BR112020006671A2 - terapias genéticas para distúrbios lisossômicos - Google Patents

terapias genéticas para distúrbios lisossômicos Download PDF

Info

Publication number
BR112020006671A2
BR112020006671A2 BR112020006671-0A BR112020006671A BR112020006671A2 BR 112020006671 A2 BR112020006671 A2 BR 112020006671A2 BR 112020006671 A BR112020006671 A BR 112020006671A BR 112020006671 A2 BR112020006671 A2 BR 112020006671A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
nucleic acid
isolated nucleic
vector
fact
sequence
Prior art date
Application number
BR112020006671-0A
Other languages
English (en)
Inventor
Asa Abeliovich
Laura Heckman
Herve RHINN
Original Assignee
Prevail Therapeutics, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Prevail Therapeutics, Inc. filed Critical Prevail Therapeutics, Inc.
Publication of BR112020006671A2 publication Critical patent/BR112020006671A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01045—Glucosylceramidase (3.2.1.45), i.e. beta-glucocerebrosidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14133—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Abstract

A presente invenção refere-se em alguns aspectos, às composições e métodos para o tratamento de doenças associadas com a função lisossômica aberrante, por exemplo, doença de Parkinson e doença de Gaucher. Em algumas modalidades, a divulgação fornece construções de expressão compreendendo um transgene que codifica um ou mais ácidos nucleicos inibidores que direcionam o SCNA ou uma parte deste, TMEM106B ou uma parte deste, ou qualquer combinação dos anteriores. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para a doença de Parkinson através da administração de tais construções de expressão a um indivíduo com sua necessidade.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TERAPI- AS GENÉTICAS PARA DISTÚRBIOS LISOSSÔMICOS".
PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. 119(e) dos Pedidos Provisórios U.S. números de série 62/567.303, depositado em 3 de outubro de 2017, intitulado "GENE THERAPIES FOR LYSOSO- MAL DISORDERS", e 62/567.305, depositado em 3 de outubro de 2017, intitulado "GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISOR- DERS", cujos conteúdos inteiro são aqui incorporados por referência.
ANTECEDENTES
[0002] A doença de Gaucher é um erro congênito raro do metabo- lismo glicosfingolipídico devido à deficiência de ácido lisossômico B- glucocerebrosidase (Gcase, "GBA"). Os pacientes sofrem de sintomas e descobertas não relacionados ao CNS, incluindo hepatoesplenome- galia, insuficiência da medula óssea levando a pancitopenia, distúrbios pulmonares e fibrose, e defeitos ósseos. Além disso, um número signi- ficativo de pacientes sofre de manifestações neurológicas, incluindo movimentos oculares sacádicos defeituosose olhar fixo, convulsões, déficits cognitivos, atraso no desenvolvimento e distúrbios de movi- mento, incluindo a doença de Parkinson.
[0003] Existem várias terapêuticas que abordam a doença periféri- ca e as principais manifestações clínicas na medula óssea hemato- poiética e nas vísceras, incluindo terapias de reposição enzimática como descritas abaixo, medicamentos de pequenas moléculas do tipo chaperone que se ligam à Gcase defeituosa e melhoram a estabilida- de, e terapia de redução de substrato que bloqueia a produção de substratos que se acumulam na doença de Gaucher, levando a sinto- mas e descobertas. No entanto, outros aspectos da doença de Gau- cher (particularmente aqueles que afetam o esqueleto e o cérebro) pa- recem refratários ao tratamento.
SUMÁRIO
[0004] Além dos pacientes com a doença de Gaucher (que possu- em mutações nos dois alelos cromossômicos do gene da GBA1), os pacientes com mutações em apenas um alelo da GBA1 estão em risco altamente aumentado de doença de Parkinson (PD). A gravidade dos sintomas da PD - que incluem dificuldade no modo de andar, tremor em repouso, rigidez e, frequentemente, depressão, dificuldades para dormir e declínio cognitivo - se correlaciona com o grau de redução da atividade enzimática. Assim, pacientes com a doença de Gaucher possuem o curso mais grave, enquanto que os pacientes com uma única mutação leve na GBA1 geralmente possuem um curso mais be- nigno. Os portadores de mutação também correm alto risco de outros distúrbios relacionados à PD, incluindo a Demência do Corpo de Lewy, caracterizada por disfunção executiva, psicose e distúrbio do movi- mento semelhante à PD e atrofia de múltiplos sistemas, com compro- metimentos motores e cognitivos característicos. Não existe nenhuma terapia que altere o curso inexorável desses distúrbios.
[0005] Em alguns aspectos, a presente invenção baseia-se em construções de expressão que codificam um ou mais RNA inibidor (por exemplo, shRNA, miRNA, etc.) que direciona um gene associado com a PD (por exemplo, a-Sinucleína (a-Syn), proteína da transmembrana 106B (TMEM106B), proteína ribossômica s25 (RPS25), proteína tau associada a microtúbulos (MAPT), ou uma combinação destas). Em alguns aspectos, a presente invenção baseia-se em construções de expressão (por exemplo, vetores) que codificam a Gcase (ou uma par- te dela) e um ou mais produtos gênicos adicionais de genes associa- dos à PD (por exemplo, a-Syn). Sem desejar ser limitado por qualquer teoria particular, as combinações de produtos gênicos aqui descritos atuam em conjunto (por exemplo, sinergicamente) para reduzir um ou mais sinais e sintomas de PD quando expressos em um indivíduo.
[0006] Consequentemente, em alguns aspectos, a presente inven- ção fornece um ácido nucleico isolado que codifica um RNA inibidor que direciona o SNCA (por exemplo, uma parte do SCNA) e inibe a expressão e/ou a atividade de a-Syn. Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um ácido nucleico isolado que compreende uma construção de expressão que codifica um primeiro produto gênico e um segundo produto gênico, em que cada produto gênico é seleciona- do independentemente dos produtos gênicos, ou suas partes, apre- sentados na Tabela 1.
[0007] Em conformidade, em alguns aspectos, a presente inven- ção fornece um ácido nucleico isolado que codifica um RNA inibidor que direciona a TMEM106B (por exemplo, uma parte da TMEM106B) e inibe a expressão e/ou a atividade da TMEM106B. Em alguns aspec- tos, a presente invenção fornece um ácido nucleico isolado compreen- dendo uma construção de expressão que codifica um primeiro produto gênico e um segundo produto gênico, em que cada produto gênico é selecionado independentemente dos produtos gênicos, ou suas par- tes, apresentados na Tabela 1.
[0008] Conforme for, em alguns aspectos, a presente invenção fornece um ácido nucleico isolado que codifica um RNA inibidor que direciona um gene que codifica a RPS25 (por exemplo, uma parte de um gene que codifica a RPS25) e inibe a expressão e/ou atividade de RPS25. Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um ácido nucleico isolado que compreende uma construção de expressão que codifica um primeiro produto gênico e um segundo produto gênico, em que cada produto gênico é selecionado independentemente dos pro- dutos gênicos, ou suas partes, apresentados na Tabela 1.
[0009] Consequentemente, em alguns aspectos, a presente inven- ção fornece um ácido nucleico isolado que codifica um RNA inibidor que direciona a MAPT (por exemplo, uma parte de um gene que codi-
fica a MAPT) e inibe a expressão e/ou a atividade de MAPT. Em al- guns aspectos, a presente invenção fornece um ácido nucleico isolado compreendendo uma construção de expressão que codifica um primei- ro produto gênico e um segundo produto gênico, em que cada produto gênico é selecionado independentemente dos produtos gênicos, ou suas componentes, apresentados na Tabela 1.
[0010] Em algumas modalidades, um primeiro produto gênico ou um segundo produto gênico é uma proteína Gcase, ou uma parte dêsta. Em algumas modalidades, um primeiro produto gênico ou um segundo produto gênico é um ácido nucleico interferente (por exemplo, ShRNA, miRNA, dsRNA, etc.). Em algumas modalidades, um ácido nucleico interferente inibe a expressão de a-Sinucleína (a-Syn). Em algumas modalidades, o primeiro produto gênico é uma proteína Gca- se e o segundo produto gênico é um ácido nucleico interferente (por exemplo, shRNA, miRNA, dsRNA, etc.) que inibe a expressão de a- Syn (por exemplo, um ácido nucleico interferente que direciona o SCNA).
[0011] Em algumas modalidades, um ácido nucleico interferente inibe a expressão de TMEM106B. Em algumas modalidades, o primei- ro produto gênico é uma proteína Gcase e o segundo produto gênico é um ácido nucleico interferente (por exemplo, ShRNA, miRNA, dsRNA, etc.) que inibe a expressão de TMEM106B (por exemplo, um ácido nu- cleico interferente que direciona a TMEM106B).
[0012] Em algumas modalidades, um ácido nucleico interferente inibe a expressão de RPS25. Em algumas modalidades, o primeiro produto gênico é uma proteína Gcase e o segundo produto gênico é um ácido nucleico interferente (por exemplo, sShRNA, miRNA, dsRNA, etc.) que inibe a expressão de um gene que codifica RPS25 (por exemplo, um ácido nucleico interferente que direciona a sequência de codificação de RPS25).
[0013] Em algumas modalidades, um ácido nucleico interferente inibe a expressão de MAPT. Em algumas modalidades, o primeiro produto gênico é uma proteína Gcase e o segundo produto gênico é um ácido nucleico interferente (por exemplo, ShRNA, miRNA, dsRNA, etc.) que inibe a expressão de MAPT (por exemplo, um ácido nucleico interferente que direciona MAPT).
[0014] Em algumas modalidades, uma construção de expressão ainda compreende um ou mais promotores. Em algumas modalidades, um promotor é um promotor da beta-actina de galinha (CBA), um pro- motor CAG, um promotor CD68 ou um promotor JeT. Em algumas modalidades, um promotor é um promotor de RNA pol ll (por exemplo, ou um promotor de RNA pol Ill (por exemplo, U6).
[0015] Em algumas modalidades, uma construção de expressão ainda compreende um sítio de entrada ribossômico interno (IRES). Em algumas modalidades, um IRES está localizado entre um primeiro pro- duto gênico e um segundo produto gênico.
[0016] Em algumas modalidades, uma construção de expressão ainda compreende uma sequência de codificação de peptídeo autocli- vável. Em algumas modalidades, um peptídeo de autoclivagem é um peptídeo T2A.
[0017] Em algumas modalidades, uma construção de expressão compreende duas sequências de repetição terminal invertida (ITR) de vírus adeno-associado (AAV). Em algumas modalidades, as sequên- cias de ITR ladeiam um primeiro produto gênico e um segundo produto gênico (por exemplo, são dispostos como se segue da extremidade 5' para a extremidade 3': ITR-primeiro produto gênico-segundo produto gênico-ITR). Em algumas modalidades, uma das sequências de ITR de um ácido nucleico isolado carece de um sítio de resolução terminal funcional (trs). Por exemplo, em algumas modalidades, um das ITRs é uma AITR.
[0018] A presente invenção refere-se, em alguns aspectos, aos vetores de rAAV compreendendo uma ITR tendo uma região "D" modi- ficada (por exemplo, uma sequência D que é modificada em relação à ITR de AAV?2 do tipo selvagem, SEQ ID NO: 16). Em algumas modali- dades, a ITR que possui a região D modificada é a 5' ITR do vetor de rAAV. Em algumas modalidades, uma região "D" modificada compre- ende uma sequência "S", por exemplo, como apresentada na SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, a ITR que possui a região "D" mo- dificada é a 3' ITR do vetor de rAAV. Em algumas modalidades, uma região "D" modificada compreende uma 3' ITR na qual a região "D" está posicionada na extremidade 3' da ITR (por exemplo, na parte ex- terna ou na extremidade terminal da ITR em relação à inserção de transgene do vetor). Em algumas modalidades, uma região "D" modifi- cada compreende uma sequência conforme apresentada na SEQ ID NO: 13 ou 14.
[0019] Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado (por exemplo, um vetor do rAAV) compreende uma região TRY. Em algu- mas modalidades, uma região TRY compreende a sequência apresen- tada na SEQ ID NO: 16.
[0020] Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado des- crito pela presente invenção compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NOs: 1 a 67.
[0021] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um vetor que compreende um ácido nucleico isolado como descrito na presente invenção. Em algumas modalidades, um vetor é um plasmídeo ou um vetor viral. Em algumas modalidades, um vetor viral é um vetor do AAV recombinante (rAAV) ou um vetor de Baculovírus. Em algumas modalidades, um vetor do rAAV é de fita simples (por exemplo, DNA de fita simples).
[0022] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece uma cé-
lula hospedeira compreendendo um ácido nucleico isolado como des- crito na presente invenção, ou um vetor como descrito pela presente invenção.
[0023] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende uma proteína da cápside e um ácido nucleico isolado ou um vetor, conforme descrito na presente invenção.
