CN110072877A - 具有钛结合能力的肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有特异性结合钛表面能力的肽。将根据本发明的钛结合肽牢固地固定到钛表面上，从而可以长时间稳定地保持与该肽连接的生理活性物质的活性。因此，该肽可以有效地用于手术再生疗法。

Description

具有钛结合能力的肽
技术领域
本发明涉及钛结合肽，更具体地涉及具有与钛表面特异性结合能力的肽，其中该肽作为钛和生理活性物质之间的接头起作用以将该生理活性物质牢固地固定到钛表面上，以便使该生理活性物质的活性能够长时间保持。
背景技术
牙科植入物是替换缺失牙齿的人造牙齿，并且广泛用于实现缺失牙齿的功能性和美学修复。与通过牙周韧带(periodontal ligament)附着于牙槽骨的天然牙齿相比，牙科植入物的特征在于人造牙根直接附着于骨。
通过植入物与周围骨的接触在放置的同时物理地固定牙科植入物，并且放置后通过在植入物周围形成新的骨组织并与周围的骨进行骨整合来生物学地固定该牙科植入物。然而，在老年患者中，由于骨量不足或骨质量降低，可能难以确保初始稳定性，该稳定性在骨整合中是重要的。在这种情况下，可能会出现植入物的早期失效。同时，即使在除了骨量不足和骨质量降低的老年患者外的一般成年患者中，生物因子的应用对于植入物放置后的初始植入和缩短治疗期是必要的。
用于牙科植入物的材料可以大致分为金属、陶瓷和聚合物。目前，大多数牙科植入物由工业纯钛(cpTi)或钛合金制成。目前，用于改性植入物表面的各种方法用于改善由钛或其合金制成的植入物与骨之间的界面。具体而言，已经对第五代植入技术进行了研究，其中将有助于骨形成的生物或生化颗粒或组分添加到喷砂大颗粒酸蚀(sandblasted,large-grit and acid-etched，SLA)表面以便缩短植入物的骨整合时间。此外，已经对其中促进成骨响应的生长因子(如蛋白质)附着于植入物表面的技术进行了基于组织工程的研究。在由磷灰石制成的植入物的情况下，已经对磷灰石与生理活性蛋白质(如细胞外基质蛋白、骨形态发生蛋白或组织生长因子)一起使用进行了研究。此外，生物材料和生理活性物质已经组合使用，或者已经开发并商业使用包含涂覆在生物材料表面上的物质的产品，例如GEM21S(含有PDGF)或INFUSE(含有BMP-2)。然而，在这种情况下，存在的问题是，当这些植入物置于体内时，生理活性物质容易释放而不能牢固地固定到生物材料表面上，并且在严重的情况下，它会因暴露于全身血液而降解，因此可能降低其生理活性，并且可能出现靶标组织以外组织的不良反应。另外，在由钛或其合金制成的植入物的情况下，已经进行了基于表面改性和生理活性物质的各种研究，在稳定性方面仍存在问题，包括可能的表面剥离。因此，对于用植入物进行组织再生，需要将生理活性物质牢固地固定到生物材料表面上，以便可以长时间保持其有效活性。
因此，本发明人为解决现有技术中出现的上述问题做出了广泛的努力，结果，已鉴定出对植入物表面具有强结合亲和力的短肽序列，并且已发现该肽容易结合到钛植入物的表面并保持稳定状态，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供一种由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的钛结合肽。
本发明的另一个目的是提供一种包含与该钛结合肽连接的生理活性肽或蛋白质的肽缀合物。
本发明的仍另一个目的是提供一种包含该钛结合肽或该肽缀合物的生物材料。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了一种由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的钛结合肽。
本发明还提供了一种包含与该钛结合肽连接的生理活性肽或蛋白质的肽缀合物。
本发明还提供了一种包含该钛结合肽或该肽缀合物的生物材料。
附图说明
图1显示了使用亲和素-生物素复合物进行的结合测定的结果，以便检查钛结合肽(SEQ ID NO:1)、对照TBP-C肽(SEQ ID NO:2)和对照氧化锆结合肽(SEQ ID NO:5)对钛的结合亲和力。
图2显示了使用增强化学发光(ECL)溶液作为取代底物进行的发光图像分析的结果，以在视觉上证明使用亲和素-生物素复合物的结合测定的结果，以便检查钛结合肽(SEQID NO:1)、对照TBP-C肽(SEQ ID NO:2)和对照氧化锆结合肽(SEQ ID NO:5)对钛的结合亲和力。
图3显示了使用亲和素-生物素复合物进行的结合测定的结果，以便确定钛结合肽(SEQ ID NO:1)与钛盘表面的最大结合。
图4显示了以对数刻度表示图3的X轴的结果。
图5显示了进行的细胞活力测试的结果，以评估给予这些肽后，钛结合肽(SEQ IDNO:1)、与钛结合肽连接的成骨肽(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4)和成骨肽(SEQ ID NO:6)的细胞毒性。
