 1996, 271:17312-17320; Hiraiwa et al. , Arch. Biochem. Bio-phys.,1997, 341:17-24). As saposinas A-D localizam principalmente para compartimento lisossomal onde facilitam o catabolismo de glicoesfingolípidos com grupos de oligossacáridos curtos. As funções da saposina C de ancorar a proteína GBA sob condições de pH baixo ao lado interno da membrana lisossomal, permitindo assim GBA a dobrar adequadamente para a interacção do substrato correta (Salvioli et al., 2000, FEBS. Lett. 472:17-21). Além disso, saposina C protege a proteína GBA de degradação proteolitica por proteases lisossomais (Sun et al. , J. Biol. Chem., 2003, 278:31918-31923) . A importância biológica desta proteína é sublinhada pelo facto de que mutações nulas no gene da prosaposina e/ou mutações pontuais na região da Saposina C do gene podem levar à Doença de Gaucher clínica, apesar da presença de GBA de tipo selvagem (Pamplos et al., Acta. Neuropathol., 1999, 97:91-97; Tylki-Szymanska, 2007, Clin. Genet., 72:538-542; Rafi et al., 1993, Somat. Cell Mol. Genet., 19:1-7) .
Além disso, a baixa atividade in vivo da mutação de GBA mais comum, N370S, pode ser explicada pela sua incapacidade em interagir com saposina C e fosfolípidos aniónicos (Salvioli et al, Biochem J., 2005, 390:.. 95-103). A união alternativa de prosaposina resulte em múltiplas variantes de transcrito que codificam a mesma diferentes isoformas. A prosaposina (variante da doença de Gaucher e variante leucodistrofia metacromática) é descrita na base de dados Entre Gene em GenelD: 5660. As sequências das suas isoformas estão disponíveis no GenBank como se segue: uma preproproteína de isoforma a de prosaposina: NM_002778.2 (ARNm) e NP_002769.1 (aminoácido); preproproteína prosaposina isoforma b: NM_001042465.1 (ARNm) e NP_001035930.1 (aminoácido) e preproproteína prosaposina isoforma c NM_001042466.1 (aminoácido) e NP_001035931.1 042.465,1 (ARNm).
Ambos os polipéptidos de GBA e o GBA que codificam moléculas de ácido nucleico, bem como os polipéptidos que ativam GBA e as moléculas de ácido nucleico correspondentes, podem ser administrados utilizando técnicas conhecidas, que incluem as técnicas descritas no presente documento. Por exemplo, o polipéptido de GBA que codifica moléculas de ácido nucleico pode ser administrado utilizando a terapêutica genética como descrito no presente documento.
Administração de Polipéptidos de Enzima Lisossomal do Tipo Protease
Num método alternativo, um indivíduo diagnosticado como tendo uma sinucleinopatia que não é uma LSD, pode ser tratado com polipéptidos protease lisossomal, tais como um polipéptido de catepsina D. Tais proteases podem ser administradas diretamente ou por administração duma molécula de ácido nucleico que codifica protease desejada.
Em geral, a enzima lisossomal do tipo protease caem nas categorias de proteases aspartil tais como uma catepsina D (ou catepsina E) e proteases cisteinilo (por exemplo, catepsina F e catepsina L) . Assim, a invenção incluie, entre outros, novos métodos de tratamento de sinucleinopatias com enzimas lisossomais do tipo protease relacionadas a polipéptido procatepsina D ou procatepsina E ou alternativamente com enzimas lisossomais do tipo protease relacionadas a polipéptido procatepsina F ou procatepsina L, ou moléculas de ácido nucleico que codificam a catepsina D, catepsina E, catepsina F ou catepsina L ou aqueles que codificam as suas formas de polipéptido pre-pro-proteín. A família catepsina de proteases inclui uma dúzia de membros aproximadamente, os quais se distinguem pela sua estrutura e as proteínas que clivam. A maioria dos membros torna-se ativado com pH baixo encontrado em lisossomas. Assim, a atividade desta família encontra-se quase inteiramente dentro desses organelos. 0 gene da catepsina D (CTSD) codifica uma protease lisossómica aspartil composta por um dímero de cadeias pesadas e leves ligadas por dissulfureto, ambos produzidos de um precursor de proteína único. Esta proteinase, que é um membro da família peptidase Cl, tem uma especificidade semelhante a, mas mais estreita do que, a de pepsina A. A informação da sequência do gene humano está disponível no GenBank como Homo sapiens catepsina D (CTSD), ARNm: NM_001909.
Dentro da família catepsina, só um outro membro conhecido (para além da catepsina D) possui atividade de protease aspartil, que é a catepsina E. É transcrita em 2 variantes. A informação da sequência para as variantes humanas está disponível em GenBank como Homo sapiens catepsina E (CTSE), ARNm: NM_001910.2 e NM_148964.1.
Dentro da família catepsina, vários outros membros possuem atividade de protease cisteína, por exemplo catepsinas C, L, F e W. Destas muitas catepsinas protease cisteína, as enzimas F e W formam um subgrupo separado, com base nas suas localizações cromossómica, homologia de sequência e padrão de união (Wex et al. , 1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. , 259:401-407) . A Catepsina F é expressa no cérebro, bem como no coração, no músculo esquelético e noutros tecidos (Wang et al., 1998, J. Biol. Chem., 273:32000-32008). Knock Out do gene da catepsina F em ratinhos conduz a uma doença neurológica com início tardio com gliose, perda neuronal e a acumulação de grânulos autof luo res cent es (Tang et al. , 2006, Mol. Cell Biol., 26:2309-2316), que se pensa ser um modelo do início, num ser humano adulto de lipofuscinose ceróide neuronal. A informação da sequência do gene humano está disponível em GenBank como Homo sapiens catepsina E (CTSE), ARNm: NM_003793.3.
Ambos os polipéptidos catepsina D ou F e catepsina D ou F que codificam moléculas de ácido nucleico podem ser administrados utilizando técnicas conhecidas, que incluem as técnicas descritas no presente documento. Por exemplo, a catepsina D que codifica moléculas de ácido nucleico pode ser administrada utilizando terapêutica genética como descrito no presente documento.
Administração de Outros Polipéptidos de Enzima Lisossomal
Exemplos de outros polipéptidos que podem ser administrados para melhorar a degradação de processamento de aS dentro de lisossomas incluiem Aspartilglucosaminidase; a-Galactosidase A; Palmitoil Proteína Tioesterase; Tripeptidil Peptidase; Proteína Lisossomal Transmembranar; Transportador de Cisteína; ceramidase ácida; α-L-fucosidase ácida; Proteína Protetora/catepsina A; β-galactosidase ácida;
Iduronato-2-sulfatase; a-L-Iduronidase;
Galactocerebrosidase; α-manosidase ácida; β-manosidase ácida;
Arilsulfatase B; Arilsulfatase A; N-Acetilgalactosamina-6-sulfato; β-galactosidase ácida; N-Acetilglucosamina-l-fosfotransferase; Esfingomielinase ácida; NPC-1; a-glucosidase; β-Hexosaminidase B; Heparano N-sulfatase; α-Ν-Acetilglucosaminidase; Acetil-CoA: α-glucosaminida; N-Acetlglucosamina-6-sulfato; α-Ν-Acetilgalactosaminidase; α-Ν-Acetilgalactosaminidase; a-Neuramidase; β-Glucuronidase; β-Hexosaminidase A; glucocerebrosidase; ubiquitina C-terminal hidrolase-LI e Lipase ácido.
As proteínas e os polipéptidos podem ser enzimas de degradação lisossomal ou proteínas não lisossomais que promovem a degradação de sinucleína ou agregados de sinucleína. Estas proteínas e as suas sequências de codificação são bem conhecidas na técnica. Tipicamente as formas humanas das proteínas e das suas sequências de codificação serão utilizadas, embora para trabalhar em modelos animais, os animais ortólogos podem ser desejáveis. Uma ou mais de tais enzimas pode ser utilizada.
Melhorar e Induzir a Autofagia de Alfa- Sinucleína
Num outro aspeto da divulgação, agentes que melhoram e/ou induzem autofagia, tais como rapamacina ou análogos de rapamacina são co-administrados com as enzimas lisossomais, por exemplo, polipéptido de GBA ou proteases de lisossomais de tipo não GBA, tais como polipéptidos de catepsina D, para alcançar um maior efeito terapêutico do que o aditivo. A autofagia é um processo catabólico que envolve a degradação de componentes da própria célula através da maquinaria lisossomal. É um processo regulado firmemente, que desempenha um papel normal no crescimento celular, desenvolvimento e homeostase, que ajuda a manter um equilíbrio entre a síntese, a degradação e subsequente reciclagem dos produtos celulares. É um mecanismo importante pelo qual uma célula faminta realoca os nutrientes dos processos desnecessários aos processos mais essenciais.
Existe uma variedade processos autofógicos, tendo todos em comum a degradação das componentes intracelulares via o lisossoma. 0 mais conhecido mecanismo de autofagia envolve a formação duma membrana em torno de uma região alvo da célula, que separa o conteúdo do resto do citoplasma. A vesícula resultante funde-se então com um lisossoma e, posteriormente, degrada o conteúdo. A autofagia pode ser amplamente separada em três tipos: macroautofagia, microautofagia e autofagia mediada por chaperones: (i) macroautofagia envolve a formação de uma membrana formada de novo selada sobre si mesma para envolver componentes citosólicos (proteínas e/ou organelos inteiros), que são degradados após a sua fusão com o lisossoma; (ii) microautofagia é a invaginação direta de materiais para dentro do lisossoma e (iii) autofagia mediada por chaperones (CMA) envolve a degradação de proteínas citosólicas específicas marcadas com uma sequência peptídica específica. A CMA é muito seletiva no que é degradado e degrada apenas certas proteínas e organelos não. A CMA é responsável pela degradação de aproximadamente 30% de proteínas citosólicas em tecidos tais como fígado, rim e em muitos tipos de células em cultura.
As moléculas chaperone ligam-se e transportam proteínas marcadas para o lisossoma via um complexo recetor. Em CMA, apenas estas proteínas que têm uma sequência de péptido de consenso são reconhecidas pela ligação de uma chaperone. Este complexo substrato/chaperone de CMA move-se então para os lisossomos, em que uma proteína de membrana associada ao lisossoma recetor de CMA reconhece o complexo; a proteína é desdobrada e translocado através da membrana do lisossoma assistida por proteínas adicionais no interior. A a-sinucleína solúvel de tipo selvagem foi relatada para ser degradada por este mecanismo (Cuervo et al. (2004), Science, 305:1292).
A autofagia é parte do crescimento e desenvolvimento diário normal duma célula em que o alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) desempenha um importante papel regulador. A inanição inibe a atividade da mTOR, provocando várias respostas celulares, incluindo a paragem celular na fase G1 precoce, a inibição da síntese proteica, a renovação de transportador de nutrientes, alterações da transcrição e autofagia. A rapamicina é um agente bem conhecido para a inibição da atividade da mTOR. Qualquer inibidor de análogo de rapamicina ou de mTOR conhecido na técnica pode ser utilizado para os métodos descritos no presente documento. Por exemplo, everolimus, ciclosporina e FK506 podem ser utilizados ou testados quanto à sua capacidade estimuladora de autofagia. Embora todos esses análogos e inibidores possam não ter a atividade estimuladora de autofagia de rapamicina, esta atividade pode ser facilmente determinada entre estes compostos. Os agentes que promovem a autofagia incluem proteínas chaperones e compostos que se ligam e acompanham substratos para o lisossoma. Outros compostos que podem estimular a autofagia incluem hsc70, N-octί1-4-βρί-β-valienamina e glicerol. Um ou mais de tais agentes pode ser utilizado nos métodos de melhorar a autofagia descrita no presente documento.
Qualquer enzima lisossomal que ajude a degradar a sinucleína ou a causar desagregação dos complexos de sinucleína, sozinha ou em combinação com outra(s) enzima(s) ou agente (s) lisossomal (ais) , pode ser utilizado para a presente invenção. Métodos de Administração
Geralmente os métodos descritos no presente documento incluem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dum composto terapêutico como descrito no presente documento a um indivíduo que está em necessidade de, ou que tenha sido determinado estar em necessidade de tal tratamento.
Como utilizado neste contexto, "tratar" significa melhorar pelo menos um sintoma do distúrbio de sinucleinopatia e/ou causar uma diminuição mensurável no nível da proteína aS no indivíduo. Do mesmo modo, a administração de uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" de uma composição descrita no presente documento para o tratamento duma sinucleinopatia resultará numa diminuição do nível da proteína aS e/ou em resultados numa melhoria em um ou mais sintomas do distúrbio de sinucleinopat ia. Esta quantidade pode ser a mesma ou diferente duma "quantidade profilaticamente eficaz" que é uma quantidade necessária para inibir, por exemplo, prevenir o início da doença ou dos sintomas da doença.
Uma quantidade eficaz pode ser administrada numa ou mais administrações, aplicações ou dosagens. Uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição depende da composição selecionada. As composições podem ser administradas de uma ou mais vezes por dia a uma ou mais vezes por semana; incluindo uma vez a cada dois dias. 0 perito na especialidade compreenderá que determinados fatores influenciam a dosagem e tempo necessário para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo, mas não limitado a, a gravidade da doença ou distúrbio, os tratamentos anteriores, o estado de saúde geral e/ou a idade do indivíduo e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições descritas no presente documento pode incluir um tratamento único ou uma série de tratamentos. A dosagem, a toxicidade e a eficácia terapêutica dos compostos pode ser determinada, por exemplo, por meio de procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinação da LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão da dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expresso como a razão LD50/ED50. Os compostos que exibem índices terapêuticos elevados são preferidos. Embora os compostos que exibem efeitos secundários tóxicos possam ser utilizados, deve ser tomado cuidado para desenhar um sistema de entrega que direcione tais compostos para o local do tecido afetado de forma a minimizar o dano potencial a células não infetadas e, assim, reduzir os efeitos secundários.
