KR20200123132A

KR20200123132A - 융합 단백질

Info

Publication number: KR20200123132A
Application number: KR1020207024000A
Authority: KR
Inventors: 이페이 이노우에
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2018-02-21
Filing date: 2019-02-21
Publication date: 2020-10-28
Also published as: US20200392193A1; JPWO2019163871A1; CN111712574A; EP3757218A4; CN111712574B; JP7501356B2; EP3757218A1; JP2024052886A; WO2019163871A1

Abstract

본 발명은, 신규 약물 송달계(DDS), 전자 디바이스의 제작 등의 용도로 유망한 수단을 제공한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, (a) 페리틴 단량체, 및 (b) 페리틴 단량체에서의 B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역 중에 삽입된 기능성 펩티드를 포함하는, 융합 단백질, 및 (a) 페리틴 단량체, 및 (b) 페리틴 단량체에서의 B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역 중에 삽입된 기능성 펩티드를 포함하는 융합 단백질로 구성되어 있고, 또한 내강을 갖는, 다량체 등을 제공한다.

Description

융합 단백질

본 발명은, 융합 단백질 등에 관한 것이다.

페리틴은, 동식물에서 미생물까지 보편적으로 존재하는, 복수의 단량체로 구성되는 내강을 갖는 구상 단백질이다. 인간 등의 동물에서는, 페리틴으로서 H쇄 및 L쇄의 2종의 단량체가 존재하는 것, 및 페리틴은 24개의 단량체로 구성되는 다량체(많은 경우, H쇄 및 L쇄의 혼합물)인 것이 알려져 있다. 한편, 미생물에서는, 페리틴은, Dps(기아 세포로부터의 DNA-결합 단백질(DNA-binding protein from starved cells))라고도 불리고 있으며, 12개의 단량체로 구성되는 다량체인 것이 알려져 있다. 페리틴은, 생체 혹은 세포 중의 철 원소의 호메오스타시스에 깊게 관여하고 있고, 그 내강 중에 철을 유지할 수 있기 때문에, 철의 수송·저장 등의 생리학적 기능의 역할을 담당하는 것이 알려져 있다. 페리틴은, 철 이외에도, 베릴륨, 갈륨, 망간, 인, 우라늄, 납, 코발트, 니켈, 크롬 등의 금속의 산화물, 또한, 셀렌화카드뮴, 황화아연, 황화철, 황화카드뮴 등의 반도체·자성체 등의 나노 입자를 인공적으로 저장할 수 있는 것으로 나타났고, 반도체 재료 공학 분야나 의료 분야에서의 응용 연구가 활발히 행해지고 있다(비특허문헌 1).

현재까지, 페리틴 단량체와 펩티드와의 융합 단백질로서, (1) 페리틴 단량체의 말단 영역에 펩티드를 부가한 융합 단백질, 및 (2) 페리틴 단량체의 내부 영역(말단 영역 이외의 영역)에 펩티드를 삽입한 융합 단백질이 몇가지 보고되어 있다.

예를 들어, 상기 (1)의 융합 단백질로서, 이하의 보고가 있다.

특허문헌 1 및 비특허문헌 1은, 페리틴 단량체의 한쪽의 말단 영역에 산화티탄을 부가한 융합 단백질을 조제한 것, 및 조제한 융합 단백질이 전자 디바이스(예, 반도체)의 제작에 유용하다는 것을 개시하고 있다.

특허문헌 2는, Dps의 양쪽의 말단 영역에 소정의 펩티드를 부가한 융합 단백질을 조제한 것, 및 조제한 융합 단백질이 특수한 다공질 구조를 갖는 전자 디바이스의 제작에 유용하다는 것을 개시하고 있다.

상기 (2)의 융합 단백질로서는, 인간 페리틴 L쇄의 D 영역 및 E 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역(페리틴 단량체의 N 말단에서부터 세어 5번째 및 6번째의 α-헬릭스 사이의 영역)에 소정의 펩티드를 삽입한 융합 단백질의 보고가 있다.

