BRPI0212919B1 - "muteínas da lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos humanos, proteínas relacionadas, composição farmacêutica, método para geração e uso das mesmas". - Google Patents

Abstract

"muteínas da lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos humanos e proteínas relacionadas". a presente invenção refere-se a um processo, que é descrito para gerar uma muteína de uma proteína selecionada do grupo que consiste da lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos humanos (hngal), da proteína relacionada à <244>~ 2~-microglobulina de rato (a2m) e da 24p3/uterocalina (24p3) de camundongos, a dita muteína possuindo afinidade detectável a um certo alvo. o processo compreende a etapa de submeter a proteína à mutagênese em uma ou mais das posições de seqüência que correspondem às posições de seqüência 33 até 54, 66 até 83, 94 até 106 e 123 até 136 da hngal, resultando em uma ou mais muteínas da proteína. são também descritas as muteínas que podem ser obtidas através deste processo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MUTEÍNAS DA LIPOCALINA ASSOCIADA À GELATINASE DE NEUTRÓFILOS HUMANOS, PROTEÍNAS RELACIONADAS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA GERAÇÃO E USO DAS MESMAS". A presente invenção refere-se a um método para gerar uma muteína da lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos humanos (hNGAL), a proteína de ratos relacionada à a2-microglobulina (A2m) ou a 24p3/uterocalina (24p3) de camundongos, em que esta muteína possui afinidade detectável a um certo alvo e a uma muteína de cada uma destas três proteínas que podem ser obtidas através deste método. A invenção refere-se ainda a ácidos nucléicos que codificam tais muteínas, uma composição farmacêutica que compreende uma muteína da invenção assim como a vários usos da muteína da lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos humanos, da proteína de ratos relacionada à a2-microglobulina (A2m) e da 24p3/uterocalina (24p3) de camundongos.

As lipocalinas (Pervaiz e Brew, FASEB J. 1 (1987), 209-214) são uma família de proteínas secretoras pequenas, freqüentemente monoméri-cas que foram isoladas de vários organismos e cujas funções fisiológicas consistem no armazenamento e no transporte de alvos diferentes, por exemplo retinol ou feromônios, assim como em funções biológicas mais complexas tais como o sabor e o olfato ou a síntese de prostaglandinas (revisado, por exemplo, por Flower, Biochem. J. 318 (1996), 1-14). As lipocalinas apresentam similaridade de seqüência mútua relativamente pequena e sua relação como uma família de proteínas estruturais foi elucidada pela primeira vez através da análise estrutural por raio X (Sawyer e outros, Nature 327 (1987), 659).

Os alvos típicos das lipocalinas são substâncias lipofílicas de baixo peso molecular tais como os retinóides, os ácidos graxos, os coleste-róis, as prostaglandinas, as biliverdinas, os feromônios, os agentes de sabor e os agentes de odor (Flower, Biochem. J. 318 (1996), 1-14; ver também Kjeldsen, Biochimica et Biophysica Acta, 1482 (2000), 272-283). Um alvo típico para as lipocalinas é a vitamina A no caso da proteína que se liga ao retinol (Rbp) assim como a β-lactoglobulina (Papiz e outros, Nature 324 (1986), 383-385).

Os anticorpos, isto é imunoglobulinas, são um exemplo clássico para as proteínas que se ligam seletivamente a alvos através de uma interação não covalente. Estas proteínas desempenham uma função crucial como reagentes nos campos da biotecnologia, da medicina, da bioanalítica assim como nas ciências biológicas e da vida em geral. Apesar das várias necessidades de proteínas de ligação em associação com o reconhecimento, a ligação ou a separação de ligantes/alvos, quase exclusivamente as imunoglobulinas são atualmente utilizadas para tais finalidades. A aplicação de outras proteínas com características definidas de ligante-ligação, por exemplo as lectinas, permaneceu restrita a casos especiais.

Recentemente, os membros da família da lipocalina se tomaram-se o assunto de pesquisa em relação a proteínas que possuem propriedades definidas de ligação ao ligante. A Offenlegungsschrift Alemã DE 197 42 706 e a publicação de patente internacional WO 99/16873 descrevem a classe das anticalinas®; polipeptídeos que exibem, como os anticorpos, características de ligação específicas para um certo ligante (conforme também Beste e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96 (1999) 1898-1903). As anticalinas® podem ser obtidas partindo de polipeptídeos da família das lipocalinas que sofrem mutação nos quatro segmentos que correspondem às posições de sequência da seqüência de polipeptídeo que compreende as posições de ami-noácidos 28 até 45, 58 até 69, 86 até 99 e 114 até 129 da proteína de ligação com a Bílina (Bbp).

Em adição, a patente Alemã DE 199 26 068, o WO 00/75308 assim como Schlehuber e outros, J. Mol. Biol. (2000), 1105-1120, descrevem as muteínas da proteína que se liga à Bilina tais como as muteínas DigA e DígA16 que se ligam especificamente à digoxigenina.

Embora a tecnologia da anticalina® tenha sido a princípio estabelecida e presumidamente tenha fornecido uma aplicação prática promissora nas muteínas de Bbp que se ligam à digoxigenina descritas anteriormente, são desejáveis melhorias e aplicações práticas adicionais. Em vista das várias aplicações potenciais para a ligação ou para as proteínas que se li- gam ao alvo no campo das ciências da vida, a produção de anticalinas® com base em estruturas alternativas da lipocalina seria desejável simplesmente pela razão de ter mais opções para a realização prática.

Conseqüentemente, é um objetivo da invenção fornecer as mu-teínas alternativas da lipocalina que possuem afinidade de ligação com um certo alvo.

Este objetivo é resolvido através do método e das muteínas com as características das presentes reivindicações independentes.

Tal método é um método para gorar uma muteína selecionada do grupo que consiste na lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos humanos (hNGAL), da proteína relacionada com a a2-microglobulina de ratos (A2m) e a 24p3/uterocalina (24p3) de camundongos, a dita muteína possuindo afinidade detectável a um certo alvo, que compreende a etapa (a) de submeter a proteína à mutagênese em uma ou mais posições da seqüência que correspondem às posições de seqüência 33 até 54, 66 até 83, 94 até 106 e 123 até 136 de hNGAL, resultando em uma ou mais muteínas da proteína. O método compreende preferencialmente uma etapa adicional (b) de enriquecimento de pelo menos uma muteína resultante que possui atividade de ligação para um certo alvo de uma ou mais muteínas através da seleção e/ou do isolamento de pelo menos uma muteína. Preferencialmente, a mutagênese resulta em um grande número de muteínas da proteína, isto é duas ou mais muteínas.

Isto significa que a presente invenção se baseia na descoberta de que a lipocalina associada com a gelatinase de neutrófilos humanos (hNGAL) e as proteínas homólogas da mesma proveniente do rato (A2m) e do camundongo (24p3) fornecem bases adequadas para a produção de proteínas que possuem atividade de ligação com um certo alvo de interesse. A hNGAL foi identificada como um membro da família das lipocalinas e sua estrutura tridimensional foi resolvida através de RMN (Coles e outros, J. Mol. Biol. 289 (1999), 139-157) e através da cristalografia por raio X (Goetz e outros, Biochemistry, 39 (2000), 1935-1941), mas até o presente momento nem sua função fisiológica nem seu alvo natural foram identificados de forma não-ambígua (Kjeldsen e outros, supra). Conseqüentemente, a presente invenção fornece pela primeira vez uma aplicação prática possível não somente para a hNGAL mas também para seus homólogos A2m e 24p3.

As posições dos aminoácidos nas proteínas A2m e 24p3 que são submetidas à mutagênese no método de acordo com a invenção são obtidas partindo de um alinhamento das seqüências de aminoácidos de hNGAL, A2m e 24p3. Na proteína A2m, que possui o mesmo número de resíduos de aminoácidos (178) que a hNGAL, as posições de sequência que são utilizadas para a mutagênese são idênticas às posições selecionadas na hNGAL, a saber as posições 33 até 54, 66 até 83, 94 até 106, e 123 a 136 da hNGAL. Para a 24p3, as posições de seqüência correspondentes são as posições de seqüência 33 até 54, 66 até 85, 96 até 108 e 125 até 138. Assim, as posições de aminoácidos que são submetidas à mutagênese são distribuídas ao longo dos quatros segmentos que corresponde a quatro alças na estrutura tridimensional de hNGAL, A2m e 24p3. O número dos segmentos (alças) definidos anteriormente que é utilizado para a mutagênese pode variar. É necessário mutar todas as quatro destas alças ao mesmo tempo, por exemplo em uma mutagênese planejada, mas é possível submeter apenas duas ou três destas alças para gerar uma muteína que possua afinidade detectável a um certo alvo.

Em uma modalidade preferida do método de acordo com a invenção, a respectiva proteína, isto é hNGAL, A2m ou 24p3 é submetida à mutagênese em uma ou mais das posições de seqüência que correspondem às posições de seqüência 40 até 50, 70 até 79, 101 até 103 e 125 até 132 da hNGAL. Por exemplo, se a hNGAL for selecionada para a produção de uma muteína, a hNGAL é submetida à mutagênese em uma ou mais das posições de seqüência 40 até 50, 70 até 79, 101 até 103 e 125 até 132.

Em uma modalidade mais preferida do método, a respectiva proteína é submetida à mutagênese em uma ou mais das posições de seqüência que correspondem às posições de seqüência 40, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 70, 72, 73, 77, 79, 101,102, 103, 125, 127, 128, 130 e 132 da hNGAL.

Em modalidades particularmente preferidas, pelo menos 10, mais preferencialmente pelo menos 15 das posições de seqüência 40, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 70, 72, 73, 77, 79, 101, 102, 103, 125, 127, 128, 130 e 132 da hNGAL ou da A2m ou das posições correspondentes da 24p3 são submetidas à mutagênese. Na modalidade mais preferida, todas estas 20 posições de seqüência são aleatórias, em que é preferido permitir que todos os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente sejam incorporados nas se-qüências de polipeptídeos nestas posições.

Isto significa que a presente invenção se baseia na descoberta de que as muteínas da hNGAL ou de suas homólogas A2m e 24p3 que possuem afinidade detectável a um certo alvo podem ser obtidas através de mutagênese, preferencialmente da mutagênese aleatória, de um total de 20 resíduos de aminoácidos, a saber as posições de seqüência 40, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 70, 72, 73, 77, 79, 101, 102, 103, 125, 127, 128, 130 e 132 da hNGAL. Esta descoberta é particularmente surpreendente por várias razões.

Como citado, um conjunto de 20 aminoácidos no total é submetido a uma reorganização aleatória, isto é submetido à mutagênese, nesta modalidade preferida do método da invenção, enquanto que um total de apenas 16 aminoácidos sofreu mutação no WO 98/16873. Quando for utilizada a mutagênese aleatória do códon NNS ou NNK para a reorganização aleatória completa destas 20 posições de aminoácidos (isto é, é permitido cada um dos 20 aminoácidos naturais em cada uma destas 20 posições selecionadas), há 3220 de combinações de códons. Se forem utilizadas 16 posições de aminoácidos para a reorganização aleatória, há 3216 combinações possíveis de códons. Conseqüentemente, aumentando o número de aminoácidos que são submetidos à mutagênese aleatória em 4 (de 16 para 20) resulta em um aumento de 324 « 106 na complexidade combinatória. Entretanto, os números de mutantes que podem ser fisicamente realizados na biblioteca correspondente baseada no DNA não podem ser deliberadamente maiores por causa de limitações experimentais e é geralmente restrito a um valor de aproximadamente 1109 até 11010 de acordo com o estado da técnica (Fitzgerald, Drug Discov. Today 5 (2000), 253-258). Em um exemplo da pre- sente invenção, foi utilizada uma biblioteca combinatória com base no DNA contendo apenas aproximadamente 1i07 variações de seqüência (muteínas).

Considerando que a pequena seção acessível do espaço de se-qüências combinatórias é reduzida adicionalmente em um fator de aproximadamente 106, é surpreendente que seja possível de alguma forma isolar de uma biblioteca combinatória contendo apenas 1107 tais muteínas de hNGAL (ou A2m ou 24p3) que a) não somente se dobram em proteínas solúveis mas b) possuem ainda uma nova especificidade ligante/alvo.

Sob este aspecto deve ser citado que a abordagem utilizada aqui contrasta com os ensinamentos da WO 99/16873. De acordo com esta referência deve ser útil manter o número total de posições de aminoácidos mutados dentro de um único experimento o menor possível de forma que um conjunto de variações obtidas através da mutagênese, isto é a biblioteca, possa em sua totalidade ou, pelo menos em uma seleção representativa da mesma, ser realizada de forma mais completa possível.

Deve ser finalmente citado que é também surpreendente que a presente abordagem é utilizada de forma bem-sucedida para a produção de uma muteína que possui atividade de ligação específica ao epítopo de uma proteína (conforme Exemplos 5, 15, por exemplo). A presente invenção também está direcionada a uma muteína da lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos humanos, da proteína relacionada com a a2-microglobulina de rato (A2m) ou da 24p3/uterocalina (24p3) de camundongos que possui afinidade detectável a um certo alvo, que pode ser obtida através da mutagênese da respectiva proteína nas posições de seqüência que correspondem às posições de seqüência 33 até 54, 66 até 83, 94 até 106 e 123 até 136 da hNGAL. São preferidas as muteínas que podem ser obtidas submetendo a respectiva proteína à mutagênese nas posições que correspondem às posições de seqüência 40 até 50, 70 até 79, 101 até 103 e 125 até 132 da hNGAL.

Preferencialmente tal muteína carrega uma substituição de ami-noácido em 5 até 10, mais preferencialmente em 8 até 12 ou mais preferido em 10 até 18 ou em 10 até 20 das 20 posições de seqüência selecionadas.

Em uma modalidade preferida, a muteína possui a seqüência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 12. Esta muteína também é referida como TIpcA.

As muteínas da invenção são capazes de se ligar ao alvo desejado com uma afinidade detectável, isto é com uma constante de afinidade de preferencialmente pelo menos 105 M'1. Geralmente as afinidades menores que esta não podem ser medidas por muito tempo com métodos comuns tal como ELISA e portanto têm importância secundária para aplicações práticas. São especialmente preferidas as muteínas que se ligam ao alvo desejado com uma afinidade de pelo menos 106 M"1, correspondendo a uma constante de dissociação para o complexo de 1 μΜ. A afinidade de ligação de uma muteína ao alvo desejado pode ser medida pelo versado na técnica através de vários métodos, por exemplo através de titulação da fluorescência, através de ELISA de competição ou através da técnica de ressonância de superfície de plasmon. O alvo (ligante) que é ligado pela muteína pode ser qualquer grupo químico que, por exemplo, possa também ser reconhecida e ligada por uma imunoglobulina. Conseqüentemente, o alvo pode ser um composto químico na forma livre ou conjugada que exibe características de um hapte-no, um hormônio tal como hormônios esteróides ou qualquer biopolímero ou fragmento do mesmo, por exemplo, um peptídeo, uma proteína ou um domínio de uma proteína, um peptídeo, um oligodesoxinucleotídeo, um ácido nu-cléico, oligo- e polissacarídeos ou outra macromolécula ou conjugados dos mesmos. Em uma modalidade preferida da invenção, o alvo é uma proteína.

As muteínas da invenção podem possuir a seqüência de aminoácidos natural da hNGAL, da A2m ou da 24p3 fora dos segmentos mutados, isto é as regiões das posições de aminoácidos 33 até 54, 66 até 83, 94 até 106 e 123 até 136 no caso da hNGAL. Por outro lado, as muteínas descritas aqui também podem conter mutações de aminoácidos fora das posições submetidas à mutagênese comparadas com a proteína do tipo selvagem contanto que estas mutações não interfiram na atividade de ligação e no do-bramento da muteína. Isto inclui, por exemplo, que mutações, substituições, deleções, inserção de resíduos de aminoácidos assim como adições de terminais N e/ou C podem ser introduzidas na seqüência de aminoácidos natural da hNGAL, da A2m ou da 24p3.

Tais modificações da seqüência de aminoácidos da proteína selecionada dentro ou fora da região de ligação selecionada incluem a mu-tagênese direcionada de posições de aminoácidos individuais, por exemplo com a finalidade de simplificar a subclonagem do gene da lipocalina mutado ou de suas partes através da incorporação de sítios de divagem para certas enzimas de restrição. Por exemplo, a mutação Glu28 para His e/ou Thr145 para Ala pode ser introduzida no gene hNGAL com a finalidade de simplificar a colnagem do segmento mutado do gene através de dois sítios de restrição novos para BsfXI nestas posições. Além disso, as mutações podem ser introduzidas dentro ou fora das quatro alças peptídicas com a finalidade de melhorar certas características da muteína da proteína escolhida como base, por exemplo sua estabilidade de dobramento ou eficiência de dobramento ou sua resistência a proteases.

Em uma modalidade preferida, por exemplo, o Cys87 da hNGAL é trocado por Ser ou Ala, através do qual sua reticulação covalente com outras proteínas tal como a gelatinase B (que poderia ocorrer em aplicações in vivo de uma muteína) pode ser prevenida e sua estrutura monomérica pode ser estabilizada. Similarmente, os resíduos de Cys que podem ocorrer como um resultado da mutagênese e da seleção da muteína da invenção não são sempre cruciais para a ligação do alvo fornecido e podem ser substituídos por Ser ou Ala com a finalidade de prevenir a formação de ligações cova-lentes ou a oxidação do grupo tiol.

Em uma muteína preferida da hNGAL, o Cys87 é substituído e/ou a muteína carrega uma ou ambas as substituições de aminoácidos Glu(28) -> His, Thr(145) -> Ala comparada com a hNGAL. Sob este aspecto, deve ser citado que a presente invenção é também direcionada a uma hNGAL (recombinante) que possui as seqüências de aminoácidos naturais em que somente Cys87 foi substituído por qualquer outro aminoácido adequado. Este polipeptídeo de hNGAL pode ser produzido utilizando os méto- dos descritos aqui para a produção das outras muteínas das invenções (ver o Exemplo 4), por exemplo através do uso do vetor pHNGAL7. O método da presente invenção compreende preferencialmente (na etapa (b)) (i) o fornecimento como o certo alvo de um composto que é selecionado do grupo que consiste em um composto químico na forma livre ou conjugada que exibe características de um hapteno imunológico, um peptídeo, uma proteína ou uma outra macromolécula, (ii) o contato do grande número de muteínas com o dito alvo com a finalidade de permitir a formação de complexos entre o dito alvo e as muteínas que possuem afinidade de ligação pelo diío aivo e (iii) a remoção das muteínas que não possuem qualquer ou não possuem afinidade de ligação substancial.

Nenhuma ou sem afinidade de ligação substancial significa sob as condições utilizadas, que nenhum complexo é formado entre o alvo e o grande número de muteínas que são colocadas em contato com o alvo. É evidente para o versado na técnica que a formação de complexos é dependente de muitos fatores tais como a concentração dos parceiros de ligação, a concentração de compostos que atuam como competidores, a força iônica dos tampões etc. A seleção e o enriquecimento são geralmente realizados sob condições que permitirão o isolamento e o enriquecimento de muteínas que possuem uma constante de afinidade de pelo menos 105 M'1 em relação ao alvo. Entretanto, as etapas de lavagem e de eluição podem ser realizadas sob rigor variável. Por exemplo, se as muteínas que possuem uma constante de afinidade de pelo menos 106 M'1 tiverem que ser isoladas, a lavagem e a eluição podem ser realizadas sob maior rigor, isto é condições mais rigorosas. É também possível uma seleção em relação às características cinéti-cas. A seleção pode, por exemplo, ser realizada sob condições que favorecem a formação de complexos do alvo com as muteínas que exibem uma dissociação lenta do alvo (receptor) ou em outras palavras uma taxa de koff menor. O termo "várias" como utilizado aqui significa que pelo menos duas muteínas que diferem uma da outra em suas sequências de aminoáci-dos estão presentes. O limite superior de muteínas geradas através da mu- íagênese é geralmente restrito pelas condições experimentais e fica geralmente entre 107e 1012. O termo "mutagênese" como utilizado aqui significa que as condições experimentais são escolhidas de forma que o aminoácido que ocorre naturalmente em uma posição da seqüência da hNGAL, da A2m ou da 24p3 possa ser substituído por pelo menos um aminoácido que não está presente nesta posição específica na respectiva seqüência polipeptídica natural. O termo "mutagênese" também inclui modificar (adicionalmente) o comprimento dos segmentos da seqüência através da deleção ou da inserção de um ou mais aminoáciuus. Assim, está dentro do escopo da invenção que, por exemplo, um aminoácido em uma posição de seqüência escolhida é substituído por uma extensão de três mutações aleatórias, levando a uma inserção de dois resíduos de aminoácidos comparados com o comprimento do (respectivo segmento) da proteína do tipo selvagem. O termo "mutagênese aleatória" significa que nenhum aminoácido isolado predeterminado (mutação) está presente em uma certa posição de seqüência mas que pelo menos dois aminoácidos podem ser incorporados em uma posição de seqüência selecionada durante a mutagênese com uma certa probabilidade.

Tais condições experimentais podem, por exemplo, ser atingidas através da incorporação de códons com uma composição de bases degenerada no gene estrutural, por exemplo, para a hNGAL na posição que será mutada. Por exemplo, o uso do códon NNK ou NNS permite a incorporação de todos os 20 aminoácidos mais o códon de término âmbar durante a mutagênese, enquanto que o códon WS limita o número de aminoácidos possivelmente incorporados em 14 uma vez que exclui os aminoácidos Cys, lie, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Vai de serem incorporados na posição selecionada da seqüência polipeptídica; o uso do códon NMS, por exemplo, restringe o número de aminoácidos possíveis em 11 em uma posição da seqüência uma vez que este exclui os aminoácidos Arg, Cys, Gly, lie, Leu, Met, Phe, Trp, Vai de serem incorporados em uma posição de seqüência selecionada. Em uma modalidade preferida do método da invenção, é realizada uma mutagênese aleatória, em que é permitido que pelo menos 4, preferencialmente 6, mais preferencialmente 8 até 12 ou 8 até 15 aminoácidos sejam incorporados em uma posição da sequência selecionada da hNGAL, da A2m ou da 24p3. Em uma modalidade particularmente preferida, pelo menos uma posição da seqüência é submetida à reorganização aleatória completa, isto é, é permitido que todos os 20 aminoácidos sejam incorporados nesta posição durante a mutagênese. Partindo do que foi descrito anteriormente, é também evidente que o aminoácido naturalmente presente em uma certa posição da seqüência da respectiva proteína tal como hNGAL possa também estar presente na muteína após submeter esta posição à mutagênese.

Em uma modalidade preferida do método da invenção, o alvo é uma proteína. A proteína pode ser fornecida na forma livre ou conjugada ou na forma de uma proteína de fusão para a seleção de muteínas.

