WO2018021647A1 - 티타늄 결합능을 가지는 펩타이드 - Google Patents

티타늄 결합능을 가지는 펩타이드 Download PDF

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박윤정
이주연
김연수
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Definitions

  • the present invention relates to a peptide having a titanium binding ability, and more particularly, a function of linking between titanium and a bioactive material so as to stably fix the bioactive material on the titanium surface to maintain the activity of the bioactive material for a long time. It relates to a peptide having a specific binding ability to the titanium surface.
  • Dental implants are artificial teeth that are implanted in a site where a tooth is lost in vivo and are widely used to enable functional and aesthetic repair of a lost tooth. Compared with natural teeth, natural teeth are attached to alveolar bone by periodontal ligaments, but dental implants are characterized by direct attachment of artificial roots and bones.
  • Implants have the physical fixation force that occurs when the implant contacts the surrounding bone at the same time as the implant, and the biological fixation force that is obtained by the formation of new bone tissue around the implant after implantation and the adhesion of the bone to the surrounding bone. Insufficient or deteriorated bone quality can make it difficult to achieve significant initial stability in bone adhesion, in which case an early failure of the implant can occur.
  • the application of biological factors is essential for shortening the initial engraftment and treatment period after implant placement in general adult patients as well as elderly patients with low bone mass and reduced bone quality.
  • Materials for dental implants can be mainly divided into metals, ceramics and polymers, and today most dental implants are made from commercially pure titanium (cpTi) or titanium alloys.
  • cpTi commercially pure titanium
  • various methods of modifying the surface of the implant are used to improve the interface between the implant and the bone made of titanium and its alloys.
  • SLA sand spray-acid corrosion treatment
  • the present inventors have made efforts to solve the problems of the prior art as a result, by discovering a short peptide sequence having a strong binding affinity on the implant surface, the peptide is easily bound to the titanium implant surface to maintain a stable state It confirmed and completed this invention.
  • An object of the present invention is to provide a peptide having a titanium binding capacity represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Another object of the present invention is to provide a peptide conjugate in which a bioactive peptide or protein is bound to the peptide having the titanium binding ability.
  • Still another object of the present invention is to provide a peptide having the titanium binding ability or a biomaterial including the peptide conjugate.
  • the present invention provides a peptide having a titanium binding ability represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also provides a peptide conjugate in which a bioactive peptide or protein is bound to the peptide having the titanium binding ability.
  • the present invention also provides a biomaterial comprising the peptide having the titanium binding ability or the peptide conjugate.
  • Biotin- 1 is avidin-biotin complex (Avidin-) to confirm the titanium binding affinity of the peptide having a titanium binding capacity (SEQ ID NO: 1) and the control TBP-C peptide (SEQ ID NO: 2) and zirconia binding peptide (SEQ ID NO: 5) Binding assay using Biotin Complex).
  • FIG. 2 shows the avidin-biotin complex (Avidin-) to confirm the titanium binding affinity of the peptide with the titanium binding capacity (SEQ ID NO: 1) and the control TBP-C peptide (SEQ ID NO: 2) and zirconia binding peptide (SEQ ID NO: 5)
  • the substrate was replaced with ECL solution (Enhanced chemiluminescence) and analyzed by a luminescence spectrometer.
  • Figure 3 is a result of a binding assay using avidin-Biotin Complex (Avidin-Biotin Complex) to determine the maximum amount of binding to the titanium disk surface of the peptide having a titanium binding capacity (SEQ ID NO: 1) .
  • FIG. 4 is a result of displaying the X-axis in a log-scale (Log-scale) in the result of FIG.
  • FIG. 5 shows cytotoxicity upon administration of a peptide having a titanium binding ability (SEQ ID NO: 1), a bone regeneration functional peptide (SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4) and a bone regeneration functional peptide (SEQ ID NO: 6) to which a peptide having a titanium binding ability is bound.
  • SEQ ID NO: 1 a peptide having a titanium binding ability
  • SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 a bone regeneration functional peptide
  • SEQ ID NO: 6 bone regeneration functional peptide
  • FIG. 6 shows a single dose of a titanium-binding peptide (SEQ ID NO: 1), a bone regenerative functional peptide (SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4) and a bone regenerative functional peptide (SEQ ID NO: 6) to which a peptide having titanium binding capacity is bound.
  • SEQ ID NO: 1 a titanium-binding peptide
  • SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 a bone regenerative functional peptide
  • SEQ ID NO: 6 bone regenerative functional peptide
  • FIG. 7 shows the results of the ALP activity of the 10th day of culture in the result of FIG. 6.
  • FIG. 8 shows a single dose of a titanium-binding peptide (SEQ ID NO: 1), a bone regenerative functional peptide (SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4) and a bone regenerative functional peptide (SEQ ID NO: 6) to which a peptide having titanium binding capacity is bound.
  • SEQ ID NO: 1 a titanium-binding peptide
  • SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 a bone regenerative functional peptide
  • SEQ ID NO: 6 bone regenerative functional peptide
  • the present invention relates to a peptide having a titanium binding ability represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 from one aspect.
  • the present invention in another aspect relates to the use of titanium binding of the peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention relates to a titanium binding method using a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in another aspect.
  • the peptide having a titanium binding ability is preferably bound to titanium used as a biomaterial without chemical modification, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a peptide conjugate in which a bioactive peptide or protein is bound to the peptide having titanium binding ability in another aspect.
  • the present invention relates to an improved physiological activity of a peptide conjugate in which a physiologically active peptide or protein is bound to the titanium binding peptide in another aspect.
  • the present invention relates to a method for improving physiological activity using a peptide conjugate in which a physiologically active peptide or protein is bound to a peptide having titanium binding ability.
  • the improvement of the physiological activity may be, for example, an improvement in bone regeneration ability, but is not limited thereto.
  • the conjugate of the peptide having a titanium binding ability and the bioactive peptide can be prepared by a chemical synthesis method using a peptide synthesis apparatus, the bioactive domain at the C 'or N' terminal portion of the peptide having a titanium binding capacity
  • the bioactive domain peptide is a substance that regulates gene expression and physiological function in vivo ( In vitro ) or in vivo ( In vivo ) as well as bone differentiation or anti-inflammatory action required for implant placement. It may be characterized in that it can play a role of correcting when an abnormal condition is exhibited due to the lack of a substance or excessive secretion involved in, and may be L-type or D-type in consideration of stability in the body.
  • the physiologically active peptide is preferably selected from the group consisting of anti-inflammatory, anti-microbial, cell adhesion, bone tissue regeneration and cell migration functional peptide, but is not limited thereto.
  • the physiologically active protein is preferably selected from the group consisting of tissue regeneration factor, tissue growth factor, intracellular transcription factor, extracellular matrix protein and anti-inflammatory protein, but is not limited thereto.
  • the peptide and the bioactive protein or low molecular weight conjugate having a titanium binding ability can be made by inducing a chemical bond using a crosslinking agent.
  • a crosslinking agent When inducing a chemical bond using a crosslinking agent, it has a free amino group at the N 'terminal of the peptide having a titanium binding ability, it is easy to form a complex by the crosslinking agent.
  • the crosslinking agent that can be used in the present invention is 1,4-bis-maleimidobutane (BMB), 1,11-bis-maleimidotetraethylene glycol (1,11-bismaleimidotetraethyleneglycol, BM [ PEO] 4), 1-ethyl-3- [3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride (1-ethyl-3- [3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC), succinimidyl-4- [N Maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy- [6-amidocaproate]] (succinimidyl-4- [N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy- [6-amidocaproate]], SMCC) and its sulfonates (sulfo- SMCC), succimidyl 6- [3- (2-pyridyldithio) -lopiona
  • the peptide conjugate may be represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the titanium-binding peptide and the bioactive protein or bioactive peptide may be linked by a linker.
  • the linker may be used as a linker as long as it can provide a space for forming a functional structure between the peptide having a titanium binding ability and the bioactive protein or the bioactive peptide, for example, the linker may be natural and / Or peptidic linkers of synthetic origin.
  • Peptide linkers of natural and / or synthetic origin may consist of an amino acid chain consisting of 1 to 50 amino acids and may comprise a repeating amino acid sequence of a naturally occurring polypeptide, such as a polypeptide having a hinge function.
  • the peptidic linker amino acid sequence may be a synthetic linker amino acid sequence designated to be rich in glycine, glutamine, and / or serine residues. These residues may, for example, be arranged in small repeat units of up to 5 amino acids and the small repeat units may be repeated to form a multimer unit. At the amino- and / or carboxy terminus of the multimer unit, up to six additional optional naturally occurring amino acids may be added. Other synthetic peptidic linkers may be a single amino acid construct repeated 10-20 times and may be up to six additional optional naturally occurring amino acids at the amino- and / or carboxy-terminus.
  • the linker may be a chemically modified form of amino acids, for example, Fmoc-6-aminohexanoic acid (Fmoc- ⁇ -Acp-OH) to which Fmoc- (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) is bound as a blocking group. It may be used in the form of, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a peptide having the titanium binding ability or a biomaterial comprising the peptide conjugate in another aspect.
  • the biomaterial is a metal coated with titanium, metal containing titanium, natural polymer coated with titanium, natural polymer mixed with titanium, synthetic polymer coated with titanium, titanium and It may be any one selected from the group consisting of mixed synthetic polymers and implants for living organisms made of titanium, but is not limited thereto.
  • implant refers to a surgical material or a procedure for restoring the function by implanting a biocompatible material through additional surgery such as bone graft or bone elongation to a surgically defective site. It enters a full-scale regeneration phase after bone adhesion, which is a physiological, morphological, and direct bond between the surrounding tissue and the implant body surface where normal function is maintained.