예를 들면, 비특허문헌 2 및 3, 및 특허문헌 3은, 인간 페리틴 L쇄에서의 D 영역 및 E 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역 중에 소정의 펩티드(예, 인터루킨-4 수용체(IL-4R) 표적 펩티드)를 삽입한 융합 단백질의 다량체(예, AP1-PBNC)를 조제한 것, 및 당해 다량체가 암 등의 질환의 치료에 유용하다는 것을 개시하고 있다.

비특허문헌 4는, 인간 페리틴 L쇄에서의 D 영역 및 E 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역 중에 프로테아제 분해성 펩티드를 삽입한 융합 단백질의 다량체를 조제한 것, 및 당해 다량체가 프로테아제 반응성 송달계로서 유용하다는 것을 개시하고 있다.

특허문헌 1: 국제공개 제2006/126595호 특허문헌 2: 국제공개 제2012/086647호 특허문헌 3: 미국 특허출원 공개 제2016/0060307호 명세서

비특허문헌 1: K. Sano et al., Nano Lett., 2007, vol.7. p.3200. 비특허문헌 2: Jae Og Jeon et al., ACS Nano(2013), 7 (9), 7462-7471. 비특허문헌 3: Sooji Kim et al., Biomacromolecules(2016), 17(3), 1150-1159. 비특허문헌 4: Young Ji Kang et al., Biomacromolecules(2012), 13(12), 4057-4064.

본 발명의 목적은, 신규 약물 송달계(DDS), 전자 디바이스의 제작 등의 용도로 유망한 수단을 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 예의 검토한 결과, 각종 생물의 페리틴 단량체에서 고도로 보존되어 있는 B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역 중에 기능성 펩티드를 삽입한 융합 단백질로 구성되는 다량체가 표적과 강하게 상호 작용할 수 있는 것을 발견했다. 예를 들어, 이러한 다량체는, 각종 생물의 페리틴 단량체에서 고도로 보존되어 있는 D 영역 이후의 영역〔예, 선행 기술에서 보고되어 있는, D 영역과 E 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역〕 중에 기능성 펩티드를 삽입한 융합 단백질로 구성되는 다량체에 비해, 표적과 보다 강하게 상호 작용할 수 있다. 따라서, 본원 발명자들은 이러한 다량체가 신규 약물 송달계(DDS), 전자 디바이스의 제작 등의 용도에 유망하다는 것을 밝혀 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본원 발명은 이하와 같다.

〔1〕 (a) 페리틴 단량체, 및 (b) 페리틴 단량체에서의 B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역 중에 삽입된 기능성 펩티드를 포함하는, 융합 단백질.

〔2〕 페리틴 단량체가 인간 페리틴 단량체인, 〔1〕의 융합 단백질.

〔3〕 인간 페리틴 단량체가 인간 페리틴 H쇄인, 〔1〕 또는 〔2〕의 융합 단백질.

〔4〕 인간 페리틴 단량체가 인간 페리틴 L쇄인, 〔1〕 또는 〔2〕의 융합 단백질.

〔5〕 페리틴 단량체가 Dps 단량체인, 〔1〕의 융합 단백질.

〔6〕 기능성 펩티드가, 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드인, 〔1〕 내지 〔5〕 중 어느 하나의 융합 단백질.

〔7〕 표적 재료가 무기물인, 〔6〕의 융합 단백질.

〔8〕 무기물이 금속 재료인, 〔7〕의 융합 단백질.

〔9〕 표적 재료가 유기물인, 〔6〕의 융합 단백질.

〔10〕 유기물이 생체 유기 분자인, 〔9〕의 융합 단백질.

〔11〕 생체 유기 분자가 단백질인, 〔10〕의 융합 단백질.

〔12〕 시스테인 잔기, 또는 시스테인 잔기 함유 펩티드가, 융합 단백질의 C 말단에 부가되어 있는, 〔1〕 내지 〔11〕 중 어느 하나의 융합 단백질.

〔13〕 (a) 페리틴 단량체, 및 (b) 페리틴 단량체에서의 B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역 중에 삽입된 기능성 펩티드를 포함하는 융합 단백질로 구성되어 있고, 또한 내강을 갖는, 다량체.

〔14〕 (1) 〔13〕의 다량체, 및 (2) 표적 재료를 포함하고,

표적 재료가, 상기 융합 단백질 중의 기능성 펩티드에 결합되어 있는, 복합체.

