ES2253561T3 - Muteinas de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrofilo humana y proteinas relacionadas. - Google Patents

Abstract

El método para generar una muteína de una proteína seleccionada del grupo consistente en la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana (hNGAL), la proteína relacionada con la a, 2-microglobulina de rata (A2m) y la 24p3/uterocalina de ratón (24p3), teniendo dicha muteína afinidad detectable por una diana determinada, que comprenda el paso (a) de: Someter la proteína a mutagénesis en una o más de las posiciones de secuencia que corresponden a las posiciones de secuencia de la 40 a la 50, de la 70 a la 79, de la 101 a la 103 y de la 125 a la 132 de la hNGAL, lo que resulta en una o más muteína(s) de la proteína.

Description

Muteínas de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana y proteínas relacionadas.

La presente invención se refiere a un método para generar una muteína de lipocalina asociada a la gelatinasa de neutrófilo humana (hNGAL), la proteína relacionada con \alpha2-microglobulina de rata (A2m) o la 24p3/uterocalina de ratón (24p3), donde esta muteína posee una afinidad detectable hacia una diana determinada y hacia una muteína de una de las tres proteínas obtenibles mediante este método. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican tales muteínas, una composición farmacéutica que comprende una muteína de la invención, así como a varios usos de la muteína de la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana, la proteína de rata relacionada con \alpha2-microglobulina (A2m) y la 24p3/uterocalina de ratón (24p3).

Las lipocalinas (Pervaiz y Brew, FASEB J. 1 (1987), 209-214) son una familia de proteínas pequeñas, a menudo proteínas monoméricas secretoras que han sido aisladas de varios organismos y cuya función fisiológica es el almacenamiento o el transporte de diferentes dianas, por ejemplo el retinol o las feromonas, así como otras funciones biológicas más complejas como el gusto y el olfato o la síntesis de prostaglandinas (revisado, por ejemplo por Flower, Biochem. J. 318 (1996), 114). Las lipocalinas tienen una similitud de secuencia mutua relativamente pequeña y su relación como familia de proteínas estructurales se descubrió inicialmente mediante análisis estructural por rayos X (Sawyer et al., Nature 327 (1987), 659).

Las dianas típicas de las lipocalinas son sustancias lipofílicas de bajo peso molecu1ar como los retinoides, los ácidos grasos, los colesteroles, las prostaglandinas, las biliverdinas, las feromonas, los saboreantes, y los aromatizantes (Flower, Biochem. J. 318 (1996), 1-14; véase también Kjeldsen, Biochemica et Biophysica Acta, 1482 (2000), 272-283). Una diana típica de las lipocalinas es la vitamina A en el caso de la proteína de unión al retinol (Rbp) así como la \beta-lactoglobulina (Papiz et al., Nature 324 (1986), 383-385).

Los anticuerpos, es decir, las inmunoglobulinas, son un clásico ejemplo de proteínas que selectivamente se unen a dianas mediante una interacción no covalente. Estas proteínas juegan un papel crítico como reactivos en los campos de la biotecnología, medicina, bioanalítica, así como en el campo de la biología y de las ciencias de la vida en general. A pesar de las múltiples necesidades para la unión de proteínas junto con el reconocimiento, unión o separación de ligandos/dianas, las inmunoglobulinas se utilizan casi exclusivamente para estos propósitos. La aplicación de otras proteínas con características definidas de unión a ligando, por ejemplo las lectinas, ha permanecido restringida a casos especiales.

Recientemente, los miembros de la familia de la lipocalina se han convertido en sujeto de la investigación concerniente a las proteínas con propiedades de unión a ligandos. La German Offenlegungsschrift DE 197 42 706 y la Solicitud de Patente Internacional WO 99/16873 describen el tipo anticalins®; polipéptidos que presentan, al igual que los anticuerpos, características de unión específicas a un determinado ligando (comparar también con Beste et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 96 (1999) 1898-1903). Las anticalins® se pueden obtener a partir de polipéptidos de la familia de las lipocalinas que están mutadas en los cuatro segmentos que corresponden a las posiciones de la secuencia lineal del polipéptido que comprende las posiciones de los aminoácidos 28 a 45, 58 a 69, 86 a 99 y 114 a 129 de la proteína de unión a Bilina (Bbp).

Además, la patente Alemana DE 199 26 068, WO 00/75308 así como Schlehuber et al., J. Mol. Biol. (2000), 1105-1120, describe las muteínas de la proteína de unión a Bilina como las muteínas DigA y DigA16 que se unen específicamente a digoxigenina.

Aún cuando la tecnología de anticalin® se ha establecido bien en principio, y ha producido presumiblemente una aplicación práctica prometedora en las muteínas Bbp que unen digoxigenina descritas anteriormente, son deseables nuevas mejoras y aplicaciones prácticas. En vista de las diferentes aplicaciones potenciales para las proteínas de unión a ligando o diana en el campo de las ciencias de la vida, la generación de anticalins® basadas en armazones alternativos de lipocalinas será deseable simplemente por la razón de tener más opciones para la realización práctica.

De acuerdo con esto, es un objeto de la invención proporcionar muteínas de lipocalina alternativas que posean afinidad de unión de una diana determinada.

Este objeto se alcanza mediante el método y las muteínas con las características de las presentes reivindicaciones independientes.

Tal método es un método para generar una luteína de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana (hNGAL), la proteína relacionada con \alpha2-microglobulina de rata (A2m) y la 24p3/uterocalina de ratón (24p3); dicha muteína posee una afinidad detectable hacia una diana específica, comprendiendo el paso de (a) someter a la proteína a mutagénesis en una o más posiciones de la secuencia que corresponde a las posiciones de la secuencia 40 a 50, 70 a 79, 101 a 103 y 125 a 132 de hNGAL, resultando en una o más luteínas de la proteína.

El método preferiblemente comprende un paso más (b) de enriquecimiento de al menos una de las muteínas resultantes con afinidad de unión para una determinada diana, a partir de una o más muteínas mediante selección o aislamiento de al menos una de estas muteínas. Preferiblemente la mutagénesis resulta en una pluralidad de muteínas de la proteína, es decir, dos o más muteínas.

Esto indica que la presente invención está basada en el hallazgo de que la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana (hNGAL) y las proteínas homólogas de la misma de rata (A2m) y ratón (24p3) proporcionan armazones adecuados para la generación de proteínas que poseen actividad de unión a una determinada diana de interés. Se ha identificado a hNGAL como un miembro de la familia de la lipocalína, su correspondiente cDNA ha sido clonado (Bundgaard et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 202 (1994), 1468-1475) y su estructura tridimensional se ha resuelto por RMN (Coles et al., J. Mol. Biol. 289 (1999), 139-157) y mediante cristalografía por rayos X: (Goetz et al.,Biochemistry, 39 (2000), 1935-1941), pero hasta ahora ni su función fisiológica ni su diana natural habían sido identificados sin ambigüedad (Kjeldsen et al; supra). Conforme a esto, la presente invención proporciona por primera vez una posible aplicación práctica no sólo para hNGAL sino que también para sus homólogos A2m y 24p3.

Las posiciones de los aminoácidos en las proteínas A2m y 24p3 que están sometidas a mutagénesis en el método de acuerdo con la invención, se obtienen a partir de un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de hNGAL, A2m, y 24p3. En la proteína A2m que posee el mismo número de residuos aminoacídicos (178) que la hNGAL, se han utilizado las mismas posiciones de secuencia para la mutagénesis que las posiciones seleccionadas para la hNGAL, es decir las posiciones de secuencia 40 a 50, 70 a 79, 101 a 103 y 125 a 132 de hNGAL. Para 24p3, las correspondientes posiciones de secuencia son las posiciones 40 a 50, 70 a 79, 103 a 105 y 127 a 134. Así, las posiciones de aminoácidos sometidas a mutagénesis se distribuyen entre cuatro segmentos de secuencia correspondientes a cuatro lazos en la estructura tridimensional de la hNGAL, la A2m y la 24p3.

El número de segmentos (lazos) definidos anteriormente que se utilizan para la mutagénesis puede variar. En una mutagénesis dirigida no es necesario mutar los cuatro lazos a la vez, por ejemplo, sino que también es posible someter solo dos o tres de los lazos a ello para generar una muteína con una afinidad detectable hacia una diana determinada.

En una realización preferida del método, la proteína respectiva se somete a mutagénesis en una o más de las posiciones de la secuencia que corresponden a las posiciones de la secuencia 40, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 70, 72, 73, 77, 79, 101, 102, 103, 125, 127, 128, 130 y 132 de hNGAL.

En realizaciones particularmente preferidas, son sometidas a mutagénesis al menos 10, y más preferiblemente al menos 15 de las posiciones de secuencia 40, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 70, 72, 73, 77, 79, 101, 102, l03, 125, 127, 128, 130 y 132 de la hNGAL o A2m, o de las posiciones correspondientes de la 24p3. En la realización más preferida, estas 20 posiciones de secuencia se aleatorizan, para lo que se deja que cualquiera de los 20 aminoácidos naturales pueda incorporarse a las secuencias de polipéptido en estas posiciones.

Esto indica que la presente invención, que está basada en el hallazgo de que las muteínas de la hNGAL o sus homólogos A2m y 24p3 con afinidad detectable hacia una diana determinada, puede obtenerse mediante mutagénesis, preferiblemente mutagénesis aleatoria en un total de 20 residuos de aminoácido, concretamente en las posiciones de secuencia 40, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 70, 72, 73, 77, 79, 102, 103, 125, 127, 128, 130 y 132 de la hNGAL. Este hallazgo es particularmente sorprendente por diferentes razones.

Tal como se ha mencionado, en esta realización preferida del método de la invención se aleatorizan en total un grupo de 20 aminoácidos, es decir, se someten a mutagénesis, mientras que en la WO 99/16873 tan solo se han mutado un total de 16 aminoácidos. Cuando se utiliza mutagénesis aleatoria con codónes NNS o NNK para la aleatorización completa de estas 20 posiciones de aminoácidos (es decir, cada uno de los 20 aminoácidos naturales es permitido en cada una de estas 20 posiciones seleccionadas), existen 32^{20} combinaciones de codónes posibles. Si se utilizan 16 posiciones de aminoácidos para la aleatorización, existen 32^{16} combinaciones de codónes posibles. De acuerdo con esto, al aumentar el número de aminoácidos sometidos a mutagénesis dirigida en 4 (de 16 a 20) resulta en un aumento de 32^{4} \approx 10^{6} en la complejidad combinatoria. No obstante, el número de mutantes que pueden obtenerse físicamente en la correspondiente biblioteca basada en DNA no puede incrementarse de forma deliberada debido a las limitaciones experimentales y está restringido normalmente a un valor de alrededor de 1\cdot10^{9} a 1\cdot10^{10} de acuerdo con los antecedentes en la materia (Fitzgerald, Drug Discov. Today 5 (2000), 253-258). En un ejemplo de la presente invención, se utilizó
una biblioteca combinatoria basada en DNA que contiene aproximadamente 1\cdot10^{7} variantes de secuencia (muteínas).

Considerando que la pequeña sección accesible del espacio de secuencia combinatorial se reduce además en un factor de aproximadamente 10^{6}, es sorprendente que sea del todo posible aislar de la biblioteca combinatorial que contiene un número de solo 1\cdot10^{7} de tales muteínas de hNGAL (o A2m o 24p3)que a) no solo se pliega en proteínas solubles sino que b) aún posee una nueva especificidad de ligando/diana.

Respecto a esto deberá apreciarse que la aproximación que se hace aquí se contrapone a lo que se dice en la WO 99/16873. De acuerdo con esta referencia seria útil mantener el número total de posiciones de aminoácidos mutadas en un único experimento tan bajo como sea posible para que la colección obtenida por mutagénesis, es decir, la biblioteca, pueda observarse en lo posible en su totalidad o en al menos una selección representativa de la misma.

Finalmente, deberá apreciarse que también es sorprendente que la presente aproximación se utilice con éxito para la producción de una luteína con una actividad específica de unión hacia un epítopo de proteína (ver los Ejemplos 5, 15, por ejemplo).

La presente invención también está dirigida hacia una lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana, proteína relacionada con \alpha2-microglobulina de rata (A2m) o 24p3/uterocalina de ratón (24p3) con una afinidad detectable hacia una diana determinada, que es obtenible por mutagénesis de la proteína respectiva en aquellas posiciones de secuencia que corresponden a las posiciones de secuencia 40 a 50, 70 a 79, 101 a 103 y 125 a 132 de hNGAL.

Preferiblemente tal muteína lleva una sustitución de entre 5 y 10 aminoácidos, más preferiblemente entre 8 y 12 y aun más preferiblemente entre 10 y 18, o entre 10 y 20 de las 20 posiciones de secuencia seleccionadas.

En una realización preferida, la muteína posee la secuencia de aminoácido de ID de SEC Nº:12. Esta muteína también es referida como TlpcA.

Las muteínas de la invención son capaces de unir la diana deseada con una afinidad detectable, es decir, con una constante de afinidad de preferiblemente al menos 10^{5} M^{-1}. Las afinidades inferiores a esto, generalmente no se pueden medir por métodos convencionales como el ELISA y son por lo tanto de una importancia secundaria para las aplicaciones prácticas. Especialmente preferidas son las muteínas que se unen a la diana deseada con una afinidad de al menos 10^{6} M^{-1}, que corresponde a constante de disociación del complejo de 1 \muM. La afinidad de unión de una muteína hacia la diana deseada puede ser medida por un experto en la materia mediante diferentes métodos, por ejemplo mediante valoración fluorescente, mediante ELISA de competición o mediante la técnica de resonancia del plasmón de superficie.

La diana (ligando) que se une a la muteína puede ser cualquier porción química que, por ejemplo, pueda también unirse o ser reconocida por una inmunoglobulina. De acuerdo con esto, la diana puede ser un compuesto químico en su forma libre o conjugada que presente características de un hapteno, una hormona como una hormona esteroidea o cualquier biopolímero o fragmento del mismo, por ejemplo, un péptido, un oligodesoxinucleótido, un ácido nucleico, oligo y polisacárido u otras macromoléculas o conjugados de las mismas. En una realización preferida de la invención, la diana es una proteína.

Las muteínas de la invención pueden tener la secuencia natural de aminoácidos de la hNGAL, A2m o 24p3 fuera de los segmentos mutados, es decir, las regiones de las posiciones de aminoácidos 40 a 50, 70 a 79, 101 a 103 y 125 a 132 en el caso de la hNGAL. Por otro lado, las muteínas descritas aquí también contienen mutaciones de aminoácidos fuera de las posiciones sometidas a mutagénesis en comparación con la proteína salvaje, siempre y cuando estas mutaciones no interfieran con la actividad de unión y la conformación de la muteína. Esto implica que pueden ser introducidas en la secuencia natural de aminoácidos de hNGAL, A2m o 24p3, por ejemplo, mutaciones, sustituciones, deleciones o inserciones de residuos de aminoácidos, así como adiciones terminales en N- o C-.

Tales modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la proteína seleccionada, dentro o fuera de la región de unión seleccionada, incluyen mutagénesis dirigida en posiciones de aminoácidos puntuales, por ejemplo, para simplificar el subclonaje del gen o de segmentos de la lipocalina mutada mediante la incorporación de sitios de corte de ciertas enzimas de restricción. Por ejemplo, la mutación Glu28 a His, y Thr145 a Ala pueden introducirse en el gen de la hNGAL para simplificar el clonaje del segmento del gen mutado mediante dos nuevos sitios de restricción BstXI en estas posiciones. Además, las mutaciones pueden introducirse dentro o fuera de los cuatro lazos peptídicos para mejorar ciertas características de la muteína de la proteína escogida como armazón, por ejemplo su estabilidad conformacional, la eficiencia de plegamiento o su resistencia a las proteasas.

En una realización preferida, por ejemplo, la Cys87 de la hNGAL se cambia por Ser o Ala, con lo que puede prevenirse su unión covalente a otras proteínas como la gelatinasa B (que sucede en aplicaciones in vivo de una muteína) y su estructura monomérica puede estabilizarse. De forma similar, los residuos Cys que ocurren como resultado de la mutagénesis y de la selección de la muteína de la invención, no son siempre cruciales para la unión de una diana determinada y puede ser sustituidos por Ser o Ala para prevenir la formación de enlaces covalentes o la oxidación del grupo tiol.

En una muteína preferida de la hNGAL, la Cys87 está sustituida y la muteína lleva una o ambas sustituciones de aminoácidos Glu(28) \rightarrow His, Thr(145) \rightarrow Ala en comparación con la hNGAL. Respecto a esto, deberá notarse que la presente invención también está dirigida a una hNGAL (recombinante) que posee las secuencias de aminoácidos naturales en las que sólo la Cys87 ha sido sustituida por cualquier otro aminoácido adecuado. Este polipéptido de la hNGAL puede producirse usando los métodos descritos aquí para la producción del resto de muteínas de la invención (véase Ejemplo 4), por ejemplo mediante el uso del vector pHNGAL7.

El método de la presente invención preferiblemente comprende (en el caso (b)) (i) proporcionar como diana, un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en un compuesto químico en su forma libre o conjugada, que presenta características de un hapteno inmunológico, un péptido, una proteína u otra macromolécula, (ii) poner en contacto la pluralidad de muteínas con dicha diana para poder permitir la formación de complejos entre dichas dianas y las muteínas que poseen afinidad de unión para dicha diana y (iii) eliminar las muteínas que no posean afinidad de unión suficiente.

No poseer afinidad de unión suficiente indica que bajo estas condiciones, no se forman complejos entre la diana y la pluralidad de muteínas que entran en contacto con ella. Queda claro a una persona entendida en la materia que la formación de complejos depende de muchos factores como la concentración de las parejas de unión, concentración de los compuestos que actúan como competidores, la fuerza iónica de los tampones, etcétera. La selección y enriquecimiento se lleva generalmente a cabo bajo condiciones que permiten el aislamiento y enriquecimiento de muteínas que poseen una afinidad constante de al menos 10^{5} M^{-1} hacia la diana. No obstante, los pasos de lavado y elución pueden ser llevados a cabo variando la astringencia. Por ejemplo, si las muteínas con una constante de afinidad de al menos 10^{6} M^{-1} deben ser aisladas, el lavado y la elución pueden realizarse aumentando la astringencia, es decir, condiciones más astringentes. También es posible hacer una selección respecto a las características cinéticas. La selección puede, por ejemplo, realizarse bajo condiciones que favorezcan la formación de complejos de la diana con las muteínas que muestran una baja disociación de la diana (receptor), o en otras palabras una tasa k_{off} baja.

El término "pluralidad" tal como se usa aquí indica que están presentes al menos dos muteínas que difieren entre ellas en sus secuencias de aminoácidos. El límite superior de las muteínas generadas por mutagénesis queda restringido normalmente por las condiciones experimentales y está generalmente entre 10^{7} y 10^{12}.

El término "mutagénesis" tal como se usa aquí indica que las condiciones experimentales se escogen de tal forma que los aminoácidos naturales en una posición de secuencia de hNGAL, A2m o 24p3 pueden sustituirse por al menos un aminoácido que no está presente en esta posición específica en la respectiva secuencia polipeptídica natural. El término "mutagénesis" también incluye (además) la modificación de la longitud de los segmentos de secuencia por deleción o inserción de uno o más aminoácidos. Así, está dentro del alcance de la invención, por ejemplo, que el aminoácido de una posición de secuencia escogida sea reemplazado por un tramo de tres mutaciones aleatorias, dando lugar a una inserción de dos residuos de aminoácido en comparación con la longitud (del segmento correspondiente) de la proteína salvaje. El término "mutagénesis aleatoria" indica que no está presente ninguna (mutación) predeterminada puntual de aminoácido en una cierta posición de secuencia, pero que al menos dos aminoácidos pueden incorporarse en una posición de la secuencia seleccionada durante la mutagénesis con una cierta probabilidad.

Tales condiciones experimentales pueden, por ejemplo, alcanzarse mediante la incorporación de codónes con una composición de bases degeneradas en el gen estructural para, por ejemplo, la hNGAL en aquella posición en la que debe ser mutada. Por ejemplo, el uso del codón NNK o NNS permite la incorporación de los 20 aminoácidos, además del codón de parada ámbar durante la mutagénesis, mientras que el codón VVS limita a 14 el número de posibles aminoácidos a incorporar, ya que excluye los aminoácidos Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val de ser incorporados en la posición seleccionada de la secuencia de polipéptido; el uso del codón NMS, por ejemplo, restringe el número de posibles aminoácidos a 11 en la posición de secuencia seleccionada ya que excluye los aminoácidos Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Val de ser incorporados en la posición seleccionada de la secuencia. En una realización preferida del método de la invención, se lleva a cabo una mutagénesis, en la que se permite que se incorporen al menos 4, preferiblemente 6, más preferiblemente de 8 a 12 o de 8 a 15 aminoácidos en una posición de secuencia seleccionada de la hNGAL, A2m o 24p3. En una realización particularmente preferida, al menos una posición de secuencia se somete a una aleatorización completa, es decir, se permite que se incorporen en esta posición los 20 aminoácidos durante la mutagénesis. De acuerdo con esto, queda claro que el aminoácido presente de forma natural en cierta posición de secuencia de la respectiva proteína como la hNGAL, puede también estar presente en la muteína tras someter esta posición a mutagénesis.

En una realización preferida del método de la invención, la diana es una proteína. La proteína puede proporcionarse tanto en su forma libre o conjugada o como una proteína de fusión para la selección de muteínas.

En una realización preferida del método de la invención, se utiliza un ácido nucleico que codifica para la pluralidad de muteínas de las respectivas proteínas seleccionadas de la hNGAL, A2m y 24p3. Este ácido nucleico es resultado de la mutagénesis y está fusionado de forma operativa en el extremo 3' con un gen codificante para la proteína pIII de la cubierta de un bacteriófago filamentoso de la familia del M13 o para un fragmento de esta proteína de la cubierta, para poder seleccionar al menos una muteína de unión de esta diana determinada.

El ácido nucleico resultante de la mutagénesis puede obtenerse mediante el uso de PCR. En una realización preferida del método de la invención, la generación del ácido nucleico que codifica para los segmentos de la respectiva proteína comprende los siguientes pasos. Primero, se generan por PCR dos fragmentos de ácido nucleico, cada uno de los cuales codifica para una parte de la proteína mutada, de tal forma que estos fragmentos están parcialmente superpuestos. Estos fragmentos se emplean con dos cebadores flanqueantes en un segundo paso de amplificación para poder obtener el ácido nucleico que comprende el gen estructural mutado completo (véase la Fig. 2 y el Ejemplo 1 que ilustran este procedimiento en dos pasos). Debido a la superposición, el producto de PCR de longitud completa será amplificado durante el curso de la reacción, sin que sea necesaria la adición de ácido nucleico adicional. Los dos fragmentos pueden obtenerse con una pareja o parejas de cebadores adecuados en dos reacciones de amplificación separadas (véase también la Fig. 2 y el Ejemplo 1, que muestran que estos fragmentos se generan en las reacciones de PCR A y B).