Os dados obtidos dos ensaios da cultura celular e dos estudos de animais podem ser utilizados na formulação de um intervalo de dosagem para utilização em seres humanos. A dosagem de tais compostos situa-se preferencialmente dentro de um intervalo de concentrações de circulação que inclui a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro deste intervalo dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. Para qualquer composto utilizado no método da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente de ensaios de cultura celular. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir um intervalo de concentrações plasmáticas circulantes que inclua a IC50 (isto é, a concentração do composto teste que atinge uma inibição semi-máxima dos sintomas) como determinado em cultura celular. Tal informação pode ser utilizada para determinar com maior precisão as doses úteis em seres humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência.
Informação mais específica sobre dosagens é discutido abaixo.
Administração de Polipéptidos e Pequenas Moléculas
Se se desejar os agentes que atravessam a barreira hematoencefálica podem ser administrados sistemicamente. Alternativamente, os agentes tais como os polipéptidos e pequenas moléculas descritos no presente documento podem ser entregues diretamente num local no corpo onde as células exibem uma acumulação de aS. Tais agentes que não atravessam a a barreira hematoencefálica podem ser administrados ao cérebro, por exemplo, utilizando injeção direta facilitada por orientação estereotáxica. Tais agentes também podem ser administrados por via intraventricular ou por vias intraparenquimatosas.
Noutros aspetos, as moléculas de ácido nucleico que codificam polipéptidos desejados podem ser entregues, por exemplo, na forma dum vetor virai que contém um um gene que codifica o polipéptido. A entrega virai pode ser sob condições que favorecem a expressão do transgene em células nervosas centrais ou periféricas específicas, tais como ependimais ou outras células gliais que revestem os ventrículos do cérebro. As células ependimais podem ser transduzidas para expressar o transgene e segregar o produto proteico codificado para dentro do líquido cefalorraquidiano (LCR).
Os polipéptidos descritos no presente documento podem ser incorporados numa composição farmacêutica útil para o tratamento de, por exemplo, inibir, atenuar, prevenir ou melhorar uma sinucleinopatia. A composição farmacêutica pode ser administrada a um indivíduo que sofre de um distúrbio de sinucleinopatia ou alguém que está em risco de desenvolver a referida deficiência. As composições devem conter uma quantidade terapêutica ou profilática do polipéptido, num veiculo farmaceuticamente aceitável. 0 veiculo farmacêutico pode ser qualquer substância compatível, não tóxica, adequada para entregar os polipéptidos ao paciente. Podem ser utilizados como veiculo água estéril, álcool, gorduras e ceras. Também podem ser incorporados nas composições farmacêuticas adjuvantes aceitáveis farmaceuticamente, agentes tampão, agentes dispersantes e outros semelhantes. 0 veículo pode ser combinado com o polipéptido em qualquer forma adequada para administração por injeção ou infusão intraventricular (forma que também pode ser adequada para administração intravenosa ou intratecal) ou de outra forma.
Os veículos adequados incluem, por exemplo, solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor EL® (BASF, Parsippany, N.J.) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS), outras soluções salinas, soluções de dextrose, soluções de glicerol, emulsões de água e óleos tais como as feitas com óleos de petróleo, animal, vegetal ou de origem sintética (óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral ou óleo de sésamo) . Em algumas formas de realização é utilizado como veículo um CSF artificial. Em geral, o veiculo será estéril e livre de pirogénios. A concentração do polipéptido na composição farmacêutica pode variar amplamente, isto é, de pelo menos, cerca de 0,01% por peso a 0,1% por peso, até cerca de 1% por peso, até tanto quanto 20% por peso ou mais da composição total.
Para administração intraventricular dos polipéptidos descritos no presente documento, ou doutros agentes, a composição deve ser estéril e deve ser um fluido. Deve ser estável sob as condições de fabrico e armazenamento e deve ser preservada contra a ação de contaminação de microorganismos tais como bactérias e fungos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser atingida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosale semelhantes. Em muitos casos, será útil incluir na composição agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol e cloreto de sódio. A taxa de administração é tal que a administração de uma única dose pode ser administrada como uma pílula grande. Uma única dose pode também ser administrada por infusão durante cerca de 1-5 minutos, cerca de 5-10 minutos, cerca de 10-30 minutos, cerca de 30-60 minutos, cerca de 1-4 horas ou consome mais do que quatro, cinco, seis, sete ou oito horas. Pode demorar mais de 1 minuto, mais do que 2 minutos, mais do que 5 minutos, mais do que 10 minutos, mais do que 20 minutos, mais do que 30 minutos, mais do que 1 hora, mais do que 2 horas ou mais do que 3 horas . Enquanto as administrações de pílula grande intraventricular são eficazes, infusões lentas são particularmente eficazes. Sem estar ligado por qualquer teoria particular de funcionamento, acredita-se que a infusão lenta é eficaz devido à renovação da CSF.
Embora as estimativas e cálculos na literatura variem, acredita-se que a renovação da CSF dentro de cerca de 4, 5, 6, 7 ou 8 horas em seres humanos. Numa forma de realização, o tempo de infusão lento deve ser medido de forma que é aproximadamente igual ou maior do que o tempo de renovação da CSF. 0 tempo de renovação pode depender da espécie, tamanho e idade do indivíduo, mas pode ser determinado utilizando métodos conhecidos na técnica. A infusão pode também ser contínua ao longo de um período de um ou mais dias. 0 paciente pode ser tratado uma vez, duas vezes ou três ou mais vezes por mês, por exemplo, semanalmente, por exemplo, a cada duas semanas. As infusões podem ser repetidas ao longo da vida dum indivíduo, como ditado por reacumulação de substrato da doença no cérebro ou em órgãos viscerais. A reacumulação pode ser determinada por qualquer das técnicas que são bem conhecidas na especialidade para a identificação e a quantização do substrato relevante, as técnicas podem ser realizadas numa ou mais amostras colhidas do cérebro e/ou dum ou mais dos órgãos viscerais. Tais técnicas incluem ensaios enzimáticos e/ou imunoensaios, por exemplo radioimunoensaios ou ELISAs. A infusão intraventricular lenta proporciona quantidades diminuídas do substrato para um polipéptido administrado (por exemplo, uma enzima) pelo menos no cérebro e, potencialmente, em órgãos viscerais. A redução num substrato, tal como a proteína aS acumulada no cérebro, pulmões, baço, rins e/ou fígado pode ser dramática. Podem ser alcançadas reduções maiores que 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%. A redução obtida não é necessariamente uniforme de paciente para paciente ou até mesmo de órgão para órgão dentro de um único paciente. As reduções podem ser determinadas por qualquer das técnicas que são bem conhecidas na especialidade, por exemplo, por ensaios enzimáticos e/ou técnicas de imunoensaio, tal como discutido noutro local no presente documento.
Num aspeto ilustrativo, a administração é realizada por infusão do polipéptido num ou em ambos os ventrículos laterais de um indivíduo ou paciente. Por infusão para os ventrículos laterais, o polipéptido é entregue no local no cérebro em que a maior quantidade de CSF é produzida. O polipéptido também pode ser infundido em mais de um ventrículo do cérebro. O tratamento pode consistir numa única infusão por local alvo ou pode ser repetida. Múltiplos locais de infusão/injeção podem ser utilizados. Por exemplo, os ventrículos em que o polipéptido é administrado podem incluir os ventrículos laterais e o quarto ventrículo. Em alguns aspetos, em adição ao primeiro local de administração, uma composição que contém o polipéptido é administrado noutro local que pode ser contralateral ou ipsilateral ao local da primeira administração. As injeções/infusões podem ser únicas ou múltiplas, unilaterais ou bilaterais.
Para entregar a solução ou outra composição que contém o polipéptido especificamente numa região particular do sistema nervoso central, tal como num ventrículo particular, por exemplo, nos ventrículos laterais ou no quarto ventrículo do cérebro, pode ser administrado por microinjeção estereotáxica. Por exemplo, no dia da cirurgia, os pacientes têm uma base de estrutura estereotáxica fixa no lugar (aparafusada no crânio) . 0 cérebro com base de estrutura estereotáxica (IRM compatível com marcações fiduciários) é fotografado utilizando IRM de alta resolução. As imagens de IRM são então transferidas para um computador que executa o software estereotáxico. Uma série de imagens coronal, sagital e axial utilizadas para determinar o local alvo da injeção de vetor e trajetória. 0 software traduz diretamente a trajetória em coordenadas 3-dimensionais adequadas para a estrutura estereotáxica. Buracos de trepanação são perfurados acima do local de entrada e do aparelho estereotáxico localizado com a agulha implantada na profundidade dada. A solução de polipéptido num veículo farmaceuticamente aceitávelé então injetada. Rotas adicionais da administração podem ser utilizadas, por exemplo, aplicação superficial cortical sob visão direta ou outra aplicação não estereotáxico.
Uma maneira de entregar uma infusão lenta é utilizar de uma bomba. Tais bombas estão disponíveis comercialmente, por exemplo, de Alzet (Cupertino, CA) ou Medtronic (Minneapolis, MN). A bomba pode ser implantável. Outra maneira conveniente de administrar as enzimas é utilizar uma cânula ou um cateter. A cânula ou cateter pode ser utilizado para múltiplas administrações separadas no tempo. Cânulas e cateteres podem ser implantados estereotaxicamente. É contemplado que as administrações múltiplas serão utilizadas para tratar o paciente típico com um distúrbio de sinucleinopatia. Cateteres e bombas podem ser utilizados separadamente ou em combinação. Administração de Moléculas de Ácido Nucleico e Terapêutica Genética
As moléculas de ácido nucleico descritas no presente documento, tais como moléculas de ácido nucleico que codificam GBA ou polipéptidos de catepsina D, podem ser entregues utilizando um número de métodos diferentes. Por exemplo, a transferência de genes pode ser mediada por um vetor de ADN virai, tal como um adenovirus (Ad) ou um vírus adeno-associado (AAV). Uma construção de vetor refere-se a uma molécula de polinucleótido que inclui o genoma vírico ou parte do mesmo e um transgene. Os adenovirus (Ads) são um grupo relativamente bem caracterizado, homogéneo de vírus, que incluiem mais de 50 serotipos. Ver, por exemplo, Pedido de PCT Internacional N.° WO 95/27071 Internacional. Os anúncios são fáceis de crescer e não requerem integração no genoma da célula hospedeira. Também foram construídos os vetores derivados de Ad recombinantes, particularmente os que reduzem o potencial para recombinação e geração de vírus do tipo selvagem. Ver, Pedido de PCT Internacional N.°s WO 95/00655 e WO 95/11984. O AAV do tipo selvagem tem uma elevada infeciosidade e especificidade de integrar no genoma da célula hospedeira. Ver, Hermonat e Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sei, EUA, 81: 6.466-6.470 e Lebkowski et al. (1988) Mol. Célula. Biol., 8:3988-3996.
Os vetores virais neurotróficos adequados para entregar as moléculas de ácido nucleico descritos no presente documento incluem, mas não estão limitados a, vetores virais adeno-associados (AAV) , vetores virais de herpes simplex (Patente US N.° 5.672.344) e vetores lentivirais.
Nos novos métodos, o AAV de qualquer serotipo ou pseudotipo pode ser utilizado. 0 serotipo do vetor virai utilizado em certas formas de realização da invenção é seleccionado do grupo que consiste de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 e AAV8 (ver, por exemplo, Gao et al. (2002) PNAS, 99: 11854 11859; e Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003) . Outros serotipos além daqueles listados no presente documento podem ser utilizados. Além disso, os vetores de AAV pseudotipados também podem ser utilizados nos métodos descritos no presente documento. Os vetores AAV de pseudotipo são aqueles que contêm o genoma dum serotipo de AAV na cápside dum segundo serotipo de AAV; por exemplo, um vetor de AAV que contém a cápside AAV2 e o genoma AAV1 ou um vetor de AAV que contém a cápside AAV5 e o genoma AAV2 (Auricchio et al., (2001) Hum. Mol. Genet., 10 (26) :3075-81) .
Os vetores de AAV são derivados de parvovirus de ADN de cadeia simples (ss) que são não patogénicas para mamíferos (revisto em Muzyscka (1992) Curr. Top. Microb. Immunol., 158:97-129). Em suma, os vetores baseados em AAV têm genes virais rep e cap que respondem por 96% do genoma virai removido, deixando os dois pares de bases (pb) 145 flanqueando repetições terminais invertidas (ITRs), que são utilizados para iniciar a replicação, embalagem e integração do ADN virai. Na ausência de vírus auxiliar, o AAV de tipo selvagem integra no genoma da célula hospedeira humana com especificidade de local preferencial no cromossomo 19ql3.3 ou pode ser mantido epissomicamente. Uma única partícula de AAV pode acomodar até 5 kb de ssADN, deixando assim, cerca de 4,5 kg para um transgene e elementos reguladores, que é tipicamente suficiente. No entanto, sistemas trans-união como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos N. 0 6.544.785, podem quase duplicar desse limite.
Num aspeto ilustrativo, o AAV é AAV2. Os vírus adeno-associados de muitos serotipos, especialmente AAV2, têm sido extensivamente estudados e caracterizados como vetores de terapêutica genética. Os peritos na especialidade estão familiarizados com a preparação de vetores de terapêutica genética baseados em AAV funcionais. Numerosas referências a vários métodos de produção, purificação e preparação de AAV para administração a seres humanos podem ser encontrados no extenso corpo de literatura publicada (ver, por exemplo, Virai Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, edição Machida, Humana Press, 2003). Além disso, a terapêutica genética baseada em AAV dirigida a células do SNC tem sido descrita na Patente dos Estados Unidos N.°s 6.180.613 e 6.503.888. Exemplos adicionais de vetores de AAV são os vetores serotipo recombinantes AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/7 e AAV2/8 que codificam a proteína humana.