[0024] Em algumas modalidades, uma proteína da cápside é ca- paz de atravessar a barreira hematoencefálica, por exemplo, uma pro- teína da cápside do AAV9 ou uma proteína da cápside do AAVrh.10. Em algumas modalidades, um rAAV transfere células neuronais e cé- lulas não neuronais do sistema nervoso central (CNS).
[0025] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um mé- todo para o tratamento de um indivíduo tendo ou com suspeita de ter a doença de Parkinson, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição (por exemplo, uma composição com- preendendo um ácido nucleico isolado ou um vetor ou um rAAV) con- forme descrita pela presente invenção.
[0026] Em algumas modalidades, a administração compreende injeção direta no CNS de um indivíduo. Em algumas modalidades, a injeção direta é injeção intracerebral, injeção intraparenquimatosa, in- jeção intratecal, injeção intracisterna magna ou qualquer combinação destas. Em algumas modalidades, a injeção direta no CNS de um indi- víduo compreende a liberação intensificada por convecção (CED).
[0027] Em algumas modalidades, a administração compreende injeção periférica. Em algumas modalidades, a injeção periférica é a injeção intravenosa.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0028] A FIG. 1 é um esquema que representa uma modalidade de um vetor compreendendo uma construção de expressão que codifica a
Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma parte desta) e um RNA inibidor que direciona o SCNA.
[0029] A FIG. 2 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo que compreende um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica o SCNA.
[0030] A FIG. 3 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo que compreende um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica um RNA inibidor que direciona o SCNA. O RNA inibidor é posicionado dentro de um íntron entre a se- quência do promotor e a sequência de codificação da Gcase.
[0031] A FIG. 4 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo que compreende um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica a progranulina (PGRN) e um RNA inibidor que direciona o SCNA. O RNA inibidor é posicionado dentro de um íntron entre a sequência do promotor e a sequência de codificação da Gcase.
[0032] A FIG. 5 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo que compreende um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica a Gcase (GBA1) e um RNA ini- bidor que direciona o SCNA. O RNA inibidor é posicionado dentro de um íntron entre a sequência do promotor e a sequência de codificação da Gcase.
[0033] A FIG. 6 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo compreendendo um vetor do rAAV que inclui uma cons- trução de expressão que codifica a Gcase (GBA1) e um RNA inibidor que direciona o SCNA. O RNA inibidor é posicionado dentro de um íntron entre a sequência do promotor e a sequência de codificação da Gcase.
[0034] A FIG. 7 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo compreendendo um vetor do rAAV que inclui uma cons-
trução de expressão que codifica a Gcase (GBA1) e um RNA inibidor que direciona o SCNA. A sequência "D" da 3' ITR está posicionada na "parte externa" do vetor.
[0035] A FIG. 8 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo que compreende um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica a Gcase (GBA1) e um RNA ini- bidor que direciona o SCNA. O RNA inibidor é posicionado dentro de um íntron entre a sequência do promotor e a sequência de codificação da Gcase.
[0036] A FIG. 9 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo que compreende um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica a Gcase (GBA1) e um RNA ini- bidor que direciona o SCNA. O RNA inibidor é posicionado dentro de um íntron entre a sequência do promotor e a sequência de codificação da Gcase.
[0037] A FIG. 10 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo que compreende um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica a Gcase (GBA1) e um RNA ini- bidor que direciona o SCNA.
[0038] A FIG. 11 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo que compreende um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica a Gcase (GBA1) e um RNA ini- bidor que direciona o SCNA. O RNA inibidor é posicionado dentro de um íntron entre a sequência do promotor e a sequência de codificação da Gcase.
[0039] A FIG. 12 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo que compreende um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica a Gcase (GBA1) e um RNA ini- bidor que direciona o SCNA. O RNA inibidor é posicionado dentro de um íntron entre a sequência do promotor e a sequência de codificação da Gcase.
[0040] A FIG. 13 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo compreendendo um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica a Gcase (GBA1) e progranulina (PGRN), e um RNA inibidor que direciona a TMEM106B. O RNA inibi- dor é posicionado dentro de um íntron entre a sequência do promotor e a sequência de codificação da Gcase.
[0041] A FIG. 14 mostra os dados representativos que indicam si- lenciamento bem-sucedido do SCNA in vitro pelo ensaio repórter GFP (parte superior) e ensaio a-Syn (parte inferior).
[0042] A FIG. 15 mostra dados representativos que indicam o si- lenciamento bem-sucedido de TMEM106B in vitro pelo ensaio repórter GFP (parte superior) e ensaio a-Syn (parte inferior).
[0043] A FIG. 16 é um esquema que representa um vetor do rAAV que compreende uma região "D" localizada na "parte externa" da ITR (por exemplo, próxima ao terminal da ITR em relação à inserção ou expressão de transgene) (parte superior) e um vetor do rAAV do tipo selvagem tendo ITRs no "interior" do vetor (por exemplo, próxima à inserção de transgene do vetor).
[0044] A FIG. 17 mostra dados para a transdução de células HEK293 utilizando rAAVs tendo ITRs com localização do tipo selva- gem (círculos) ou alternativas (por exemplo, "parte externa"; quadra- dos) da sequência "D". Os rAAVs tendo ITRs colocadas na parte ex- terna foram capazes de transferir as células tão eficientemente quanto os rAAVs tendo ITRs do tipo selvagem.
[0045] A FIG. 18 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo que compreende um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica um RNA inibidor que direciona a RPS25.
[0046] A FIG. 19 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo que compreende um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica um RNA inibidor que direciona a RPS25.
[0047] A FIG. 20 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo que compreende um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica um RNA inibidor que direciona a MAPT.
[0048] A FIG. 21 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo que compreende um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica um RNA inibidor que direciona a MAPT.
[0049] A FIG. 22 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo que compreende um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica a progranulina (PGRN) e um RNA inibidor que direciona a MAPT. O RNA inibidor é posicionado dentro de um íntron entre a sequência do promotor e a sequência de codificação da PGRN.
[0050] A FIG. 23 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo que compreende um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica um RNA inibidor que direciona a MAPT.
[0051] A FIG. 24 é um esquema que representa uma modalidade de um plasmídeo compreendendo um vetor do rAAV que inclui uma construção de expressão que codifica a progranulina (PGRN) e um RNA inibidor que direciona a MAPT. O RNA inibidor é posicionado dentro de um íntron entre a sequência do promotor e a sequência de codificação da PGRN.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0052] A presente invenção baseia-se, em parte, nas composições e métodos para expressão de combinações de produtos gênicos asso-
ciados com a PD em um indivíduo. Um produto gênico pode ser uma proteína, um fragmento (por exemplo, parte) de uma proteína, um áci- do nucleico interferente que inibe um gene associado à PD, etc. Em algumas modalidades, um produto gênico é uma proteína ou um frag- mento de proteína codificado por um gene associado à PD. Em algu- mas modalidades, um produto gênico é um ácido nucleico interferente (por exemplo, sShRNA, siRNA, miRNA, amiRNA, etc.) que inibe um ge- ne associado à PD.
[0053] Um gene associado à PD refere-se a um gene que codifica um produto gênico que está associado genética, bioquímica ou funcio- nalmente com a PD. Por exemplo, indivíduos tendo mutações no gene de GBA1 (que codifica a proteína Gcase), foram observados de ter um risco aumentado de desenvolver a PD em comparação com indivíduos que não possuem uma mutação na GBA1. Em outro exemplo, a PD está associada com o acúmulo de agregados de proteínas compreen- dendo a proteína a-Sinucleína (a-Syn); consequentemente, o SCNA (que codifica a a-Syn) é um gene associado à PD. Em algumas moda- lidades, um cassete de expressão aqui descrito codifica uma forma do tipo selvagem ou não mutante de um gene associado à PD (ou sua sequência de codificação). Exemplos de genes associados à PD são listados na Tabela 1.
2 Tao
E
Õ E E É Zz SsSS o OoO'S 8 208 o 2=e2z 2 = -—-—- 8 | TESS 6 o sm a ao = z os Bos SN = s 2 | Sô o om E Z Rx O — — jo o = |O e = E Z|ó Ss So zo oO O O |O o TE É | a aI& | [8] So nan o o jo ao a = z|Zz zZzZZ2|Z Zz <|Z no o o o So çÇ o o“ = c o o 9 2 e Ss Ss TE E = o o om g = o > E & 2 o Ss eos a v às g & PA 2 28 o gv E Ss o Ex) Ss & 8 o & =P o o ES s£ E Ss gg É E ê a o sa 3 je |8 2 8 88 Ss E 7 3 8 2|º S E - Es) o > E) - E E Sh 2 Ss Cv 2 E E|5 8 |É |& Tio o & To mo o E 2 o à g|o o £ = x o |" |53 ê 2 8 & Ss s e E jo o Ss E 8 SE 5/o o ê õ SEBOS o g E|o e $ Sig Ss 8 E 56 28 õ O E E|&X e vs É v 2/5 E D o E 2 o o seis o Bjs o es 3 e 2 o|8 Si o | |: = 1 als = Te 22 CE 3 8 o /o a = ol à 8/2 o e|S & E O | ee S | Se os Se a E º SEE 282 e $i e BE E = 8 7 8 6 o 3 os 3 6/3 gp ÁS o Wj/o o Ó e 2 Echo o ódio E |S o <c To c É E o 8 a E õ Ss os EE |S 2 882 2 88 os w ls o = o 2 e|E ES 3|o E SE SSIS nn &iF 2 2S| gm o E 6 3 2S|/k o E o Ss a = lo 3 3|8 Bs 7 SE ola O o oO FE |s g E o >|S vo 5 Saw 3 o F S o E o <q = = 2 NE 8 S < q x o & Cc Z FE = o a < õ õ o R & x |= o a = E & vv o g ol o 8 cao 2 O E E Os Z a 3 8 sô z o E e jo o E o o Es a 8 H E 2 o o o Ss < o 2 Ss Bs Ss uu £ 8 " q ê | E o z as 2 o vv £ 2i re 8 = o o Ãs = = Ss 2 2 o E sjlo 2 Ss Ss s o < S £ E 2 3 o ZA 8 2 9/5 2/2888 = <Q F ? e So S/S 2 o x fe) a Silo E E Z Fr 8 ê ã
E 2 2 2
É
Ácidos nucleicos e vetores isolados
[0054] Um ácido nucleico isolado pode ser DNA ou RNA. Em al- guns aspectos, a presente invenção fornece ácidos nucleicos isolados (por exemplo, vetores do rAAV) que codificam um ou mais ácidos nu- cleicos inibidores que direcionam um ou mais genes associados à PD, por exemplo, SCNA, TMEM106B, RPS25 e MAPT. Em algumas moda- lidades, os ácidos nucleicos isolados ainda compreendem uma se- quência de codificação de proteína, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma Gcase (por exemplo, GBA1) ou pro- granulina (por exemplo, PGRN).
[0055] Geralmente, um ácido nucleico isolado como aqui descrito pode codificar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ácidos nucleicos ini- bidores (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, amiRNA, etc.). Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado codifica mais do que 10 ácidos nucleicos inibidores. Em algumas modalidades, cada um dos um ou mais ácidos nucleicos inibidores direciona um gene di- ferente ou uma parte de um gene (por exemplo, um primeiro miRNA direciona uma primeira sequência alvo de um gene e um segundo MIRNA direciona uma segunda sequência alvo do gene que é diferen- te da primeira sequência alvo). Em algumas modalidades, cada um dos um ou mais ácidos nucleicos inibidores direciona a mesma se- quência alvo do mesmo gene (por exemplo, um ácido nucleico isolado codifica várias cópias do mesmo miRNA).
[0056] Os aspectos da presente invenção referem-se a um ácido nucleico isolado compreendendo uma construção de expressão que codifica um ou mais ácidos nucleicos interferentes (por exemplo, dsR- NA, siRNA, miRNA, amiRNA, etc.) que direcionam uma proteína a- Sinucleína (por exemplo, o produto gênico do gene SCNA). A proteína a-Sinucleína refere-se a uma proteína encontrada no tecido cerebral, que desempenha um papel na manutenção do suprimento de vesícu-
las sinápticas nos terminais pré-sinápticos, através do agrupamento das vesículas sinápticas e regulação da liberação de dopamina. Em seres humanos, o gene SCNA está localizado no cromossomo 4. Em algumas modalidades, o gene SCNA codifica um peptídeo que é re- presentado pela NCBI Reference Sequence NP 001139527.1. Em al- gumas modalidades, um gene SCNA compreende a sequência apre- sentada na SEQ ID NO: 1.