图6显示了评估牙周韧带干细胞(PDLSC)中ALP活性持续18天的结果，以便检查当给予一次这些肽时，钛结合肽(SEQ ID NO:1)、与钛结合肽连接的成骨肽(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4)和成骨肽(SEQ ID NO:6)中的每一种的成骨分化诱导活性和负载。
图7显示了在图6中所示的结果中培养第10天的ALP活性。
图8显示了评估牙周韧带干细胞(PDLSC)的矿化持续18天的结果，以便检查当给予一次这些肽时，钛结合肽(SEQ ID NO:1)、与钛结合肽连接的成骨肽(SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4)和成骨肽(SEQ ID NO:6)中的每一种的成骨分化诱导活性和负载。
具体实施方式
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。通常，本文所用的命名法和下面所述的实验方法是本领域公知且常用的那些。
在本发明中，为了通过使用能够不经化学修饰地结合到钛植入物表面的肽接头牢固地固定生理活性物质以使其活性能够长时间保持，通过噬菌体展示技术鉴定了对钛植入物表面具有结合亲和力的肽序列，并且发现该肽能以稳定固定的状态存在于钛表面上。
因此，在一方面，本发明涉及由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的钛结合肽、由SEQID NO:1的氨基酸序列表示的钛结合肽的用途、以及使用由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的肽将生理活性物质附着于钛的方法。
在本发明中，该钛结合肽优选不经化学修饰地结合到用作生物材料的钛，但不限于此。
在又另一方面，本发明涉及包含与该钛结合肽连接的生理活性肽或蛋白质的肽缀合物。在另一方面，本发明涉及肽缀合物用于改善生理活性的用途，该肽缀合物包含与该钛结合肽连接的生理活性肽或蛋白质。在仍另一方面，本发明涉及使用肽缀合物改善生理活性的方法，该肽缀合物包含与该钛结合肽连接的生理活性肽或蛋白质。例如，生理活性的改善可以包括骨再生能力的改善，但不限于此。
在本发明中，可以使用肽合成仪化学地合成该钛结合肽和该生理活性肽的缀合物。具体地，可以将生理活性结构域依次化学地连接到该钛结合肽的C末端或N末端，从而合成钛结合肽-生理活性肽(例如成骨分化诱导序列)缀合物，该缀合物由N末端-钛结合肽-生理活性结构域-C末端或N末端-生理活性结构域-钛结合肽-C末端组成。
该生理活性肽结构域是具有植入物放置所需的成骨分化诱导活性或抗炎活性并且在体外或体内调节基因表达和生理功能的物质。当参与体内功能调节的物质缺乏或出现由过度分泌引起的异常病理时，此生理活性肽结构域可以充当控制剂。考虑到其体内稳定性，它可以呈L形式或D形式。
在本发明中，该生理活性肽优选选自下组，该组由抗炎、抗微生物、细胞粘附、骨组织再生和细胞迁移功能肽组成，但不限于此。
在本发明中，该生理活性蛋白优选选自下组，该组由组织再生因子、组织生长因子、细胞内转录因子、细胞外基质蛋白和抗炎蛋白组成，但不限于此。
在本发明中，该钛结合肽与生理活性肽或低分子量物质的缀合物可以通过使用交联剂诱导化学键合来形成。如果使用交联剂诱导化学键合，则将容易通过该交联剂形成缀合物，因为该钛结合肽的N末端具有游离氨基。
可用于本发明的交联剂的例子包括但不限于1,4-双马来酰亚胺基丁烷(BMB)、1,11-双马来酰亚胺基四乙二醇(BM[PEO]4)、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸酯]](SMCC)及其磺酸酯(磺基-SMCC)、6-[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯(SPDP)及其磺酸酯(磺基-SPDP)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)及其磺酸酯(磺基-MBS)以及[4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯](SMPB)及其磺酸酯(磺基-SMPB)。
在本发明中，该肽缀合物可以由SEQ ID NO:3或4的氨基酸序列表示，但不限于此。