Em certos métodos descritos no presente documento, the vetor inclui um transgene ligado operativamente a um promotor. O transgene codifica uma molécula biologicamente ativa, tal como um polipéptido de GBA, cuja expressão no SNC resulta, pelo menos, na correção parcial duma sinucleinopatia. O nível de expressão de transgenes em células eucarióticas é largamente determinado pelo promotor transcricional dentro da cassete de expressão do transgene. Promotores que mostram atividade a longo prazo e que são específicos para tecidos e ainda para células são utilizados em algumas formas de realização. Os exemplos de promotores incluem, mas não estão limitados a, o promotor citomegalovírus (CMV) (Kaplitt et al. (1994) Nat. Genet., 8:148-154), CMV/promotor da globina β3 humana (Mandei et al. (1998) J. Neurosci., 18:4271-4284), o promotor GFAP (Xu et al. (2001) Gene Ther., 8:1323-1332), o promotor enolase neuronal específica de 1,8 kb (NSE) (Klein et al. (1998) Exp. Neurol., 150:183-194), o promotor beta actina de galinha (CBA) (Miyazaki (1989) Gene, 79:269-277), o promotor β-glucuronidase (GUSB) (Shipley et al. (1991) Genetics, 10:1009-1018) e promotores de ubiquitina, tais como os isolados de ubiquitina A humana, ubiquitina B humana e ubiquitina C humana, como descrito na Patente U.S. N.° 6.667.174. Para prolongar a expressão, outros elementos reguladores podem, adicionalmente, ser ligados operativamente ao transgene, tais como, por exemplo, o Elemento Regulador Publicado do Vírus da Hepatite da Marmota (Woodchuck Hepatitis Virus Post Regulatory Element) (WPRE) (Donello et al. (1998) J. Virol., 72:5085-5092) ou o local de poliadenilação da hormona de crescimento bovina (BGH).
Para algumas aplicações de terapêutica genética no SNC, pode ser necessário controlar a atividade transcricional. Para este fim, a regulação farmacológica da expressão do gene com vetores virais pode ser obtida por inclusão de vários elementos reguladores e promotores sensíveis a fármacos, conforme descrito, por exemplo, em Haberma et al. (1998) Gene Ther., 5:1604-16011 e Ye et al. (1995) Science, 283:88-91.
Preparações de AAV de titulo alto podem ser produzidas utilizando técnicas conhecidas na especialidade, por exemplo, como descrito na Patente dos Estados Unidos N.° 5.658.776 e Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, editores Machida, Humana Press, 2003.
Dosagens
Para o tratamento da doença, a dosagem apropriada dum polipéptido, por exemplo, um GBA ou polipéptido de catepsina ou outro agente descrito no presente documento, dependerá do tipo de doença a ser tratado, da gravidade e curso da doença, se o polipéptido ou agente é administrado para fins profiláticos ou terapêuticos, da terapêutica anterior, da história clínica do paciente e da resposta à enzima ou agente e do critério do médico assistente.
Num regime de terapêutica de combinação, as composições descritas no presente documento são administradas numa quantidade terapeuticamente eficaz ou sinérgica. Uma quantidade terapeuticamente sinérgica é aquela quantidade de um ou mais polipéptidos ou outros agentes em combinação com um ou mais de outros polipéptidos ou agentes, necessária para reduzir ou eliminar significativamente as condições ou sintomas associados com uma doença particular de uma maneira que é mais do que aditiva, quando os dois polipéptidos/agentes são administrados isoladamente.
Enquanto as dosagens podem variar dependendo da doença e do paciente, o polipéptido é geralmente administrado ao paciente em quantidades de cerca de 0,1 até cerca de 1000 miligramas por 50 kg do paciente, em cada administração e pode ser repetida semanalmente, mensalmente ou em outros intervalos de tempo como necessário. Numa forma de realização, o polipéptido é administrado ao paciente em quantidades de cerca de 1 até cerca de 500 miligramas por 50kg de paciente, por mês. Noutras formas de realização, o polipéptido é administrado ao paciente em quantidades de cerca de 5 até cerca de 300 miligramas por kg de paciente 50 por mês, ou cerca de 10 até cerca de 200 miligramas por 50kg de paciente por mês.
Dependendo do tipo e gravidade da doença, o polipéptido ou agente pode ser administrado de modo a que a concentração local prevista é cerca de 106 pg/ml até cerca de 100 pg/ml, 1 ng/ml até cerca de 95 pg/ml, 10 ng/ml até cerca de 85 pg/ml, 100 ng/ml até cerca de 75 pg/ml, de cerca de 100 ng/ml até cerca de 50 pg/ml, de cerca de 1 pg/ml até cerca de 25 pg/ml, de cerca de 1 pg/ml até cerca de 15 pg/ml, de cerca de 1 pg/ml até cerca de 10 pg/ml ou de cerca de 1 pg/ml até cerca de 4 pg/ml.
Quando o polipéptido ou o agente é entregue porde terapêutica genética através de viriões virais, a dose pode ser de cerca de 2xl06 até cerca de 2xl012 drp, de cerca de 2xl07 até cerca de 2x1o11 drp ou de cerca de 2xl08 até cerca de 2xl010 drp (partículas resistentes DNase) por dose unitária. Em certos aspetos, a concentração ou o titulo do vetor na composição é de pelo menos: (a) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou 50 (X1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou 50 (X109 tu/ml) ou (c) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou 50 (X1010 iu/ml) .
Os termos "partículas de genoma (gp)" ou "equivalentes de genoma", como utilizados em referência a um titulo virai, referem-se ao número de viriões que o genoma de ADN de AAV recombinante contém, independentemente da infeciosidade ou funcionalidade. 0 número de partículas de genoma numa preparação de vetor particular pode ser medido por procedimentos, tais como descrito nos Exemplos no presente documento ou, por exemplo, em Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.
Os termos "unidade de infecção (iu)," "partícula infeciosa," ou "unidade de replicação", como utilizado em referência a um título virai, referem-se ao número de partículas de vetor de AAV recombinante competentes para replicação e infeciosas como medidas pelo ensaio do centro infecioso, também conhecido como ensaio de centro de replicação, tal como descrito, por exemplo, em McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973. O termo "unidade de transdução (tu)" como utilizado em referência a um título virai, refere-se ao número de partículas de vetor de AAV recombinantes infeciosas que resultam na produção de um produto transgene funcional como medido em ensaios funcionais, tais como descritos nos Exemplos no presente documento ou, por exemplo, em Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124 ou em Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (ensaio LFU).
Quando o polipéptido ou o agente é administrado por terapêutica química ou de proteína, a dose pode ser de cerca de 0,1 mg até cerca de 50 mg, de cerca de 0,1 mg até cerca de 25 mg, de cerca de 0,1 mg até cerca de 10 mg, de cerca de 0,5 mg até cerca de 5 mg ou desde cerca de 0,5 mg até cerca de 2,5 mg por dose unitária.
Os polipéptidos e agentes descritos no presente documento podem ser administrados como uma dose única ou repetidamente. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. 0 progresso da terapêutica da invenção é monitorado por técnicas e ensaios convencionais.
Composições Farmacêuticas
Uma "composição farmacêutica" ou "medicamento" destina-se a abranger uma combinação de um componente ativo ou agente, por exemplo, um polipéptido de enzima e opcionalmente, um veiculo ou outro material, por exemplo, um composto ou composição, que é inerte (por exemplo, um agente ou rótulo detetável) ou ativo, tal como um adjuvante, diluente, ligante, estabilizador, tampão, sal, solvente lipofílico, conservante, adjuvante ou semelhante ou uma mistura de duas ou mais destas substâncias.
Os veículos são preferencialmente aceitáveis farmaceuticamente. Podem incluir excipientes e aditivos farmacêuticos, proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos e hidratos de carbono (por exemplo, açúcares, incluindo monossacáridos, di-, tri-, tetra- e oligossacidos; açúcares derivados, tais como alditóis, ácidos aldónicos, açúcares esterifiçados e semelhantes e polissacáridos ou polímeros de açúcar) que podem estar presentes isoladamente ou em combinação, incluídos sozinhos ou em combinação 1-99,99% por peso ou volume. Excipientes proteicos exemplificativos incluem albumina de soro tal como albumina de soro humana (HSA) , albumina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína e semelhantes. Componentes de aminoácido/anticorpo representativas, que podem também funcionar com uma capacidade tamponante, incluem alanina, glicina, arginina, betaina, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartamo e semelhantes. Excipientes de hidratos de carbono também são destinados dentro do âmbito da presente invenção, exemplos dos quais incluem, mas não estão limitados a, monossacarídeos tais como frutose, maltose, galactose, glicose, D-manose, sorbose e semelhantes; dissacarídeos tais como lactose, sacarose, trealose, celobiose e semelhantes; polissacarídeos, tais como rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranos, amidos e semelhantes e alditois, tais como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol) e mioinositol. 0 termo veículo também inclui um tampão ou um agente de ajuste de pH ou uma composição que contém os mesmos; tipicamente, o tampão é um sal preparado de um ácido ou de uma base orgânicos. Os tampões representativos incluem sais de ácidos orgânicos, tais como sais de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético ou ácido ftálico, Tris, cloridrato de trometamina ou tampões de fosfato. Os veículos adicionais incluem excipientes/aditivos poliméricos tais como polivinilpirrolidonas, ficois (um açúcar polimérico), dextratos (por exemplo, ciclodextrinas, tais como 2-hidroxipropil -. quadratura .-ciclodextrina), polietilenoglicóis, agentes aromatizantes, agentes antimicrobianos, edulcorantes, antioxidantes, agentes anti-estáticos, tensioativos (por exemplo, polissorbatos, tais como "TWEEN 20" ® e "TWEEN 80" ®), lípidos (por exemplo, fosfolípidos, ácidos gordos), esteróides (por exemplo, colesterol) e agentes quelantes (por exemplo, EDTA).
Tal como utilizado no presente documento, o termo "veículo aceitável farraaceuticamente" abrange qualquer dos veículos farmacêuticos padrão, tais como solução salina, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores de absorção e semelhantes, uma solução salina tamponada com fosfato, água e emulsões, tais como uma emulsão óleo/água ou água/óleo e vários tipos de agentes humectantes, compatíveis com administração farmacêutica. Os compostos ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições. As composições e medicamentos fabricados e/ou utilizados de acordo com a presente divulgação e que incluem os polipéptidos particulares, moléculas de ácido nucleico ou outros agentes podem incluir estabilizantes e conservantes e qualquer dos veículos descritos no presente documento, com a condição adicional de que sejam aceitáveis para utilização in vivo. Para exemplos de veículos, estabilizadores e adjuvants adicionais, ver Martin REMINGTON' S PHARM. SCI., 15a Edição (Mack Publ. Co . , Easton (1975) e Williams e Williams, (1995) e na "PHYSICIAN'S DESK REFERENCE," 52a edição, Medical Economics, Montvale, N.J. (1998) .
Os métodos descritos no presente documento incluem o fabrico e a utilização de composições farmacêuticas, que podem incluir compostos identificados pelos métodos de rastreio descritos no presente documento como ingredientes ativos. Também estão incluídas as próprias composições farmacêuticas. Por exemplo, as composições descritas no presente documento podem incluir agentes that aumentam o nível ou atividade de um ou de ambos GBA ou de PS/SC.
As composições farmacêuticas são formuladas tipicamente para serem compatíveis com a sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem administração parentérica, por exemplo, intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral (por exemplo, inalação), transdérmica (tópica), transmucosa e retal.
Os métodos de formulação de composições farmacêuticas adequados são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, os livros nas séries Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, Nova Iorque). Por exemplo, soluções ou suspensões utilizadas para aplicação parentérica, intradérmica ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril tal como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicois, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil-parabeno; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetracético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajustamento da tonicidade tais como cloreto de sódio ou dextrose. 0 pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parentérica pode ser fechada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos para injetáveis de doses múltiplas feitos de vidro ou plástico.
As composições farmacêuticas adequadas para injeção podem incluir soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para administração intravenosa, os veículos adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor EL ™ (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida até ao ponto que exista fácil seringabilidade. Deve ser estável sob as condições de fabrico e armazenamento e deve ser preservada contra a ação de contaminação de microorganismos tais como bactérias e fungos. 0 veículo pode ser um solvente ou um meio de dispersão que contenha, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização dum revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho da partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de tensioativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácidoascórbico, timerosalesemelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir na composição agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que atrasa a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação do composto ativo na quantidade requerida num solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes acima enumerados, como requerido, seguido de esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo num veículo estéril, que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles acima enumerados. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem sob vácuo e liofilização, os quais produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma sua solução previamente filtrada-esterilizada dos mesmos.
As composições orais incluem geralmente um diluente inerte ou um veículo comestível. Para a finalidade de administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e utilizado na forma de comprimidos, pequeno comprimido circular ou cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina. As composições orais podem também ser preparadas utilizando um veiculo fluido para usar como um elixir bucal. Os agentes de ligação compatíveis farmaceuticamente, e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, pequeno comprimido circular e semelhantes podem conter qualquer dos seguintes ingredientes, ou compostos de uma natureza semelhante: um ligante tal como celulose microcristalina, goma de tragacanto ou gelatina; um excipiente tal como amido ou lactose, um agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel® ou amido de milho; um lubrificante tal como estearato de magnésio ou Sterotes®; um deslizante tal como dióxido de silício coloidal; um agente edulcorante tal como sacarose ou sacarina ou um agente aromatizante tal como hortelã-pimenta, salicilato de metilo ou aroma de laranja.