〔15〕〔1〕 내지 〔12〕 중 어느 하나의 융합 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.

〔16〕〔15〕의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.

〔17〕〔15〕의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.

페리틴 단량체에서의 B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역 중에 기능성 펩티드를 삽입한, 페리틴 단량체 및 기능성 펩티드의 융합 단백질을 포함하는 다량체는, 표적과 매우 강하게 상호 작용할 수 있다. 본 발명에 의해, 이러한 상호 작용 능력이 뛰어난 다량체뿐만 아니라, 이러한 다량체의 조제에 사용할 수 있는 단량체인 융합 단백질, 및 이러한 다량체를 사용하여 제공할 수 있는 복합체가 제공된다. 또한, 본 발명에 의해, 이러한 융합 단백질, 다량체 및 복합체의 조제에 유용한 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 및 숙주 세포도 제공된다.

[도 1-1] 도 1-1은, 동적 광산란법(DLS)에 의한 FTH-BC-TBP의 입자 직경 및 용액 분산성의 평가를 나타내는 도면이다. FTH-BC-TBP는, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 티타늄 인식 펩티드(minTBP1)가 삽입 융합된 인간 유래 페리틴 H쇄이다.
[도 1-2] 도 1-2는, 동적 광산란법(DLS)에 의한 FTH-D-TBP의 입자 직경 및 용액 분산성의 평가를 나타내는 도면이다. FTH-D-TBP는, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 4번째와 5번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 금 인식 펩티드(GBP1)가 삽입 융합된 인간 유래 페리틴 H쇄이다.
[도 2] 도 2는, 수정 진동자 마이크로밸런스(QCM)법에 의한, 티타늄 성막에 대한 FTH-BC-TBP 및 FTH-D-TBP의 흡착성의 평가를 나타내는 도면이다.
[도 3] 도 3은, 수정 진동자 마이크로밸런스(QCM)법에 의해 측정된, FTH-BC-TBP 및 FTH-D-TBP 농도에 대한 주파수의 변화를 나타내는 도면이다. 각 농도에 대한 주파수의 변화를 측정하고, 다음으로, 각 농도의 역수와 주파수 변화의 역수와의 상관 관계를 플롯하고, 그 기울기로부터 해리 평형 상수 KD값을 구했다.
[도 4] 도 4는, FHBc에 대하여, 3% 인텅스텐산 염색에 의한 투과형 전자 현미경(TEM)상(像)(바구니상(狀) 형상)을 나타내는 도면이다. FHBc는, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 아암(arm) 인식 RGD 펩티드가 삽입 융합되고, C 말단에 시스테인이 추가된 인간 유래 페리틴 H쇄이다.
[도 5] 도 5는, 동적 광산란법(DLS)에 의한, 산화철 나노 입자를 봉입한 FHBc의 입자 직경 및 용액 분산성의 평가를 나타내는 도면이다.
[도 6-1] 도 6-1은, 동적 광산란법(DLS)에 의한 FTH-BC-GBP의 입자 직경 및 용액 분산성의 평가를 나타내는 도면이다. FTH-BC-GBP는, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 금 인식 펩티드(GBP1)가 삽입 융합된 인간 유래 페리틴 H쇄이다.
[도 6-2] 도 6-2는, 동적 광산란법(DLS)에 의한 FTH-D-GBP의 입자 직경 및 용액 분산성의 평가를 나타내는 도면이다. FTH-D-GBP는, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 4번째와 5번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 금 인식 펩티드(GBP1)가 삽입 융합된 인간 유래 페리틴 H쇄이다.
[도 7] 도 7은, 수정 진동자 마이크로밸런스(QCM)법에 의한, 금 박막에 대한 FTH-BC-GBP 및 FTH-D-GBP의 흡착성의 평가를 나타내는 도면이다. 각 농도에 대한 주파수의 변화를 측정하고, 다음으로, 각 농도의 역수와 주파수 변화의 역수와의 상관 관계를 플롯하고, 그 기울기로부터 해리 평형 상수 KD값을 구했다.
[도 8] 도 8은, FTL-BC-GBP의 모식적 입체 구조를 나타내는 도면이다. FTL-BC-GBP는, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 금 인식 펩티드(GBP1)가 삽입 융합된 인간 유래 페리틴 L쇄이다.
[도 9] 도 9는, FTL-DE-GBP의 모식적 입체 구조를 나타내는 도면이다. FTL-DE-GBP는, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 5번째와 6번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 금 인식 펩티드(GBP1)가 삽입 융합된 인간 유래 페리틴 L쇄이다.
[도 10] 도 10은, 수정 진동자 마이크로밸런스(QCM)법에 의한, 금 박막에 대한 FTL-BC-GBP 및 FTL-DE-GBP의 흡착성의 평가를 나타내는 도면이다. FTL-BC-GBP 및 FTL-DE-GBP 농도에 대한 주파수의 변화를 측정하고, 다음으로, 각 농도의 역수와 주파수 변화의 역수와의 상관 관계를 플롯하고, 그 기울기로부터 해리 평형 상수 KD값을 구했다.
[도 11] 도 11은, BCDps-CS4에 대하여, 3% 인텅스텐산 염색에 의한 투과형 전자 현미경(TEM)상(바구니상 형상)을 나타내는 도면이다. BCDps-CS4는, 페리틴의 대응 영역과 C 말단에 이종 펩티드가 삽입된 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 유래의 Dps이다.
[도 12] 도 12는, 수정 진동자 마이크로밸런스(QCM)법에 의한, 금 박막에 대한 FTH-BC-GBP 및 FTH-DE-GBP의 흡착성의 평가를 나타내는 도면이다. FTH-BC-GBP 및 FTH-DE-GBP 농도에 대한 주파수의 변화를 측정하고, 다음으로, 각 농도의 역수와 주파수 변화의 역수와의 상관 관계를 플롯하고, 그 기울기로부터 해리 평형 상수 KD값을 구했다.