Em uma modalidade preferida do método da invenção, é utilizado um ácido nucléico que codifica as várias muteínas da respectiva proteína selecionada da hNGAL, da A2m e da 24p3. O ácido nucléico resulta da mutagênese e fica fundido de forma operacional na extremidade 3’ com um gene que codifica a proteína de revestimento plll de um bacteriófago filamento-so da família do M13 ou um fragmento desta proteína de revestimento, com a finalidade de selecionar pelo menos uma muteína para a ligação do alvo fornecido. O ácido nucléico que resulta da mutagênese pode ser obtido através do uso da PCR. Em uma modalidade preferida do método da invenção, a produção do ácido nucléico que codifica os segmentos mutados da respectiva proteína compreende as duas etapas a seguir. Primeiro, os dois fragmentos de ácido nucléico, dos quais cada um codifica uma parte da proteína mutada, são gerados através da PCR de forma que estes fragmentos sejam parcialmente sobrepostos. Estes fragmentos são empregados com dois ini-ciadores flanqueadores em uma segunda etapa de amplificação com a finalidade de obter o ácido nucléico que compreende o gene estrutural mutado completo (ver a Figura 2 e o Exemplo 1 que ilustram este procedimento de duas etapas). Devido à sobreposição o produto da PCR de comprimento completo será amplificado no curso desta reação, sem que seja necessária a adição de qualquer ácido nucléico adicional. Os dois fragmentos podem ser obtidos com um par ou pares de iniciadores adequados em duas reações de amplificação separadas (ver também a Figura 2 e o Exemplo 1, que mostram que tais dois fragmentos são gerados nas reações de PCR A e B).

Para algumas aplicações, é útil empregar a muteína da invenção da hNGAL, da A2m ou da 24p3 em uma forma marcada. Conseqüentemen-te, a invenção refere-se ainda a uma muteína de cada uma das três proteínas utilizadas como base aqui que é conjugada a uma marcação selecionada do grupo que consiste em marcação enzimática, marcação radioativa, marcação fluorescente, marcação cromogênica, marcação luminescente, um hapteno, biotina, digoxigenina, complexos metálicos, metais e ouro coloidal. A muteína pode também ser conjugada a uma molécula orgânica. O termo "molécula orgânica" como utilizado no presente pedido de patente significa preferencialmente uma molécula orgânica que compreende pelo menos dois átomos de carbono, mas não mais que 7 ligações de carbono que podem sofrer rotação que possuem um peso molecular entre 100 e 2000 Daltons, preferencialmente 1000 Dáltons e uma molécula que inclui um ou dois átomos de metal.

Em geral, é possível marcar a muteína com qualquer substância química ou enzima apropriada, que gera diretamente ou indiretamente em uma reação química, enzimática ou física um composto ou um sinal detectá-vel que pode ser utilizado para a detecção. Um exemplo para uma reação física é a emissão de fluorescência após a excitação com radiação ou a emissão de raios X por uma marcação radioativa; a fosfatase alcalina, a peroxidase de rábano ou a β-galactosidase são exemplos de marcações enzi-máticas que catalisam a formação de compostos cromogênicos (coloridos) que podem ser então detectados. Em geral todas as marcações que são utilizadas para anticorpos, exceto aquelas que são exclusivamente utilizadas com a porção açúcar na parte Fc das imunoglobulinas podem ser também utilizados para conjugação com as muteínas da presente invenção. Estes conjugados podem ser preparados através de métodos conhecidos pelo versado na técnica.

Uma opção que é particularmente vantajosa para as aplicações práticas das muteínas descritas aqui, é o uso das muteínas na forma de proteínas de fusão. Em modalidades preferidas de tal proteína de fusão uma enzima, uma proteína ou um domínio de proteína, um peptídeo, por exemplo um peptídeo tal como uma sequência sinal e/ou uma marcação por afinidade é fundida de forma operacional ao terminal amino ou ao terminal carbóxi da muteína. O parceiro de fusão pode ser adequado para conferir novas características para a muteína, por exemplo atividade enzimática ou afinidade por outras moléculas tais como proteínas, macromoléculas ou alvos com baixo peso molecular. Por exemplo, são possíveis as fusões com enzimas que catalisam as reações cromogênicas ou fluorogênicas (por exemplo a fosfata-se alcalina, a peroxidase de rábano silvestre, a glutationa-S-transferase) ou que podem servir para a liberação de agentes citotóxicos. Os exemplos adicionais de parceiros de fusão que podem ser vantajosos na prática são domínios de ligação tais como o domínio de ligação com a albumina da proteína G, a proteína A, os fragmentos de anticorpos, os domínios oligomerizan-tes, as toxinas ou ainda as muteínas da invenção ou anticalinas® com especificidade diferente ou igual ao alvo. Um exemplo específico para as últimas seria uma proteína de fusão que compreende uma muteína da hNGAL da presente invenção e a muteína de ligação com a digoxigenina DigA16 descrita na Patente Alemã DE 199 26 068. As marcações de afinidade tal como a Strep-Tag® ou a Strep-tag® II (Schmidt e outros, J. Mol. Biol. 255 (1996), 753-766) ou as marcações de oligohistidina (por exemplo, marcações His6) ou proteínas tal como a glutationa-S-transferase que podem ser utilizadas para a purificação através de cromatografia por afinidade e/ou para a detecção (por exemplo utilizando a afinidade específica da Strep-tag® para a es-treptavidina) são exemplos adicionais de parceiros de fusão preferidos. As proteínas com propriedades cromogênicas ou fluorescentes tal como a proteína fluorescente verde (GFP) são também parceiros de fusão adequados. O termo proteína de fusão como utilizado aqui inclui ainda as muteínas da invenção, por exemplo as muteínas da hNGAL, que são equi- padas com uma seqüência sinal. As seqüências sinal no terminal N de um polipeptídeo de acordo com a invenção podem ser adequadas para direcionar o polipeptídeo para um compartimento celular específico durante a biossíntese, por exemplo no periplasma de E. coli ou no lúmen da célula eucariótica ou no meio que circunda a célula. Fazendo isso, a seqüência sinal é clivada através de uma peptidase sinal. É também possível utilizar outras seqüências de direcionamento ou de sinalização que estão necessariamente localizadas no terminal N do polipeptídeo e que permitem a localização do mesmo em compartimentos celulares específicos. Uma seqüência sinal preferida para a secreção no periplasma de E. coli é a seqüência de sinal OmpA. Um grande número de seqüências sinais adicionais é conhecido na arte. A invenção está direcionada ainda a uma molécula de ácido nu-cléico que compreende uma seqüência que codifica uma muteína de acordo com a invenção ou uma proteína de fusão da mesma. Em uma modalidade preferida a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nu-cleotídeos que codifica a muteína da SEQ ID Ns: 12.

Uma vez que a degeneração do código genético permite substituições de certos códons por outros códons que especificam o mesmo ami-noácido e conseqüentemente dá origem a mesma proteína, a invenção não está limitada a uma molécula de ácido nucléico específica mas inclui todas as moléculas de ácido nucléico que compreendem uma seqüência de nucle-otídeos que codifica uma muteína com a seqüência de aminoácidos de acordo com a presente invenção. A molécula de ácido nucléico que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma muteína de qualquer uma da hNGAL, da A2m ou da 24p3 como é descrito aqui pode estar ligada de forma operacional a uma seqüência reguladora para permitir a expressão da molécula de ácido nucléico em uma célula hospedeira (in vivo) ou sua transcrição e tradução em um sistema sem célula (in vitro).

Uma molécula de ácido nucléico tal como um DNA é considerado como sendo "capaz de expressar uma molécula de ácido nucléico ou uma seqüência de nucleotídeos codificadora" ou capaz de "permitir a ex- pressão de uma seqüência de nucleotídeos" se esta contiver seqüências de nucleotídeos que contêm informação transcricional e de tradução e se tais seqüências estiverem "ligadas de forma operacional" a seqüências de nucleotídeos que codificam o polipeptídeo. Uma ligação que pode ser operada é uma ligação em que as seqüências de DNA reguladoras e as seqüências de DNA que devem ser expressas estão conectadas de forma que permita a expressão gênica. A natureza precisa das regiões e dos elementos reguladores necessários para a expressão gênica pode variar de organismo para organismo, mas deve, em geral, incluir uma região promotora que, em pro-cariotos por exemplo, contém tanto a seqüência reguladora do promotor que pode compreender uma região funcional de transcrição em uma célula quanto uma região de término da transcrição funcional em uma célula. Os elementos utilizados para a transcrição ou para a tradução são promotores, intensificadores, seqüências líderes, sítios de início da transcrição e sítios de término da transcrição, sinais de poliadenilação, sítios de ligação de ribos-somos tal como a seqüência de Shine-Dalgarno e similares. Estas seqüên-cias reguladoras e/ou a muteína da invenção podem fazer parte de um vetor. Conseqüentemente, a invenção refere-se também a um vetor que compreende uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma muteína da hNGAL, da A2m ou da 24p3 como descrito aqui.

Em uma modalidade adicional, a invenção refere-se ainda a um método para a produção de uma muteína da invenção ou de uma proteína de fusão da mesma. Neste método a muteína ou a proteína de fusão é produzida partindo do ácido nucléico que codifica a muteína através de métodos de engenharia genética em um organismo hospedeiro bacteriano ou eucari-ótico e é isolada deste organismo hospedeiro ou de sua cultura. Para esta finalidade uma célula hospedeira adequada é geralmente transformada primeiro com um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica, por exemplo, uma muteína de NGAL da invenção. A célula hospedeira, que pode ser qualquer célula hospedeira procariótica ou eucariótica é então cultivada sob condições que permitem a biossíntese do polipeptídeo. O polipeptídeo é então geralmente recuperado da célula ou do meio de culti- vo. Uma vez que cada uma da lipocalina associada à gelatinase de neutróli-fos humanos, da A2m e da 24p3 contêm uma ponte dissulfeto estrutural é preferido direcionar o polipeptídeo para um compartimento celular que possui um meio oxidante de tiol/redox de dissulfeto através do uso de uma se-qüência sinal adequada. Tal meio oxidante está presente no periplasma de bactérias tal como E. coli ou no lúmen do retículo endoplasmático de uma célula eucariótica e geralmente favorece a formação correta das ligações dissulfeto. É, entretanto, também possível produzir um polipeptídeo da invenção no citossol de uma célula hospedeira, preferencialmente E. coli. Neste caso o polipeptídeo pode, por exemplo, ser produzido na forma de corpos de inclusão, seguido pela renaturação in vitro. Uma opção adicional é o uso de cepas mutadas especificamente que possuem um meio oxidante no citossol e assim permitem a produção da proteína nativa no citossol.

Como é evidente partindo da descrição anterior, a muteína da presente invenção ou uma fusão ou um conjugado da mesma pode ser empregada em muitas aplicações. Em geral, uma muteína descrita aqui pode ser utilizada em todas as aplicações em que os anticorpos são utilizados, exceto naquelas que se baseiam especifica mente na glicosilação da parte Fc.

Um uso preferido da muteína é a detecção de um alvo através de uma muteína da invenção ou de uma proteína de fusão da mesma, que compreende as etapas de colocar a muteína em contato com uma amostra suspeita de conter o certo alvo sob condições adequadas, permitindo assim a formação de um complexo entre a muteína e o certo alvo e de determinação da muteína complexada através de um sinal adequado. Este sinal pode ser causado por uma marcação tal como uma marcação fluorescente ou cromogênica como explicando anteriormente. Este sinal pode ser também causado pela alteração de propriedades físicas que é ocasionada pela ligação, isto é a formação do próprio complexo. Um exemplo de tais propriedades é a ressonância de superfície de plasmon cujo valor é alterado durante a ligação de parceiros de ligação dos quais um é imobilizado em uma superfície tal como uma folha de ouro.

Como citado anteriormente, uma muteína descrita aqui e seus derivados podem ser empregados em muitas áreas similares a anticorpos ou seus fragmentos. Uma muteína é preferencialmente utilizada para a ligação a uma fase sólida, de forma que o alvo da muteína ou um conjugado ou uma proteína de fusão deste alvo pode ser imobilizada ou separada. É também preferido o uso da muteína para a marcação com uma enzima, um anticorpo ou uma substância radioativa ou um outro grupo com uma atividade bioquímica ou com características de ligação definidas, de forma que o alvo da muteína ou um conjugado ou uma proteína de fusão deste alvo possa ser detectada ou colocada em contato com o mesmo. As muteínas da invenção podem servir por exemplo na detecção de estruturas químicas através de métodos bioanalíticos estabelecidos tal como ELISA ou Western Blot, na microscopia ou em métodos com sensores imunológicos. Aqui, o sinal de detecção pode ser gerado diretamente através do uso da muteína ligada através de um anticorpo direcionado contra a mesma ou por exemplo utilizando uma marcação por afinidade. Há também várias aplicações possíveis para uma muteína da hNGAL, da A2m ou da 24p3 na medicina. Em adição ao seu uso no diagnóstico, pode ser preparado um polipeptídeo mutante da invenção que se liga por exemplo a moléculas de superfície celular específicas a tecidos ou a tumores. Tal muteína pode, por exemplo, ser empregada na forma conjugada ou na forma de uma proteína de fusão para a "geração de imagem de tumores" ou diretamente para terapia para o câncer.

Um outro uso relacionado e preferido de uma muteína descrita aqui é a validação do alvo, isto é a verificação do fato de um peptídeo que se assume que esteja envolvido no desenvolvimento de uma doença ou de um distúrbio é na verdade de alguma forma o causador da doença ou do distúrbio. Este uso para a validação da proteína como um alvo de droga farmaco-lógica tira vantagem da capacidade de uma muteína da presente invenção reconhecer especificamente uma área de superfície de uma proteína em sua conformação nativa, isto é a capacidade de uma muteína descrita aqui se ligar a um epítopo nativo. Sob este aspecto, deve ser citado que esta capacidade de se ligar a um epítopo nativo foi relatada somente para um número limitado de anticorpos recombinantes, independente do fato de terem sido produzidos através do protocolo clássico de imunização de Kõhler e Milstein (Nature 256 (1975), 495-497) ou através de técnicas combinatórias tal como a exibição por fago. O uso de uma muteína para a validação de um alvo de droga não compreende apenas a detecção de um alvo que é uma proteína, mas também a detecção de um alvo que é um domínio de proteína, um peptídeo, uma molécula de ácido nucléico, uma molécula orgânica ou um complexo metálico.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende uma muteína da lipocalina associada à geiatinase de neutrófilos humanos, da proteína relacionada à a.2-microglobu-lina de ratos (A2m) ou a 24p3/uterocalina (24p3) de camundongos de acordo com a invenção ou uma proteína de fusão dos mesmos e um veículo farma-ceuticamente aceitável.

Uma muteína, por exemplo uma muteína da hNGAL, de interesse farmacêutico pode, por exemplo, ser uma muteína que possui ligação com superfícies celulares específicas a tumores. Esta pode ser ainda uma muteína que se liga a uma droga específica e que serve como uma forma "de liberação controlada" para esta droga ou um armazenamento a longo prazo da droga no corpo de um paciente. Tal muteína pode ser administrada através de qualquer rota terapeuticamente eficiente para um produto farmacêutico protéico, por exemplo de forma parenteral, intranasal, retal, bucal ou através de inalação por sprays ou aerossóis no trato respiratório. A administração pode ocorrer em formulações em dosagens unitárias contendo carre-adores, adjuvantes e veículos farmaceuticamente aceitáveis não-tóxicos convencionais quando desejado. O termo "parenteral" abrange as formas de fornecimento tais como a injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-esternal, intra-arterial e técnicas de infusão. Devido ao baixo peso molecular, a inalação é uma das formas preferidas de administração de uma muteína farmaceuticamente útil da invenção.

Conseqüentemente, a muteína da presente invenção pode ser formulada em composições que utilizam tanto ingredientes farmaceuticamente aceitáveis quanto os métodos de preparação. Ver, por exemplo, Remington e outros, Pharmaceutical Sciences, 15- Ed., Mack Pub., Easton (1975).

Para inalação as muteínas da invenção podem ser primeiro colocadas em uma forma dispersa particulada. Isto pode ser realizado através da preparação de um aerossol aquoso ou de partículas sólidas que contêm o respectivo polipeptídeo. Ordinariamente, um aerossol aquoso é produzido através da formulação de uma solução ou de uma suspensão aquosa do polipeptídeo desejado junto com veículos e estabilizantes farmaceutica-mente aceitáveis convencionais. Os veículos e os estabilizantes variarão dependendo das necessidades para cada polipeptídeo, podem incluir tenso-ativos não-iônicos (tais como Tweens, Pluronics ou polietileno glicol), proteínas inócuas como a albumina do soro, os ésteres de sorbitana, o ácido oléi-co, a lecitina, aminoácidos tal como a glicina, tampões, sais, açúcares ou álcoois de açúcares. As formulações podem incluir ainda agentes broncodi-latadores. As formulações serão esterilizadas. Os aerossóis serão geralmente preparados partindo de soluções isotônicas. As partículas incluem opcionalmente proteínas tensoativas normais do pulmão. Os exemplos de formulações para inalação de proteínas são descritos na Patente U.S. 6.099.517, por exemplo. Também é possível a administração de composições em pó seco para inalação de uma muteína da invenção. As formulações em pó seco são descritas na Patente U.S. 6.123.936, por exemplo.

Uma opção para a preparação de composições farmacêuticas adequadas para inalação inclui formar aerossóis de partículas em uma suspensão aquosa ou não aquosa, por exemplo propulsora por fluorocarbono. Tais partículas incluem, por exemplo, agregados intramoleculares dos poli-peptídeos ou de polipeptídeos lipossomais ou envoltos por microcápsulas. Os aerossóis devem ser livres de agentes que irritam os pulmões, isto é, substâncias que causam bronquioconstrição aguda, tosse, edema pulmonar ou destruição de tecidos. Entretanto, os agentes não irritantes que aumentam a absorção são adequados para uso aqui.

As composições adequadas para a administração parenteral compreendem soluções aquosas ou não-aquosas esterilizadas farmaceuti- camente aceitáveis, dispersões, suspensões ou emulsões, assim como pós esterilizados para reconstituição em soluções ou dispersões injetáveis esterilizadas, imediatamente antes do uso. Os exemplos representativos de car-readores, diluentes, solventes ou veículos aquosos e não-aquosos adequados incluem a água, o etanol, os polióis, por exemplo, - glicerol, propileno glicol, polietileno glicol - e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, por exemplo, azeite de oliva e ésteres orgânicos injetáveis tal como o oleato de etila. A fluidez pode ser mantida de várias formas incluindo o uso de materiais de revestimento tal como a lecitina, a manutenção do tamanho de partícula necessário (no caso de dispersões) e tensoativos.

As composições podem conter ainda adjuvantes tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, agentes de dispersão, agentes antibacterianos e antifúngicos tais como o parabeno, o cloro-butanol, o fenol e o ácido sórbico, agentes isotônicos tais como açúcares, cloreto de sódio ou agentes que retardam a absorção tal como o monoeste-rato de alumínio e a gelatina. A muteína pode ser incorporada em sistemas de liberação lenta ou controlada ou de distribuição direcionada tais como matrizes, lipossomos e microesferas.

As formulações injetáveis podem ser esterilizadas de várias formas, incluindo a filtração através de um filtro de retenção de bactérias ou através de agentes esterilizantes de incorporação na forma de composições sólidas esterilizadas que podem ser dissolvidas ou dispersas em água esterilizada ou em outro meio injetável esterilizado logo antes do uso. A seqüência codificadora de cada uma das proteínas utilizadas como base aqui pode servir como um ponto de partida para a mutagênese dos segmentos peptídicos selecionados na presente invenção. A seqüência codificadora da hNGAL foi descrita por Bundgard e outros, Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 202 (1994), 1468-1475. As seqüências codificadoras da A2m e da 24p3 respectivamente foram publicadas por Chan e outros, Nucleic Acid Res. 16 (1988) 11638; e Stoesz e outros, Oncogene 11 (1995), 2233-2241, por exemplo. Para a mutagênese dos aminoácidos nas quatro alças peptídicas, o versado na técnica possui à sua disposição as várias técnicas disponíveis para a mutagênese direcionada ao sítio ou para a mu-tagênese através da reação em cadeia da polimerase. O método de mutagênese pode, por exemplo, ser caracterizado pelo fato de que as misturas de oligodesoxinucleotídeos sintéticos, que carregam uma composição de bases degenerada nas posições desejadas, podem ser utilizadas para a introdução das mutações. O uso de blocos de construção de nucleotídeos com especificidade reduzida de pares de bases, como por exemplo a iosina, é também uma opção para a introdução de mutações no segmento da seqüência ou nas posições de aminoácidos escolhidas. O procedimento para a mutagênese de sítios de ligação ao alvo é simplificado quando comparado com os anticorpos, uma vez que para hNGAL somente quatro ao invés de seis segmentos de seqüência - que correspondem às quatro alças peptídicas citadas anteriormente - têm que ser manipuladas para esta finalidade. Uma possibilidade adicional é a assim chamada mutagênese em tripleto. Este método utiliza misturas de tripletos de nucleotídeos diferentes dos quais cada um codifica um aminoácido para a incorporação da seqüência codificadora.

Um dos vários métodos aplicáveis para a introdução de mutações na região das quatro alças peptídicas selecionadas das proteínas de base utilizadas aqui (isto é no caso da hNGAL nas posições de seqüência 33 até 54, 66 até 83, 94 até 106 e 123 até 136) se baseia no uso de quatro oligodesoxinucleotídeos, dos quais cada um deriva parcialmente de um dos quatro segmentos de seqüência correspondentes que serão mutados. Na produção destes oligodesoxirribonucleotídeos, o versado na técnica pode empregar misturas de blocos de ácidos nucléicos para a síntese de tais tripletos de nucleotídeos que correspondem às posições de aminoácidos que serão mutadas, de forma que surgem códons ou anticódons aleatoriamente para todos os aminoácidos ou, de acordo com o código genético e com a composição desta mistura, para uma seleção dos aminoácidos desejados nesta posição.

Por exemplo, o primeiro oligodesoxinucleotídeo corresponde em sua seqüência - além das posições mutadas - pelo menos parcialmente ao filamento codificador da alça peptídica, que está localizado na seqüência polipeptídica da hNGAL na posição mais próxima ao N-terminal. Conse-qüentemente, o segundo oligodesoxinucleotídeo corresponde pelo menos parcialmente ao filamento não-codificador do segundo segmento de seqüên-cia seguindo na seqüência polipeptídica. O terceiro oligodesoxinucleotídeo corresponde por sua vez pelo menos parcialmente ao filamento codificador do terceiro segmento de seqüência correspondente. Finalmente, o quarto oligodesoxinucleotídeo corresponde pelo menos parcialmente ao filamento não-codificador do quarto segmento de seqüência. Pode ser realizada uma reação em cadeia de polimerase com os respectivos primeiro e segundo oli-godesoxinucieotídeos e separadamente, se necessário, com os respectivos terceiro e quarto oligodesoxinucleotídeos utilizando o ácido nucléico que codifica a proteína de base e/ou seu filamento complementar como um molde.

Os produtos da amplificação de ambas estas reações podem ser combinados através de vários métodos conhecidos em um ácido nucléico que compreende a seqüência proveniente do primeiro até o quarto segmentos de seqüência e que carregam as mutações nas posições de aminoácidos selecionadas. Para esta finalidade, ambos os produtos podem ser por exemplo submetidos a uma nova reação em cadeia da polimerase utilizando oligodesoxinucleotídeos flanqueadores como iniciadores assim como uma ou mais moléculas de ácido nucléico mediadoras que contribuem com a seqüência entre o segundo e o terceiro segmento de seqüência. Este procedimento é reproduzido esquematicamente na Figura 1. Na escolha do número dos oligodesoxinucleotídeos utilizados para a mutagênese e de seu arranjo dentro da seqüência gênica da proteína utilizada, o versado na técnica possui além disso várias alternativas à sua disposição.