Para algunas aplicaciones, es útil emplear la muteína inventiva de hNGAL, A2m o 24p3 en una forma marcada. De acuerdo con esto, la invención también se refiere a una muteína de cada una de las tres proteínas utilizadas aquí como armazón, que está conjugada a una marca seleccionada del grupo consistente en marcaje enzimático, marcaje radioactivo, marcaje fluorescente, marcaje cromogénico, marcaje luminiscente, un hapteno, biotina, digoxigenina, complejos metálicos, metales, y oro coloidal. La muteína también puede ser conjugada a una molécula orgánica. El término "molécula orgánica" tal como se usa en la presente solicitud preferiblemente indica una molécula orgánica que comprende al menos dos átomos de carbono, pero no más de 7 enlaces de carbono rotatorios que poseen un peso molecular de entre 100 y 2000 Dalton, preferiblemente 1000 Dalton y una molécula que incluya uno o más átomos metálicos.

En general, es posible marcar la muteína con cualquier sustancia química o enzima apropiada, que directa o indirectamente genere en una reacción química, enzimática o física un compuesto detectable o una señal que pueda utilizarse para la detección. Un ejemplo de reacción física es la emisión de fluorescencia tras la excitación con radiación o la emisión de rayos X por un marcaje radioactivo; son ejemplos de marcaje enzimático que cataliza la formación de compuestos cromogénicos (coloreados) que pueden ser detectados, la fosfatasa alcalina, la peroxidasa de rábano picante o la \beta-galactosidasa. En general todos los marcajes que se utilizan con anticuerpos, excepto aquellos que exclusivamente se utilizan con la matriz glucídica en la parte Fc de las inmunoglobulinas, pueden también utilizarse para la conjugación de las muteínas de la presente invención. Estos conjugados pueden prepararse mediante los métodos conocidos por una persona entendida en la materia.

Una opción que es particularmente ventajosa para las aplicaciones prácticas de las muteínas descritas aquí, es el uso de las muteínas en forma de proteínas de fusión. En realizaciones preferidas de tales proteínas de fusión, un enzima, una proteína o un dominio de la proteína, un péptido, por ejemplo un péptido tal que una secuencia señal y/o cola de afinidad, se unen de forma operativa al extremo amino-terminal o carboxi-terminal de la muteína.

La pareja de fusión puede ser adecuada para conferir nuevas características a la muteína, por ejemplo actividad enzimática o afinidad para otras moléculas como las proteínas, macromoléculas o dianas de bajo peso molecular. Son posibles, por ejemplo, las fusiones con enzimas que pueden catalizar reacciones cromogénicas o fluorogénicas (por ejemplo, la fosfatasa alcalina, la peroxidasa de rábano picante o la glutation-S-transferasa) o que pueden servir para la liberación de agentes citotóxicos. Más ejemplos de parejas de fusión que pueden ser ventajosas en la práctica son los dominios de unión, como el dominio de unión a albúmina de la proteína G, la proteína A, fragmentos de anticuerpo, dominios de oligomerización, toxinas o también muteínas de la invención o anticalins® con la misma o diferente especificidad de diana. Un ejemplo específico para esto último sería una proteína de fusión que comprende una muteína de hNGAL de la presente invención y la muteína de unión a digoxigenina DigA16 descrita en la Patente Alemana DE 199 26 068. Las colas de afinidad, como la Strep-Tag® o la Strep-tag® II (Schmidt et al., J. Mol. Biol. 255 (1996), 753-766), las colas de oligohistidina (por ejemplo, colas His6), o las proteínas como la glutation-S-transferasa, que puede utilizarse para la purificación por cromatografía de afinidad y para la detección (por ejemplo, utilizando la afinidad específica del Strep-tag® por la estreptavidina) son otros ejemplos de parejas de fusión preferidas. Las proteínas con propiedades cromogénicas o fluorescentes como la proteína verde fluorescente (GFP) también son parejas de fusión adecuadas.

El término proteína de fusión tal como se usa aquí también incluye muteínas de la invención, por ejemplo muteínas de hNGAL, que están equipadas con una secuencia señal. Las secuencias señal en el extremo N-terminal de un polipéptido de acuerdo con la invención pueden ser adecuadas para dirigir al polipéptido hacia un compartimento celular específico durante la biosíntesis, por ejemplo el periplasma de E. Coli, el lumen de la célula eucariota o el medio circundante de la célula. Cuando esto se utiliza, la secuencia señal se rompe mediante una peptidasa de señal. También es posible utilizar otras secuencias diana o de señalización que están localizadas necesariamente en el extremo N-terminal del polipéptido y que permiten la localización del mismo en compartimentos celulares específicos. Una secuencia señal preferida para la secreción en el periplasma de E.coli es la secuencia señal OmpA. Se conocen un gran número de secuencias señal en la materia.

La invención también está dirigida a moléculas de ácido nucleico que comprendan una secuencia que codifique una muteína de acuerdo con la invención o una proteína de fusión de la misma. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótido que codifica la luteína con ID de SEC Nº: 12.

Ya que la degeneración del código genético permite las sustituciones de ciertos codónes por otros codónes que codifican para los mismos aminoácidos y por lo tanto dan lugar a la misma proteína, la invención no se limita a una sola molécula de ácido nucleico específica sino que incluye todas las moléculas de ácido nucleico que comprendan una secuencia de nucleótidos que codifiquen para una muteína con la secuencia de aminoácido de acuerdo con la presente invención.

La molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una muteína de la hNGAL, A2m o 24p3 como se ha descrito aquí, puede estar unida de forma funcional a una secuencia reguladora para permitir la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula huésped (in vivo) o su transcripción y traducción en un sistema libre de células (in vitro).

Una molécula de ácido nucleico como el DNA se espera que sea "capaz de expresar una molécula de ácido nucleico o una secuencia de nucleótidos codificante" o capaz "de permitir la expresión de una secuencia de nucleótidos" cuando contiene secuencias de nucleótidos que contienen información transcripcional y traduccional, y cuando tales secuencias están "funcionalmente unidas" a las secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido. Una unión funcional es una unión en la que las secuencias reguladoras de DNA y las secuencias de DNA que se intentan expresar están conectadas de tal forma que se permite la expresión génica. La naturaleza exacta de las regiones reguladoras y de los elementos necesarios para la expresión génica puede variar entre los diferentes organismos pero, en general, incluirán una región promotora que, en procariotas por ejemplo, contiene tanto las secuencias reguladoras del promotor, que pueden comprender una región transcripcional funcional en una célula, como una región transcripcional terminadora funcional en una célula. Los elementos utilizados para la transcripción o la traducción son promotores, activadores, secuencias líder, sitios de inicio de la transcripción y sitios de terminación de la transcripción, señales de poliadenilización, sitios de unión al ribosoma, como la secuencia Shine-Dalgarno, o similares. Estas secuencias reguladoras y la muteína de la invención pueden ser parte de un vector. De acuerdo con esto, la invención también se refiere a un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una muteína de hNGAL, A2m o 24p3 como se ha descrito aquí.

En otra realización, la invención también se refiere a un método para producir una muteína de la invención o una proteína de fusión de la misma. En este método la muteína de la proteína de fusión se produce a partir del ácido nucleico codificante de la muteína, y mediante métodos de ingeniería genética, en un organismo huésped bacteriano o eucariota y se aisla de este organismo huésped o de su cultivo. Para este propósito, una célula huésped adecuada se transforma primeramente con un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica, por ejemplo, una muteína de NGAL de la invención. La célula huésped, que puede ser una célula huésped procariota o eucariota, se cultiva entonces bajo condiciones que permiten la biosíntesis del polipéptido. El polipéptido se recupera normalmente a partir de la célula o del medio de cultivo. Ya que cada lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana, A2m y 24p3 contienen un enlace estructural disulfuro es preferible introducir el polipéptido en un compartimento celular que posea un medio rédox oxidante de tiol/disulfuro mediante el uso de una secuencia señal adecuada. Tal medio oxidante está presente en el periplasma de las bacterias como E. coli o en el lumen del retículo endoplasmático de una célula eucariota y normalmente favorece la formación correcta de los puentes disulfuro. También es posible, no obstante, producir un polipéptido de la invención en el citosol de una célula huésped, preferiblemente E. coli. En este caso el polipéptido puede, por ejemplo, ser producido en forma de cuerpos de inclusión, seguido por la renaturalización in vitro. Otra opción es la utilización de cepas mutadas de forma específica que poseen un medio oxidante en el citosol y que permite la producción de la proteína nativa en el citosol.

Como es evidente según la descripción anterior, la muteína de la presente invención o una fusión o un conjugado de las mismas pueden utilizarse en muchas aplicaciones. En general, la muteína descrita aquí puede utilizarse en todas las aplicaciones en las que se utilizan anticuerpos, excepto aquellas en las que específicamente se utiliza la glicosilación de la parte Fc.

Un uso preferido de la muteína es la detección de una diana mediante una muteína de la invención o una proteína de fusión de la misma, que comprende los pasos de poner en contacto la muteína con una muestra de la que se sospecha que contiene una diana determinada, bajo condiciones adecuadas, permitiendo así la formación de un complejo entre la muteína y la diana determinada, y marcando la muteína acomplejada mediante una señal adecuada. Esta señal puede ser provocada por una marca de tipo fluorescente o cromogénica como se ha explicado antes. Esta señal puede también estar provocada por el cambio de una propiedad física a causa de la unión, es decir por la formación de los complejos en sí. Un ejemplo de tales propiedades es la resonancia en plasmón de superficie, cuyo valor cambia durante la unión de las parejas de unión en las que una esta inmovilizada en una superficie como puede ser una lámina de oro.

Como se ha dicho antes, una muteína descrita aquí y sus derivados pueden ser empleados en muchas áreas de forma similar a los anticuerpos o sus fragmentos. Una muteína se utiliza preferiblemente unida a una fase sólida, por lo que la diana de la muteína, un conjugado o una proteína de fusión de esta diana puede acabar inmovilizada o separada. Más preferido es el uso de una muteína para el marcaje con un enzima, un anticuerpo, una sustancia radioactiva u otro grupo con una actividad bioquímica o con características de unión definidas, de forma que la diana de la muteína, o un conjugado o una proteína de fusión de esta diana pueda ser detectado o puesto en contacto con ello. Las muteínas de la invención pueden servir por ejemplo en la detección de estructuras químicas por medio de métodos bioanalíticos establecidos como el ELISA o el Western Blot, en microscopía o como inmunosensores. Aquí, la señal de detección puede estar generada directamente por el uso de un conjugado adecuado de la muteína o una proteína de fusión, o indirectamente con la detección de la muteína unida mediante un anticuerpo dirigido contra ella, o por ejemplo usando una cola de afinidad.

También existen en medicina numerosas aplicaciones posibles de una muteína de hNGAL, A2m o 24p3. Además de su uso en diagnóstico, se puede preparar un polipéptido mutante de la invención que se una, por ejemplo, a moléculas de superficie específicas de tejido o de tumor. Tal muteína puede, por ejemplo, emplearse de forma conjugada como una proteína de fusión para la "visualización de tumores" o directamente para la terapia contra el cáncer.

Otro uso relacionado y preferido de una muteína descrita aquí es la validación de una diana, es decir, examinar si un polipéptido que se asume que está involucrado en el desarrollo de una enfermedad o trastorno es de alguna manera la causa de la enfermedad o trastorno. Este uso para la validación de una proteína como la diana de un fármaco se aprovecha de la capacidad de una muteína de la presente invención de reconocer de forma específica un área de la superficie de una proteína en su conformación nativa, es decir, la capacidad de una muteína descrita aquí de unirse a un epítopo nativo. Respecto a esto, deberá notarse que esta capacidad de unirse a un epítopo nativo ha sido descrita solo para un número limitado de anticuerpos recombinantes, sin tener en cuenta si han sido producidos mediante el protocolo de inmunización clásico de Köhler y Milstein (Nature 256 (1975), 495-497) o mediante técnicas combinatorias como la presentación en fagos. La utilización de una muteína para la validación de una diana de fármaco no solo comprende la detección de una diana que sea una proteína, sino también la detección de una diana que sea un dominio de proteína, un péptido, una molécula de ácido nucleico, una molécula orgánica o un complejo
metálico.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una muteína de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana, proteína relacionada con \alpha2-microglobulina de rata (A2m) o 24p3/uterocalina de ratón (24p3) de acuerdo con la invención o una proteína de fusión de las mismas y un vehículo farmacológicamente aceptable.

Una muteína, por ejemplo una muteína hNGAL, de interés farmacéutico puede, por ejemplo, ser una muteína que posea propiedades de unión a superficies celulares específicas de tumores. También puede ser una muteína que se una a un fármaco específico y que sirva como una forma de liberación "de liberación sostenida" de este fármaco o un almacenaje de larga duración de este fármaco en el cuerpo del paciente. Tal muteína puede ser administrada mediante cualquier ruta terapéuticamente efectiva para un medicamento proteico, por ejemplo vía parenteral, intranasal, rectal, bucal, o por inhalación de pulverizadores o aerosoles en el tracto respiratorio. La administración puede darse en formulaciones de dosis unitarias que contienen transportadores convencionales no tóxicos y farmacológicamente aceptables, adyuvantes y vehículos como se desee. El término "parenteral" abarca los modos de liberación como las técnicas de infusión e inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal e intra-arterial. Debido al bajo peso molecular, la inhalación es una de las vías preferidas de administración de una muteína farmacológicamente útil de la invención.

De acuerdo con esto, la muteína de la presente invención se puede formular en composiciones usando ingredientes y métodos de preparación conocidos y farmacológicamente aceptables. Véase por ejemplo, Remington et al, Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Pub., Easton (1975).

Para la inhalación, las muteínas de la invención pueden colocarse primero en forma de partícula en dispersión. Esto se consigue preparando un aerosol acuoso o partículas sólidas que contienen el respectivo polipéptido. Normalmente, un aerosol acuoso se elabora mediante la formulación de una solución acuosa o suspensión del polipéptido deseado junto con transportadores y estabilizantes convencionales farmacológicamente aceptables. Los transportadores y estabilizantes variarán dependiendo de los requisitos de cada polipéptido, estos pueden incluir surfactantes no iónicos (como Tweens, Pluronics o polietilenglicol), proteínas inocuas como la albúmina sérica, ésteres de sorbitan, ácido oleico, lecitina, aminoácidos como la glicina, tampones, sales, azúcares o alcoholes de azúcar. Las formulaciones también pueden incluir agentes broncodilatadores. Las formulaciones serán estériles. Los aerosoles generalmente se prepararan a partir de soluciones isotónicas. Las partículas incluyen de forma opcional proteínas surfactantes de pulmón. Formulaciones de ejemplo para la inhalación de proteínas se describen por ejemplo en la Patente Estadounidense 6,099,517. La administración de composiciones en polvo seco para a inhalación de una muteína de la invención también es posible. Las formulaciones en polvo seco se describen por ejemplo en la Patente Estadounidense 6,123,936.

Una opción para preparar composiciones farmacéuticas adecuadas para la inhalación incluye formas de aerosoles de partículas en una suspensión acuosa o no acuosa, por ejemplo propelente de fluorocarbono. Tales partículas incluyen, por ejemplo, agregados intramoleculares de polipéptidos o polipéptidos liposomales o atrapados en microcápsulas. Los aerosoles estarán libres de irritantes, es decir sustancias que provocan broncoconstricción aguda, tos, edema pulmonar o destrucción de tejido. No obstante, los agentes no irritantes potenciadotes de la absorción son adecuados para usar aquí.

Las composiciones adecuadas para la administración parenteral comprenden soluciones estériles acuosas o no acuosas farmacológicamente aceptables, dispersiones, suspensiones oemulsiones, así como polvo estéril para la reconstitución en soluciones estériles inyectables o en dispersiones, inmediatamente antes de su uso. Ejemplos representativos de transportadores adecuados acuosos y no acuosos, diluyentes, solventes o vehículos incluyen agua, etanol, polioles, por ejemplo el glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, por ejemplo el aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables como el oleato de etilo. La fluidez puede mantenerse de varias maneras incluyendo el uso de surfactantes, de materiales de recubrimiento como la lecitina y del mantenimiento del tamaño de partícula necesario (en el caso de las dispersiones).

Las composiciones pueden también contener adyuvantes como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsificantes, agentes dispersantes, antibacterianos y agentes antifúngicos como el paraben, clorobutanol, fenol y ácido sórbico, agentes isotónicos como los azúcares, cloruro sódico, o agentes que retrasan la absorción como el monostearato de aluminio y la gelatina. La muteína puede incorporarse en sistemas de liberación lenta o sostenida o de localización, como puede ser las matrices poliméricas, los liposomas y las microesferas.

Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse mediante varios medios, incluyendo la filtración a través de un filtro que retiene bacterias, o la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones estériles sólidas que puedan disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio estéril inyectable justo antes de ser usado.

La secuencia codificante para cada una de las proteínas utilizadas como armazones aquí, puede servir como un punto de partida para la mutagénesis de los segmentos de péptido seleccionados en la presente invención. La secuencia codificante de la hNGAL ha sido descrita por Bundgard et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 202 (1994), 1468-1475. La secuencia codificante de la A2m y la 24p3, han sido publicadas respectivamente por Chan et al., Nucleic Acid Res. 16 (1988) 11638; y Stoesz et al., Oncogene 11 (1995), 2233-2241, por ejemplo. Para la mutagénesis de los aminoácidos en los cuatro lazos peptídicos, la persona entendida en la materia tiene a su disposición los diferentes métodos conocidos para la mutagénesis dirigida o para la mutagénesis mediante la reacción en cadena de la polimerasa. El método de mutagénesis puede, por ejemplo, basarse en que las mezclas de los oligodesoxinucleótidos sintéticos, que son portadores de una composición de bases degeneradas en las posiciones deseadas, pueden utilizarse para la introducción de mutaciones. El uso de nucleótidos con una especificidad de pares de bases reducida, como por ejemplo la inosina, también es una opción para la introducción de mutaciones dentro del segmento de la secuencia escogida o en determinadas posiciones de aminoácido. El procedimiento para la mutagénesis de los sitios de unión a dianas es simple en comparación con el de los anticuerpos ya que para la hNGAL solo deben ser manipulados para este propósito cuatro en lugar de seis segmentos de la secuencia, correspondientes a los cuatro lazos mencionados anteriormente. Otra posibilidad es la llamada mutagénesis de triplete. Este método utiliza mezclas de diferentes tripletes de nucleótidos cada uno de los cuales codifica para un aminoácido para incorporarse en la secuencia codificante.

Uno de los diferentes métodos aplicables en la introducción de mutaciones en la región de los cuatro lazos de péptido seleccionados de las proteínas armazón utilizadas aquí (es decir, en el caso de la hNGAL en la posición de secuencia 40 a 50, 70 a 79, 101 a 103 y 125 a 132), se basa en el uso de cuatro oligodesoxinucleótidos, cada uno de los cuales deriva parcialmente de uno de los cuatro correspondientes segmentos de secuencia a ser mutados. En la producción de estos oligodesoxinucleótidos, el experto en la materia puede emplear mezclas de bloques de construcción de ácidos nucleicos para la síntesis de estos tripletes de nucleótido que corresponden a las posiciones de aminoácidos a ser mutadas, de tal forma que los codónes o anticodones generan aleatoriamente todos los aminoácidos, de acuerdo con el código genético y de la composición de esta mezcla, para una selección de los aminoácidos deseados en esta posición.

Por ejemplo, el primer oligodesoxinucleótido corresponde a esta secuencia –aparte de las posiciones mutadas- al menos parcialmente a la cadena codificante para el lazo peptídico que está localizado en la secuencia de polipéptido de la hNGAL en la posición N-terminal final. De acuerdo con esto, el segundo oligodesoxinucleótido corresponde al menos parcialmente a la cadena no codificante para el segundo segmento de secuencia siguiendo la secuencia de polipéptido. El tercer oligodesoxinucleótido corresponde a su vez, al menos parcialmente, a la cadena codificante para el tercer segmento de secuencia. Finalmente, el cuarto oligodesoxinucleótido corresponde al menos parcialmente a la cadena no codificante para el cuarto segmento de secuencia. Se puede realizar una reacción en cadena de la polimerasa con el primer y segundo oligodesoxinucleótido y separadamente si es necesario, con el respectivo tercer y cuarto oligodesoxinucleótido utilizando como molde el ácido nucleico que codifica la proteína armazón o su cadena complementaria.

Los productos de amplificación de ambas reacciones pueden combinarse, por varios métodos conocidos, en un ácido nucleico que comprende la secuencia del primer al cuarto segmento de secuencia y que lleva las mutaciones en las posiciones de aminoácidos seleccionadas. Para este fin, ambos productos pueden ser sometidos, por ejemplo, a una nueva reacción en cadena de polimerasa utilizando oligodesoxinucleótidos flanqueantes como cebadores así como una o más moléculas de ácido nucleico mediadoras que contribuyen a la secuencia entre el segundo y el tercer segmento de secuencia. Este procedimiento se reproduce de forma esquemática en la Fig. 1. Para escoger el número de oligodesoxinucleótidos utilizados para la mutagénesis y su distribución dentro de la secuencia génica de la proteína utilizada, el experto en la materia posee muchas más alternativas a su disposición.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican para la región de secuencia que acompaña a los cuatro lazos peptídicos y que contienen mutaciones en las posiciones seleccionadas definidas antes, pueden conectarse por ligación con las secuencias perdidas 5' y 3' de un ácido nucleico que codifica por ejemplo para hNGAL y/o el vector y puede ser clonado en un organismo huésped. Están disponibles multitud de procedimientos para la ligación y la clonación. Por ejemplo, durante una amplificación, las moléculas de ácido nucleico sintético con secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción, que están también presentes en las posiciones correspondientes en la secuencia de ácido nucleico para hNGAL, pueden estar unidas a ambos extremos del ácido nucleico a ser clonado, por lo que la ligación se hace posible tras la hidrólisis con la correspondiente enzima de restricción. Las secuencias perdidas 5' y 3' de un ácido nucleico codificante para la lipocalina utilizada en la presente invención, también pueden estar unidas a la molécula de ácido nucleico que comprende las posiciones de secuencia mutadas por PCR.

Los segmentos de secuencia mayor dentro del gen codificante para la proteína seleccionada para mutagénesis, también puede someterse a mutagénesis aleatoria mediante métodos conocidos, por ejemplo mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa bajo condiciones de tasa de error aumentada, por mutagénesis química o usando cepas bacterias mutadoras (Low et al. J. Mol. Biol. 260 (1996), 359-368). Tales métodos pueden también utilizarse para una mayor optimización de la afinidad de la diana o especificidad de la diana de una muteína que ya haya sido producida. Las mutaciones que pueden ocurrir fuera de la secuencia de los segmentos de las posiciones 40 a 50, 70 a 79, 101 a 103 y 125 a 132 de hNGAL, por ejemplo, pueden tolerarse a menudo o pueden incluso ser ventajosas, por ejemplo si contribuyen a una eficiencia mejorada de plegamiento o estabilidad de la muteína.