[0057] Um ácido nucleico inibidor que direciona o SCNA pode compreender uma região de complementaridade (por exemplo, uma região do ácido nucleico inibidor que hibridiza com o gene alvo, tal como o SCNA) que possui entre 6 e 50 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, um ácido nucleico inibidor compreende uma região de complementaridade com SCNA que está entre cerca de 6 e 30, cerca de 8 e 20 ou cerca de 10 e 19 nucleotídeos de compri- mento. Em algumas modalidades, um ácido nucleico inibidor é com- plementar com pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos contíguos de uma sequência de SCNA.
[0058] Os aspectos da presente invenção referem-se a um ácido nucleico isolado compreendendo uma construção de expressão que codifica um ou mais ácidos nucleicos interferentes (por exemplo, dsR- NA, siRNA, miRNA, amiRNA, etc.) que direcionam uma proteína TMEMA106B (por exemplo, o produto gênico do gene SCNA). A proteí- na TMEM106B refere-se à proteína da transmembrana 106B, que é uma proteína envolvida na morfogênese dos dendritos e na regulação do tráfego lisossômico. Em seres humanos, o gene de TMEM106B es- tá localizado no cromossomo 7. Em algumas modalidades, o gene de TMEMA106B codifica um peptídeo que é representado pela NCBI Refe- rence Sequence NP 060844.2. Em algumas modalidades, um gene de TMEM106B compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2.
[0059] Um ácido nucleico inibidor que direciona a TMEM106B po- de compreender uma região de complementaridade (por exemplo, uma região do ácido nucleico inibidor que hibridiza com o gene alvo, tal como de TMEM106B) que está entre 6 e 50 nucleotídeos de com- primento. Em algumas modalidades, um ácido nucleico inibidor com- preende uma região de complementaridade com TMEM106B que está entre cerca de 6 e 30, cerca de 8 e 20 ou cerca de 10 e 19 nucleotí- deos de comprimento. Em algumas modalidades, um ácido nucleico inibidor é complementar com pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos contí- guos de uma sequência de TMEM106B.
[0060] Os aspectos da presente invenção referem-se a um ácido nucleico isolado que compreende uma construção de expressão que codifica um ou mais ácidos nucleicos interferentes (por exemplo, dsR- NA, siRNA, miRNA, amiRNA, etc.) que direcionam uma proteína ribos- sômica s25 (RPS25) (por exemplo, o produto gênico de RPS25). À proteína RPS25 refere-se a uma proteína ribossômica que é uma su- bunidade do ribossomo s40, um complexo protéico envolvido na sínte- se de proteínas. Em seres humanos, o gene de RPS25 está localizado no cromossomo 11. Em algumas modalidades, o gene de RPS25 codi- fica um peptídeo que é representado pela NOBI Reference Sequence NP 001019.1. Em algumas modalidades, um gene de RPS25 com- preende a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 36.
[0061] Um ácido nucleico inibidor que direciona a RPS25 pode compreender uma região de complementaridade (por exemplo, uma região do ácido nucleico inibidor que hibridiza com o gene alvo, tal como RPS25) que está entre 6 e 50 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, um ácido nucleico inibidor compreende uma região de complementaridade com a RPS25 que está entre cerca de 6 e 30, cerca de 8 e 20 ou cerca de 10 e 19 nucleotídeos de comprimen-
to. Em algumas modalidades, um ácido nucleico inibidor é complemen- tar com pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos contíguos de uma sequência de RPS25.
[0062] Os aspectos da presente invenção referem-se a um ácido nucleico isolado que compreende uma construção de expressão que codifica um ou mais ácidos nucleicos interferentes (por exemplo, dsR- NA, siRNA, miRNA, amiRNA, etc.) que direcionam uma proteína tau associada ao microtúbulo, MAPT (por exemplo, o produto gênico do gene de MAPT). A proteína MAPT refere-se à proteína tau associada ao microtúbulo, que é uma proteína envolvida na estabilização do mi- crotúbulo. Em seres humanos, o gene de MAPT está localizado no cromossomo 17. Em algumas modalidades, o gene de MAPT codifica um peptídeo que é representado pela NCBI Reference Sequence NP 005901.2. Em algumas modalidades, um gene de MAPT compre- ende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 37.
[0063] Um ácido nucleico inibidor que direciona a MAPT pode compreender uma região de complementaridade (por exemplo, uma região do ácido nucleico inibidor que hibridiza com o gene alvo, tal co- mo MAPT) que está entre 6 e 50 nucleotídeos de comprimento. Em al- gumas modalidades, um ácido nucleico inibidor compreende uma região de complementaridade com a MAPT que está entre cerca de 6 e 30, cer- ca de 8 e 20 ou cerca de 10 e 19 nucleotídeos de comprimento. Em al- gumas modalidades, um ácido nucleico inibidor é complementar com pe- lo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos contíguos de uma sequência de MAPT.
[0064] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um ácido nuclei- co isolado que compreende uma construção de expressão que codifica um primeiro produto gênico e um segundo produto gênico, em que ca- da produto gênico é selecionado independentemente dos produtos gê-
nicos, ou suas partes, apresentados na Tabela 1.
[0065] Em algumas modalidades, um produto gênico é codificado por uma parte de codificação (por exemplo, um cDNA) de um gene de ocorrência natural. Em algumas modalidades, um primeiro produto gê- nico é uma proteína (ou um fragmento desta) codificada pelo gene de GBA1. Em algumas modalidades, um produto gênico é um ácido nu- cleico inibidor que direciona (por exemplo, hibridiza com, ou compre- ende uma região de complementaridade com) um gene associado à PD (por exemplo, SCNA). Um especialista versado reconhece que a ordem de expressão de um primeiro produto gênico (por exemplo, Gcase) e um segundo produto gênico (por exemplo, RNA inibidor que direciona o SCNA) geralmente pode ser revertida (por exemplo, o RNA inibidor é o primeiro produto gênico e a Gcase é o segundo produto gênico). Em algumas modalidades, um produto gênico é um fragmento (por exemplo, parte) de um gene listado na Tabela 1. Um fragmento de proteína pode compreender ao redor de 50%, ao redor de 60%, ao re- dor de 70%, ao redor de 80%, ao redor de 90% ou ao redor de 99% de uma proteína codificada pelos genes listados na Tabela 1. Em algu- mas modalidades, um fragmento de proteína compreende entre 50% e 99,9% (por exemplo, qualquer valor entre 50% e 99,9%) de uma prote- ína codificada por um gene listado na Tabela 1. Em algumas modali- dades, um produto gênico (por exemplo, um RNA inibidor) hibridiza com a parte de um gene alvo (por exemplo, é complementar a 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou mais nucleotídeos contíguos de um gene alvo, por exemplo, SCNA).
[0066] Em algumas modalidades, uma construção de expressão é monocistrônica (por exemplo, a construção de expressão codifica uma única proteína de fusão compreendendo um primeiro produto gênico e um segundo produto gênico). Em algumas modalidades, uma constru- ção de expressão é policistrônica (por exemplo, a construção de ex-
pressão codifica dois produtos gênicos distintos, por exemplo, duas proteínas ou fragmentos de proteína diferentes).
[0067] Um vetor de expressão policistrônico pode compreender um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais) promotores. Qualquer promotor adequado pode ser utilizado, por exemplo, um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor endógeno, um pro- motor específico de tecido (por exemplo, um promotor específico do CNS), etc. Em algumas modalidades, um promotor é um promotor de beta-actina de galinha (promotor de CBA), um promotor CAG (por exemplo, como descrito por Alexopoulou et al. (2008) BMC Cell Biol. 9:2; doi: 10.1186/1471-2121-9-2), um promotor CD68 ou um promotor JeT (por exemplo, como descrito por Tornge et al. (2002) Gene 297(1- 2):21-32). Em algumas modalidades, um promotor está ligado de ma- neira operável a uma sequência de ácido nucleico que codifica um primeiro produto gênico, um segundo produto gênico ou um primeiro produto gênico e um segundo produto gênico. Em algumas modalida- des, um cassete de expressão compreende uma ou mais sequências reguladoras adicionais, incluindo, mas não limitadas a estas, sequên- cias de ligação ao fator de transcrição, sítios de emenda de íntrons, sítios de poli(A) adição, sequências intensificadoras, sítios de ligação a repressores ou qualquer combinação dos anteriores.
[0068] Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nuclei- co que codifica um primeiro produto gênico e uma sequência de ácido nucleico que codifica um segundo produto gênico são separadas por uma sequência de ácido nucleico que codifica um sítio de entrada ri- bossômico interno (IRES). Exemplos de sítios IRES são descritos, por exemplo, por Mokrejs et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34(Database issue):D125-30. Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico que codifica um primeiro produto gênico e uma sequência de ácido nucleico que codifica um segundo produto gênico são separadas por uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de au- toclivagem. Exemplos de peptídeos de autoclivagem incluem, mas não são limitados a estes, T2A, P2A, E2A, F2A, BNCPV 2A e BmIFV 2A, e os descritos por Liu et al. (2017) Sci Rep. 7: 2193. Em algumas moda- lidades, o peptídeo de autoclivagem é um peptídeo de T2A.
[0069] Patologicamente, distúrbios tais como a PD e a doença de Gaucher estão associados ao acúmulo de agregados protéicos com- postos em grande parte pela proteína a-Sinucleína (a-Syn). Conse- quentemente, em algumas modalidades, os ácidos nucleicos isolados aqui descritos compreendem um ácido nucleico inibidor que reduz ou im- pede a expressão da proteína a-Syn. Uma sequência que codifica um ácido nucleico inibidor pode ser colocada em uma região não trasladada (por exemplo, íntron, SUTR, 3'UTR, etc.) do vetor de expressão.
[0070] Em algumas modalidades, um ácido nucleico inibidor é po- sicionado em um íntron de uma construção de expressão, por exem- plo, em um íntron a montante da sequência que codifica um primeiro produto gênico. Um ácido nucleico inibidor pode ser um RNA de fita dupla (dsRNA), siRNA, microRNA (mIiRNA), miRNA artificial (amiRNA) ou um aptâmero de RNA. Geralmente, um ácido nucleico inibidor se liga a (por exemplo, hibridiza com) cerca de 6 e cerca de 30 (por exemplo, qualquer número inteiro entre 6 e 30, inclusivos) nucleotí- deos contíguos de um RNA alvo (por exemplo, mMRNA). Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico inibidor é um miRNA ou um amiRNA, por exemplo, um miRNA que direciona o SNCA (o gene que codifica a proteína a-Syn). Em algumas modalidades, o miRNA não compreende nenhuma incompatibilidade com a região do mMRNA de SNCA à qual ele hibridiza (por exemplo, o miRNA é "aperfeiçoado"). Em algumas modalidades, o ácido nucleico inibidor é um sShRNA (por exemplo, um sShRNA que direciona o SNCA).
[0071] Em algumas modalidades, um ácido nucleico inibidor é um
MicroRNA artificial (amiRNA). Um microRNA (mIRNA) de uma forma geral se refere a um pequeno RNA de não de codificação encontrado em plantas e animais e funciona na regulação da transcricional e pós- translacional da expressão do gene. Os miRNAs são transcritos pela RNA polimerase para formar uma estrutura em formato de grampo de cabelo-alça referida pri-miRNAs que são subsequentemente proces- sados por enzimas (por exemplo, Drosha, Pasha, spliceossoma etc.) para uma estrutura em formato de grampo de cabelo pré-miRNA que é processada por Dicer para formar um duplex de miRNA/MIRNA* (em que * indica a fita passageira do duplex de miRNA), uma fita das quais é então incorporada a um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Em algumas modalidades, um RNA inibidor como aqui descrito é um miRNA que direciona SCNA ou TMEM106B.
[0072] Em algumas modalidades, um ácido nucleico inibidor que direciona o SCNA compreende um duplex de miRNA/MIRNA*. Em al- gumas modalidades, a fita de miRNA de um duplex de miRNA/MIRNA* compreende ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 3 a 8. Em algumas modalidades, a fita de miRNA* de um duplex de miRNA/MIRNA* compreende ou consiste na sequên- cia apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 3 a 8.
[0073] Em algumas modalidades, um ácido nucleico inibidor que direciona a TMEM106B compreende um duplex de miRNA/MIRNA”*. Em algumas modalidades, a fita de miRNA de um duplex de miR- NA/MIRNA* compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 ou 10. Em algumas modalidades, a fita de miRNA* de um duplex de miRNA/MIRNA* compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 ou 10.