As moléculas de ácido nucléico que codifica a região de seqüência que abrange as quatro alças peptídicas utilizadas e que contêm mutações nas posições selecionadas definidas anteriormente podem ser conectadas através da ligação com as seqüências a 5’ e a 3’ que estão faltando de um ácido nucléico que codifica a hNGAL, por exemplo e/ou do vetor e podem ser clonadas em um organismo hospedeiro conhecido. Está à disposição uma variedade de procedimentos para a ligação e a clolangem. Por exemplo, no curso de uma amplificação, as moléculas de ácidos nucléicos sintéticos com seqüências de reconhecimento de endonucleases de restrição, que também estão presentes nas posições correspondentes na se-qüência de ácido nucléico da hNGAL, podem ser ligadas em ambas as extremidades do ácido nucléico que será clonado de forma que se torna possível uma ligação após a hidrólise com a enzima de restrição correspondente. As seqüências a 5’ e a 3’ que estão faltando de um ácido nucléico que codifica a respectiva lipocalina utilizada na presente invenção também podem ser ligadas à molécula de ácido nucléico que compreende as posições de sequência rnuiaíadas através da PCR.

Segmentos de seqüência mais longos dentro do gene que codifica a proteína selecionada para mutagênese também podem ser submetidos à mutagênese aleatória através de métodos conhecidos, por exemplo através do uso da reação em cadeia da polimerase sob condições de maior taxa de erro, através da mutagênese química ou através do uso de cepas bacterianas que causam mutações (Low e outros, J. Mol. Biol. 260 (1996), 359-368). Tais métodos podem ser também utilizados para a otimização adicional da afinidade com o alvo ou da especificidade com o alvo de uma mu-teína que já foi produzida. As mutações que ocorrem possivelmente fora dos segmentos de seqüência 33 até 54, 66 até 83, 94 até 106 e 123 até 136 da hNGAL, por exemplo, podem ser freqüentemente toleradas ou podem ainda provar ser vantajosas, por exemplo se contribuírem para uma eficiência de dobramento ou uma estabilidade de dobramento maior da muteína.

Após ter levado as seqüências de ácido nucléico codificadoras que foram submetidas à mutagênese à expressão, os clones que variam a informação genética para o grande número de respectivas muteínas que se ligam a um alvo fornecido podem ser selecionados da biblioteca obtida. As estratégias de ligação e as estratégias de seleção conhecidas podem ser empregadas para a seleção destes clones. Os métodos deste tipo foram descritos no contexto da produção ou da engenharia de fragmentos recom-binantes de anticorpos, tal como a técnica de "exibição de fagos" (Hoess, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 (1993), 572-579; Wells e Lowman, Curr. Opin.

Struct. Biol. 2 (1992), 597-604) ou os métodos de "seleção de colônias" (Skerra e outros, Anal. Biochem. 196 (1991), 151-155) ou a "exibição de ri-bossomos" (Roberts, Curr. Opin. Chem. Biol. 3 (1999) 268-273).

Uma modalidade da técnica de "exibição de fagos" (Hoess, supra; Wells e Lowman, supra; Kay e outros, Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual (1996) Academic Press) é fornecida aqui como um exemplo de um método de seleção de acordo com a invenção para muteínas com características de ligação desejadas. As várias outras modalidades preferidas da técnica de "exibição de fagos" são incorporadas aqui na descrição como referência. Para o exemplo de método de seleção, são produzidos fasmídeos que efetuam a expressão do gene estrutural hNGAL mutado na forma de uma proteína de fusão com uma sequência sinal no N-terminal, preferencialmente a seqüência sinal de OmpA e com a proteína de revestimento plll do fago M13 (Model e Russel, em "The Bacteriophages", Vol. 2 (1988), Plenum Press, Nova Iorque, 375-456) ou fragmentos desta proteína de revestimento, que são incorporados no revestimento do fago, no C-terminal. O fragmento C-terminal ΔρΙΙΙ da proteína de revestimento de fago, que contém apenas os aminoácidos 217 até 406 da proteína de revestimento natural plll, é preferencialmente utilizado para produzir proteínas de fusão. É especialmente preferido um fragmento C-terminal proveniente da plll no qual o resíduo de cisteína na posição 201 está faltando ou é substituído por um outro aminoácido. A proteína de fusão pode conter outros componentes tal como por exemplo uma marcação de afinidade ou uma seqüência de epítopo para um anticorpo que permite a imobilização ou a purificação posterior da proteína de fusão ou de suas partes. Além disso, o códon de término pode estar localizado entre a região codificadora da hNGAL ou sua muteína e o segmento gênico para a proteína de revestimento ou seu fragmento, cujo códon de término, preferencialmente um códon de término âmbar, é pelo menos parcialmente traduzido em um aminoácido durante a tradução em uma cepa supressora adequada.

Os fasmídeos que significam plasmídeos que carregam a região intergênica de um fago filamentoso bacteriano, tal como por exemplo M13 ou f1 (Beck e Zink, Gene 16 (1981), 35-58) ou uma parte funcional da mesma, de forma que durante a superinfecção das células bacterianas com um fago auxiliador, por exemplo M13K07, VCS-M13 ou R408, um filamento do DNA circular do fasmídeo é empacotado com proteínas de revestimento e é exportado para o meio na forma do assim chamado fagemídeo. Por outro lado, este fagemídeo possui a muteína da hNGAL codificada pelo respectivo fasmídeo montada em sua superfície na forma de uma fusão com a proteína de revestimento plll ou seu fragmento, em que a seqüência sinal da proteína de fusão é norrnaimente ciivada. Por outro lado este carrega uma ou mais cópias da proteína de revestimento plll nativa proveniente do fago auxiliador e assim é capaz de infectar um receptor geralmente uma cepa bacteriana que carrega um plasmídeo F ou F. Desta maneira garante-se um acoplamento físico entre o ácido nucléico empacotado que carrega a informação genética para a respectiva muteína da hNGAL e a proteína codificada que é pelo menos parcialmente apresentada na forma funcional na superfície do fagemídeo. O vetor phNGALõ (Figura 1) pode ser utilizado por exemplo na construção do fasmídeo com as seqüências que codificam as muteínas da hNGAL. O ácido nucléico que codifica as alças peptídicas pode, por exemplo, ser inserido no vetor phNGAL5 através de ambos os sítios de restrição BstXI. Os fasmídeos recombinantes são incorporados através da transformação na cepa de E. coli, por exemplo XL1-blue (Bullock e outros, BioTechniques 5 (1987), 376-379) ou TG1. Desta forma, são produzidos clones que podem produzir muitas muteínas diferentes da hNGAL na forma de proteínas de fusão.

Esta biblioteca, isto é o conjunto dos clones obtidos, é subsequentemente superinfectada em cultura líquida de acordo com métodos conhecidos com um fago auxiliador M13. Após esta infecção a temperatura de incubação da cultura pode ser reduzida para a produção de fagemídeos. As temperaturas de incubação preferidas são aquelas em que se espera o do-bramento ótimo da muteína de hNGAL como um componente da proteína de fusão com a proteína de revestimento do fago ou seu fragmento. Durante ou após a fase de infecção a expressão do gene para a proteína de fusão com a muteína de hNGAL pode ser induzida nas células bacterianas, por exemplo através da adição de anidrotetraciclina. São escolhidas as condições de indução de forma que uma fração substancial dos fagemídeos produzidos apresente pelo menos uma muteína da hNGAL. Os fagemídeos são isolados após uma fase de incubação da cultura de por exemplo 6 até 8 horas. São conhecidos vários métodos para o isolamento dos fagemídeos, tal como por exemplo a precipitação com polietileno glicol.

Os fagemídeos isolados podem ser submetidos a uma seleção através ua incubação com o alvo desejado, em que o alvo está presente em uma forma que permite pelo menos uma imobilização temporária de tais fagemídeos que carregam as muteínas com a atividade de ligação desejada na forma de proteínas de fusão em seu revestimento. Entre as várias modalidades conhecidas pelo versado na técnica, o alvo pode ser por exemplo conjugado com uma proteína veículo tal como a albumina do soro e pode ser ligado através desta proteína carreadora a uma superfície que se liga à proteína, por exemplo o poliestireno. As placas para microtitulação adequadas para as técnicas de ELISA ou os assim chamados "adesivos imunológicos" podem ser preferencialmente utilizados para esta imobilização do alvo. Alternativamente, os conjugados do alvo podem ser também implementados com outros grupos de ligação tal como por exemplo a biotina. O alvo pode ser então imobilizado sobre superfícies que se ligam seletivamente a este grupo, tais como por exemplo placas para microtitulação ou partículas paramagné-ticas revestidas com estreptavidina ou avidina.

Os sítios residuais de ligação à proteína ou ao fagemídeo presentes nas superfícies que são carregadas com os alvos podem ser saturados com soluções de bloqueio conhecidas para os métodos de ELISA. Os fagemídeos são por exemplo subseqüentemente colocados em contato em um tampão fisiológico com o alvo imobilizado na superfície. Os fagemídeos não-ligados são removidos através de várias lavagens. As partículas de fagemídeos que permanecem na superfície são subseqüentemente eluídas. Para a eluição, o alvo livre pode ser adicionado na forma de uma solução.

Mas os fagemídeos também podem ser eluídos através da adição de proteases ou, por exemplo, na presença de ácidos, bases, detergentes ou sais caotrópicos ou sob condições moderadamente desnaturantes. Um método preferido é a eluição utilizando tampões de pH 2,2, em que o eluato é subse-qüentemente neutralizado.

Depois disso, as células de E. coli são infectadas com os fagemídeos eluídos utilizando métodos geralmente conhecidos. Os ácidos nu-cléicos podem ser também extraídos dos fagemídeos eluídos e ser incorporados nas células de outra forma. Partindo dos clones de E. coli obtidos desta maneira, os fagemídeos são por sua vez gerados através da superin-fecção com fagos M13 auxiliadores de acordo com o método descrito anteriormente e os fagemídeos propagados desta forma são mais uma vez submetidos a uma seleção na superfície com o alvo imobilizado. Os vários ciclos de seleção são freqüentemente necessários com a finalidade de se obter os fagemídeos com as muteínas da invenção na forma enriquecida. O número de ciclos de seleção é preferencialmente escolhido de forma que na análise funcional subseqüente pelo menos 0,1% dos clones estudados produza muteínas com afinidade detectável ao alvo fornecido. Dependendo do tamanho, isto é da complexidade da biblioteca empregada, são tipicamente necessários 2 até 8 ciclos para esta finalidade.

Para a análise funcional das muteínas selecionadas, uma cepa de E. coli é infectada com os fagemídeos obtidos dos ciclos de seleção e é isolado o DNA de filamento duplo correspondente do fasmídeo. Partindo deste DNA de fasmídeo ou ainda do DNA de filamento simples extraído dos fagemídeos, as seqüências de ácido nucléico das muteínas selecionadas da invenção podem ser determinadas através dos métodos comuns para esta finalidade e a seqüência de aminoácido pode ser derivada das mesmas. A região mutada ou a seqüência da muteína inteira da hNGAL pode ser subclo-nada em um outro vetor de expressão e expressa em um organismo hospedeiro adequado. O phNGAL7 pode ser utilizado por exemplo como o vetor de expressão (conforme Figura 3) e a expressão com os derivados do phNGAL7 pode ser realizada em cepas de E. coli, por exemplo E. co//-TG1.

As muteínas da hNGAL produzidas através da engenharia genética podem ser purificadas através de vários métodos químicos protéicos. As muteínas de hNGAL produzidas por exemplo com o phNGAL7 carregam o peptídeo de afinidade Strep-Tag II (Schimdt e outros, supra) e seu C-terminal e podem portanto preferencialmente ser purificadas através da cromatografia por afinidade pela estreptavidina. A seleção também pode ser realizada através de outros métodos. Muitas modalidades correspondentes são conhecidas pelo versado na técnica ou estão descritas na literatura. Uma combinação de métodos também pude ser aplicada. Por exemplo, os clones selecionados ou pelo menos enriquecido pela "exibição de fagos" pode ser adicionalmente submetido a uma "seleção de colônias". Este procedimento possui a vantagem de que os clones individuais podem ser isolados diretamente em relação à produção de uma muteína de hNGAL com afinidade de ligação detectável para um alvo.

Em adição ao uso de E. coli como organismo hospedeiro na técnica de "exibição de fagos" ou no método de "seleção de colônias", outras cepas bacterianas, leveduras ou ainda células de insetos ou células de mamíferos podem por exemplo ser utilizadas para esta finalidade. Em adição à seleção de uma muteína de hNGAL de uma biblioteca primária produzida partindo de uma seqüência de ácido nucléico codificadora de uma muteína, também podem ser aplicados métodos comparáveis com a finalidade de otimizar uma muteína em relação à afinidade ou à especificidade pelo alvo desejado através da mutagênese repetida, opcionalmente limitada de sua seqüência de ácido nucléico codificadora. É surpreendente que através do uso da invenção podem ser isoladas as muteínas de hNGAL que exibem afinidade detectável a um certo alvo (conforme Exemplos 4, 5). É adicionalmente possível submeter as muteínas produzidas a uma mutagênese aleatória adicional, opcionalmente parcial com a finalidade de selecionar variantes com afinidade ainda maior partindo da nova biblioteca obtida desta forma. Um procedimento correspondente já foi descrito para o caso de muteínas que se ligam à digoxigenina da proteína que se liga à bilina com a finalidade de uma "maturação da afinidade" (DE 199 26 068, WO 00/75308; Schlehuber e outros, supra) e pode também ser aplicado para uma muteína descrita aqui de uma forma correspondente pelo versado na técnica. A invenção é ainda ilustrada pelos exemplos não-limitantes a seguir e pelos desenhos em anexo em que: A Figura 1 representa esquematicamente o vetor fasmideal phNGAL5; A Figura 2 ilustra esquematicamente a produção da biblioteca de muteí-nas da lipocalina no nível de ácido nucléico; A Figura 3 representa esquematicamente o vetor de expressão phNGAL7; A Figura 4 representa esquematicamente o vetor de expressão pTLpc3; A Figura 5 representa a ligação da muteína TIpcA à lipocalina da Lágrima e um experimento de controle correspondente com hNGAL utilizando ELISA; A Figura 6 representa esquematicamente o vetor fasmideal phNGAL12;

A Figura 7 representa esquematicamente o vetor de expressão phNGALI 5; A Figura 8 representa a ligação das muteínas RFY-B, RFY-C e RFY-E - junto com a hNGAL como controle - com um peptídeo da tromboespondina (SEQ ID Ne: 18) em um ELISA; A Figura 9 representa a ligação das muteínas RFY-B, RFY-C e RFY-E -junto com a hNGAL como controle - com um peptídeo da tromboespondina (SEQ ID Ne: 18) de acordo com a espectroscopia por ressonância de superfície de plasmon (SPR); A Figura 10 representa a ligação da muteína N4 da hNGAL com a interleu-cina-8 em um ELISA; A Figura 11 representa esquematicamente o vetor de expressão pTNFa; A Figura 12 representa a ligação do TNFa com as muteínas TNF-V1 e TNF-V2 da hNGAL - junto com a hNGAL como um controle - em um ensaio de colônias pontuais. A Figura 1 exibe um desenho esquemático do phNGAL5. Este vetor codifica uma proteína de fusão da seqüência sinal OmpA, uma hNGAL modificada com três substituições de aminoácidos Gln28 para His, Leu137 para lie assim como Thr145 por Ala, a marcação de afinidade Strep-Tag II e uma forma encurtada da proteína de revestimento plll do M13, que compreende os aminoácidos 217 até 409 (plll). O gene estrutural inteiro é submetido ao controle transcricional do promotor/operador da tetraciclina (tetp/0) e termina no terminador da transcrição da lipoproteína (tipp). Os elementos adicionais do vetor são a origem de replicação (ori), a região intergênica do bacteriófago filamentoso f1 (f1-IG), o gene de resistência à ampicilina (bla) que codifica a β-lactamase e o gene repressor da tetraciclina (tetR). Um có-don de término âmbar, que é parcialmente traduzido em Gin nas cepas hospedeiras supressoras do âmbar SupE, fica localizado entre a região codifi-cadora da hNGAL com a seqüência sinal OmpA e a Strep-Tag II assim como a região codificadora da proteína plll truncada do revestimento do fago. Tanto os dois sítios de restrição BstXI utilizados para a clonagem do cassete gênico mutado quanto os sítios de restrição que flanqueiam o gene estrutural são marcados. Um segmento relevante da seqüência de ácido nucléico do phNGAL.5 é reproduzido junto com a seqüência de aminoácido codificada na seqüência que é listada como a SEQ ID N2: 7. O segmento começa com um sítio de restrição de Xbal e termina com o sítio de restrição de Hind\\\. Os elementos do vetor fora desta região são idênticos aos do vetor pASK75, cuja seqüência de nucleotídeos completa é fornecida na publicação de patente Alemã DE 44 17 598 A1. A Figura 2 exibe esquematicamente uma estratégia para a mu-tagênese planejada de 20 posições de aminoácidos selecionadas na hNGAL através da aplicação repetida da reação em cadeia da polimerase (PCR). Para cada uma das quatro alças peptídicas em que os aminoácidos têm que ser mutados, foi sintetizado um oligodesoxinucleotídeo, (SEQ ID N2: 1, SEQ ID N2: 2, SEQ ID N2: 3 e SEQ ID N2: 4), em que as respectivas misturas dos nucleotídeos fornecidos na listagem de seqüência foram empregadas nos sítios de mutação. Devido à composição escolhida, dos três códons de término possíveis juntos somente o códon de término âmbar, TAG, foi permitido nos códons mutados, que é traduzido na forma de glutamina nas cepas su-pE de E. coli XL1-blue (Bullock e outros, BioTechniques 5 (1987), 376-378) ou TG1 (Sambrook e outros, Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Press) que foram utilizadas para a expressão gênica. Para certas aplicações, por exemplo para a expressão gênica em outras cepas bacterianas ou organismos, tal códon sem sentido, quando ocorre no gene estrutural para uma muteína selecionada da hNGAL, pode ser substituído por um códon que codifica glutamina pelo versado na técnica, por exemplo através de mutagênese direcionada ao sítio. Um fragmento de ácido nucléico com 168 pares de bases foi amplificado (1. PCR, PCR A) com os iniciadores SEQ ID Ns: 1 e SEQ ID N8: 2 utilizando o DNA de plasmídeo de phNGALS (SEQ ID N8) contendo o cDNA da hNGAL clonado como molde. Em uma outra PCR, um fragmento de ácido nucléico com 179 pares de bases foi amplificado (1. PCR, PCR B) com os iniciadores SEQ ID N8: 3 e SEQ ID N9: 4, também utilizando phNGAL3 como molde. O phNGAL3 difere do phNGAL5 somente pelos dois sítios de restrição de físíXI faltando nas posições 283 e 630 e um sítio de restrição de SsfXI adicional na posição 675, exibindo as seqüências da hNGAL do tipo selvagem ali. A mistura de ambos os produtos da PCR, que foram parcialmente sobrepostas, serviu como molde em uma outra amplificação (2. PCR) com os dois iniciadores da PCR flanqueadores SEQ ID N8: 5 e SEQ ID N8: 6, em que um fragmento gênico de 386 pares de bases foi obtido. Este fragmento continha a mistura de todos os 20 códons mutados e foi subseqüentemente clonado utilizando os dois sítios de restrição de BsfXI no vetor phNGAL5. O uso destes dois sítios de restrição, cujo arranjo especial levou a duas extremidades de DNA penduradas incompatíveis durante a digestão de restrição, possibilitou uma ligação particularmente eficiente. A substituição dos aminoácidos Gln28 para His e Thr145 para Ala em relação à seqüência original assim como uma mutação silenciosa no códon para Ser156 foram previamente realizadas durante a construção do phNGAL5 com a finalidade de introduzir ambos os sítios de restrição de físfXI no gene estrutural da hNGAL. A Figura 3 mostra um desenho do phNGAL7. O phNGAL7 codifica uma proteína de fusão constituída pela seqüência sinal OmpA, uma hNGAL modificada de acordo com a Figura 1, a marcação de afinidade Strep-Tag® II e um domínio de ligação com a albumina (abd) da proteína G de Strepíococcus (Kraulis e outros, FEBS Lett. 378 (1996), 190-194). Todos os elementos genéticos adicionais são idênticos aos do phNGAL.5. Um segmento relevante da seqüência de ácido nucléico do phNGAL7 é reproduzido junto com a seqüência de aminoácidos codificada na listagem de seqüência como a SEQ ID NQ: 9. O segmento começa com o sítio de restrição de Xba\ e termina com o sítio de restrição de HindlW. Os elementos do vetor fora desta região são idênticos aos do vetor pASK75, cuja seqüência de nucleotídeos completa é fornecida na publicação de patente Alemã DE 44 17 598 A1. A Figura 4 mostra um desenho do pTLpc3. O pTLpc3 codifica uma proteína de fusão constituída pela seqüência sinal OmpA, uma Lipoca-lina da Lágrima humana modificada com a substituição de aminoácido Cys97 para Ser e a marcação de afinidade Strep-Tag® II. Todos os elementos genéticos adicionais são idênticos aos do phNGALõ. Um segmento relevante da seqüência de ácido nucléico do pTLpc3 é reproduzido junto com a seqüência de aminoácidos codificada na listagem de seqüência como a SEQ ID N°: 9. O segmento começa com o sítio de restrição de Xba\ e termina com o sítio de restrição de Hind\\\. Os elementos do vetor fora desta região são idênticos aos do vetor pASK75, cuja seqüência de nucleotídeos completa é fornecida na publicação de patente Alemã DE 44 17 598 A1. A Figura 5 exibe uma representação gráfica dos dados provenientes do Exemplo 5, em que as medidas de ligação com a muteína TIpcA da hNGAL foram realizadas através de um Ensaio Imunoabsorvente ligado à Enzima (ELISA). A ligação da TIpcA e a lipocalina da Lágrima (quadrados) foi comparada com a interação da hNGAL e a lipocalina da Lágrima (cículos abertos). A TIpcA se liga à lipocalina da Lágrima de uma forma dependente da concentração. A hNGAL não exibe um sinal de ligação significativo. A Figura 6 exibe um desenho esquemático do phNGAL12. Este vetor codifica uma proteína de fusão da seqüência sinal OmpA, uma hNGAL modificada com as quatro substituições de aminoácidos Gln28 para His, Cys87 para Ser, Leu137 para lie assim como Thr145 para Ala, a marcação de afinidade Strep-Tag® II e uma forma encurtada da proteína plll de reves- timento do M13, que compreende os aminoácidos 217 até 406 (plll). Em adição, o phNGAL12 carrega duas mutações pontuais dentro da região codifi-cadora da seqüência sinal OmpA com a finalidade de remover um sítio de restrição de EcoK12. O gene estrutural inteiro é submetido ao controle trans-cricional pelo promotor/operador da tetraciclina (tet0/p) e termina no termina-dor da transcrição da lipoproteína (tipp). Os elementos adicionais do vetor compreendem a origem de replicação (ori), a região intergênica do bacterió-fago filamentoso f1 (Í1-IG), o gene de resistência à ampicilina (bla) que codifica a β-lacmatase e o gene repressor da tetraciclina (tetR). Um códon de término âmbar, que é parcialmente traduzido em Gin nas cepas hospedeiras supressoras do âmbar supE, fica localizado entre a região da hNGAL, fundido com a seqüência sinal OmpA e a Strep-Tag® II e a região codificadora da proteína de revestimento truncada plll do fago. Os dois sítios de restrição de BstXI utilizados para a clonagem do cassete gênico mutado e os sítios de restrição que flanqueiam o gene estrutural são marcados. Um segmento relevante da seqüência de ácido nucléico do phNGAL12 é reproduzido junto com a seqüência de aminoácidos codificada na listagem de seqüência como a SEQ ID N°: 19. O segmento começa com o sítio de restrição de Xba\ e termina com o sítio de restrição de Hind\II. Os elementos do vetor fora desta região são idênticos aos do vetor pASK75, cuja seqüência de nucleotídeos completa é fornecida na publicação de patente Alemã DE 44 17 598 A1. A Figura 7 exibe um desenho esquemático do phNGAL15. O phNGAL15 codifica uma proteína de fusão da seqüência sinal OmpA com uma hNGAL modificada de acordo com a Figura 6 e a marcação de afinidade Strep-Tag® II. O phNGAL15 carrega as mesmas mutações silenciosas dentro da região codificadora da seqüência sinal OmpA que o phNGAL12. Um segmento relevante da seqüência de ácido nucléico do phNGAL15 é reproduzido junto com a seqüência de aminoácidos codificada na listagem de seqüência como a SEQ ID Ne: 21. O segmento começa com o sítio de restrição de Xbal e termina com o sítio de restrição de Hind\\\. Os elementos do vetor adequados fora desta região são idênticos aos do vetor pASK75, cuja seqüência de nucleotídeos completa é fornecida na publicação de pa- tente Alemã DE 44 17 598 A1. A Figura 8 exibe uma representação gráfica dos dados do Exemplo 10, em que as medidas de ligação com as muteínas da hNGAL e um peptídeo da tromboespondina foram realizadas através do Ensaio Imunoabsorvente ligado à Enzima (ELISA). A ligação das muteínas da hNGAL RFY-B (círculos), RFY-C (quadrados) e RFY-E (diamantes) com o peptídeo da tromboespondina foi comparada com a interação da hNGAL (triângulos) e o peptídeo da tromboespondina. O peptídeo da tromboespondina foi imobilizado em uma placa para microtitulação revestida com avidina através de um grupo biotina ligado ao seu C-terminal. As muteínas da hNGAL se ligam ao peptídeo da tromboespondina de uma maneira dependente da concentração, enquanto que a hNGAL não dá origem a um sinal de ligação significativo. Foi observado um baixo nível de reatividade cruzada entre as muteínas da hNGAL e a avidina na ausência do peptídeo (símbolos abertos). A Figura 9 exibe uma representação gráfica dos dados do Exemplo 11, em que as medidas de ligação com as muteínas da hNGAL a um peptídeo da tromboespondina foram realizadas empregando a espectroscopia por ressonância de superfície de plasmon (SPR). As interações moleculares entre as muteínas da hNGAL RFY-B (círculos), RFY-C (quadrados) e RFY-E (diamantes), respectivamente, com o peptídeo da tromboespondina foram comparadas com a interação entre a hNGAL (triângulos) e o peptídeo da tromboespondina. As muteínas da hNGAL se ligam ao peptídeo da tromboespondina de uma maneira dependente da concentração, enquanto que a hNGAL não dá origem a um sinal de ligação significativo. Não foi detectada qualquer reatividade cruzada das muteínas da hNGAL com o chip sensor SA (não-mostrado). A Figura 10 exibe uma representação gráfica dos dados do Exemplo 15, em que as medidas de ligação com a muteína N4 da hNGAL foram realizadas através de um Ensaio Imunoabsorvente ligado à Enzima (ELISA). A interleucina-8 foi imobilizada sobre a placa para microtitulação revestida com avidina através de grupos biotina ligados aos seus resíduos de lisina. A ligação da muteína N4 da hNGAL à interleucina-8 (círculos pre- enchidos) foi comparada com a interação da muteína N4 da hNGAL somente com a avidina (círculos abertos). A muteína N4 da hNGAL se liga à interleu-cina-8 de uma maneira dependente da concentração, enquanto que não exibe sinal de ligação significativo somente com a avidina. A Figura 11 exibe um desenho esquemático do plasmídeo pTNFa. Os códigos do pTNFa para uma proteína de fusão constituída da forma madura do Fator de Necrose de Tumor α (TNFa) assim como uma marcação de hexahistidina em seu N-terminal. Todos os elementos genéticos adicionais são idênticos aos do plasmídeo pRSET (Schoepfer, Gene 124 (1993), 82-85). Um segmento relevante da seqüência de ácido nucléico do pTNFa é reproduzido junto com a seqüência de aminoácidos codificada na listagem de seqüência como a SEQ ID N°: 31. O segmento começa com o sítio de restrição Nde\ e termina com o sítio de restrição Hind\\\. Os elementos do vetor fora desta região são idênticos aos do vetor pRSET5a, cuja seqüência de nucleotídeos completa é fornecida sob o N- de acesso de EMBL X54202. A Figura 12 (A) mostra o resultado do ensaio de colônias pontuais do Exemplo 18, em que foi testada a ligação do TNFa trimérico às mu-teínas imobilizadas da hNGAL. As células de E. coli TG1-F' expressando as proteínas de fusão ABD a seguir foram salpicadas quatro ou cinco vezes sobre uma membrana hídrofílica de acordo com (B): hNGAL, a proteína de ligação com a bilina (BBP), duas muteínas não-relacionadas provenientes da biblioteca descrita no Exemplo 6, 9 clones isolados no ensaio de seleção de colônias descrito no Exemplo 17 e - como um controle - nenhuma proteína. As muteínas secretadas das respectivas colônias foram imobilizadas sobre uma membrana hidrofóbica revestida com HSA como descrito no Exemplo 18. A ligação do TNFa digoxigenado foi visualizada empregando um conjugado Fab-Fosfatase Alcalina antidígoxigenina. (B) representa as posições em que os respectivos clones foram salpicados sobre a membrana.