在本发明中，可以通过接头将该钛结合肽和该生理活性蛋白或肽彼此连接。该接头可以是提供这样的空间的任何接头，使得该钛结合肽和该生理活性蛋白或肽可以形成功能结构。例如，该接头可以表示天然和/或合成起源的肽接头。天然和/或合成起源的肽接头可以具有由1至50个氨基酸组成的氨基酸链，并且可以含有天然存在的多肽(如具有铰链功能的多肽)的重复氨基酸序列。在另一个实施方案中，该肽接头的氨基酸序列可以是“合成的肽接头氨基酸序列”，其被指定为富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基。这些残基例如以最多5个氨基酸的小重复单元排列。可以重复几次这种小重复单元以形成多聚体单元。在该多聚体单元的氨基末端和/或羧基末端，可以添加多达6个额外的任意天然存在的氨基酸。其他合成肽接头可以由重复10至20次之间的单个氨基酸组成。在氨基末端和/或羧基末端中的每一个，可以存在多达6个额外的任意天然存在的氨基酸。同时，该接头可以是化学修饰形式。例如，该接头能以Fmoc-6-氨基己酸(Fmoc-ε-Acp-OH)的形式使用，其具有与其偶联的封闭基团Fmoc-(9-芴基甲氧基羰基)，但不限于此。
在又另一方面，本发明涉及包含该钛结合肽或该肽缀合物的生物材料。
在本发明中，该生物材料可以为选自下组的任何一种，该组由钛涂覆的金属、含钛金属、钛涂覆的天然聚合物、与钛混合的天然聚合物、钛涂覆的合成聚合物、与钛混合的合成聚合物和由钛制成的用于体内植入的植入物组成，但不限于此。
如本文所用，术语“植入物”是指用于通过额外的手术(如骨移植术或牵引成骨术)将生物相容性材料植入缺陷区域，从而恢复缺陷区域功能的手术材料或程序。在骨整合后，缺陷区域进入规则的再生阶段，骨整合是放置的植入物体表面与保持正常功能的周围组织的生理、形态和直接结合。
如本文所用，术语“钛”通常是指工业纯钛(cpTi)或钛合金。钛具有非常高的耐腐蚀性，因为在其表面上天然形成了氧化钛(TiO2)膜。已知该氧化钛膜具有约3-10nm的厚度，并且此膜的存在诱导适当的骨整合。另外，该氧化钛膜的优点在于即使在不利条件(如口内条件)下也能稳定且天然地形成。
与目前使用的氧化锆陶瓷植入物相比，钛植入物能以更多样化的方式进行表面改性。例如，喷砂技术是基于细砂颗粒的高速轰击的加工方法，并且即使当使用除砂之外的金属颗粒时，也可以使用术语“喷砂”。对于钛，此项技术用于通过用氧化铝颗粒轰击氧化钛在钛植入物的表面上形成多孔层。通过各种表面改性方法处理表面可以增加骨细胞与钛植入物表面的粘附。这可能影响植入物的初始稳定性。
在本发明中，该钛优选是通过向纯氧化钛添加5-7wt％的铝、3-5wt％的钒、0-0.25wt％的铁和0-0.2wt％的氧而获得的合金，但不限于此。
在本发明中，该天然聚合物优选为选自下组的任何一种，该组由胶原蛋白、海藻酸、丙二醇、海藻酸、硫酸软骨素和壳聚糖组成，但不限于此。另外，该合成聚合物优选为选自下组的任何一种，该组由聚乳酸乙醇酸、泊洛沙姆和丙二醇组成，但不限于此。
当将钛涂覆的金属、含钛金属、钛涂覆的天然聚合物、与钛混合的天然聚合物、钛涂覆的合成聚合物、与钛混合的合成聚合物和由钛制成的用于体内植入的植入物植入体内时，生理活性物质可以与该肽共价键合，而不诱导化学键合，因此它能以稳定状态存在，同时可以保持其活性。也就是，将促进植入物周围的骨组织再生相关细胞的迁移、增殖和分化，最终可以在短时间内发生有效的组织再生效果，从而可以缩短治疗时间。另外，可以减少由于植入物表面上的不稳定键而可能诱导的全身或其他组织的副作用。因此，该植入物可用于手术再生治疗。
在本发明中，另外使用称为“消减淘选(subtractive panning)”的新噬菌体展示技术来排除选择与钛盘表面以外的材料结合的序列的可能性。
如本文所用，术语“消减淘选”是指可用于鉴定与特定材料结合而不与其他特定材料结合的序列的噬菌体展示技术。在消减淘选技术中，将噬菌体文库施加到不希望结合的材料，然后仅回收未结合的噬菌体，之后将该噬菌体再次施加到希望结合的材料，然后丢弃未结合的噬菌体，仅回收结合的噬菌体(Munirathinam,Gnanasekar等人,Novel PhageDisplay-Based Subtrative Screening To Identify Vaccine Candidates of Brugiamalayi,Infect Immun.,72:4707-4715,2004)。
实施例
在下文中，将参考实施例进一步详细描述本发明。对于本领域普通技术人员将显而易见的是，这些实施例仅用于说明目的，而不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1：通过噬菌体展示鉴定钛结合肽序列
为了鉴定结合到钛盘表面的特异性肽序列，使用噬菌体展示技术。将具有高度多样性和复杂性的随机肽文库标记的M13噬菌体施加到钛盘表面，之后洗掉未结合的噬菌体，并且仅回收结合的噬菌体。重复这些程序几次。应用消减淘选程序，分析编码与最终获得的噬菌体结合的肽的DNA序列，从而鉴定钛结合肽序列。消减淘选是可用于鉴定与特定材料结合而不与其他特定材料结合的序列的新噬菌体展示技术。
在这个实施例中，聚苯乙烯板孔用于通过噬菌体展示鉴定钛结合肽，因而此项技术应用于排除不与钛盘表面结合但与聚苯乙烯板结合的序列。