[0074] Um microRNA artificial (amiRNA) é derivado da modificação do miRNA nativo para substituir as regiões de direcionamento naturais do pré-mRNA com uma região de direcionamento de interesse. Por exemplo, um miRNA expresso de ocorrência natural pode ser utilizado como um scaffold ou cadeia principal (por exemplo, um scaffold de pri- MIRNA), com a sequência tronco substituída por aquela de um miRNA que direciona um gene de interesse. Um microRNA precursor artificial (pré-amiRNA) é normalmente processado de tal modo que um único RNA pequeno é de preferência gerado. Em algumas modalidades, os vetores do scAAV e os scAAVs aqui descritos compreendem um ácido nucleico que codifica um amiRNA. Em algumas modalidades, o scaffold de pri-miRNA do amiRNA é derivado de um pri-miRNA selecionado do grupo que consiste em pri-MIR-21, pri-MIR-22, pri-MIR-26a, pri-MIR-30a, Pri-MIR-33, pri-MIR-122, pri-MIR-375, pri-MIR-199, pri-MIR-99, pri-MIR- 194, pri-MIR-155 e pri-MIR-451. Em algumas modalidades, um amiRNA compreende uma sequência de ácido nucleico que direciona o SCNA ou a TMEM106B e um scaffold de eSIBR amiRNA, por exemplo, como des- crito em Fowler et al. Nucleic Acids Res. 2016 Mar 18; 44(5): e48.
[0075] Em algumas modalidades, um amiRNA que direciona o SCNA compreende ou consiste na sequência apresentada em qual- quer uma das SEQ ID NOs: 17 a 22. Em algumas modalidades, um amiRNA que direciona a TMEM106B compreende ou consiste na se- quência apresentada na SEQ ID NO: 11 ou 12. Em algumas modali- dades, um amiRNA que direciona a RPS25 compreende ou consiste na sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 38 a 45. Em algumas modalidades, um amiRNA que direciona a MAPT compreende ou con- siste na sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 46 a 61.
[0076] Um ácido nucleico isolado como descrito nesta invenção pode existir por si só ou como parte de um vetor. Geralmente, um ve- tor pode ser um plasmídeo, cosmídeo, fagomídeo, cromossomo artifi- cial bacteriano (BAC) ou um vetor viral (por exemplo, vetor adenoviral, vetor de vírus adeno-associado (AAV), vetor retroviral, vetor baculovi- ral, etc.). Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo (por exemplo, um plasmídeo que compreende um ácido nucleico isolado como aqui descrito). Em algumas modalidades, o vetor é um vetor do AAV recombinante (rAAV). Em algumas modalidades, um vetor do rA- AV é de fita simples (por exemplo, DNA de fita simples). Em algumas modalidades, um vetor é um vetor de baculovírus (por exemplo, um vetor de poliedrose nuclear de Autographa californica (ACNPV)).
[0077] Tipicamente, um vetor do rAAV (por exemplo, genoma de rAAV) compreende um transgene (por exemplo, uma construção de expressão compreendendo um ou mais de cada um dos seguintes: promotor, íntron, sequência intensificadora, sequência de codificação de proteína, sequência de codificação inibidora de RNA, sequência da cauda de poliA, etc.) ladeado por duas sequências de repetição termi- nal invertida (ITR) do AAV. Em algumas modalidades, o transgene de um vetor do rAAV compreende um ácido nucleico isolado, conforme descrito pela presente invenção. Em algumas modalidades, cada uma das duas sequências de ITR de um vetor do rAAV é uma ITR de com- primento total (por exemplo, aproximadamente 145 pb de comprimento e contendo o sítio de ligação à Rep funcional (RBS) e o sítio de reso- lução terminal (trs)). Em algumas modalidades, uma das ITRs de um vetor do rAAV é truncada (por exemplo, encurtada ou não de tamanho completo). Em algumas modalidades, uma ITR truncada não possui um sítio de resolução terminal funcional (trs) e é utilizada para produ- ção de vetores do AAV autocomplementares (vetores do scAAV). Em algumas modalidades, uma ITR truncada é uma AITR, por exemplo, como descrito por McCarty et al. (2003) Gene Ther. 10(26):2112-8.
[0078] Os aspectos da presente invenção referem-se aos ácidos nucleicos isolados (por exemplo, vetores do rAAV) compreendendo uma ITR tendo uma ou mais modificações (por exemplo, adições, eli- minações, substituições de ácido nucleico, etc.) em relação a uma ITR do AAV do tipo selvagem, por exemplo, em relação à ITR do AAV2 do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 16). A estrutura da ITR do AAV?2 do tipo selvagem é mostrada na FIG. 16. Geralmente, uma ITR do tipo selvagem compreende uma região de 125 nucleotídeos que se autoenrijecem para formar uma estrutura em formato de grampo de cabelo na forma T de fita dupla palindrômica, que consiste em duas hastes transversais (formadas por sequências referidas como B/B' e CIC', respectivamente), uma região de tronco mais longa (formada pe- las sequências A/A') e uma região terminal de fita simples referida co- mo a região “D”. (FIG. 16). Geralmente, a região "D" de uma ITR é po- sicionada entre a região de tronco formada pelas sequências A/A' e a inserção contendo o transgene do vetor do rAAV (por exemplo, posici- onada na "parte interna" da ITR em relação ao terminal da ITR ou pro- ximal à inserção do transgene ou construção de expressão do vetor do rAAV). Em algumas modalidades, uma região "D" compreende a se- quência apresentada na SEQ ID NO: 14. Observou-se que a região "D" desempenha um papel importante na encapsidação de vetores do rAAV por proteínas da cápside, por exemplo, conforme divulgado por Ling et al. (2015) J Mol Genet Med 9(3).
[0079] A presente invenção é baseada, em parte, na surpreenden- te descoberta de que os vetores do rAAV que compreendem uma re- gião "D" localizada na "parte externa" da ITR (por exemplo, proximal ao terminal da ITR em relação à inserção de transgene ou construção de expressão) são eficientemente encapsidados por proteínas da cápside do AAV em comparação aos vetores do rAAV tendo ITRs com ITRs não modificados (por exemplo, do tipo selvagem). Em algumas modalidades, os vetores do rAAV tendo uma sequência "D" modificada (por exemplo, uma sequência "D" na posição "externa") possuem toxi- cidade reduzida em relação aos vetores do rAAV tendo sequências de ITR do tipo selvagem.
[0080] Em algumas modalidades, uma sequência "D" modificada compreende pelo menos uma substituição de nucleotídeo em relação a uma sequência "D" do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 14). Uma sequência "D" modificada pode ter pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais de 10 substituições de nucleotídeo em relação a uma sequência "D" do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, uma sequência "D" modificada compreende pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 substituições de ácidos nucleicos em relação a uma sequência "D" do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, uma se- quência "D" modificada está entre cerca de 10% e cerca de 99% (por exemplo, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99%) idêntica a uma se- quência "D" do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 14). Em al- gumas modalidades, uma sequência "D" modificada compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 13, também referida como uma sequência "S", como descrito em Wang et al. (1995) J Mol Biol 250(5):573-80.
[0081] Um ácido nucleico isolado ou vetor do rAAV, conforme des- crito na divulgação, pode ainda compreender uma sequência "TRY", por exemplo, como apresentada na SEQ ID NO: 28 ou como descrito em Francois, et al. 2005. The Cellular TATA Binding Protein Is Required for Rep-Dependent Replication of a Minimal Adeno-Associated Virus Type 2 p5 Element. J Virol. 2005. Em algumas modalidades, uma se- quência TRY é posicionada entre uma ITR (por exemplo, uma 5' ITR) e uma construção de expressão (por exemplo, uma inserção de codifica- ção de transgene) de um ácido nucleico isolado ou vetor do rAAV.
[0082] Em alguns aspectos, a presente invenção se refere a veto- res de Baculovírus compreendendo um ácido nucleico isolado ou vetor do rAAV, conforme descrito na divulgação. Em algumas modalidades, o vetor de Baculovírus é um vetor de poliedrose nuclear de Autogra-
pha californica (ACNPV), por exemplo, como descrito em Urabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43 e Smith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896.
[0083] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece uma cé- lula hospedeira compreendendo um ácido nucleico isolado ou vetor, como aqui descrito. Uma célula hospedeira pode ser uma célula proca- riótica ou uma célula eucariótica. Por exemplo, uma célula hospedeira pode ser uma célula de mamífero, célula bacteriana, célula de levedu- ra, célula de inseto, etc. Em algumas modalidades, uma célula hospe- deira é uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula HEK293T. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é uma célula bacte- riana, por exemplo, uma célula de E. coli. rAAVs
[0084] Em alguns aspectos, a presente invenção se refere aos AAVs recombinantes (rAAVs) compreendendo um transgene que codi- fica um ácido nucleico como aqui descrito (por exemplo, um vetor do rAAV como aqui descrito). O termo "rAAVs" geralmente se refere a partículas virais compreendendo um vetor do rAAV encapsidado por uma ou mais proteínas da cápside do AAV. Um rAAV descrito pela presente invenção pode compreender uma proteína da cápside tendo um sorotipo selecionado de AAV1, AAV2, AAV3, AAVA4, AAV5, AAVG6, AAV7, AAV8, AAV9 e AAV1IO. Em algumas modalidades, um rAAV compreende uma proteína da cápside de um hospedeiro não humano, por exemplo, uma proteína da cápside do AAV de reso tal como AA- Vrh.10, AAVrh.39, etc. Em algumas modalidades, um rAAV descrito pela presente invenção compreende uma proteína da cápside que é uma variante de uma proteína da cápside do tipo selvagem, tal como uma variante da proteína da cápside que inclui pelo menos 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais de 10 (por exemplo, 15, 20, 25, 50, 100, etc.) substituições de aminoácido (por exemplo, mutações) em relação à proteína da cápside do AAV do tipo selvagem da qual é derivada.
[0085] Em algumas modalidades, os rAAVs descritos na presente invenção se espalham de imediato através do CNS, particularmente quando introduzidos no espaço CSF ou diretamente no parênquima cerebral. Consequentemente, em algumas modalidades, os rAAVs descritos na divulgação compreendem uma proteína da cápside que é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica (BBB). Por exemplo, em algumas modalidades, um rAAV compreende uma proteína da cápside tendo um sorotipo AAV9 ou AAVrh.10. A produção de rAÃAVs é descrita, por exemplo, em Samulski et al. (1989) J Virol. 63(9):3822-8 e Wright (2009) Hum Gene Ther. 20(7): 698—706.
[0086] Em algumas modalidades, um rAAV como descrito pela presente invenção (por exemplo, compreendendo um genoma de rA- AV recombinante encapsidado por proteínas da cápside do AAV para formar uma partícula da cápside do rAAV) é produzido em um sistema de expressão vetorial de Baculovírus (BEVS). A produção de rAAVs utilizando BEVS é descrita, por exemplo, em Urabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43, Smith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888- 1896, Patente U.S. No. 8.945.918, Patente U.S. No. 9.879.282 e Pu- blicação PCT Internacional WO 2017/184879. No entanto, um rAAV pode ser produzido utilizando qualquer método adequado (por exem- plo, utilizando genes rep e cap recombinantes). Composições Farmacêuticas
[0087] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece composi- ções farmacêuticas compreendendo um ácido nucleico isolado ou rA- AV conforme aqui descrito e um veículo farmaceuticamente aceitável. Como utilizado nesta invenção, o termo "farmaceuticamente aceitável" refere-se a um material, tal como um veículo ou diluente, que não anu- la a atividade ou propriedades biológicas do composto e é relativamen- te não tóxico, por exemplo, o material pode ser administrado a um in-
divíduo sem provocar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de maneira prejudicial com qualquer um dos componentes da composição em que está contido.
[0088] Como aqui utilizado, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" significa um material, composição ou veículo farmaceutica- mente aceitável, tal como uma carga, estabilizante, agente dispersan- te, agente de suspensão, diluente, excipiente, agente espessante, sol- vente ou material de encapsulação líquido ou sólido, envolvido na condução ou transporte de um composto útil dentro da invenção no ou para o paciente, de tal modo que ele possa desempenhar sua função planejada. Os ingredientes adicionais que podem ser incluídos nas composições farmacêuticas utilizadas na prática da invenção são co- nhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Remington's Phar- maceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA), que é aqui incorporado por referência.