본 발명은, (a) 페리틴 단량체, 및 (b) 페리틴 단량체에서의 B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역 중에 삽입된 기능성 펩티드를 포함하는, 융합 단백질을 제공한다.

페리틴(다량체 단백질)은, 다양한 생물에 보편적으로 존재한다. 따라서, 본 발명에서는, 페리틴을 구성하는 페리틴 단량체로서, 다양한 생물의 페리틴 단량체를 사용할 수 있다. 페리틴 단량체가 유래하는 생물로서는, 예를 들면, 동물, 곤충, 어류, 식물 등의 고등 생물, 및 미생물을 들 수 있다. 동물로서는, 포유 동물 또는 조류(예, 닭)가 바람직하고, 포유 동물이 보다 바람직하다. 포유 동물로서는, 예를 들어, 영장류(예, 인간, 원숭이, 침팬지), 설치류(예, 생쥐, 쥐, 햄스터, 기니피그, 토끼), 가축 및 사역용의 포유 동물(예, 소, 돼지, 양, 염소, 말)을 들 수 있다. 페리틴 단량체로서는, H쇄 또는 L쇄 중 어느 것도 사용할 수 있다. 페리틴 단량체로서는, 천연으로 발생하는 페리틴 단량체, 또는 그 변이체를 모두 사용할 수 있다.

일 실시형태에서는, 페리틴 단량체는, 인간 페리틴 단량체이다. 인간에 대한 임상 응용의 관점에서, 페리틴 단량체로서 인간 페리틴 단량체를 사용하는 것이 바람직하다. 인간 유래 페리틴 단량체로서, 인간 페리틴 H쇄, 또는 인간 페리틴 L쇄 모두 사용할 수 있다.

바람직하게는, 인간 페리틴 H쇄는, 이하라도 좋다:

(A1) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(B1) 서열 번호 2의 아미노산 서열에 있어서, 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및 부가로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 1 혹은 수개의 아미노산 잔기의 수식을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 다량체(예, 24량체) 형성능을 갖는 단백질; 또는

(C1) 서열 번호 2의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 다량체(예, 24량체) 형성능을 갖는 단백질.