Exemplos Exemplo 1: Produção de uma biblioteca para muteínas da hNGAL A não ser que seja indicado de forma diferente, foram utilizados métodos de engenharia genética conhecidos pelo versado na técnica, como por exemplo os descritos em Sambrook e outros (supra). A PCR foi aplicada em várias etapas de acordo com a Figura 2 para a mutagênese planejada de no total 20 posições de aminoácidos selecionadas nas quatro alças peptídicas da hNGAL. As reações da PCR foram realizadas em um volume de 100 μι em ambas as primeiras etapas de amplificação, em que foram empregados 20 ng de DNA de plasmídeo do phNGAL3 como molde junto com 50 pmoles de cada um dos respectivos iniciadores (SEQ ID NP: 1 e SEQ ID N3: 2 ou SEQ ID Ns: 3 e SEQ ID N3: 4, respectivamente), que foram sintetizados de acordo com o método convencional da fosforoamidita. Em adição, a mistura de reação continha 10 μί do tampão Taq 10x (Tris/HCI 100 mM pH 9,0, KCI 500 mM, MgCfe 15 mM, 1% v/v de Triton X-100), 10 μί de Mix dos dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 2 mM). Após completar o volume com água, foram adicionadas 5 U da DNA polime-rase Taq (5 υ/μί, Promega) e foram realizados 20 ciclos de temperatura de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 60°C e 1,5 minuto a 72°C em um termociclador com uma tampa aquecida (Eppendorf), seguidos por uma incubação durante 5 minutos a 60°C. Os produtos da amplificação desejados foram isolados através da eletroforese preparatória em gel de agarose da Agarose com Baixo ponto de Fusão (Roche Diagnostics) utilizando o kit de extração de DNA Jetsorb (Genomed). A etapa de amplificação subseqüente também foi realizada em uma mistura de 100 μΙ_, em que aproximadamente 6 ng de ambos os respectivos fragmentos foram utilizados como moldes, na presença de 50 pmoles de cada um dos iniciadores SEQ ID N3: 5 e SEQ ID N3: 6. Os componentes restantes da mistura da PCR foram adicionados nas mesmas quantidades que nas etapas de amplificação anteriores. A PCR ocorreu com 20 ciclos de temperatura de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 55°C, 1,5 minuto a 72°C, seguidos por uma incubação subseqüente durante 5 minutos a 60°C. O produto da PCR foi purificado utilizando E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit (PeqLab).

Para a clonagem deste fragmento, que representava a biblioteca das muteínas da hNGAL na forma de ácido nucléico, este foi primeiro corta- do com a enzima de restrição BsfXI (New England Biolabs) de acordo com as instruções do fabricante e purificado através do E.Z.N.A Cycle-Pure Kit. Após uma segunda digestão de restrição com BstXI, o fragmento de ácido nucléico foi purificado através da eletroforese preparatória em gel de agaro-se, resultando em um fragmento de DNA de filamento duplo de 347 nucleo-tídeos de tamanho. O DNA do vetor phNGALõ foi cortado com BstXI da mesma maneira e o maior dos dois fragmentos resultantes (3971 pb) foi isolado.

Para a ligação, 2,75 μg (12 pmoles) do fragmento da PCR e 31,45 μς (12 pmoles) do fragmento do vetor foram incubados na presença de 180 Unidades Weiss da T4 DNA ligase (New England Biolabs) em um volume total de 600 μΙ_ (Tris/HCI 50 mM pH 7,8, MgCI2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, 50 μg/mL de BSA) durante quatro dias a 16°C. O DNA foi subse-qüentemente precipitado através da adição de 50 pg de tRNA de levedura (Boehringer Mannheim), 125 pL de acetato de amônio 5 M e 500 pL de eta-nol por 120 pL de mistura de ligação. A incubação a -20°C durante três dias foi seguida pela centrifugação (30 minutos, 16000 g, 4°C). Cada precipitado foi lavado com 750 pL de etanol (70% v/v, -20°C), centrifugado (5 minutos, 16000 g, 4°C) e seco a vácuo (2 minutos). O DNA foi finalmente dissolvido em 200 pL de TE/10 (Tris/HC11 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM pH 8,0) e ajustado com água para um volume final de 260 pL. A preparação de células eletrocompetentes da cepa XL1 -blue de E. coli K12 (Bullock e outros, supra) foi realizada de acordo com os métodos descritos porTung e Chow (Trends Genet. 11 (1995), 128-129) e por Hen-gen (Trends Biochem. Sei. 21 (1996), 75-76). 1 L de meio LB foi ajustado através da adição de uma cultura estacionária de XL1-blue cultivada a noite toda até uma densidade óptica a 600 nm de Οϋεοο = 0,08 e foi incubado a 200 rpm e 26°C em um frasco Erlenmeyer de 2 L. Após atingir uma OD6oo = 0,6, a cultura foi resfriada durante 30 minutos em gelo e foi subseqüente-mente centrifugada durante 15 minutos a 4000 g e 4°C. O sedimento de células foi lavado duas vezes com 500 mL de glicerol 10% p/v gelado e foi finalmente ressuspenso em 2 mL de meio GYT gelado (glicerol 10% p/v, ex- trato de levedura 0,125% p/v, triptona 0,25% p/v). O sistema Micro Pulser (BioRad) foi utilizado com as cubetas do mesmo fabricante (separação de eletrodos de 2 mm) para a eletroporação. Todas as etapas foram realizadas na câmara fria a 4°C. Cada 5 pL da solução de DNA mencionada anteriormente foram misturados com 40 μΙ_ da suspensão de células, incubados durante 1 minuto em gelo e finalmente transferidos para a cubeta. Após a eletroporação a suspensão foi imediatamente diluída em 2 mL de meio SOC gelado (triptona 2% p/v, extrato de levedura 0,5% p/v, NaCI 10 mM, MgSÜ4 10 mM, MgCI? 10 mM) e foi agitada durante 60 minutos a 37°C e 200 rpm. A cultura foi diluída em 2 L de meio 2xYT com 100 pg/mL de ampicilina (2YT/Amp) e cultivada até a OD550 gerada pelas células em replicação ser aumentada para 0,64. Empregando no total 34,2 pg do DNA ligado, foram obtidos 7x107 transformantes desta maneira com 49 rodadas de eletroporação. Os transformantes foram adicionalmente utilizados de acordo com o Exemplo 2.

Exemplo 2: Apresentação por fagemídeo e seleção das muteínas da hNGAL contra a Lipocalina da Lágrima humana 200 mL da cultura, contendo as células que foram transformadas com os vetores de fasmídeo similares ao phNGAL5 codificando a biblioteca das muteínas da lipocalina na forma de proteínas de fusão, foram transferidos para um frasco Erlenmeyer esterilizado. Após a infecção com o fago auxiliador VCS-M13 (Stratagene) a uma multiplicidade de infecção de aproximadamente 10 a cultura foi agitada durante mais 30 minutos a 37°C, 160 rpm. Foi subseqüentemente adicionada a canamicina (70 pg/mL), a temperatura da incubadora foi diminuída para 30°C e, após 10 minutos, foi adicionada a ani-drotetraciclina (ACROS Organics) a 100 pg/L (200 pL de uma solução estoque de 100 pg/mL em dimetilformamida, DMF) com a finalidade de induzir a expressão gênica. A incubação foi mantida durante mais 5 horas a 30°C, 160 rpm.

Foram removidos 50 mL desta cultura e as células foram sedimentadas através de centrifugação (15 minutos, 12000 g, 4°C). O sobrena-dante contendo as partículas de fagemídeo foi esterilizado por filtração (0,45 pm), misturado com ΛΑ de volume (12,5 mL) de PEG 8000 20% p/v, NaCI 15% p/v e incubado durante a noite a 4°C. Após a centrifugação (20 minutos, 18000 g, 4°C) as partículas de fagemídeos precipitadas foram dissolvidas em 2 mL de PBS gelado (KH2P04 4 mM, Na2HP04 16 mM, NaCI 115 mM, pH 7,4). A solução foi incubada em gelo durante 30 minutos e foi distribuída em dois recipientes de reação de 1,5 mL. Após a centrifugação dos componentes não-dissolvidos (5 minutos, 18500 g, 4°C) cada sobrenadante foi transferido para um novo recipiente de reação. A mistura com Ά de volume de PEG 8000 20% p/v, NaCI 15% p/v e a incubação durante 30 até 60 minutos em gelo serviu para reprecipitar as partículas de fagemídeo. Após a centrifugação (20 minutos, 18500 g, 4°C) o sobrenadante foi removido e as partículas de fagemídeo precipitadas foram dissolvidas e combinadas em um total de 400 pL de PBS. Após a incubação durante 30 minutos em gelo a solução foi centrifugada (5 minutos, 18500 g, 4°C) com a finalidade de remover agregados residuais e o sobrenadante foi utilizado diretamente para o enriquecimento da afinidade.

Os adesivos imunológicos (NUNC) foram utilizados para o enriquecimento da afinidade dos fagemídeos recombinantes carregando as proteínas de fusão com a muteína da hNGAL. Estes foram revestidos durante a noite com 800 pL de Lipocalina da Lágrima humana (Tlpc) (450 pg/mL) em PBS.

Para a produção da Tlpc recombinante, as células de E. coli JM83 (Yanisch-Perron e outros, Gene 33 (1985), 103-119) foram transformadas com o plasmídeo de expressão pTLpc3 que carrega o cDNA da Tlpc (para o cDNA da Tlpc, ver Holzfeind e Redl, Gene 139 (1994), 177-183) e utilizadas para a produção e a purificação da proteína de acordo com o exemplo 3. O rendimento de proteína foi de 2,2 mg por 1 L de volume de cultura.

Os sítios de ligação desocupados na superfície do Adesivo Imunológico foram saturados através da incubação com 1,2 mL de BSA 2% p/v em PBST (PBS com 0,1% v/v de Tween 20) durante 2 horas à temperatura ambiente. Depois disso o Adesivo Imunológico foi incubado com uma mistura de 250 pL da solução de fagemídeo e de 500 pL do tampão de blo- queio (3% p/v de BSA em PBST) durante 1 hora à temperatura ambiente.

Para a remoção dos fagemídeos que não se ligam, foi realizada uma lavagem oito vezes, cada vez com 950 μΙ_ de PBST durante 2 minutos. Os fagemídeos adsorvidos foram finalmente eluídos através de um tratamento de 10 minutos do Adesivo Imunológico com 950 pL de glicina/HCI 0,1 M pH 2,2, seguido pela neutralização imediata do pH da fração de eluição misturando-a com 150 μΙ_ de Tris 0,5 M.

Para a amplificação, a solução do fagemídeo (1,1 ml_, contendo entre 106 e 108 Unidades Formadoras de Colônia, dependendo do ciclo da seleção) foi brevemente aquecida até 37°C, misturada com 3 mL de uma cultura em crescimento exponencial de E. coli XL1-blue (OD550 = 0,5) e incubada durante 30 minutos a 37°C, 200 rpm. As células infectadas com os fagemídeos foram subseqüentemente sedimentadas (2 minutos, 4420 g, 4°C), ressuspensas em 600 μι. do meio de cultura e plaqueadas em três placas de ágar com meio LB contendo 100 pg/mL de ampicilina (LB/Amp; 140 mm de diâmetro).

Após a incubação durante 14 horas a 32°C, as células foram raspadas das placas de ágar, cada uma com a adição de 10 mL de meio 2xYT/Amp, foram transferidas para um frasco Erlenmeyer esterilizado e foram agitadas durante 20 minutos a 37°C, 200 rpm para a suspensão completa. 200 mL de meio 2xYT/Amp preaquecidos até 37°C foram inoculados em uma OD550 = 0,08 com um volume apropriado desta suspensão.

Para a produção repetida e para o enriquecimento da afinidade das partículas de fagemídeo o mesmo procedimento descrito no início deste exemplo foi utilizado. Nestes casos 50 mL de meio 2xYT/Amp foram inoculados com 0,2 até 1 mL da suspensão das células cultivadas nas placas de ágar e os fagemídeos foram produzidos durante um período de sete ao invés de cinco horas a 30°C. Foram realizados através desta maneira quatro ciclos de seleção adicionais com a Tlpc.

Exemplo 3: Identificação de muteínas da hNGAL que se ligam à Lipocalina da Lágrima humana através do uso do método de "seleção de colônias" Para a produção analítica das muteínas da hNGAL na forma de proteínas de fusão com a Strep-Tag® II assim como com o domínio de ligação com a albumina e a sua caracterização através da seleção de colônias, o cassete gênico entre os dois sítios de divagem de BstXI foi subclonado do vetor phNGALõ no phNGAL7.

Para esta finalidade o DNA do fasmídeo foi isolado da mistura dos clones de E. coli obtidos através da infecção com os fagemídeos do Exemplo 2 eluídos como um resultado dos últimos ciclos de seleção, utilizando o Perfectprep Plasmid Midi Kit (Eppendorf). O DNA foi cortado com a enzima de restrição BstXI e o menor dos dois fragmentos (347 pb) foi purificado através da eletroforese preparatória em gel de agarose que é descrita no Exemplo 1. O DNA do vetor phNGAL7 foi cortado com BsfXI e o maior dos dois fragmentos (3971 pb) foi isolado da mesma forma.

Para a ligação, cada 100 fmoles dos dois fragmentos de DNA foram misturados com 1,5 Unidade Weiss da T4 DNA ligase (Promega) em um volume total de 20 μΙ_ (Tris/HCI 30 mM pH 7,8, MgCU 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM), seguido pela incubação durante a noite a 16°C. A E. coli TG1-F" (E. coli K12 TG1, que perdeu seu epissomo através da cultura repetida sob condições não-seletivas) foi transformada com 2 μΙ_ desta mistura de ligação de acordo com o método de CaCb (Sambrook e outros, supra).

Uma membrana hidrofílica de PVDF (Millipore, tipo GVWP, tamanho de poro 0,22 μίτι), marcada na posição e cortada do tamanho, foi colocada sobre uma placa de LB/Amp com ágar. 150 μΙ_ da suspensão de células provenientes da batelada de transformação, que foi centrifugada (5000 g, 2 min, 4°C) e ressuspensa em 500 μι do meio de cultura, foram plaqueadas uniformemente sobre esta membrana. A placa de ágar foi incubada durante 7,5 horas a 37°C até que as colônias tivessem atingido um tamanho de aproximadamente 0,5 mm.

Nesse meio tempo uma membrana hidrofóbica (Millipore, Immo-bilon P, tamanho de poro 0,45 μητι) também cortada do tamanho, foi umede-cida com PBS de acordo com as instruções do fabricante. Foi subseqüente-mente agitada durante 4 horas à temperatura ambiente em uma solução de 10 mg/mL de albumina do soro humano (HSA, Sigma) em PBS. Os sítios de ligação remanescentes na membrana foram saturados através da incubação com BSA 3% p/v, Tween 20 0,5% v/v em PBS durante 2 horas à temperatura ambiente. A membrana foi lavada duas vezes durante 10 minutos cada com 20 mL de PBS e agitada depois disso durante 10 minutos em 10 mL de meio LB/Amp, aos quais foram adicionados 200 pg/L de anidrotetraciclina. Esta foi subseqüentemente marcada em uma posição e colocada sobre uma placa de cultura com LB/Amp com ágar, que continha adicionalmente 200 pg/L de anidrotetraciclina. A membrana hidrofílica sobre as quais as colônias cresceram foi colocada sobre a membrana hidrofóbica de forma que ambas as marcas ficaram sobrepostas. A placa de cultura foi incubada com ambas as membranas a 22°C durante 15 horas. Durante esta fase as respectivas muteínas da hNGAL foram secretadas das colônias e foram imobilizadas através do domínio de ligação com a albumina na HSA na membrana inferior.

Depois disso, a membrana superior com as colônias foi transferida para uma placa de LB/Amp com ágar fresca e foi armazenada a 4°C. A membrana hidrofóbica foi removida, lavada três vezes durante 5 minutos cada com 20 mL de PBST e subseqüentemente incubada durante 1 hora em 10 mL de uma solução de um conjugado (10 μg/mL) da lipocalina da Lágrima e a biotina em PBST. Para a produção do conjugado, uma solução de 0,285 mg do éster N-hidroxissuccinimida do ácido D-biotinoil-e-amidoca-próico (Roche) em 9 μί de DMSO foi lentamente adicionada a 2,5 mL de Tlpc 450 μg/mL em NaHC03 5% p/v (pH 8,2). Após agitar durante 1 hora à temperatura ambiente, o reagente em excesso foi removido através de uma coluna de filtração em gel PD-10 (Pharmacia) utilizando PBS como o tampão de corrida.