Tras haber expresado las secuencias de ácido nucleico codificantes que fueron sometidas a mutagénesis, pueden seleccionarse de la biblioteca obtenida los clones que llevan la información genética para la pluralidad de las respectivas muteínas que se unen a una diana determinada,. Puede utilizarse las estrategias de expresión conocidas y las estrategias de selección para la selección de estos clones. Los métodos de esta clase han sido descritos en el contexto de la producción o de la ingeniería de fragmentos de anticuerpos recombinantes, como la técnica de presentación en fagos (Hoess, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 (1993), 572-579; Wells y Lowman, Curr. Opin Struct. Biol. 2 (1992), 597\cdot-604), métodos de "cribado de colonias" (Skerra et al., Anal. Biochem. 196 (1991), 151-155) o presentación en ribosomas (Roberts, Curr. Opin. Chem. Biol. 3 (1999) 268-273).

Una realización de la técnica de presentación en fagos (Hoess, supra; Wells y Lowman, supra; Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual (1996), Academic Press) se proporciona aquí como ejemplo de un método de selección de acuerdo con la invención para muteínas con las características de unión deseadas. Para el método de selección del ejemplo, se producen fásmidos que afectan la expresión del gen estructural mutado de la hNGAL como una proteína de fusión con una secuencia señal en el extremo N-terminal, preferiblemente una secuencia señal OmpA, y con la proteína pIII de la cubierta del fago M13 (Model y Russel, en "The Bacteriophages" Vol. 2 (1988), Plenum Press, New York, 375-456) o fragmentos de esta proteína de cubierta que se incorporan en la cubierta del fago, en el C-terminal. El fragmento C-terminal \DeltapIII de la proteína de cubierta del fago, que contiene sólo los aminoácidos 217 a 406 de la proteína de cubierta natural pIII, se utiliza preferiblemente para producir las proteínas de fusión. Es especialmente preferido un fragmento C-terminal de pIII en que el residuo de cisteína en la posición 201 se pierde o está reemplazado por otro aminoácido.

La proteína de fusión puede contener otros componentes tales como, por ejemplo una cola de afinidad o una secuencia epítopo para un anticuerpo, que permite la inmovilización de la proteína de fusión o sus partes. Además, puede localizarse un codón de parada entre la región codificante para la hNGAL o su muteína y el segmento de gen para la proteína de cubierta o su fragmento, cuyo codón de parada, preferiblemente un codón de parada ámbar, está al menos parcialmente traducido en un aminoácido durante la traducción en una cepa supresora adecuada.

Los fásmidos se definen aquí como plásmidos que llevan la región intergenética de un fago bacteriano filamentoso, como por ejemplo M13 o f1 (Beck y Zink, Gene 16 (1981), 35-58) o una parte funcional del mismo, por lo que durante la superinfección de las células bacterianas con un fago ayudante, por ejemplo el M13K07, VCS-M13 o R408, una cadena del DNA circular del fásmido se empaqueta con las proteínas de la cubierta y es exportado en el medio y llamado fagémido. Por un lado, este fagémido posee la muteína de la hNGAL codificada por el fásmido respectivo construido en su superficie como una fusión de la proteína pIII de la cubierta o su fragmento, donde la secuencia señal de la proteína de fusión está normalmente escindida. Por otro lado, lleva una o más copias de la proteína pIII de la cubierta nativa del fago ayudante y es capaz, por lo tanto, de infectar a un receptor, generalmente una cepa bacteriana portadora de un plásmido F o F'. De esta manera se asegura un acoplamiento físico entre el ácido nucleico empaquetado portador de la información genética para la muteína respectiva de la hNGAL, y la proteína codificada que está al menos parcialmente presentada de forma funcional en la superficie del fagémido.

El vector phNGAL5 (Fig. 1) puede utilizarse por ejemplo en la construcción del plásmido con las secuencias codificantes para las muteínas de la hNGAL. El ácido nucleico codificante para los lazos peptídicos puede, por ejemplo, insertarse en el vector phNGAL5 mediante los dos sitios de restricción BstXI. Los fásmidos recombinantes se incorporan por transformación en una cepa de E. coli, por ejemplo la XL1-blue (Bullock et al., BioTechniques 5 (1987), 376-379) o TG1. De esta manera, los clones se hacen de tal forma que producen muchas muteínas de hNGAL diferentes como proteínas de fusión.

Esta biblioteca, es decir la colección de clones obtenidos, se superinfecta a continuación en un cultivo líquido de acuerdo con los métodos conocidos con un fago M13 ayudante. Tras esta infección la temperatura de incubación del cultivo puede reducirse por la producción de los fagémidos. Las temperaturas de incubación preferidas son aquellas en las que se espera un plegamiento óptimo de la muteína hNGAL como componente de la proteína de fusión con la proteína de cubierta del fago o su fragmento. Durante o tras la fase de infección, la expresión del gen para la proteína de fusión con la muteína hNGAL puede ser inducida en células bacterianas, por ejemplo por adición de anhidrotetraciclina. Las condiciones de inducción se escogen de tal forma que una fracción sustancial de los fagémidos producidos presenten al menos una muteína de la hNGAL. Los fagémidos se aislan tras una fase de incubación del cultivo de por ejemplo de 6 a 8 horas. Se conocen varios métodos para aislar los fagémidos, como por ejemplo la precipitación con polietilenglicol.

Los fásmidos aislados pueden someterse a una selección por incubación con la diana deseada, donde la diana esta presente en una forma que permita al menos una inmovilización temporal de aquellos fagémidos portadores de muteínas con la actividad de unión deseada como proteínas de fusión en su cubierta. Entre las varias realizaciones conocidas por los expertos en la materia, la diana puede por ejemplo conjugarse con una proteína transportadora como la albúmina sérica y unirse mediante esta proteína transportadora a una superficie que une proteínas, por ejemplo poliestireno. Para la inmovilización de la diana se pueden utilizar preferiblemente placas microtituladas adecuadas para técnicas de ELISA o los llamados "immuno-sticks". Alternativamente, los conjugados de la diana pueden también mejorarse con otros grupos de unión como por ejemplo biotina. La diana puede entonces inmovilizarse en superficies que selectivamente se unen a este grupo, tales como por ejemplo, placas microtituladas o partículas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina o avidina.

Los sitios de unión a proteína o fagémido residuales presentes en las superficies que están cargadas con las dianas pueden saturarse con soluciones de bloqueo conocidas para los métodos de ELISA. A continuación, los fagémidos en un tampón fisiológico son, por ejemplo, puestos en contacto con la diana inmovilizada en la superficie. Los fagémidos no unidos se eliminan mediante lavados múltiples. Seguidamente se eluyen las partículas de fagémido restantes en la superficie. Para la elución, puede añadirse la diana libre en una solución. Los fagémidos pueden también eluirse por adición de proteasas o, por ejemplo, en presencia de ácidos, bases, detergentes o sales caotrópicas, o bajo condiciones moderadamente desnaturalizantes. Un método preferido es la elución utilizando tampones de pH 2,2, en donde la elución se neutraliza seguidamente.

Después de esto, las células de E. coli se infectan con la elución de fagémidos usando generalmente métodos conocidos. Los ácidos nucleicos pueden también extraerse de los fagémidos eluídos e incorporarse en las células de otra manera. Partiendo de los clones de E. coli obtenidos de esta manera, los fagémidos se generan a su vez por superinfección con fagos M13 ayudantes de acuerdo con el método descrito antes, y los fagémidos propagados de esta manera se someten, una vez más, a una selección con la diana inmovilizada en la superficie. A menudo son necesarios múltiples ciclos de selección para obtener los fagémidos con las muteínas de la invención en forma enriquecida. El número de ciclos de selección se elige preferiblemente de forma que en el posterior análisis funcional, al menos un 0,1% de los clones estudiados producen muteínas con afinidad detectable para la diana escogida. Dependiendo del tamaño, es decir de la complejidad de la biblioteca empleada, son necesarios normalmente de 2 a 8 ciclos para este fin.

Para el análisis funcional de las muteínas seleccionadas, una cepa de E. coli es infectada con los fagémidos obtenidos de los ciclos de selección y se aisla el correspondiente fásmido de DNA de doble cadena. Partiendo de este fásmido de DNA o del DNA de cadena sencilla extraído de los fagémidos, las secuencias de ácidos nucleicos de las muteínas seleccionadas de la invención pueden determinarse por los métodos comunes para este propósito, y la secuencia de aminoácido puede derivarse de éstas. La región mutada o la secuencia completa de la muteína de la hNGAL puede ser subclonada en otro vector de expresión y expresarse en un organismo huésped adecuado. El phNGAL7 puede utilizarse, por ejemplo, como vector de expresión (véase. Fig. 3) y la expresión con los derivados de phNGAL7 puede realizarse en cepas de E. coli, por ejemplo E.coli-TG1. Las muteínas de la hNGAL producidas mediante ingeniería genética pueden purificarse mediante varios métodos proteoquímicos. Las muteínas de la hNGAL producidas por ejemplo con el phNGAL7 llevan el péptido de afinidad Strep-Tag II (Schmidt et al., supra) en su extremo C-terminal y pueden, por lo tanto, purificarse preferiblemente por cromatografía de afinidad con estreptavidina.

La selección también puede llevarse a cabo mediante otros métodos. Muchas realizaciones correspondientes son conocidas por los expertos en la materia o están descritas en la literatura. También puede aplicarse una combinación de métodos. Por ejemplo, los clones seleccionados o al menos enriquecidos por presentación en fagos pueden someterse de forma adicional a un "cribaje de colonias". Este procedimiento posee la ventaja que los clones individuales pueden aislarse directamente del resto de muteína hNGAL con afinidad de unión detectable para una diana producidas.

Además de utilizar E. coli como organismo huésped en la técnica de presentación en fagos o el método de "cribaje de colonias", otras cepas bacterianas, levaduras o también células de insecto o células de mamífero pueden utilizarse, por ejemplo, para este propósito. Además de la selección de una muteína de la hNGAL de una biblioteca primaria, producida partiendo de una secuencia de ácido nucleico codificante para una muteína, se pueden también aplicar métodos comparables para poder optimizar una muteína en lo que respecta a la afinidad o especificidad por la diana deseada, como la repetición opcional de mutagénesis limitada de su secuencia de ácido nucleico codificante.

Es sorprendente que mediante el método de la invención, las muteínas de hNGAL puedan aislarse mostrando una afinidad detectable a una diana determinada (véanse Ejemplos 4, 5).

También es posible someter a las muteínas producidas a otra mutagénesis aleatoria parcial opcional para seleccionar variantes de aún más afinidad de la nueva biblioteca así obtenida. Un procedimiento correspondiente ya ha sido descrito para las muteínas de unión a digoxigenina de la proteína de unión a bilina con el propósito de "madurar la afinidad" (DE 199 26 068, WO 00/75308; Sehlehuber et al., supra) y puede también aplicarse a la muteína descrita aquí de una forma correspondiente por un experto en la materia.

La invención se ilustra en profundidad mediante los siguientes ejemplos y los dibujos adjuntos en los que:

La figura 1 describe de forma esquemática el vector fasmídico phNGAL5;

La figura 2 ilustra de forma esquemática la producción de la biblioteca de muteínas de lipocalina a nivel de ácido nucleico;

La figura 3 describe de forma esquemática el vector de expresión phNGAL7;

La figura 4 describe de forma esquemática el vector de expresión pTlpc3;

La figura 5 describe la unión de la muteína TlpcA a la lipocalina lagrimar y el correspondiente experimento control con ELISA usando la hNGAL;

La figura 6 describe de forma esquemática el vector fasmídico phNGAL12;

La figura 7 describe de forma esquemática el vector de expresión phNGAL15;

La figura 8 describe la unión de las muteínas RFY-B, RFY-C, y RFY-E -junto con la hNGAL como control- a un péptido de trombospondina (ID de SEC Nº: 18) en un ELISA;

La figura 9 describe la unión de las muteínas RFY-B, RFY-C, y RFY-E -junto con la hNGAL como control- a un péptido de trombospondina (ID de SEC Nº: 18) de acuerdo con espectroscopia de resonancia de plasmón de superficie (SPR);

La figura 10 describe la unión de la muteína N4 de la hNGAL a la interleucina-8 en un ELISA;

La figura 11 describe de forma esquemática el vector de expresión pTNF\alpha;

La figura 12 describe la unión de TNF\alpha a las muteínas TNF-V1 y TNF-V2 de hNGAL -junto con la hNGAL como control- en un ensayo de punteado de colonias.

La Fig. 1 muestra un dibujo esquemático del phNGAL5. Este vector codifica para una proteína de fusión de la secuencia señal OmpA, la hNGAL modificada con las tres sustituciones de aminoácido Gln28 a His, Leu137 a Ile, así como Thr145 a Ala, la cola de afinidad Strep-Tag II y una forma acortada de la proteína pIII de la cubierta del M13, que comprende los aminoácidos 217 a 406 (pIII). El gen estructural completo es sometido al control transcripcional del promotor/operador de la tetraciclina (tet^{p/o}) y finaliza en el terminador de la transcripción de lipoproteína (t_{lpp}). Otros elementos del vector son el origen de replicación (ori), la región intergénica del bacteriófago filamentoso f1 (fl-IG), el gen de la resistencia a ampicilina (bla) codificante de una \beta-lactamasa y el gen represor de la tetraciclina (tetR). Un codón de parada ámbar, que está parcialmente traducido en Gln en una cepa supresora de ámbar SupE, está localizado entre la región codificante para la hNGAL con la secuencia señal OmpA y la Strep-Tag II, así como la región codificante para la proteína truncada pIII de la cubierta de fago. Ambos sitios de restricción BstXI utilizados para el casete génico mutado y los sitios de restricción flanqueantes a la estructura génica están marcados. Un segmento relevante de la secuencia de ácido nucleico de phNGAL5 se reproduce junto con la secuencia de aminoácidos codificada en el listado de secuencias como ID de SEC Nº:7. El segmento comienza como un sitio de restricción XbaI y finaliza con el sitio de restricción HindIII. Los elementos del vector fuera de esta región son idénticos a aquellos del vector pASK75, cuya secuencia de nucleótidos completa se proporciona en la publicación de patente alemana DE 44 17 598 A1.

La Fig. 2 muestra esquemáticamente una estrategia para la mutagénesis dirigida de 20 posiciones de aminoácido seleccionadas en la hNGAL mediante aplicación repetida de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se sintetizó un oligodesoxinucleótido para cada uno de los cuatro lazos peptídicos en que los aminoácidos iban a ser mutados (ID de SEC Nº:1, ID de SEC Nº:2, ID de SEC Nº:3 e ID de SEC Nº:4), en los que se empleó en los sitios de mutación la respectiva mezcla de los nucleótidos proporcionados en el listado de secuencias. Debido a la composición escogida, de los tres posibles codónes de parada, solo el codón de parada ámbar, TAG, se permitió en los codónes mutados, que es traducido como glutamina en la cepa de E. coli supE- XLl-blue (Bullock et al., BioTechniques 5 (1987), 376-378) o TG1 (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Press) que se utilizó para la expresión génica. Para ciertas aplicaciones, por ejemplo la expresión génica en otras cepas bacterianas u organismos, cuando aparece un codón sin sentido en un gen estructural para una muteína seleccionada de hNGAL, puede ser sustituida por un codón codificante de glutamina por un experto en la materia, por ejemplo mediante mutagénesis dirigida al sitio. Un fragmento de ácido nucleico con 168 pares de bases se amplificó (1. PCR, PCR A) con los cebadores ID de SEC Nº:1 e ID de SEC Nº:2 utilizando el plásmido de DNA phNGAL3 (ID de SEC Nº:8) conteniendo el cDNA de la hNGAL como molde. En otra PCR, un fragmento de ácido nucleico con 179 pares de bases se amplificó (1. PCR, PCR B) con los cebadores ID de SEC Nº:3 e ID de SEC Nº:4, también utilizando phNGAL3 como molde. El phNGAL3 difiere del phNGAL5 en tan solo dos sitios de restricción BstXI perdidos en las posiciones 283 y 630, y un sitio de restricción más BstXI en la posición 675, donde muestra las secuencias salvajes de la hNGAL. La mezcla de ambos productos de PCR, que están parcialmente superpuestos, sirve como molde en otra amplificación (2. PCR) con los dos cebadores flanqueantes de PCR ID de SEC Nº:5 e ID de SEC Nº:6, en donde se obtuvo un fragmento génico de 386 pares de bases. Este fragmento contiene la mezcla de los 20 codónes mutados y se clonó a continuación usando los dos sitios de restricción BstX en el vector phNGAL5. El uso de estos dos sitios de restricción y este ordenamiento especial que lleva a la formación de dos extremos de DNA cohesivos no compatibles durante la digestión de restricción, permite una ligación particularmente eficiente. La sustitución de los aminoácidos Gln28 a His y Thr145 a Ala respecto a la secuencia original así como una mutación silente en el codón para la Ser156 se consiguieron con anterioridad durante la construcción del pHNGAL5 para poder introducir ambos sitios de restricción BstXI dentro de la estructura génica de la hNGAL.

La Fig. 3 muestra un dibujo del phNGAL7. El phNGAL7 codifica una proteína de fusión compuesta de la secuencia señal OmpA, una hNGAL modificada de acuerdo con la Fig. 1, la cola de afinidad Strep-Tag® II, y un dominio de unión a albúmina (abd) de la proteína G de Streptococcus (Kraulis et al., FEBS Lett. 378 (1996), 190-194). El resto de elementos genéticos son idénticos a los del phNGAL5. Se reproduce un segmento relevante de la secuencia de ácido nucleico del phNGAL7, junto con la de la secuencia de aminoácidos codificada en el listado de secuencias como ID de SEC Nº:9. El segmento comienza con el sitio de restricción XbaI y finaliza con el sitio de restricción HindIII. Los elementos del vector fuera de esta región son idénticos a los del vector pASK75, cuya secuencia de nucleótidos completa se proporciona en la publicación de patente alemana DE 44 17 598 A1.

La Fig. 4 muestra un dibujo del pTlpc3. El pTlpc3 codifica para una proteína de fusión compuesta de la secuencia señal OmpA, una Lipocalina lagrimar humana modificada con la sustitución del aminoácido Cys97 a Ser y, la cola de afinidad Strep-Tag® II. El resto de elementos genéticos son idénticos a los del phNGAL5. Se reproduce un segmento relevante de la secuencia de ácido nucleico de pTlpc3, junto con la de la secuencia de aminoácidos codificada en el listado de secuencias como ID de SEC Nº:9. El segmento comienza con el sitio de restricción XbaI y finaliza con el sitio de restricción HindIII. Los elementos del vector fuera de esta región son idénticos a los del vector pASK75, cuya secuencia de nucleótidos completa se proporciona en la publicación de patente alemana DE 44 17 598 A1.

La Fig. 5 muestra una representación gráfica de los datos del Ejemplo 5, en el que las mediciones de unión con la muteína TlpcA de hNGAL se realizaron mediante un ensayo inmunosorbente de unión a enzima (ELISA). La unión de la TlpcA y la lipocalina lagrimar (cuadrados) se comparó con la interacción de la hNGAL y la lipocalina lagrimar (círculos abiertos). La TlpcA se une a la lipocalina lagrimar en una forma dependiente de la concentración. La hNGAL no muestra una señal de unión significativa.

La Fig. 6 muestra un dibujo esquemático del phNGAL12. Este vector codifica para una proteína de fusión de la secuencia señal OmpA, una hNGAL modificada con las cuatro sustituciones de aminoácidos Gln28 a His, Cys87 a Ser, Leu137 a Ile así como Thr145 a Ala, la cola de afinidad Strep-Tag® II y una forma acortada de la proteína pIII de la cubierta del M13, que comprende los aminoácidos 217 a 406 (pIII). Además, el phNGAL12 lleva dos mutaciones silentes dentro de la región codificante de la secuencia señal OmpA para poder eliminar un sitio de restricción EcoK12. El gen estructural completo está sometido al control transcripcional por el promotor/operador de la tetraciclina (tet^{p/o}) y finaliza en el terminador de la transcripción de lipoproteína (t_{lpp}). Otros elementos del vector son el origen de replicación (ori), la región intergénica del bacteriófago filamentoso f1 (fl-IG), el gen de la resistencia a ampicilina (bla) codificante de una \beta-lactamasa y el gen represor de la tetraciclina (tetR). Un codón de parada ámbar, que está parcialmente traducido en Gln en una cepa huésped supresora de ámbar SupE, está localizada entre la región codificante para hNGAL fusionada con la secuencia señal OmpA y la Strep-Tag® II, y la región codificante para la proteína truncada pIII de la cubierta de fago. Tanto los sitios de restricción BstXI utilizados para el casete génico mutado como los sitios de restricción flanqueantes a la estructura génica están marcados. Un segmento relevante de la secuencia de ácido nucleico del phNGAL12 se reproduce junto con la secuencia de aminoácidos codificada en el listado de secuencias como ID de SEC Nº:19. El segmento comienza como un sitio de restricción XbaIy finaliza con el sitio de restricción HindIII. Los elementos del vector fuera de esta región son idénticos a aquellos del vector pASK75, cuya secuencia de nucleótidos completa se proporciona en la publicación de la patente alemana DE 44 17 598 A1.

La Fig. 7 muestra un dibujo esquemático del phNGAL15. El phNGAL15 codifica para una proteína de fusión compuesta por la secuencia señal OmpA, un hNGAL modificado de acuerdo con la Fig. 6 y la cola de afinidad Strep-Tag® II. El phNGAL15 lleva las mismas mutaciones silentes dentro de la región codificante de la secuencia señal OmpA del phNGAL12. Un segmento relevante de la secuencia de ácido nucleico del phNGAL15 junto con la secuencia de aminoácidos codificada se reproducen en el listado de secuencias como ID de SEC Nº:21. El segmento comienza como un sitio de restricción XbaIy finaliza con el sitio de restricción HindIII. Los elementos del vector fuera de esta región son idénticos a aquellos del vector pASK75, cuya secuencia de nucleótidos completa se proporciona en la publicación de la patente alemana DE 44 17 598 A1.

La Fig. 8 muestra una representación gráfica de los datos del Ejemplo 10, en que las mediciones de unión con las muteínas de la hNGAL y un péptido de la trombospondina se realizaron mediante un ensayo inmunosorbente de unión a enzima (ELISA). La unión de las muteínas de la hNGAL RFY-B (círculos), RFY-C (cuadrados), y RFY-E (diamantes) al péptido de trombospondina se comparó con la interacción de la hNGAL (triángulos) y el péptido de la trombospondina. El péptido de la trombospondina se inmovilizó en la placa microtitulada cubierta con avidina mediante un grupo biotina unido a su extremo C-terminal. Las muteínas de la hNGAL se unen al péptido de la trombospondina de una forma dependiente de la concentración, mientras que la hNGAL no muestra una señal de unión significativa. Se observó un bajo nivel de reacción cruzada entre las muteínas de la hNGAL y la avidina en ausencia del péptido (símbolos abiertos).