바람직하게는, 인간 페리틴 L쇄는, 이하라도 좋다:

(A2) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(B2) 서열 번호 4의 아미노산 서열에 있어서, 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및 부가로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 1 혹은 수개의 아미노산 잔기의 수식을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 다량체(예, 24량체) 형성능을 갖는 단백질; 또는

(C2) 서열 번호 4의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 다량체(예, 24량체) 형성능을 갖는 단백질.

다른 실시형태에서는, 페리틴 단량체는, 미생물 페리틴 단량체이다. 미생물 페리틴은, Dps라고도 불린다. Dps는, 그것이 유래하는 세균의 종류에 따라서는 NapA, 박테리오페리틴, Dlp 또는 MrgA로 칭호되는 경우가 있고, 또한, Dps에는, DpsA, DpsB, Dps1, Dps2 등의 서브 타입이 알려져 있다(T.Haikarainen and A.C.Papageorgion, Cell.Mol.Life Sci., 2010 vol.67, p.341를 참조). 따라서, 본 발명에서는, 미생물 페리틴 단량체로서, Dps 또는 상기 별칭 단백질의 단량체를 사용할 수 있다.

미생물 페리틴으로서는, 다양한 미생물의 페리틴이 알려져 있다(예, 국제공개 제2012/086647호). 이러한 미생물로서는, 예를 들어, 리스테리아(Listeria)속, 스타필로코커스(Staphylococcus)속, 바실러스(Bacillus)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 비브리오(Vibrio)속, 전체 합성시아(전체 합성)속, 브루셀라(Brucella)속, 보렐리아(Borrelia)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 캄필로박터(Campylobacter)속, 써모시네코코커스(Thermosynechococcus)속, 및 데이노코커스(Deinococcus)속, 및 코리네박테리움(Corynebacterium)속에 속하는 세균을 들 수 있다. 리스테리아속에 속하는 세균으로서는, 예를 들어, 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)를 들 수 있다. 스타필로코커스속에 속하는 세균으로서는, 예를 들면, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus Aureus)를 들 수 있다. 바실러스속에 속하는 세균으로서는, 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 들 수 있다. 스트렙토코커스속에 속하는 세균으로서는, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)를 들 수 있다. 비브리오속에 속하는 세균으로서는, 예를 들어, 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)를 들 수 있다. 에스케리시아속에 속하는 세균으로서는, 예를 들어, 에스케리시아 콜라이(전체 합성 coli)를 들 수 있다. 브루셀라속에 속하는 세균으로서는, 예를 들어, 브루셀라 멜리텐시스(Brucella Melitensis)를 들 수 있다. 보렐리아속에 속하는 세균으로서는, 예를 들어, 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia Burgdorferi)를 들 수 있다. 마이코박테리움속에 속하는 세균으로서는, 예를 들어, 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)를 들 수 있다. 캄필로박터속에 속하는 세균으로서는, 예를 들어, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)를 들 수 있다. 써모시네코코커스속에 속하는 세균으로서는, 예를 들어, 써모시네코코커스 엘롱가투스(Thermosynechococcus Elongatus)를 들 수 있다. 데이노코커스속에 속하는 세균으로서는, 예를 들어, 데이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans)를 들 수 있다. 코리네박테리움(Corynebacterium)속에 속하는 세균으로서는, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)을 들 수 있다. 따라서, 본 발명에서는, 미생물 페리틴 단량체로서, 이러한 미생물의 페리틴 단량체를 사용할 수 있다.

바람직하게는, 미생물 페리틴 단량체는, 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 페리틴(Dps) 단량체라도 좋다. 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 페리틴(Dps) 단량체는, 이하라도 좋다:

(A3) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(B3) 서열 번호 6의 아미노산 서열에 있어서, 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및 부가로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 1 혹은 수개의 아미노산 잔기의 수식을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 다량체(예, 12량체) 형성능을 갖는 단백질; 또는

(C3) 서열 번호 6의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 다량체(예, 12량체) 형성능을 갖는 단백질.