更具体地，在完成上述常规噬菌体展示的重复循环后，再次扩增所得噬菌体并将其添加到聚苯乙烯板的空孔中，然后回收未结合到孔表面的噬菌体。然后，将未与聚苯乙烯板结合的回收噬菌体再次结合到钛盘表面，然后用洗涤缓冲液强烈洗涤，并且最终仅回收结合到钛盘表面的剩余噬菌体。
所用的噬菌体展示试剂盒是购自New England Biolabs(美国)的Ph.D.-12噬菌体展示试剂盒。将使用试剂盒提供的由12个氨基酸组成的随机肽文库标记的试剂盒噬菌体筛选的17个最终克隆以大肠杆菌(E.coli)培养状态送至Cosmogenetech有限公司(韩国)以分析其序列。
结果，如表1所示，显示14个克隆具有相同的DNA序列。通过翻译DNA序列，可以获得由12个氨基酸残基组成的最终肽序列(SLNYTGHRPVVH：SEQ ID NO:1；钛结合肽)作为TBP(钛结合序列)。由于肽序列很可能是特异性结合到钛盘表面的序列，因此选择该肽序列作为与钛盘表面特异性结合的候选肽序列。在剩余的3个克隆中，将2个克隆翻译成由8个氨基酸残基组成的肽序列，并且将1个克隆翻译成由12个氨基酸残基组成的肽序列，但是排除了此肽序列，因为短接头序列(3个氨基酸)被鉴定为在使用试剂盒进行筛选过程中不能被检测到的序列。
表1
据揭示，克隆#16具有错误的短接头序列(GRG)而不是正确序列(GGG)，该正确序列未在此表中呈现。
实施例2：钛结合肽的合成
使用合成仪通过F-moc固相合成方法从C末端到N末端合成TBP肽(SLNYTGHRPVVH：SEQ ID NO:1；钛结合肽)或TBP-C肽(VSAAGTKASPAV；SEQ ID NO:2；钛结合肽对照)。具体地，使用具有Fmoc-(9-芴基甲氧基羰基)作为与其连接的封闭基团的Rink树脂(0.075mmol/g，100-200目，1％DVB交联)合成肽。将50mg Rink树脂置于合成仪中，然后用DMF溶胀，之后使用20％哌啶/DMF溶液除去Fmoc基团。将0.5M根据C末端到N末端序列的氨基酸溶液(溶剂：二甲基甲酰胺，DMF)、1.0M DIPEA(二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮，DMF和NMP)和0.5M HBTU(溶剂：二甲基甲酰胺，DMF)分别以5、10和5当量的量添加到树脂中，并允许在氮气氛下反应1-2小时。完成每个脱保护和偶联步骤后，用DMF和NMP洗涤树脂两次。甚至在偶联最终氨基酸后，将树脂脱保护以除去Fmoc基团。
使用茚三酮测试方法确认肽的合成。将测试和合成的树脂用四氢呋喃(THF)或二氯甲烷(DCM)干燥，然后将三氟乙酸(TFA)裂解混合物以每克树脂20ml的量添加到树脂中，然后摇动3小时。接下来，通过过滤分离含有溶解在其中的树脂和肽的混合物。使用旋转蒸发器除去滤出的溶液。然后，添加冷乙醚，或将过量的冷乙醚直接添加到含有溶解在其中的肽的TFA混合溶液中，以便使肽在固相中结晶。通过离心分离结晶的肽。此时，通过用乙醚洗涤数次和离心过程完全除去TFA混合物。因此，将获得的肽溶解在蒸馏水中并冷冻干燥。
从树脂上切下每种合成的肽，洗涤，冷冻干燥，然后通过液相色谱法纯化。通过质谱法测量纯化的肽的分子量。
比较实施例1：TBP-C(VSAAGTKASPAV；SEQ ID NO:2)肽的合成
作为与钛结合肽比较的对照，使用肽合成仪通过F-moc固相化学合成方法合成TBP-C(SLNATGARAVVA；SEQ ID NO:2；钛结合肽对照)，其中用丙氨酸取代从SEQ ID NO:1序列的C末端开始位置1和6处的组氨酸残基、位置4处的脯氨酸残基和位置9处的酪氨酸残基。
比较实施例2：氧化锆结合肽的合成
作为与钛结合肽比较的对照，使用肽合成仪通过F-moc固相化学合成方法合成氧化锆结合肽(VSPFGTKWSPFV；SEQ ID NO:5，韩国专利申请号10-2015-0048441)，其是本申请人拥有的专利序列。
比较实施例3：与钛结合肽连接的成骨肽的合成
为了评估性能，使用肽合成仪通过F-moc固相化学合成方法合成包含与钛结合肽连接的成骨肽(GLRSKSKKFRRPDIQYPDA；SEQ ID NO:6，韩国专利申请号10-2011-0037839)(其是本申请人拥有的专利序列)的序列。
比较实施例4：通过接头与钛结合肽连接的成骨肽的合成
为了评估性能，使用肽合成仪通过F-moc固相化学合成方法合成包含通过接头与钛结合肽连接的成骨肽(GLRSKSKKFRRPDIQYPDA；SEQ ID NO:6，韩国专利申请号10-2011-0037839)(其是本申请人拥有的专利序列)的序列(SLNYTGHRPVVH接头GLRSKSKKFRRPDIQYPDA；SEQ ID NO:4)。作为接头，使用具有与其偶联的封闭基团Fmoc-(9-芴基甲氧基羰基)的Fmoc-6-氨基己酸(Fmoc-ε-Acp-OH)。从C末端到N末端依次合成成骨肽、接头和钛结合肽。
比较实施例5：成骨肽的合成