[0089] As composições (por exemplo, composições farmacêuticas) aqui fornecidas podem ser administradas por qualquer via, incluindo entérica (por exemplo, oral), parenteral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, subcutânea, intraventricular, trans- dérmica, interdérmica, retal, intravaginal, intraperitoneal, tópico (como por pós, pomadas, cremes e/ou gotas), mucosal, nasal, bucal, sublin- gual; por instilação intratraqueal, instilação brônquica e/ou inalação; e/ou como um spray oral, spray nasal e/ou aerossol. As vias especifi- camente contempladas são administração oral, administração intrave- nosa (por exemplo, injeção intravenosa sistêmica), administração regi- onal por meio do fornecimento de sangue e/ou linfa, e/ou administra- ção direta a um local afetado. Em geral, a via de administração mais apropriada dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a natu- reza do agente (por exemplo, sua estabilidade no ambiente do trato gastrointestinal) e/ou a condição do indivíduo (por exemplo, se o indi-
víduo é capaz de tolerar a administração oral). Em certas modalida- des, o composto ou a composição farmacêutica aqui descrita é ade- quado para administração tópica no olho de um indivíduo. Métodos
[0090] A divulgação baseia-se, em parte, nas composições para expressão de combinações de produtos gênicos associados à PD em um indivíduo que atua em conjunto (por exemplo, sinergicamente) pa- ra tratar a doença de Parkinson. Como utilizado nesta invenção, "tra- tar" ou "tratamento" refere-se a (a) prevenção ou atraso do início da doença de Parkinson; (b) redução da gravidade da doença de Parkin- son; (c) redução ou impedimento do desenvolvimento de sintomas ca- racterísticos da doença de Parkinson; (d) e/ou prevenção do agrava- mento dos sintomas característicos da doença de Parkinson. Os sin- tomas da doença de Parkinson incluem, por exemplo, disfunção moto- ra (por exemplo, tremor, rigidez, lentidão de movimento, dificuldade em andar), disfunção cognitiva (por exemplo, demência, depressão, ansi- edade), disfunção emocional e comportamental.
[0091] Em conformidade, em alguns aspectos, a divulgação forne- ce um método para o tratamento de um indivíduo tendo ou suspeito de ter a doença de Parkinson, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição (por exemplo, uma composição que compreende um ácido nucleico isolado ou um vetor ou um rAAV) como descrita pela presente invenção.
[0092] Em algumas modalidades, uma composição é administrada diretamente no CNS do indivíduo, por exemplo, através da injeção di- reta no cérebro e/ou medula espinhal do indivíduo. Exemplos de mo- dalidades de administração direta ao CNS incluem, mas não são limi- tados a estes, injeção intracerebral, injeção intraventricular, injeção intracisternal, injeção intraparenquimatosa, injeção intratecal e qualquer combinação dos anteriores. Em algumas modalidades, a injeção direta no CNS de um indivíduo resulta na expressão do transgene (por exem- plo, expressão do primeiro produto gênico, segundo produto gênico e, se aplicável, terceiro produto gênico) no mesencéfalo, estriado e/ou córtex cerebral do indivíduo. Em algumas modalidades, a injeção direta no CNS resulta na expressão do transgene (por exemplo, expressão do primeiro produto gênico, segundo produto gênico e, se aplicável, terceiro produ- to gênico) na medula espinhal e/ou CSF do indivíduo.
[0093] Em algumas modalidades, a injeção direta no CNS de um indivíduo compreende a liberação intensificada por convecção (CED). A liberação intensificada por convecção é uma estratégia terapêutica que envolve a exposição cirúrgica do cérebro e a colocação de um ca- teter de pequeno diâmetro diretamente em uma área alvo do cérebro, seguida pela infusão de um agente terapêutico (por exemplo, uma composição ou rAAV conforme aqui descrito) diretamente no cérebro do indivíduo. A CED é descrita, por exemplo, em Debinski et al. (2009) Expert Rev Neurother. 9(10):1519-27.
[0094] Em algumas modalidades, uma composição é administrada perifericamente a um indivíduo, por exemplo, através da injeção perifé- rica. Exemplos de injeção periférica incluem injeção subcutânea, inje- ção intravenosa, injeção intra-arterial, injeção intraperitoneal ou qual- quer combinação dos anteriores. Em algumas modalidades, a injeção periférica é a injeção intra-arterial, por exemplo, a injeção na artéria carótida de um indivíduo.
[0095] Em algumas modalidades, uma composição (por exemplo, uma composição compreendendo um ácido nucleico isolado ou um vetor ou um rAAV) como descrita na divulgação é administrada tanto periférica quanto diretamente ao CNS de um indivíduo. Por exemplo, em algumas modalidades, um indivíduo é administrado com uma com- posição por injeção intra-arterial (por exemplo, injeção na artéria caró- tida) e por injeção intraparenquimatosa (por exemplo, injeção intrapa-
renquimatosa por CED). Em algumas modalidades, a injeção direta no CNS e a injeção periférica são simultâneas (por exemplo, ocorrem ao mesmo tempo). Em algumas modalidades, a injeção direta ocorre an- tes (por exemplo, entre 1 minuto e 1 semana, ou mais anteriormente) da injeção periférica. Em algumas modalidades, a injeção direta ocorre após (por exemplo, entre 1 minuto e 1 semana, ou mais posterior) a injeção periférica.
[0096] A quantidade de composição (por exemplo, uma composi- ção que compreende um ácido nucleico isolado ou um vetor ou um rAAV) como descrita pela divulgação administrada a um indivíduo irá variar dependendo do método de administração. Por exemplo, em al- gumas modalidades, um rAAV, como aqui descrito, é administrado a um indivíduo com um título entre cerca de 10º cópias do genoma (GC)/kg e cerca de 10** GC kg (por exemplo, ao redor de 10º GC/kg, ao redor de 10*º GC/kg, ao redor de 10** GC/kg, ao redor de 10? GC/kg, ao redor de 10º"? GC/kg ou ao redor de 10** GC/kg). Em algu- mas modalidades, um indivíduo recebe um título elevado (por exem- plo, > 10º? cópias de genoma GC/kg de um rAAV) através da injeção no espaço de CSF ou através da injeção intraparenquimatosa.
[0097] Uma composição (por exemplo, uma composição que com- preende um ácido nucleico isolado ou um vetor ou um rAAV) como descrita na divulgação pode ser administrada a um indivíduo uma ou várias vezes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 20 ou mais) vezes. Em algumas modalidades, uma composição é administrada a um indi- víduo continuamente (por exemplo, cronicamente), por exemplo, atra- vés de uma bomba de infusão.
EXEMPLOS Exemplo 1: Vetores do rAAV
[0098] Os vetores do AAV são gerados utilizando células, tais co- mo células HEK293, para transfecção de plasmídeo triplo. As sequên-
cias de ITR ladeiam uma construção de expressão compreendendo um elemento promotor/intensificador para cada transgene de interes- se, um sinal 3' poliA e sinais pós-translacionais tais como o elemento WPRE. Múltiplos produtos gênicos podem ser expressos simultanea- mente tais como GBA1 e um ou mais ácidos nucléicos inibidores (por exemplo, ácidos nucléicos inibidores que direcionam o SCNA), por exemplo, através da expressão com 2 cassetes de expressão separa- dos. A presença de uma sequência intrônica curta que é eficientemen- te unida, a montante do gene expresso, pode melhorar os níveis de expressão. ShRNAs e outros RNAs reguladores podem ser potencial- mente incluídos nessas sequências. Exemplos de construções de ex- pressão descritos pela presente invenção são mostrados nas FIGs. 1 a 13e 18 a 24, e na Tabela 2 abaixo. Tabela 2 Nome Promo- | shR- CDS | PoliA1 Elemento tor 1 NA 1 bicistrôni- a A e memêmnt Sr MRNAiaSyn GBA1 WPRE bGH 40 1 H O4nt PrevailVector X1 SNCA CMVe + SNC | WPRE bG sl A Tabela 2-continuação- Nome Promo- | CDS2 PoliA2 | Comprimento PrevailVector O CMVe CBAp - - - 4004 MRNAiaSyn GBA1 WPRE bGH [pesmen a snes — 1 1 Exemplo 2: Ensaios baseados na célula de transdução viral em células deficientes de GBA
[0099] As células deficientes de GBA1 são obtidas, por exemplo,
como fibroblastos de pacientes com GD, monócitos ou células hES ou células-tronco pluripotentes induzidas derivadas do paciente (iPSCs). Essas células acumulam substratos tais como glicosilceramida e glico- silfosfina (GluCer e GluSph). O tratamento de linhagens celulares cul- tivadas do tipo selvagem ou mutantes com inibidores de Gcase, tais como CBE, também é utilizado para obter células deficientes de GBA.
[00100] Utilizando esses modelos de células, os defeitos lisossômi- cos são quantificados em termos de acúmulo de agregados de proteí- nas, tais como a a-Sinucleína com um anticorpo para essa proteína ou fosfo-aSyn, seguido pela formação de imagem utilizando microscopia fluorescente. A formação de imagem de anormalidades lisossômicas por ICC para marcadores de proteína tais como LAMP1, LAMP?2, LIMP1, LIMP2, ou utilizando corantes tais como Lysotracker, ou pela captação através do compartimento endocítico de dextrano fluorescen- te ou outros marcadores, também é executada. A formação de ima- gem com relação ao acúmulo de marcador de autofagia devido à fusão defeituosa com o lisossomo, tal como para LC3, também pode ser executada. Western blotting e/ou ELISA são utilizados para quantificar o acúmulo anormal desses marcadores. Da mesma forma, o acúmulo de substratos de glicolipídio e produtos de GBA1 é medido utilizando abordagens padrão.
[00101] Os desfechos terapêuticos (por exemplo, redução da pato- logia associada à PD) são medidos no contexto da expressão da transdução dos vetores do AAV, para confirmar e quantificar a ativida- de e função. A Gcase também pode ser quantificada utilizando medi- das de ELISA de proteínas ou através dos ensaios padrão de atividade de Gcase. Exemplo 3: Ensaios in vivo utilizando camundongos mutantes
[00102] Este exemplo descreve ensaios in vivo de vetores do AAV utilizando camundongos mutantes. Estudos in vivo de vetores do AAV como acima em camundongos mutantes são executados utilizando os ensaios descritos, por exemplo, em Liou et al. (2006) J. Biol. Chem. 281(7): 4242-4253, Sun et al. (2005) J. Lipid Res. 46:2102-2113 e Farfel-Becker et al. (2011) Dis. Model Mech. 4(6):746-—752.
[00103] A liberação intratecal ou intraventricular de controle de veí- culo e vetores do AAV (por exemplo, em uma dose de 2 x 10"! vg/camundongo) é executada utilizando matérias-primas concentradas de AAV, por exemplo, em um volume de injeção entre 5 e 10 ul. A libe- ração intraparenquimatosa por convecção é executada.
[00104] O tratamento é iniciado antes do início dos sintomas ou subsequente ao início. Os desfechos medidos são o acúmulo de subs- trato no CNS e CSF, o acúmulo da enzima Gcase por ELISA e da ati- vidade enzimática, desfechos motores e cognitivos, disfunção lisossô- mica e acúmulo de monômeros de a-Sinucleína, protofibrilas ou fibri- las. Exemplo 4: Modelos químicos de doença
[00105] Este exemplo descreve ensaios in vivo de vetores do AAV utilizando um modelo de camundongo induzido quimicamente da do- ença de Gaucher (por exemplo, o modelo de camundongo CBE). Os estudos in vivo desses vetores do AAV são executados em um modelo de camundongo induzido quimicamente da doença de Gaucher, por exemplo, como descrito em Vardi et a/. (2016) J Pathol. 239(4):496-
509.
[00106] A liberação intratecal ou intraventricular de controle de veí- culo e vetores do AAV (por exemplo, na dose de 2 x 10*' vg/camun- dongo) é executada utilizando matérias-primas concentradas de AAV, por exemplo, com volume de injeção entre 5 e 10 ul. A liberação intra- parenquimatosa através da liberação intensificada por convecção é executada. A liberação periférica é obtida por injeção da veia da cau- da.
[00107] O tratamento é iniciado antes do início dos sintomas ou subsequente ao início. Os desfechos medidos são o acúmulo de subs- trato no CNS e CSF, o acúmulo da enzima Gcase por ELISA e da ati- vidade enzimática, desfechos motores e cognitivos, disfunção lisossô- mica e acúmulo de monômeros de a-Sinucleína, protofibrilas ou fibri- las. Exemplo 5: Ensaios clínicos em pacientes com PD, LBD, doença de Gaucher
[00108] Em algumas modalidades, pacientes tendo certas formas de doença de Gaucher (por exemplo, GD1) possuem um risco aumen- tado de desenvolver doença de Parkinson (PD) ou demência do corpo de Lewy (LBD). Este exemplo descreve ensaios clínicos para avaliar a segurança e eficácia dos rAAVs conforme descrito pela presente in- venção, em pacientes tendo doença de Gaucher, PD e/ou LBD.
[00109] Os ensaios clínicos desses vetores para o tratamento da doença de Gaucher, PD e/ou LBD são executados utilizando um proje- to de estudo semelhante àquele descrito em Grabowski et al. (1995) Ann. Intern. Med. 122(1):33-39. Exemplo 6: Tratamento de doenças periféricas
[00110] Em algumas modalidades, pacientes tendo certas formas de doença de Gaucher apresentam sintomas de neuropatia periférica, por exemplo, como descrito em Biegstraaten et al. (2010) Brain 133 (10):2909—2919.