  • titanium of the present invention refers to a commercially pure titanium (cpTi) or titanium alloy (Titanium alloy), the corrosion of the titanium oxide (TiO2) film (Film) is formed naturally on the surface Very strong on In addition, the thickness of the titanium oxide film is about 3-10 nm, and the presence of the oxide film is known to induce proper bone adhesion, and has the advantage of being stable and naturally formed even in adverse conditions such as oral cavity.
  • Titanium implants are capable of a variety of surface modifications than currently used zirconia ceramic implants.
  • the sand-blasting method is a method of processing hard and small sand particles at high speed by using the name sand-blasting even when using metal particles other than sand, and in the case of titanium, titanium oxide and oxide This technique is used to make porous membranes on the implant surface by colliding aluminum particles. Titanium implants treated with various surface modification methods can increase the adhesion of bone cells to the surface, which may affect the initial stability of the implant.
  • the titanium is preferably an alloy composed of 5-7% by weight of aluminum, 3-5% by weight of vanadium, 0-0.25% by weight of iron, 0-0.2% by weight of pure titanium oxide It is not limited to this.
  • the natural polymer is preferably any one selected from the group consisting of collagen, alginic acid, propylene glycol, alginic acid, chondroitin sulfate and chitosan, but is not limited thereto.
  • the synthetic polymer is preferably any one selected from the group consisting of polylactic glycolic acid, poloxamer and propylene glycol, but is not limited thereto.
  • the implant may be present in a stable state in a state in which the bioactive substance is covalently bonded to the peptide without inducing a chemical bond and maintains activity.
  • the implant promotes the migration, proliferation and differentiation of bone tissue regeneration-related cells around the implant so that an efficient tissue regeneration effect can be finally generated within a short time, the treatment time can be shortened, and can be induced due to unstable coupling of the implant surface. It is useful for surgical regenerative treatment because it can reduce side effects on systemic or other tissues.
  • a new phage display technique called subtractive panning was applied to block the possibility of binding to the titanium disc surface.
  • “Subtractive panning” of the present invention is a technique that can be used to discover a sequence that binds to a specific material but does not bind to a specific material, and then binds a phage library to a material that you do not want to bind. After recovering only the unused phages, the unbound phages are discarded and the unbound phages are recovered and the combined phages are recovered (Munirathinam, Gnanasekar et. Al., Novel Phage Display-Based Subtrative Screening To). Identify Vaccine Candidates of Brugia malayi, Infect Immun., 72: 4707-4715, 2004).
  • Phage display was used to identify specific peptide sequences that bind to the titanium disk surface. After attaching labeled M13 phages with high diversity and complexity to the titanium disc surface, unbound phages were washed and recovered only with bound phages. Subtractive panning was applied. Finally, a peptide sequence having titanium binding ability was identified by sequencing the DNA encoding the peptide labeled on the obtained phage. Subtractive panning is a new phage display technique that can be used to discover sequences that bind to certain substances but not to others.
  • the phage obtained after the repetition cycle of the above-mentioned universal phage display is amplified again, dispensed to empty wells of a polystyrene plate and then bound to the well surface. Only those phages that did not bind to the polystyrene plate were obtained by recovering the unused phages, which were once again bound to the titanium disc surface, and then washed strongly with a washing solution to finally bind only those phages that remained on the remaining titanium disc surface. Recovered.
  • Phage display kit was purchased by using Ph.D.-12 Phage Display Kit of New England Biolabs (USA), and the final 17 excavated using labeled phages with random peptide library consisting of 12 amino acids provided in the kit. Dog clones were sequenced by applying to Cosmojintech Co., Ltd. in the form of E. coli culture.
  • TBP TBP
  • VSAAGTKASPAV Titanium Binding Peptide-Control
  • the synthesized peptides were cleaved from the resin, washed, lyophilized and separated and purified by liquid chromatography. The molecular weight of the purified peptide was confirmed by mass spectrometry.
  • TBP-C (SLNATGARAVVA; SEQ ID NO: 2; Titanium Binding Peptide-) in which the 1st, 6th histidine, the 4th proline, and the 9th tyrosine were substituted with alanine at the C terminus in the sequence of SEQ ID NO: 1 as a control of the peptide having titanium binding capacity Control) was synthesized using a peptide synthesizer by F-moc solid phase chemical synthesis.
  • Zirconia binding peptide (VSPFGTKWSPFV; SEQ ID NO: 5, Patent Application 10-2015-0048441), which is a patented sequence, was synthesized using a peptide synthesis apparatus by F-moc solid phase chemical synthesis.
  • a sequence in which a bone regeneration functional peptide (GLRSKSKKFRRPDIQYPDA; SEQ ID NO: 6, Patent Application 10-2011-0037839), which is a patent sequence, is bound to a titanium binding peptide (SLNYTGHRPVVH GLRSKSKKKRPRPDIQYPDA) SEQ ID NO: 3) was synthesized using a peptide synthesizer by F-moc solid phase chemical synthesis.
  • a bone regeneration functional peptide (GLRSKSKKFRRPDIQYPDA; SEQ ID NO: 6, Patent Application 10-2011-0037839), which is a patent sequence, is bound to a peptide having a titanium binding ability through a linker.
  • SLNYTGHRPVVH Linker GLRSKSKKFRRPDIQYPDA; SEQ ID NO: 4 was synthesized using a peptide synthesizer by F-moc solid phase chemical synthesis.
  • the linker used Fmoc-6-aminohexanoic acid (Fmoc- ⁇ -Acp-OH) combined with Fmoc- (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) as a blocking group, and bone regeneration functional peptides-linkers- It was synthesized in the order of peptides having titanium binding capacity.
  • Bone regeneration functional peptide (GLRSKSKKFRRPDIQYPDA; SEQ ID NO: 6, Patent Application 10-2011-0037839), which is a patented sequence, was synthesized using a peptide synthesis apparatus by F-moc solid phase chemical synthesis.
  • biotin was labeled to confirm the binding affinity of the peptides with titanium.
  • Each peptide was biotinylated using EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce Biotechnology, USA) according to the manufacturer's test method, and bound through ultrafiltration, a membrane separation method using pressure difference as a driving force. By-products were removed. Then, the molecular weight of the synthesis result was confirmed by measuring the molecular weight by mass spectrometry. Analysis and purification used reverse phase high performance liquid chromatography.
  • the binding affinity of the peptides with titanium binding ability with titanium was measured by an Avidin-Biotin Complex binding assay.
  • One titanium disc is placed in each well of a 24-well polystyrene plate, followed by a blocking solution (0.1 M NaHCO 3 (pH 8.6), 5 mg / ml BSA, 0.02% NaN 3 (optional), Block at least 1 hour with filter sterilize, discard blocking solution and wash 6 times more strongly with washing solution (TBS + 0.1% [v / v] Tween-20).
  • the peptide TBP (SEQ ID NO: 1) and the peptide TBP-C (SEQ ID NO: 1) of Comparative Example 1 and 2 were synthesized, separated, and purified by labeling biotin in Example 3-1 on the surface of the titanium disc.
  • ZBP SEQ ID NO: 5, Patent Application 10-2015-0048441
  • ZBP SEQ ID NO: 5, Patent Application 10-2015-0048441
  • ExtrAvidin-Peroxidase Cat. # E2886, Sigma-Aldrich, USA
  • the solution was washed strongly 6 times or more with appropriate washing solution, and then the substrate solution (2,2'-AZINO-BIS, Cat. # A3219, Sigma-Aldrich, USA) was applied to the titanium disk surface. 50 ⁇ l was dispensed and the color reaction was carried out at room temperature for 20 minutes. After 20 minutes, 50 ⁇ l of 1% SDS solution was treated to stop the reaction and the absorbance was measured at 405 nm.
  • the absorbance value of the peptide TBP having a titanium binding capacity was higher than that of the peptides TBP-C and ZBP of Comparative Examples 1 and 2 and showed a concentration-dependent trend.
  • the peptide sequence having titanium binding ability is a sequence that binds to the titanium disk surface in a concentration-dependent manner, and that the peptide sequence has a binding motif.
  • a luminescence analyzer (Luminescent Image Analyzer, LAS-1000, Fujifilm, Japan) was used for detection.
  • the substrate material treated in the above process at least three times with an appropriate washing solution, and then analyzed with a luminescence analyzer using ECL solution (Enhanced chemiluminescence). do.
  • ECL solution Enhanced chemiluminescence
  • a binding assay was performed using avidin-Biotin Complex to determine the maximum amount of binding per unit area of the titanium disk surface of the TBP peptide (SEQ ID NO: 1).
  • One titanium disc is placed in each well of a 24-well polystyrene plate, followed by blocking solution (0.1 M NaHCO 3 (pH 8.6), 5 mg / ml BSA, 0.02% NaN 3 (optional), filter sterilize) for at least 1 hour. Then, the blocking solution was discarded and washed 6 times or more strongly with a washing solution (TBS + 0.1% [v / v] Tween-20), and then synthesized, separated and purified by biotin labeling on the titanium disk surface in Example 3-1.
  • Peptide TBP having a titanium binding capacity of Example 1 (SEQ ID NO: 1) and peptides TBP-C (SEQ ID NO: 2), ZBP (SEQ ID NO: 5, Patent Application 10-2015-0048441) of Comparative Examples 1 and 2 at 40 nM 40 50 ⁇ l was dispensed at each concentration up to mM. After 15 hours of reaction at room temperature, the solution was washed with washing solution, and ExtrAvidin-Peroxidase (Cat. # E2886, Sigma-Aldrich, USA) was diluted 1: 500 in the blocking solution and 50 ⁇ l was dispensed on the titanium disk surface.