Para administração por inalação, os compostos podem ser entregues na forma de um pulverizador de aerossol dum recipiente pressurizado ou dispensador que contém um propulsor adequado, por exemplo, um gás tal como dióxido de carbono, ou um nebulizador. Tais métodos incluem aqueles descritos na Patente U.S. N.° 6.468.798. A administração sistémica de um composto terapêutico, tal como descrito no presente documento, também pode ser por via transmucosal ou transdérmica. Para administração transmucosal ou transdérmica, são utilizados na formulação os penetrantes apropriados para permear a barreira. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, para administração transmucosal, detergentes, sais biliares e derivados de ácido fusidico. A administração transmucosal pode ser realizada através da utilização de pulverizadores nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, os compostos ativos são formulados em unguentos, pomadas, géis ou cremes como geralmente conhecido na técnica.
As composições farmacêuticas também podem ser preparadas na forma de supositórios (por exemplo, com bases de supositório convencional tais como manteiga de cacau e outros glicéridos) ou enemas de retenção para entrega retal.
Os compostos terapêuticos que são ou incluem ácido nucleico podem ser administrados por qualquer método adequado para a administração de agentes de ácido nucleico, tal como uma vacina de ADN. Estes métodos incluem pistolas de genes, in jetores de bio e pensos para a pele bem como métodos sem agulha tal como a vacina de ADN de micro-particula, tecnologia divulgada na Patente U.S. N.° 6.194.389 e a vacinação sem agulha transdérmica de mamífero com vacina em forma de pó como divulgado na Patente U.S. N.° 6.168.587. Adicionalmente, a entrega intranasal é possível, como descrito em, entre outros, Hamajima et al., (1998) Clin. Immunol. Immunopathol., 88(2), 205-10. Também podem ser utilizados os lipossomas (por exemplo, tal como descrito na Patente U.S. N.° 6.472.375) e a microencapsulação. Também podem ser utilizados os sistemas de entrega de micropartícuias dirigíveis biodegradáveis (por exemplo, tal como descrito na Patente U.S. N.° 6.471.996) .
Num aspeto, os compostos terapêuticos são preparados com veículos que irão proteger os compostos terapêuticos contra a eliminação rápida do organismo, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de entrega microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biocompatíveis, biodegradáveis, tais como, acetato de vinilo de etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Tais formulações podem ser preparadas utilizando técnicas padrão. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente de Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. Também podem ser utilizadas como veículos aceitáveis farmaceuticamente as suspensões de lipossomas (incluindo lipossomas direcionados a células infetadas com anticorpos monoclonais para antigénios virais). Estas podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos dos peritos na especialidade, por exemplo, como descrito na Patente U.S. N.0 4.522.811 .
As composições farmacêuticas podem ser incluída num recipiente, num pacote ou num dispensador juntamente com instruções para administração.
Kits
Os kits de acordo com a presente divulgação são conjuntos de componentes separadas. Embora possam ser embalados num recipiente único, podem ser subembalados separadamente. Mesmo um único recipiente pode ser dividido em compartimentos. Tipicamente, um conjunto de instruções vai acompanhar o kit e proporcionar instruções para a entrega das enzimas, por exemplo, os polipéptidos de GBA, intraventricularmente. As instruções podem ser impressas, em formato electrónico, como um vídeo de instruções ou DVD, num CD, numa disquete, na internet com um endereço proporcionado na embalagem ou uma combinação destes meios. Outros componentes, tais como diluentes, tampões, solventes, fita, parafusos e ferramentas de manutenção podem ser proporcionadas para além da enzima, uma ou mais cânulas ou cateteres, e/ou uma bomba. Métodos de Rastreio
Também incluído no presente documento estão métodos de rastreio para compostos teste, por exemplo, polipéptidos, polinucleótidos, compostos teste de molécula grande ou pequena inorgânico ou orgânico, para identificar agentes úteis no tratamento de distúrbios de sinucleinopatia que não estão associados com uma doença de depósito lisossomal, por exemplo, uma sinucleinopatia primário. Em particular, os novos ensaios de rastreio são concebidos para localizar novos compostos que servem como agentes de ativação para GBA quer as formas de tipo selvagem ou formas mutantes de GBA.
Como utilizado no presente documento, "moléculas pequenas" refere-se a moléculas orgânicas ou inorgânicas pequenas de massa molecular inferior a cerca de 3000 Daltons. Em geral, pequenas moléculas úteis para a invenção têm uma massa molecular de menos de 3000 Daltons (Da) . As pequenas moléculas podem ser, por exemplo de pelo menos cerca de 100 Da até cerca de 3000 Da (por exemplo, entre cerca de 100 até cerca de 3000 Da, de cerca de 100 até cerca de 2500 Da, de cerca de 100 até cerca de 2000 Da, de cerca de 100 até cerca de 1750 Da, de cerca de 100 até cerca de 1500 Da, de cerca de 100 até cerca de 1250 Da, de cerca de 100 até cerca de 1000 Da, de cerca de 100 até cerca de 750 Da, de cerca de 100 até cerca de 500 Da, de cerca de 200 até cerca de 1500, de cerca de 500 até cerca de 1000, de cerca de 300 até cerca de 1000 Da ou de cerca de 100 até cerca de 250 Da).
Os compostos teste podem ser, por exemplo, produtos naturais ou os membros de uma biblioteca de química combinatória. Um conjunto de moléculas diversas deve ser utilizado para cobrir uma variedade de funções, tais como carga, aromaticidade, ligação a hidrogénio, flexibilidade, tamanho, comprimento da cadeia lateral, hidrofobia e rigidez. Técnicas combinatórias adequadas para a síntese de moléculas pequenas são conhecidos na técnica, por exemplo, como exemplificado por Obrecht e Villalgordo, Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries, Pergamon-Elsevier Science Limited (1998) e incluem aqueles tais como as técnicas de síntese "split e pool" ou "paralelo", técnicas de fase sólida e de fase de solução e técnicas de codificação (ver, por exemplo, Czarnik, (1997) Curr. Opin. Chem. Bio., 1:60 -6) . Além disso, um número de bibliotecas de moléculas pequenas estão disponíveis comercialmente. Um número de compostos teste de pequenas moléculas adequados está listado na Patente U.S. N.° 6.503.713, incorporada no presente documento por referência na sua totalidade
As bibliotecas rastreadas que utilizam os métodos da presente divulgação podem englobar uma variedade de tipos de compostos teste. Uma dada biblioteca pode englobar um conjunto de compostos teste estruturalmente relacionados ou não relacionados. Em algumas formas de realização, os compostos teste são moléculas de péptido ou eptidomimético. Em algumas formas de realização, os compostos teste são ácido nucleico.
Em alguns aspetos, os compostos teste e as bibliotecas dos mesmos podem ser obtidos alterando sistematicamente a estrutura de um primeiro composto teste, por exemplo, um primeiro composto teste que é estruturalmente semelhante a um parceiro de ligação natural conhecido do polipéptido alvo ou uma primeira molécula pequena identificada como capaz de se ligar ao polipéptido alvo, por exemplo, utilizando métodos conhecidos na técnica ou os métodos descritos no presente documento e correlacionando essa estrutura para uma atividade biológica resultante, por exemplo, um estudo de relação estrutura-atividade. Como um perito na especialidade irá apreciar, há uma variedade de métodos padrão para a criação de uma tal relação estrutura-atividade. Assim, em algumas ocasiões, o trabalho pode ser largamente empírico e noutras, a estrutura tridimensional de um polipéptido endógeno ou uma porção da mesma pode ser utilizada como um ponto de partida para o desenho racional de um composto ou compostos duma molécula pequena. Por exemplo, numa forma de realização, uma biblioteca geral de moléculas pequenas é ratreada, por exemplo, utilizando os métodos descritos no presente documento.
Em alguns aspectos, um composto teste é aplicado a uma amostra teste, por exemplo, uma célula ou um tecido vivo ou um órgão e um ou mais efeitos do composto teste é avaliado. Numa célula cultivada ou primária, por exemplo, a capacidade do composto teste para aumentar os níveis e/ou atividade de GBA ou PS SC pode ser determinada. Os modelos baseados em células MES descritos no presente documento podem ser utilizados para tais ensaios de rastreio. Por exemplo, utilizando placas de cultura de células MES (96- ou 384 poços com base), são aplicadas bibliotecas químicas baseadas em molécula pequena numa concentração teste de 1 μΜ durante um período de 36 a 48 horas. As células são lisadas e analisadas por ELISA sanduíche, por exemplo, como delinedo nas Figuras 3a a 3d no presente documento para determinar o efeito líquido destes compostos, na concentração da proteína alfa-sinucleína em cada poço.
Em alguns aspetos, a amostra teste é ou é derivada de (por exemplo, uma amostra colhida de) um modelo in vivo de um distúrbio de sinucleinopatia como descrito no presente documento. Por exemplo, um modelo animal, por exemplo, um modelo de roedor tal como um modelo de ratinho ou ratazana, pode ser utilizado. Especificamente, o modelo de sinucleinopatia de ratinho de Masliah é adequado (comercialmente disponível de JSW Research in Graz, Austria) (ver, Masliah et ai., Science, 18 de fevereiro de 2000; 287(5456):1265-9.
Os métodos para avaliação de cada um destes efeitos são conhecidos na técnica. Por exemplo, a capacidade para modular a expressão de uma proteína pode ser avaliada no gene ou no nível da proteína, por exemplo, utilizando métodos quantitativos de PCR ou imunoensaios. Em algumas formas de realização, métodos de alto rendimento, por exemplo, chips de proteínas ou genes como são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Capítulo 12,
Genomics, em Griff iths et al., Editores Modem genetic Analysis, 1999,W. H. Freeman and Company; Ekins e Chu, 1999 Trends in Biotechnology, 17:217-218; MacBeath e Schreiber, 2000 Science, 289 (5485) : 1760-1763; Simpson, Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2002; Hardiman, Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts, DNA Press, 2003), podem ser utilizados para detetar um efeito em dois, três, quatro, cinco ou mais dos polipéptidos descritos no presente documento.
Um composto teste que foi rastreado por um método descrito no presente documento e determinado para aumentar os níveis e/ou a atividade de GBA ou de PS/SC ou para diminuir os níveis de agregados de aS, pode ser considerado um composto candidato. Um composto candidato que foi rastreado subsequentemente, por exemplo, num modelo in vivo dum distúrbio, por exemplo, um modelo animal dum distúrbio de sinucleinopatia e foi determinado ter um efeito desejável no distúrbio, por exemplo, num ou mais sintomas do distúrbio, pode ser considerado um agente terapêutico candidato. Os agentes terapêuticos candidatos uma vez rastreados num ambiente clinico são agentes terapêuticos. Os compostos candidatos, os agentes terapêuticos candidatos e os agentes terapêuticos podem ser otimizados opcionalmente e/ou derivados e formulados com excipientes aceitáveis fisiologicamente para formar composições farmacêuticas.
Assim, os compostos teste identificados como "eventos" (por exemplo, compostos teste que aumentam os níveis e/ou a atividade de GBA ou de PS/SC) podem ser selecionados e sistematicamente alterado num primeiro rastreio, por exemplo, utilizando o desenho racional para otimizar a afinidade de ligação, avidez, especificidade ou outro parâmetro. Esta otimização também pode ser rastreada utilizando os métodos descritos no presente documento. Assim, num aspeto, a divulgação inclui o rastreio de uma primeira biblioteca de compostos utilizando um método conhecido na técnica e/ou descritos no presente documento, para identificar um ou mais eventos nessa biblioteca, sujeitando esses eventos a alteração estrutural sistemática para criar uma segunda biblioteca de compostos estruturalmente relacionados com o hit e rastreando a segunda biblioteca utilizando os métodos descritos no presente documento.
Os compostos teste identificados como eventos podem ser considerados compostos terapêuticos candidatos, úteis no tratamento de distúrbios de sinucleinopatia, como descrito no presente documento. Uma variedade de técnicas úteis para a determinação das estruturas de "eventos" podem ser utilizadas nos métodos descritos no presente documento, por exemplo, RMN, espectrometria de massa, detetores de cromatografia gasosa equipado com captura de eletrões, espectroscopia de absorção e de fluorescência. Assim, a divulgação também inclui compostos identificados como "eventos" pelos métodos descritos no presente documento e métodos para a sua administração e utilização no tratamento, prevenção ou atraso do desenvolvimento ou progressão dum distúrbio descrito no presente documento.
Os compostos teste identificados como compostos terapêuticos candidatos podem ser adicionalmente rastreados por administração num modelo animal dum distúrbio de sinucleinopatia como descrito no presente documento. 0 animal pode ser monitorizado para uma mudança no distúrbio, por exemplo, por uma melhoria num parâmetro do distúrbio, por exemplo, um parâmetro relacionado com o resultado clinico. EXEMPLOS
Os exemplos seguintes são proporcionados, os quais não limitam o âmbito da invenção descrita nas reivindicações. Exemplo 1: Glicoesfingolipideos Associado Bioquimicamente com α-Sinucleína in Vitro. A experiência realizada neste exemplo demonstra a existência de complexos estáveis entre a proteína a-sinucleína e os gangliosídeos de cérebro humano, que em última análise se tornam substratos da enzima de GBA.