[00111] Este exemplo descreve ensaios in vivo de vetores do AAV como descrito nesta invenção para o tratamento de neuropatia perifé- rica associada com a doença de Gaucher (por exemplo, doença de Gaucher tipo 1). Resumidamente, pacientes com doença de Gaucher tipo 1 identificados como tendo sinais ou sintomas de neuropatia peri- férica são administrados com um rAAV conforme descrito pela presen- te invenção. Em algumas modalidades, os sinais e sintomas neuropá-
ticos periféricos do indivíduo são monitorados, por exemplo, utilizando métodos descritos em Biegstraaten et a/., após a administração do rA- AV.
[00112] Os níveis de produtos gênicos transferidos, conforme des- crito na presente invenção em pacientes (por exemplo, no soro de um paciente, em tecido periférico (por exemplo, tecido hepático, tecido do baço, etc.)) de um paciente são analisados, por exemplo, através da análise Western blot, ensaios funcionais enzimáticos ou estudos de formação de imagem. Exemplo 7: Tratamento das formas do CNS
[00113] Este exemplo descreve ensaios in vivo de rAAVs como descrito nesta invenção para o tratamento de formas do CNS da doen- ça de Gaucher. Resumidamente, pacientes com doença de Gaucher identificados como tendo uma forma de doença de Gaucher no CNS (por exemplo, doença de Gaucher tipo 2 ou tipo 3) são administrados com um rAAV como descrito na presente invenção. Os níveis de pro- dutos gênicos transferidos conforme descrito na presente invenção no CNS de pacientes (por exemplo, no soro do CNS de um paciente, no líquido cérebro-espinhal (LCR) de um paciente ou no tecido do CNS de um paciente) são analisados, por exemplo, através da análise Wes- tern blot, ensaios funcionais enzimáticos ou estudos de formação de imagem. Exemplo 8: Teste de Construções de SshRNA de SCNA e TMEM106B Células HEK293
[00114] A linhagem celular 293 de rim embrionário humano (HEK293) foi utilizada neste estudo (ft85120602, Sigma-Aldrich). As célu- las HEK293 foram mantidas em meio de cultura (D-MEM [t11995065, Thermo Fisher Scientific] suplementado com soro fetal bovino a 10% [FBS] [410082147, Thermo Fisher Scientific]) contendo 100 unida- des/ml de penicilina e 100 pug/ml de estreptomicina (%15140122, Ther-
mo Fisher Scientific). Transfecção de plasmídeo
[00115] A transfecção do plasmídeo foi executada utilizando o rea- gente de transfecção Lipofectamine 2000 (ftt11668019, Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células HEK293 (tt12022001, Sigma-Aldrich) foram plaqueadas na densidade de 3 x 10º células/ml em meio de cultura sem antibióticos. No dia seguinte, o plasmídeo e o reagente Lipofectamine 2000 foram combinados na solução Opti-MEM (t31985062, Thermo Fisher Scienti- fic). Após 5 minutos, as misturas foram adicionadas à cultura de HEK293. Após 72 horas, as células foram colhidas para extração de RNA ou proteína ou submetidas às análises de formação de imagem. Para as análises de formação de imagem, as placas foram pré- revestidas com solução de poli-L-lisina a 0,01% (P8920, Sigma- Aldrich) antes do plaqueamento das células. Análise de expressão do gene através da PCR quantitativa em tempo real (GRT-PCR)
[00116] Os níveis relativos de expressão do gene foram determina- dos através da PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) utilizando o Power SYBR Green Cells-to-CT Kit (H4402955, Thermo Fisher Sci- entific) de acordo com as instruções do fabricante. Os plasmídeos candidatos foram transfectados transitoriamente para células HEK293 plaqueadas em placas de 48 cavidades (7,5 x 10º células/cavidade) utilizando reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (0,5 ug de plasmídeo e 1,5 ul de reagente em 50 ul de solução Opti-MEM). Após 72 horas, o RNA foi extraído das células e utilizado para a transcrição reversa para sintetizar o CDNA de acordo com as instruções do fabri- cante. Para análise quantitativa da PCR, 2-5 ul de produtos de CDONA foram amplificados em duplicatas utilizando pares de iniciadores espe- cíficos do gene (concentração final de 250 nM) com Power SYBR
Green PCR Master Mix (tt4367659, Thermo Fisher Scientific). As se- quências iniciadoras para os genes de SNCA, TMEM106B e GAPDH foram: 5- AAG AGG GTG TTC TCT ATG TAG GC -3' (SEQ ID NO: 64), 5- GCT CCT CCA ACA TTT GTC ACT T -3' (SEQ ID NO: 65) pa- ra SNCA, 5-ACA CAG TAC CTA CCG TTA TAG CA-3' (SEQ ID NO: 66), 5-TGT TGT CAC AGT AAC TTG CAT CA-3' (SEQ ID NO: 67) pa- ra TMEM106B, e 5- CTG GGC TAC ACT GAG CAC C -3' (SEQ ID NO: 68), 5- AAG TGG TCG TTG AGG GCA ATG -3' (SEQ ID NO: 69) para GAPDH. A PCR quantitativa foi executada em um sistema de PCR em tempo real QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific). Os ní- veis de expressão foram normalizados pelo gene não destrutivo de GAPDH e calculados utilizando o método comparativo de CT.
Análise de Formação de Imagem por Fluorescência
[00117] Os plasmídeos repórter de EGFP, que contêm 3'-UTR do gene de SNCA humano na jusante da região de codificação de EGFP, foram utilizados para a validação dos plasmídeos de inativação de SNCA e TMEM106B. Os plasmídeos repórteres de EGFP e os plasmí- deos de inativação de candidatos foram simultaneamente transfecta- dos para células HEK293 plaqueadas em placas de 96 cavidades re- vestidas com poli-L-lisina (3,0 x 10º células/reservatório) utilizando o reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (0,04 ug de plasmídeo repórter, 0,06 ug de plasmídeo de inativação e 0,3 ul de reagente em ul de solução Opti-MEM). Após 72 horas, as intensidades fluores- centes do sinal de EGFP foram medidas na excitação 488 nm/emissão 512 nm utilizando a leitora multimodo Varioskan LUX (Thermo Fisher Scientific). As células foram fixadas com PFA a 4% na RT durante 10 minutos e incubadas com D-PBS contendo 7 pg/ml de 7-aminoactino- micina D (7-AAD) durante 30 min na RT. Após lavagem com D-PBS, as intensidades fluorescentes do sinal 7-AAD foram medidas na exci- tação 546 nm/emissão 647 nm utilizando a leitora Varioskan para quantificar o número de células. O sinal de EGFP normalizado por ní- veis de sinal de 7-AAD foi comparado com as amostras inativadas de controle. Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima (ELISA)
[00118] Os plasmídeos repórter a-Sinucleína, que contêm 3-UTR do gene de SNCA humano ou gene de TMEM106B a jusante da região de codificação de SNCA, foram utilizados para a validação de plasmí- deos de inativação no nível da proteína. Os níveis de proteína a- Sinucleína foram determinados por ELISA (HtKHBO0061, Thermo Fisher Scientific) utilizando os lisados extraídos das células HEK293. Os plasmídeos candidatos foram transfectados transitoriamente em célu- las HEK293 plaqueadas em placas de 48 cavidades (7,5 x 10º célu- las/cavidade) utilizando reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (0,1 ug de plasmídeo repórter, 0,15 ug de plasmídeo de inativação e 0,75 ul de reagente em 25 ul de solução Opti-MEM). Após 72 horas, as células foram submetidas à lise no tampão de ensaio de radioimuno- precipitação (RIPA) (f89900, Thermo Fisher Scientific) suplementado com coquetel de inibidor de protease (%P8340, Sigma-Aldrich) e sub- metidas à vibração ultrassônica durante alguns segundos. Após a in- cubação em gelo durante 30 min, os lisados foram centrifugados em
20.000 ug a 4 ºC durante 15 min e o sobrenadante foi coletado. Os níveis de proteína foram quantificados. As placas foram lidas em uma leitora de placas Varioskan em 450 nm e as concentrações foram cal- culadas utilizando o software SoftMax Pro 5. As concentrações de pro- teina medidas foram normalizadas para a concentração total de prote- ína determinada com um ensaio de ácido bicinconínico (*%423225, Thermo Fisher Scientific).
[00119] AFIG.14e Tabela 3 mostram dados representativos indi- cando o silenciamento bem-sucedido de SCNA in vitro pelo ensaio re- pórter GFP (parte superior) e ensaio a-Syn (parte inferior). A FIG. 15 e
Tabela 4 mostram dados representativos indicando o silenciamento bem-sucedido de TMEM106B in vitro pelo ensaio repórter GFP (parte superior) e ensaio a-Syn (parte inferior). Tabela 3 [9 rena Tamo — rancor Tsmemannis | Tabela 4 [9 remar resto — Tronsor [semen | 100011 | JL intrônico | TMEM mi JetLong Exemplo 9: Colocação da sequência "D" de ITR e transdução ce- lular
[00120] O efeito da colocação da sequência "D" de ITR na transdu- ção celular de vetores do rAAV foi investigado. As células HEK293 fo- ram transferidas com rAAVs que codificam a Gcase tendo 1) ITRs do tipo selvagem (por exemplo, sequências "D" próximas à inserção do transgene e distais ao terminal da ITR) ou 2) ITRs com a sequência "D" localizada na "parte externa" do vetor (por exemplo, sequência "D" localizada próxima ao terminal da ITR e distal à inserção do transge- ne), como mostrado na FIG. 20. Surpreendentemente, os dados indi- cam que os rAAVs tendo a sequência "D" localizada na posição "ex- terna" mantêm a capacidade de serem acondicionados e transferir cé- lulas com eficiência (FIG. 17).
EQUIVALENTES
[00121] Este Pedido incorpora por referência os conteúdos dos se- guintes documentos na sua totalidade: o Pedido Internacional PCT re- ferido pelo Doc. de Procuração Número P1094.70002WO00, deposita- do em 3 de outubro de 2018; Pedido Internacional PCT referido pelo Doc. de Procuração Número P1094.70003WO00, depositado em 3 de outubro de 2018; Pedidos Provisórios Números de Série 62/567.296, depositado em 3 de outubro de 2017, intitulado "GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS"; 62/567.311, depositado em 3 de outubro de 2017, intitulado “GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS”; 62/567.319, depositado em 3 de outubro de 2017, intitu- lado “GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS”; 62/567.301, depositado em 3 de outubro de 2018, intitulado “GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS”; 62/567.310, depositado em 3 de outubro de 2017, intitulado “GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS”; 62/567.303, depositado em 3 de outubro de 2017, inti- tulado "GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS"; e 62/567.305, depositado em 3 de outubro de 2017, intitulado "GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS".
[00122] Tendo assim descrito os vários aspectos de pelo menos uma modalidade desta invenção, deve ser observado que várias alte- rações, modificações e melhoras ocorrerão facilmente para aqueles versados na técnica. Tais alterações, modificações e melhoras se des-
tinam a fazer parte desta divulgação e se destinam a estar dentro do espírito e escopo da invenção. Em conformidade, a descrição anterior e os desenhos são apenas a título de exemplo.
[00123] Embora várias modalidades da presente invenção tenham sido aqui descritas e ilustradas, aqueles de habilidade prática na técni- ca visualizarão facilmente uma variedade de outros meios e/ou estru- turas para a execução das funções e/ou obter os resultados e/ou uma ou mais das vantagens aqui descritas e cada uma dessas variações e/ou modificações é considerada de estar dentro do escopo da presen- te invenção. De um modo mais geral, aqueles versados na técnica irão observar facilmente que todos os parâmetros, dimensões, materiais e configurações descritos nesta invenção devem ser exemplares e que os parâmetros, dimensões, materiais e/ou configurações reais depen- derão da aplicação ou aplicações específicas para os quais os ensi- namentos da presente invenção são utilizados. Aqueles versados na técnica irão reconhecer, ou serão capazes de verificar, utilizando não mais do que a experimentação de rotina, muitos equivalentes às mo- dalidades específicas da invenção aqui descritas. Deve, portanto, ficar entendido que as modalidades anteriores são apresentadas apenas a título de exemplo e que, dentro do escopo das reivindicações anexas e equivalentes, a invenção pode ser praticada de outra forma que não como especificamente descrito e reivindicado. A presente invenção é direcionada a cada característica, sistema, artigo, material e/ou méto- do individual aqui descrito. Além disso, qualquer combinação de dois ou mais de tais características, sistemas, artigos, materiais e/ou méto- dos, se tais características, sistemas, artigos, materiais e/ou métodos não forem mutuamente inconsistentes, está incluída no escopo da presente invenção.
[00124] Os artigos indefinidos "um" e "uma", conforme aqui utiliza- dos no relatório descritivo e nas reivindicações, a menos que clara-
mente indicado o contrário, devem ser entendidos de significar "pelo menos um".