La Fig. 9 muestra una representación gráfica de los datos del Ejemplo 11, en que las mediciones de unión con las muteínas de la hNGAL a un péptido de la trombospondina se realizaron mediante espectroscopia de resonancia de plasmón de superficie (SPR). Las interacciones moleculares entre las muteínas de la hNGAL RFY-B (círculos), RFY-C (cuadrados), y RFY-E (diamantes), respectivamente, con el péptido de la trombospondina se compararon con la interacción entre la hNGAL (triángulos) y el péptido de la trombospondina. Las muteínas de la hNGAL se unen al péptido de la trombospondina de una forma dependiente de la concentración, mientras que la hNGAL no muestra una señal de unión significativa. No se detectó reactividad cruzada de la muteínas de la hNGAL con el sensor del chip SA (no mostrado).

La Fig. 10 muestra una representación gráfica de los datos del Ejemplo 15, en que las mediciones de unión con la muteína N4 de la hNGAL se realizaron mediante un ensayo inmunosorbente de unión a enzima (ELISA). La interleucina-8 se inmovilizó en una placa microtitulada cubierta con avidina mediante grupos biotina unidos a sus residuos lisina. La unión de la muteína N4 de hNGAL a la interleucina-8 (círculos cerrados) se comparó con la interacción de la muteína N4 de la hNGAL con la avidina sola (círculos abiertos). La muteína N4 de la hNGAL se une a la interleucina-8 de una forma dependiente de la concentración, mientras que no se observa una señal de unión significativa con la avidina sola.

La Fig. 11 muestra un dibujo esquemático del plásmido pTNF\alpha. El pTNF\alpha codifica para una proteína de fusión a partir de la forma madura del Factor de Necrosis Tumoral a (TNF\alpha) con una cola de hexahistidina en su extremo N-terminal. El resto de elementos genéticos son idénticos a los del plásmido pRSET (Schoepfer, Gene 124 (1993), 82-85). Un segmento relevante de la secuencia de ácido nucleico del pTNF\alpha junto con la secuencia de aminoácidos codificada se reproducen en el listado de secuencias como ID de SEC Nº:31. El segmento comienza como un sitio de restricción NdeI y finaliza con el sitio de restricción HindIII. Los elementos del vector fuera de esta región son idénticos a aquellos del vector pRSET5a, cuya secuencia de nucleótidos completa se proporciona bajo el número de acceso del EMBL X54202.

La Fig. 12 En (A) se muestra el resultado del ensayo de punteado de colonias del Ejemplo 18, en que se probó la unión de TNF\alpha trimérico a muteínas de la hNGAL inmovilizadas. Las células de E. coli TG1-F^{-} que expresan las siguientes proteínas de fusión ABD se puntearon de cuatro a cinco veces sobre una membrana hidrofílica, según se muestra en (B): la hNGAL, la proteína de unión a bilina (BBP), dos muteínas no relacionadas con la biblioteca descrita en el Ejemplo 6, 9 clones aislados en el ensayo de cribaje de colonias descrito en el Ejemplo 17, y -como control- sin proteína. Las muteínas secretadas de las colonias respectivas se inmovilizaron en una membrana hidrofóbica cubierta con HSA como se destaca en el Ejemplo 18. La unión de TNF\alpha digoxigenado se visualizó utilizando un conjugado Fab anti-digoxigenina–Fosfatasa alcalina. En (B) se describen las posiciones donde los clones respectivos se puntearon sobre la membrana.

Ejemplos Ejemplo 1 Producción de una biblioteca de muteínas de hNGAL

Si no se indica de otro modo, se utilizaron métodos de ingeniería genética conocidos para los expertos en la materia, como por ejemplo los descritos en Sambrook et al.(supra).

Para la mutagénesis dirigida se utilizó una PCR en múltiples pasos en un total de 20 posiciones aminoacídicas seleccionadas en los cuatros lazos peptídicos de la hNGAL, de acuerdo con la Figura 2. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen de 100 \mul en los dos primeros pasos de amplificación, en los que 20 ng de DNA plasmídico phNGAL3 se utilizó como molde junto a 50 pmol de cada uno de los respectivos cebadores (ID de SEC Nº:1 y ID de SEC Nº:2 o ID de SEC Nº:3 y ID de SEC Nº:4, respectivamente), que han sido sintetizados de acuerdo con el método convencional de fosforamidita. Además, la mezcla de reacción contenía 10 ml de tampón Taq 10x (Tris/HCl 100 mM pH 9,0, KCl 500 mM, MgCl_{2} 15 mM, Triton X-100 1% v/v), 10 \mul de mezcla de dNTP (dATP, dCTP, dGTP y dTTP 2 mM). Tras llevar hasta volumen con agua, se añaden 5U de polimerasa de DNA Taq (5 U/\mul, Promega) y se sometió a 20 ciclos de temperatura de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 60ºC y 1,5 minutos a 72ºC en untermociclador con tapa calefactada (Eppendorf), seguido de una incubación de 5 minutos a 60ºC. La amplificación de los productos deseados se aisló mediante electroforesis preparativa en gel de agarosa con Agarosa de bajo punto de fusión (Roche Diagnostics) y utilizando el equipo de extracción de DNA Jetsorb (Genomed).

El siguiente paso de amplificación también se llevó a cabo en una mezcla de 100 \mul, donde aproximadamente 6 ng de estos respectivos fragmentos se utilizaron como moldes, en presencia de 50 pmol de cada uno de los cebadores ID de SEC Nº:5 y ID de SEC Nº:6. El resto de componentes de la mezcla de PCR se añadieron en las mismas cantidades que el paso de amplificación previo. La PCR se realizó en 20 ciclos de temperatura de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 55ºC,1,5 minutos a 72ºC, seguido de la consiguiente incubación de 5 minutos a 60ºC. El producto de PCR se purificó utilizando el equipo E.Z.N.A. Ciclo-Pure (PeqLab).

Para el clonaje de este fragmento, que representa la biblioteca de muteínas de hNGAL en su forma de ácido nucleico, primeramente se digirió con la enzima de restricción BstXI (New England Biolabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se purificaron mediante el equipo E.Z.N.A. Ciclo-Pure. Tras una segunda digestión de restricción con BstXI, elfragmento de ácido nucleico se purificó mediante electroforesis preparativa en gel de agarosa, lo que resultó en un fragmento de DNA de doble cadena de 347 nucleótidos de longitud. El DNA del vector phNGAL5 se cortó con BstXI del mismo modo y se aisló el mayor de los dos fragmentos generados (3971 pb).

Para la ligación, 2,75 \mug (12 pmol) del fragmento de PCR y 31,45 \mug (12 pmol) del fragmento de vector se incubaron en presencia de 180 Unidades Weiss de ligasa de DNA T4 (New England Biolabs) en un volumen total de 600 \mul(Tris/HCl 50 mM pH 7,8, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, BSA 50 \mug/ml) durante cuatro días a 16ºC. A continuación el DNA fue precipitado mediante la adición de 50 \mug de tRNA de levadura (Boehringer Mannheim), 125 \mul de acetato amónico 5 M y 500 \mul de etanol por cada 120 \mul de mezcla de ligación. La incubación a -20ºC durante tres días fue seguida de una centrifugación (30 minutos, 16000 g, 4ºC). Cada precipitado se lavó con 750 \mul de etanol (70% v/v, a -20ºC), se centrifugó (5 minutos, 16000 g, 4ºC), y se secó mediante vacío (2 minutos). El DNA se disolvió finalmente en 200 \mul de TE/10 (Tris/HCl 1 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM pH 8,0) y se ajustó con agua hasta un volumen final de 260 \mul.

La preparación de células electrocompetentes de la cepa de E. coli K12 XL1-blue (Bullock et al., supra) se llevó a cabo según los métodos descritos por Tung y Chow (Trends Genet. 11 (1995), 128-129) y por Hengen (Trends Biochem. Sci. 21 (1996), 75-76). Se llevó 1 L. de medio LB a una densidad óptica de DO_{600} = 0,08 a 600 nm mediante la adición de un cultivo estacionario de toda la noche de XL1-b1ue y se incubó a 26ºC y 200 rpm en un Erlenmeyer de 2l. Tras alcanzar una DO_{600} = 0,6, el cultivo se enfrió durante 30 minutos en hielo y a continuación se centrifugó durante 15 minutos a 4000 g y 4ºC. El botón de células se lavó dos veces con 500 ml de glicerol 10% p/v enfriado en hielo y se resuspendió finalmente en 2 ml de medio GYT enfriado en hielo (glicerol 10% p/v, extracto de levadura 0,125% p/v, triptona 0,25 % p/v).

El sistema Micro Pulser (BioRad) con las cubetas del mismo fabricante (separación del electrodo de 2 \muM) se utilizaron para la electroporación. Todos los pasos se llevaron a cabo en una cámara fría a 4ºC. Cada 5 \mul de la solución de DNA mencionada anteriormente se mezcló con 40 \mul de la suspensión celular, se incubó durante 1 minuto en hielo y se transfirió finalmente a la cubeta. Tras la electroporación, la suspensión se diluyó inmediatamente en 2 ml de medio SOC enfriado en hielo (triptona 2% p/v, extracto de levadura 0,5% p/v, NaCl 10 mM, MgSO_{4} 10 mM, MgCl_{2} 10 mM) y se agitó durante 60 minutos a 37ºC y 200 rpm. El cultivo se diluyó en 2l. de medio YT 2x con 100 \mug/ml de ampicilina (2YT/Amp) y se cultivó hasta que la replicación celular causó un aumento de la DO_{550} hasta 0,64. De este modo, utilizando un total de 34,2 \mug del DNA ligado se obtuvieron 7x10^{7} transformantes en 49 operaciones de electroporación. Los transformantes se utilizaron posteriormente de acuerdo con el Ejemplo 2.

Ejemplo 2 Presentación en fagémidos y selección de muteínas de hNGAL contra la Lipocalina lagrimar humana

Se transfirieron a un Erlenmeyer estéril 200 ml del cultivo, que contiene las células que fueron transformadas con los vectores fasmídicos similares a phNGAL5 y que codifican la biblioteca de muteínas de lipocalina como proteínas de fusión. Tras la infección con el fago ayudante VCS-M13 (Stratagene) a una multiplicidad de infección de aproximadamente 10, se agitó el cultivo durante 30 minutos más a 37ºC, 160 rpm. A continuación se añadió Kanamicina (70 \mug/ml), se redujo la temperatura del incubador hasta 30ºC y, tras 10 minutos, se añadió anhidrotetraciclina (ACROS Organics) a 100 \mug/l (200 \mul de una solución de reserva a 100 \mug/ml en dimetilformamida, DMF) para inducir la expresión génica. Se mantuvo la incubación durante 5 horas más a 30ºC, 160 rpm.

Se recogieron 50 ml de este cultivo y se sedimentaron las células por centrifugación (15 minutos, 12000 g, 4ºC). El sobrenadante que contiene las partículas de fagémido se filtró en condiciones de esterilidad (0,45 \mum), se mezcló con 1/4 de volumen (12,5 ml) de PEG 8000 20% p/v, NaCl 15% p/v, y se incubó toda la noche a 4ºC. Tras la centrifugación (20 minutos, 18000 g, 4ºC), las partículas de fagémido precipitadas se disolvieron en 2 ml de PBS frío (KH_{2}PO_{4} 4 mM, Na_{2}HPO_{4} 16 mM, NaCl 115 mM, pH 7,4). La solución se incubó en hielo durante 30 minutos y se distribuyó in dos recipientes de reacción de 1,5 ml. Tras la centrifugación de los componentes no disueltos (5 minutos, 18500 g, 4ºC), cada sobrenadante se transfirió a un nuevo recipiente de reacción.

La mezcla con 1/4 de volumen de PEG 8000 al 20% p/v, NaCl al 15% p/v, y la incubación entre 30 y 60 minutos en hielo sirven para reprecipitar las partículas de fagémido. Tras la centrifugación (20 minutos, 18500 g, 4ºC), el sobrenadante se eliminó y las partículas de fagémido precipitadas se disolvieron y combinaron en un total de 400 \mul de PBS. Tras una incubación de 30 minutos en hielo, se centrifugó la solución (5 minutos, 18500 g, 4ºC) para eliminar los agregados residuales y se usó el sobrenadante se utilizó directamente para el enriquecimiento por afinidad. El enriquecimiento por afinidad de los fagémidos recombinantes que contenían las proteínas de fusión muteínas de hNGAL se realizó mediante Immuno-sticks (NUNC). Éstos se recubrieron con 800 \mul de Lipocalina lagrimar humana (Tlpc) (450 \mug/ml) en PBS durante toda la noche.

Para la producción de la Tlpc recombinante, se transformaron células de E. coli JM83 (Yanisch-Perron et al., Gene 33 (1985), 103-119) con el plásmido de expresión pTlpc3 que contiene el cDNA de la Tlpc (para el cDNA de la Tlpc, ver Holzfeind y Redl, Gene 139 (1994), 177-183) y se usó para la producción y purificación de proteínas de acuerdo con el ejemplo 3. El rendimiento de proteína fue de aproximadamente 2,2 mg por litro de volumen de cultivo.

Los lugares de unión libres en la superficie del Immuno-Stick se saturó por incubación con 1,2 ml de BSA al 2% p/v en PBST (PBS con Tween 20 0,1% v/v) durante 2 horas a TA. Tras ello, el Immuno-Stick se incubó con una mezcla de 250 ml de la solución de fagémido y 500 ml de tampón de bloqueo (BSA al 3% p/v en PBST) durante 1 hora a TA.

Para la eliminación de los fagémidos no unidos, se realizaron ocho lavados, cada uno de ellos con 950 \mul de PBST durante 2 minutos. Los fagémidos adsorvidos se eluyeron finalmente mediante un tratamiento de 10 minutos del Immuno-Stick con 950 \mul de glicina/HCl 0,1 M pH 2,2, seguido de la neutralización inmediata del pH de la fracción de elución mezclándolo con 150 \mul de Tris 0,5 M.

Para la amplificación, esta solución de fagémido (1,1 ml, que contiene entre 10^{6} y 10^{8} unidades formadoras de colonias, dependiendo del ciclo de se1ección) se calentó brevemente hasta 37ºC, se mezcló con 3 ml de un cultivo en crecimiento exponencial de E. coli XLl-blue (DO_{550} = 0,5), y se incubó durante 30 minutos a 37ºC, 200 rpm. Las células infectadas con los fagémidos se sedimentaron seguidamente (2 minutos, 4420 g, 4ºC), se resuspendieron en 600 \mul del medio de cultivo, y se plaquearon en tres placas de agar con medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina (LB/Amp; 140 mm de diámetro).

Tras la incubación de 14 horas a 32ºC, las células se rascaron de las placas de agar, con adición en cada una de ellas de 10 ml de medio YT/Amp 2x, se transfirieron a un Erlemneyer estéril, y se agitaron durante 20 minutos a 37ºC, 200 rpm para su completa resuspensión. 200 ml de medio YT/Amp 2x precalentado a 37ºC se inocularon con un volumen apropiado de esta suspensión hasta alcanzar una DO_{550} = 0,08.

Para la producción y enriquecimiento de partículas de fagémido por afinidad de forma repetida, se utilizó el mismo procedimiento descrito al principio de este ejemplo. En este caso 50 ml de medio YT/Amp 2x se inoculó con entre 0,2 y 1 ml de la suspensión de las células que habían crecido en las placas de agar y los fagémidos se produjeron durante un periodo de siete horas en lugar de cinco a 30ºC. Para ciclos de selección posteriores con la Tlpc se realizó de este modo.

Ejemplo 3 Identificación de las muteínas de hNGAL de unión a la Lipocalina lagrimar humana mediante el uso del método de "cribaje de colonias"

Para la producción analítica de las muteínas de hNGAL como proteínas de fusión con la Strep-Tag® II así como con el dominio de unión a albúmina y su caracterización mediante cribaje de colonias, se subclonó la casete entre los dos sitios de corte con BstXI del vector phNGAL5 en el phNGAL 7.

Con este propósito se aisló el DNA fasmídico de la mezcla de clones de E. coli obtenidos mediante la infección con los fagémidos del Ejemplo 2 y eluído como resultado del último ciclo de selección, utilizando el equipo Perfectprep Plasmid Midi Kit (Eppendorf). El DNA se cortó con la enzima de restricción BstXI y el menor de los dos fragmentos (347 pb) se purificó mediante electroforesis preparativa en gel de agarosa como se describe en el Ejemplo 1. El DNA del vector phNGAL7 se cortó con BstXI y el mayor de los dos fragmentos (3971 pb) se aisló de la misma manera.

Para la ligación, 100 fmol de cada uno de los dos fragmentos de DNA se mezclaron con 1,5 Unidades Weiss de ligasa de DNA T4 (Promega) en un volumen total de 20 \mul (Tris/HCl 30 mM pH 7,8, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM), seguido de una incubación de toda la noche a 16ºC. Células de E. coli TG1-F^{-}(E. coli K12 TG1, que ha perdido su episoma tras su repetido cultivo en condiciones de cultivo no selectivas) se transformaron con 2 \mul de esta mezcla de ligación de acuerdo con el método del CaCl_{2} (Sambrook et al., supra).

Una membrana hidrofílica de PVDF (Millipore, tipo GVWP, tamaño de poro 0,22 \mum), marcada en una posición y cortada a medida, se colocó en una placa de agar con LB/ Amp. 150 \mul de la suspensión celular de la porción de transformación, que se habían centrifugado (5000 g, 2 min, 4ºC) y resuspendido en 500 \mul de medio de cultivo, se plaquearon uniformemente en esta membrana. Esta placa de agar se incubó durante 7,5 horas a 37ºC hasta que las colonias alcanzaron un tamaño de aproximadamente 0,5 mm.

Mientras tanto, una membrana hidrofóbica (Millipore, Immobilon P, tamaño de poro 0,45 \mum), también cortada a medida, se humedeció con PBS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación se agitó durante 4 horas a TA en una solución de 10 mg/ml de albúmina sérica humana (HSA, Sigma) en PBS. Los sitios de unión restantes de la membrana se saturaron por incubación con BSA al 3% p/v, Tween 20 al 0,5% v/v en PBS durante 2 horas a TA. La membrana se lavó dos veces durante 10 minutos cada vez con 20 ml de PBS y se agitó luego durante 10 minutos en 10 ml de medio LB/Amp, al que se le habían añadido 200 \mug/l de anhidrotetraciclina. A continuación se marcó en una posición y se colocó en una placa de cultivo con agar LB/Amp, que contenía adicionalmente 200 \mug/l de anhidrotetraciclina. La membrana hidrofílica en la que las colonias habían crecido se colocó encima de la membrana hidrofóbica de forma que las dos marcas quedaron superpuestas. La placa de cultivo se incubó con ambas membranas a 22ºC durante 15 horas. Durante esta fase las respectivas muteínas de hNGAL se secretaron desde las colonias y se inmovilizaron a través del dominio de unión a la albúmina en el HSA de la membrana inferior.

Posteriormente, la membrana superior con las colonias se transfirió a una placa fresca de agar LB/Amp y se guardó a 4ºC. La membrana hidrofóbica se recogió, se lavó tres veces durante 5 minutos cada vez con 20 ml de PBST, y a continuación se incubó durante 1 hora en 10 ml de una solución de conjugado (10 \mug/ml) de Lipocalina lagrimar y biotina en PBST. Para la producción del conjugado, se añadió lentamente una solución de 0,285 mg de éster N-hidroxisuccinimida del ácido D-biotinoil-\varepsilon-amidocaproico (Roche) en 9 \mul de DMSO, a 2,5 ml de Tlpc 450 \mug/ml en NaHCO_{3} al 5% p/v (pH 8,2). Tras agitarse durante 1 hora a TA, el reactivo en exceso se eliminó mediante una columna de gel de filtración PD-10 (Pharmacia) utilizando PBS como tampón de trabajo.

Tras la incubación con el conjugado, la membrana se lavó tres veces con PBST, seguido de una incubación de 1 hora con 10 ml de fosfatasa alcalina conjugada con avidina (Sigma, dilución 1:40000 en PBST). A continuación la membrana se lavó dos veces con PBST y una con PBS durante 5 minutos cada vez y se agitó durante 10 minutos en tampón AP (Tris/HCl 0,1M pH 8,8, NaCl 0,1M, MgCl_{2} 5 mM). Para la reacción cromogénica, la membrana se incubó en 10 ml de tampón AP, al que se le añadieron 30 \mul de sal 4-toluidina 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (Roth, 50 \mug/ml en dimetilformamida) y 5 \mul de nitroazul de tetrazolio (Roth, 75 \mug/ml en dimetilformamida al 70% v/v), hasta que se pudieron reconocer distintivamente señales de color en las posiciones de algunas de las colonias. De este modo se detectó la actividad de unión de la proteína ligando, es decir la Tlpc, de las muteínas de la hNGAL producidas por estas colonias.

Doce de las colonias que dieron lugar a puntos de color se cultivaron desde la primera membrana. Su DNA plasmídico se aisló y la casete génica hNGAL se analizó mediante secuenciación con el sistema Genetic Analyzer 310 (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y utilizando el oligodesoxinucleótido ID de SEC Nº: 11 como cebador. Los doce clones secuenciados mostraron solo ocho secuencias diferentes, que se llamaron TlpcA, TlpcB, TlpcC, TlpcD, TlpcE, TlpcF, TlpcG y TlpcH. El clon TlpcA se encontró cinco veces. Las secuencias nucleotídicas de los clones se tradujeron a secuencias aminoacídicas y aquellos aminoácidos que diferían de la hNGAL se muestran en la Tabla 1. La secuencia nucleotídica y aminoacídica de la muteína TlpcA se muestran también como ID de SEC Nº:12 y ID de SEC Nº: 13. La secuenciación reveló codónes de parada ámbar, que se suprimían en las cepas de E. coli utilizadas, en diferentes posiciones en todas las variantes seleccionadas.

Ejemplo 4 Producción de las muteínas de hNGAL

Para la producción preparativa de hNGAL y sus muteínas, se producieron en la cepa de E. coli TG1-F^{-}, una colonia seleccionada así como la hNGAL originalmente codificada en el phNGAL7, como control.

Para ello, 100 ml de medio LB/Amp se inocularon con una sola colonia del transformante TG1-F^{-} que contenía el respectivo plásmido, y se incubó toda la noche a 30ºC, 200 rpm. Entonces se inocularon 2l de medio LB/Amp en un Erlenmeyer de 5l con 40 ml de uno de los precultivos y se agitaron a 22ºC, 200 rpm hasta una DO_{550} = 0,5. La inducción se realizó mediante la adición de 200 \mug/l de anhidrotetraciclina (200 ml de una solución de reserva de 2 mg/ml en DMF) seguido de agitación durante 3 horas más a 22ºC, 200 rpm.