Os gangliosídeos são glicosfingolípidos complexos, que contêm uma unidade de glicocerebrosideo como parte da sua estrutura química (ver, por exemplo, Dreisewerd et al. , (2005) Anal Chem., 77, 4098-107). Como consequência, as unidades de glicocerebrosideo constituem tanto um bloco de construção e um produto de degradação no ciclo de degradação por síntese contínua de gangliosídeos. A co-incubação de um grupo de gangliósideos derivados do cérebro bem caracterizados (ver, Schlossmacher et al., (2005) N.E.J.M., 352, 728-731 e
Dreisewerd et al. (2005)) com uma proteína a-sinucleína recombinante in vitro levou à formação de um complexo que era estável sob condições SDS/PAGE altamente desnaturantes, provocando um deslocamento electroforético do complexo α-sinucleína com 16 kDa para o complexo proteína a-sinucleína /glicocerebrosideo de massa molecular superior com 19-20 kDa, como indicado por Western blotting (FIGURA 1). A FIGURA 1 é uma representação dum Western Blot, que demonstra a formação dependente do tempo dum complexo 19 - 20 kDa estável (aS/G) entre gangliosídeos de cérebro humano e a proteína α-sinucleína in vitro. Os gangliosídeos derivados do cérebro humano (G) foram co-incubados com a proteína α-sinucleína humana recombinante (aS; de tipo selvagem) a 4 °C durante vários períodos de tempo até 72 horas, antes de serem submetidas a SDS/PAGE. Como um controlo negativo (C), a água foi incubada com proteína α-sinucleína humana recombinante durante 72 horas. A aparência dependente do tempo de uma banda superior que migra a 19 - 20 kDa foi observada nas amostras incubadas com gangliosídeos, mas não com água e foi interpretada como um complexo de gangliosídeo de proteína α-sinucleína estável (aS/G). A presença de uma proteína α-sinucleína não complexada é indicada por uma banda com a massa molecular de 16 kDa.
Estas e descobertas relacionadas demonstraram que a proteína α-sinucleína pode interagir com lípidos complexos contendo glicocerebrosídeo de uma forma que é altamente estável e relativamente resistente à presença de SDS.
Exemplo 2: Glicocerebrosídeo Associado Bioquimicamente com Proteína α-Sinucleína in Vitro
Derivado de tecido humano ou Glicocerebrosídeo sintético (também conhecida como glucosilceramida; GC) é co-incubado com proteína α-sinucleína humana recombinante (aS; de tipo selvagem) a 4 °C durante vários períodos de tempo até 72 horas, antes de serem submetidas a SDS/PAGE. Como um controlo negativo (C) , a água foi incubada com proteína α-sinucleína humana recombinante durante 72 horas. A aparência dependente do tempo de uma banda superior que migra a 19 - 22 kDa deve ser observada nas amostras incubadas com glicocerebrosídeo. A presença de uma proteína α-sinucleína não complexada é indicada por uma banda com a massa molecular de 16 kDa.
Estas e descobertas relacionadas demonstraram que a proteína α-sinucleína pode interagir com glicocerebrosídeo de uma forma que é altamente estável e relativamente resistente à presença de SDS.
Exemplo 3: Glicosfingosina Associado Bioquimicamente com
Proteína α-Sinucleína in Vitro
Derivado de tecido humano ou Glucosfingosina sintético (também conhecido como glicosilsfingosina; GC) é co-incubado com proteína α-sinucleína humana recombinante (aS; de tipo selvagem) a 4 °C durante vários períodos de tempo até 72 horas, antes de serem submetidas a SDS/PAGE. Como um controlo negativo (C) , a água foi incubada com proteína α-sinucleína humana recombinante durante 72 horas. A aparência dependente do tempo de uma banda superior que migra a 19 - 22 kDa deve ser observada nas amostras incubadas com glicosfingosina. A presença de uma proteína α-sinucleina não complexada é indicada por uma banda com a massa molecular de 16 kDa.
Estas e descobertas relacionadas demonstraram que a proteína α-sinucleína pode interagir com glicosfingosina de uma forma que é altamente estável e relativamente resistente à presença de SDS.
Exemplo 4: Estabelecimento de um Sistema de Cultura Celular Neural que Expressa Dopamina para Expressão da Proteina a-Sinucleína
Um sistema de cultura celular mesencefálica de roedor que expressa dopamina (células MES23.5) foi utilizado para o estabelecimento dum sistema de sobre-expressão da proteina α-sinucleina. Anteriormente, estas células tinham sido utilizadas por Sharon et ai. para criar linhas de células estáveis que sobre-expressam aS. No entanto, esses autores observaram que clones de células MES23.5 de aS transfetadas estáveis perdem qradualmente a expressão de aS após a passaqem de 2 ou ma is meses (Sharon R, et al. , (2001) PNAS 98, 9110-9115). Para evitar este problema, neste trabalho, as células MES23.5 foram transfetadas transitoriamente de cada vez utilizando Lipofectamine® 2000 (Invitrogen Corp.). Dado que as células MES23.5 são apenas fracamente aderentes a placas de plástico de cultura de tecidos, as células foram cultivadas em placas de plástico revestidas a poli-D-lisina, uma medida que não foi utilizada anteriormente na literatura. Além disso, Invitrogen Corp recomenda a transfeção com Lipofectamine 2000 quando as células são >80% confluentes, foi empiricamente encontrado aqui, neste estudo, que a eficiência de transfeção foi muito melhorada por transfeção, quando as células são 50 - 60% confluentes (como medido pela eficiência de transfeção duma Proteina Verde Fluorescente (GFP) - que codifica plasmideo em poços irmãos, visualizado 24 horas após a transfeção sob um microscópio fluorescente).
Tal como mostrado na FIGURA 2A, as células MES23.5 foram transfetadas transitorimente com um aS de comprimento completo que codifica plasmideo de ADNc SNCA - sob o controlo dum promotor CMV. As células foram transfetadas com 0, 0,25, 0,5, 1, 5 e 10 pg (por placa de 10 cm) de plasmideo. 24 horas mais tarde, as células foram lavadas com solução salina tamponada com Tris e Usadas em 140 mM de NaCl, 50 mM de Tris-Hcl, pH 8, 0, 1 mM de EDTA, 0,5% de Triton-XlOO e lx inibidores da protease. Os lisados foram centrifugados a 100.000 x g durante 30 minutos a 4 °C; os 2/3 da parte superior dos sobrenadantes foram removidos e congelados em tubos siliconizados a -80 0 C. As amostras foram executadas em SDS/PAGE, utilizando 1 mM DTT como o agente redutor. A expressão da proteína aS foi confirmada 24 horas após a transfeção por Western blotting, em que os lisados celulares foram sondados com um anticorpo monoclonal contra a proteína aS (sin-1 anticorpo, BD Transduction Labs). A expressão mostrou ser dependente da quantidade inicial do plasmídeo transfetado, até uma quantidade de saturação de 5-10 pg por placa de 10 cm.
Exemplo 5: Estudos Exploratórios Utilizando Células MES23.5 para a Expressão Concomitante de α-Sinucleína e Proteínas Lisossomais Selecionadas A experiência realizada neste exemplo (como mostrado na FIGURA 2B) mostra que níveis aumentados da proteína de GBA celular podem reduzir o nível da proteína α-sinucleína neural.
As células MES23.5 foram transfetadas com 0,5 pg de ADNc SNCA que codifica aS por placa de 10 cm mais 1,25, 2,5 ou 5 pg (baixo, médio ou alto) ADNc codificando para GBA na ausência ou na presença de 5 pg de ADNc codificando para Prosaposina. Todos os braços da experiência foram equilibrados até um total de 10,5 pg de ADNc por placa de 10 cm utilizando o ADNc de vetor vazio. Os plasmídeos de ADNc que codificam Prosaposina e GBA sob um promotor de CMV, assim como o CMV-XL5 de vetor vazio foram adquiridos a OriGene Technologies, Inc (os clones tinham sido totalmente verificados por sequência após isolamento e uma maxiprep) . 24 horas mais tarde, as células foram lisadas e sondadas para GBA e os níveis da proteína. O painel superior da FIGURA 2B3 é uma representação dum Western Blot que indica a expressão da proteína de GBA na ausência e na presença de prosaposina co-transfetada. O GBA foi sondado utilizando o anticorpo monoclonal 8E4 . A sobre-expressão de GBA ocorreu duma forma ligeiramente dependente da dosagem do gene na ausência de prosaposina. Na presença de sobre-expressão da prosaposina, o próprio sinal de GBA foi diminuído. Esta observação pode ser explicada por uma modificação de GBA durante a sua ativação que conduz à sua reconhecibilidade reduzida pelo anticorpo monoclonal empregue, sob estas condições de SDS/PAGE/ifestern blotting, por uma taxa de degradação intra-lisossomal mais rápida de GBA após a sua ativação por PS/SC ou pode ter ocorrido como resultado das taxas reduzidas globais de transcrição e translação de ADNc dada a entrega concomitante de três plasmídeos portadores de ADNc exógenos distintos. 0 painel inferior da FIGURA 2B mostra que o GBA, na ausência de prosaposina co-transfetada, reduziu os níveis da proteína α-sinucleína co-expressa na maior quantidade de ADNc de GBA co-transfetado. Este efeito redutor da proteína a-sinucleína observada por GBA foi grandemente potenciado pela co-expressão de prosaposina, como indicado pela diminuição forte nos níveis da proteína α-sinucleína mesmo nas concentrações mais baixas (baixa e média) de ADNc que codifica GBA transfetado. 0 gráfico de barras na FIGURA 2C ilustra um resumo semi quantitativo dos dados mostrados na FIGURA 2B.
Em resumo, foi concluído que o aumento da atividade de GBA sob estas condições de cultura de células ex vivo pode diminuir os níveis de estado estacionário de a-sinucleína, especialmente na presença de PS/SC elevados. Assim, esta estratégia pode ser utilizada para diminuir os níveis de estado estacionário de α-sinucleína in vivo, incluindo no cérebro humano que está em risco de - ou já afetado por - níveis perigosamente elevados de conteúdo de α-sinucleína, por exemplo, num indivíduo tendo um distúrbio de sinucleinopatia. Em conformidade, as estratégias para aumentar a atividade de GBA e/ou os níveis de PS/SC in vivo representam uma nova avenida para o tratamento neuroprotetor de Doença de Parkinson (DP) e sinucleinopatias relacionadas.
Exemplo 6: Estabelecimento de um Sistema ELISA Primeiro-do-Tipo Sensível e Preciso para Determinar
Quantitativamente Concentrações de a-Sinucleína em Células MES23.5 Transfetadas
Para experiências e investigações adicionais, foi desejado diminuir a confiança nos métodos Western blot, que são de baixo rendimento e têm um intervalo dinâmico limitado e, em vez disso criar um sistema ELISA sanduíche quantitativo (ensaio imunoadsorvente ligado a enzima) para a quantificação de rendimento médio de aS com sensibilidade, especificidade otimizado e intervalo dinâmico melhorados.
Soros de 6 coelhos foram criados e purificados por afinidade em Open Biosystems, Inc. (http://www.openbiosystems.com) contra aS humana de comprimento inteiro recombinante. A aS recombinante tinha sido caracterizada por MS e HPLC e submetido a análises da concentração de proteína e composição de aminoácidos. Para ELISA, placas MaxiSorp com 384-poços (Nunc, Inc.) foram revestidas com 50 μΐ/poço que capturam Ab policlonal (hSA-2) diluído em tampão de revestimento (NaHC03 com 0,2% NaN3, pH 9,6). Após lavagens comPBS/0,05% Tween-20 (PBS-T), as placas foram bloqueadas durante 2 horas a 37 °C em tampão de bloqueador (1,125% de gelatina de pele de peixe; PBS-T) . Após 4 lavagens, as amostras foram carregadas e incubadas a 4 °C durante 12 horas. Foi gerado mAb Sin-1 biotinilado (como o Ab de ensaio) utilizando 200 pg de Sulfo-NHS-LC Biotina (Pierce), diluído em tampão de bloqueador e adicionado à placa durante 2 horas a 37 °C. Após 4 lavagens, ExtrAvidina fosfatase (Sigma) diluída em tampão de bloqueador foi aplicada durante 1 hora a 37 °C. 0 desenvolvimento da cor foi realizado utilizando Fast-fosfato de p-nitrofenilo (Sigma) e monitorizada cineticamente em 0D 405 nm cada 5 minutos até aos 60 minutos. Várias concentrações de aS (r-haS) humana altamente purificada, recombinante, foram utilizadas como padrão para estabelecer a sensibilidade e o intervalo do ensaio do ELISA, conforme mostrado na FIGURA 3A (r2 > 0,98) .
Para otimizar uma razão de ' DNA : Lipofectamine® 2000' com baixa toxicidade celular, as células MES23.5 foram transfetadas com 0,25, 0,5 ou 1 pg de ADNc SNCA humano, de tipo selvagem que codifica para aS mais ADNc de vetor vazio até um total de 5,5 pg de ADN por placa de 10 cm. 24 horas após a transfeção, os lisados de células foram colhidas como descrito acima. Para diluições em série de lisados celulares tampão de bloqueadoro contendo 0,5% de lisado proveniente de poços transfetados do vetor foi utilizado como diluente, o qual também foi utilizado para criar o branco e a correspondente curva padrão de aS humana recombinante. A saturação cinética foi examinada para identificação do(s) ponto (s) de tempo em que os padrões e as diluições da amostra estavam em fase log.
Ao analisar estes lisados celulares por concentrações de ELISA em células MES-aS foi registado que o paralelismo esperado após diluição em série de dependente da dose de ADNc SCNA, foi mostrado, (ambos os aspetos são demonstradas no gráfico da FIGURA 3B) e isso permitiu pela primeira vez o cálculo preciso da quantidade total de concentração de proteína aS expressa em células vivas (como mostrado na FIGURA 3C).