Após a incubação com o conjugado, a membrana foi lavada três vezes com PBST, seguidas pela incubação durante 1 hora com 10 mL de conjugado alcalina avidina-fosfatase (Sigma, diluição 1:40000 em PBST). A membrana foi subseqüentemente lavada duas vezes cada uma com PBST e uma vez com PBS durante 5 minutos e agitada durante 10 minutos em tampão AP (Tris/HCI 0,1 M pH 8,8, NaCI 0,1 M, MgCI2 5 mM). Para a reação cromogênica, a membrana foi incubada em 10 mL de tampão AP, ao qual foram adicionados 30 μι do sal de 4-toluidina fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila (Roth, 50 pg/mL em dimetilformamida) e 5 μΙ_ de nitro azul de tetra-zólio (Roth, 75 pg/mL em 70% v/v de dimetilformamida), até que sinais coloridos distintos pudessem ser reconhecidos nas posições de algumas das colônias. Desta maneira foi detectada a atividade de ligação para o ligação da proteína, isto é Tlpc, das muteínas da hNGAL produzidas por estas colônias.

Doze das colônias que produzem pontos coloridos foram cultivadas partindo da primeira membrana. Seu DNA de plasmídeo foi isolado e o cassete gênico da hNGAL foi submetido à análise de seqüência através do uso do sistema Genetic Analyzer 310 (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante utilizando o oligodesoxinucleotídeo da SEQ ID N9: 11 como íniciador. Os doze clones seqüenciados exibiram somente oito seqüências diferentes, que foram denominadas TIpcA, TIpcB, TIpcC, TIpcD, TIpcE, TIpcF, TIpcG, TIpcH. O clone TIpcA foi encontrado cinco vezes. As seqüências de nucleotídeos dos clones foram traduzidas em seqüências de aminoácidos e tais aminoácidos que desviavam da hNGAL são fornecidos na Tabela 1. A seqüência de aminoácidos e a seqüência de nucleotídeos da muteína TIpcA são também fornecidas como a SEQ ID N9: 12 e a SEQ ID N9: 13. O seqüenciamento revelou códons de parada do tipo âmbar, que foram suprimidos nas cepas de E. coli empregadas, em posições diferentes em todas as variações selecionadas.

Exemplo 4: Produção das muteínas da hNGAL

Para a produção preparatória da hNGAL e de suas muteínas uma colônia selecionada assim como a hNGAL originalmente codificada no phNGAL7, como um controle, foram produzidas na cepa de E. coli TG1-F'.

Para esta finalidade, 100 mL do meio LB/Amp foram inoculados com uma única colônia do transformante TG1-F' carregando o respectivo plasmídeo e incubados durante a noite a 30°C, 200 rpm. 2 L de meio LB/Amp em um frasco Erlenmeyer de 5 L foram então inoculados com cada 40 mL desta pré-cultura e foram agitadas a 22°C, 200 rpm até uma OD550 = 0,5. A indução foi realizada através da adição de 200 pg/L de anidrotetraci- clina (200 μΙ_ de uma solução estoque em DMF) seguida por agitação durante 3 horas adicionais a 22°C, 200 rpm.

As células de um frasco foram centrifugadas (15 minutos, 4420 g, 4°C) e, após a decantação do sobrenadante, foram ressuspensas em 20 ml_ de tampão de liberação periplasmática (Tris/HCI 100 mM pH 8,0, sacarose 500 mM, EDTA 1 mM) com resfriamento durante 30 minutos em gelo. Sub-seqüentemente os esferoplastos foram removidos em duas etapas de cen-trifugação sucessivas (15 minutos, 4420 g, 4°C e 15 minutos, 30000 g, 4°C). O sobrenadante compreendendo o extrato protéico periplasmático foi submetido à diálise contra o tampão CP (Tris/HCI 100 mM pH 8,0, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM), esterilizado por filtração e serviu para a purificação cromato-gráfica. A purificação ocorreu através da marcação de afinidade Strep-Tag® II (Schmidt e outros, supra) que estava situada entre a variação da hNGAL e o domínio de ligação com a albumína. No presente caso foi empregada a muteína "1" com estreptavidina (Patente Alemã 196 41 876.3; Voss e Skerra, Protein Eng. 10 (1997), 975-982), que estava acoplada a uma sefarose ativada com NHS (Pharmacia) fornecendo 5 mg/mL de estreptavidina imobilizada, em relação ao volume de leito da matriz.

Uma coluna para cromatografia com volume de leito de 4 mL preenchida com este material foi equilibrada com 20 mL de tampão CP a 4°C em uma vazão de 40 mL/h. A cromatografia foi monitorada através da medida da absorção a 280 nm do eluato em um nitro azul de tetrazólio. Após a aplicação do extrato protéico periplasmático, a coluna foi lavada com tampão CP até que a linha de base fosse atingida e a muteína da hNGAL ligada foi subseqüentemente eluída com 10 mL de uma solução de D-destiobiotina 2,5 mM (Sigma) em tampão CP. As frações contendo a muteína hNGAL purificada foram verificadas através de eletroforese em gel de SDS-poliacrila-mida (Fling e Gregerson, Anal. Biochem. 155 (1986), 83-88) e foram agrupadas. Os rendimentos de proteínas ficavam entre 30 pg e 70 pg por 1 L de cultura.

Tabela 1: Características da seqüência das muteínas da hNGAL selecionadas Pos. hNGAL TIpcA TIpcB TIpcC TIpcD TIpcE TIpcF TIpcG TIpcH 40 Ala Cys Gly Leu Ser Vai Gly Arg Ala 42 Leu Vai Tyr Pro Vai Leu Ser Ser Cys 44 Glu Gin Tyr lie Phe Gin* Phe lie Pro 46 Lys Leu Gin* Gin* Gin* Cys Arg Phe Leu 47 Asp Leu Arg Ala Ser Trp Phe Gin* Phe 49 Gin Ser Trp lie Ser Cys Vai Vai Phe 50 Lys Met Ser Phe Ala Pro Gin Phe Leu 70 Leu Leu Leu Glu Gly Asp Ser Pro Gin* 72 Arg Met Arg Ala Asn Glu Gin* Ala Arg 73 Lys Asp Asp Tyr Lys Lys Gin Asn Pro 77 Asp Arg Pro Vai Asn Asn Trp lie Ser 79 Trp Tyr Met Lys Thr Vai Arg Ala Arg 101 Pro Gly Leu Tyr Tyr Pro Phe Vai Leu 102 Gly lie. Ser Leu Trp Vai Pro Vai Thr 103 Leu Vai Leu Tyr Gin* Leu Ser Thr Met 125 Lys Ser Trp Leu Gly Glu Arg Ala Lys 127 Ser Met Ala Cys Arg Ala Lys Lys Ser 128 Gin Thr Asp Pro Met Ser Ala Thr Asp 130 Arg Gin* Gin Gly Glu Gin His Lys Asp 132 Tyr Ala Trp Lys Thr Leu Ser Leu lie 55 lie Val° 98 Lys Asn0 *Estes resíduos de glutamina eram codificados pelos códons de término do tipo âmbar. °Estas substituições de aminoácidos ocorreram por causa das mutações aleatórias.

Exemplo 5: Medida da afinidade das muteínas da hNGAL para a Lipocalina da Lágrima Para a detecção da ligação em um ELISA (Ensaio Imunoabsor-vente ligado à Enzima) as cavidades de uma placa para microtitulação (Micro Test III Flexible Assay Plate; Falcon) foram preenchidas cada uma com 100 μΙ_ de uma solução 20 mg/mL de HSA em PBST e foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente (RT). Após lavar três vezes com PBST, 50 μΙ_ de uma solução 1 μΜ da proteína de fusão purificada da muteína TIpcA da hNGAL e da hNGAL do Exemplo 3 foram colocados dentro das cavidades de forma que a proteína ficasse imobilizada através da formação de complexos entre o abd e a HSA. Após uma hora a solução foi removida e lavada três vezes com PBST. Então foi preparada uma série de diluições em PBST de um conjugado da lipocalina da Lágrima e a biotina em PBST, partindo de 140 pg/mL, (Exemplo 3), seguida pela incubação de 1 hora à temperatura ambiente. Após lavar três vezes com PBST, o conjugado avidina-fosfatase alcalina (Sigma), diluído 1:10000 com PBST, foi colocado nas cavidades. A incubação foi realizada durante 1 hora à temperatura ambiente e seguida pela lavagem duas vezes com PBST e duas vezes com PBS. A detecção da lipocalina da Lágrima ligada nas muteínas da hNGAL imobilizadas foi realizada assim através da hidrólise do fosfato de p-nitrofenila, catalisada pela fosfatase alcalina. Para esta finalidade, 100 pL de uma solução de 0,5 mg/mL de fosfato de p-nitrofenila (Amresco) em tampão AP (NaCI 100 mM, MgCI2 5 mM, Tris/HCI 100 mM pH 8,8) foram colocados dentro das cavidades e a formação do produto foi monitorada através da medida da absorção a 405 nm em um fotômetro SpectraMax 250 (Molecular Devices).

Exemplo 6: Preparação de uma biblioteca com mais de 10 bilhões de muteínas independentes da hNGAL

Foi preparada uma biblioteca aleatória de hNGAL com maior diversidade através da mutagênese planejada de no total 20 posições de aminoácidos selecionadas nas quatro alças peptídicas utilizando a PCR em várias etapas de acordo com a Figura 2. As reações de PCR foram realizadas em um volume de 100 pL em ambas as primeiras etapas de amplificação, em que 10 ng do DNA de plasmídeo do phNGALõ (Figura 1) foram empregados como molde, junto com 50 pmoles de cada um dos pares de iniciadores (SEQ ID N2: 1 e SEQ ID N2: 2 ou SEQ ID N2: 3 e SEQ ID Ns: 4, respectivamente), que foram sintetizados de acordo com o método convencional da fosforoamidita. Em adição, a mistura de reação continha 10 pL do tampão da Taq 10x (Tris/HCI 100 mM pH 9,0, KCI 500 mM, MgCI2 15 mM, Triton X-100 1% v/v) e 10 pL de dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 2 mM). Após completar o volume com água, foram adicionados 5 U da DNA polimerase Taq (5 U/pL, Promega) e foram realizados 20 ciclos de temperatura de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 60°C e 1,5 minuto a 72°C em um ter-mociclador (thermocycler) com uma tampa aquecida (Eppendorf), seguidos por uma incubação final durante 5 minutos a 60°C. O produto da amplificação desejado foi isolado em cada caso através da eletroforese preparatória em gel de agarose da GTQ Agarose (Roth) utilizando o kit de extração de DNA Jetsorb (Genomed). A etapa de amplificação subseqüente foi também realizada em uma mistura de 100 pL, em que aproximadamente 6 ng dos dois fragmentos de DNA foram utilizados como molde na presença de 50 pmoles de cada um dos iniciadores SEQ ID N-: 5 e SEQ ID Ns: 6. Ambos estes iniciadores carregavam um grupo biotina em sua extremidade a 5’, em contraste com o Exemplo 1. Os componentes restantes da mistura para a PCR foram adicionados nas mesmas quantidades que nas etapas de amplificação anteriores. A PCR foi realizada com 20 ciclos de temperatura de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 60°C, 1,5 minuto a 72°C, seguidos por uma incubação subseqüente durante 5 minutos a 60°C. O produto da PCR foi purificado utilizando o E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit (PeqLab).

Para a clonagem do fragmento de DNA que representava a biblioteca das muteínas da hNGAL na forma de ácido nucléico, o produto da PCR biotinilado a 5’ foi cortado com a enzima de restrição SsfXI (Promega) de acordo com as instruções do fabricante e o fragmento resultante de 347 nucleotídeos de tamanho foi purificado através da eletroforese preparatória em gel de agarose como descrito anteriormente. Os fragmentos de DNA residuais que não foram ou foram digeridos de forma incompleta foram removidos através de suas marcações de biotina a 5’ incubando a sua solução com esferas paramagnéticas revestidas com estreptavidina (Dynal), obtendo assim o fragmento cortado duplamente adequado para a reação de ligação subseqüente.

Para esta finalidade, 100 μΙ_ da suspensão disponível comercialmente das partículas paramagnéticas em uma concentração de 10 mg/mL foram lavados três vezes com 100 μΙ_ de tampão TE. As partículas paramagnéticas foram então drenadas e misturadas com 11 até 22 pmoles do fragmento de DNA em 100 μΙ_ de tampão TE durante 15 min à temperatura ambiente. As partículas paramagnéticas foram coletadas na parede do recipiente Eppendorf com o auxílio de um magneto e o sobrenadante contendo o fragmento de DNA purificado foi recuperado para uso na reação de ligação a seguir. O DNA do vetor phNGAL (Figura 6) foi cortado com BsfXI como descrito anteriormente e o maior dos dois fragmentos resultantes (3971 pb) foi isolado através da eletroforese preparatória em gel de agarose. Para a ligação, 6,85 pg (30 pmoles) do fragmento da PCR e 78,65 pg (30 pmoles) do fragmento do vetor foram incubados na presença de 855 Unidades Weiss da T4 DNA ligase (Promega) em um volume total de 8550 pL (Tris/HCI 50 mM pH 7,8, MgCI2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, BSA 50 pg/mL) durante quatro dias a 16°C. O DNA foi então precipitado através da adição de 110 pg de tRNA de levedura (Boehringer Mannheim), 350 pL de acetato de amônio 5 M e 1300 pL de etanol por 350 pL da mistura de ligação. A incubação a -20°C durante dois dias foi seguida pela centrifugação (30 minutos, 16000 g, 4°C). Cada precipitado foi lavado com 750 pL de etanol (70% v/v, -20°C), centrifugado (5 minutos, 16000 g, 4°C) e seco a vácuo (2 minutos). O DNA foi finalmente dissolvido em um volume total de 427,5 pL de água para uma concentração final de 200 pg/mL. A preparação de células eletrocompetentes da cepa XL1-blue de E. coli K12 (Bullock e outros, supra) foi realizada de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1. O sistema Micro Pulser (BioRad) foi utilizado em associação às cubetas do mesmo fabricante (separação dos eletrodos 2 mm) para a eletro-poração. Todas as etapas foram realizadas na câmara fria a 4°C. Cada 10 pL da solução de DNA (2 pg) obtida anteriormente foram misturados com 100 pL da suspensão de células, incubados durante 1 minuto em gelo e transferidos para a cubeta pré-resfriada. Então foi realizada a eletroporação (5 ms, 12,5 kV/cm) e a suspensão foi imediatamente diluída em 2 mL de meio SOC gelado seguida pela agitação durante 60 minutos a 37°C e 200 rpm. A cultura foi diluída em 1,5 L de meio 2xYT contendo 100 pg/mL de ampicilina (2YT/Amp) até uma OD550 de 0,5 e cultivada a 37°C até a OD550 ter aumentado para 0,7 o que é causado pelas células em replicação. Empregando no total 85,5 pg do DNA ligado, 1.8Ί010 transformantes foram obtidos desta maneira utilizando 43 rodadas de eletroporação juntas. Os transformantes foram adicionalmente utilizados de acordo com o Exemplo 7.

Exemplo 7: Apresentação por fagemídeo e seleção das muteínas da hNGAL contra um peptídeo de oito aminoácidos proveniente do domínio de ligação da célula da Tromboespondina 1 humana ("peptídeo da tromboespondina") A cultura de 1500 mL, contendo as células que foram transformadas com os vetores de fasmídeo correspondendo ao phNGAL12, mas codificando a biblioteca das muteínas da lipocalina na forma de proteínas de fusão, foi infectada com 0 fago auxiliador VCS-M13 (Stratagene) a uma multiplicidade de infecção de aproximadamente 10. A cultura foi agitada durante mais 30 minutos a 37°C, 160 rpm. Então a temperatura da incubadora foi diminuída para 26°C e a Canamicina foi adicionada (70 pg/mL). Após 10 minutos, a anidrotetraciclina foi adicionada a 25 pg/L (1875 pL de uma solução estoque a 20 pg/mL em DMF) com a finalidade de induzir a expressão gêni-ca. A incubação continuou durante mais 15 horas a 26°C, 160 rpm.

As células foram sedimentadas por centrifugação (60 minutos, 12500 g, 4°C). O sobrenadante contendo as partículas de fagemídeo foi esterilizado por filtração (0,45 pm), misturado com % do volume (375 mL) de 20% p/v de PEG 8000 gelado, 15% p/v de NaCI e incubado durante uma hora a 4°C. Após a centrifugação (30 minutos, 18500 g, 4°C) as partículas de fagemídeo precipitadas foram dissolvidas em 60 mL de PBS gelado. A solução foi incubada em gelo durante 60 minutos e foi distribuída em dois tubos de centrifugação SS34. Após a centrifugação dos componentes não-dissolvidos (5 minutos, 18500 g, 4°C) cada sobrenadante foi transferido para um novo tubo de centrifugação.

As partículas de fagemídeo foram precipitadas novamente através da mistura com % do volume de 20% p/v de PEG 8000, 15% p/v de NaCI, seguida pela incubação durante 60 minutos em gelo. Os fagemídeos foram aliquotados (2 ml_) e foram adicionados EDTA 1 mM e benzamidina 50 mM (Sigma) para o armazenamento durante longo período a -20°C. O peptídeo sintético biotinilado da tromboespondina derivado do domínio de ligação celular da Tromboespondina 1 humana (Tulasne e outros, Blood 98 (2001), 3346-3352; H2N-Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met-Trp-Lys-Aca-Aca -Lys-Biotina-COOH, SEQ ID N°: 18, Aca: ácido amino capróico) foi utilizado junto com as partículas paramagnéticas revestidas com Estreptavidina (Dynal) como alvo para o enriquecimento da afinidade da biblioteca de fagemídeos que representa as muteínas da hNGAL.

Para esta finalidade uma alíquota de 2 mL dos fagemídeos precipitados do que foi obtido acima foi centrifugada (20 minutos, 18500 g, 4°C), o sobrenadante foi removido e as partículas de fagemídeo sedimentadas foram dissolvidas em 1 mL de PBS. Após a incubação durante 30 horas em gelo a solução foi centrifugada (5 minutos, 18500 g, 4°C) para remover os agregados residuais e o sobrenadante foi utilizado diretamente para o enriquecimento da afinidade.

Com a finalidade de enriquecer os fagemídeos que se ligam aos peptídeos, 40 pL de uma solução 825 nM (33 pmoles) do peptídeo da tromboespondina biotinilada em PBS (preparada através da mistura de 100 pL de uma solução 10 pM do peptídeo sintético em DMF com 1112 pL de PBS) foram misturados com 260 pL de uma solução dos fagemídeos recém-preparados (entre 21012 e 51012 unidades formadoras de colônias, cfu) e incubados à temperatura ambiente durante 1 h de forma que a formação de complexos entre o peptídeo e as muteínas apresentadas pelos fagemídeos fosse capaz de ocorrer. Então, 100 pL de uma solução de 8% p/v de BSA, 0,4% v/v de Tween 20 em PBS foram adicionados.

Em paralelo a isto, 100 pL da suspensão disponível comercialmente das partículas paramagnéticas com estreptavidina (Dynal) foram lavados três vezes com 100 pL de PBS. Aqui, as partículas foram mantidas suspensas durante 1 min através da rotação do tubo Eppendorf de 1,5 mLe então coletadas na parede do tubo com o auxílio de um magneto e o sobre-nadante foi eliminado. Com a finalidade de saturar os sítios de ligação não específica, as partículas paramagnéticas foram incubadas com 100 μΙ_ de BSA 2% p/v em PBST à temperatura ambiente durante 1 h.

Após a remoção do sobrenadante, a mistura do peptídeo bioti-nilado da tromboespondina e os fagemídeos foi adicionada às partículas paramagnéticas e as partículas foram ressuspensas e incubadas à temperatura ambiente durante 10 min. Finalmente, os sítios livres de estreptavidina de ligação com a biotina foram saturados através da adição de 10 pL de uma solução de D-destiobiotina 4 mM (Sigma) em PBS à mistura e da incubação da dita mistura à temperatura ambiente durante 5 minutos. Esta etapa serviu para prevenir que a Strep-tag® II - como parte da proteína de fusão das muteínas e do fragmento da proteína plll de revestimento do fago - formasse um complexo com a estreptavidina.

Os fagemídeos não-ligados foram removidos através da lavagem das partículas paramagnéticas oito vezes com 1 mL de PBST contendo D-destiobiotina 1 mM. Cada vez as partículas eram coletadas com o auxílio de um magneto e o sobrenadante era descartado. Finalmente os fagemídeos ligados foram eluídos através da ressuspensão das partículas em 950 μΙ_ de glicina/HCI 0,1 M pH 2,2 e da incubação durante 15 minutos. Após coletar as partículas com o magneto, o sobrenadante foi recuperado e neutralizado imediatamente através da adição de 150 μί de Tris 0,5 M.

Com a finalidade de amplificação, esta solução de fagemídeo (1,1 mL, contendo entre 107 e 1010 cfu, dependendo do ciclo da seleção) foi brevemente aquecida até 37°C, misturada com 3 mL de uma cultura crescendo exponencialmente de E. coli XL1-blue (OD550 = 0,5 a 37°C) e incubada durante 30 minutos a 37°C, 200 rpm. As células infectadas com os fagemídeos foram subseqüentemente sedimentadas (2 minutos, 4420 g, 4°C), ressuspensas em 600 μί do meio de cultura e plaqueadas em três placas de ágar com meio LB contendo 100 pg/mL de ampicilina (LB/Amp; 140 mm de diâmetro).

Após a incubação durante 14 horas a 32°C, as células foram raspadas das placas de ágar, cada uma com a adição de 10 ml_ de meio 2xYT/Amp, foram transferidas para um frasco Erlenmeyer e foram agitadas durante 20 minutos a 37°C, 200 rpm para ressuspensão completa.

Para um outro ciclo de produção e para o enriquecimento da afinidade das partículas de fagemídeo 50 mL de meio 2xYT/Amp preaquecidos até 37°C foram inoculados com 0,2 até 1 mL da dita suspensão de forma que a densidade celular fosse de OD550 = 0,08. Esta cultura foi incubada a 37°C, 160 rpm até uma densidade celular de OD550 = 0,5. Então a cultura foi infectada com o fago auxiliador VCS-M13 (Stratagene) em uma multiplicidade de infecção de aproximadamente 10 e a cultura foi agitada durante mais 30 minutos a 37°C, 160 rpm. A canamicina (70 pg/mL) foi subseqüente-mente adicionada, a temperatura da incubadora foi diminuída para 26°C e, após 10 minutos, a anidrotetraciclina foi adicionada a 25 pg/L para induzir a expressão gênica. A incubação continuou durante mais 15 horas a 26°C, 160 rpm.

As células foram sedimentadas através de centrifugação (15 minutos, 12000 g, 4°C). O sobrenadante contendo as partículas de fagemídeo foi esterilizado porfiltração (0,45 pm), foi misturado com Va do volume (12,5 mL) de 20% p/v de PEG 8000, 15% p/v de NaCI e foi incubado durante 1 h no gelo. Após a centrifugação (20 minutos, 18000 g, 4°C) as partículas de fagemídeo precipitadas foram dissolvidas em 2 mL de PBS gelado. A solução foi incubada em gelo durante 30 minutos e foi distribuída em dois tubos de reação de 1,5 mL. Após a centrifugação dos componentes não-dissolvidos (5 minutos, 18500 g, 4°C) cada sobrenadante foi transferido para um novo tubo de reação.