Las células de uno de los recipientes se centrifugaron (15 minutos, 4420 g, 4ºC) y, tras decantar el sobrenadante, se resuspendieron en 20 ml de tampón de liberación periplásmica (Tris/HCl 100 mM pH 8,0, sacarosa 500 mM, EDTA 1 mM) con enfriamiento durante 30 minutos en hielo. A continuación los esferoplastos se eliminaron en dos pasos de centrifugación sucesivos (15 minutos, 4420 g, 4ºC y 15 minutos, 30000 g, 4ºC). El sobrenadante que contenía el extracto de proteína periplasmática se dializó contra tampón CP (Tris/HCl 100 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM), fue filtrado en condiciones de esterilidad, y se utilizó para la purificación cromatográfica.

La purificación se llevó a cabo mediante la cola de afinidad Strep-Tag® II (Schmidt et al., supra) que se situó entre la variante hNGAL y el dominio de unión a la albúmina. En el presente caso se utilizó la muteína de estreptavidina "1" (German Patent 196 41 876,3; Voss y Skerra, Protein Eng. 10 (1997), 975-982), que se acopló a sefarosa activada con NHS (Pharmacia) dando lugar a 5 mg/ml de estreptavidina inmovilizada, en relación con el volumen de lecho de la matriz.

Una columna de cromatografía de 4 ml de volumen de lecho cargada con este material se equilibró con 20 ml de tampón CP a 4ºC a una tasa de flujo de 40 ml/h. La cromatografía se monitorizó midiendo la absorción a 280 nm del eluído en un fotómetro de flujo. Tras la aplicación del extracto de proteína periplasmática, la columna se lavó con tampón CP hasta alcanzar el nivel base y la muteína hNGAL unida se eluyó posteriormente con 10 ml de una solución de D-destiobiotina 2,5 mM (Sigma) en tampón CP. Las fracciones que contenían la muteína purificada hNGAL se comprobaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (Fling und Gregerson, Anal. Biochem. 155 (1986), 83-88) y se agruparon. Los rendimientos de proteína fueron de entre 30 \mug y 70 \mug por litro de cultivo.

TABLA 1 Características de las secuencias de las muteínas de hNGAL seleccionadas

1

2

* Estos residuos de glutamina estaban codificados por codónes de parada ámbar.

º Estas sustituciones aminoacídicas aparecen a causa de mutaciones aleatorias.

Ejemplo 5 Medida de la afinidad de las muteínas de hNGAL por la Lipocalina lagrimar

Para la detección de unión en un ELISA (Ensayo inmunosorvente de unión a enzima) los pocillos se una placa microtitulada (Placa Micro Test III Flexible Assay; Falcon) se cargaron con 100 \mul de una solución de HSA 20 mg/ml en PBST y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente (TA). Tras tres lavados con PBST, se cargó en los pocillos 50 \mul de una solución 1 \muM de la proteína de fusión purificada de la muteína hNGAL TlpcA y hNGAL del Ejemplo 3, y la proteína se inmovilizó por la formación de un complejo entre el DUA y el HSA. Tras una hora la solución se eliminó y se lavó tres veces con PBST. Entonces se preparó un banco de diluciones en PBST de un conjugado de Lipocalina lagrimar y biotina en PBST, empezando en 140 \mug/ml,(Ejemplo 3), seguido de 1 hora de incubación a TA. Tras tres lavados con PBST, se cargó en los pocillos fosfatasa alcalina conjugada con avidina (Sigma), diluida 1:10000 en PBST. La incubación se realizó durante 1 hora a TA y se continuó con dos lavados con PBST y dos con PBS. La detección de la lipocalina lagrimar unida a las muteínas de hNGAL inmovilizadas se consiguió entonces mediante la hidrólisis de p-nitrofenilfosfato, catalizada mediante la fosfatasa alcalina. Para ello, 100 \mul de una solución de p-nitrofenilfosfato 0,5 mg/ml (Amresco) en tampón AP (NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM, Tris/HCl 100 mM pH 8,8) se cargaron en los pocillos y la formación de producto de monitorizó mediante la medición de la absorción a 405 nm en un fotómetro SpectraMax 250 (Molecular Devices).

Ejemplo 6 Preparación de una biblioteca con más de 10 billones de muteínas de hNGAL independientes

Una biblioteca aleatoria de hNGAL con una diversidad aumentada se preparó mediante mutagénesis dirigida en un total de 20 posiciones aminoacídicas seleccionadas en los cuatro lazos peptídicos, utilizando múltiples pasos de PCR de acuerdo con la Figura 2. Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 100 \mul en los dos primeros pasos de amplificación, en los que se utilizó 10 ng de DNA plasmídico phNGAL5 (Fig. 1) como molde, junto con 50 pmol de cada par de cebadores (ID de SEC Nº:1 y ID de SEC Nº:2 o ID de SEC Nº: 3 y ID de SEC Nº:4, respectivamente), que se sintetizaron de acuerdo con el método convencional de fosforamidita. Además, la mezcla de reacción contenía 10 \mul de tampón Taq 10x (Tris/HCl 100 mM pH 9,0, KCl 500 mM, MgCl_{2} 15 mM, Triton X-100 1% v/v) y 10 \mul de mezcla de dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 2 mM). Tras llevar hasta volumen con agua, se añadieron 5 U de polimerasa de DNA Taq (5 U/\mul, Promega) y se llevaron a cabo 20 ciclos de temperatura de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 60ºC, y 1,5 minutos a 72ºC en un termociclador con tapa calefactada (Eppendorf), seguido de una incubación final de 5 minutos a 60ºC. El producto de amplificación deseado se aisló en cada caso mediante electroforesis preparativa en gel de agarosa de Agarosa GTQ (Roth) utilizando un equipo de extracción de DNA Jetsorb (Genomed).

El posterior paso de amplificación también se realizó en una mezcla de 100 \mul, en la que aproximadamente 6 ng de los dos fragmentos de DNA se utilizaron como molde en presencia de 50 pmol de cada uno de los cebadores ID de SEC Nº:5 y ID de SEC Nº: 6. Ambos cebadores portaban un grupo biotina en su extremo 5', contrariamente a lo expuesto en el Ejemplo 1. El resto de componentes de la mezcla de PCR se añadieron en las mismas cantidades que en los pasos de amplificación previos. La PCR se llevó a cabo en 20 ciclos de temperatura de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 60ºC, 1,5 minutos a 72ºC, seguido de una posterior incubación durante 5 minutos a 60ºC. El producto de PCR se purificó utilizando el equipo E.Z.N.A. Ciclo-Pure (PeqLab).

Para el clonaje del fragmento de DNA que representaba la biblioteca de muteínas de hNGAL en su forma de ácido nucleico, el producto de PCR biotinilado en 5' se cortó con la enzima de restricción BstXI (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y el fragmento resultante de 347 nucleótidos de tamaño se purificó mediante electroforesis preparativa en gel de agarosa como se ha descrito anteriormente. Los fragmentos de DNA residuales que no se digirieron o lo hicieron de forma incompleta se eliminaron gracias a sus colas biotina en 5' mediante incubación de la solución con cuentas paramagnéticas cubiertas de estreptavidina (Dynal), obteniendo así el fragmento de DNA doblemente cortado adecuado para la subsiguiente reacción de ligación.

Para este fin, 100 \mul de una suspensión de cuentas paramagnéticas disponible comercialmente a una concentración de 10 mg/ml se lavaron tres veces con 100 \mul de tampón TE. Entonces, las cuentas paramagnéticas se drenaron y se mezclaron con entre 11 y 22 pmol del fragmento de DNA en 100 \mul de tampón TE durante 15 min a temperatura ambiente. Las cuentas paramagnéticas se recogieron en la pared del tubo Eppendorf con ayuda de un imán y el sobrenadante que contenía el fragmento de DNA purificado se recuperó para su posterior utilización en la siguiente reacción de ligación.

El DNA del vector phNGAL12 (Fig. 6) se cortó con BstXI como se describe anteriormente y el mayor de los dos fragmentos generados (3971 pb) se aisló mediante electroforesis preparativa en gel de agarosa. Para la ligación, 6,85 \mug (30 pmol) del fragmento de PCR y 78,65 \mug (30 pmol) del fragmento de vector se incubaron en presencia de 855 Unidades Weiss de ligasa de DNA T4 (Promega) en un volumen total de 8550 \mul (Tris/HCl 50 mM pH 7,8, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, BSA 50 mg/ml) durante cuatro días a 16ºC. El DNA se precipitó entonces por adición de 110 \mug de tRNA de levadura (Boehringer Mannheim), 350 \mul de acetato amónico 5M, y 1300 \mul de etanol por cada 350 \mul de mezcla de ligación. La incubación a -20ºC durante dos días se siguió de una centrifugación (30 minutos, 16000 g, 4ºC). Cada precipitado se lavó con 750 \mul de etanol (70% v/v, -20ºC), se centrifugó (5 minutos, 16000 g, 4ºC), y se secó al vacío (2 minutos). El DNA se disolvió finalmente en un volumen total de 427,5 \mul de agua hasta una concentración final de 200 \mug/ml.

La preparación de células electrocompetentes de la cepa de E. coli K12 XL1-blue (Bullock et al., supra) se realizó de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1.

El sistema Micro Pulser (BioRad) junto con las cubetas del mismo proveedor (separación del electrodo de 2 mm) se utilizaron para la electroporación. Todos los pasos se llevaron a cabo en una cámara fría a 4ºC. 10 \mul de cada una de las soluciones de DNA anteriores (2 \mug) se mezclaron con 100 \mul de la suspensión celular, se incubó 1 minuto en hielo, y se transfirió a la cubeta pre-enfriada. Entonces se realizó la electroporación (5 ms, 12,5 kV/cm) y la suspensión se diluyó inmediatamente en 2 ml de medio SOC enfriado en hielo seguido de agitación durante 60 minutos a 37ºC y 200 rpm. El cultivo se diluyó en 1,5 l de medio YT 2x que contenía 100 \mug/ml de ampicilina (2YT/Amp) hasta una DO_{550} de 0,5 y se cultivó a 37ºC hasta que la DO_{550} aumentó hasta 0,7 a causa de la replicación de las células. Utilizando un total de 85,5 g de DNA ligado, se obtuvieron de este modo 1,8x10^{10} transformantes utilizando en conjunto 43 pasos de electroporación. Los transformantes se utilizaron posteriormente de acuerdo con el ejemplo 7.

Ejemplo 7 Presentación y selección de fagémidos de las muteínas de hNGAL contra un péptido de ocho aminoácidos del dominio de unión celular de la Trombospondina l humana ("péptido de la trombospondina")

El cultivo de 1500 ml, que contenía células que se habían transformado con los vectores fasmídicos correspondientes a phNGAL12, pero que codifican para la biblioteca de muteínas de la lipocalina como proteínas de fusión, se infectaron con el fago ayudante VCS-M13 (Stratagene) a una multiplicidad de infección de aproximadamente 10. El cultivo se agitó durante 30 minutos adicionales a 37ºC, 160 rpm. Entonces se disminuyó la temperatura del incubador hasta 26ºC y se añadió Kanamicina (70 \mug/ml). Tras 10 minutos, se añadió anhidrotetraciclina a 25 \mug/l (1875 \mul de una solución de reserva a 20 \mug/ml en DMF) para inducir la expresión génica. La incubación se mantuvo durante otras 15 horas a 26ºC, 160 rpm.

Las células se sedimentaron mediante centrifugación (60 minutos, 12500 g, 4ºC). El sobrenadante, que contenía las partículas de fagémido, se filtró en condiciones de esterilidad (0,45 \mum), se mezcló con 1/4 de volumen (375 ml) de PEG 8000 al 20% p/v enfriado en hielo, NaCl 15% p/v, y se incubó durante una hora a 4ºC. Tras la centrifugación (30 minutos, 18500 g, 4ºC) las partículas de fagémido precipitadas se disolvieron en 60 ml de PBS frío. La solución se incubó en hielo durante 60 minutos y se distribuyó en dos tubos de centrifugación SS34. Tras la centrifugación de los componentes no disueltos (5 minutos, 18500 g, 4ºC) cada sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de centrifugación.

Las partículas de fagémido se reprecipitaron mediante la mezcla con 1/4 de volumen de PEG 8000 al 20% p/v, NaCl al 15% p/v, seguido de una incubación de 60 minutos en hielo. Los fagémidos se alicuotaron (2 ml) y se añadieron EDTA 1 mM y benzamidina 50 mM (Sigma) para su almacenamiento a largo plazo a -20ºC.

Los péptidos biotinilados sintéticos derivados de la trombospondina del dominio de unión celular de la Trombospondina 1 humana (Tulasne et al., Blood 98 (2001), 3346-3352; H_{2}N-Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met-Trp-Lys-Aca-Aca-Lys-Biotina-COOH, ID de SEC Nº:18, Aca: ácido aminocaproico) se usaron junto con partículas paramagnéticas recubiertas de estreptavidina (Dynal) como diana para el enriquecimiento por afinidad de la biblioteca de fagémidos que representan las muteínas de hNGAL.

Con este propósito se centrifugó una alícuota de 2 ml de los fagémidos precipitados anteriores (20 minutos, 18500 g, 4ºC), se eliminó el sobrenadante, y las partículas sedimentadas de fagémido se disolvieron en 1 ml de PBS. Tras una incubación de 30 minutos en hielo, se centrifugó la solución (5 minutos, 18500 g, 4ºC) hasta la eliminación de los agregados residuales y el sobrenadante se utilizó directamente para el enriquecimiento por afinidad.

Para enriquecer los fagémidos de unión a péptidos, se mezclaron 40 \mul de una solución de péptido biotinilado de la trombospondina 825 nM (33 pmol) en PBS (preparada mediante la mezcla de 100 \mul de una solución de péptido sintético a 10 \muM en DMF con 1112 \mul de PBS) se mezcló con 260 \mul de una solución de los fagémidos recién preparados (entre 2x10^{12} y 5x10^{12} unidades formadoras de colonias, cfu) y se incubaron a TA durante 1 h para permitir que ocurriera la formación de complejos entre el péptido y las muteínas presentadas por los fagémidos. Entonces, se añadieron 100 \mul de una solución de BSA al 8% p/v, Tween 20 0,4% v/v en PBS.

Paralelamente a esto, 100 \mul de una suspensión disponible comercialmente de partículas paramagnéticas con estreptavidina (Dynal) se lavaron tres veces con 100 \mul de PBS. Hasta ese momento, las partículas se mantuvieron en suspensión durante 1 min por rotación del tubo Eppendorf de 1,5 ml y después se recogieron en la pared del tubo con la ayuda de un imán, y el sobrenadante se eliminó. Para saturar los sitios de unión inespecíficos, se incubaron las partículas paramagnéticas con 100 \mul de BSA al 2% p/v en PBST a TA durante 1 h.

Tras eliminar el sobrenadante, la mezcla de péptido biotinilado de la trombospondina y de fagémidos se añadió a las partículas paramagnéticas, se resuspendieron las partículas y se incubaron a TA durante 10 min. Finalmente, los lugares de unión a biotina libres de estreptavidina se saturaron por adición de 10 \mul de una solución de D-destiobiotina 4 mM (Sigma) en PBS a la mezcla, y se incubó dicha mezcla a TA durante 5 min. Este paso sirvió para evitar que el Strep-tag® II, que forma parte de la proteína de fusión de las muteínas y el fragmento pIII de la proteína de la cubierta del fago, formara un complejo con la estreptavidina.

Los fagémidos no unidos se eliminaron mediante ocho lavados de las partículas paramagnéticas con 1 ml de PBST fresco que contenía D-destiobiotina 1 mM. Cada vez las partículas se recogieron con ayuda de un imán y el sobrenadante se eliminó. Finalmente, los fagémidos unidos se eluyeron mediante la resuspensión de las partículas en 950 \mul de glicina/HCl 0,1M pH 2,2 e incubación durante 15 minutos. Tras recoger las partículas con el imán, el sobrenadante se recuperó y se neutralizó inmediatamente por la adición de 150 \mul de Tris 0,5 M.

Con el propósito de amplificarla, esta solución de fagémidos (1,1 ml, que contenía entre 10^{7} y 10^{10} cfu, en función del ciclo de selección) se calentó brevemente hasta 37ºC, se mezcló con 3 ml de un cultivo en crecimiento exponencial de E. coli XLl-blue (DO_{550} = 0,5 a 37ºC), y se incubó durante 30 minutos a 37ºC, 200 rpm. Las células infectadas con los fagémidos se sedimentaron a continuación (2 minutos, 4420 g, 4ºC), se resuspendieron en 600 \mul de medio de cultivo, y se plaquearon en tres placas de agar con medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina (LB/Amp; 140 mm de diámetro).

Tras una incubación de 14 horas a 32ºC, las células se rascaron desde las placas de agar, cada vez con la adición de 10 ml de medio YT/Amp 2x, se transfirieron a un Erlenmeyer estéril, y se agitaron durante 20 minutos a 37ºC, 200 rpm para su completa resuspensión.

Para un nuevo ciclo de producción y enriquecimiento por afinidad de las partículas de fagémido, se inocularon 50 ml de medio YT/Amp 2x precalentado a 37ºC, con entre 0,2 y 1 ml de dicha suspensión de modo que la densidad celular fuera de una DO_{550} = 0,08. Este cultivo se incubó a 37ºC, 160 rpm hasta una densidad celular de DO_{550} = 0,5. Entonces el cultivo se infectó con el fago ayudante VCS-M13 (Stratagene) a una multiplicidad de infección de aproximadamente 10 y el cultivo se agitó durante 30 minutos más a 37ºC, 160 rpm. Posteriormente se añadió kanamicina (70 \mug/ml), se redujo la temperatura del incubador hasta 26ºC y, tras 10 minutos, se añadió anhidrotetraciclina hasta 25 \mug/l para inducir la expresión génica. La incubación continuó durante otras 15 horas a 26ºC, 160 rpm.

Las células se sedimentaron mediante centrifugación (15 minutos, 12000 g, 4ºC). El sobrenadante que contenía las partículas de fagémido se filtró en condiciones estériles (0,45 \mum), se mezcló con 1/4 de volumen (12,5 ml) de PEG 8000 al 20% p/v, NaCl al 15% p/v, y se incubó durante 1 h en hielo. Tras la centrifugación (20 minutos, 18000 g, 4ºC), las partículas de fagémido se disolvieron en 2 ml de PBS frío. La solución se incubó en hielo durante 30 minutos y se distribuyó en dos recipientes de reacción de 1,5 ml. Tras la centrifugación de los componentes no disueltos (5 minutos, 18500 g, 4ºC), cada sobrenadante se transfirió a un nuevo recipiente de reacción.

Las partículas de fagémido se reprecipitaron mediante la mezcla con 1/4 de volumen de PEG 8000 al 20% p/v, NaCl al 15% p/v, seguido de incubación durante 60 minutos en hielo. Tras la centrifugación (20 minutos, 18500 g, 4ºC) el sobrenadante se eliminó y las partículas de fagémido precipitadas se disolvieron en 1 ml de PBS. Tras la incubación de 30 minutos en hielo, la solución se centrifugó (5 minutos, 18500 g, 4ºC) y el sobrenadante se utilizó directamente para el enriquecimiento por afinidad. De este modo se llevaron a cabo cinco ciclos de selección más con el péptido de la trombospondina.

Ejemplo 8 Identificación de las muteínas de hNGAL de unión al péptido de la trombospondina mediante el método de "cribaje de colonias"

Para la producción analítica de las muteínas de hNGAL como proteínas de fusión con el Strep-Tag® II y el dominio de unión a albúmina, la casete génica entre los dos sitios de corte BstXI se subclonó desde el vector phNGAL12 en el phNGAL7.

Para ello, el DNA fasmídico se aisló de la mezcla de clones de E. coli obtenidos por infección con los fagémidos del Ejemplo 7, eluído como resultado del cuarto y quinto ciclos de selección, utilizando el equipo Plasmid Midi Kit (Qiagen). El DNA de ambas preparaciones se cortó con la enzima de restricción BstXI y en cada caso el menor de los dos fragmentos (347 pb) se purificó mediante electroforesis preparativa en gel de agarosa como se describe en el Ejemplo 6. El DNA del vector phNGAL7 se cortó con BstXI y el mayor de los dos fragmentos (3971 pb) se aisló del mismo modo.

Para la ligación, cada 100 fmol de los fragmentos pequeños de DNA aislados se mezclaron con 100 fmol del fragmento grande de DNA y con 1,5 unidades Weiss de ligasa de DNA T4 (Promega) en un volumen total de 20 \mul (Tris/HCl 30 mM pH 7,8, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM), seguido de una incubación de toda la noche a 16ºC. La cepa E. coli TG1-F^{-} (E. coli K12 TG1, que ha perdido todo su episoma a través de repetidos cultivos bajo condiciones no selectivas) se transformó con 2 \mul de cada una de estas mezclas de ligación de acuerdo con el método del CaCl_{2} (Sambrook et al., supra), obteniéndose así 2,0 ml de una suspensión celular. 100 \mul de esta suspensión se plaquearon en una placa de agar que contenía medio LB/Amp y se incubó a 37ºC durante 14 h.

Dos membranas hidrofílicas de PVDF (Millipore, tipo GVWP, tamaño de poro 0,22 \mum), se marcaron en una posición y se cortaron a medida, y se colocaron en placas de agar LB/Amp. 150 \mul de la suspensión celular de las porciones de transformación, que se habían centrifugado (5000 g, 2 min, 4ºC) y resuspendido en 500 \mul de medio de cultivo, se plaquearon uniformemente en estas membranas. Estas placas de agar se incubaron durante 7,5 horas a 37ºC hasta que las colonias hubieron alcanzado un tamaño de aproximadamente 0,5 mm.

Mientras tanto, dos membranas hidrofóbicas (Millipore, Inmovilon P, tamaño de poro 0,45 \mum), se cortaron también a medida, y se humedecieron con PBS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Entonces se agitaron durante 4 horas a temperatura ambiente en 10 ml de una solución de albúmina sérica humana 10 mg/ml (HSA, Sigma) en PBS. Los sitios de unión restantes de las membranas se saturaron por incubación con 20 ml de BSA al 3% p/v, Tween 20 al 0,5% v/v en PBS durante 2 horas a TA. Las membranas se lavaron dos veces durante 10 minutos cada vez con 20 ml de PBS y se sumergieron luego durante 10 minutos en 10 ml de medio LB/Amp, al que se le había añadido anhidrotetraciclina hasta 200 \mug/l.

Finalmente, se marcaron en una posición y se colocaron en una placa de cultivo con agar LB/Amp, que contenía adicionalmente 200 \mug/l de anhidrotetraciclina. Las anteriores membranas hidrofílicas en las que las colonias habían crecido, se colocaron encima de las membranas hidrofóbicas de forma que las dos marcas quedaron superpuestas. Las placas de cultivo se incubaron el conjunto de ambas membranas a 22ºC durante 15 horas. Durante esta fase las respectivas muteínas de la hNGAL se secretaron desde las colonias en la membrana superior y se inmovilizaron a través del dominio de unión a la albúmina en el HSA de la membrana inferior.