Foi também confirmado que sob estas condições refinadas de expressão celular a viabilidade das células MES23.5 e MES-sin não foi alterada, como medido por LDH em meio condicionado (lactato desidrogenase, uma enzima citosólica normalmente), como um marcador de vazamento de célula e por conversão celular de MTT ((brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) a formazano, como um marcador do metabolismo celular intacto. Para estes ensaios de toxicidade padrão, um controlo positivo que conduz a 100% de lise de células (0,1% tratamento Triton-X®-l00), foi realizado em paralelo. Os resultados são mostrados na FIGURA 3D. Determinou-se que, para o intervalo de concentrações de ADNc escolhidas em todas as experiências, as células MES-aS e MES-vetor foram metabolicamente totalmente ativas no ensaio MTT e não mostraram qualquer libertação de LDH derivado de citosol para o meio condicionado de células transfetadas e não transfetadas. Assim, ambos os ensaios demonstraram integridade celular.
Exemplo 7: Doenças Relacionadas com Sinucleinopatia bem como as Mutações Dirigidas ao Local Catalitico em GBA Promovem a Acumulação de α-Sinucleina em Células MES Dopaminérgicas A expressão de células otimizada/sistema de leitura de ELISA descrito no Exemplo 6 foi utilizado para examinar os efeitos da sobre-expressão das proteínas GBA mutantes nos níveis de aS em células MES23.5.
As células MÊS foram transfetadas com 0,5 pg por 10 centímetros de placa de plasmídeo portador de ADNc SNCA que codifica aS mais 5 pg por 10 centímetros de placa de plasmídeo que codifica GBA humano de tipo selvagem ou mutante. As variantes de GBA utilizadas foram do tipo selvagem, N370S, D409H, L444P, E235A e E340A. Estes 5 GBA mutantes foram criados por mutagénese dirigida ao local, utilizando o Quickchange® kit (Stratagene) e verificados por sequência. O N370S, D409H e L444P são conhecidos por ocorrerem (no homozigoto ou no estado heterozigoto composto) na doença de Gaucher no estado heterozigoto em pacientes da doença de Parkinson e/ou pacientes com demência com corpos de Lewy. As proteínas GBA mutantes E235A e E340A não são conhecidas por ocorrer em pessoas . São dirigidas para o catalisador ácido/base e nucleófilo, respetivamente, da enzima de GBA, e foi previamente monstrado ser cataliticamente inactivo, apesar de ser adequado para o tráfego para o lisossoma (Fabrega et al. , 2000, Glycobiology, volume 10, páginas 1217-1224). 24 horas após a transfeção, as células MÊS foram lisadas como descrito acima e todos os lisados foram analisados por ELISA. Como demonstrado num gráfico de barras compósito que resume várias experiências ELISA (mostrado na FIGURA 4) , quando se comparam as alterações no estado estacionário de α-sinucleína para conhecer quantidades da proteína α-sinucleína recombinante que foi carregada em paralelo, foi registado que a co-expressão (5 pg/prato de 10 cm) de GBA de tipo selvagem (mas não prosaposina) com aS sob estas condições não altera significativamente os níveis de aS (109,7+/-9,88% dos níveis de controlo de ADNc vetor) . Isto está em contraste com o resultado observado no Exemplo 5 acima. A discrepância observada pode refletir as diferenças de ADN total transfetado nos dois paradigmas (FIGURA 2B; FIGURA 2C versus FIGURA 4), conduzindo assim a alterações na razão de DNA: feetamine® 2000 e no papel de prosaposina co-expressa (saposina C). Assim, é concebível que o GBA de tipo selvagem pode ter efeitos variáveis nos níveis de aS nestas células MES23.5, dependendo da taxa de importação de aS para os lisossomas e a composição bem como o estado de ativação de mais do que uma enzima lisossómica.
Em contraste, a co-transfeção com aS dos mutantes portadores de N370S, D409H ou L444P de GBA relacionados com a doença (5 pg por placa de 10 cm) conduz consistentemente à acumulação intracelular de α-sinucleína que era 121,1 + / -4,98%, 269,4 + / - 56,6% e 172,7 + /-23.02% dos níveis de controlo (média + / - erro padrão da média, n = 4 (a-6) , de 5 experiências independentes), como demonstrado no gráfico de barras da FIGURA 4. Estes resultados ajudam a explicar - pela primeira vez - porque as pessoas com mutações N370S, D409H ou L444P são mais suscetíveis à Doença de Parkinson esporádica. É interessante que a mutação que geralmente produz a forma mais leve da doença de Gaucher (DG), nomeadamente N370S, promove apenas uma acumulação leve de aS, enquanto as associadas a um fenótipo de DG mais grave promovem uma acumulação intracelular de aS mais proeminente de (ver, por exemplo, D409H mutante de GBA na FIGURA 4).
Para investigar se os efeitos pró-acumulatórios de mutações de GBA nas concentrações aS foram devido a um defeito tráfego que causaram um stress celular mais generalizado, ou uma perda da função enzimática dentro do lisossoma, empregamos a seguir dois mutantes que estão devidamente adequados para o trafego para o lisossoma, mas exibem perda total da função enzimática. A co-transfeção com aS das variantes portadoras da mutação de sentido errado E235A- e E340A de GBA (5 yg por placa de 10 cm) levou a níveis intracelulares de α-sinucleína que foram 231,0 + /-37.14 e 156,4% + / - 19,65% dos níveis de ADN do vetor de controlo, respetivamente (média + / - erro padrão da média, n = 4 (-6), de 5 experiências independentes), como demonstrado no gráfico de barras mostrado na FIGURA 4.
Com base nos resultados destas experiências, parece que a perda de atividade desta enzima lisossomal tipo não protease contribui pelo menos em parte para o efeito de acumulação de aS que foi induzido por mutantes de GBA humanos relacionados com a doença.
Exemplo 8: A Expressão de Catepsina D Reduz Consistente e Significativamente os Niveis da Proteína α-Sinucleína de uma Forma Dependente da Dose O sistema descrito no Exemplo 6 foi utilizado para examinar os efeitos de uma enzima lisossomal tipo protease, nomeadamente a catepsina D, em niveis de aS co-transfetada.
As células MES23.5 foram transfetadas com 0,5 yg por placa de 10 cm de um plasmídeo portador de ADNc SNCA humano de tipo selvagem que codifica aS (designado por células MES-hSNCA WT no Western blot mostrado na FIGURA 6) mais os 1,25, 2,5 ou 5 yg por placa de 10 cm de uma catepsina D humana que codifica ADNc CTSD de plasmídeo, que foi adquirido de OriGene Technologies, Inc. e estava sob o controlo de um promotor CMV. O clone de Catepsina D foi totalmente verificado por sequência após isolamento e maxiprep. Cada braço de transfeção foi equilibrado com o ADN de vetor vazio até um total de 5,5 yg de ADN por placa de 10 cm. 24 horas após a transfeção as células foram lisadas e os lisados resultantes foram analisados por ELISA sanduíche descrito no presente documento.
Como demonstrado na FIGURA 5, a co-expressão de catepsina D humana reduziu os níveis da proteína intracelular α-sinucleína. Isto ocorreu numa forma dependente da dosagem de ADNc CTSD, em que quantidades crescentes de catepsina D co-transfetada resultou numa redução progressiva dos níveis intracelulares de α-sinucleína. Quando se compara as alterações no estado estacionário de α-sinucleína para conhecer os níveis da proteína α-sinucleína recombinante que foi carregada em paralelo, foi calculado que a maior concentração de sobre-expressão de catepsina D (5 yg / prato de 10 cm) conduziu a um nível total intracelular de a-sinucleína que foi de 25,3 + / - 7, 0% de níveis de controlo (n = 11, a partir de 3 experiências independentes) . Menores níveis de sobre-expressão de catepsina D (1,25 yg / prato de 10 cm e 2,5 yg / prato de 10 cm) conduziu a níveis intracelulares de α-sinucleína que foram de 68 + / - 17,7% e 53 + / -16, 8% de níveis de controlo, respetivamente (n = 2, a partir de 2 experiências independentes). Da mesma forma, a catepsina D humana foi capaz de baixar os níveis de aS de ratazana co-transfetada utilizando o mesmo paradigma.
Para demonstrar que o efeito redutor de catepsina D sobre aS, de facto medido, foi tão elevado como 75 por cento da quantidade total da concentração intracelular de aS detetável (e para mostrar que este efeito não foi devido ao sistema ELISA escolhido, os resultados foram confirmados por Western blotting. Como mostrado na FIGURA 6, os lisados celulares foram sondados independentemente com 2 anticorpos anti-sinucleína diferentes: o monoclonal sin-1 anteriormente descrito, e uma 7071AP policlonal de coelho (Periquet et al., (2007) J.
Neurosci., 27:3338-46).
Importante, a co-expressão de catepsina D com aS durante 24 horas não levou à geração de quaisquer espécies de massas moleculares inferiores ou superiores visíveis, como visualizado por sin-1 e 7071AP. O mesmo resultado foi obtido quando se utiliza um terceiro anticorpo, o policlonal de coelho, hSA-2 purificado por afinidade (dados não mostrados), e quando blots foram sobredesenvolvidos durante uma exposição mais longa.
Para confirmar que os efeitos da catepsina D tiveram lugar in vivo e não durante o procedimento de lise celular, os efeitos de um inibidor potente da Catepsina D, pepstatina A, foram examinados pela sua presença no tampão de lise celular. Como mostrado no gráfico de barras da FIGURA 5 (as primeiras duas barras da esquerda), a inclusão de pepstatina A no tampão de lise não alterou a quantidade de aS detectada no lisado, demonstrando assim que os resultados descritos nas FIGURAS 5 e 6 acima não foram um artefato do procedimento de lise celular.
Para confirmar que o efeito de Catepsina D na redução de aS em células MES23.5 foi especifico e não foi causado por uma redução geral no metabolismo celular e integridade, os ensaios de MTT e LDH foram realizados em células MES-sin que tinham sido co-transfetadas com a quantidade mais elevada de ADNc que codifica catepsina D (5 pg / prato de 10 cm) . A lise das células com 0,1% de Triton-X® 100 serviu como um controlo positivo, representando a morte celular máxima. As células MES-sin co-transfetadas com ADNc CTSD exibiram um sinal de MTT normal que não foi diferente das células transfetadas do vetor de controlo (101,3 + / - 3,91% e 100 + / - 4,05%, respetivamente; n = 6, a partir de 2 experiências independentes) . Do mesmo modo as células MES-sin co-transfetadas com Catepsina D exibiram um sinal LDH que foi idêntico ao das células transfetadas do vetor de controlo.
Para examinar se a Catepsina D também podia reduzir os níveis das proteínas aS portadoras de mutação de sentido errado, as células MES23.5 foram transfetadas com quantidades baixas (0,5 pg/prato de 10 cm) de ADNc SCNA que codificam as variantes tanto A30P, E46K ou A53T de a-sinucleína que estão ligadas à Doença de Parkinson familiar em seres humanos, bem como um mutante S129D e um S129A. A fosforilação de aS no resíduo de serina 129 é conhecida por ser uma característica patológica de como agregados aS in vivo (Anderson J et ai., 2006, J Biol Chem, volume 281, páginas 29739-29752.) . A mutação de um resíduo Ser para Asp é conhecida na técnica para imitar a fosforilação baseada em serina sustentada. O mutante S129A, um mutante de aS incompetente para fosforilação, também foi incluído para comparação.
Conforme mostrado no gráfico de barras da FIGURA 7, a co-expressão de ADNc CTSD que codifica Catepsina D (5 yg/placa de 10 cm) com qualquer aS A30P, E46K, A53T, S129D ou S129A causou uma redução de grau semelhante em níveis de aS para todas as proteínas aS examinadas, quando comparadas com a sua co-expressão com ADN de vetor vazio. Ao comparar as alterações no estado estacionário de α-sinucleína aos níveis bem caraterizados de proteína α-sinucleína recombinante que foi carregada em paralelo, estimou-se que a sobre-expressão de catepsina D (a uma concentração de ADNc de 5 yg/10 cm prato) conduziu a níveis intracelulares de α-sinucleína que foram de 23, 98 + /- 3,57%, 33, 08 +/- 18,51%, 39,21 +/- 14, 63%, 34,84 +/-11,36% e 34,31 +/- 13,39% dos níveis de controlo cognatos, para A30P, E46K, A53T, S129D ou polipéptidos S129AaS, respetivamente (n = 2 (-3) de 2-3 experiências independentes).
Estes resultados sugerem que (a) que a Catepsina D é capaz de também degradar as formas mutantes de aS que ocorrem na DP familiar e (b) que a fosforilação ou a desfosforilação no resíduo Serl29 do aS não altera a atividade proteolitica ('sinucleínase') exibida pela Catepsina D para aS.
De notar, os resíduos D98 e Q99 de aS representam o motivo pelo qual aS é reconhecida pelo recetor Lamp2a durante a autofagia mediada por chaperones (CMA); Cuervo et al, 2004, Science, volume 305, páginas 1292-1295). Para investigar a importância deste motivo na ação de redução de aS induzida por catepsina D, as células MES23.5 também foram transfetadas com um ADNc (0,5 yg/prato de 10 cm) que codifica uma variante dum mutante de aS, onde os resíduos D98 e Q99 foram ambos alterados para alanina (A) por mutagénese dirigida ao local (isto é, variante DQ/AA de aS) . Ao comparar as alterações no estado estacionário de DQ/AA-aS aos níveis bem caraterizados de proteína α-sinucleína recombinante que foi carregada em paralelo, estimou-se que a sobre-expressão de catepsina D (5 yg/prato de 10 cm) conduziu a níveis intracelulares de DQ/AA aS que foram de 22, 14 + / - 5,32% dos níveis de controlo do vetor, (n = 3, de 3 experiências independentes; não mostrado) . Com base nestes resultados, parece que ou alfa-sinucleína também entra no lisossoma por um método diferente de CMA mediado por Lamp2a ou de Catepsina D exibe e/ou induz atividade sinucleinase de atividades extra lisossomais.