作为与钛结合肽比较的对照，使用肽合成仪通过F-moc固相化学合成方法合成成骨肽(GLRSKSKKFRRPDIQYPDA；SEQ ID NO:6，韩国专利申请号10-2011-0037839)，其是本申请人拥有的专利序列。
实施例3：钛结合肽对钛的结合亲和力的分析
3-1：用生物素标记的钛结合肽的合成
为了检查实施例1和比较实施例1和2中合成的肽对钛的结合亲和力，用生物素标记该肽。根据制造商的说明书，使用EZ-Link磺基-NHS-生物素(Pierce Biotechnology，美国)将每种肽生物素化，并通过超滤除去未结合的副产物，超滤是基于压力差的膜分离方法。通过质谱法测量合成的产物的分子量。通过反相液相色谱法分析并纯化合成的产物。为了分析，使用直径为4.6mm的C18柱，并且将0.1％TFA/H2O和0.092％TFA/乙腈以1ml/min的速率用0-60％的梯度在柱上冲洗30分钟。所用UV检测器的波长为220nm。为了纯化，使用直径为2.2cm的柱，并使用20ml/min的流速和如上所述的溶剂和检测波长。仅收集生物素标记的肽级分，并使用旋转蒸发器浓缩以除去溶剂，然后冷冻干燥。
3-2：钛结合肽对钛的结合亲和力的测量
通过进行使用亲和素-生物素复合物的结合测定来测量钛结合肽对钛的结合亲和力。具体地，将一个钛盘置于24孔聚苯乙烯板的每个孔中，然后用封闭缓冲液(0.1M NaHCO3(pH 8.6)、5mg/ml BSA、0.02％NaN3(任选的)，过滤器灭菌)封闭至少1小时。接下来，丢弃封闭缓冲液，并用洗涤缓冲液(TBS+0.1％[v/v]Tween-20)将每个钛盘强烈洗涤6次或更多次，之后将50μl实施例1钛结合肽TBP(SEQ ID NO:1)以及比较实施例1和2的肽TBP-C(SEQ IDNO:2)和ZBP(SEQ ID NO:5，韩国专利申请10-2015-0048441)中的每种以范围从100nM至1μM的浓度分配到每个钛盘的表面上，在实施例3-1中进行了生物素标记、合成、分离和纯化前述三种肽。将每个钛盘在室温下孵育15小时，然后用洗涤缓冲液强烈洗涤6次或更多次，并将50μl 1:500稀释的ExtrAvidin-过氧化物酶(2,2'-AZINO-BIS，Cat.#A3219，Sigma-Aldrich，美国)的封闭缓冲液分配到每个钛盘的表面上。将每个钛盘在室温下孵育1小时，然后用洗涤缓冲液强烈洗涤6次或更多次，之后将50μl底物溶液(2,2'-AZINO-BIS，Cat.#A3219，Sigma-Aldrich，美国)分配到每个钛盘的表面上并允许在室温下反应20分钟以便显色。用50μl 1％SDS溶液处理每个钛盘以终止反应，并测量405nm处的吸光度。
结果，如图1所示，当用实施例1的钛结合肽TBP(SEQ ID NO:1)、比较实施例1的肽TBP-C(SEQ ID NO:2)和比较实施例2的肽ZBP(SEQ ID NO:5，韩国专利申请号10-2015-0048441)中的每种处理每个钛盘时，实施例1的钛结合肽TBP的吸光度值高于比较实施例1和2的肽TBP-C和ZBP的吸光度值，并且吸光度值的这种增加是浓度依赖性的。这证明钛结合肽序列是以浓度依赖性方式结合到钛盘表面的序列。另外，这些结果表明肽序列具有结合基序。另外，比较实施例1和2的肽TBP-C和ZBP的吸光度值低于实施例1的钛结合肽TBP的吸光度值，比较实施例1和2的肽TBP-C和ZBP显示了独立于其浓度的吸光度值，表明比较实施例1和2的TBP-C和ZBP的肽序列不与钛盘表面结合。
为了在视觉上证明测量结果，使用发光图像分析仪(LAS-1000，Fujifilm，日本)进行检测。具体地，用合适的洗涤溶液进行洗涤至少3次以除去在上述程序中用作底物的2,2'-AZINO-BIS，然后使用增强化学发光(ECL)溶液用发光图像分析仪进行分析。结果，如图2所示，仅检测到与钛盘结合的肽。这证明实施例1的钛结合肽(TBP)与钛盘结合，而比较实施例1和2中合成的TBP-C和ZBP几乎不与钛盘结合。
实施例4：钛结合肽最大结合量的检查
为了检查钛盘表面每单位面积的钛结合肽TBP(SEQ ID NO:1)的最大结合量，进行使用亲和素-生物素复合物的结合测定。具体地，将一个钛盘置于24孔聚苯乙烯板的每个孔中，然后用封闭缓冲液(0.1M NaHCO3(pH8.6)、5mg/ml BSA、0.02％NaN3(任选的)，过滤器灭菌)封闭至少1小时。接下来，丢弃封闭缓冲液，并用洗涤缓冲液(TBS+0.1％[v/v]Tween-20)将每个钛盘强烈洗涤6次或更多次，之后将50μl实施例1钛结合肽TBP(SEQ ID NO:1)以及比较实施例1和2的肽TBP-C(SEQ ID NO:2)和ZBP(SEQ ID NO:5，韩国专利申请10-2015-0048441)中的每种以范围从100nM至40mM的浓度分配到每个钛盘的表面上，在实施例3-1中进行了生物素标记、合成、分离和纯化前述三种肽。将每个钛盘在室温下孵育15小时，然后用洗涤缓冲液强烈洗涤，并将50μl 1:500稀释的ExtrAvidin-过氧化物酶(Cat.#E2886，Sigma-Aldrich，美国)的封闭缓冲液分配到每个钛盘的表面上。将每个钛盘在室温下孵育1小时，然后用洗涤缓冲液强烈洗涤，之后将50μl底物溶液(2,2'-AZINO-BIS，Cat.#A3219，Sigma-Aldrich，美国)分配到每个钛盘的表面上并允许在室温下反应20分钟以便显色。用50μl 1％SDS溶液处理每个钛盘以终止反应，并测量405nm处的吸光度。