[00125] A frase "e/ou" conforme utilizada nesta invenção no relató- rio descritivo e nas reivindicações deve ser entendida de significar "ca- da um ou ambos" dos elementos combinados, isto é, elementos que estão conjuntamente presentes em alguns casos e disjuntivamente presentes em outros casos. Outros elementos podem opcionalmente estar presentes, além dos elementos especificamente identificados pela cláusula “e/ou”, relacionados ou não a esses elementos especifi- camente identificados, a menos que claramente indicado o contrário. Assim, como um exemplo não limitativo, uma referência a "A e/ou B", quando utilizada em conjunto com linguagem aberta tal como "com- preendendo", pode se referir, em uma modalidade, a A sem B (opcio- nalmente incluindo elementos diferentes de B); em outra modalidade, a B sem A (opcionalmente incluindo elementos diferentes de A); em mais outra modalidade, a ambos A e B (incluindo opcionalmente ou- tros elementos); etc.
[00126] Conforme aqui utilizado no relatório descritivo e nas reivin- dicações, "ou" deve ser entendido de ter o mesmo significado que "e/ou" como definido acima. Por exemplo, ao separar itens em uma lista, "ou" ou "e/ou" devem ser interpretados como sendo inclusivos, isto é, a inclusão de pelo menos um, mas também incluindo mais do que um, de um número ou lista de elementos, e, opcionalmente, itens não listados adicionais. Somente termos claramente indicados ao con- trário, tais como “apenas um de” ou “exatamente um de” ou, quando utilizados nas reivindicações, “consistindo em”, irão se referir à inclu- são de exatamente um elemento de um número ou lista de elementos. Em geral, o termo "ou" conforme usado nesta invenção, deve ser ape- nas interpretado como indicando alternativas exclusivas (isto é, "um ou outro, mas não ambos") quando precedido por termos de exclusivida-
de, tais como "cada um", "um de", "apenas um de" ou "exatamente um de". "Consistindo essencialmente em" quando utilizado nas reivindica- ções, terá seu significado comum conforme utilizado no campo do di- reito de patentes.
[00127] Conforme aqui utilizado no relatório descritivo e nas reivin- dicações, a frase "pelo menos um", em referência a uma lista de um ou mais elementos, deve ser compreendida de significar pelo menos um elemento selecionado de qualquer um ou mais dos elementos no lista de elementos, mas não necessariamente incluindo pelo menos um de cada um e todos os elementos listados especificamente na lista de elementos e não excluindo quaisquer combinações de elementos na lista de elementos. Essa definição também permite que os elementos possam opcionalmente estar presentes além dos elementos especifi- camente identificados dentro da lista de elementos em que a frase "pe- lo menos um" se refere, relacionada ou não a esses elementos especi- ficamente identificados. Assim, como um exemplo não limitativo, "pelo menos um de A e B" (ou, equivalentemente, "pelo menos um de A ou B" ou, equivalentemente, "pelo menos um de A e/ou B") pode se refe- rir, em uma modalidade, a pelo menos um, incluindo opcionalmente mais de um, A, sem B presente (e opcionalmente incluindo elementos diferentes de B); em outra modalidade, a pelo menos um, opcional- mente mais do que um, B, sem A presente (e opcionalmente incluindo elementos diferentes de A); em mais outra modalidade, a pelo menos um, opcionalmente incluindo mais do que um, A, e pelo menos um, opcionalmente incluindo mais do que um, B (e opcionalmente incluindo outros elementos); etc.
[00128] Nas reivindicações, assim como no relatório descritivo aci- ma, todas as frases de transição, tais como "compreendendo", "incluin- do", "transportando", "tendo", "contendo", "envolvendo", "retendo" e se- melhantes, devem ser entendidas como abertas, isto é, significam in-
cluindo, mas não limitadas a esta. Somente as frases transitórias “con- sistindo em” e “consistindo essencialmente em” devem ser frases tran- sitórias fechadas ou semifechadas, respectivamente, conforme apre- sentado no United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03.
[00129] O uso de termos ordinais tais como "primeiro", "segundo", "terceiro", etc. nas reivindicações para modificar um elemento reivindi- cado, por si só, não implica nenhuma prioridade, precedência ou or- dem de um elemento reivindicado sobre outro ou a ordem temporal na qual os atos de um método são executados, mas são utilizados ape- nas como marcações para distinguir um elemento reivindicado tendo um determinado nome de outro elemento tendo o mesmo nome (mas para uso do termo ordinal) para distinguir os elementos reivindicados.
[00130] Também deve ficar entendido que, a menos que seja cla- ramente indicado o contrário, em qualquer método aqui reivindicado que inclua mais do que uma etapa ou ato, a ordem das etapas ou atos do método não é necessariamente limitada à ordem na qual as etapas ou atos do método são recitados.
SEQUÊNCIAS
[00131] Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado, vetor do rAAV ou cassete de expressão do gene que codifica um ou mais produtos gênicos (por exemplo, um primeiro, segundo e/ou terceiro produto gênico) compreende ou consiste em (ou codifica um polipeptí- deo tendo) uma sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 69. Em algumas modalidades, um produto gênico é codifica- do por uma parte (por exemplo, fragmento) de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 69.

Claims (33)

REIVINDICAÇÕES
1. Ácido nucleico isolado compreendendo uma construção de expressão que codifica um ácido nucleico inibidor que inibe a ex- pressão ou a atividade de a-Syn ladeada por repetições terminais in- vertidas do AAV (ITRs), caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das ITRs compreende uma sequência "D" modificada em relação a uma ITR de AAV?2 do tipo selvagem (SEQ ID NO: 16).
2. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico inibidor é complemen- tar a pelo menos seis nucleotídeos contíguos da sequência apresenta- da na SEQ ID NO: 1.
3. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico inibidor é um RNA inibidor que compreende a sequência de ácido nucleico apresen- tada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 3 a 8 ou 7 a 12.
4. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico inibidor compreende a sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 17 a 22.
5. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a região "D" modi- ficada é uma sequência "D" localizada na parte externa da ITR em re- lação à construção de expressão.
6. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a ITR que com- preende a sequência "D" modificada é uma 3' ITR.
7. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreendendo uma construção de expressão que codifica um ácido nucleico inibidor que inibe a expressão ou a atividade do TMEM106B ladeada por repetições terminais invertidas do AAV (ITRs), em que pe-
lo menos um das ITRs compreende uma sequência "D" modificada em relação a uma ITR de AAV?2 do tipo selvagem (SEQ ID NO: 16).
8. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico inibidor é complemen- tar a pelo menos seis nucleotídeos contíguos da sequência apresenta- da na SEQ ID NO: 2.
9. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico inibidor é um RNA inibidor que compreende a sequência de ácido nucleico apresen- tada na SEQ ID NO: 9 ou 10.
10. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o ácido nu- cleico inibidor compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 11 ou 12.
11. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que a região "D" modificada é uma sequência "D" localizada na parte externa da ITR em relação à construção de expressão.
12. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que a ITR com- preendendo a sequência "D" modificada é uma 3' ITR.
13. Ácido nucleico isolado compreendendo uma construção de expressão que codifica um primeiro produto gênico e um segundo produto gênico, caracterizado pelo fato de que cada produto gênico é independentemente selecionado dos produtos gênicos, ou suas par- tes, apresentados na Tabela 1.
14. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o primeiro produto gênico é uma proteína Gcase, ou uma porção desta.
15. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação
13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o segundo produto gênico é um ácido nucleico inibidor que direciona o SNCA.
16. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico interferente é um SIRNA, sShRNA, miRNA ou dsRNA, opcionalmente em que o ácido nu- cleico interferente inibe a expressão da proteína a-Syn.
17. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que ainda com- preende um ou mais promotores, opcionalmente em que cada um dos um ou mais promotores é independentemente um promotor de beta actina de galinha (CBA), um promotor CAG, um promotor CD68 ou um promotor JeT.
18. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizado pelo fato de que ainda com- preende um sítio de entrada ribossômico interno (IRES), opcionalmen- te em que o IRES está localizado entre o primeiro produto gênico e o segundo produto gênico.
19. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18, caracterizado pelo fato de que ainda com- preende uma sequência de codificação de peptídeo de autoclivagem, opcionalmente em que o peptídeo de autoclivagem é T2A.
20. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a construção de expressão compreende duas sequências de repetição terminal in- vertida (ITR) do vírus adeno-associado (AAV) que ladeiam o primeiro produto gênico e o segundo produto gênico.
21. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que possui a se- quência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 12 e 17 a 35.
22. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico isolado como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 21.
23. Vetor de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o vetor é um plasmídeo.
24. Vetor de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral, opcionalmente em que o ve- tor viral é um vetor de AAV recombinante (rAAV) ou um vetor de Bacu- lovírus.
25. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de o ácido nucleico isolado como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 21 ou o vetor como definido em qualquer uma das rei- vindicações 22 a 24.
26. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o ácido nucleico isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21 ou o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 24.
27. Vírus adeno-associado recombinante (rAAV) caracteri- zado pelo fato de que compreende: (i) uma proteína do capsídeo; e (ii) o ácido nucleico isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, ou o vetor como definido na reivindicação
22.
28. rAAV de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a proteína do capsídeo é capaz de atravessar a bar- reira hematoencefálica, opcionalmente em que a proteína do capsídeo é uma proteína do capsídeo do AAV9 ou uma proteína do capsídeo do AAVrh.10.
29. rAAV de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracte- rizado pelo fato de que o rAAV transfere células neuronais e células não neuronais do sistema nervoso central (CNS).
30. Método para o tratamento de um indivíduo tendo ou com suspeita de ter a doença de Parkinson, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração ao indivíduo de um ácido nucleico isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, do vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 24, da composição como definida na reivindicação 25, ou do rAAV como definido em qualquer uma das reivindicações 26 a 29.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- do pelo fato de que a administração compreende a injeção direta no CNS do indivíduo, opcionalmente em que a injeção direta é injeção intracerebral, injeção intraparenquimatosa, injeção intratecal, injeção intracisterna magna ou qualquer combinação destas.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracteriza- do pelo fato de que a injeção direta no CNS do indivíduo compreende a liberação intensificada por convecção (CED).
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 32, caracterizado pelo fato de que a administração compre- ende injeção periférica, opcionalmente em que a injeção periférica é injeção intravenosa.
BR112020006671-0A 2017-10-03 2018-10-03 terapias genéticas para distúrbios lisossômicos BR112020006671A2 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762567303P 2017-10-03 2017-10-03
US201762567305P 2017-10-03 2017-10-03
US62/567,303 2017-10-03
US2/567,305 2017-10-03
PCT/US2018/054223 WO2019070891A1 (en) 2017-10-03 2018-10-03 GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020006671A2 true BR112020006671A2 (pt) 2020-12-01

Family

ID=65995011

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020006671-0A BR112020006671A2 (pt) 2017-10-03 2018-10-03 terapias genéticas para distúrbios lisossômicos

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11807849B2 (pt)
EP (1) EP3692151A4 (pt)
JP (4) JP2020537542A (pt)
KR (2) KR20200078513A (pt)
CN (2) CN111465691A (pt)
AU (3) AU2018346102B2 (pt)
BR (1) BR112020006671A2 (pt)
CA (1) CA3078501A1 (pt)
IL (2) IL273768A (pt)
MX (2) MX2020004005A (pt)
WO (1) WO2019070891A1 (pt)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019070894A1 (en) 2017-10-03 2019-04-11 Prevail Therapeutics, Inc. GENE THERAPIES FOR LYSOSOMIAL DISORDERS
EP3692151A4 (en) 2017-10-03 2021-07-14 Prevail Therapeutics, Inc. GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS
MX2020003557A (es) 2017-10-03 2020-10-07 Prevail Therapeutics Inc Terapias genicas para los trastornos lisosomales.