Exemplo 9: A Expressão de Catepsina F Reduz os Niveis da Protéina a-Sinucleína 0 sistema descrito no Exemplo 6 foi utilizado para examinar os efeitos de outra enzima lisossomal catepsina, nomeadamente catepsina F, em níveis de aS co-transfetada.
As células MES23.5 foram transfetadas com 0,5 pg por placa de 10 cm de plasmídeo ADNc SCNA que codifica aS mais 5 pg por 10 cm prato de um plasmídeo CTSF humano que codifica Catepsina F humana, que foi adquirido de Ori-Gene Technologies, Inc. e estava sob o controlo de um promotor CMV. O clone de Catepsina F foi totalmente verificado por sequência após isolamento e maxiprep. 24 horas após a transfeção, as células foram lisadas e os lisados foram analisados por ELISA sanduíche.
Vinte e quatro horas após a transfeção, a protéina catepsina F humana co-expressa reduziu a concentração de proteína α-sinucleína intracelular, tal como medido por ELISA sanduíche. Ao comparar as alterações nos níveis do estado estacionário de α-sinucleína aos níveis bem caraterizados de proteína α-sinucleína recombinante que foi carregada em paralelo, estimou-se que a sobre-expressão de catepsina F (5 pg/prato de 10 cm) conduziu a níveis intracelulares de α-sinucleína que foram de 51,7 +/- 14,1% dos niveis de controlo (n =3, de 2 experiências independentes).
Para confirmar que o efeito de Catepsina F na redução de aS foi especifico e não foi causado por uma redução geral na integridade celular, o ensaio de LDH foi realizado em células MES-sin que tinham sido co-transfetadas com ADNc CTSF que codifica Catepsina F (5 pg/prato de 10 cm) . A lise das células com 0,1% de Triton X-100 serviu como um controlo positivo para a toxicidade celular, para promover a morte celular máxima. As células MES-sin co-transfetadas com Catepsina F exibiram um sinal de LDH que foi inferior ou igual ao das células transfetadas do vetor de controlo (dados de 2 experiências independentes; não mostrados).
Exemplo 10: O Aumento da Atividade de GBA Previne a Acumulação de α-Sinucleína num Modelo de Ratinho
Um modelo de ratinho em que a proteína α-sinucleína humana de tipo selvagem é sobreproduzida moderadamente no cérebro, pode ser utilizado como um modelo para a acumulação da proteína a- sinucleína em corpos celulares do cérebro.0 nível de atividade de GBA no sistema nervoso central é aumentado quer por tratamento dos ratinhos com isofagomina (IFG), um açúcar imino que foi mostrado aumentar a atividade de GBA em ratinhos e em seres humanos (Lieberman R et al., (2007) Nat Chem Biol. fevereiro; 3(2):101-7.) ou uma substância tipo isofagomina ou por administração ou sobre-expressão da proteína GBA nos ratinhos. O aumento da atividade de GBA previne a acumulação dependente da idade da protéina α-sinucleína em células neuronais do sistema nervoso central e/ou periférico. Exemplo 11: O Aumento da Atividade de GBA Proporciona Efeitos Terapêuticos num Modelo de Ratinho de Parkinson O efeito terapêutico do aumento da atividade de GBA em neurónios é confirmado num modelo de doença de Parkinson familiar inovador, C3H-Tg(SNCA)83Vle, que mostra a redução da acumulação de agregados de α-sinucleína no cérebro dos animais de teste. Este modelo de ratinho expressa α-sinucleína humana A53T mutante sob o controlo do promotor da proteína do ratinho prião (prnp) . O promotor prnp foi mostrado para alcançar elevados níveis de expressão do gene na maioria dos neurónios do sistema nervoso central. Com 8 meses de idade ratinhos homozigóticos B6; C3H-Tg(SN-CA)83Vle começam a desenvolver fenótipo progressivo e inclusões neuronais intracitoplasmática dependentes da idade, semelhantes aos observados em doentes com sinucleinopatias. O aumento da atividade de GBA previne a acumulação dependente da idade de α-sinucleína em corpos celulares do cérebro e reduz o fenótipo da doença.
Exemplo 12: O Aumento da Atividade de Catepsina D Previne a Acumulação de α-Sinucleína num Modelo de Ratinho
Um modelo de ratinho em que a proteína α-sinucleína humana de tipo selvagem ou mutante é sobreproduzida moderadamente no cérebro, pode ser utilizado como um modelo para a acumulação da proteína a- sinucleína em corpos celulares do cérebro. A atividade de Catepsina D é aumentado quer por tratamento dos ratinhos sistemicamente ou por infusão do cérebro ou estereotaxicamente com uma pequena molécula ativadora ou estabilizadora da atividade da Catepsina D ou por administração ou que sobre-expressão da proteína Catepsina D ou a sua pré-pro-proteína in vivo. 0 aumento da atividade de Catepsina D previne a acumulação dependente da idade da proteína α-sinucleína em corpos celulares do cérebro. Claro que, os mesmos testes podem ser realizados utilizando outras catepsinas, polipéptidos, prepolipeptidos e com polinucleótidos que codificam os mesmos.
Exemplo 13: O Aumento da Atividade de Catepsina D Proporciona Efeitos Terapêuticos num Modelo de Ratinho de Parkinson 0 efeito terapêutico do aumento da atividade de GBA em neurónios é confirmado num modelo de doença de Parkinson familiar inovador, C3H-Tg (SNCA) 83Vle, que mostra a redução da acumulação de agregados de α-sinucleína no cérebro dos animais de teste. Este modelo de ratinho expressa a-sinucleína humana A53T mutante sob o controlo do promotor da proteína do ratinho prião (prnp) . 0 promotor prnp foi mostrado para alcançar elevados níveis de expressão do gene na maioria dos neurónios do sistema nervoso central. Com 8 meses de idade ratinhos homozigóticos B6;C3H-Tg(SN-CA)83Vle começam a desenvolver fenótipo progressivo e inclusões neuronais intracitoplasmática dependentes da idade, semelhantes aos observados em doentes com alfa-sinucleinopatias. 0 aumento da
atividade de Catepsina D previne a acumulação dependente da idade de α-sinucleína em corpos celulares do cérebro e reduz o fenótipo da doença. Claro que, este modelo pode ser utilizado para testar outras catepsinas de uma forma semelhante. OUTRAS FORMAS DE REALIZAÇÃO
Tem sido descrito um certo número de formas de realização da invenção. No entanto, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem se afastarem do âmbito da invenção. Em conformidade, outras formas de realização estão dentro do âmbito das reivindicações.
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • WO 07084737 A [0005] • WO 9527071 A [0082] • WO 9500655 A [0082] • WO 9511984 A [0082] • US 5672344 A [0083] • US 6544785 B [0085] • US 6180613 B [0086] • US 6503888 B [0086] • US 6667174 B [0088] • US 5658776 A [0090] • US 6468798 B [0111] • US 6194389 B [0114] • US 6168587 B [0114] • US 6472375 B [0114] • US 6471996 B [0114] • US 4522811 A [0115] • US 6503713 B [0120]
Documentos de não patente citados na descrição • DAWSON et al. Science, 2003, vol. 302, 819-22 [0002] • VILA et al. Nat Med., 2004, vol. 10, S58-62 [0002] • KRUEGER et al. Nat. Genet., 1997, vol. 18, 106-108 [0003] • ZARRANZ et al. Ann. Neurol., 2004, vol. 55 (2), 164-73 [0003] • POLYMEROPOULOS et al. Science, 1997, vol. 276, 2045-7 [0003] • CHARTIER—HARLIN et al. Lancet, 2004, vol. 364, 1167-9 [0003] • SINGLETON et al. Science, 2003, vol. 302, 841 [0003] • PALS et al. Ann. Neurol., 2004, vol. 56, 591-5 [0003] • MARAGANORE et al. JAMA, 2006, vol. 296, 661-70 [0003] • SPILLANTINI et al. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1998, vol. 95, 6469-73 [0004] • BABA et al. Am. J. Pathol., 1998, vol. 152, 879-884 [0004] • ANDERSON et al. J. Biol. Chem., 2006, vol. 281, 29739-29752 [0004] • SHARON et al. P.N.A.S., 2001, vol. 98, 9110-9115 [0004] • TABNERetal. Free Radio. Biol. Med., 2002, vol. 32 (11), 1076-83 [0005] • FAHN et al. Ann. Neurol., 1992, vol. 32, 804-12 [0005] • LEE. Antioxid. Redox Signal, 2003, vol. 5, 337-48 [0005] • HASHIMOTO et al. Neuromolecular Med., 2 0 03, vol. 4 (1-2), 21-36 [0005] • LO BIANCO. PNAS, 2004, vol. 101, 17510-17515 [0006] • α-synuclein and synucleinopathies. SCHLOSSMACHER MG. The Dementias 2 Blue Books of Practical Neurology. Butterworth Heinemann, Inc, 2007, 184-213 [0035] • a-synuclein and synucleinopathies. SCHLOSSMACHER MG. The Dementias 2 Blue Books of Practical Neurology. Butterworth Heinemann, Inc, 2007, vol. 8, 18 4-213 [0036] • EBLAN et al. N. Engl. J. Med., 2005 [0039] • KLEIN; SCHLOSSMACHER. Neurology, 2007, vol. 69 (22), 2093-104 [0041] • CLARK et al. Neurology, 2007, vol. 69 (12), 1270-7 [0042] • LWIN et al. Mol. Genet. Metab., 2004, vol. 81 (1), 70-3 [0042] • SIDRANSKY. Mol Genet Met, 2004, 6-15 [0045] • LEONOVA et al. J. Biol. Chem, 1996, vol. 271, 17312-17320 [0047] • HIRAIWA et al. Arch. Biochem. Biophys., 1997, vol. 341, 17-24 [0047] • SALVIOLI et al. FEES. Lett., 2000, vol. 472, 17-21 [0047] • SUN et al. J. Biol. Chem., 2003, vol. 278, 31918-31923 [0047] • PAMPLOS et al. Acta. Neuropathol., 1999, vol. 97, 91-97 [0047] • TYLKI-SZYMANSKA. Clin. Genet., 2007, vol. 72, 538-542 [0047] • RAFI et al. Somat. Cell Mol. Genet., 1993, vol. 19, 1-7 [0047] • SALVIOLI et al. Biochem. J., 2005, vol. 390, 95-103 [0048] • WEX et al. Biochem. Biophys . Res. Commun ., 1999, vol. 259, 401-407 [0054] • WANG et al. J. Biol. Chem., 1998, vol. 273, 32000-32008 [0054] • TANG et al. Mol. Cell Biol., 2006, vol. 26, 2309-2316 [0054] • CUERVO et al. Science, 2004, vol. 305, 1292 [0062] • HERMONAT ; MUZYCZKA. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1984, vol. 81, 6466-6470 [0082] • LEBKOWSKI et al .Mol. Cell. Biol., 1988, vol. 8, 3988-3996 [0082] • GAO et al. PNAS, 2002, vol. 99, 11854-11859 [0084] • Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols.
Humana Press, 2003 [0084] [0090] • AURICCHIO et al. Hum. Mol. Genet., 2001, vol. 10 (26), 3075-81 [0084] • MUZYSCKA. Curr. Top. Microb. Immunol., 1992, vol. 158, 97-129 [0085] • KAPLITT et al. Nat. Genet., 1994, vol. 8, 148-154 [0088] • MANDEL et al. J. Neurosci., 1998, vol. 18, 4271-4284 [0088] • XU et al. Gene Ther., 2001, vol. 8, 1323-1332 [0088] • KLEIN et al. Exp. Neurol., 1998, vol. 150, 183-194 [0088] • MIYAZAKI. Gene, 1989, vol. 79, 269-277 [0088] • SHIPLEY et al. Genetics, 1991, vol. 10, 1009-1018 [0088] • DONELLOetal. J. Virol., 1998, vol. 72, 5085-5092 [0088] • HABERMAetal. Gene Ther., 1998, vol. 5, 1604-16011 [0089] • YE et al. Science, 1995, vol. 283, 88-91 [0089] • CLARK et al. Hum. Gene Ther., 1999, vol. 10, 1031-1039 [0096] • VELDWIJK et al. Mol. Ther., 2002, vol. 6, 272-278 [0096] • MCLAUGHLIN et al. J. Virol., 1988, vol. 62, 1963-1973 [0097] • XIAO et al. Exp. Neurobiol., 1997, vol. 144, 113-124 [0098] • FISHER et al. J. Virol., 1996, vol. 70, 520-532 [0098] • MARTIN. REMINGTON'SPHARM. SCI. MackPubl. Co, 1975 [0104] • WILLIAMS ; WILLIAMS. PHYSICIAN'S DESK REFERENCE . Medical Economics, 1995 [0104] • HAMAJIMA et al. Clin. Immunol. Immunopathol., 1998, vol. 88 (2), 205-10 [0114] • CZARNIK. Curr. Opin. Chem. Bio., 1997, vol. 1, 60-6 [0120] • MAS LI AH et al. Science, 18 February 2 0 0 0, vol. 287 (5456), 1265-9 [0124] • Modem genetic Analysis. Genomics. W. H. Freeman and Company, 1999 [0125] • EKINS ; CHU. Trends in Biotechnology, 1999, vol. 17, 217-218 [0125] • MACBEATH ; SCHREIBER. Science, 2000, vol. 289 (5485), 1760-1763 [0125] • SIMPSON. Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002 [0125] • HARDIMAN. Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts. DNA Press, 2003 [0125] • DREISEWERD et al. Anal Chem., 2005, vol. 77, 4098-107 [0132] • SCHLOSSMACHER et al. N.E.J.M., 2005, vol. 352, 728-731 [0132] • SHARON R et al. PNAS, 2001, vol. 98, 9110-9115 [0139] • FABREGA et al. Glycobiology, 2000, vol. 10, 1217-1224 [0152] • PERIQUET et al. J. Neurosci., 2007, vol. 27, 3338-46 [0160] • ANDERSON J et al. J Biol Chem, 2006, vol. 281, 29739-29752 [0164] • CUERVO et al. Science, 2004, vol. 305, 1292-1295 [0167] • LIEBERMAN R et al. Nat Chem Biol., February 2007, vol. 3 (2), 101-7 [0172]
Lisboa, 19 de Janeiro de 2016

Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um ou ambos de: um polipéptido de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA) e um polinucleótido que codifica um polipéptido de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA), na preparação de um medicamento para utilização num método de tratamento dum indivíduo com uma sinucleinopatia, mas não uma doença de depósito lisossomal diagnosticada clinicamente, em que o polipéptido ou polinucleótido é administrado numa quantidade eficaz para reduzir um nível de a-sinucleína no sistema nervoso central ou periférico do indivíduo, ou em ambos, ou no compartimento lisossomal do indivíduo.