结果，如图3和4所示，钛结合肽TBP(SEQ ID NO:1)在100μM浓度下显示出最大吸光度值。基于钛结合肽的分子量和分配量的反算，可以看出结合到一个钛盘表面的钛结合肽的最大量是8.025μg。因此，可以看出，因为钛盘的直径为10mm，所以每平方毫米的钛盘表面可以固定约0.10223μg的钛结合肽。
实施例5：与钛结合肽连接的成骨肽的细胞毒性的体外评估
为了评估当单独给予这些肽时，钛结合肽连接的成骨肽(SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4)和钛结合肽(SEQ ID NO:1)是否具有细胞毒性，进行细胞活力测试。
具体地，将一个钛盘置于24孔低附着聚苯乙烯板的每个孔中，并用封闭溶液(0.1MNaHCO3(pH 8.6)、5mg/ml BSA、0.02％NaN3(任选的)，过滤器灭菌)封闭至少1小时。接下来，丢弃封闭溶液，用洗涤溶液(DPBS：Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水)洗涤每个孔3次或更多次，之后将50μl下表2所示的溶液分配并涂覆在每个钛盘的表面上。将每个孔在室温下孵育15小时，然后用洗涤液(DPBS)洗涤3次或更多次。接下来，每个钛盘分配悬浮于含有10％FBS(胎牛血清)和1％抗生素-抗霉菌溶液(Thermo Fisher Scientific，美国)的50μl培养基(Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modifications，Hyclone，美国)中的3×104个PDLSC细胞。在至少7小时后，观察到细胞附着到盘表面上，并且将培养基另外添加到每个孔中，以便使盘浸没在培养基中，然后培养细胞3天。接下来，将细胞分开，用台盼蓝染色，并用血细胞计数器计数以确定活细胞的数量。
表2
结果，活细胞的数量如下表3所示。将钛结合肽连接的成骨肽或钛结合肽上的细胞活力与阴性对照上的细胞活力进行比较，结果示于图5中。图5中的结果证明，当单独给予钛结合肽连接的成骨肽(SEQ ID NO:3或4)或钛结合肽(SEQ ID NO:1)时，在孵育3天期间，它对细胞没有细胞毒性。
表3
实施例6：与钛结合肽连接的成骨肽的功能的体外评估
6-1：与钛结合肽连接的成骨肽的碱性磷酸酶(ALP)活性的测量
为了检查当给予一次这些肽时，钛结合肽连接的成骨肽(SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4)和钛结合肽(SEQ ID NO:1)的成骨分化诱导活性和负载，评估牙周韧带干细胞(PDLSC)中的ALP活性。具体地，将一个钛盘置于24孔低附着聚苯乙烯板的每个孔中，并用封闭溶液(0.1M NaHCO3(pH 8.6)、5mg/ml BSA、0.02％NaN3(任选的)，过滤器灭菌)封闭至少1小时。接下来，丢弃封闭溶液，并用洗涤溶液(DPBS：Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水)洗涤每个孔3次或更多次，之后将50μl实施例5的表2所示的溶液分配并涂覆在每个钛盘的表面上。将每个孔在室温下孵育15小时，然后用洗涤液(DPBS)洗涤3次或更多次。接下来，每个钛盘分配悬浮于含有10％FBS(胎牛血清)和1％抗生素-抗霉菌溶液(Thermo Fisher Scientific，美国)的50μl培养基(Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modifications，Hyclone，美国)中的3x 104个PDLSC细胞。在至少7小时后，观察到细胞附着到盘表面上，并且将培养基另外添加到每个孔中，以便使盘浸没在培养基中，然后培养细胞。第二天，用含有补充物(hMSC Osteogenic Lonza，美国)的成骨分化诱导培养基(Differentiation Basal Medium-Osteogenic，Lonza，美国)替换培养基，并将细胞培养18天。
在第一次涂覆盘表面后18天，在不添加含有生理活性物质的溶液的情况下，在替换培养基的同时培养细胞。在培养的第0、6、10、13和18天，回收培养基，并使用碱性磷酸酶测定试剂盒(cat#.ab83369,abcam,美国)测量ALP活性。