  • ExtrAvidin-Peroxidase Cat. # E2886, Sigma-Aldrich, USA
  • substrate solution (2,2'-AZINO-BIS, Cat. # A3219, Sigma-Aldrich, USA) was dispensed on the surface of titanium disk and 20 at room temperature. The reaction was developed in minutes. To stop the reaction, 50 ⁇ l of 1% SDS solution was treated and absorbance was measured at 405 nm.
  • the maximum saturated absorbance value was confirmed at a concentration of 100 ⁇ M of the peptide TBP (SEQ ID NO: 1) having a titanium binding capacity. Inverted through the molecular weight and aliquot of the peptide having a titanium binding capacity, the peptide having a binding capacity of 8.025 ⁇ g is bound to the maximum surface of one titanium disk. Therefore, since the diameter of the titanium disk is 10 mm, it can be calculated that a peptide having about 0.10223 ⁇ g of titanium binding capacity can be fixed per 1 mm 2 of the titanium disk surface area.
  • Cell viability test was performed to evaluate cytotoxicity when administration of bone regeneration functional peptide (SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4) and titanium binding peptide (SEQ ID NO: 1) combined with a titanium binding peptide alone.
  • One titanium disc is placed in each well of a 24-well low attachment polystyrene plate, followed by blocking solution (0.1 M NaHCO 3 (pH 8.6), 5 mg / ml BSA, 0.02 Block at least 1 hour with% NaN 3 (optional), filter sterilize. Since the blocking solution was discarded and washed three times or more with a washing solution (DPBS: Dulbeccos phosphate buffered saline), 50 ⁇ l of the solution shown in Table 2 was coated on the surface of the titanium disc and coated (coating).
  • blocking solution 0.1 M NaHCO 3 (pH 8.6), 5 mg / ml BSA, 0.02 Block at least 1 hour with% NaN 3 (optional), filter sterilize. Since the blocking solution was discarded and washed three times or more with a washing solution (DPBS: Dulbeccos phosphate buffered saline), 50 ⁇ l of the solution shown in Table 2 was coated on the surface of the titanium disc and coated (coating).
  • PDLSC cells per disc consisted of 10% FBS (Fetal Bovine Serum) and 1% antibiotic-antimycotic solution (Thermo Fisher). Scientific, USA) was adjusted to float in 50 ⁇ l of medium added (Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modifications, Hyclone, USA). After at least 7 hours, the cells are adhered to the surface of the disk, and the medium is added to the disk to lock, incubated for 3 days, the cells are removed, stained with trypan blue, and numbered with a hematocytometer to measure the number of viable cells. Calculated.
  • Bioactive substances NT Voice Control TBP TBP-bone regeneration functional peptide TBP-Linker-Bone Regeneration Functional Peptides Bone Regeneration Functional Peptides BMP-2 density x 100 ⁇ M 100 ⁇ M 100 ⁇ M 100 ⁇ M 100ng / ml
  • the viable cell number was calculated as shown in Table 3 and compared with the negative control group, the viability of the cells was calculated as shown in FIG. 5. This is toxic to cells during three days of culture compared to the negative control group when administration of a bone regeneration functional peptide (SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4) or titanium binding peptide (SEQ ID NO: 1) combined with a peptide having a titanium binding capacity This proved to be absent.
  • a bone regeneration functional peptide SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4
  • titanium binding peptide SEQ ID NO: 1
  • PDLSC ALP activity was evaluated in Periodontal ligament stem cells.
  • One titanium disc is placed in each well of a 24-well low attachment polystyrene plate, followed by blocking solution (0.1 M NaHCO 3 (pH 8.6), 5 mg / ml BSA, 0.02 Block at least 1 hour with% NaN 3 (optional), filter sterilize.
  • the blocking solution was discarded and washed three times or more with a washing solution (DPBS: Dulbeccos phosphate buffered saline), and 50 ⁇ l of the solution shown in Table 2 was coated on the surface of the titanium disc and coated (coating).
  • DPBS Dulbeccos phosphate buffered saline
  • 50 ⁇ l of the solution shown in Table 2 was coated on the surface of the titanium disc and coated (coating).
  • the cells were washed three times or more with washing solution (DPBS), and 3 ⁇ 10 4 PDLSC cells per disc consisted of 10% FBS (Fetal Bovine Serum) and 1% antibiotic-antimycotic solution (Thermo Fisher). Scientific, USA) was adjusted to float in 50 ⁇ l of medium added (Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modifications, Hyclone, USA).
  • the cells were adhered to the disk surface and cultured by adding the medium to lock the disk, followed by the differentiation induction medium (h) differentiation basal medium (hMSC Osteogenic SingleQuots®, Lonza, USA) Osteogenic, Lonza, USA) and cultured for 18 days.
  • h differentiation induction medium
  • hMSC Osteogenic SingleQuots® Lonza, USA
  • Osteogenic, Lonza, USA Osteogenic, Lonza, USA
  • culture was performed with only the replacement of the medium without administration of a solution containing additional functional bioactive substances for 18 days, and cultured on days 0, 6, 10, 13, and 18 of the culture.
  • the ALP activity was measured using the ALP activity measurement kit (Alkaline phosphatase assay kit, cat # .ab83369, abcam, USA).
  • the blocking solution was discarded and washed three times or more with a washing solution (DPBS: Dulbeccos phosphate buffered saline), and 50 ⁇ l of the solution shown in Table 2 was coated on the surface of the titanium disc and coated (coating).
  • DPBS Dulbeccos phosphate buffered saline
  • 50 ⁇ l of the solution shown in Table 2 was coated on the surface of the titanium disc and coated (coating).
  • the cells were washed three times or more with washing solution (DPBS), and 3 ⁇ 104 PDLSC cells per disc were treated with 10% FBS (Fetal Bovine Serum) and 1% antibiotic-antimycotic solution (Thermo Fisher Scientific). , USA) was added to the medium (Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modifications, Hyclone, USA) added to the suspension to adjust to float in 50 ⁇ l.
  • the cells were adhered to the disk surface and cultured by adding the medium to lock the disk, and the next day, differentiation induction medium (Differentiation Basal Medium-) with supplementation (hMSC Osteogenic SingleQuots®, Lonza, USA) was added. Osteogenic, Lonza, USA) was incubated for 18 days.
  • differentiation induction medium Differentiation Basal Medium-
  • supplementation hMSC Osteogenic SingleQuots®, Lonza, USA
  • the cells were cultured with only the replacement of the medium without administration of a solution containing additional functional bioactive material, and on day 18 of culture, the medium was removed and treated with 2% Alizarin red S (Sigma-Aldrich, USA) solution. Staining was performed. When the mineralization proceeds and the mineral is produced, it is dyed red as shown in FIG. 8, and 10% Cetylpyridinium chloride (Sigma-Aldrich, USA) is added thereto to react for 2 hours at room temperature to measure absorbance at 570 nm.
  • Alizarin red S Sigma-Aldrich, USA
  • the bone regeneration functional peptide test group (Comparative Example 3; SEQ ID NO: 3) coupled with the peptide having a titanium binding ability and the bone regeneration functional peptide where the peptide having a titanium binding ability were bound through a linker (comparison)
  • Example 4 SEQ ID NO: 4
  • the bone regeneration functional peptide in which the negative control group and the peptide having the titanium binding ability were coupled to the bone regeneration functional peptide test group (Comparative Example 3; SEQ ID NO: 3), and the negative control group and the peptide having the titanium binding ability were connected through the linker.
  • the peptide having a titanium binding ability according to the present invention is stably fixed to the titanium surface, the activity of the bioactive substance introduced into the peptide can be stably maintained on the titanium surface for a long time, and thus is useful for surgical regeneration treatment. .

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Abstract

본 발명은 티타늄 표면에 특이적인 결합능을 가지는 펩타이드에 관한 것으로, 본 발명에 따른 티타늄 결합 펩타이드는 티타늄 표면에 안정적으로 고정됨으로써, 상기 펩타이드에 도입된 생리활성 물질의 활성을 티타늄 표면에서 안정하게 장기간 동안 유지시킬 수 있으므로, 이를 이용한 외과적 재생 치료에 유용하다.

Description

티타늄 결합능을 가지는 펩타이드
본 발명은 티타늄 결합능을 가지는 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생리활성물질을 티타늄 표면에 안정하게 고정시켜 생리활성물질의 활성 (activity) 을 장기간 유지시킬 수 있도록 티타늄과 생리활성물질 간의 연결 기능을 하는 티타늄 표면에 특이적인 결합능을 가지는 펩타이드에 관한 것이다.
치과용 임플란트란 생체 내 치아가 상실된 부위에 이식하는 인공치아로서 상실된 치아의 기능적, 심미적 수복을 가능하게 하기 위해 널리 사용되고 있다. 자연치아와 비교하였을 때, 자연치아는 치주인대에 의해 치조골에 부착되어 있으나 치과용 임플란트는 인공치근과 골이 직접 부착되는 특징이 있다.
임플란트는 식립과 동시에 임플란트가 주변골에 접촉함으로써 발생하는 물리적인 고정력과, 식립 후 임플란트 주변에 신생골조직이 형성되고 주변골과의 골유착이 일어남으로써 얻어지는 생물학적인 고정력을 가지게 되지만 노인 환자는 골량의 부족 또는 골질의 저하로 인해 골유착에서 중요한 초기 안정성 확보가 어려운 경우가 발생할 수 있으며, 이러한 경우에는 임플란트의 조기 실패가 일어날 수 있다. 한편, 골량이 부족하고 저하된 골질을 가진 노인 환자뿐만 아니라 일반 성인 환자에서도 임플란트 식립 이후 초기 생착 및 치료기간의 단축을 위해 생물학적 인자의 적용이 필수적이다.