Posteriormente, las membranas superiores con las colonias se transfirió a una placa fresca de agar LB/Amp y se guardaron a 4ºC. Las membranas hidrofóbicas se recogieron y se lavaron tres veces durante 5 minutos cada vez con 20 ml de PBST.

Para el análisis de la actividad de unión de las muteínas de la hNGAL inmovilizadas, las membranas se incubaron durante 1 hora en 10 ml de una solución del péptido biotinilado de trombospondina (10 \mug/ml) en PBST (una solución de reserva 1 mM del péptido biotinilado en DMF se diluyó 1:100 en PBST). Las membranas se lavaron tres veces con PBST, seguido de una incubación de 1 hora con 10 de fosfatasa alcalina conjugada con avidina (Sigma, dilución 1:40,000 en PBST) para la detección de los péptidos unidos a través de sus grupos biotina. Las membranas se lavaron dos veces con PBST y una con PBS, cada vez durante 5 minutos, y se agitaron durante 10 minutos en tampón AP (Tris/HCl 0,1M pH 8,8, NaCl 0,1M, MgCl_{2} 5 mM). Para la reacción cromogénica, las membranas se incubaron en 10 ml de tampón AP, al que se le habían añadido 30 \mul de sal 4-toluidina 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (Roth, disuelta a 50 \mug/ml en dimetilformamida) y 5 \mul de nitroazul de tetrazolio (Roth, 75 \mug/ml en dimetilformamida 70% v/v), hasta que se pudieron reconocer señales de color distintivas en las posiciones de algunas de las colonias.

19 de estas colonias (9 aisladas en el ciclo de sembrado cuatro y 10 del ciclo cinco) que dieron lugar a puntos de color intenso en las membranas hidrofóbicas se cultivaron de las correspondientes membranas hidrofílicas. Su DNA plasmídico se aisló y la casete génica de hNGAL se analizó mediante secuenciación utilizando el sistema Genetic Analyzer 310 con el equipo Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y utilizando como cebador el oligodesoxinucleótido ID de SEC Nº: 11.

Los 19 clones secuenciados mostraron solo doce secuencias diferentes, que se nombraron RFY-A, RFY-B, RFY-C, RFY-D, RFY-E, RFY-F, RFY-G, RFY-H, RFY-I, RFY-J, RFY-K y RFY-L. El clone RFY-B se encontró dos veces y el clone RFY-C se encontró seis veces. El clone RFY-J mostraba una deleción de 3 nucleótidos, que resultaba en la deleción de un aminoácido situado en el lazo Nº,4 del péptido en la posición 125. En el clone RFY-L se identificó un codón de parada ámbar, que se traduce en una aminoácido glutamina en una cepa supresora supE.

Las secuencias nucleotídicas de los clones se tradujo a secuencias aminoacídicas y aquellos aminoácidos que diferían de la proteína hNGAL original se muestran en la Tabla 2a,b. Las secuencias nucleotídicas de las muteínas RFY-B, RFY-C, y RFY-E se muestran también como ID de SEC Nº: 23, ID de SEC Nº: 25 y ID de SEC Nº: 27 en el listado de secuencias. Las secuencias aminoacídicas de estas muteínas se muestran como ID de SEC Nº: 24, ID de SEC Nº: 26 y ID de SEC Nº: 28 en el listado de secuencias.

Las muteínas RFY-B y RFY-C, que se encontraron dos y seis veces respectivamente se escogieron para la caracterización detallada de su actividad de unión. Además se eligió la muteína RFY-E, a causa de que su composición aminoacídica en las regiones aleatorizadas parece ser claramente única.

TABLA 2a Características de las secuencias de las muteínas de hNGAL seleccionadas

3

TABLA 2b Características de las secuencias de las muteínas de hNGAL seleccionadas

4

5

	* Este residuo de glutamina estaba codificado por un codón de parada ámbar.
	º \begin{minipage}[t]{115mm} Estas substituciones aminoacídicas aparecieron debido a mutaciones accidentales fuera de las posiciones aleatorizadas.\end{minipage}
	\Delta \begin{minipage}[t]{115mm} Esta deleción aminoacidica apareció debido a una mutación accidental fuera de las posiciones aleatorizadas.\end{minipage}

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Ejemplo 9 Producción de las muteínas de hNGAL

Para la producción preparativa de las muteínas de hNGAL RFY-B, RFY-C, y RFY-E obtenidas en el Ejemplo 8 la región codificante mutagenizada entre los sitios de corte BstXI se subclonó del vector phNGAL7 en el plásmido de expresión phNGAL15 (Fig. 7). El plásmido así obtenido codificaba una proteína de fusión de la muteína con la secuencia señal OmpA, en el extremo amino-terminal y la cola de afinidad Strep-Tag® II en el extremo carboxi-terminal.

Para subclonar, el plásmido de DNA que codificaba la muteína relevante se cortó con la enzima de restricción BstXI, y el menor de los dos fragmentos (347 pb) se purificó mediante electroforesis preparativa en gel de agarosa como se describe en el Ejemplo 6. Del mismo modo, el DNA del vector phNGAL15 se cortó con BstXI, y se aisló el mayor de los dos fragmentos (3398 pb).

Para la ligación se añadieron 1,5 unidades Weiss de ligasa de DNA T4 (Promega) a 50 fmol de cada uno de los dos fragmentos de DNA en un volumen total de 20 \mul (Tris/HCl 30 mM pH 7,8, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, ATP l mM) y la mezcla se incubó a 16ºC durante 16 h. 5 \mul de la mezcla de ligación se usaron entonces para transformar E. coli JM83 (Yanisch-Perron et al., Gene 33 (1985), 103-119) de acuerdo con el método del CaCl_{2}, obteniéndose 2,0 ml de una suspensión celular. 100 \mul de esta suspensión se plaquearon en una placa de agar que contenía medio LB/Amp y se incubó a 37ºC durante 14 h.

Se utilizó una única colonia de los transformantes E. coli-JM83 para inocular en 100 ml de medio LB/Amp, seguido de incubación de toda la noche a 30ºC, 200 rpm. Se inocularon entonces 40 ml de este precultivo en 2 l de medio LB/Amp en un Erlenmeyer de 5 l y se agitaron a 22ºC, 200 rpm hasta una DO_{550} = 0,5. La inducción se realizó mediante la adición de 200 \mug/l de anhidrotetraciclina (200 \mul of una solución de reserva de 2 mg/ml en DMF) seguido de agitación durante 3 horas más a 22ºC, 200 rpm.

Las células de uno de los recipientes se centrifugaron (15 minutos, 4420 g, 4ºC) y, tras eliminar el sobrenadante, se resuspendieron en 20 ml de tampón de liberación periplásmica pre-enfriada (Tris/HCl 100 mM pH 8,0, sacarosa 500 mM, EDTA 1 mM) y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Los esferoplastos se eliminaron entonces en dos pasos de centrifugación sucesivos (15 minutos, 4420 g, 4ºC y 15 minutos, 30000 g, 4ºC). El sobrenadante que contenía el extracto de proteína periplasmática se dializó contra tampón CP (Tris/HCl 100 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM), fue filtrado en condiciones de esterilidad, y se utilizó para la purificación cromatográfica de la muteína de hNGAL.

El método de purificación se basó en la cola de afinidad Strep-Tag® II del extremo C-terminal (Schmidt et al., supra). En el presente caso se utilizó la muteína de estreptavidina "1" (Patente alemana 196 41 876,3; Voss y Skerra, Protein Eng. 10 (1997), 975-982), que se acopló a sefarosa activada con NHS (Pharmacia) dando lugar a 5 mg/ml de estreptavidina inmovilizada por 1 ml de volumen del lecho de la matriz.

Una columna de cromatografía de 4 ml de volumen de lecho cargada con este material se equilibró con 20 ml de tampón CP a 4ºC a una tasa de flujo de 40 ml/h. La cromatografía se monitorizó midiendo la absorción a 280 nm del eluído en un fotómetro de flujo. Tras la aplicación del extracto de proteína periplasmática, la columna se lavó con tampón CP hasta alcanzar el nivel basal y la muteína hNGAL unida se eluyó posteriormente con 10 ml de una solución de D-destiobiotina 2,5 mM (Sigma) en tampón CP. Las fracciones que contenían la muteína purificada de hNGAL se comprobaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (Fling und Gregerson, supra) y se agruparon. Para obtener concentraciones adecuadas de proteína y unas condiciones de tampón adecuadas para las aplicaciones posteriores se concentraron las agrupaciones de muteína hasta un volumen final de 500 \mul utilizando tubos centricon YM 10 (límite de peso molecular 1000, Millipore) por ultrafiltración y a continuación se dializó contra tampón HBS (NaCl 150 mM, HEPES 10 mM pH 7,4, EDTA 3 mM). Los rendimientos de proteína de RFY-B, RFY-C, y RFY-E fueron de 70 mg, 60 mg y 200 mg respectivamente por litro de cultivo. De este modo, se prepararon tanto la hNGAL original como sus muteínas RFY-B, RFY-C, y RFY-E.

Ejemplo 10 Medición de la afinidad de las muteínas de hNGAL por el péptido de trombospondina en un ELISA

Para la detección de la unión en un ELISA (Ensayo inmunosorbente ligado a enzima), los pocillos de una placa microtitulada (Maxisorb, Nunc) se cargaron con 50 \mul cada uno de una solución de avidina 50 \mug/ml (Fluka) en PBS y se incubó toda la noche a temperatura ambiente (TA). Tras tres lavados con PBST, 50 \mul de una solución 1 \muM de péptido biotinilado de la trombospondina ID de SEC Nº: 18 en PBST se cargaron en los pocillos y se inmovilizó el péptido a través de la formación de complejos entre la biotina y los avidina preadsorbida. Tras una incubación de una hora, la solución se eliminó y los pocillos de la placa microtitulada se lavaron tres veces con PBST. Para saturar los sitios de unión inespecíficos, los pocillos se cargaron con 100 de BSA al 4% p/v en PBST y se incubó durante una hora a TA, seguido de tres lavados con PBST.

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Entonces se preparó un banco de diluciones de las muteínas del Ejemplo 9, empezando en una concentración de 100 nM, y se incubaron 1 hora a TA. Como control de unión inespecífica a la avidina, se aplicó en los pocillos en los que el péptido de la trombospondina se había omitido un banco de diluciones similar de hNGAL y sus muteínas. Tras tres lavados con PBST, se aplicó en los pocillos el anticuerpo Anti-strepII conjugado con HRP (IBA), diluido 1:8000 con PBST. La incubación se llevó a cabo durante 1 hora a TA y se siguió de tres lavados con PBST y dos con PBS.

La detección de las muteínas de hNGAL unidas se consiguió utilizando 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina y H_{2}O_{2} como sustratos para la peroxidasa de rábano picante. Para ello, se cargaron en los pocillos 100 \mul de una solución lista para usar de sustrato de la HRP (Biochem Immunosystems) y la aparición de color se detuvo algunos minutos después añadiendo 100 \mul de ácido sulfúrico 0,3 M. La formación de producto se midió a través de la absorción final a 450 nm en un fotometro SpectraMax 250 (Molecular Devices).

La curva se ajustó mediante regresión no lineal por mínimos cuadrados con la ayuda del programa informático Kaleidagraph (Synergy software), de acuerdo con la ecuación [P \cdot L]= ([P]_{t}[L]_{t})/(K_{D}+[P]_{t}). En la que [P]_{t} es la concentración total de péptido de la trombospondina inmovilizado (en unidades de A_{450}), [L]t es la concentración de la muteína o hNGAL aplicada, respectivamente, [P \cdot L] es la concentración del complejo formada (en unidades de A_{450}), y K_{D} es la constante de disociación aparente.

Las curvas de unión resultantes se muestran en la Fig. 8. Los valores obtenidos para la constante de disociación aparente de los complejos entre las muteínas de hNGAL y el péptido de la trombospondina se resumen en la siguiente tabla:

hNGAL variante	\hskip40mm	K_{D} [nM]
hNGAL:		-*
RFY-B:		4,3 \pm 0,2
RFY-C:		4,6 \pm 0,6
RFY-E:		8,2 \pm 0,8
* actividad de unión no detectable

Ejemplo 11 Medición de la afinidad de las muteínas de hNGAL por el péptido de la trombospondina utilizando RPS

La afinidad de unión de las muteínas de hNGAL al péptido de la trombospondina con ID de SEC Nº: 18 se determinó mediante la técnica de resonancia del plasmón de superficie (RPS) utilizando el sistema BIAcore X (BIACORE). Los primeros 35 \mul del péptido biotinilado de la trombospondina a una concentración de 1 \mug/ml (preparado mediante la mezcla de 1 de una solución de péptido a 200 \mug/ml en DMF con 199 \mul de tampón HBS que contenía NaCl 150 mM, HEPES 10 mM pH 7,4, EDTA 3 mM) se inmovilizaron en la superficie de un canal de flujo de un chip sensor SA recubierto de estreptavidina (BIACORE) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, resultando en una cantidad de alrededor de 400 unidades de respuesta (UR). Las curvas de unión de las muteínas de hNGAL se midieron entonces aplicando 35 \mul de cada muteína purificada del Ejemplo 9 en tampón HBS a concentraciones entre 500 nM y 25 nM utilizando el tampón HBS-EP como tampón de reacción (HBS que contenía surfactante P20 al 0,005% surfactante P20) y a una tasa de flujo continua de 5 \mul/min.

Los valores de resonancia en equilibrio se midieron al final de la fase de inyección por el canal con el péptido de la trombospondina inmovilizado para cada concentración de proteína aplicada. Solo se detectaron efectos negligibles del tampón en el segundo canal del chip sensor, que sirvió como control. Estos valores se representaron directamente frente a la concentración de la muteína de hNGAL.

La curva se ajustó mediante regresión no lineal por mínimos cuadrados con la ayuda del programa informático Kaleidagraph (Synergy software), de acuerdo con la ecuación [P \cdot L]= ([P]_{t}[L]_{t})/(K_{D}+[P]_{t}). En la que [P]_{t} es la concentración total de péptido de la trombospondina inmovilizado (en UR), [L]t es la concentración de la muteína o hNGAL aplicada, respectivamente, [P \cdot L] es la concentración del complejo formada (en UR), y K_{D} es la constante de disociación bajo las condiciones de equilibrado.

Las curvas de unión resultantes se muestran en la Fig. 9. Los valores obtenidos de la constante de disociación de los complejos por medición con RPS entre las muteínas de hNGAL y el péptido de la trombospondina se resumen en la siguiente tabla:

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hNGAL variante	\hskip40mm	K_{D} [nM]
hNGAL:		-*
RFY-B:		105,4 \pm 6,5
RFY-C:		106,1 \pm 15,7
RFY-E:		107,2 \pm 11,4
* actividad de unión no detectable

Ejemplo 12 Selección de muteínas de hNGAL contra la interleucina-8 humana (IL-8)

La citocina humana recombinante interleucina-8 (Baggiolini y Clark-Lewis, FEBS Lett. 397, (1992), 97-101; H_{2}N-AVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRA
ENS-COOH; ID de SEC Nº:29) se conjugó con grupos biotina y se usó como diana para el enriquecimiento por afinidad de la biblioteca de fagémidos que representan las muteínas de hNGAL en presencia de partículas paramagnéticas cubiertas de estreptavidina (Dynal).

El conjugado se preparó mezclando 5,6 nmol (12,5 \mug) de sulfosuccinimidil-2(biotinamido)etil-l,3-ditiopropionato (NHS-SS-Biotina, Pierce) disuelto en 3,4 \mul de H_{2}O con 1,4 nmol (12,5 \mug) de IL-8 humana recombinante (Promocell) disuelta en 50 \mul de H_{2}O, 36,6 \mul de H_{2}O y con 10 \mul de PBS/NaOH concentrado 10x pH 8,5. La mezcla se incubó bajo agitación a temperatura ambiente (TA) durante 1 h. El reactivo en exceso se eliminó del conjugado de IL-8 mediante una columna de filtración en gel de PD-l0 (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando PBS/NaOH pH 8,5 como tampón de trabajo. La IL-8 biotinilada eluída de la columna de PD-10 se ajustó a una concentración final de 1 \muM con el mismo tampón resultando en un volumen total de 1,24 ml. La IL-8 marcada se guardó en alícuotas a -80ºC y se descongeló directamente antes de ser utilizada.

Para el aislamiento de los fagémidos que presentaban una muteína con afinidad para la IL-8, se descongeló una alícuota de los fagémidos precipitados obtenida como en el Ejemplo 7, que se había mantenido a -20ºC para su almacenamiento a largo plazo, y los fagémidos se sedimentaron (20 minutos, 18500 g, 4ºC). Tras descartar el sobrenadante, las partículas de fagémido sedimentadas se disolvieron en 270 \mul de PBS, se incubaron durante 30 minutos en hielo y finalmente se centrifugaron (5 minutos, 18500 g, 4ºC) para eliminar los agregados residuales.

Para enriquecer los fagémidos de unión a IL-8, 30 \mul de una solución de interleucina-8 biotinilada 1 \muM (30 pmol) se mezcló con 270 \mul de los fagémidos en PBS (alrededor de 10^{13} cfu) y se incubó a TA durante 1 h para permitir que ocurriera la formación de complejos entre la citocina y las muteínas presentadas por los fagémidos. Entonces, se añadieron 100 \mul de una solución de BSA al 8% p/v, Tween 20 0,4% v/v en PBS.

Paralelamente a esto, 100 \mul de una suspensión disponible comercialmente de partículas paramagnéticas con estreptavidina (Dynal) se lavaron tres veces con 1 ml de PBS. Hasta ese momento, las partículas se mantuvieron en suspensión durante 1 min por rotación del tubo Eppendorf de 1,5 ml y después se recogieron en la pared del tubo con la ayuda de un imán, y el sobrenadante se eliminó. Para saturar los sitios de unión inespecíficos, se incubaron las partículas paramagnéticas con 1 ml de BSA al 2% p/v en PBST a TA durante 1 h.

Tras eliminar el sobrenadante como anteriormente, la mezcla de IL-8 biotinilado y de fagémidos se añadió a las partículas paramagnéticas, se resuspendieron las partículas y se incubaron a TA durante 10 min. Finalmente, los lugares de unión a biotina libres de estreptavidina se saturaron por adición de 10 \mul de una solución de D-destiobiotina 4 mM (Sigma) en PBS a la mezcla, y se incubó dicha mezcla a TA durante 5 min. Este paso sirvió para evitar que el Strep-tag® II, que forma parte de la proteína de fusión de las muteínas y el fragmento pIII de la proteína de la cubierta del fago, formaran un complejo con la estreptavidina.

Los fagémidos no unidos se eliminaron mediante ocho lavados de 1 min de las partículas paramagnéticas con 1 ml de PBST fresco que contenía D-destiobiotina 1 mM. Cada vez las partículas se recogieron con ayuda de un imán y el sobrenadante se eliminó. Finalmente, los fagémidos unidos se eluyeron en condiciones reductoras mediante la resuspensión de las partículas en 1 ml de PBST que contenía destiobiotina 1 mM y DTT 100 mM. La solución se incubó a 37ºC durante 1 hora para reducir el puente disulfito que contiene la molécula de unión entre la interleucina-8 y la biotina, liberando así los fagémidos unidos específicamente a la IL-8 desde las cuentas.

Con el propósito de amplificarla, esta solución de fagémidos eluídos (1,0 ml, que contenía entre 10^{7} y 10^{8} cfu, en función del ciclo de selección) se calentó brevemente hasta 37ºC, se mezcló con 3 ml de un cultivo en crecimiento exponencial de E. coli XLl-blue (DO_{550} = 0,5 a 37ºC), y se agitó durante 30 minutos a 37ºC a 200 rpm. Las células infectadas se sedimentaron (2 minutos, 4420 g, 4ºC), se resuspendieron en 600 ml de medio de cultivo, y se plaquearon en tres placas de agar con medio LB que contenía 100 mg/ml de ampicilina (LB/Amp; 140 mm de diáme-
tro).

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Tras una incubación de 14 horas a 32ºC, el confluente de células se rascó desde las placas de agar, cada vez con la adición de 10 ml de medio YT/Amp 2x. La suspensión se transfirió a un Erlenmeyer estéril, y se agitó durante 20 minutos a 37ºC, 200 rpm.

Para un nuevo ciclo de producción y enriquecimiento por afinidad de las partículas de fagémido, se inocularon 50 ml de medio YT/Amp 2x precalentado a 37ºC, con entre 0,2 y 1 ml de dicha suspensión de modo que la densidad celular fuera de una DO_{550} = 0,08. Este cultivo se incubó a 37ºC, 160 rpm hasta una densidad celular de DO_{550} = 0,5. Entonces el cultivo se infectó con el fago ayudante VCS-M13 (Stratagene) a una multiplicidad de infección de aproximadamente 10 y se agitó durante 30 minutos más a 37ºC, 160 rpm. Posteriormente se añadió kanamicina (70 \mug/ml), se redujo la temperatura del incubador hasta 26ºC y, tras 10 minutos, se añadió anhidrotetraciclina hasta 25 \mug/l para inducir la expresión génica. La incubación continuó durante otras 15 horas a 26ºC, 160 rpm.

Las células se sedimentaron mediante centrifugación (15 minutos, 12000 g, 4ºC). El sobrenadante que contenía las partículas de fagémido se filtró en condiciones estériles (0,45 \mum), se mezcló con 1/4 de volumen (12,5 ml) de PEG 8000 al 20% p/v, NaCl al 15% p/v, y se incubó durante 1 h en hielo. Tras la centrifugación (20 minutos, 18000 g, 4ºC), las partículas de fagémido se disolvieron en 2 ml de PBS frío. La solución se incubó en hielo durante 30 minutos y se distribuyó en dos recipientes de reacción de 1,5 ml. Tras la centrifugación de los componentes no disueltos (5 minutos, 18500 g, 4ºC), cada sobrenadante se transfirió a un nuevo recipiente de reacción.

Las células se sedimentaron mediante centrifugación (15 minutos, 12000 g, 4ºC). El sobrenadante que contenía las partículas de fagémido se filtró en condiciones estériles (0,45 \mum), se mezcló con 1/4 de volumen (12,5 ml) de PEG 8000 al 20% p/v, NaCl al 15% p/v, y se incubó durante 1 h en hielo. Tras la centrifugación (20 minutos, 18000 g, 4ºC), las partículas de fagémido precipitadas se disolvieron en 2 ml de PBS frío. La solución se incubó en hielo durante 30 minutos y se distribuyó en dos recipientes de reacción de 1,5 ml. Tras la centrifugación de los componentes no disueltos (5 minutos, 18500 g, 4ºC), cada sobrenadante se transfirió a un nuevo recipiente de reacción.