结果，如图6所示，在用与钛结合肽连接的成骨肽(比较实施例5；SEQ ID NO:6)处理的测试组和用BMP-2(骨形态发生蛋白)处理的对照组中未观察到ALP活性的显著变化。当进行重复双因素方差分析以便根据培养时间和处理物质的种类检查显著性时，显示ALP活性确实根据培养时间和处理物质的种类而不同，并且培养时间和处理物质具有相互作用(p<0.05)。另外，为了检查培养第10天处理物质之间的ALP活性的差异是否具有统计学意义，分析了培养第10天的ALP活性的测量结果。如图7所示，在培养第10天，NT(阴性对照)组和用钛结合肽连接的成骨肽(比较实施例3；SEQ ID NO:3)处理的测试组之间以及NT组和用通过接头与钛结合肽连接的成骨肽(比较实施例4；SEQ ID NO:4)处理的测试组之间有统计学上的显著差异(p<0.05)。此外，t检验的结果表明，用钛结合肽连接的成骨肽(比较实施例3；SEQ ID NO:3)处理的测试组和用通过接头与钛结合肽连接的成骨肽(比较实施例4；SEQ IDNO:4)处理的测试组之间没有统计学上的显著差异(p>0.05)。另外，单因素方差分析的结果表明，阴性对照组、用BMP-2处理的对照组和仅用键再生肽(比较实施例5；SEQ ID NO:6)处理的测试组之间没有统计学上的显著差异(p>0.05)。
总之，只有与实施例1的钛结合肽(TBP)连接的成骨肽(如比较实施例3和4中合成的肽)在培养18天期间显示出ALP活性的统计学上的显著变化。然而，未与钛结合肽连接的生理活性物质显示ALP活性没有显著变化。
6-2：与钛结合肽连接的成骨肽的矿化诱导活性的评估
为了检查当给予一次时，钛结合肽连接的成骨肽(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4)的成骨分化诱导活性和负载，评估肽对牙周韧带干细胞(PDLSC)的矿化。具体地，将一个钛盘置于24孔低附着聚苯乙烯板的每个孔中，并用封闭溶液(0.1M NaHCO3(pH 8.6)、5mg/mlBSA、0.02％NaN3(任选的)，过滤器灭菌)封闭至少1小时。接下来，丢弃封闭溶液，并用洗涤溶液(DPBS：Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水)洗涤每个孔3次或更多次，之后将50μl实施例5的表2所示的溶液分配并涂覆在每个钛盘的表面上。将每个孔在室温下孵育15小时，然后用洗涤液(DPBS)洗涤3次或更多次。接下来，每个钛盘分配悬浮于含有10％FBS(胎牛血清)和1％抗生素-抗霉菌溶液(Thermo Fisher Scientific，美国)的50μl培养基(Minimum EssentialMedium Eagle Alpha Modifications，Hyclone，美国)中的3x 104个PDLSC细胞。在至少7小时后，观察到细胞附着到盘表面上，并且将培养基另外添加到每个孔中，以便使盘浸没在培养基中，然后培养细胞。第二天，用含有补充物(hMSC Osteogenic Lonza，美国)的成骨分化诱导培养基(Differentiation Basal Medium-Osteogenic，Lonza，美国)替换培养基，并将细胞培养18天。
在第一次涂覆盘表面后18天，在不添加含有生理活性物质的溶液的情况下，在替换培养基的同时培养细胞。在培养第18天，除去培养基，并用2％茜素红S(Sigma-Aldrich，美国)溶液染色细胞。当将细胞矿化以产生矿物质时，细胞染成红色。然后，将细胞与10％氯化十六烷基吡啶(Sigma-Aldrich，美国)在室温下孵育2小时，并测量570nm处的吸光度。
结果，如图8所示，可以在视觉上观察到用钛结合肽连接的成骨肽(比较实施例3；SEQ ID NO:3)处理的测试组和用通过接头与钛结合肽连接的成骨肽(比较实施例4；SEQ IDNO:4)处理的测试组中的矿物质产生积极地发生。此外，吸光度的测量结果证明，用与钛结合肽连接的成骨肽处理的测试组显示出矿化诱导活性。统计显著性的分析结果表明，NT(阴性对照)组和用钛结合肽连接的成骨肽(比较实施例3；SEQ ID NO:3)处理的测试组之间以及NT组和用通过接头与钛结合肽连接的成骨肽(比较实施例4；SEQ ID NO:4)处理的测试组之间有统计学上的显著差异(p<0.05)。此外，t检验的结果表明，阴性对照组和仅用钛结合肽(SEQ ID NO:1)处理的测试组之间、以及用钛结合肽连接的成骨肽(比较实施例3；SEQ IDNO:3)处理的测试组和用通过接头与钛结合肽连接的成骨肽(比较实施例4；SEQ ID NO:4)处理的测试组之间没有统计学上的显著差异(p>0.05)。另外，单因素方差分析的结果表明，阴性对照组、用BMP-2处理的对照组和仅用键再生肽(比较实施例5；SEQ ID NO:6)处理的测试组之间没有统计学上的显著差异(p>0.05)。
如上所述的结果表明，仅在存在实施例1的钛结合肽(TBP)的情况下，生理活性物质可以牢固地附着于钛盘或植入物的表面上并且可以长时间保持其活性；而在没有钛结合肽的情况下，生理活性物质从钛盘或植入物的表面脱离，并且不能表现出其活性。