  2. 2. A utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a sinucleinopatia é uma sinucleinopatia primária.
  3. 3. A utilização de acordo com a reivindicação 2, em que a sinucleinopatia compreende qualquer uma ou várias de: doença de Parkinson (DP); demência com corpos de Lewy (DLB) esporádica ou herditária; falência autonômica pura (PAF) com deposição de α-sinucleína; atrofia multissistémica (MSA); neurodegeneração hereditária com acumulação de ferro no cérebro e doença com corpos de Lewy incidental de idade avançada.
  4. 4. A utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a sinucleinopatia é uma sinucleinopatia secundária.
  5. 5. A utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a sinucleinopatia compreende qualquer uma ou várias de: doença de Alzheimer da variante com corpos de Lewy; síndrome de Down; paralisia supranuclear progressiva; tremor essencial com corpos de Lewy; parkinsonismo familiar com ou sem demência; demência ligada ao gene tau e ao gene progranulina com ou sem parkinsonismo; doença de Creutzfeldt Jakob; encefalopatia espongiforme bovina; doença de Parkinson secundária; parkinsonismo resultante de exposição a neurotoxina; parkinsonismo induzido por um fármaco com deposição de α-sinucleína; ataxia espinocerebelar esporádica ou hereditária; esclerose lateral amiotrófica (ELA) e distúrbio comportamental do sono de movimento rápido dos olhos idiopático.
  6. 6. A utilização de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda a administração de um ou mais agentes que melhoram a autofagia dos complexos α-sinucleína ou um polipéptido que melhora o processo de degradação de complexos de α-sinucleína dentro dos lisossomos.
  7. 7. A utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o agente compreende um inibidor de mTOR.
  8. 8. A utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o agente compreende rapamicina ou um análogo de rapamicina.
  9. 9. A utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o agente compreende um ou mais de everolimus, ciclosporina, FK506, hsc70, N-octil-4-epi-p-valienamine e glicerol.
  10. 10. A utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o agente compreende uma molécula pequena, uma molécula grande, um péptido, um anticorpo, um ácido nucleico ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
  11. 11. Um ou ambos de um polipéptido de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA) e um polinucleótido que codifica um polipéptido de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA), para utilização num método de tratamento duma sinucleinopatia que não é uma doença de depósito lisossomal diagnosticada clinicamente.
  12. 12. Utilização de um ou ambos de: um polipéptido de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA) e um polinucleótido que codifica um polipéptido de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA), na preparação de um medicamento para utilização num método de tratamento dum indivíduo com qualquer uma ou várias de: doença de Parkinson (DP) ; demência com corpos de Lewy (DLB) esporádica ou herditária; falência autonômica pura (PAF) com deposição de α-sinucleína; atrofia multissistémica (MSA); neurodegeneração hereditária com acumulação de ferro no cérebro; doença com corpos de Lewy incidental de idade avançada; doença de Alzheimer da variante com corpos de Lewy; síndrome de Down; tremor essencial com corpos de Lewy; parkinsonismo familiar com ou sem demência; demência ligada ao gene tau e ao gene progranulina com ou sem parkinsonismo; doença de Creutzfeldt Jakob; encefalopatia espongiforme bovina; doença de Parkinson secundária; parkinsonismo resultante de exposição a neurotoxina; parkinsonismo induzido por um fármaco com deposição de α-sinucleína; ataxia espinocerebelar esporádica ou hereditária; esclerose lateral amiotrófica (ELA) e distúrbio comportamental do sono de movimento rápido dos olhos idiopático, em que o polipéptido ou polinucleótido é administrado numa quantidade eficaz para reduzir um nível de α-sinucleína no sistema nervoso central ou periférico do indivíduo, ou em ambos, ou no compartimento lisossomal do indivíduo.
  13. 13. Um ou ambos de um polipéptido de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA) e um polinucleótido que codifica um polipéptido de ácido beta-glucocerebrosidase (GBA), para utilização num método de tratamento da doença de Parkinson (DP); demência com corpos de Lewy (DLB) esporádica ou herditária; falência autonômica pura (PAF) com deposição de α-sinucleína; atrofia multissistémica (MSA); neurodegeneração hereditária com acumulação de ferro no cérebro; doença com corpos de Lewy incidental de idade avançada; doença de Alzheimer da variante com corpos de Lewy; sindrome de Down; tremor essencial com corpos de Lewy; parkinsonismo familiar com ou sem demência; demência ligada ao gene tau e ao gene progranulina com ou sem parkinsonismo; doença de Creutzfeldt Jakob; encefalopatia espongiforme bovina; doença de Parkinson secundária; parkinsonismo resultante de exposição a neurotoxina; parkinsonismo induzido por um fármaco com deposição de α-sinucleína; ataxia espinocerebelar esporádica ou hereditária; esclerose lateral amiotrófica (ELA) ou distúrbio comportamental do sono de movimento rápido dos olhos idiopático. Lisboa, 19 de Janeiro de 2016
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0811265A2 (pt) 2007-05-16 2014-09-30 Brigham & Womens Hospital Tratamento de sinucleinopatias
WO2009009378A2 (en) * 2007-07-12 2009-01-15 The Uab Research Foundation Cathepsin-d neuroprotection
GB201011420D0 (en) * 2010-07-06 2010-08-18 United Arab Emirates Universit Method for diagnosis
US9290759B2 (en) * 2010-08-25 2016-03-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Optimized miRNA constructs
SI3366688T1 (sl) 2010-12-08 2022-07-29 The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Substituirani pirazolopirimidini kot aktivatorji glukocerebrozidaze
ES2745470T3 (es) * 2011-03-31 2020-03-02 Univ Iowa Res Found Partícula de AAV2 que comprende una proteína de la cápside de AAV2 y un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una tripeptidilo peptidasa 1 (TPP1) para el tratamiento de lipofuscinosis ceroide infantil tardía (LINCL) en un mamífero no roedor mediante inyección intraventricular o administración icv
EP2533051A1 (en) 2011-06-06 2012-12-12 Centogene GmbH Method for the diagnosis of Gaucher's disease
CN112574964A (zh) * 2012-05-18 2021-03-30 衣阿华大学研究基金会 用于治疗淀粉状蛋白沉积的方法和组合物
CA2889990A1 (en) * 2012-11-05 2014-05-08 Genzyme Corporation Compositions and methods for treating proteinopathies
EP2919759A4 (en) 2012-11-14 2016-07-20 Ohio State Innovation Foundation MATERIALS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF GLIOBLASTOMES
WO2015075011A1 (en) * 2013-11-21 2015-05-28 F. Hoffmann-La Roche Ag ANTI-alpha-SYNUCLEIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE
WO2016025533A2 (en) * 2014-08-11 2016-02-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for treating synucleinopathies
CA2996445A1 (en) * 2014-09-05 2016-03-10 Eli Hatchwell Methods and compositions for inhibiting and treating neurological conditions
WO2016164474A1 (en) * 2015-04-06 2016-10-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Predictive value of combined genetic enzymatic and lipidomic data in disease risk for lewy body disease
AU2016256895B2 (en) 2015-05-07 2022-05-26 Takeda Pharmaceutical Company Limited Glucocerebrosidase gene therapy for parkinson's disease
GB201512203D0 (en) * 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
CA3003435A1 (en) * 2015-10-28 2017-05-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Intrathecal administration of adeno-associated-viral vectors for gene therapy
EP3264092A1 (en) * 2016-07-01 2018-01-03 Centogene AG Use of lyso-gb1 as druggable target
IL269550B1 (en) 2017-03-27 2024-09-01 Chase Therapeutics Corp Combining a 5HT3 antagonist and pramipexole for the treatment of synucleinopathies
CN111542549A (zh) 2017-10-03 2020-08-14 普利维尔治疗公司 用于溶酶体障碍的基因疗法
CA3078464A1 (en) 2017-10-03 2019-04-11 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
BR112020006671A2 (pt) 2017-10-03 2020-12-01 Prevail Therapeutics, Inc. terapias genéticas para distúrbios lisossômicos
BR112020012921A2 (pt) * 2018-01-12 2020-12-08 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotídeos antissenso de alfa-sinucleína e usos dos mesmos
US12053510B2 (en) 2018-05-01 2024-08-06 Orfoneuro Aps Treatment of neuronal ceroid lipofuscinosis
JP2022510341A (ja) * 2018-12-05 2022-01-26 ワシントン・ユニバーシティ 神経の疾患を検出し、予防し、回復に向かわせ、治療する方法
DK3850089T5 (da) 2019-02-04 2024-08-19 Freeline Therapeutics Ltd Polynukleotider
WO2020210713A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
CN114466656A (zh) 2019-07-24 2022-05-10 康德生物医疗有限公司 在治疗神经变性病症中的模拟肽化合物(r)-2-氨基-n-((s)-1-(((s)-5-氨基-1-(3-苄基-1,2,4-噁二唑-5-基)戊基)氨基)-3-(4-羟基-2,6-二甲苯基)-1-氧代丙-2-基)-5-胍基戊酰胺
US20230103407A1 (en) * 2020-03-10 2023-04-06 University Of Cincinnati Materials and methods for the treatment of gaucher disease
CN116322744A (zh) 2020-07-29 2023-06-23 自由行疗法有限公司 稳定性提高的突变的β-葡糖脑苷脂酶

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5672344A (en) 1987-12-30 1997-09-30 The Regents Of The University Of Michigan Viral-mediated gene transfer system
US20020168750A1 (en) 1988-12-23 2002-11-14 James Rasmussen Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase
JPH05503841A (ja) 1989-11-16 1993-06-24 デューク ユニバーシティ 動物組織細胞の微片仲介トランスフォーメーション
US5858784A (en) 1991-12-17 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery
TW404844B (en) 1993-04-08 2000-09-11 Oxford Biosciences Ltd Needleless syringe
ATE304604T1 (de) 1993-06-24 2005-09-15 Frank L Graham Adenovirus vektoren für gentherapie
US5571787A (en) * 1993-07-30 1996-11-05 Myelos Corporation Prosaposin as a neurotrophic factor
RU2162342C2 (ru) 1993-10-25 2001-01-27 Кэнджи Инк. Рекомбинантный аденовирусный вектор и способы его применения
WO1995013365A1 (en) 1993-11-09 1995-05-18 Targeted Genetics Corporation Generation of high titers of recombinant aav vectors
US7252989B1 (en) 1994-04-04 2007-08-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Adenovirus supervector system
EP0755454B1 (en) 1994-04-13 2008-02-13 The Rockefeller University Aav-mediated delivery of dna to cells of the nervous system
US6042820A (en) 1996-12-20 2000-03-28 Connaught Laboratories Limited Biodegradable copolymer containing α-hydroxy acid and α-amino acid units
US6472375B1 (en) 1998-04-16 2002-10-29 John Wayne Cancer Institute DNA vaccine and methods for its use
US6544785B1 (en) 1998-09-14 2003-04-08 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses
ATE286253T1 (de) 1998-10-23 2005-01-15 Evotec Neurosciences Gmbh Methoden zur diagnose oder prognose der alzheimerschen krankheit
AU7856600A (en) 1999-10-04 2001-05-10 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Novel carbamates and ureas
JP2004516016A (ja) 2000-09-18 2004-06-03 ジェンザイム・コーポレイション ハイブリッドユビキチンプロモーターを含む発現ベクター
TW200918046A (en) * 2002-04-03 2009-05-01 Novartis Ag Indolylmaleimide derivatives
EP1638605B1 (en) * 2003-06-20 2014-01-08 Raptor Pharmaceutical, Inc. Delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
US20050208090A1 (en) * 2004-03-18 2005-09-22 Medtronic, Inc. Methods and systems for treatment of neurological diseases of the central nervous system
KR20130128481A (ko) 2005-06-08 2013-11-26 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 리소좀 효소를 코딩하는 유전자의 돌연변이와 관련있는 ｃｎｓ 질환의 치료 방법
EA015629B1 (ru) * 2005-08-11 2011-10-31 Арпи Матоссиан-Роджерс Пептиды, используемые для лечения и диагностики аутоиммунных заболеваний
AR059089A1 (es) 2006-01-20 2008-03-12 Genzyme Corp Administracion intraventricular de una enzima para enfermedades de almacenamiento lisosomal
CA2656643C (en) * 2006-06-23 2015-08-25 Amicus Therapeutics, Inc. Method for the treatment of neurological disorders by enhancing the activity of .beta.-glucocerebrosidase
BRPI0811265A2 (pt) 2007-05-16 2014-09-30 Brigham & Womens Hospital Tratamento de sinucleinopatias
WO2009009378A2 (en) 2007-07-12 2009-01-15 The Uab Research Foundation Cathepsin-d neuroprotection

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Publication number Publication date
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US8454954B2 (en) 2013-06-04
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CA2684946C (en) 2015-03-31
WO2008144591A3 (en) 2009-12-30
AU2008254774A1 (en) 2008-11-27

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