Las partículas de fagémido se reprecipitaron mediante la mezcla con 1/4 de volumen de PEG 8000 al 20% p/v, NaCl al 15% p/v, seguido de incubación durante 60 minutos en hielo. Tras la centrifugación (20 minutos, 18500 g, 4ºC) el sobrenadante se eliminó y las partículas de fagémido precipitadas se disolvieron en 270 \mul de PBS. Tras una incubación de 30 minutos en hielo, la solución se centrifugó (5 minutos, 18500 g, 4ºC) y el sobrenadante se utilizó directa-
mente para el enriquecimiento por afinidad. De este modo se llevaron a cabo cuatro ciclos de selección más con IL-8.

Ejemplo 13 Identificación de muteínas hNGAL que se unen a interleucina-8 por el uso del método "cribaje de colonias"

Para la producción analítica de las muteínas hNGAL como proteínas de fusión con el Strep-Tag® II y el dominio de unión a albúmina como se describe en el Ejemplo 3, el casete génico entre los dos sitos de corte BstXI se subclonó del vector phNGAL12 sobre el phNGAL7.

Para este propósito el fásmido de DNA se aisló de la mezcla de los clones de E. coli obtenidos por infección con los fagémidos del Ejemplo 12, eluídos tras el quinto ciclo de selección, utilizando el equipo Plásmido Midi Kit de (Qiagen). El DNA se cortó con el enzima de restricción BstXI y el pequeño de los dos fragmentos (347 pb) se purificó mediante electroforesis preparativa en gel de agarosa como se describe en el Ejemplo 6. El DNA del vector phNGAL7 se cortó con BstXI y el mayor de los dos fragmentos (3971 pb) se aisló de la misma manera.

Para la ligación, 100 fmol del fragmento pequeño de DNA aislado se mezcló con 100 fmol del fragmento grande de DNA y se incubaron con 1,5 Unidades Weiss de ligasa T4 de DNA (Promega) en un volumen total de 20 \mul (Tris/HCl 30 mM pH 7,8, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM), seguido por la incubación durante la noche a 16ºC. E. coli TG1-F^{-} (E. coli K12 TG1, que ha perdido su episoma por el cultivo repetitivo bajo condiciones no selectivas) se transformó con 4 \mul de esta mezcla de ligación de acuerdo con el método CaCl_{2} (Sambrook et al., supra), obteniendo una suspensión celular de 2,0 ml. La suspensión celular se centrifugó (5000 g, 2 min, 4ºC), se resuspendió en 100 \mul de medio de cultivo, y se plaqueó en una placa de agar que contenía medio LB/Amp y se incubó a 37ºC durante 14 h para determinar la eficiencia de transformación.

Una membrana hidrofílica PVDF (Millipore, tipo GVWP, tamaño de poro 0,22 \mum), marcado en una posición y cortada a medida, se dejó caer sobre la placa de agar de LB/Amp. La suspensión celular de un lote fresco de transformación, que había sido transformado con 5-10 \mul de la mezcla de ligación descrita antes, se centrifugó (5000 g, 2 min, 4ºC), se resuspendió en 100 \mul del medio de cultivo, y se plaqueó uniformemente sobre esta membrana para poder obtener entre 400 y 500 colonias. La placa de agar se incubó durante 7,5 horas a 37ºC hasta que las colonias alcanzaron un tamaño de aproximadamente 0,5 mm.

Mientras tanto, una membrana hidrofóbica (Millipore, Immobilon P, tamaño de poro 0,45 \mum), también se cortó a medida, se humedeció con PBS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El recubrimiento con HSA se logró por agitación durante 4 horas a TA en 10 ml de una solución de HSA 10 mg/ml (Sigma) en PBS. Los sitios de unión restantes en la membrana se saturaron por incubación con 20 ml de BSA al 3% (p/v), Tween-20 al 0,1% (v/v) en PBS durante 2 horas a TA. La membrana se lavó dos veces durante10 minutos con 20 ml de PBS y se sumergió después durante 10 minutos en 10 ml de medio LB/Amp, al que se añadió 200 \mug/l de anhidrotetraciclina.

Finalmente, se marcó en una posición y se dejó caer sobre una placa de cultivo de agar con LB/Amp, que adicionalmente contenía 200 \mug/l de anhidrotetraciclina. La membrana hidrofílica anterior, sobre la que crecieron las colonias, se dejó caer sobre la membrana hidrofóbica de tal forma que las dos marcas quedaran superpuestas. La placa de cultivo se incubó con el conjunto de ambas membranas a 22ºC durante 15 horas. Durante esta fase las muteínas respectivas de hNGAL se secretaron de las colonias sobre la membrana superior y se inmovilizaron mediante su dominio de unión a albúmina mediante el HSA a la membrana inferior.

Tras esto, la membrana superior con las colonias se transfirió a una placa fresca de agar con LB/Amp y se guardó a 4ºC. La membrana hidrofóbica se retiró y se lavó tres veces durante 5 minutos cada vez con 20 ml de PBST.

Para el análisis de la actividad de unión de las muteínas de hNGAL inmovilizadas, la membrana se incubó durante 1 hora en 3,5 ml de una solución de IL-8 digoxigenada 100 nM en PBS.

El conjugado se preparó mezclando 14 nmo1 (9,2 \mug) de éster N-hidroxisuccinimida del ácido digoxigenin-3-O-metilcarbonil-\varepsilon-aminocaproico (DIG-NHS, Roche) disuelto en 2,3 \mul de DMSO con 1,4 nmol (12,5 \mug) de IL-8 recombinante humana (Promocell) disuelto en 50 \mul de H_{2}O, 37,7 \mul de H_{2}O y con 10 \mul 10x de PBS/NaOH pH 8,5 concentrado. La mezcla se incubó bajo agitación a TA durante 1h. El reactivo en exceso se eliminó del conjugado de IL-8 mediante una columna de filtración en gel de PD-10 (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando PBS/NaOH pH 8,5 como tampón de trabajo. La IL-8 digoxigenada eluída de la columna de PD-10 se ajustó a una concentración final de 1 \muM con el mismo tampón resultando en un volumen total de 1,56 ml. La IL-8 marcada se guardó en alícuotas a -80ºC y se descongeló directamente antes de ser utilizada.

La membrana se lavó tres veces con PBST, seguido por una incubación durante 1 hora con 10 ml de Fab anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1:1000 en PBST para la detección de IL-8 unida mediante sus grupos digoxigenina. La membrana se lavó dos veces con PBST y una vez con PBS, cada uno durante 5 minutos, y se agitó durante 10 minutos en tampón AP. Para la reacción cromogénica, la membrana se incubó en 10 ml de tampón AP, al que se le añadió 30 \mul de sal 4-toluidina 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (Roth, disuelto a 50 \mug/ml en dimetilformamida) y 5 \mul de nitro azul de tetrazolio (Roth, dimetilformamida 75 \mug/ml en 70% v/v), hasta reconocer señales de diferente color en las posiciones de algunas de las colonias.

De 200 colonias que aparecieron sobre la membrana 9 dieron lugar a un punto de color intenso sobre la membrana hidrofóbica que fueron cultivadas de la correspondiente membrana hidrofílica. Su plásmido de DNA se aisló y el casete génico de hNGAL se sometió al análisis de secuencia mediante el uso del sistema Genetic Analyzer 310 con el equipo Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y utilizando el cebador de oligodesoxinucleótido ID DE SEC Nº:5.

Los 9 clones presentaron la misma secuencia, indicando que una sola muteína se enriqueció preferentemente durante el proceso de selección. Esta muteína se llamó variante N4.

Las secuencias de nucleótidos del clon N4 se tradujeron en su secuencia de aminoácido y aquellos residuos de aminoácido diferentes de la proteína original de hNGAL se proporcionan en:

Tabla 3. La secuencia de nucleótidos y la secuencia completa de aminoácidos de la muteína N4 también se proporcionan en ID de SEC Nº:30 e ID de SEC Nº: 34.

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TABLA 3 Características de la Secuencia de la muteína de hNGAL N4

6

7

Ejemplo 14 Producción de la muteína N4 de hNGAL

Para la producción preparativa de la muteína N4 de hNGAL obtenida del Ejemplo 13, el casete BstXIse aisló de la variante en phNGAL 7 y se subclonó en el plásmido de expresión phNGAL15 (Fig. 7). El plásmido resultante codifica una proteína de fusión de la muteína N4 con la secuencia señal OmpA en el amino terminal y la cola de afinidad Strep-Tag® II en el carboxi terminal.

Para el subclonaje, el plásmido de DNA phNGAL7 que codifica para la muteína relevante, se cortó con el enzima de restricción BstXI, y el menor de los dos fragmentos (347pb) se purificó por electroforesis preparativa en gel de agarosa como se describe en el Ejemplo 6. De la misma manera, el vector de DNA phNGAL15 se cortó con BstXI, y se aisló el mayor de los dos fragmentos (3398pb).

Se añadieron 1,5 unidades Weiss de la ligase T4 de DNA (Promega) a 50 fmol de cada uno de los dos fragmentos de DNA en un volumen total de 20 \mul (Tris/HCl 30 mM pH 7,8, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM) y se incubó la mezcla para la ligación a 16ºC durante 16 h. 5 \mul de la mezcla de ligación se utilizaron entonces para transformar E. coli JM83 (Yanisch-Perron et al., supra) de acuerdo con el método del CaCl_{2}, obteniendo 2,0 ml de una suspensión celular. 100 \mul de esta suspensión se plaquearon en agar que contenía medio LB/Amp y se incubó a 37ºC durante
14 h.

Se utilizó una sola colonia de los transformantes de E. coli JM83 para inocular 100 ml de medio LB/Amp, seguido por la incubación toda la noche a 30ºC y 200 rpm. Se inocularon entonces 2 l de medio LB/Amp en un frasco Erlenmeyer de 5 l con 40 ml de este precultivo y se agitaron a 22ºC y 200 rpm hasta alcanzar una DO_{550}= 0,5. La expresión de la muteína N4 se indujo por adición de 200 \mug/l de anhidrotetraciclina (200 \mul de una solución de reserva a 2 mg/ml en DMF) y continuó la incubación durante otras 3 horas.

Las células del frasco se centrifugaron (15 minutos, 5571 g, 4ºC) y, tras eliminar el sobrenadante, se resuspendieron en 20 ml de tampón de liberación periplásmica preenfriado (Tris/HCl 100 mM pH 8,0, sacarosa 500 mM, EDTA 1 mM) y se incubó durante 30 minutos en hielo. Los esferoplastos se eliminaron entonces en dos pasos de centrifugación sucesivos (15 minutos, 2988 g, 4ºC y 15 minutos, 25000 g, 4ºC). El sobrenadante que comprende el extracto de proteína periplasmática se dializó con tampón CP (Tris/HCl l0 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM), filtrado en condiciones de esterilidad, y utilizado para la purificación cromatográfica de la muteína hNGAL.

El método de purificación se basó en la cola de afinidad C-terminal Strep-Tag® II (Schmidt et al., supra) empleando Strep-Tactin® Superflow-material (IBA). Se equilibró una columna de cromatografía en lecho de 4 ml cargada con este material, con 20 ml de tampón CP a 4ºC a una tasa de flujo de 2 ml/min. La cromatografía se monitorizó midiendo la absorción a 280 nm en un fotómetro de flujo. Tras la aplicación del extracto de proteína periplasmática (tasa de flujo 0,8 ml/min) la columna se lavó con tampón CP a una tasa de flujo de 2 ml/min hasta alcanzar la línea basal. La muteína de hNGAL unida se eluyó con una solución de D-destiobiotina 2,5 mM (Sigma) en tampón CP a una tasa de flujo de 1 ml/min. Las fracciones (2,5 ml cada una) que contenían la muteína de hNGAL purificada se juntaron y concentraron en un volumen final de aproximadamente 500 \mul utilizando tubos YM 10 centricon (corte de PM 10 kDa, Millipore) y se analizaron en un gel SDS-poliacrilamida al 15% (Fling y Gregerson, supra). Finalmente, el material se esterilizó por filtración (0,22 \mum) y se guardó a 4ºC.

Ejemplo 15 Medición de la afinidad de la muteína N4 de hNGAL para IL-8 en un ensayo ELISA

Para la detección de unión en un experimento ELISA, dos filas (12 pocillos cada una) de una placa microtitulada de 96 (Maxisorb, Nunc) se cubrieron con 50 \mul de una solución de Avidina 50 \mug/ml (Fluka) en PBS durante la noche a 4ºC. Tras lavar tres veces con PBST, una fila se trató con 50 \mul/pocillo de una solución de IL-8 biotinilada 1 \muM en PBST, mientras que la segunda fila se incubó con PBST como control. Tras 1 hora a TA, todos los pocillos se lavaron tres veces con PBST y los sitios inespecíficos de unión se saturaron con 100 \mul de leche en polvo desnatada al 4% p/v en PBST durante 1 hora a TA.

Para determinar el valor K_{D} de la muteína N4 para IL-8, se prepararon unas series de dilución de la proteína N4 del Ejemplo 14 en PBST, partiendo de una concentración de 1 \muM. Como control de unión inespecífica a avidina, se aplicó unas series de dilución similares de la muteína N4 a pocillos donde la IL-8 había sido omitida. Se permitió la formación de complejos durante 1 hora a TA, seguido por tres lavados con PBST y la incubación a TA durante 1 hora con anticuerpo anti-StrepII conjugado con HRP (IBA) diluido 1:8000 en PBST.

La detección de muteína N4 unida se realizó utilizando 3,3',5,5'-tetrametilbencidina y H_{2}O_{2} como sustratos para la peroxidasa de rábano picante. Para este propósito, se cargaron todos los pocillos con 100 \mul de una solución fresca de sustrato de HRP (Biochem Immunosystems). La evolución del color se paró pocos minutos después añadiendo 100 \mul de ácido sulfúrico 0,3 M. La formación de producto se midió mediante absorción final a 450 nm en un fotómetro SpectraMax 250 (Molecular Devices).

La curva se ajustó mediante regresión no lineal por mínimos cuadrados con la ayuda del programa de ordenador Kaleidagraph (Synergy software) de acuerdo con el Ejemplo 10. Las curvas de unión resultantes se describen en la Fig. 10. El valor obtenido para la constante de disociación aparente del complejo entre la muteína N4 de hNGAL y la IL-8 es de 300 \pm 34 nM.

Ejemplo 16 Selección de muteínas hNGAL contra TNF\alpha biotinilado

El Factor de Necrosis Tumoral \alpha humano recombinante (TNF\alpha, ID DE SEC Nº:31, ID DE SEC Nº: 35) se conjugó con grupos biotina y se utilizó como diana para el enriquecimiento de afinidad de la biblioteca de fagémidos representando las muteínas de hNGAL obtenidas como se describe en el Ejemplo 7, en presencia de partículas paramagnéticas recubiertas de estreptavidina (Dynal).

Para la producción de células recombinantes TNF\alpha, se transformaron E. coli BL21 [DE3] con el plásmido de expresión pTNF\alpha, que codifica la citocina TNF\alpha (Wang et al., Science 228 (1985), 149-154) con una cola N-terminal Arg-Gly-Ser-His(6)-Gly(3). La expresión de TNF\alpha se realizó como está descrito por Schmidt y Skerra (Schmidt\cdoty Skerra, J. Chromatogr. 676 (1994), 103-119) excepto que la producción de la citocina recombinante se indujo a 30ºC durante 4 horas. Bajo estas condiciones, el TNF\alpha se acumula como una proteína soluble en el citoplasma y puede liberarse por la siguiente congelación-descongelación del botón celular de 1l de medio de cultivo en 30 ml de tampón de lisis (NaH_{2}PO_{4}/NaOH 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM). El TNF\alpha se purificó de la solución en su forma trimérica (Lohrengel et al., Cytokine 12 (1999), 573-577) empleando a continuación Cromatografía de Afinidad Metal Inmovilizado (IMAC; Porath et al., Nature 258. (l975) 598-599) y cromatografía por exclusión de tamaño. La proporción de proteína fue aproximadamente 1,5 mg por litro de volumen de cultivo.

El conjugado se preparó haciendo reaccionar 40 nmol (24,3 \mug) de NHS-SS-Biotina (Pierce) disuelto en 25 \mul de H_{2}O con 10 nmol (187,7 \mug) de TNF\alpha humana recombinante disuelto en 235 \mul de PBS/NaOH pH 8,5 en un volumen total de 1 ml de PBS/NaOH a pH 8,5. La mezcla se incubó con agitación a temperatura ambiente (TA) durante 1h. El reactivo en exceso se eliminó entonces del conjugado de TNF\alpha mediante una columna de filtración en gel PD-l0 (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con PBS en un tampón de trabajo.

Para el aislamiento de los fagémidos que presentan una muteína con afinidad para el TNF\alpha, se descongeló una alícuota de los fagémidos precipitados obtenida como en el Ejemplo 7, que se mantuvo a -20ºC para almacenar a largo plazo y los fagémidos se sedimentaron (20 minutos, 18500 g, 4ºC). Tras descartar el sobrenadante, las partículas de fagémido sedimentadas se disolvieron en 270 \mul de PBS, se incubaron durante 30 minutos en hielo y finalmente se centrifugaron (5 minutos, 18500 g, 4ºC) para eliminar los agregados residuales.

30 \mul de una solución 1 \muM (30 pmol) de TNF\alpha biotinilado (preparado al mezclar 200 \mul de una solución 2,5 \muM de la citocina biotinilada en PBS con 300 \mul de PBS) se mezcló con 270 \mul de los fagémidos en PBS (alrededor de 10^{13} cfu) y se incubó a TA durante 1 h por lo que se permitió que se formaran los complejos entre la citocina y las muteínas presentadas por los fagémidos. Entonces, se añadieron 100 \mul de una solución de BSA al 8% p/v BSA, 0,4% v/v Tween 20 en PBS.

Paralelo a esto, 100 \mul de una suspensión comercialmente disponible de partículas paramagnéticas recubiertas de estreptavidina (Dynal) se lavó tres veces con 1 ml de PBS. Aquí, las partículas se mantuvieron en suspensión durante 1 min por rotación del recipiente Eppendorf de 1,5 ml y se recogió entonces en a pared del recipiente con la ayuda de un imán, y el sobrenadante se eliminó. Para poder saturar los sitios de unión inespecíficos, las partículas paramagnéticas se incubaron con 1 ml de BSA al 2% (p/v)en PBST a TA durante 1h.

Tras eliminar el sobrenadante como antes, se añadió la mezcla de TNF\alpha biotinilado y los fagémidos a las partículas paramagnéticas, y se resuspendieron las partículas e incubaron a TA durante 10 min. Finalmente, los sitios de unión de biotina libres de estreptavidina se saturaron por adición a la mezcla de 10 \mul de una solución 4 mM de D-destiobiotina (Sigma) en PBS y se incubó dicha mezcla a TA durante 5 min. Este paso sirvió para prevenir la formación de complejos con estreptavidina por parte de Strep-tag® II -como parte de la proteína de fusión de las muteínas y del fragmento de la proteína pIII de la cubierta de fago-.

Los fagémidos no unidos se eliminaron lavando las partículas paramagnéticas ocho veces durante 1 min con 1 ml de PBS fresco que contenía D-destiobiotina 1 mM. Cada vez las partículas se recogieron con la ayuda de un imán y el sobrenadante se eliminó por pipeteo. Finalmente, los fagémidos unidos se eluyeron bajo condiciones de reducción por resuspensión de las partículas en 1 ml de PBST que contenía destiobiotina 1 mM y DTT 100 mM. La solución se incubó a 37ºC durante 1 h para reducir los puentes disulfuro contenidos en la molécula de enlace entre TNF\alpha y la biotina, liberando de esta manera los fagémidos específicamente unidos al TNF\alpha de las cuentas.

Por motivos de amplificación, la solución de fagémido eluída (1,0 ml, que contenía entre 10^{7} y 10^{9} cfu, dependiendo del ciclo de selección) se llevó brevemente a 37ºC, se mezcló con 3 ml de un cultivo en crecimiento exponencial de E. coli XL1-blue (DO_{550}=0,5 a 37ºC), y se agitó a 200 rpm durante 3 minutos a 37ºC. Las células infectadas se sedimentaron (2 minutos, 4420 g, 4ºC), se resuspendieron en 600 \mul de medio de cultivo y se plaquearon en tres placas de agar con medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina (LB/Amp; 140 mm de diámetro).

Tras la incubación durante 14 horas a 32ºC, el confluente de colonias se rascó de las placas de agar, cada una mediante la adición de 10 ml de medio 2xYT/Amp. La suspensión se transfirió a un frasco Erlenmeyer estéril y se agitó durante 20 minutos a 37ºC, 200 rpm.

Durante otro ciclo de producción y enriquecimiento por afinidad de las partículas de fagémido, se inocularon 50 ml de medio 2xYT/Amp precalentado a 37ºC con 0,2 a 1 ml de dicha suspensión por lo que la densidad de células fue de DO_{550}=0,08. Este cultivo se incubó a 37ºC, 160 rpm hasta que se alcanzó una DO_{550}= 0,5. Entonces se infectó el cultivo con el fago ayudante VCS-M13 (Stratagene) en una multiplicidad de infección de aproximadamente 10 y el cultivo se agitó durante 30 minutos más a 37ºC, 160 rpm. A continuación se añadió kanamicina (70 \mug/ml), la temperatura del incubador se bajó a 26ºC y tras 10 minutos, se añadió anhidrotetraciclina a 25 \mug/l para inducir la expresión génica. La incubación continuó durante otras 15 horas a 26ºC, 160 rpm.

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Las células se sedimentaron por centrifugación (15 minutos, 12000 g, 4ºC). El sobrenadante que contenía las partículas de fagémido se filtró en condiciones de esterilidad (0,45 \mum), se mezcló con 1/4 de volumen (12,5 ml) de PEG 8000 al 20% p/v, NaCl al 15% p/v, y se incubó durante 1 h en hielo. Tras la centrifugación (20 minutos. 18000 g, 4ºC) las partículas de fagémido precipitadas se disolvieron en 2 ml de PBS frío. La solución se incubó en hielo durante 30 minutos y se distribuyó en 2 recipientes de reacción de 1,5 ml. Tras la centrifugación; los componentes disueltos (5 minutos, 18500 g, 4ºC) cada sobrenadante se transfirió a un nuevo recipiente de reacción.

Las partículas de fagémido se reprecipitaron al mezclar con 1/4 volumen de PEG 8000 al 20% p/v, NaCl al 15% p/v, seguido por la incubación durante 60 minutos en hielo. Tras la centrifugación (20 minutos, 13500 g, 4ºC) el sobrenadante se eliminó y las partículas de fagémido precipitadas se disolvieron en 270 \mul de PBS. Tras la incubación durante 30 minutos en hielo, la solución se centrifugó (5 minutos, 18500 g, 4ºC) y el sobrenadante se utilizó directamente para el enriquecimiento por afinidad. Se llevaron a cabo cuatro ciclos más de selección con TNF\alpha de este modo.