치과용 임플란트의 재료는 주로 금속, 세라믹, 고분자로 나눌 수 있으며, 오늘날 대부분의 치과용 임플란트는 공업용 순티탄 (Commercially pure titanium, cpTi) 또는 티타늄 합금 (Titanium alloy)으로부터 제조된다. 현재는 티타늄 및 그 합금으로 이루어진 임플란트와 골 사이의 계면을 향상시키기 위하여 임플란트의 표면을 개질하는 방법이 다양하게 사용되고 있다. 특히 임플란트의 골유착 기간을 단축시키기 위해 현재 주류를 이루고 있는 모래분사-산 부식 처리 (SLA) 표면에 골 형성에 도움이 되는 생물학적, 생화학적 입자 또는 성분을 첨가하는 5세대 임플란트 기술에 대한 연구가 진행 중이며, 조직공학을 응용하여 골 형성 반응을 향상시키는 단백질 등의 성장인자를 임플란트 표면에 부착시키는 기술이 연구되고 있다. 아파타이트를 재료로 한 임플란트의 경우에는 세포외 기질 단백질, 골형성 단백질이나 조직성장인자와 같은 생리활성 물질을 함께 사용하는 연구들이 진행된 바 있었고, 생체재료와 생리활성 물질을 함께 적용하거나 재료표면에 물질을 코팅한 GEM21S (PDGF 함유)나 INFUSE (BMP-2 함유)등의 제품이 개발되어 상용화 되었으나 생체 내에 이식했을 때, 생리활성 물질이 재료표면에 안정하게 고정되어 있지 않고 쉽게 방출되며 심지어는 이것이 전신혈에 노출되어 분해되기 때문에 생리활성능의 저하 뿐만 아니라 목적 조직 외에서 부작용이 발생할 수 있다는 문제점이 있었다. 티타늄 및 그 합금을 재료로 하는 임플란트의 경우에도 마찬가지로 다양한 표면 개질 및 생리활성 물질을 이용한 연구가 진행되고 있지만 표면 박리 가능성 등 안정성에는 아직 문제가 있다. 그러므로, 임플란트를 이용한 조직재생을 위해서는 생리활성 물질이 생체재료 표면에 안정하게 고정되어 장시간 동안 유효한 활성을 유지하도록 해야 할 필요가 있다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 임플란트 표면에 강한 결합 친화도를 가지는 짧은 펩타이드 서열을 발굴하여 상기 펩타이드가 티타늄 임플란트 표면에 쉽게 결합하여 안정한 상태로 유지되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 티타늄 결합능이 있는 펩타이드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 티타늄 결합능이 있는 펩타이드에 생리활성 펩타이드 또는 단백질이 결합되어 있는 펩타이드 결합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 또는 상기 펩타이드 결합체를 포함하는 생체재료를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 티타늄 결합능이 있는 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 티타늄 결합능이 있는 펩타이드에 생리활성 펩타이드 또는 단백질이 결합되어 있는 펩타이드 결합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 또는 상기 펩타이드 결합체를 포함하는 생체재료를 제공한다.
도 1은 티타늄 결합능이 있는 펩타이드(서열번호 1)와 대조군인 TBP-C 펩타이드(서열번호 2) 및 지르코니아 결합 펩타이드(서열번호 5)의 티타늄 결합 친화성을 확인하기 위해 아비딘-비오틴 콤플렉스 (Avidin-Biotin Complex)를 이용한 결합 어세이 (Binding assay)를 진행한 결과이다.
도 2는 티타늄 결합능이 있는 펩타이드(서열번호 1)와 대조군인 TBP-C 펩타이드(서열번호 2) 및 지르코니아 결합 펩타이드(서열번호 5)의 티타늄 결합 친화성을 확인하기 위해 아비딘-비오틴 콤플렉스 (Avidin-Biotin Complex)를 이용한 결합 어세이 (Binding assay)를 진행한 결과를 시각적으로 입증하기 위해 기질 물질을 ECL 용액 (Enhanced chemiluminescence)으로 대체하여 발광분석장치로 분석한 결과이다.
도 3은 티타늄 결합능이 있는 펩타이드(서열번호 1)의 티타늄 디스크 표면에 대한 최대 결합량을 확인하기 위해 아비딘-비오틴 콤플렉스 (Avidin-Biotin Complex)를 이용한 결합 어세이 (Binding assay)를 진행한 결과이다.
도 4는 도 3의 결과에서 X축을 로그 스케일 (Log-scale)로 표시한 결과이다.
도 5는 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 (서열번호 1), 티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 결합된 골재생 기능성 펩타이드(서열번호 3 또는 서열번호 4) 및 골재생 기능성 펩타이드(서열번호 6) 투여 시 세포 독성을 평가하기 위해 cell viability test를 진행한 결과이다.
도 6은 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 (서열번호 1), 티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 결합된 골재생 기능성 펩타이드(서열번호 3 또는 서열번호 4) 및 골재생 기능성 펩타이드(서열번호 6)의 1회 투여에 대한 골분화 유도 기능성 및 로딩능을 확인하기 위해, 18일 동안 PDLSC (Periodontal ligament stem cell)에서 ALP 활성 평가를 진행한 결과이다.
도 7은 도 6의 결과에서 배양 10일차의 ALP 활성을 표시한 결과이다.
도 8은 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 (서열번호 1), 티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 결합된 골재생 기능성 펩타이드(서열번호 3 또는 서열번호 4) 및 골재생 기능성 펩타이드(서열번호 6)의 1회 투여에 대한 골분화 유도 기능성 및 로딩능을 확인하기 위해, 18일 동안 PDLSC (Periodontal ligament stem cell)에서 광화 (mineralization) 성능 평가를 진행한 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 화학적인 수식 없이 티타늄 임플란트 표면에 결합할 수 있는 펩타이드를 용하여 생리활성 물질을 안정적으로 고정함으로써 생리활성 물질의 활성을 장기간 유지시킬 수 있도록 하기 위해, 파지 디스플레이(Phage display) 기법을 통해 티타늄 임플란트 표면에 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열을 발굴하고, 상기 펩타이드가 티타늄 표면에 안정하게 고정된 상태로 존재함을 규명하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 티타늄 결합능이 있는 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 다른 관점에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드의 티타늄 결합 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 이용한 티타늄 결합 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 티타늄 결합능이 있는 펩타이드는 생체재료로 사용되는 티타늄에 화학적인 수식 없이 결합하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서 상기 티타늄 결합능이 있는 펩타이드에 생리활성 펩타이드 또는 단백질이 결합되어 있는 펩타이드 결합체에 관한 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 티타늄 결합능이 있는 펩타이드에 생리활성 펩타이드 또는 단백질이 결합되어 있는 펩타이드 결합체의 향상된 생리활성 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 티타늄 결합능이 있는 펩타이드에 생리활성 펩타이드 또는 단백질이 결합되어 있는 펩타이드 결합체를 이용한 생리활성을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 상기 생리활성의 향상은 예를 들면 골 재생능의 향상이 있을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다
본 발명에 있어서, 티타늄 결합능이 있는 펩타이드와 생리활성 펩타이드의 결합체는 펩타이드 합성장치를 이용하여 화학적 합성 방법으로 제조할 수 있으며, 티타늄 결합능을 가지는 펩타이드의 C' 또는 N' 말단 부위에 생리활성 도메인을 순차적으로 화학 합성되도록 하여, N' 말단-티타늄 결합능이 있는 펩타이드-생리활성 도메인-C' 말단의 순서 또는 N' 말단-생리활성 도메인-티타늄 결합능이 있는 펩타이드-C'말단의 순서'로 합성하여 티타늄 결합능이 있는 펩타이드-생리활성 펩타이드(예: 골분화 유도서열) 결합체를 제조할 수 있다.
상기 생리활성 도메인인 펩타이드는 임플란트 식립 시 요구되는 골분화유도 또는 항염증 작용뿐만 아니라 세포 내 (In vitro) 혹은 생체 내 (In vivo)에서 유전표현과 생리기능을 조절하는 물질로서 생체 내에서 기능 조절에 관여하는 물질의 결핍이나 과도한 분비에 의해 비정상적인 병태를 보일 때 바로잡아 주는 역할을 할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 체내에서의 안정성을 고려하여 L-형 또는 D-형으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성 펩타이드는 항염증, 항미생물, 세포부착, 골조직재생 및 세포이동 기능성 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성 단백질은 조직재생인자, 조직성장인자, 세포내 전사인자, 세포 외 기질 단백질 및 항염증 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 및 생리활성 단백질 혹은 저분자 물질 결합체는 가교제를 이용하여 화학적 결합을 유도시켜 만들 수 있다. 가교제를 이용하여 화학적 결합을 유도 시킬 경우, 티타늄 결합능이 있는 펩타이드의 N' 말단에 자유 아미노기를 지니고 있어 가교제에 의한 복합체 형성이 용이하다.