As partículas de fagemídeo foram precipitadas novamente através da mistura de 1/4 do volume de 20% p/v de PEG 8000, 15% p/v de NaCI, seguida pela incubação durante 60 minutos em gelo. Após a centrifugação (20 minutos, 18500 g, 4°C) o sobrenadante foi removido e as partículas de fagemídeo precipitadas foram dissolvidas em 1 mL de PBS. Após a incubação durante 30 minutos em gelo a solução foi centrifugada (5 minutos, 18500 g, 4°C) e o sobrenadante foi utilizado diretamente para o enriquecimento da afinidade. Foram realizados através desta maneira cinco ciclos de seleção adicionais com o peptídeo da tromboespondina.

Exemplo 8: Identificação de muteínas da hNGAL que se ligam ao peptídeo da tromboespondina através do uso do método de "seleção de colônias" Para a produção analítica das muteínas da hNGAL na forma de proteínas de fusão com a Strep-Tag® II e o domínio de ligação com a albu-mina, o cassete gênico entre os dois sítios de divagem de BstX\ foi subclo-nado do vetor phNGAL12 no phNGAL7.

Para esta finalidade o DNA do fasmídeo foi isolado da mistura dos clones de E. coli obtidos através da infecção com os fagemídeos do Exemplo 7, eluído como um resultado dos quarto e quinto ciclos de seleção, utilizando o Plasmid Midi Kit (Qiagen). O DNA de ambas as preparações foi cortado com a enzima de restrição BstXI e em cada caso o menor dos dois fragmentos (347 pb) foi purificado através da eletroforese preparatória em gel de agarose como descrito no Exemplo 6. O DNA do vetor phNGAL7 foi cortado com físfXI e o maior dos dois fragmentos (3971 pb) foi isolado da mesma forma.

Para a ligação, cada 100 fmoles dos fragmentos pequenos de DNA isolados foram misturados com 100 fmoles do fragmento de DNA grande e com 1,5 Unidade Weiss da T4 DNA ligase (Promega) em um volume de 20 pL (Tris/HCI 30 mM pH 7,8, MgCI2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM), seguidos pela incubação durante a noite a 16°C. A E. coli TG1-F' {E. coli K12 TG1, que perdeu seu epissomo através do cultivo repetido sob condições não-seletivas) foi transformada com 2 pL de cada uma destas misturas de ligação de acordo com o método do CaCI2 (Sambrook e outros, supra), obtendo 2,0 mL de uma suspensão de células. 100 pL desta suspensão foram plaqueados em uma placa de ágar contendo meio LB/Amp e incubados a 37°C durante 14 h.

Duas membranas PVDF hidrofílicas (Millipore, tipo GVWP, tamanho de poro 0,22 μιτι), marcadas na posição e cortadas no tamanho, foram colocadas sobre as placas de LB/Amp com ágar. 150 pL da suspensão de células provenientes das bateladas de transformação, que foram centrifugadas (5000 g, 2 min, 4°C) e ressuspensas em 500 μΙ_ do meio de cultura, foram plaqueados uniformemente sobre estas membranas. As placas de ágar foram incubadas durante 7,5 horas a 37°C até que as colônias atingissem um tamanho de aproximadamente 0,5 mm.

Nesse meio tempo duas membranas hidrofóbicas (Millipoore, Immobilon P, tamanho de poro 0,45 μίτι), também cortadas no tamanho, foram umedecidas com PBS de acordo com as instruções do fabricante. Foram então agitadas durante 4 horas à temperatura ambiente em 10 mL de uma solução de 10 mg/mL de albumina de soro humano (HSA, Sigma) em PBS. Os sítios de ligação remanescentes nas membranas foram saturados através da incubação com 20 mL de BSA 3% p/v, Tween 20 0,5% v/v em PBS durante 2 horas à temperatura ambiente. As membranas foram lavadas duas vezes durante 10 minutos cada com 20 mL de PBS e imersas depois disso durante 10 minutos em 10 mL de meio LB/Amp, aos quais foram adicionados 200 pg/L de anidrotetraciclina.

Finalmente, foram marcadas em uma posição e foram colocadas sobre as placas de cultura com LB/Amp com ágar, que continham adicionalmente 200 pg/L de anidrotetraciclina. As membranas hidrofílicas que foram preparadas anteriormente, nas quais foram cultivadas as colônias, foram colocadas sobre as membranas hidrofóbicas de forma que ambas as marcas ficassem sobrepostas. As placas de cultura foram incubadas cada uma com uma pilha de ambas as membranas a 22°C durante 15 horas. Durante esta fase as respectivas muteínas da hNGAL foram secretadas das colônias sobre a membrana superior e foram imobilizadas através de seu domínio de ligação com albumina com a HSA sobre as membranas inferiores.

Depois disso, as membranas superiores com as colônias foram transferidas para placas de LB/Amp com ágar frescas e armazenadas a 4°C. As membranas hidrofóbicas foram removidas, lavadas três vezes durante 5 minutos cada com 20 mL de PBST.

Para a análise da atividade de ligação das muteínas da hNGAL imobilizadas as membranas foram então incubadas durante 1 hora em 10 mL de uma solução 10 pg/mL do peptídeo da tromboespondina biotinilado em PBST (uma solução estoque de 1 mM do peptídeo biotinilado em DMF era portanto diluída 1:100 em PBST). As membranas foram lavadas três vezes com PBST, seguidas pela incubação durante 1 hora com 10 mL do conjugado avidina-fosfatase alcalina (Sigma, diluição 1:40.000 em PBST) para a detecção de peptídeos ligados através de seus grupos biotina. As membranas foram lavadas duas vezes com PBST e uma vez com PBS, cada uma durante 5 minutos e agitadas durante 10 minutos em tampão AP (Tris/HCI 0,1 M pH 8,8, NaCI 0,1 M, MgCI2 5 mM). Para a reação cromogênica. as membranas foram incubadas em 10 mL de tampão AP, aos quais foram adicionados 30 pL do sal 4-toluidina fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila (Roth, dissolvido a 50 pg/mL em dimetilformamida) e 5 pL de nitro azul de tetrazólio (Roth, 75 pg/mL em 70% v/v de dimetilformamida), até que sinais coloridos distintos pudessem ser reconhecidos nas posições das mesmas colônias. 19 das colônias (9 isoladas do quarto ciclo de seleção e 10 do quinto ciclo) que deram origem a pontos de cor intensos nas membranas hidrofóbicas foram cultivadas partindo das membranas hidrofílicas correspondentes. Seu DNA de plasmídeo foi isolado e o cassete gênico da hNGAL foi submetido à análise de seqüência através do uso do sistema Genetic Analyzer 310 com o Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante e utilizando o oligode-soxinucleotídeo SEQ ID Ne: 11 como iniciador.

Os 19 clones seqüenciados exibiam somente doze sequências diferentes, que foram nomeadas RFY-A, RFY-B, RFY-C, RFY-D, RFY-E, RFY-F, RFY-G, RFY-H, RFY-I, RFY-J, RFY-K e RFY-L. O clone RFY-B foi encontrado 2 vezes e o clone RFY-C foi encontrado seis vezes. O clone RFY-J exibia uma deleção de 3 nucleotídeos, resultando na deleção de um aminoácido situado dentro da alça peptídica N- 4 na posição 125. Um códon de término âmbar, que é traduzido no aminoácido glutamina em uma cepa supressora SupE, foi identificado no clone RFY-L.

As seqüências de nucleotídeos dos clones foram traduzidas em seqüências de aminoácidos e tais aminoácidos que desviavam da proteína hNGAL original são fornecidos na Tabela 2a,b. As seqüências de nucleotí-deos das muteínas RFY-B, RFY-C e RFY-E também são fornecidas como a SEQ ID Ns: 23, a SEQ ID Ne: 25 e a SEQ ID Ns: 27 na listagem de seqüên-cias. As seqüências de aminoácidos destas muteínas são fornecidas como a SEQ ID N°: 24, a SEQ ID N2: 26 e a SEQ ID N2: 28 na listagem de seqüências.

As muteínas RFY-B e RFY-C, que foram encontradas duas vezes e seis vezes respectivamente foram escolhidas para a caracterização detalhada de sua atividade de ligação. Em adição a muteína RFY-E foi escolhida, porque a sua composição de aminoácidos nas regiões que sofreram reorganização aleatória parecia ser bastante exclusiva.

Tabela 2a: Características das seqüências das muteínas selecionadas da hNGAL

Pos. hNGAL RFY-A RFY-B RFY-C RFY-D RFY-E RFY-F RFY-G RFY-H 40 Ala Phe Gly Gly Thr Gly Leu Ser Met 42 Leu Glu Thr His Pro Thr Phe Gly Vai 44 Glu Leu Tyr Leu Leu Vai Ala Pro Leu 46 Lys Ser Arg Asn Vai Thr Leu Ser lie 47 Asp Arg Leu Vai Leu Leu Phe Leu Pro 49 Gin Phe Ser Pro Thr Ser His Arg Asn 50 Lys Thr Vai Asn Glu Arg Arg Leu Vai 70 Leu Met Asp Asp lie Pro Thr His Pro 72 Arg Phe Trp Leu Met Met Ser Lys Pro 73 Lys Ser Ala Met Asp Gly Ser Asn Ser 77 Asp Leu Asn Pro Leu Lys Ser Pro Gly 79 Trp Leu Lys Phe Pro Lys Lys Lys Glu 101 Pro Phe Leu Pro Asp Met Pro Cys Arg 102 Gly Leu Gly Phe Ala Ser Phe Vai Gly 103 Leu Asp Leu Leu Leu Asn Ser Ala Asp 125 Lys Asn Pro Asn Pro Gin Pro Glu Arg 127 Ser Ser Gly Pro Lys His He Leu Leu 128 Gin Gin Gly Arg Asn Lys Ser Asn Lys 130 Arg Arg lie Tyr Trp Pro Pro Pro Gin 132 Tyr Tyr Trp Glu Lys Ser Pro Leu lie 106 Phe° Tabela 2b: Características das seqüências das muteínas selecionadas da hNGAL

Pos. hNGAL RFY-I RFY-J RFY-K RFY-L 40 Ala Cys Arg Gin Ser 42 Leu Gly Leu Pro Pro 44 Glu Leu Cys Lys Ser 46 Lys Ser Pro His Leu 47 Asp Phe Phe Leu Ala 49 Gin Asn Vai Ser Gly 50 Lys Gly Arg Leu Gin* 70 Leu Lys Lys Pro Thr 72 Arg His Glu Lys Asn 73 Lys Gly Arg Met Ala 77 Asp Arg Ala Pro Ser 79 Trp Thr His lie Arg 101 Pro Gly Lys Ala Asn 102 Gly Ser Phe Trp Phe 103 Leu Cys Ser Glu Ser 125 Lys Met ΛΛΛ Thr Lys 127 Ser Leu Pro Gly Lys 128 Gin Asn Ser Thr Lys 130 Arg Asn lie Pro Asp 132 Tyr Ser Glu Thr Pro 106 Tyr Ser° 126 Vai Pro° * Este resíduo de glutamina era codificado por um códon de término âmbar. 0 Estas substituições de aminoácidos ocorreram devido a mutações acidentais fora das posições que sofreram reorganização aleatória. Δ Esta deleção de aminoácidos surgiu devido a uma mutação acidental fora das posições que sofreram reorganização aleatória.

Exemplo 9: Produção das muteínas da hNGALs Para a produção preparatória das muteínas da hNGAL RFY-B, RFY-C e RFY-E obtidas no Exemplo 8 a região codificadora que sofreu mutação entre os dois sítios de divagem de BsfXI foi subclonada do vetor phNGAL7 no plasmídeo de expressão phNGAL15 (Figura 7). O plasmídeo obtido desta forma codificava uma proteína de fusão da muteína com a seqüência sinal OmpA, no terminal amino e a marcação de afinidade Strep-Tag® II no terminal carbóxi.

Para a subclonagem, o DNA de plasmídeo que codifica a muteína relevante foi cortado com a enzima de restrição físfXI e o menor dos dois fragmentos (347 pb) foi purificado através da eletroforese preparatória em gel de agarose como descrito no Exemplo 6. Da mesma maneira, o DNA do vetor phNGALI 5 foi cortado com BstXI e o maior dos dois fragmentos (3398 pb) foi isolado. 1,5 Unidade Weiss da T4 DNA ligase (Promega) foi adicionada a 50 fmoles de cada um dos dois fragmentos de DNA em um volume total de 20 pL (Tris/HCI 30 mM pH 7,8, MgCI2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM) e para a ligação a mistura foi incubada a 16°C durante 16 h. 5 μΙ_ da mistura de ligação foram então utilizados para transformar a E. coli JM83 (Yanisch-Perron e outros, Gene 33 (1985), 103-119) de acordo com o método do CaCl2, obtendo 2,0 mL de uma suspensão de células. 100 μΙ_ desta suspensão foram pla-queados em uma placa de ágar contendo meio LB/Amp e incubados a 37°C durante 14 h.

Uma única colônia dos transformantes de E. co//-JM83 foi utilizada para a inoculação de 100 mL de meio LB/Amp, seguida pela incubação durante a noite a 30°C, 200 rpm. 2 L do meio LB/Amp em um frasco Er-lenmeyer de 5 L foram então inoculados com 40 mL desta pré-cultura e foram agitados a 22°C, 200 rpm até uma OD550 = 0,5. A indução foi realizada através da adição de 200 pL/L de anidrotetraciclina (200 pL de uma solução estoque a 2 mg/mL em DMF) seguida pela agitação durante mais 3 horas a 22°C, 200 rpm.

As células de um frasco foram centrifugadas (15 minutos, 4420 g, 4°C) e, após remover o sobrenadante, foram ressuspensas em 20 mL de tampão de liberação periplasmática pré-resfriado (Tris/HCI 100 mM pH 8,0, sacarose 500 mM, EDTA 1 mM) e incubadas durante 30 minutos em gelo. Os esferoplastos foram então removidos em duas etapas sucessivas de centrifugação (15 minutos, 4420 g, 4°C e 15 minutos, 30000 g, 4°C). O sobre- nadante que compreende o extrato de proteínas periplasmáticas foi submetido à diálise contra o tampão CP (Tris/HCI 100 mM pH 8,0, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM), esterilizado por filtração e utilizado para a purificação croma-tográfica da muteína da hNGAL. O método de purificação era baseado na marcação de afinidade Strep-Tag® II C-terminal (Schmidt e outros, supra). No presente caso foi empregada a muteína "1" com estreptavidina (Patente Alemã 196 41 876.3; Voss e Skerra, supra), que foi acoplada a uma sepharose ativada com NHS (Pharmacia) fornecendo 5 mg/mL de estreptavidina imobilizada por 1 mL do volume de leito da matriz.

Uma coluna para cromatografia com volume de leito de 4 mL preenchida com este material foi equilibrada com 20 mL de tampão CP a 4°C a uma vazão de 40 mL/h. A cromatografia foi monitorada através da medida da absorção a 280 nm do eluato em um nitro azul de tetrazólio. Após a aplicação do extrato de proteínas periplasmáticas, a coluna foi lavada com tampão CP até que a linha de base fosse alcançada e a muteína de hNGAL ligada foi subseqüentemente eluída com 10 mL de uma solução de D-desti-obiotina 2,5 mM (Sigma) em tampão CP. As frações contendo a muteína de hNGAL purificada foram verificadas através de eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (Fling e Gregerson, supra) e foram agrupadas. Para a obtenção de concentrações de proteína e condições tamponantes adequadas para aplicações adicionais os grupos de muteínas foram concentrados a um volume final de cerca de 500 pL utilizando tubos centricon YM 10 (faixa de PM de 1000, Millipore) para a ultrafiltração e subseqüentemente submetidos à diálise contra o tampão HBS (NaC1150 mM, HEPES 10 mM pH 7,4, EDTA 3 mM). Os rendimentos protéicos para RFY-B, RFY-C e RFY-E foram de 70 pg, 60 pg e 200 pg respectivamente por 1 L de cultura. Desta maneira tanto a hNGAL original quanto suas muteínas RFY-B, RFY-C e RFY-E foram preparadas.

Exemplo 10: Medida da afinidade das muteínas da hNGAL em relação ao peptídeo da tromboespondina em ELISA

Para a detecção da ligação em um ELISA (Ensaio Imunossor- vente ligado à Enzima) as cavidades de uma placa para microtitulação (Ma-xisorb, Nunc) foram cada preenchidas com 50 μΙ_ de uma solução 50 pg/mL de Avidina (Fluka) em PBS e foram incubadas durante a noite à temperatura ambiente (RT). Após lavar três vezes com PBST, 50 μΙ_ de uma solução 1 μΜ do peptídeo da tromboespondina biotinilado SEQ ID N°: 18 em PBST foram colocados nas cavidades e o peptídeo foi imobilizado através da formação de complexos entre a biotina e a avidina pré-adsorvida. Após a incubação durante 1 hora a solução foi removida e as cavidades da placa de microtitulação foram lavados três vezes com PBST. Com a finalidade de saturar os sítios de ligação não específica, as cavidades foram preenchidos com 100 ul_ de BSA 4% p/v em PBST e incubados durante uma hora à temperatura ambiente, seguida pela lavagem três vezes com PBST.

Então foi preparada uma série de diluições das muteínas do Exemplo 9, partindo da concentração de 100 nM e seguida pela incubação de 1 hora à temperatura ambiente. Como um controle para a ligação não específica com a avidina, uma série de diluições similar da hNGAL e de suas muteínas foi aplicada às cavidades nos quais o peptídeo da tromboespondina foi omitido. Após lavar três vezes com PBST, o conjugado anticorpo Anti-strepll-HRP (IBA), diluído 1:8000 com PBST foi aplicado nas cavidades. A incubação foi realizada durante 1 hora à temperatura ambiente e seguida pela lavagem três vezes com PBST e duas vezes com PBS. A detecção das muteínas ligadas da hNGAL foi realizada utilizando 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina e H202 como substratos para a peroxidase do rábano silvestre. Para esta finalidade, 100 pL de uma solução HRP-substra-to pronta para uso (Biochem Immunosystems) foi colocados dentro das cavidades e o desenvolvimento de cor foi interrompido após alguns minutos através da adição de 100 pL do ácido sulfúrico 0,3 Μ. A formação de produto foi medida através da absorção do ponto final a 450 nm em um fotômetro SpectraMax 250 (Molecular Devices). A curva foi ajustada através da regressão não linear dos mínimos quadrados com o auxílio do programa de computador Kaleidagraph (Synergy software) de acordo com a equação [P L] = ([P]t[L]t)/(Ko+[P]t). Onde [P]t é a concentração total do peptídeo da tromboespondina imobilizada (em unidades de A450), [L]t é a concentração da muteína aplicada ou da hNGAL, respectivamente, [P L] é a concentração do complexo formado (em unidades de A450) e KD é a constante de dissociação aparente.

As curvas de ligação resultantes são representadas na Figura 8. Os valores obtidos para as constantes de dissociação aparente dos complexos entre as muteínas hNGAL e o peptídeo da tromboespondina estão resumidos na tabela a seguir: variação da hNGAL Kn fnMI hNGAL: -* RFY-B: 4.3 ± 0.2 RFY-C: 4.6 ± 0.6 RFY-E: 8.2 ± 0.8 * nenhuma atividade de ligação detectável Exemplo 11: Medida da afinidade das muteínas da hNGAL em relação ao peptídeo da tromboespondina utilizando SPR A afinidade de ligação das muteínas da hNGAL em relação ao peptídeo da tromboespondina SEQ ID N°: 18 foi determinada através da ressonância de superfície de plasmon (SPR) utilizando o sistema BIAcore X (BIACORE). Primeiro 35 pL do peptídeo da tromboespondina biotinilado em uma concentração de 1 μg/mL (preparado através da mistura de 1 pL de uma solução peptídica a 200 μg/mL em DMF com 199 pL de tampão HBS contendo NaCI 150 mM, HEPES 10 mM pH 7,4, EDTA 3 mM) foram imobilizados na superfície de um canal de fluxo de um chip sensor SA revestido com estreptavidina (BIACORE) de acordo com as instruções do fabricante, resultando em uma quantidade de cerca de 400 unidades de resposta (RU). As curvas de ligação das muteínas da hNGAL foram então medidas aplicando 35 pL de cada uma das muteínas purificadas do Exemplo 9 em tampão HBS em concentrações entre 500 nM e 25 nM utilizando HBS-EP (HBS contendo 0,005% do Tensoativo P20) como um tampão de corrida e uma vazão contínua de 5 pL/min.

Os valores da ressonância no estado estacionário foram medi- dos no término da fase de injeção para o canal com o peptídeo da tromboes-pondina imobilizado para cada concentração de proteína aplicada. Foram detectados somente efeitos tamponantes negligenciáveis no segundo canal do chip sensor, que serviu como um controle. Estes valores foram diretamente representados graficamente contra a concentração da muteína da hNGAL. A curva foi ajustada através da regressão não linear dos mínimos quadrados com o auxílio do programa de computador Kaleidagraph (Synergy software) de acordo com a equação [PL] = ([P]t[L]t)/(KD+[P]t). Onde [P]t é a concentração total do peptídeo da tromboespondina imobilizada (em RU), [L]t é a concentração da muteína aplicada ou da hNGAL, respectivamente, [P L] é a concentração do complexo formado (em RU) e KD é a constante de dissociação sob condições de equilíbrio.

As curvas de ligação resultantes são representadas na Figura 9. Os valores obtidos das medidas da SPR para as constantes de dissociação dos complexos entre as muteínas da hNGAL e o peptídeo da tromboespondina estão resumidos na tabela a seguir: variação da hNGAL Kn FnM] hNGAL: -* RFY-B: 105,4 ±6,5 RFY-C: 106,1 ±15,7 RFY-E: 107,2 ±11,4 * nenhuma atividade de ligação detectável Exemplo 12: Seleção das muteínas da hNGAL contra a interleucina-8 (IL-8) humana A citocina humana recombinante interleucina-8 (Baggiolini e Clark-Lewis, FEBS Lett. 397, (1992), 97-101; H2N- AVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDP KENWVQRWEKFLKRAENS-COOH; SEQ ID NO:29) foi conjugada com os grupos biotina e foi utilizada como um alvo para o enriquecimento da afinidade partindo da biblioteca de fagemídeos que representa as muteínas da hNGAL na presença de partículas paramagnéticas revestida com estreptavidina (Dynal). O conjugado foi preparado misturando 5,6 nmoles (12,5 pg) de sulfossuccinimidil-2-(biotinamido)etil-1,3-ditiopropionato (NHS-SS-Biotin, Pierce) dissolvidos em 3,4 μΙ_ de H2O com 1,4 nmol (12,5 pg) da IL-8 humana recombinante (Promocell) dissolvida em 50 pL de H2O, 36,6 pL de H20 e com 10 pL de PBS/NaOH pH 8,5 concentrado 10x. A mistura foi incubada sob agitação à temperatura ambiente (RT) durante 1 h. O excesso de rea-gente foi então removido do conjugado de IL-8 através de uma coluna de filtra-ção em gel PD-10 (Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante utilizando PBS/NaOH pH 8,5 como 0 tampão de corrida. A IL-8 biotinilada eluída da coluna PD-10 foi ajustada até uma concentração final de 1 pM com o mesmo tampão resultando em um volume final de 1,24 mL. A IL-8 marcada foi armazenada em alíquotas a -80°C e descongelada diretamente antes do uso.