尽管已经参考具体特征详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说将显而易见的是，此描述仅用于优选实施方案，并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物限定。
工业实用性
将根据本发明的钛结合肽牢固地固定到钛表面上，从而可以长时间稳定地保持与该肽连接的生理活性物质的活性。因此，该肽可以有效地用于手术再生疗法。
文本文件
所见所附的序列表。
<110> 纳米智能生物医学工程有限公司
首尔大学校产学协力团
<120> 具有钛结合能力的肽
<130> PP-B1819
<150> KR 10-2016-0094893
<151> 2016-07-26
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 钛结合的肽
<400> 1
Ser Leu Asn Tyr Thr Gly His Arg Pro Val Val His
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 钛结合的肽-对照 (来自钛结合的肽的4氨基酸取代)
<400> 2
Val Ser Ala Ala Gly Thr Lys Ala Ser Pro Ala Val
1 5 10
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 钛结合的肽与骨再生肽的融合肽
<400> 3
Ser Leu Asn Tyr Thr Gly His Arg Pro Val Val His Gly Leu Arg Ser
1 5 10 15
Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala
20 25 30
<210> 4
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 钛结合的肽与骨再生肽的融合肽，其中钛结合的肽与骨再生肽通过接头连接
<400> 4
Ser Leu Asn Tyr Thr Gly His Arg Pro Val Val His Gly Leu Arg Ser
1 5 10 15
Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala
20 25 30
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锆结合的肽
<400> 5
Val Ser Pro Phe Gly Thr Lys Trp Ser Pro Phe Val
1 5 10
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骨再生肽
<400> 6
Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg Pro Asp Ile Gln Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala

Claims (11)

1.一种由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的钛结合肽。
2.权利要求1的钛结合肽，其中该肽不经化学修饰地与钛结合。
3.一种肽缀合物，其包含与权利要求1的钛结合肽连接的生理活性肽或蛋白质。
4.权利要求3的肽缀合物，其中该生理活性肽选自下组，该组由抗炎、抗微生物、细胞粘附、骨组织再生和细胞迁移功能肽组成。
5.权利要求3的肽缀合物，其中该生理活性蛋白选自下组，该组由组织再生因子、组织生长因子、细胞内转录因子、细胞外基质蛋白和抗炎蛋白组成。
6.权利要求3的肽缀合物，其中该肽缀合物由SEQ ID NO:3或4的氨基酸序列表示。
7.一种生物材料，其包含权利要求1的钛结合肽或权利要求3的肽缀合物。
8.权利要求7的生物材料，其中该生物材料为选自下组的任何一种，该组由钛涂覆的金属、含钛金属、钛涂覆的天然聚合物、与钛混合的天然聚合物、钛涂覆的合成聚合物、与钛混合的合成聚合物和由钛制成的用于体内植入的植入物组成。
9.权利要求8的生物材料，其中该钛优选是通过向纯氧化钛添加5-7wt％的铝、3-5wt％的钒、0-0.25wt％的铁和0-0.2wt％的氧而获得的合金。
10.权利要求8的生物材料，其中该天然聚合物为选自下组的任何一种，该组由胶原蛋白、海藻酸、丙二醇、海藻酸、硫酸软骨素和壳聚糖组成。
11.权利要求8的生物材料，其中该合成聚合物为选自下组的任何一种，该组由聚乳酸乙醇酸、泊洛沙姆和丙二醇组成。
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