본 발명에서 사용할 수 있는 가교제는 1,4-비스-말레이미 도부탄(1,4-bis-maleimidobutane, BMB), 1,11-비스-말레이미도테트라에틸렌글리콜(1,11-bismaleimidotetraethyleneglycol, BM[PEO]4), 1-에틸-3-[3-디메틸 아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride, EDC), 숙시니미딜-4-[N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카복시-[6-아미도카프로에이트]](succinimidyl-4-[N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy- [6-amidocaproate]], SMCC) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMCC), 숙시미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-로피오나미도]헥사노에이트](succimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-ropionamido] hexanoate, SPDP) 및 그의 설폰화염(sulfo-SPDP), m-말레이미도벤조일-N-하이드로시숙시니미드 에스터(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, MBS) 및 그의 설폰화염(sulfo-MBS), 숙시미딜[4-(p-말레이미도페닐) 부틸레이트](succimidyl[4-(p-maleimidophenyl) butyrate], SMPB) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMPB) 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드 결합체는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 및 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩타이드는 링커에 의해 연결될 수 있다. 상기 링커는 티타늄 결합능이 있는 펩타이드와 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩타이드가 기능적 구조를 형성할 수 있도록 공간을 부여할 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 링커로 활용할 수 있으며, 예를 들어, 상기 링커는 천연 및/또는 합성 기원의 펩타이드성 링커일 수 있다. 천연 및 또는 합성 기원의 펩타이드성 링커는 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 사슬로 이루어질 수 있고, 경첩 기능을 갖는 폴리펩티드와 같이 천연 발생 폴리펩티드의 반복적인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 펩타이드성 링커 아미노산 서열은 글리신, 글루타민, 및/또는 세린 잔기가 풍부하도록 지정된 합성 링커 아미노산 서열일 수 있다. 이들 잔기는 예를 들어 5개 이하의 아미노산의 작은 반복 단위로 배열될 수 있고 상기 작은 반복 단위는 멀티머 단위를 형성하도록 반복되어 배열 될 수 있다. 멀티머 단위의 아미노- 및/또는 카르복시 말단에서, 6개 이하의 추가의 임의의 천연 발생 아미노산이 첨가될 수 있다. 기타 합성 펩타이드성 링커는 10 내지 20회 반복되는 단일 아미노산 구성일 수 있고, 아미노- 및/또는 카르복시-말단에 6개 이하의 추가 임의의 천연 발생 아미노산일 수 있다. 한편, 상기 링커는 아미노산이 화학적으로 변형된 형태일 수 있으며, 예컨데, 블로킹 그룹(Blocking group)으로 Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)이 결합된 Fmoc-6-aminohexanoic acid (Fmoc-ε-Acp-OH)의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 또는 상기 펩타이드 결합체를 포함하는 생체재료에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 생체재료는 티타늄이 표면에 코팅된 금속, 티타늄을 함유하는 금속, 티타늄이 표면에 코팅된 천연 고분자, 티타늄과 혼합된 천연 고분자, 티타늄이 표면에 코팅된 합성 고분자, 티타늄과 혼합된 합성 고분자 및 티타늄으로 제작된 생체 이식용 임플란트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "임플란트"는 외과적으로 결손이 있는 부위에 골 이식 또는 골 신장술 등의 부가적인 수술을 통하여 생체 적합한 재료를 이식해 기능을 회복시켜주는 외과적 재료 또는 술식을 지칭한다. 이는 정상적인 기능이 유지되고 있는 주변 조직과 식립된 임플란트 본체 표면과의 생리적, 형태적, 직접적 결합인 골유착이 이루어진 후 본격적인 재생단계에 들어간다.
본 발명의 "티타늄"은 공업용 순티탄 (Commercially pure titanium, cpTi) 또는 티타늄 합금 (Titanium alloy)을 통틀어 이르는 말로서, 표면에 산화티타늄 (Titanium Oxide, TiO2) 필름 (Film)이 자연적으로 형성되기 때문에 부식에 매우 강하다. 또한 상기 산화티타늄 필름의 두께는 약 3 - 10 nm로 이 산화물 필름의 존재가 적절한 골유착을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 구강 내와 같은 악조건에서도 안정적이고 자연적으로 형성되는 장점을 가진다.
티타늄 임플란트는 현재 사용되는 지르코니아 세라믹 임플란트보다 다양한 표면 개질이 가능하다. 예를 들어 모래 분사 (sand-blasting) 방법은 단단하고 작은 모래 입자를 고속으로 충돌시켜 가공하는 방법으로 모래 이외의 금속 입자 등을 사용할 때에도 모래 분사라는 명칭을 사용하며, 티타늄의 경우 산화티타늄과 산화알루미늄 입자를 충돌시켜 임플란트 표면에 다공성 막을 만들기 위해 사용하는 기법이다. 다양한 표면 개질 방법을 통해 표면처리를 한 티타늄 임플란트는 그 표면에 대한 골세포의 부착능을 높일 수 있으며, 이는 임플란트의 초기 안정성에 영향을 줄 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 티타늄은 순수 산화티타늄에 5~7 중량 %의 알루미늄, 3~5 중량 %의 바나듐, 0 ~ 0.25 중량 %의 철, 0 ~ 0.2 중량 %의 산소로 구성된 합금인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 천연고분자는 콜라겐, 알긴산, 프로필렌글리콜, 알긴산, 황산 콘드로이틴 및 키토산으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 합성고분자는 폴리락틱글리콜산, 폴록사머 및 프로필렌 글리콜로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
티타늄이 표면에 코팅된 금속, 티타늄을 함유하는 금속, 티타늄이 표면에 코팅된 천연 고분자, 티타늄과 혼합된 천연 고분자, 티타늄이 표면에 코팅된 합성 고분자, 티타늄과 혼합된 합성 고분자 및 티타늄으로 제작된 생체 이식용 임플란트는 생체 내 이식 시, 상기 펩타이드와 화학적 결합 유도 없이 공유결합되어 활성을 유지한 채 생리활성물질을 안정한 상태로 존재할 수 있다. 즉, 임플란트 주변의 골조직 재생관련 세포의 이행, 증식 및 분화를 촉진하여 최종적으로 효율적인 조직재생 효과가 단시간 내에 발생하도록 하며 치료시간을 단축할 수 있고, 또한 임플란트 표면의 불안정 결합으로 인해 유도될 수 있는 전신 또는 타 조직에 대한 부작용을 감소시킬 수 있으므로, 외과적 재생 치료에 유용하다.
본 발명에서는 Subtractive panning이라는 새로운 파지 디스플레이 기법을 적용하여 티타늄 디스크 표면 외에 결합하는 서열일 가능성을 차단하였다.
본 발명의 "Subtractive panning"이란 특정 물질에는 결합하면서 다른 특정 물질에는 결합하지 않는 서열을 발굴하고자 할 때 사용할 수 있는 기법으로, 먼저 결합을 원치 않는 물질에 파지 라이브러리 (phage library)를 결합시키고 나서 결합하지 않은 파지만을 회수한 뒤, 다시 결합을 원하는 물질에 결합시키고 이번에는 결합하지 않은 파지는 버리고 결합한 파지만을 회수하는 방법이다(Munirathinam, Gnanasekar et. al., Novel Phage Display-Based Subtrative Screening To Identify Vaccine Candidates of Brugia malayi, Infect Immun., 72:4707-4715, 2004).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 파지 디스플레이를 이용한 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 서열 발굴
티타늄 디스크 표면에 결합하는 특정한 펩타이드 서열을 발굴하기 위하여 파지 디스플레이 방법 (Phage display)을 이용하였다. 다양성과 복잡성이 높은 랜덤 펩타이드 라이브러리 (Random peptide library)가 표지된 M13 파지들을 티타늄 디스크 표면에 붙인 뒤, 결합하지 않은 파지는 씻어내고 결합한 파지만을 회수하는 것을 여러 번 반복하였고, Subtractive panning을 적용하여 최종적으로 얻은 파지에 표지된 펩타이드에 대하여 이를 코딩하는 DNA를 서열 분석하여 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 서열을 발굴하였다. Subtractive panning은 특정 물질에는 결합하면서 그 외 다른 물질에는 결합하지 않는 서열을 발굴하고자 할 때 사용 가능한 새로운 파지 디스플레이 기법이다.
본 실시예에서는 파지 디스플레이를 통한 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 발굴에 폴리스티렌 플레이트 (polystrene plate) 웰(well)을 사용하므로, 티타늄 디스크 표면 외에 폴리스티렌 플레이트 (polystyrene plate)에 결합하는 펩타이드 서열을 배제하고자 이 기법을 추가하였다.
보다 상세하게는, 상기 언급된 보편적인 파지 디스플레이의 반복 사이클을 마친 이후에 얻은 파지를 다시 증폭시켜, 폴리스티렌 플레이트 (polystrene plate)의 빈 웰 (well) 에 대해 분주한 다음 웰 (well) 표면에 결합하지 않은 파지를 회수함으로써 폴리스티렌 플레이트에 결합하지 않는 파지들만 획득하였고, 이를 다시 한 번 티타늄 디스크 표면에 결합시킨 뒤, 워싱 (Washing) 용액으로 강하게 세척하여 최종적으로 남아있는 티타늄 디스크 표면에 결합된 파지들만 회수하였다.
파지 디스플레이 키트는 New England Biolabs (USA)의 Ph.D.-12 Phage Display Kit를 구입하여 사용하였으며, 상기 키트에서 제공하는 12 개 아미노산으로 구성된 랜덤 펩타이드 라이브러리가 표지된 파지들을 이용하여 발굴한 최종 17 개 클론을 대장균 배양액 상태로 (주)코스모진텍에 의뢰하여 서열 분석하였다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 14 개의 클론이 동일한 DNA 서열을 나타냄을 확인하였고 이를 번역하여 12 개 아미노산으로 구성된 최종 펩타이드 서열 TBP (SLNYTGHRPVVH: 서열번호 1; Titanium Binding Peptide)를 얻을 수 있었다. 상기 펩타이드 서열은 티타늄 디스크 표면에 결합하는 특이적 서열일 가능성이 높으므로, 티타늄 디스크 표면에 결합하는 특이적인 펩타이드 서열의 후보로 상기 펩타이드 서열을 선택하였다. 나머지 3개의 클론 중 2개의 클론은 8 개 아미노산으로 구성된 펩타이드 서열로 번역되었고, 1개의 클론은 12 개 아미노산으로 구성된 펩타이드 서열로 번역되었으나 이와 연결된 숏 링커(short linker) 서열 (3 개 아미노산)이 상기 키트를 이용한 발굴에서 나올 수 없는 서열로 판명되어 기각하였다.