Para 0 isolamento de fagemídeos que exibem uma muteína com afinidade pela IL-8, uma alíquota dos fagemídeos precipitados, obtidos como no Exemplo 7, que foram mantidos em armazenamento a -20°C durante longo período, foi descongelada e foi obtido um pélete de fagemídeos (20 minutos, 18500 g, 4°C). Após a remoção do sobrenadante, as partículas sedimentadas de fagemídeos foram dissolvidas em 270 pL de PBS, incubadas durante 30 minutos em gelo e finalmente centrifugadas (5 minutos, 18500 g, 4°C) para remover os agregados residuais.

Com a finalidade de enriquecer os fagemídeos que se ligam à IL-8, 30 pL de uma solução 1 pM (30 pmoles) da interleucina-8 biotinilada foram misturados com 270 pL dos fagemídeos em PBS (cerca de 1013 cfu) e incubados à temperatura ambiente durante 1 h de modo que fosse permitido ocorrer a formação de complexos entre a citocina e as muteínas apresentadas pelos fagemídeos. Então, 100 pL de uma solução de BSA 8% p/v, Tween 20 0,4% v/v em PBS foram adicionados.

Em paralelo a isto, 100 pL da suspensão disponível comercialmente de partículas paramagnéticas com estreptavidina (Dynal) foram lavados três vezes com 1 mL de PBS. Ali, as partículas foram mantidas suspensas durante 1 min através da rotação do tubo Eppendorf de 1,5 mL e então coletadas na parede do tubo com o auxílio de um magneto e o sobrenadante foi retirado com pipeta. Com a finalidade de saturar os sítios de ligação não específica, as partículas paramagnéticas foram incubadas com 1 ml_ de BSA 2% (p/v) em PBST à temperatura ambiente durante 1 h.

Após a remoção do sobrenadante como descrito anteriormente, a mistura da IL-8 biotinilada e os fagemídeos foi incubada à temperatura ambiente durante 10 min. Finalmente, os sítios livres de estreptavidina de ligação com a biotina foram saturados através da adição de 10 pL de uma solução de D-destiobiotina 4 mM (Sigma) em PBS à mistura e da incubação da dita mistura à temperatura ambiente durante 5 min. Esta etapa servia para prevenir que a Strep-Tag® II - como parte da proteína de fusão das muteínas e o fragmento da proteína plll de revestimento de fago - formasse um complexo com a estreptavidina.

Os fagemídeos não-ligados foram removidos através da lavagem das partículas paramagnéticas oito vezes durante 1 min com 1 mL de PBST fresco contendo D-destiobiotina 1 mM. Cada vez as partículas eram coletadas com o auxílio do magneto e o sobrenadante era retirado com pi-peta. Finalmente, os fagemídeos ligados eram eluídos sob condições reduto-ras através da ressuspensão das partículas em 1 mL de PBST contendo destiobiotina 1 mM e DTT 100 mM. A solução foi incubada a 37°C durante 1 h para reduzir a ligação dissulfeto contida na molécula ligante entre a inter-leucina-8 e a biotina, liberando assim os fagemídeos ligados especificamente à IL-8 das esferas.

Com a finalidade de amplificação, a solução de fagemídeo eluí-do (1,0 mL, contendo entre 107 e 108 cfu, dependendo do ciclo de seleção) foi brevemente levada até 37°C, misturada com 3 mL de uma cultura em crescimento exponencial de E. coli XL1-blue (OD55o = 0,5 a 37°C) e foi agitada a 200 rpm durante 30 minutos a 37°C. As células infectadas foram sedimentadas (2 minutos, 4420 g, 4°C), ressuspensas em 600 pL de meio de cultura e plaqueadas em três placas de ágar com meio LB contendo 100 pg/mL de ampicilina (LB/Amp; 140 mm de diâmetro).

Após a incubação durante 14 horas a 32°C, a cobertura de colônias foi raspada das placas de ágar, cada uma com a adição de 10 mL de meio 2xYT/Amp. A suspensão foi transferida para um frasco Erlenmeyer esterilizado e agitada durante 20 minutos a 37°C, 200 rpm.

Para um outro ciclo de produção e para o enriquecimento da afinidade das partículas de fagemídeos, 50 ml_ de meio 2xYT/Amp preaqueci-dos até 37°C foram inoculados com 0,2 até 1 mL da dita suspensão de foram que a densidade celular fosse OD550 = 0,08. Esta cultura foi incubada a 37°C, 160 rpm, até que uma densidade celular de OD550 = 0,5 fosse atingida. Então, a cultura foi infectada com o fago auxiliador VCS-M13 (Stratagene) a uma multiplicidade de infecção de aproximadamente 10 e a cultura foi agitada durante mais 30 minutos a 37°C, 160 rpm. A canamicina (70 pg/mL) foi subsequentemente adicionada, a temperatura da incubadora foi diminuída para 26°C e, após 10 minutos, foi adicionada a anidrotetraciclina a 25 pg/L para induzir a expressão gênica. A incubação continuou durante mais 15 horas a 26°C, 160 rpm.

As células foram sedimentadas através de centrifugação (15 minutos, 12000 g, 4°C). O sobrenadante contendo as partículas de fagemídeo foi esterilizado porfiltração (0,45 pm), foi misturado com !4 do volume (12,5 mL) de 20% p/v de PEG 8000, 15% p/v de NaCI e foi incubado durante 1 h em gelo. Após a centrifugação (20 minutos, 18000 g, 4°C) as partículas precipitadas de fagemídeo foram dissolvidas em 2 mL de PBS gelado. A solução foi incubada em gelo durante 30 minutos e foi distribuída em dois tubos de reação de 1,5 mL. Após a centrifugação dos componentes não-dissolvidos (5 minutos, 18500 g, 4°C) cada sobrenadante foi transferido para um novo tubo de reação.

As partículas de fagemídeo foram precipitadas novamente através da mistura de % do volume de 20% p/v de PEG 8000, 15% p/v de NaCI, seguida pela incubação durante 60 minutos em gelo. Após a centrifugação (20 minutos, 18500 g, 4°C) 0 sobrenadante foi removido e as partículas precipitadas de fagemídeo foram dissolvidas em 270 pL de PBS. Após a incubação durante 30 minutos em gelo a solução foi centrifugada (5 minutos, 18500 g, 4°C) e 0 sobrenadante foi utilizado diretamente para o enriquecimento da afinidade. Através desta maneira foram realizados quatro ciclos adicionais de seleção com a IL-8.

Exemplo 13: Identificação de muteínas da hNGAL que se ligam à interleuci-na-8 através do uso do método de "seleção de colônias" Para a produção analítica das muteínas da hNGAL na forma de proteínas de fusão com a Strep-Tag® II e o domínio de ligação com a albu-mina que é descrito no Exemplo 3, o cassete gênico entre os dois sítios de divagem de BsfXI foi subclonado do vetor phNGAL12 no phNGAL7.

Para esta finalidade o DNA do fasmídeo foi isolado da mistura dos clones de E. coli obtidos através da infecção com os fagemídeos do Exemplo 12, eluído após o quinto ciclo de seleção, utilizando o Plasmid Midi Kit (Qiagen). O DNA foi cortado com a enzima de restrição SsfXI e o menor dos dois fragmentos (347 pb) foi purificado através de eletroforese preparatória em gel de agarose como descrito no Exemplo 6. O DNA do vetor phNGAL7 foi cortado com BstXI e o maior dos dois fragmentos (3971 pb) foi isolado da mesma forma.

Para a ligação, 100 fmoles do fragmento de DNA pequeno isolado foram misturados com 100 fmoles do fragmento de DNA grande e incubados com 1,5 Unidade Weiss de T4 DNA ligase (Promega) em um volume total de 20 pL (Tris/HCI 30 mM pH 7,8, MgCh 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM), seguido pela incubação durante a noite a 16°C. A E. coli TG1-F" (E. coli K12 TG1, que perdeu seu epissomo através da cultura repetida sob condições não-seletivas) foi transformada com 4 pL desta mistura de ligação de acordo com o método de CaCL (Sambrook e outros, supra), obtendo 2,0 mL de uma suspensão celular. A suspensão celular foi centrifugada (5000 g, 2 min, 4°C), ressuspensa em 100 pL do meio de cultura, plaqueada em uma placa de ágar contendo o meio LB/Amp e incubada a 37°C durante 14 h para determinar a eficiência de transformação.

Uma membrana hidrofílica de PVDF (Millipore, tipo GVWP, tamanho de poro 0,22 pm), marcada na posição e cortada do tamanho, foi colocada sobre uma placa de LB/Amp com ágar. A suspensão de células provenientes da batelada de transformação fresca, que foi tranformada com 5-10 pL da mistura de ligação descrita anteriormente, foi centrifugada (5000 g, 2 min, 4°C) e ressuspensa em 100 pL do meio de cultura e uniformemente plaqueada sobre esta membrana para a obtenção de 400 até 500 colônias. A placa de ágar foi incubada durante 7,5 horas a 37°C até que as colônias tivessem atingido um tamanho de aproximadamente 0,5 mm.

Nesse meio tempo uma membrana hidrofóbica (Millipore, Immo-bilon P, tamanho de poro 0,45 pm) também cortada do tamanho, foi umede-cida com PBS de acordo com as instruções do fabricante. O revestimento com HSA foi conseguido através da agitação durante 4 horas à temperatura ambiente em 10 mL de uma solução de 10 mg/mL de HSA (Sigma) em PBS. Os sítios de ligação remanescentes na membrana foram saturados através da incubação com 20 mL de BSA 3% (p/v), Tween 20 0,1% (v/v) em PBS durante 2 horas à temperatura ambiente. A membrana foi lavada duas vezes durante 10 minutos cada com 20 mL de PBS e imersa depois disso durante 10 minutos em 10 mL de meio LB/Amp, aos quais foram adicionados 200 pg/L de anidrotetraciclina.

Finalmente, esta foi marcada em uma posição e colocada sobre uma placa de cultura com LB/Amp com ágar, que continha adicionalmente 200 pg/L de anidrotetraciclina. A membrana hidrofílica descrita anteriormente, sobre a qual as colônias cresceram, foi colocada sobre a membrana hidrofóbica de forma que ambas as marcas ficassem sobrepostas. A placa de cultura foi incubada com a pilha de ambas as membranas a 22°C durante 15 horas. Durante esta fase as respectivas muteínas da hNGAL foram secreta-das das colônias na membrana superior e foram imobilizadas através de seu domínio de ligação com a albumina através de HSA na membrana inferior.

Depois disso, a membrana superior com as colônias foi transferida para uma placa de LB/Amp com ágar fresca e foi armazenada a 4°C. A membrana hidrofóbica foi removida e lavada três vezes durante 5 minutos cada com 20 mL de PBST.

Para a análise da atividade de ligação das muteínas da hNGAL imobilizadas, a membrana foi incubada durante 1 hora em 3,5 mL de uma solução da IL-8 digoxigenada 100 nM em PBS. O conjugado foi preparado misturando 14 nmoles (9,2 pg) do éster N-hidroxissuccinimida do ácido digoxigenin-3-0-metilcarbonil-8-amino- capróico (DIG-NHS, Roche) dissolvidos em 2,3 pL de DMSO com 1,4 nmol (12,5 pg) da IL-8 humana recombinante (Promocell) dissolvido em 50 μΙ_ de H2O, 37,7 μΙ_ de H20 e com 10 pL de PBS/NaOH pH 8,5 concentrado 10x. A mistura foi incubada sob agitação à temperatura ambiente durante 1 hora. O excesso de reagente foi removido do conjugado da IL-8 através de uma coluna de filtração em gel PD-10 (Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante utilizando PBS/NaOH pH 8,5 como o tampão de corrida. A IL-8 digoxigenada eluída da coluna PD-10 foi ajustada até uma concentração final de 1 μΜ com 0 mesmo tampão resultando em um volume total de 1,56 mL. A IL-8 marcada foi armazenada em alíquotas a -80°C e descongelada diretamente antes do uso. A membrana foi lavada três vezes com PBST, seguida pela incubação durante 1 hora com 10 mL do conjugado Fab antidigoxigenina-Fosfatase alcalina diluído 1:1000 em PBST para a detecção da IL-8 ligada através de seus grupos digoxigenina. A membrana foi lavada duas vezes com PBST e uma vez com PBS, cada uma durante 5 minutos e agitada durante 10 minutos em tampão AP. Para a reação cromogênica, a membrana foi incubada em 10 mL do tampão AP, aos quais foram adicionados 30 pL do sal de 4-toluidina do fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indoli!a (Roth, dissolvido a 50 pg/mL em dimetilformamida) e 5 pL nitro azul tetrazólio (Roth, 75 pg/mL em dimetilformamida 70% v/v), até que sinais coloridos distintos pudessem ser reconhecidos nas posições de algumas das colônias.

Das 200 colônias que apareceram na membrana 9 produziram um ponto intenso de cor na membrana hidrofóbica e foram cultivadas partindo da membrana hidrofílica correspondente. Seu DNA de plasmídeo foi isolado e 0 cassete gênico da hNGAL foi submetido à análise de seqüência através do uso do sistema Genetic Analyzer 310 com o Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante e utilizando o oligodesoxinucleotídeo da SEQ ID Νθ: 5 como iniciador.

Todos os 9 clones exibiam a seqüência idêntica, indicando que uma única muteína foi preferencialmente enriquecida durante o procedimento de seleção. Esta muteína foi denominada variação N4.

As seqüências de nucleotídeos do clone N4 foram traduzidas em sua seqüência de aminoácidos e os resíduos de aminoácidos que desviavam da proteína hNGAL original são fornecidos na Tabela 3. A seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos completa da muteína N4 são também fornecidas como a SEQ ID Ns: 30 e a SEQ ID N°: 34.

Tabela 3: Características da seqüência da muteína N4 da hNGAL

Pos. hNGAL N4 40 Ala Asp 42 Leu Tyr 44 Glu Ala 46 Lys Ser 47 Asp Leu 49 Gin Gly 50 Lys Leu 70 Leu Vai 72 Arg Tyr 73 Lys Asp 77 Asp Vai 79 Trp Ser 101 Pro Glu 102 Gly Ala 103 Leu Vai 125 Lys Asp 127 Ser Arg 128 Gin Pro 130 Arg Ser 132 Tyr Glu Exemplo 14: Produção da muteína N4 da hNGAL

Para a produção preparatória da muteína N4 da hNGAL obtida no Exemplo 13, o cassete físfXI foi isolado da variação no phNGAL7 e sub-clonado no plasmídeo de expressão phNGAL15 (Figura 7). O plasmídeo resultante codifica uma proteína de fusão da muteína N4 com a seqüência sinal OmpA no terminal amino e a marcação de afinidade Strep-Tag® II no terminal carbóxi.

Para a subclonagem, o DNA de plasmídeo do phNGAL7 que codifica a muteína relevante foi cortado com a enzima de restrição BstXI e o menor dos dois fragmentos (347 pb) foi purificado através da eletroforese preparatória em gel de agarose que é descrita no Exemplo 6. Da mesma maneira, o DNA do vetor phNGAL15 foi cortado com SsfXI e o maior dos dois fragmentos (3398 pb) foi isolado. 1,5 Unidade Weiss da T4 DNA ligase (Promega) foi adicionada a 50 fmoles de cada um dos dois fragmentos de DNA em um volume total de 20 pL (Tris/HCI 30 mM pH 7,8, MgCI2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM) e para a ligação a mistura foi incubada a 16°C durante 16 h. 5 μΙ_ da mistura de ligação foram então utilizados para transformar a E. coii JM63 (Yaniscn-Perron e outros, supra) de acordo com o método do CaCI2, obtendo 2,0 mL de uma suspensão de células. 100 μΙ_ desta suspensão foram plaqueados em uma placa de ágar contendo meio LB/Amp e incubados a 37°C durante 14 h.

Uma única colônia dos transformantes de E. coli-JM83 foi utilizada para a inoculação de 100 mL de meio LB/Amp, seguida pela incubação durante a noite a 30°C e 200 rpm. 2 L do meio LB/Amp em um frasco Er-lenmeyer de 5 L foram então inoculados com 40 mL desta pré-cultura e foram agitados a 22°C e 200 rpm até que uma OD550 = 0,5 fosse atingida. A expressão da muteína N4 foi induzida através da adição de 200 pL/L de ani-drotetraciclina (200 pL de uma solução estoque a 2 mg/mL em DMF) e a incubação foi mantida durante mais 3 horas.

As células de um frasco foram centrifugadas (15 minutos, 5571 g, 4°C) e, após remover o sobrenadante, foram ressuspensas em 20 mL de tampão de liberação periplasmática pré-resfriado (Tris/HCI 100 mM pH 8,0, sacarose 500 mM, EDTA 1 mM) e incubadas durante 30 minutos em gelo. Os esferoplastos foram então removidos em duas etapas sucessivas de centrifugação (15 minutos, 2988 g, 4°C e 15 minutos, 25000 g, 4°C). O sobrenadante que compreende o extrato de proteínas periplasmáticas foi submetido à diálise contra o tampão CP (Tris/HCI 100 mM pH 8,0, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM), esterilizado por filtração e utilizado para a purificação cromatográfica da muteína da hNGAL. O método de purificação era baseado na marcação de afinidade Strep-Tag® II C-terminal (Schmidt e outros, supra) empregando o material Strep-Tactin® Superflow (IBA). Uma coluna para cromatografia com volume de leito de 4 mL preenchida com este material foi equilibrada com 20 mL de tampão CP a 4°C a uma vazão de 2 mL/min. A cromatografia foi monitorada através da medida da absorção a 280 nm em um nitro azul de tetrazólio. Após a aplicação do extrato de proteínas periplasmáticas (vazão de 0,8 mL/min) a coluna foi lavada com tampão CP a uma vazão de 2 mL/min até que a linha de base fosse alcançada. A muteína de hNGAL ligada foi eluída com uma solução de D-destiobiotina 2,5 mM (Sigma) em tampão CP a uma vazão de i mL/min. As frações (25 mL cada) contendo a muteína de hNGAL purificada foram agrupadas, concentradas até um volume final de aproximadamente 500 pL utilizando tubos centricon YM 10 (faixa de PM de 10 kDa, Millipore) e analisadas em um gel de SDS-poliacrilamida a 15% (Fling e Gre-gerson, supra). Finalmente, o material foi esterilizado por filtração (0,22 pm) e armazenado a 4°C.

Exemplo 15: Medida da afinidade da muteína N4 da hNGAL pela IL-8 em um ensaio de ELISA

Para a detecção da ligação em um experimento de ELISA duas fileiras (cada uma com 12 cavidades) de uma placa para microtitulação de 96 cavidades (Maxisorb, Nunc) foram revestidas com 50 pL de uma solução 50 pg/mL de Avidina (Fluka) em PBS durante a noite a 4°C. Após lavar três vezes com PBST, uma fileira foi tratada com 50 pL/cavidade de uma solução 1 pM de IL-8 biotinilada em PBST, enquanto que a segunda fileira foi incubada com PBST como um controle. Após 1 hora à temperatura ambiente, todas as cavidades foram lavadas três vezes com PBST e os sítios de ligação não específica foram saturados com 100 pL de leite em pó desnatado 4% p/v em PBST durante 1 hora à temperatura ambiente.

Para determinar o valor de KD da muteína N4 em relação à IL-8, foi preparada uma série de diluições da proteína N4 do Exemplo 14 em PBST, partindo de uma concentração de 1 pM. Como um controle para a ligação não específica com a avidina, foi aplicada uma série de diluições similares da muteína N4 às cavidades onde a IL-8 foi omitida. A formação de complexos foi permitida durante 1 hora à temperatura ambiente, seguida por três lavagens com PBST e a incubação à temperatura ambiente durante 1 hora com o conjugado anticorpo anti-strepll-HRP (IBA) diluído 1:8000 em PBST. A detecção da muteína N4 ligada foi realizada utilizando 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina e H2O2 como substratos para a peroxidase da rábano. Para esta finalidade, todos as cavidades foram preenchidas com 100 μΙ_ de uma solução HRP-substrato pronta para uso (Biochem Immunosystems). O desenvolvimento de cor foi interrompido após alguns minutos através da adição de 100 μΙ_ do ácido sulfúrico 0,3 Μ. A formação de produto foi medida através da absorção do ponto final a 450 nm em um fotômetro SpectraMax 250 (Molecular Devices). A curva foi ajustada através da regressão não linear dos mínimos quadrados com o auxílio do programa de computador Kaleidagraph (Synergy software) de acordo com o Exemplo 10. As curvas de ligação resultantes são representadas na Figura 10. O valor obtido para a constante de dissociação aparente do complexo entre a muteína N4 da hNGAL e a IL-8 é de 300 ± 34 nM.

Exemplo 16: Seleção de muteínas da hNGAL contra o TNFa biotinilado O Fator de Necrose de Tumor α humano recombinante (TNFa, SEQ ID Na: 31, SEQ ID Na: 35) foi conjugado com grupos biotina e utilizado como um alvo para 0 enriquecimento da afinidade da biblioteca de fagemí-deos que representa as muteínas da hNGAL obtidos como descrito no Exemplo 7 na presença de partículas paramagnéticas revestidas com Es-treptavidina (Dynal).

Para a produção do TNFa recombinante, células de E. coli BL21 [DE3] foram transformadas com 0 plasmídeo de expressão pTNFa que codifica a citocina TNFa (Wang e outros, Science 228 (1985), 149-154) com uma Arg-Gly-Ser-His(6)-Gly(3)-marcação N-terminal. A expressão do TNFa foi realizada como descrito por Schmidt e Skerra (Schmidt e Skerra, J. Chro-matogr. 676 (1994), 103-119) exceto pelo fato de que a produção da citocina recombinante foi induzida a 30°C durante 4 horas. Sob estas condições, o TNFa se acumula na forma de proteína solúvel no citoplasma e pode ser liberado através do congelamento e descongelamento subsequentes do pé-lete de células de 1 L de meio de cultura em 30 ml_ de tampão de lise (NaHaPCVNaOH 50 mM pH 8,0, NaCI 300 mM, imidazol 10 mM). O TNFa foi purificado de tal solução em sua forma trimérica (Lohrengel e outros, Cytokine 12 (1999), 573-577) empregando subseqüentemente a Cromatografia por Afinidade com Metal Imobilizado (IMAC; Porath e outros, Nature 258, (1975) 598-599) e a cromatografia de exclusão de tamanho. O rendimento de proteína era de aproximadamente 1,5 mg por 1 L de volume de cultura. O conjugado foi preparado através da reação de 40 nmoles (24,3 pg) de NHS-SS-Biotin (Pierce) dissolvidos em 25 μί_ de hi20 com iü nmoles (187,7 pg) de TNFa humano recombinante dissolvidos em 235 μΙ_ de PBS/NaOH pH 8,5 em um volume total de 1 mL de PBS/NaOH pH 8,5. A mistura foi incubada com agitação à temperatura ambiente (TA) durante 1 h. O excesso de reagente foi então removido do conjugado de TNFa através de uma coluna de filtração em gel PD-10 (Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante com PBS como o tampão de corrida.