단백질 (B1) 내지 (B3)에서는, 아미노산 잔기의 결실, 치환, 부가 및 삽입으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4종의 수식에 의해, 1개 또는 수개의 아미노산 잔기를 개변할 수 있다. 아미노산 잔기의 수식은, 아미노산 서열 중의 하나의 영역에 도입되어도 좋지만, 복수의 다른 영역에 도입되어도 좋다. 용어 「1 또는 수개」는, 단백질의 활성을 크게 손상하지 않는 개수를 나타낸다. 용어 「1 또는 수개」가 나타내는 수는, 예를 들면 1 내지 50개, 바람직하게는 1 내지 40개, 보다 바람직하게는 1 내지 30개, 보다 더욱 바람직하게는 1 내지 20개, 특히 바람직하게는 1 내지 10개 또는 1 내지 5개(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개)이다.

단백질 (C1) 내지 (C3)에서는, 대상의 아미노산 서열에 대한 상동성의 정도는, 바람직하게는 92% 이상이고, 보다 바람직하게는 95% 이상이고, 보다 더욱 바람직하게는 97% 이상이며, 가장 바람직하게는 98% 이상 또는 99% 이상이다. 아미노산 서열의 상동성(즉, 동일성 또는 유사성)은, 예를 들어 Karlin 및 Altschul에 의한 알고리즘 BLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)), Pearson에 의한 FASTA(MethodsEnzymol., 183, 63(1990))를 사용하여 결정할 수 있다. 이 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTP, BLASTN으로 불리는 프로그램이 개발되어 있으므로(http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조), 이러한 프로그램을 디폴트 설정으로 사용하여, 상동성을 계산해도 좋다. 또한, 상동성으로서는, 예를 들어, Lipman-Pearson법을 채용하고 있는 가부시키가이샤 제네틱스의 소프트웨어 GENETYX Ver7.0.9를 사용하여, ORF에 코드되는 폴리펩티드 부분 전장(全長)을 사용하여, 유닛 크기 대 비교 (Unit Size to Compare)=2의 설정에서 유사성을 퍼센트(percentage_ 계산하였을 때의 수치를 사용해도 좋다. 혹은, 상동성은, NEEDLE 프로그램(J Mol Biol 1970; 48: 443-453) 검색에서, 디폴트 설정의 파라미터(갭 페널티(Gap penalty)=10, 연장 페널티(Extend penalty)=0.5, 매트릭스(Matrix)=EBLOSUM62)를 사용하여 얻어진 값(Identity)이라도 좋다. 이러한 계산으로 도출되는 상동성 %의 값 중, 가장 낮은 값을 채용해도 좋다. 상동성 %로서는, 바람직하게는 동일성 %가 이용된다.

아미노산 서열에 있어서 변이를 도입해야 할 아미노산 잔기의 위치는, 당업자에게 명확하지만, 서열 얼라인먼트를 추가로 참고로 하여 특정되어도 좋다. 구체적으로는, 당업자는, 1) 복수의 아미노산 서열을 비교하고, 2) 상대적으로 보존되어 있는 영역, 및 상대적으로 보존되어 있지 않은 영역을 명확하게 하고, 다음으로, 3) 상대적으로 보존되어 있는 영역 및 상대적으로 보존되어 있지 않은 영역에서, 각각, 기능에 중요한 역할을 할 수 있는 영역 및 기능에 중요한 역할을 할 수 없는 영역을 예측할 수 있으므로, 구조·기능의 상관성을 인식할 수 있다. 따라서, 당업자는, 서열 얼라인먼트를 이용함으로써 아미노산 서열에 있어서 변이를 도입해야 할 위치를 특정할 수 있고, 또한, 기지(旣知)의 2차 및 3차 구조 정보를 병용하여, 아미노산 서열에 있어서 변이를 도입해야 할 아미노산 잔기의 위치를 특정할 수도 있다.

아미노산 잔기가 치환에 의해 변이되는 경우, 아미노산 잔기의 치환은, 보존적 치환이라도 좋다. 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 용어 「보존적 치환」이란, 소정의 아미노산 잔기를, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 말한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는, 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 이러한 패밀리로서는, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예, 아스파라긴산, 글루타민산), 비하전성(非荷電性) 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β-분기 측쇄를 갖는 아미노산(예, 트레오닌, 발린, 이소류신), 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘), 하이드록실기(예, 알콜성, 페놀성) 함유 측쇄를 갖는 아미노산(예, 세린, 트레오닌, 티로신), 및 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산(예, 시스테인, 메티오닌)을 들 수 있다. 바람직하게는, 아미노산의 보존적 치환은, 아스파라긴산과 글루타민산과의 사이에서의 치환, 아르기닌과 라이신과 히스티딘과의 사이에서의 치환, 트립토판과 페닐알라닌과의 사이에서의 치환, 페닐알라닌과 발린과의 사이에서의 치환, 류신과 이소류신과 알라닌과의 사이에서의 치환, 및 글리신과 알라닌과의 사이에서의 치환이라도 좋다.