Figure PCTKR2017002436-appb-T000001
실시예 2: 티타늄 결합능이 있는 펩타이드의 합성
TBP (SLNYTGHRPVVH: 서열번호 1; Titanium Binding Peptide) 내지 TBP-C (VSAAGTKASPAV; 서열번호 2; Titanium Binding Peptide-Control)의 펩타이드를 합성장치를 이용하여 C 말단으로부터 F-moc 고체상 화학합성방법으로 합성하였다. 즉, 블로킹 그룹(Blocking group)으로 Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)이 결합된 Rink resin (0.075mmol/g, 100 ~ 200 mesh, 1% DVB crosslinking)을 사용하여 합성하였으며, 합성기에 50mg의 Rink resin을 넣은 뒤 DMF로 resin을 스웰링(swelling) 시킨 후 Fmoc-group의 제거를 위해 20% piperidine/DMF 용액을 사용하였다. C 말단부터 서열대로 0.5M amino acid 용액(용매: 디메틸포름아마이드, DMF), 1.0M DIPEA(용매: 디메틸포름아마이드&엔메틸피롤리돈, DMF&NMP), 0.5M HBTU (용매: 디메틸포름아마이드, DMF)를 각각 5, 10, 5 당량씩 넣어 질소 기류하에서 1~2시간 동안 반응시켰다. 상기 디프로텍션(deprotection)과 커플링(coupling) 단계가 끝날 때마다 DMF와 NMP로 두 번씩 세척하는 과정을 거쳤다. 마지막 아미노산을 커플링(coupling) 시킨 후에도 디프로텍션(deprotection)을 해주어 Fmoc-group을 제거하였다.
합성의 확인은 닌하이드린 테스트(ninhydrin test) 방법을 이용하였고, 테스트를 거치고 합성이 완료된 레진(resin)은 테트라하이드로퓨란(THF)이나 디클로로메탄(DCM)으로 건조시킨 후 트리플루오로아세트산 (TFA) cleavage cocktail을 resin 1g 당 20ml의 비율로 넣어 3시간 shaking 시킨 후 필터링을 통해 resin과 펩타이드가 녹아 있는 cocktail을 분리하였다. 필터로 걸러진 용액을 진공증발농축기(rotary evaporator)를 이용하여 제거한 후 콜드 에테르(cold ether)를 넣어주거나 펩타이드가 녹아있는 TFA cocktail용액에 직접 콜드 에테르를 과량 넣어주어 펩타이드를 고체상으로 결정화시키고 이를 원심분리하여 분리해내었다. 이때 에테르로 여러 번 세척과 원심분리 과정을 거쳐 TFA cocktail을 완전히 제거하였다. 이렇게 해서 얻어진 펩타이드는 증류수에 녹여 동결건조하였다.
합성된 펩타이드는 레진으로부터 절단시켜 세척하고, 동결건조한 후 액체크로마토그래피에 의해 분리, 정제하였다. 정제된 펩타이드의 분자량을 Mass spectrometry를 통해 확인하였다.
비교예 1: TBP-C (VSAAGTKASPAV; 서열번호 2) 펩타이드 합성
티타늄 결합능이 있는 펩타이드의 대조군으로서 서열번호 1의 서열에서 C 말단으로부터 1번째, 6번째 히스티딘, 4번째 프롤린, 9번째 티로신이 알라닌으로 치환된 TBP-C (SLNATGARAVVA; 서열번호 2; Titanium Binding Peptide-Control)을 F-moc 고체상 화학합성 방법으로 펩타이드 합성장치를 이용하여 합성하였다.
비교예 2: 지르코니아 결합 펩타이드 합성
티타늄 결합능이 있는 펩타이드의 대조군으로서 기보유한 특허 서열인 지르코니아 결합 펩타이드 (VSPFGTKWSPFV; 서열번호 5, 특허출원 10-2015-0048441)를 F-moc 고체상 화학합성 방법으로 펩타이드 합성장치를 이용하여 합성하였다.
비교예 3: 티타늄 결합능이 있는 펩타이드와 결합된 골재생 기능성 펩타이드 합성
티타늄 결합능이 있는 펩타이드에 결합하여 성능 평가를 진행할 실험군으로서 기보유한 특허 서열인 골재생 기능성 펩타이드 (GLRSKSKKFRRPDIQYPDA; 서열번호 6, 특허출원 10-2011-0037839)를 티타늄 결합 펩타이드와 결합시킨 서열을 (SLNYTGHRPVVH GLRSKSKKFRRPDIQYPDA; 서열번호 3) F-moc 고체상 화학합성 방법으로 펩타이드 합성장치를 이용하여 합성하였다.
비교예 4: 티타늄 결합능이 있는 펩타이드와 링커를 통해 결합된 골재생 기능성 펩타이드 합성
티타늄 결합능이 있는 펩타이드에 결합하여 성능 평가를 진행할 실험군으로서 기보유한 특허 서열인 골재생 기능성 펩타이드 (GLRSKSKKFRRPDIQYPDA; 서열번호 6, 특허출원 10-2011-0037839)를 링커를 통해 티타늄 결합능이 있는 펩타이드와 결합한 서열을 (SLNYTGHRPVVH Linker GLRSKSKKFRRPDIQYPDA; 서열번호 4) F-moc 고체상 화학합성 방법으로 펩타이드 합성장치를 이용하여 합성하였다. 링커는 블로킹 그룹(Blocking group)으로 Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)이 결합된 Fmoc-6-aminohexanoic acid (Fmoc-ε-Acp-OH)를 사용하였으며, C 말단부터 서열대로 골재생 기능성 펩타이드 - 링커 - 티타늄 결합능이 있는 펩타이드의 순서로 합성하였다.
비교예 5: 골재생 기능성 펩타이드 합성
티타늄 결합능이 있는 펩타이드의 대조군으로서 기보유한 특허 서열인 골재생 기능성 펩타이드 (GLRSKSKKFRRPDIQYPDA; 서열번호 6, 특허출원 10-2011-0037839)를 F-moc 고체상 화학합성 방법으로 펩타이드 합성장치를 이용하여 합성하였다.
실시예 3: 티타늄 결합능이 있는 펩타이드의 티타늄과의 결합 친화성 (Binding affinity) 확인
3-1: 티타늄 결합능이 있는 펩타이드의 비오틴 표지 합성
실시예 1 및 비교예 1, 2의 펩타이드를 합성한 뒤 해당 펩타이드들의 티타늄과의 결합 친화성을 확인하기 위하여 비오틴을 표지하였다. 각각의 펩타이드에 제조사의 실험법에 따라 EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce Biotechnology, USA)을 사용하여 비오틴화(Biotinylation) 하였으며, 압력차를 추진력으로 이용하는 막분리법인 한외여과(Ultrafiltration)를 통해 결합되지 않은 부산물을 제거하였다. 이후, Mass spectrometry로 분자량을 측정함으로써 합성 결과물의 분자량을 확인하였다. 분석과 정제는 분석용 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (reverse phase liquid chromatography)를 이용하였다. 직경 4.6mm의 C18 컬럼을 이용하여 유속 1ml/min으로 0.1% TFA/H2O 와 0.092% TFA/아세토 나이트릴 (acetonitrile)를 0~60%의 변화를 주면서 30분간 흘려주는 방법으로 분석하였으며, 이때 자외선 검출기의 파장은 220nm로 하였다. 정제는 직경 2.2cm의 컬럼을 이용하여 유속 20ml/min으로 용매와 검출파장을 같은 조건으로 실시하였다. 비오틴이 결합된 펩타이드만을 일부 취하여 진공 증발 농축기(rotary evaporator)를 이용하여 용매를 제거한 후 동결 건조하였다.
3-2: 티타늄 결합능이 있는 펩타이드의 티타늄과의 결합 친화성 (Binding affinity) 측정
티타늄 결합능이 있는 펩타이드의 티타늄과의 결합 친화성을 아비딘-비오틴 복합체 (Avidin-Biotin Complex) 결합 어세이 (Binding assay)를 통해 측정하였다. 24-웰 (well) 폴리스티렌 플레이트 (polystyrene plate)의 각 well에 티타늄 디스크를 1 개씩 넣은 다음, 블로킹 용액 (0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3 (optional), filter sterilize)으로 최소 1 시간 이상 블록 (block) 한 뒤, 블로킹 용액을 버리고 워싱 용액 (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20) 으로 6 회 이상 강하게 세척한다. 이후 티타늄 디스크 표면에 실시예 3-1 에서 비오틴을 표지하여 합성, 분리, 정제한 실시예 1의 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 TBP (서열번호 1) 및 비교예 1, 2의 펩타이드 TBP-C (서열번호 2), ZBP (서열번호 5, 특허출원 10-2015-0048441) 를 100 nM 에서 1M 까지 농도별로 50 ㎕씩 분주하였다. 상온에서 15 시간 동안 반응시킨 뒤 각각에 알맞은 워싱 용액으로 6 회 이상 강하게 세척하고 ExtrAvidin-Peroxidase (Cat. #E2886, Sigma-Aldrich, USA) 를 블로킹 용액에 1 : 500 으로 희석하여 티타늄 디스크 표면에 50 ㎕씩 분주하였다. 이를 상온에서 1 시간 반응시킨 뒤 각각에 적절한 워싱 용액으로 6 회 이상 강하게 세척한 뒤, 기질 용액 (2,2'-AZINO-BIS, Cat. #A3219, Sigma-Aldrich, USA) 을 티타늄 디스크 표면에 50 ㎕ 분주하고 상온에서 20분 발색 반응하였다. 20분 뒤, 반응을 멈추기 위해 1 % SDS 용액을 50 ㎕씩 처리하고 405 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 TBP (서열번호 1) 및 비교예 1의 펩타이드 TBP-C (서열번호 2), 비교예 2의 펩타이드 ZBP (서열번호 5, 특허출원 10-2015-0048441) 를 처리하였을 때, 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 TBP의 흡광도 값이 비교예 1 및 2의 펩타이드 TBP-C 및 ZBP 에 비해 높게 나타났으며 농도 의존적인 경향을 보였다. 이는 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 서열이 티타늄 디스크 표면에 농도 의존적으로 결합하는 서열임을 입증하며 상기 펩타이드 서열이 결합 모티프를 가지고 있음을 입증하는 결과이다. 또한, 비교예 1 및 2의 펩타이드 TBP-C 및 ZBP 의 흡광도 값이 실시예 1의 티타늄 결합 펩타이드 TBP 에 비해 매우 낮게 나타났으며 농도와 관련 없이 경향성 없는 흡광도 값을 보였기에 이는 비교예 1, 2의 펩타이드 서열 TBP-C 와 ZBP 가 티타늄 디스크 표면에 결합하지 않는 것을 보여주는 결과이다.