Para o isolamento dos fagemídeos exibindo uma muteína com afinidade pelo TNFa, uma alíquota dos fagemídeos precipitados obtidos como no Exemplo 7, que foram mantidos a -20°C durante um armazenamento de longo período, foi descongelada e foi obtida um pélete de fagemídeos (20 minutos, 18500 g, 4°C). Após a remoção do sobrenadante, as partículas sedimentadas de fagemídeo foram dissolvidas em 270 μΙ_ de PBS, incubadas durante 30 minutos em gelo e finalmente centrifugadas (5 minutos, 18500 g, 4°C) para remover os agregados residuais. 30 pL de uma solução 1 μΜ (30 pmoles) de TNFa biotinilado (preparado através da mistura de 200 μΐ_ de uma solução 2,5 μΜ da citocina biotinilada em PBS com 300 μΙ_ de PBS) foram misturados com 270 μΙ_ dos fagemídeos em PBS (cerca de 1013 cfu) e incubados à temperatura ambiente durante 1 h de modo que fosse permitida que a formação de complexos entre a citocina e as muteínas apresentadas pelos fagemídeos ocorresse. Então, 100 μ!_ de uma solução de BSA 8% p/v, Tween 20 0,4% v/v em PBS foram adicionados.

Em paralelo a isto, 100 μΐ_ da suspensão disponível comercialmente das partículas paramagnéticas com estreptavidina (Dynal) foram lavados três vezes com 1 ml_ de PBS. Ali, as partículas foram mantidas suspensas durante 1 min através da rotação do tubo Eppendorf de 1,5 ml_ e então coletadas na parede do tubo com o auxílio de um magneto e o sobre-nadante foi retirado com pipeta. Com a finalidade de saturar os sítios de ligação não específica, as partículas paramagnéticas foram incubadas com 1 mL de BSA 2% (p/v) em PBST à temperatura ambiente durante 1 h.

Após a remoção do sobrenadante como descrito acima, a mistura do TNFa biotinilado e os fagemídeos foi adicionada às partículas paramagnéticas e as partículas foram ressuspensas e incubadas à temperatura ambiente durante 10 min. Finalmente, os sítios livres de estreptavidina de ligação com a biotina foram saturados através da adição de 10 μΐ de uma solução de D-destiobiotina 4 mM (Sigma) em PBS à mistura e da incubação da dita mistura à temperatura ambiente durante 5 minutos. Esta etapa serviu para prevenir que a Strep-tag® II - como parte da proteína de fusão das muteínas e do fragmento da proteína plll de revestimento do fago - formasse um complexo com a estreptavidina.

Os fagemídeos não-ligados foram removidos através da lavagem das partículas paramagnéticas oito vezes durante 1 min com 1 mL de PBST fresco contendo D-destiobiotina 1 mM. Cada vez as partículas eram coletadas com o auxílio de um magneto e o sobrenadante era retirado com a pipeta. Finalmente os fagemídeos ligados foram eluídos sob condições re-dutoras através da ressuspensão das partículas em 1 mL de PBST contendo destiobiotina 1 mM e DTT 100 mM. A solução foi incubada a 37°C durante 1 h para reduzir a ligação dissulfeto contida na molécula ligante entre o TNFa e a biotina, liberando assim os fagemídeos ligados especificamente ao TNFa das esferas.

Com a finalidade de amplificação, a solução de fagemídeos eluí-da (1,0 mL, contendo entre 107 e 109 cfu, dependendo do ciclo da seleção) foi brevemente aquecida até 37°C, misturada com 3 mL de uma cultura crescendo exponencialmente de E. coli XL1-blue (OD550 = 0,5 a 37°C) e agitada a 200 rpm durante 30 minutos a 37°C. As células infectadas foram sedimentadas (2 minutos, 4420 g, 4°C), ressuspensas em 600 pL do meio de cultura e plaqueadas em três placas de ágar com meio LB contendo 100 pg/mL de ampicilina (LB/Amp; 140 mm de diâmetro).

Após a incubação durante 14 horas a 32°C, a cobertura de células foi raspada das placas de ágar, cada uma com a adição de 10 mL de meio 2xYT/Amp. A suspensão foi transferida para um frasco Erlenmeyer esterilizado e foi agitada durante 20 minutos a 37°C, 200 rpm.

Para um outro ciclo de produção e para o enriquecimento da afinidade das partículas de fagemídeo 50 mL de meio 2xYT/Amp preaquecidos até 37°C foram inoculados com 0,2 até 1 mL da dita suspensão de forma que a densidade celular fosse de OD550 = 0,08. Esta cultura foi incubada a 37°C, 160 rpm até que uma densidade celular de OD550 = 0,5 fosse atingida. Então a cultura foi infectada com o fago auxiliador VCS-M13 (Stratagene) em uma multiplicidade de infecção de aproximadamente 10 e a cultura foi agitada durante mais 30 minutos a 37°C, 160 rpm. A canamicina (70 pg/mL) foi subseqüentemente adicionada, a temperatura da incubadora foi diminuída para 26°C e, após 10 minutos, a anidrotetraciclina foi adicionada a 25 pg/L para induzir a expressão gênica. A incubação continuou durante mais 15 horas a 26°C, 160 rpm.

As células foram sedimentadas através de centrifugação (15 minutos, 12000 g, 4°C). O sobrenadante contendo as partículas de fagemídeo foi esterilizado porfiltração (0,45 pm), foi misturado com 1X do volume (12,5 mL) de 20% p/v de PEG 8000,15% p/v de NaCI e foi incubado durante 1 h no gelo. Após a centrifugação (20 minutos, 18000 g, 4°C) as partículas de fagemídeo precipitadas foram dissolvidas em 2 mL de PBS gelado. A solução foi incubada em gelo durante 30 minutos e foi distribuída em dois vasos de reação de 1,5 mL. Após a centrifugação dos componentes não-dissolvidos (5 minutos, 18500 g, 4°C) cada sobrenadante foi transferido para um novo tubo de reação.

As partículas de fagemídeo foram precipitadas novamente através da mistura com V* do volume de 20% p/v de PEG 8000, 15% p/v de NaCI, seguida pela incubação durante 60 minutos em gelo. Após a centrifu- gação (20 minutos, 18500 g, 4°C) o sobrenadante foi removido e as partículas de fagemídeo precipitadas foram dissolvidas em 270 μΙ_ de PBS. Após a incubação durante 30 minutos em gelo a solução foi centrifugada (5 minutos, 18500 g, 4°C) e o sobrenadante foi utilizado diretamente para o enriquecimento da afinidade. Foram realizados através desta maneira quatro ciclos de seleção adicionais com o peptídeo do TNFa.

Exemplo 17: Identificação de muteínas da hNGAL que se ligam ao TNFa através do uso do método de "seleção de colônias" Para a produção analítica das muteínas da hNGAL na forma de proteínas de fusão com a Strep-Tag® II e o domínio de ligação com a albu-mina como descrito no Exemplo 3, o cassete gênico entre os dois sítios de divagem de BstXI foi subclonado do vetor phNGAL12 no phNGAL7.

Para esta finalidade o DNA do fasmídeo foi isolado da mistura dos clones de E. coli obtidos através da infecção com os fagemídeos do Exemplo 16, eluídos após o quinto ciclo de seleção, utilizando o Plasmid Midi Kit (Qiagen). O DNA foi cortado com a enzima de restrição BstXI e o menor dos dois fragmentos (347 pb) foi purificado através da eletroforese preparatória em gel de agarose como descrito no Exemplo 6. O DNA do vetor phNGAL7 foi cortado com BstXI e o maior dos dois fragmentos (3971 pb) foi isolado da mesma forma.

Para a ligação, 100 fmoles do fragmento de DNA pequeno isolado foram misturados com 100 fmoles do fragmento de DNA grande e incubados com 1,5 Unidade Weiss da T4 DNA ligase (Promega) em um volume total de 20 pL (Tris/HCI 30 mM pH 7,8, MgC^ 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM), seguido pela incubação durante a noite a 16°C. A E. coli TG1-F' (E., coli K12 TG1, que perdeu seu epissomo através da cultura repetida sob condições não-seletivas) foi transformada com 4 pL desta mistura de ligação de acordo com o método de CaCh (Sambrook e outros, supra), com a obtenção de 2,0 mL de uma suspensão de células. A suspensão de células foi centrifugada (5000 g, 2 min, 4°C), ressuspensa em 100 pL do meio de cultura, plaqueada em uma placa de ágar contendo meio LB/Amp e incubada a 37°C durante 14 h para a determinação da eficiência de transformação.

Uma membrana hidrofílica de PVDF (Millipore, tipo GVWP, tamanho de poro 0,22 μηι), marcada na posição e cortada do tamanho, foi colocada sobre uma placa de LB/Amp com ágar. A suspensão de células provenientes da batelada de transformação fresca, que foi transformada com 3-6 μΙ_ da mistura de ligação descrita acima, foi centrifugada (5000 g, 2 min, 4°C) e ressuspensa em 100 pL do meio de cultura e plaqueada uniformemente sobre esta membrana com a finalidade de se obter 400 até 500 colônias. A placa de ágar foi incubada durante 7,5 horas a 37°C até que as colônias tivessem atingido um tamanho de aproximadamente 0,5 mm.

Nesse meio tempo uma membrana hidrofóbica (Millipore, Immo-bilon P, tamanho de poro 0,45 μιτι) também cortada do tamanho, foi umede-cida com PBS de acordo com as instruções do fabricante. O revestimento com HSA foi conseguido através da agitação durante 4 horas à temperatura ambiente em 10 ml_ de uma solução de 10 mg/ml_ de HSA (Sigma) em PBS. Os sítios de ligação remanescentes na membrana foram saturados através da incubação com 20 mL de leite em pó desnatado 4% (p/v), Tween-20 0,1% (v/v) em PBS durante 2 horas à temperatura ambiente. A membrana foi lavada duas vezes durante 10 minutos com 20 mL de PBS e imersa depois disso durante 10 minutos em 10 mL de meio LB/Amp, aos quais foram adicionados 200 pg/L de anidrotetraciclina.

Finalmente, esta foi marcada em uma posição e colocada sobre uma placa de cultura com LB/Amp com ágar, que continha adicionalmente 200 pg/L de anidrotetraciclina. A membrana hidrofílica anterior, sobre a qual as colônias cresceram foi colocada sobre a membrana hidrofóbica de forma que ambas as marcas ficaram sobrepostas. A placa de cultura foi incubada com a pilha de membranas a 22°C durante 15 horas. Durante esta fase as respectivas muteínas da hNGAL foram secretadas das colônias da membrana superior e foram imobilizadas através de seu domínio de ligação com a albumina via a HSA na membrana inferior.

Depois disso, a membrana superior com as colônias foi transferida para uma placa de LB/Amp com ágar fresca e foi armazenada a 4°C. A membrana hidrofóbica foi removida, lavada três vezes durante 5 minutos cada com 20 mL de PBST.

Para a análise da atividade de ligação das muteínas da hNGAL imobilizadas a membrana foi então incubada durante 1 hora em 3,5 mL de uma solução de TNFa digoxigenado 100 nM em PBST contendo 0,5% p/v de leite em pó desnatado. O conjugado foi preparado através da reação de 40 nmoles (27,5 pg) de DIG-NHS (Roche) dissolvidos em 27 pL de DMSO com 10 nmoles (187,7 pg) de TNFa dissolvidos em 235 pL de PBS/NaOH pH 8,5 em um volume total de 1 mL de PBS/NaOH pH 8,5. A mistura foi incubada à temperatura ambiente (TA) durante 1 h. O excesso de reagente foi então removido do conjugado de TNFa através de uma coluna de filtração em gel PD-10 (Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante com PBS como o tampão de corrida. A membrana foi lavada três vezes com PBST, seguidas pela incubação durante 1 hora com 10 mL de Fab antidigoxigenina conjugadas a fosfatase alcalina diluído 1:1000 em PBST para a detecção do TNFa ligado através de seus grupos digoxigenina. A membrana foi lavada duas vezes com PBST e uma vez com PBS, cada uma durante 5 minutos e agitada durante 10 minutos em tampão AP. Para a reação cromogênica, a membrana foi incubada em 10 mL de tampão AP, aos quais foram adicionados 30 pL do sal de 4-toluidina fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila (Roth, dissolvido a 50 pg/mL em dimetilformamida) e 5 pL de nitro azul de tetrazólio (Roth, 75 pg/mL em 70% v/v de dimetilformamida), até que sinais coloridos distintos pudessem ser reconhecidos nas posições de algumas das colônias.

Das 1800 colônias que surgiram nas membranas de vários experimentos de seleção de colônia, 14 que produziam pontos intensos de cor na membrana hidrofóbica foram cultivadas partindo da membrana hidrofílica correspondente. Seu DNA de plasmídeo foi isolado e o cassete gênico da hNGAL foi submetido à análise de seqüência através do uso do sistema Genetic Analyzer 310 com o Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante e utilizando o oligo-desóxinucleotídeo da SEQ ID N°: 5 como iniciador.

Desta 14 muteínas, 13 exibiam a mesma seqüência, que foi denominada TNF-V1, enquanto que a décima quarta seqüência era diferente e foi denominada TNF-V2.

As seqüências de nucleotídeos dos clones TNF-V1 e TNF-V2 foram traduzidas em suas seqüências de aminoácidos e os resíduos de ami-noácido que desviavam da proteína hNGAL original são fornecidos na Tabela 4. As seqüências de nucleotídeos das muteínas TNF-V1 e TNF-V2 são também fornecidas como a SEQ ID Ne: 32 e a SEQ ID N°: 33, respectivamente. As seqüências de aminoácidos completas destas duas muteínas são fornecidas como SEQ ID Ne: 36 e SEQ ID N°: 37, respectivamente.

Tabela 4: Características da seqüência das muteínas TNF-V1 e TNF-V2 da hNGAL

Pos. hNGAL TNF-V1 TNF-V2 40 Ala Phe Gly 42 Leu Phe Phe 44 Glu Leu Vai 46 Lys Leu Phe 47 Asp Glu Asn 49 Gin Phe lie 50 Lys Phe Ser 70 Leu Thr Asp 72 Arg Leu Ala 73 Lys Glu Asn 77 Asp Phe Ala 79 Trp Glu Arg 80 lie ΔΔΔ* lie 101 Pro Lys Gly 102 Gly His Asn 103 Leu Gly Vai 125 Lys Asp Gly 127 Ser Ser Asp 128 Gin Gin Ser 130 Arg Arg Asn 132 Tyr Asn Arg * A muteína TNF-V1 não possui o resíduo de isoleucina na posição 80 por causa de uma deleção dos nucleotídeos 238 até 240.

Exemplo 18: Confirmação da atividade de ligação das muteínas selecionadas da hNGAL em relação ao TNFa através do uso do "ensaio de colônias pontuais" O ensaio de colônias pontuais foi realizado de uma maneira similar à do ensaio de seleção de colônias apresentado no Exemplo 17 exceto pelo fato de que as colônias isoladas de E. coli portando os plasmídeos de expressão correspondentes foram pinçadas de uma placa mestra na membrana hidrofílica - marcada com uma grade - ao invés de plaqueando uma suspensão de células transformadas. Cada clone respectivo foi colocado em pontos com um palito de dente esterilizado quatro ou cinco vezes em uma membrana hidrofílica (Millipore, tipo GVWP, tamanho de poro 0,22 pm) que foi colocada sobre uma placa de cultura de LB/Amp com ágar. As células foram cultivadas a 37°C durante 5 horas.

Nesse meio tempo uma membrana hidrofóbica (Millipore, Immo-bilon P, tamanho de poro 0,45 pm) foi umedecida com PBS de acordo com as instruções do fabricante. O revestimento com HSA foi conseguido através da agitação durante 4 horas à temperatura ambiente em 10 ml_ de uma solução de 10 mg/mL de HSA (Sigma) em PBS. Os sítios de ligação remanescentes na membrana foram saturados através da incubação com 20 mL de BSA 3% (p/v), Tween-20 0,1% (v/v) em PBS durante 2 horas à temperatura ambiente. A membrana foi lavada duas vezes durante 10 minutos com 20 mL de PBS e imersa depois disso durante 10 minutos em 10 mL de meio LB/Amp, aos quais foram adicionados 200 pg/L de anidrotetraciclina.

Finalmente, esta foi marcada em uma posição e colocada sobre uma placa de cultura com LB/Amp com ágar, que continha adicionalmente 200 pg/L de anidrotetraciclina. A membrana hidrofílica anterior, sobre a qual as colônias cresceram, foi colocada sobre a membrana hidrofóbica de forma que ambas as marcas ficaram sobrepostas. A placa de cultura foi incubada com a pilha de membranas a 22°C durante 15 horas. Durante esta fase as respectivas muteínas da hNGAL foram secretadas das colônias da membrana superior e foram imobilizadas através de seu domínio de ligação com a albumina na HSA na membrana inferior.

Depois disso, a membrana superior com as colônias foi transferida para uma placa de LB/Amp com ágar fresca e foi armazenada a 4°C. A membrana hidrofóbica foi removida, lavada três vezes durante 5 minutos cada com 20 mL de PBST.

Para confirmar a atividade de ligação das muteínas em pontos em relação ao TNFa a membrana foi então incubada durante 1 hora em 3,5 mL de uma solução de TNFa digoxigenado 100 nM em PBST contendo 0,05% p/v de leite em pó desnatado (uma solução estoque de 1,5 μΜ do TNFa digoxigenado em PBS foi portanto diluída 1:15 em PBST contendo »*V\ ir\ A IOIK7 OI II μυ UCOI ICllCIVJU). A membrana foi lavada três vezes com PBST, seguidas pela incubação durante 1 hora com 10 mL de conjugado Fab antidigoxigenina-Fosfatase alcalina diluído 1:1000 em PBST para a detecção do TNFa ligado através de seus grupos digoxigenina. A membrana foi lavada duas vezes com PBST e uma vez com PBS, cada uma durante 5 minutos e agitada durante 10 minutos em tampão AP. Para a reação cromogênica, as membranas foram incubadas em 10 mL de tampão AP, aos quais foram adicionados 30 pL do sal de 4-toluidina fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila (Roth, dissolvido a 50 pg/mL em dimetilformamida) e 5 pL de nitro azul de tetrazólio (Roth, 75 pg/mL em 70% v/v de dimetilformamida). Os sinais coloridos distintos podiam ser reconhecidos nas posições em que as muteínas TNF-V1 e TNF-V2 foram aplicadas em pontos, enquanto que não podia ser observado qualquer sinal de ligação para a hNGAL do tipo selvagem (codificada pelo phNGAL7), para a proteína de ligação com a bilina (codificada pelo vetor pBBP22; Schlehuber e outros, J. Mol. Biol. 297 (2000), 1105-1120), para duas muteínas não-relacionadas da biblioteca das muteínas da hNGAL descritas no Exemplo 6 (ambas subclonadas no phNGAL7) e para o clone expressando nenhuma proteína (carregando o pBluescript (Stratagene) como um plasmídeo), confirmando a atividade de ligação da TNF-V1 e da TNF-V2 ao TNFa.

REIVINDICAÇÕES

Claims (15)

1. Método para a geração de uma muteína de uma proteína selecionada do grupo consistindo em lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos humanos (hNGAL), da proteína relacionada à a2-microglobulina de ratos (A2m) e da 24p3/uterocalina (24p3) de camundongos, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa (a) de: submeter a proteína à mutagênese 1 a 32 das posições de seqüência que correspondem às posições de seqüência 40 até 50, 70 até 79, 101 até 103 e 125 até 132 da hNGAL, resultando em uma biblioteca de muteínas da proteína.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa (b) de: enriquecer uma muteína resultante partindo da biblioteca de muteínas através da seleção e/ou do isolamento pelo menos da dita muteína.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a mutagênese na etapa (a) resulta em 107 a 1012 muteínas da proteína.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a proteína é submetida à mutagênese em 1 a 20 das posições de seqüência que correspondem às posições de seqüência 40, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 70, 72, 73, 77, 79, 101, 102, 103, 125, 127, 128, 130, e 132 da hNGAL.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que um ácido nucléico que codifica uma ou mais muteínas da proteína, cujo ácido nucléico resulta da mutagênese, está fundido de forma operacional na extremidade 3’ com um gene que codifica a proteína plll de revestimento de um bacteriófago filamentosos da família do M13 ou um fragmento desta proteína de revestimento, com a finalidade de selecionar pelo menos uma muteína para a ligação do alvo fornecido.

6. Muteína de lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos humana (hNGAL), proteína relacionada à a2-microglobulina de rato (A2m), ou 24p3/uterocalina (24p3), caracterizada pelo fato de que a muteína compreende uma mutação em 1 a 32 das posições de seqüência correspondentes às posições de seqüência 40 a 50, 70 a 79, 101 a 103 e 125 a 132 de hNGAL.

7. Muteína de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a muteína compreende uma mutação em 1 a 20 das posições de seqüência, as quais correspondem às posições de seqüência 40, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 70, 72, 73, 77, 79, 101, 102, 103, 125, 127, 128, 130 e 132 de hNGAL.

8. Muteína da hNGAL de acordo com reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que a Cys87 é substituída e/ou em que a muteína carrega uma ou mais das substituições de aminoácidos Glu28 -> His, Thr145 -> Ala quando comparada com a hNGAL.

9. Muteína da hNGAL de acordo com reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de possuir a seqüência de aminoácidos de SEQ ID Ne: 17, de SEQ ID Ne: 24, de SEQ ID Ne: 26, ou de SEQ ID Ne: 28.

10. Muteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizada pelo fato de que é conjugada a uma marcação selecionada do grupo que consiste em uma molécula orgânica, uma marcação enzimática, uma marcação radioativa, uma marcação fluorescente, uma marcação cromogênica, uma marcação luminescente, um hapteno, digoxigenina, biotina, complexos metálicos, metais e ouro coloidal.

11. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende uma muteína de hNGAL, de A2m ou de 24p3 como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 10, em que uma enzima, uma proteína ou um domínio de proteína, um peptídeo, uma seqüência sinal e/ou um rótulo de afinidade está fundida de forma operacional ao terminal amino ou ao terminal carbóxi da muteína.

12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma muteína de hNGAL, de A2m, ou de 24p3 como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 10 ou uma proteína de fusão como definida na reivindicação 11 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

13. Método para a produção de uma muteína de hNGAL, de A2m, ou de 24p3 como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 10 ou uma proteína de fusão como definida na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a muteína ou a proteína de fusão é produzida partindo do ácido nucléico que codifica a muteína através de métodos de engenharia genética em um organismo hospedeiro bacteriano ou eucariótico e é isolada deste organismo hospedeiro ou de sua cultura.

14. Uso de uma muteína de hNGAL, de A2m ou de 24p3 como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 10 ou uma proteína de fusão como definida na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de ser para a detecção de um certo alvo, que compreende as etapas de colocar a muteína em contato com uma amostra suspeita de conter o certo alvo sob condições adequadas, permitindo assim a formação de um complexo entre a muteína e o certo alvo e determinando a muteína complexada através de um sinal adequado.

15. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o alvo fornecido é uma proteína ou um domínio de proteína, um peptídeo, uma molécula de ácido nucléico, uma molécula orgânica ou um complexo metálico e a detecção e realizada para a validação da proteína como alvo para droga farmacológica.