KR20220006527A (ko) 2019-04-10 2022-01-17 프리베일 테라퓨틱스, 인크. 리소좀 장애에 대한 유전자 요법
EP3953377A1 (en) 2019-04-10 2022-02-16 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
WO2021030522A1 (en) * 2019-08-13 2021-02-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SMALL RIBOSOMAL PROTEIN SUBUNIT 25 (RPS25) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
US20230346979A1 (en) 2020-08-10 2023-11-02 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for neurodegenerative disorders
US20230310654A1 (en) 2020-08-10 2023-10-05 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
KR20230088393A (ko) 2020-10-15 2023-06-19 프리베일 테라퓨틱스, 인크. 재조합 아데노 연관 바이러스 조성물 및 이의 제조 방법
AU2021361063A1 (en) 2020-10-15 2023-06-08 Prevail Therapeutics, Inc. Assay for measuring potency of gene therapy drug product
JP2024523445A (ja) * 2021-06-21 2024-06-28 ユニキュアー バイオファーマ ビー．ブイ． α－シヌクレインをサイレンシングするための遺伝子構築物及びその使用
AU2022301044A1 (en) * 2021-06-28 2023-12-21 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions for tau reduction gene therapy
CN113846122B (zh) * 2021-08-16 2023-08-25 中国医学科学院医学生物学研究所 一种过表达snca的腺相关病毒载体aav-snca、制备方法及其应用
WO2023178338A2 (en) * 2022-03-18 2023-09-21 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Methods and compositions for treating tmem43 related cardiomyopathy with a viral vector

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5879680A (en) 1987-12-23 1999-03-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cloned DNA for synthesizing unique glucocerebrosidase
WO1998009524A1 (en) * 1996-09-06 1998-03-12 Chiron Corporation Methods and compositions for liver specific delivery of therapeutic molecules using recombinant aav vectors
WO2000014113A2 (en) 1998-09-09 2000-03-16 Myelos Corporation Method of stimulating prosaposin receptor activity
EP1121429A2 (en) 1998-10-16 2001-08-08 Introgene B.V. Gene therapy of alzheimer's disease by delivery of an encoded apolipoprotein e
CA2348382C (en) 1998-11-10 2013-09-17 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric parvovirus vectors and methods of making and administering the same
US6696272B1 (en) 1999-06-02 2004-02-24 Hsc Research & Development Limited Partnership Products and methods for gaucher disease therapy
MXPA02009804A (es) 2000-04-06 2003-07-14 Kos Pharma Inc Compuestos y metodos para reducir los niveles de colesterol sin inducir hipertrigliveridemia.
GB0009887D0 (en) * 2000-04-20 2000-06-07 Btg Int Ltd Cytotoxic agents
CA2406743A1 (en) 2000-04-28 2001-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
WO2002024932A2 (en) 2000-09-18 2002-03-28 Genzyme Corporation Expression vectors containing hybrid ubiquitin promoters
US7232670B2 (en) 2001-09-28 2007-06-19 St. Jude Children's Research Hospital Targeting proteins to cells expressing mannose receptors via expression in insect cells
PL222683B1 (pl) * 2001-11-13 2016-08-31 Univ Pennsylvania Rekombinowane wirusy stowarzyszone z adenowirusem (AAV), sposoby ich wytwarzania, pakująca komórka gospodarza, kompozycja zawierająca wirus, zastosowanie wirusa, wyizolowane wirusy AAV, białka,sztuczne białka kapsydu, cząsteczki, komórki gospodarza, sposoby dostarczania transgenu, sposób identyfikacji serotypu, zestaw diagnostyczny, sposób izolacji nowych wirusów, rekombinowana komórka
US20030133924A1 (en) 2001-12-21 2003-07-17 Novazyme Pharmaceuticals, Inc. Highly phosphorylated acid beta-glucocerebrosidase and methods of treating gaucher's disease
AU2003221733A1 (en) 2002-04-17 2003-11-03 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved raav vectors
EP3513814A1 (en) 2003-05-01 2019-07-24 Genzyme Corporation Gene therapy for neurometabolic disorders
WO2006036465A2 (en) 2004-09-03 2006-04-06 University Of Florida Compositions and methods for treating cystic fibrosis
DE602005015994D1 (de) 2004-09-29 2009-09-24 Childrens Memorial Hospital siRNA-VERMITTELTES GEN-SILENCING VON ALPHA-SYNUKLEIN
ES2485369T3 (es) 2005-06-08 2014-08-13 Amicus Therapeutics, Inc. Tratamiento de trastornos del SNC asociados con mutaciones en genes que codifican enzimas lisosómicas
GB0605337D0 (en) * 2006-03-17 2006-04-26 Genomica Sau Treatment of CNS conditions
JP5123936B2 (ja) 2006-05-30 2013-01-23 メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ 認知症の検出および治療
DK2037948T3 (en) 2006-05-30 2016-08-01 Mayo Foundation Detection and treatment of dementia
SI2029742T1 (sl) 2006-06-07 2016-11-30 Genzyme Corporation Genska terapija amiotrofične lateralne skleroze in drugih motenj hrbtenjače
US20080249058A1 (en) * 2007-04-05 2008-10-09 Erik Roberson Agents that reduce neuronal overexcitation
US8962273B2 (en) 2007-05-11 2015-02-24 Genzyme Corporation Methods of producing a secreted protein
EP3000320B1 (en) 2007-05-16 2019-01-16 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Treatment of synucleinopathies
US20090176729A1 (en) * 2007-12-14 2009-07-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method of treating neurodegenerative disease
EP3009143B1 (en) 2008-01-16 2018-10-03 Neurodyn Life Sciences Inc. Progranulin for use in treating parkinson's disease or alzheimer's disease
WO2009120978A2 (en) 2008-03-27 2009-10-01 The Ohio State University Treatment of metabolic-related disorders using hypothalamic gene transfer of bdnf and compositions therfor
CN107083400A (zh) 2009-05-02 2017-08-22 建新公司 神经退行性疾病的基因治疗
WO2010129791A1 (en) * 2009-05-06 2010-11-11 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Rna targeting in alpha-synucleinopathies
CA3049237C (en) * 2010-04-23 2024-06-11 University Of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
WO2012027558A2 (en) 2010-08-25 2012-03-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York OPTIMIZED miRNA CONSTRUCTS
WO2012027713A2 (en) * 2010-08-26 2012-03-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of snca
JP5704361B2 (ja) 2010-10-27 2015-04-22 学校法人自治医科大学 神経系細胞への遺伝子導入のためのアデノ随伴ウイルスビリオン
CN103491974A (zh) 2010-11-16 2014-01-01 神经机能生命科学公司 用于提高中性溶酶的表达与活性的方法
GB201103062D0 (en) * 2011-02-22 2011-04-06 Isis Innovation Method
EP3081568B1 (en) 2011-05-09 2019-11-13 Eip Pharma, LLC Compositions and methods for treating alzheimer's disease
EP2833923A4 (en) 2012-04-02 2016-02-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS
EP2850195B1 (en) 2012-05-18 2020-01-22 University of Iowa Research Foundation Methods and compositions for treating amyloid deposits
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
JP2016503405A (ja) 2012-11-05 2016-02-04 ジェンザイム・コーポレーション タンパク質症を処置するための組成物および方法
CN105431170B (zh) * 2013-04-08 2019-10-29 爱荷华大学研究基金会 嵌合腺相关病毒/博卡病毒细小病毒载体
BR112015028605A8 (pt) 2013-05-15 2019-12-24 Univ Minnesota uso de uma composição e uso de um imunossupressor e uma composição
US9347107B2 (en) 2013-05-23 2016-05-24 Norman Z Lai Vector containing multiple nucleotide sequences for the expression of enzymes
JP2016523980A (ja) 2013-07-11 2016-08-12 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク タウ発現を抑制するマイクロｒｎａ
US9574184B2 (en) 2013-09-25 2017-02-21 Children's Hospital Medical Center Lysosomal protein targeting sequence and therapeutic applications of same
US20160243260A1 (en) 2013-10-24 2016-08-25 Uniqure Ip B.V. Treatment of neurological diseases using adeno-associated virus (AAV) comprising AAV-5 capsid proteins
GB201403260D0 (en) * 2014-02-25 2014-04-09 Univ Manchester Treatment of retinal degeneration using gene therapy
EP3193942B1 (en) 2014-08-11 2020-03-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lysosomal targeting and uses thereof
BR112017009497A2 (pt) * 2014-11-05 2018-02-06 Voyager Therapeutics, Inc. polinucleotídeos de aadc para o tratamento da doença de parkinson
EP3221456B1 (en) 2014-11-21 2021-09-22 University of Florida Research Foundation, Inc. Genome-modified recombinant adeno-associated virus vectors
WO2016151523A1 (en) * 2015-03-25 2016-09-29 Università Degli Studi Di Trento Rna interference mediated therapy for neurodegenerative diseases
US20170035860A1 (en) 2015-04-02 2017-02-09 Alexander C. Flynn Compositions and methods for treatment of neurogenerative diseases
EP3285788A4 (en) 2015-04-23 2018-12-05 University of Massachusetts Modulation of aav vector transgene expression
EP3292206B8 (en) * 2015-05-07 2022-02-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Glucocerebrosidase gene therapy for parkinson's disease
EP3091087A1 (en) 2015-05-08 2016-11-09 Fundació Institut d'Investigació en Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol Method for in vitro diagnosis of synucleinopathies using alpha-synuclein gene transcripts
ES2901766T3 (es) 2015-05-15 2022-03-23 Regenxbio Inc Virus adenoasociado para el suministro terapéutico al sistema nervioso central
US20190055578A1 (en) 2015-10-29 2019-02-21 Voyager Therapeutics, Inc. Delivery of central nervous system targeting polynucleotides
US10548947B2 (en) 2015-11-05 2020-02-04 Bamboo Therapeutics, Inc. Modified Friedreich ataxia genes and vectors for gene therapy
WO2017136536A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 University Of Massachusetts Method to enhance the efficiency of systemic aav gene delivery to the central nervous system
HRP20231451T1 (hr) 2016-02-05 2024-03-01 Emory University Ubrizgavanje jednolančanog ili samo-komplementarnog adeno-povezanog virusa 9 u cerebrospinalnu tekućinu
US11066456B2 (en) 2016-02-25 2021-07-20 Washington University Compositions comprising TREM2 and methods of use thereof
EP3423109A4 (en) 2016-03-02 2019-08-14 The Children's Hospital of Philadelphia THERAPY FOR FRONTOTEMPORAL DEMENTIA
JP7221275B2 (ja) 2017-08-03 2023-02-13 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド Ａａｖを送達するための組成物および方法
EP3692151A4 (en) 2017-10-03 2021-07-14 Prevail Therapeutics, Inc. GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS
MX2020003557A (es) 2017-10-03 2020-10-07 Prevail Therapeutics Inc Terapias genicas para los trastornos lisosomales.
WO2019070894A1 (en) 2017-10-03 2019-04-11 Prevail Therapeutics, Inc. GENE THERAPIES FOR LYSOSOMIAL DISORDERS
US20200283800A1 (en) 2017-10-23 2020-09-10 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for neurodegenerative diseases
BR112020008033A2 (pt) * 2017-10-23 2020-10-27 Prevail Therapeutics, Inc. terapias gênicas para doença neurodegenerativa
AU2019388975A1 (en) 2018-11-28 2021-06-24 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for neurodegenerative disease
EP3953377A1 (en) 2019-04-10 2022-02-16 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
KR20220006527A (ko) 2019-04-10 2022-01-17 프리베일 테라퓨틱스, 인크. 리소좀 장애에 대한 유전자 요법
US20220211871A1 (en) 2019-04-10 2022-07-07 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
BR112021020157A2 (pt) 2019-04-10 2021-12-14 Prevail Therapeutics Inc Terapias gênicas para transtornos lisossomais

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018346102A1 (en) 2020-04-30
CN111465691A (zh) 2020-07-28
AU2018346102B2 (en) 2023-05-11
IL273768A (en) 2020-05-31
KR20220010062A (ko) 2022-01-25
EP3692151A1 (en) 2020-08-12
AU2023214366A1 (en) 2023-08-31
AU2018346102A2 (en) 2020-11-12
WO2019070891A1 (en) 2019-04-11
EP3692151A4 (en) 2021-07-14
CA3078501A1 (en) 2019-04-11
JP2024014935A (ja) 2024-02-01
US20200231970A1 (en) 2020-07-23
CN112501208A (zh) 2021-03-16
AU2020260476B2 (en) 2023-06-15
JP2020537542A (ja) 2020-12-24
JP2022060228A (ja) 2022-04-14
MX2020004005A (es) 2020-10-05
US20200318115A1 (en) 2020-10-08
MX2020011748A (es) 2021-01-08
WO2019070891A8 (en) 2019-05-09
AU2023214366B2 (en) 2023-10-12
IL279669A (en) 2021-03-01
JP2024037189A (ja) 2024-03-18
US11807849B2 (en) 2023-11-07
US12049626B2 (en) 2024-07-30
AU2020260476A1 (en) 2020-11-26
KR20200078513A (ko) 2020-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112020006671A2 (pt) terapias genéticas para distúrbios lisossômicos
JP7336730B2 (ja) ライソゾーム病の遺伝子治療
BR112020006633A2 (pt) terapias genéticas para distúrbios lisossômicos
BR112020008033A2 (pt) terapias gênicas para doença neurodegenerativa
AU2020272974A1 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
US20220211871A1 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
BR112021010234A2 (pt) Terapias de gene para doença neurodegenerativa
EP3952923A1 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
JP2022526823A (ja) リソソーム障害のための遺伝子療法

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]