이러한 결과를 시각적으로 확인하기 위해 발광분석장치 (Luminescent Image Analyzer, LAS-1000, Fujifilm, Japan)를 이용하여 검출하였다. 먼저 상기의 과정에서 처리한 기질 물질인 2,2'-AZINO-BIS를 제거하기 위해 각각에 적절한 워싱 용액으로 최소 3회 이상 세척한 뒤, ECL 용액 (Enhanced chemiluminescence)을 사용하여 발광분석장치로 분석한다. 그 결과, 도 2와 같이 티타늄 디스크에 결합한 펩타이드만이 검출되었으며, 이를 통해 실시예 1의 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 TBP 는 티타늄 디스크에 결합하며, 비교예 1 및 2의 펩타이드 TBP-C 및 ZBP 는 티타늄 디스크에 거의 결합하지 않음을 입증하였다.
실시예 4: 티타늄 결합능이 있는 펩타이드의 최대 결합량 확인
티타늄 결합능이 있는 펩타이드 TBP (서열번호 1)의 티타늄 디스크 표면의 단위 면적당 최대 결합량을 확인하기 위해 아비딘-비오틴 콤플렉스 (Avidin-Biotin Complex)를 이용한 결합 어세이 (Binding assay)를 진행하였다. 24-웰 (well) 폴리스티렌 플레이트 (polystyrene plate)의 각 well에 티타늄 디스크를 1 개씩 넣은 다음, 블로킹 용액(0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3 (optional), filter sterilize)으로 최소 1 시간 이상 블록 (block) 한다. 이후 블로킹 용액을 버리고 워싱 용액 (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20) 으로 강하게 6 회 이상 세척한 뒤, 티타늄 디스크 표면에 실시예 3-1 에서 비오틴 표지하여 합성, 분리, 정제한 실시예 1의 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 TBP (서열번호 1) 및 비교예 1, 2의 펩타이드 TBP-C (서열번호 2), ZBP (서열번호 5, 특허출원 10-2015-0048441) 를 100 nM 에서 40 mM 까지 농도별로 50 ㎕씩 분주하였다. 상온에서 15 시간 동안 반응시킨 뒤 워싱 용액으로 강하게 세척하고 ExtrAvidin-Peroxidase (Cat. #E2886, Sigma-Aldrich, USA) 를 블로킹 용액에 1 : 500 으로 희석하여 티타늄 디스크 표면에 50 ㎕씩 분주하였다. 상온에서 1 시간 반응시킨 뒤 워싱 용액으로 강하게 세척한 뒤, 기질 용액 (2,2'-AZINO-BIS, Cat. #A3219, Sigma-Aldrich, USA) 을 티타늄 디스크 표면에 50 ㎕ 분주하고 상온에서 20 분 반응시켜 발색하였다. 반응을 멈추기 위해 1 % SDS 용액 50 ㎕씩 처리하고 405 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 3과 도 4에 나타난 바와 같이, 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 TBP (서열번호 1)의 100 μM 농도에서 최대로 포화된 흡광도 값을 확인하였다. 티타늄 결합능이 있는 펩타이드의 분자량과 분주량을 통해 역산해보면 8.025 ㎍의 티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 티타늄 디스크 1 개 표면에 최대 결합하는 양이다. 따라서, 티타늄 디스크의 지름이 10 mm이므로, 티타늄 디스크 표면 면적 1 mm2 당 약 0.10223㎍의 티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 고정될 수 있다고 계산할 수 있다.
실시예 5: 티타늄 결합능이 있는 펩타이드와 결합된 골재생 기능성 펩타이드의 in vitro 세포 독성 평가
티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 결합된 골재생 기능성 펩타이드(서열번호 3 또는 서열번호 4) 및 티타늄 결합 펩타이드(서열번호 1) 단독 투여 시 세포 독성을 평가하기 위해 cell viability test를 진행하였다.
24-웰 (well) 저부착성 (low attachment) 폴리스티렌 플레이트 (polystyrene plate)의 각 well에 티타늄 디스크를 1 개씩 넣은 다음, 블로킹 용액 (0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3 (optional), filter sterilize)으로 최소 1 시간 이상 블록 (block) 한다. 이후 블로킹 용액을 버리고 워싱 용액 (DPBS : Dulbeccos phosphate buffered saline) 으로 3 회 이상 세척한 뒤, 티타늄 디스크 표면에 표 2와 같은 용액을 각각 50 ㎕씩 분주하여 코팅 (coating) 하였다. 상온에서 15 시간 동안 반응시킨 뒤 워싱 용액 (DPBS) 으로 3 회 이상 세척하고, 디스크 1 개 당 3×104 개의 PDLSC 세포가 10% FBS (Fetal Bovine Serum) 과 1% antibiotic-antimycotic solution (Thermo Fisher Scientific, USA) 가 첨가된 배지 (Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modifications, Hyclone, USA) 50㎕에 부유하도록 조절하여 분주하였다. 최소 7 시간 후 디스크 표면에 세포가 부착된 것을 확인하고 배지를 디스크가 잠기도록 추가하여 3일 간 배양한 뒤, 세포를 떼어 trypan blue로 염색하고 혈구계 (hematocytometer)로 숫자를 세어 생존 세포수를 계산하였다.
생리활성물질 NT 음성대조군 TBP TBP-골재생 기능성 펩타이드 TBP-Linker-골재생 기능성 펩타이드 골재생 기능성 펩타이드 BMP-2
농도 x 100μM 100μM 100μM 100μM 100ng/ml
결과적으로, 표 3과 같이 생존 세포수가 계산되었으며 음성대조군과 비교하였을 때 도 5와 같이 세포의 생존률을 계산할 수 있었다. 이것으로 티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 결합된 골재생 기능성 펩타이드(서열번호 3 또는 서열번호 4) 또는 티타늄 결합 펩타이드(서열번호 1) 단독 투여 시, 음성대조군과 비교하여 3일 간 배양하는 동안 세포에 독성이 없음을 입증하였다.
Total cell number NT 음성대조군 TBP TBP-골재생 기능성 펩타이드 TBP-Linker-골재생 기능성 펩타이드 골재생 기능성 펩타이드 BMP-2
#1 8.0×104 7.0×104 7.5×104 6.0×104 7.5×104 4.5×104
#3 7.0×104 7.0×104 8.0×104 7.5×104 6.5×104 7.5×104
Average 7.5×104 7.0×104 7.8×104 6.8×104 7.0×104 6.0×104
SD 5.0×103 ㅡ 2.5×103 7.5×103 5.0×103 1.5×104
실시예 6: 티타늄 결합능이 있는 펩타이드와 결합된 골재생 기능성 펩타이드의 in vitro 기능 평가
6-1: 티타늄 결합능이 있는 펩타이드와 결합된 골재생 기능성 펩타이드의 ALP 활성 측정
티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 결합된 골재생 기능성 펩타이드(서열번호 3 또는 서열번호 4) 또는 티타늄 결합 펩타이드(서열번호 1)의 1회 투여에 대한 골분화 유도 기능성 및 로딩능을 확인하기 위해, PDLSC (Periodontal ligament stem cell)에서 ALP 활성 평가를 진행하였다. 24-웰 (well) 저부착성 (low attachment) 폴리스티렌 플레이트 (polystyrene plate)의 각 well에 티타늄 디스크를 1 개씩 넣은 다음, 블로킹 용액 (0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3 (optional), filter sterilize)으로 최소 1 시간 이상 블록 (block) 한다. 이후 블로킹 용액을 버리고 워싱 용액 (DPBS : Dulbeccos phosphate buffered saline) 으로 3 회 이상 세척한 뒤, 티타늄 디스크 표면에 실시예 5의 표 2와 같은 용액을 각각 50 ㎕씩 분주하여 코팅 (coating) 하였다. 상온에서 15 시간 동안 반응시킨 뒤 워싱 용액 (DPBS)으로 3 회 이상 세척하고, 디스크 1 개 당 3×104 개의 PDLSC 세포가 10% FBS (Fetal Bovine Serum)와 1% antibiotic-antimycotic solution (Thermo Fisher Scientific, USA) 가 첨가된 배지 (Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modifications, Hyclone, USA) 50 ㎕에 부유하도록 조절하여 분주하였다. 최소 7 시간 후 디스크 표면에 세포가 부착된 것을 확인하고 배지를 디스크가 잠기도록 추가하여 배양한 뒤, 다음날 보충제 (hMSC Osteogenic SingleQuots®, Lonza, USA) 가 추가된 골분화 유도 배지 (Differentiation Basal Medium-Osteogenic, Lonza, USA) 로 교체하여 18일 간 배양하였다.