Ejemplo 17 Identificación de muteínas de hNGAL que se unen al TNF\alpha utilizando el método de "cribaje de colonias"

Para la producción analítica de las muteínas de hNGAL como proteínas de fusión con el Strep-Tag® II y el dominio de unión a albúmina como se describe en el Ejemplo 3, el casete génico entre los dos sitios de escisión BstXI se subclonó a partir del vector phNGAL12 en el phNGAL7.

Para este propósito el fásmido de DNA se aisló de la mezcla de los clones de E. coli obtenida por infección con los fagémidos del Ejemplo 16, eluídos tras el ciclo de selección, utilizando el equipo Plasmid Midi Kit (Qiagen). El DNA se cortó con la enzima de restricción BstXI y el pequeño de los dos fragmentos (347pb) se purificó por electroforesis preparativa en gel de agarosa como se describe en el Ejemplo 6. El DNA del vector phNGAL7 se cortó con BstXI y el mayor de los dos fragmentos (3971pb) se aisló de igual modo.

Para la ligación, 100 fmol del fragmento pequeño de DNA aislado se mezcló con 100 fmol del fragmento grande de DNA y se incubaron con 1,5 unidades Weiss de ligasa T4 de DNA (Promega) en un volumen total de 20 \mul (Tris/HCl 30 mM pH 7,8, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM), seguido por la incubación durante la noche a 16ºC. E. coli TG1-F^{-} (E. coli K12 TG1, que ha perdido su episoma por el cultivo repetitivo bajo condiciones no selectivas) se transformó con 4 \mul de esta mezcla de ligación de acuerdo con el método CaCl_{2} (Sambrook et al., supra), obteniendo una suspensión celular de 2,0 ml. La suspensión celular se centrifugó (5000 g, 2 min, 4ºC), se resuspendió en 100 \mul de medio de cultivo, y se plaqueó en una placa de agar que contenía medio LB/Amp y se incubó a 37ºC durante 14 h para determinar la eficiencia de transformación.

Una membrana hidrofílica PVDF (Millipore, tipo GVWP, tamaño de poro 0,22 \mum), marcado en una posición y cortada a medida, se dejó caer sobre la placa de agar de LB/Amp. La suspensión celular de un lote fresco de transformación, que había sido transformado con 3-6 \mul de la mezcla de ligación descrita antes, se centrifugó (5000 g, 2 min, 4ºC), se resuspendió en 100 \mul del medio de cultivo, y se plaqueó uniformemente sobre esta membrana para poder obtener entre 400 y 500 colonias. La placa de agar se incubó durante 7,5 horas a 37ºC hasta que las colonias alcanzaron un tamaño de aproximadamente 0,5 mm.

Mientras tanto, una membrana hidrofóbica (Millipore, Immobilon P, tamaño de poro 0,45 \mum), también se cortó a medida, se humedeció con PBS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El recubrimiento con HSA se logró por agitación durante 4 horas a TA en 10 ml de una solución de 10 mg/ml HSA (Sigma) en PBS. Los sitios de unión restantes en la membrana se saturaron por incubación con 20 ml de leche desnatada en polvo al 4% (p/v), Tween-20 al 0,1% (v/v) en PBS durante 2 horas a TA. La membrana se lavó dos veces durante 10 minutos con 20 ml de PBS y se sumergió después durante 10 minutos en 10 ml de medio LB/Amp, al que se añadió 200 \mug/l de anhidrotetraci-
clina.

Finalmente, se marcó en una posición y se dejó caer sobre una placa de cultivo de agar con LB/Amp, que adicionalmente contenía 200 \mug/l de anhidrotetraciclina. La membrana hidrofílica anterior, sobre la que crecieron las colonias, se dejó caer sobre la membrana hidrofóbica de tal forma que las dos marcas quedaran superpuestas. La placa de cultivo se incubó con el conjunto de ambas membranas a 22ºC durante 15 horas. Durante esta fase las muteínas respectivas de hNGAL se secretaron de las colonias sobre la membrana superior y se inmovilizaron mediante su dominio de unión a albúmina mediante HSA a la membrana inferior.

Tras esto, la membrana superior con las colonias se transfirió a una placa fresca de agar con LB/Amp y se guardó a 4ºC. La membrana hidrofóbica se retiró y se lavó tres veces durante 5 minutos cada vez con 20 ml de PBST.

Para el análisis de la actividad de unión de las muteínas de hNGAL inmovilizadas, la membrana se incubó durante 1 hora en 3,5 ml de una solución de TNF\alpha en PBST que contenía leche desnatada en polvo al 0,5% p/v.

El conjugado se preparó reaccionando 40 nmol (27,5 \mug) de DIG-NHS (Roche) disuelto en 27 \mul de DMSO con 10 nmol (187,7 \mug) El TNF\alpha se disolvió en 235 \mul de PBS/NaOH pH 8,5 en un volumen total de 1 ml PBS/NaOH pH 8,5. La mezcla se incubó con agitación a temperatura ambiente (TA) durante 1h. El reactivo en exceso se eliminó del conjugado de TNF\alpha mediante una columna de filtración en gel de PD-10 (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando PBS como tampón de trabajo.

La membrana se lavó tres veces con PBST, seguido por una incubación durante 1 hora con 10 ml de Fab anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1:1000 en PBST para la detección de TNF\alpha unida mediante sus grupos digoxigenina. La membrana se lavó dos veces con PBST y una vez con PBS, cada uno durante 5 minutos, y se agitó durante 10 minutos en tampón AP. Para la reacción cromogénica, la membrana se incubó en 10 ml de tampón AP, al que se le añadió 30 \mul de sal 4-toluidina 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (Roth, disuelto a 50 \mug/ml en dimetilformamida) y 5 \mul de nitro azul de tetrazolio (Roth, dimetilformamida 75 \mug/ml en 70% v/v), hasta reconocer señales de diferente color en las posiciones de algunas de las colonias.

De 1800 colonias que aparecieron en las membranas de los muchos experimentos de cribaje de colonias, 14 dieron lugar a puntos de color intenso sobre la membrana hidrofóbica que fueron cultivadas de la correspondiente membrana hidrofílica. Su plásmido de DNA se aisló y el casete génico de hNGAL se sometió al análisis de secuencia mediante el uso del sistema Genetic Analyzer 310 con el equipo Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y utilizando el cebador de oligodesoxinucleótido ID DE SEC
Nº:5.

De estas 14 muteínas, 13 presentaron la misma secuencia, que se denominó TNF-V1, mientras que la decimocuarta secuencia era diferente y se designó TNF-V2.

Las secuencias de nucleótido de los clones TNF-V2 y TNF-V2 se tradujeron en su secuencia de aminoácido y aquellos residuos de aminoácido diferentes de la proteína original de hNGAL se proporcionan en la Tabla 4. Las secuencias de nucleótidos de las muteínas TNF-V1 y TNF-V2 también se proporcionan en ID DE SEC Nº:32 e ID DE SEC Nº: 33, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos completas de estas dos muteínas se proporcionan en ID DE SEC Nº:36 e ID DE SEC Nº: 37, respectivamente.

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TABLA 4 Características de la secuencia de las muteínas TNF-V1 y TNF-V2 de hNGAL

8

9

* La Muteína TNF-V1 carece del residuo isoleucina en la posición 80 debido a una deleción de los nucleótidos 238 a 240.

Ejemplo 18 Confirmación de la actividad de unión de las muteínas seleccionadas de hNGAL para TNF\alpha utilizando el "ensayo de punteado de colonias"

El ensayo de punteado de colonias se llevó a cabo de una forma similar al ensayo de cribaje de colonias del Ejemplo 17 excepto que las colonias sencillas de E. coli portadoras de los correspondientes plásmidos de expresión se puntearon a partir de una placa maestra sobre la membrana hidrofílica -marcada con una cuadrícula- en lugar de plaquear una suspensión de células transformadas. Cada clon se punteó con un palillo de dientes estéril cuatro o cinco veces sobre la membrana hidrofílica (Millipore, tipo GVWP, tamaño de poro 0,22 \mum) que se colocaron obre una placa de cultivo con agar LB/Amp. Las células crecieron a 37ºC durante 5 horas.

Mientras tanto, la membrana hidrofóbica (Millipore, Immobilon P, tamaño de poro 0,45 \mum), se humedeció con PBS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El recubrimiento con HSA se logró por agitación durante 4 horas a TA en 10 ml de una solución de 10 mg/ml HSA (Sigma) en PBS. Los sitios de unión restantes en la membrana se saturaron por incubación con 20 m de BSA al 3% (p/v), Tween-20 al 0,1% (v/v) en PBS durante 2 horas a TA. La membrana se lavó dos veces durante10 minutos con 20 ml de PBS y se sumergió después durante 10 minutos en 10 ml de medio LB/Amp, al que se añadió 200 \mug/l de anhidrotetraciclina.

Finalmente, se marcó en una posición y se dejó caer sobre una placa de cultivo de agar con LB/Amp, que adicionalmente contenía 200 \mug/l de anhidrotetraciclina. La membrana hidrofílica anterior, sobre la que crecieron las colonias, se dejó caer sobre la membrana hidrofóbica de tal forma que las dos marcas quedaran superpuestas. La placa de cultivo se incubó con el conjunto de ambas membranas a 22ºC durante 15 horas. Durante esta fase las muteínas respectivas de hNGAL se secretaron de las colonias sobre la membrana superior y se inmovilizaron mediante su dominio de unión a albúmina mediante HSA a la membrana inferior.

Tras esto, la membrana superior con las colonias se transfirió a una placa fresca de agar con LB/Amp y se guardó a 4ºC. La membrana hidrofóbica se retiró y se lavó tres veces durante 5 minutos cada vez con 20 ml de PBST.

Para confirmar la actividad de unión de las muteínas punteadas hacia TNF\alpha, la membrana se incubó entonces durante 1 hora en 3,5 ml de una solución de 100 nM de TNF\alpha digoxigenado en PBST que contenía leche desnatada en polvo al 0,5% p/v (una solución de reserva de TNF\alpha digoxigenado 1,5 \muM en PBS se diluyó por tanto a 1:15 en PBST que contenía leche desnatada en polvo).

La membrana se lavó tres veces con PBST, seguido por una incubación durante 1 hora con 10 ml de Fab anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1:1000 en PBST para la detección de TNF\alpha unida mediante sus grupos digoxigenina. La membrana se lavó dos veces con PBST y una vez con PBS, cada uno durante 5 minutos, y se agitó durante 10 minutos en tampón AP. Para la reacción cromogénica, la membrana se incubó en 10 ml de tampón AP, al que se le añadió 30 \mul de sal 4-toluidina 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (Roth, disuelto a 50 \mug/ml en dimetilformamida) y 5 \mul de nitro azul de tetrazolio (Roth, dimetilformamida 75 \mug/ml en 70% v/v). Se pudieron reconocer señales de diferente color en las posiciones en que las muteínas TNF-V1 y TNF-V2 estaban punteadas, mientras que no se pudo observar señal de unión en hNGAL salvaje (codificado por phNGAL7), ni en la proteína de unión a bilina (codificada por el vector pBBP22; Schlehuber et al. J. Mol. Biol. 297 (2000), 1105-1120), ni en dos muteínas no relacionadas de la biblioteca de muteínas de hNGAL descritas en el Ejemplo 6 (ambas subclonadas en phNGAL7), ni para el clon que no expresa proteína (portador del plásmido pBluescript (Stratagene)), confirmando así la actividad de unión de TNF-V1 y TNF-V2 hacia TNF\alpha (Fig. 12).

<110> Pieris Proteolab AG

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Muteínas de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana y proteínas relacionadas

\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/EP01/11213

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2001-09-27

\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/EP02/04223

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2002-04-16

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20) ... (22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n: a, g, c o t; k: g o t

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26) ... (28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n: a, g, c o t; k: g o t

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (32) ... (34)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n: a, g, c o t; k: g o t

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (38) .... (43)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n: a, g, c o t; k: g o t

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (47) ... (52)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n: a, g, c o t; k: g o t

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30) ... (32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n: a, g, c o t; m: a o c

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (36) ... (38)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n: a, g, c o t; m: a o c

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (48) ... (53)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n: a, g, c o t; m: a o c

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (56) ... (59)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n: a, g, c o t; m: a o c

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (53) ... (61)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n: a, g, c o t; k: g o t

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31) ... (34)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n: a, g, c o t; m: a o c

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (37) ... (40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n: a, g, c o t; m: a o c

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (44) ... (49)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n: a, g, c o t; k: g o t

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (52) ... (54)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n: a, g, c o t; k: g o t

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctttagttc cgaagccagc tccttggttc tcccgtaga

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1231

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22) ... (84)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (85) ... (1221)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de fusión de la hNGAL modificada, la Strep-tag II y el fragmento de la del fago

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (85) ... (618)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hNGAL madura

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (619) ... (648)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cola de afinidad Strep-tag II

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (649) ... (651)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Codón de parada ámbar

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (652) ... (1221)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácidos 217-406 de la proteína pIII de la cubierta

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1231

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22) ... (84)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (85) ... (1221)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de fusión de la hNGAL modificada, la Strep-tag II y el fragmento de la proteína pIII de la cubierta del fago

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (85) ... (618)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hNGAL madura

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (619) ... (648)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cola de afinidad Strep-tag II

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (649) ... (651)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Codón de parada ámbar

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (652) ... (1221)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácidos 217-406 de la proteína pIII de la cubierta

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 805

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22) ... (84)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (85) ... (795)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de fusión de la hNGAL modificada, la Strep-tag II y el fragmento de la proteína pIII de la cubierta del fago

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (85) ... (618)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hNGAL madura

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (619) ... (648)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cola de afinidad Strep-tag II

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (649) ... (795)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dominio de unión a la albúmina de la proteína G

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 580

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22) ... (84)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (85) ... (570)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de fusión de la Lipocalina lagrimar humana modificada y la Strep-tag II

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (85) ... (543)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lipocalina lagrimar humana madura

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (544) ... (570)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cola de afinidad Strep-tag II

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

23

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccactcccta tcagtgat

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 537

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (537)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Muteína Tlpca

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 400

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (-21) ... (-1)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cadena

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (379)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de fusión de la hNGAL modificada, la Strep-tag II y el fragmento de la proteína pIII de la cubierta del fago

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (178)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hNGAL madura

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (179) ... (188)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cola de afinidad Strep-tag II

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (189)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Codón de parada ámbar

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (190) ... (379)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácidos 217-406 de la proteína pIII de la cubierta

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 400

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (-21) ... (-1)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cadena

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (379)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de fusión de la hNGAL modificada, la Strep-tag II y el fragmento de la proteína pIII de la cubierta del fago

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (178)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hNGAL madura

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (179) ... (188)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cola de afinidad Strep-tag II

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (189)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Codón de parada ámbar

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (190) ... (379)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácidos 217-406 de la proteína pIII de la cubierta

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

29

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (-21) ... (-1)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cadena

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (237)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de fusión de la hNGAL modificada, la Strep-tag II y el dominio de unión a la albúmina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (178)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hNGAL madura

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (179) ... (188)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cola de afinidad Strep-tag II

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (189) ... (237)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dominio de unión a la albúmina de la proteína G

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

32

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (-21) ... (-1)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cadena

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de fusión de la Lipocalina lagrimar humana modificada y la Strep-tag II

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (152)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lipocalina lagrimar humana madura

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (153) ... (162)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cola de afinidad Strep-tag II

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

33

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (178)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Muteína Tlpca

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

35

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de la trombospondina 1 humana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Res MOD

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> biotinilación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Aca Aca Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1231

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22) ... (84)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (85) ... (1221)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de fusión de la hNGAL modificada, la Strep-tag II y el fragmento de la proteína pIII de la cubierta del fago

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (85) ... (618)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hNGAL madura

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (619) ... (648)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cola de afinidad Strep-tag II

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (649) ... (651)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Codón de parada ámbar

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (652) ... (1221)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácidos 217-406 de la proteína pIII de la cubierta

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

37

38

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 400

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (-21) ... (-1)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cadena

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (379)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de fusión de la hNGAL modificada, la Strep-tag II y el fragmento de la proteína pIII de la cubierta del fago

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (178)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hNGAL madura

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (179) ... (188)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cola de afinidad Strep-tag II

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (189)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Codón de parada ámbar

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (190) ... (379)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácidos 217-406 de la proteína pIII de la cubierta

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 658

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22) ... (84)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (85) ... (648)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de fusión de la hNGAL modificada y la Strep-tag II

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (85) ... (618)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hNGAL madura

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (619) ... (648)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cola de afinidad Strep-tag II

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

42

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (-21) ... (-1)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cadena

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (188)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de fusión de la hNGAL modificada y la Strep-tag II

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (178)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hNGAL madura modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (179) ... (188)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cola de afinidad Strep-tag II

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

44

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 534

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (534)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Muteína RFY-B

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (178)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Muteína RFY-B

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 534

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (534)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Muteína RFY-C

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (178)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Muteína RFY-C

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

51

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 534

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (534)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Muteína RFY-E

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

53

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (178)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Muteína RFY-E

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (77)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Interleucina-8 humana recombinante

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 534

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (534)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Muteína N4

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

57

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 522

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4) ... (513)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de fusión entre el factor de necrosis tumoral \alpha y la cola de afinidad

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4) ... (42)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cola de afinidad Arg-Gly-Ser-His(6)-Gly(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (43) ... (513)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Factor de necrosis tumoral \alpha maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

58

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 534

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (534)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Muteína TNF-V1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

61

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 534

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (534)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Muteína TNF-V2

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

62

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (178)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Muteína N4

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

64

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cadena

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) ... (170)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína de fusión entre el factor de necrosis tumoral \alpha y la cola de afinidad

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<220>

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<221>

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<222> (1) ... (13)

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<223> Cola de afinidad Arg-Gly-Ser-His(6)-Gly(3)

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<220>

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<221>

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<222> (14) ... (170)

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<223> Factor de necrosis tumoral \alpha maduro

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<400> 35

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66

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<210> 36

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<211> 178

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<221>

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<222> (1) ... (178)

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<223> Muteína TNF-V1

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<400> 36

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67

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<210> 37

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<211> 178

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<221>

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<222> (1) ... (178)

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<223> Muteína tnf-v2

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<400> 37

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68

Claims (16)

1. El método para generar una muteína de una proteína seleccionada del grupo consistente en la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana (hNGAL), la proteína relacionada con la \alpha,2-microglobulina de rata (A2m) y la 24p3/uterocalina de ratón (24p3), teniendo dicha muteína afinidad detectable por una diana determinada, que comprenda el paso (a) de:

Someter la proteína a mutagénesis en una o más de las posiciones de secuencia que corresponden a las posiciones de secuencia de la 40 a la 50, de la 70 a la 79, de la 101 a la 103 y de la 125 a la 132 de la hNGAL, lo que resulta en una o más muteína(s) de la proteína.

2. El método de la reivindicación 1 que además comprenda el paso (b) de:

Enriquecer al menos una de las muteínas resultantes con afinidad de unión para una diana determinada de entre una o más muteínas mediante selección y/o aislamiento de al menos dicha muteína.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la mutagénesis del paso (a) resulta en una pluralidad de muteínas de la proteína.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, en el que la proteína se somete a mutagénesis en una o más de las posiciones de secuencia que corresponden a las posiciones de secuencia 40, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 70, 72, 73, 77, 79, 101, 102, 103, 125, 127, 128, 130 y 132 de la hNGAL.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, en el que un ácido nucleico que codifica una o más muteína(s) de la proteína, siendo este ácido nucleico resultado de la mutagénesis, se fusiona funcionalmente en el extremo 3' con un gen codificante de una proteína pIII de la cubierta de un bacteriófago filamentoso de la familia del M13 o para un fragmento de esta proteína de la cubierta, para seleccionar al menos una muteína para la unión de la diana determinada.

6. La muteína derivada de la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana (hNGAL), de la proteína relacionada con la \alpha,2-microglobulina de rata (A2m) o la 24p3/uterocalina de ratón (24p3), en la que la muteína comprenda una mutación en una o más de las posiciones de secuencia que corresponden a las posiciones de secuencia de la 40 a la 50, de la 70 a la 79, de la 101 a la 103 y de la 125 a la 132 de la hNGAL, y en la que la muteína tenga afinidad de unión detectable por una diana determinada.

7. La muteína de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la muteína comprenda una mutación en una o más de las posiciones de secuencia que corresponden a las posiciones de secuencia 40, 42, 44, 47, 49, 50, 70, 72, 73, 77, 79, 101, 102, 103, 125, 127, 128, 130 y 132 de la hNGAL.

8. La muteína de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7, en la que la Cys87 se sustituye y/o en la que la muteína muestra una o más de las sustituciones aminoacídicas Glu28 \rightarrow His, Thr145 \rightarrow Ala comparado con la hNGAL.

9. La muteína de la hNGAL de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7, que tiene la secuencia aminoacídica ID de SEC Nº: 17, ID de SEC Nº: 24, ID de SEC Nº: 26 o ID de SEC Nº: 28.

10. La muteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 9, que esté conjugado con un marcaje seleccionado del grupo consistente en una molécula orgánica, un marcaje enzimático, un marcaje radiactivo, un marcaje fluorescente, un marcaje cromogénico, un marcaje luminiscente, un hapteno, digoxigenina, biotina, complejos metálicos, metales, y oro coloidal.

11. La proteína de fusión que comprende una muteína de la hNGAL, la A2m o la 24p3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 10, en la que una enzima, una proteína o el dominio de una proteína, un péptido, una secuencia señal y/o una cola de afinidad se fusionen funcionalmente al extremo amino-terminal o carboxi-terminal de la muteína.

12. La molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una muteína de hNGAL, A2m o 24p3 o una proteína de fusión de las mismas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 11.

13. La composición farmacéutica que comprenda una muteína de hNGAL, A2m o 24p3 o una proteína de fusión de las mismas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 11 y un transportador farmacológicamente aceptable.

14. El método para producir una muteína de hNGAL, A2m o 24p3 o una proteína de fusión de las mismas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 11, en el que la muteína o proteína de fusión de la misma se produce a partir del ácido nucleico que codifica la muteína mediante métodos de ingeniería genética en un organismo huésped bacteriano o eucariota, y se aisla de este organismo huésped o de su cultivo.

15. La utilización de una muteína de hNGAL, A2m o 24p3 o una proteína de fusión de las mismas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 11, para la detección de una diana determinada, que comprenda los pasos de unir la muteína con una muestra en la que se sospecha que contiene la diana determinada en condiciones adecuadas, permitir que se forme un complejo entre la muteína y dicha diana, y determinar mediante una señal adecuada la muteína que ha formado complejos.

16. La utilización de la reivindicación 15, en la que la diana determinada es una proteína o dominio de proteína, un péptido, una molécula de ácido nucléico, una molécula orgánica o un complejo metálico y la detección se lleva a cabo para la validación de la diana como diana de un fármaco.