최초 1회의 디스크 표면 코팅 후 18일 간 추가적인 기능성 생리활성물질이 포함된 용액의 투여 없이 배지만 교체하면서 배양하였고, 배양 0일, 6일, 10일, 13일, 18일 차에 배양액 (cultured media) 을 회수하여 ALP 활성 측정 키트 (Alkaline phosphatase assay kit, cat#.ab83369, abcam, USA) 를 이용하여 ALP 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 것과 같이, 티타늄 결합 펩타이드와 결합되지 않은 골재생 기능성 펩타이드 (비교예 5; 서열번호 6) 실험군 및 BMP-2(Bone morphogenic protein) 대조군에서는 유의한 ALP 활성의 변화가 관찰되지 않았다. 배양 시간과 처리 물질의 종류에 따른 유효성을 확인하기 위해 반복이 있는 이원 배치 분산 분석 (Two-way ANOVA) 을 시행하였을 때, 배양 시간과 처리해 준 물질의 종류에 따라서 각각 ALP 활성에 차이가 존재하고, 또한 배양 시간과 처리 물질이 상호작용 효과가 있음을 확인 (p<0.05) 하였다. 또한 배양 10일차에서 각각 처리해 준 물질들 사이의 ALP 활성 차이가 통계적으로 유의한지 알아보기 위해 배양 10일차의 ALP 활성 결과만 따로 검정하였다. 도 7에 나타난 것과 같이, 배양 10일차에서 NT (negative control) 음성대조군과 티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 결합된 골재생 기능성 펩타이드 (비교예 3; 서열번호 3) 실험군 사이, 음성대조군과 티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 링커를 통해 결합된 골재생 기능성 펩타이드 (비교예 4; 서열번호 4) 실험군 사이에 통계적 유의성이 있고 (p<0.05), 티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 결합된 골재생 기능성 펩타이드 (비교예 3; 서열번호 3) 실험군과 티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 링커를 통해 결합된 골재생 기능성 펩타이드 (비교예 4; 서열번호 4) 실험군 두 집단 사이에는 유의성이 없음 (p>0.05) 을 T-검정으로 확인하였다. 또한 음성대조군, BMP-2 대조군, 골재생 기능성 펩타이드 단독 실험군 (비교예 5; 서열번호 6)의 세 집단 사이에는 통계적 유의성이 없음 (p>0.05) 을 일원 배치 분산 분석 (One-way ANOVA) 으로 확인하였다.
결론적으로, 비교예 3 및 4와 같이, 실시예 1의 티타늄 결합 펩타이드 TBP와 결합된 상태의 골재생 기능성 펩타이드 만이 18일 간의 배양 기간 동안 ALP 활성에 통계적으로 유의한 변화를 보여주었으며, 티타늄 결합능이 있는 펩타이드와 결합하지 않은 기능성 생리활성물질은 유의한 ALP 활성의 변화를 나타내지 못함을 입증하였다.
6-2: 티타늄 결합능이 있는 펩타이드와 결합된 골재생 기능성 펩타이드의 광화 (mineralization) 성능 평가
티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 결합된 골재생 기능성 펩타이드(서열번호 3 또는 서열번호 4)의 1회 투여에 대한 골분화 유도 기능성 및 로딩능을 확인하기 위해, PDLSC (Periodontal ligament stem cell)에서 광화 (mineralization) 성능 평가를 진행하였다. 24-웰 (well) 저부착성 (low attachment) 폴리스티렌 플레이트 (polystyrene plate)의 각 well에 티타늄 디스크를 1 개씩 넣은 다음, 블로킹 용액 (0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3 (optional), filter sterilize)으로 최소 1 시간 이상 블록 (block) 한다. 이후 블로킹 용액을 버리고 워싱 용액 (DPBS : Dulbeccos phosphate buffered saline) 으로 3 회 이상 세척한 뒤, 티타늄 디스크 표면에 실시예 5의 표 2와 같은 용액을 각각 50 ㎕씩 분주하여 코팅 (coating) 하였다. 상온에서 15 시간 동안 반응시킨 뒤 워싱 용액 (DPBS) 으로 3 회 이상 세척하고, 디스크 1 개 당 3×104 개의 PDLSC 세포가 10% FBS (Fetal Bovine Serum)과 1% antibiotic-antimycotic solution (Thermo Fisher Scientific, USA)가 첨가된 배지 (Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modifications, Hyclone, USA) 50 ㎕에 부유하도록 조절하여 분주하였다. 최소 7 시간 후 디스크 표면에 세포가 부착된 것을 확인하고 배지를 디스크가 잠기도록 추가하여 배양한 뒤, 다음날 보충제 (hMSC Osteogenic SingleQuots®, Lonza, USA)가 추가된 골분화 유도 배지 (Differentiation Basal Medium-Osteogenic, Lonza, USA)로 교체하여 18일 간 배양하였다.
최초 1회의 디스크 표면 코팅 후 18일 간 추가적인 기능성 생리활성물질이 포함된 용액의 투여 없이 배지만 교체하면서 배양하였고, 배양 18일차에 배지를 제거하고 2% Alizarin red S (Sigma-Aldrich, USA) 용액으로 염색을 실시하였다. 광화 작용이 진행되어 미네랄이 생성되면 도 8과 같이 붉은 색으로 염색이 되며, 이를 10% Cetylpyridinium chloride (Sigma-Aldrich, USA) 를 첨가하여 상온에서 2시간 반응시켜 녹여내 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 티타늄 결합능이 있는 펩타이드와 결합된 골재생 기능성 펩타이드 실험군 (비교예 3; 서열번호 3) 및 티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 링커를 통해 결합된 골재생 기능성 펩타이드 (비교예 4; 서열번호 4) 실험군에서 미네랄 생성이 활발히 일어났다는 것을 육안으로 확인할 수 있었다. 또한 흡광도 측정 결과도 티타늄 결합능이 있는 펩타이드와 결합된 골재생 기능성 펩타이드가 광화 작용을 확실히 나타냄을 입증하였다. 통계적 유의성을 확인한 결과, 음성대조군과 티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 결합된 골재생 기능성 펩타이드 실험군 (비교예 3; 서열번호 3) 사이, 음성대조군과 티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 링커를 통해 결합된 골재생 기능성 펩타이드 실험군 (비교예 4; 서열번호 4) 사이에 통계적 유의성이 있고 (p<0.05), 음성대조군과 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 단독 (서열번호 1) 실험군 사이, 티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 결합된 골재생 기능성 펩타이드 (비교예 3; 서열번호 3) 실험군과 티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 링커를 통해 결합된 골재생 기능성 펩타이드 (비교예 4; 서열번호 4) 실험군 사이에는 유의성이 없음 (p>0.05) 을 T-검정으로 확인하였다. 또한 음성대조군, BMP-2 대조군, 골재생 기능성 펩타이드 (비교예 5; 서열번호 6) 단독 실험군의 세 집단 사이에는 통계적 유의성이 없음 (p>0.05) 을 일원 배치 분산 분석 (One-way ANOVA)으로 확인하였다.
이를 통해 실시예 1의 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 TBP가 결합된 도입 조건 하에서만 티타늄 소재의 디스크 또는 임플란트 표면에 기능성 생리활성물질이 안정적으로 부착하여 작용 시간 동안 유지될 수 있고, 티타늄 결합능이 있는 펩타이드가 부재하는 경우에는 생리활성물질이 티타늄 소재의 디스크 또는 임플란트 표면에서 소실되어 그 기능을 나타내지 못한다는 것을 입증하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 티타늄 결합능이 있는 펩타이드는 티타늄 표면에 안정적으로 고정됨으로써, 상기 펩타이드에 도입된 생리활성물질의 활성을 티타늄 표면에서 안정하게 장기간 동안 유지시킬 수 있으므로, 이를 이용한 외과적 재생 치료에 유용하다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 티타늄 결합능이 있는 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 화학적인 수식 없이 티타늄에 결합하는 것을 특징으로 하는 티타늄 결합능이 있는 펩타이드.
  3. 제1항의 티타늄 결합능이 있는 펩타이드에 생리활성 펩타이드 또는 생리활성 단백질이 결합되어 있는 펩타이드 결합체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 생리활성 펩타이드는 항염증, 항미생물, 세포부착, 골조직재생 및 세포이동 기능성 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드 결합체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 생리활성 단백질은 조직재생인자, 조직성장인자, 세포내 전사인자, 세포 외 기질 단백질 및 항염증 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드 결합체.
  6. 제3항에 있어서, 상기 펩타이드 결합체는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 펩타이드 결합체.
  7. 제1항의 티타늄 결합능이 있는 펩타이드 또는 제3항의 펩타이드 결합체를 포함하는 생체재료.
  8. 제7항에 있어서, 상기 생체재료는 티타늄이 표면에 코팅된 금속, 티타늄을 함유하는 금속, 티타늄이 표면에 코팅된 천연 고분자, 티타늄과 혼합된 천연 고분자, 티타늄이 표면에 코팅된 합성 고분자, 티타늄과 혼합된 합성 고분자 및 티타늄으로 제작된 생체 이식용 임플란트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생체재료.
  9. 제8항에 있어서, 상기 티타늄은 순수 산화티타늄에 5~7 중량 %의 알루미늄, 3~5 중량%의 바나듐, 0 ~ 0.25 중량%의 철, 0 ~ 0.2 중량%의 산소로 구성된 합금인 것을 특징으로 하는 생체재료.
  10. 제8항에 있어서, 상기 천연고분자는 콜라겐, 알긴산, 프로필렌글리콜, 알긴산, 황산 콘드로이틴 및 키토산으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생체재료.
  11. 제8항에 있어서, 상기 합성고분자는 폴리락틱글리콜산, 폴록사머 및 프로필렌 글리콜로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생체재료.
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