고등 생물의 페리틴 단량체는, 다양한 고등 생물 사이에서 고도로 보존된 6개의 α-헬릭스를 갖는 것, 및 고등 생물의 페리틴 단량체로서 H쇄 및 L쇄의 2종의 단량체가 존재하는 것이 알려져 있다. 한편, 미생물의 페리틴 단량체(Dps 단량체)는, 다양한 미생물 사이에서 고도로 보존된 5개의 α-헬릭스를 갖는 것, 및 미생물의 페리틴 단량체로서는 1종의 단량체가 존재하는 것이 알려져 있다. 고등 생물 및 미생물의 페리틴 단량체는, A 영역, B 영역, C 영역, 및 D 영역 중의 α-헬릭스가 고도로 보존되어 있다. 고등 생물의 페리틴 단량체에서는, 미생물의 페리틴 단량체에 존재하는 B 영역과 C 영역의 경계 중의 α-헬릭스의 결손이 확인된다. 한편, 미생물의 페리틴 단량체에서는, 고등 생물의 페리틴 단량체에 존재하는 E 영역 중의 α-헬릭스의 결손이 확인된다. 고등 생물의 페리틴 단량체로서 인간 페리틴 단량체, 미생물의 페리틴 단량체로서 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 페리틴 단량체를 예로 들어서, α-헬릭스의 위치를 요약하면, 이하의 표 1에 나타내는 바와 같다.

각종 생물의 페리틴 단량체에서 고도로 보존되어 있는 B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역(인간 등의 고등 생물에서는, 페리틴 단량체의 N 말단에서부터 세어 2번째 및 3번째의 α-헬릭스 사이의 영역; 및 미생물에서는, 페리틴(Dps) 단량체의 N 말단에서부터 세어 2번째 및 4번째의 α-헬릭스 사이의 영역)에 기능성 펩티드를 삽입한 융합 단백질로 구성되는 다량체는, 각종 생물의 페리틴 단량체에서 고도로 보존되어 있는 D 영역 이후의 영역〔예, 선행 기술에서 보고되어 있는, D 영역과 E 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역(예, 페리틴 단량체의 N 말단에서부터 세어 5번째 및 6번째의 α-헬릭스 사이의 영역)〕에 기능성 펩티드를 삽입한 융합 단백질로 구성되는 다량체에 비해, 표적과 보다 강하게 상호 작용할 수 있다.

페리틴 단량체에서의 B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스는, 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 또한, 당업자라면, 각종 생물 유래의 페리틴 단량체에 있어서, B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스의 위치를 적절하게 특정할 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서 기능성 펩티드가 삽입되는 B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역도 또한, 당해 분야에 공지되어 있으며, 또한, 당업자라면 적절히 특정할 수 있다. 예를 들어, 인간 페리틴 H쇄(서열 번호 2) 등의 고등 등물(等物) 페리틴 H쇄에 대한 기능성 펩티드의 이러한 삽입 위치로서는, 78 내지 96번(바람직하게는 83 내지 91번)의 아미노산 잔기로 이루어진 영역 중의 임의의 위치를 이용할 수 있다. 또한, 인간 페리틴 L쇄(서열 번호 4) 등의 고등 등물 페리틴 L쇄에 대한 기능성 펩티드의 이러한 삽입 위치로서는, 74 내지 92번(바람직하게는 79 내지 87번)의 아미노산 잔기로 이루어진 영역 중의 임의의 위치를 이용할 수 있다. 추가로, 리스테리아 이노쿠아 Dps(서열 번호 6) 등의 미생물 페리틴 단량체 Dps에 대한 기능성 펩티드의 이러한 삽입 위치로서는, 67 내지 94번(바람직하게는 82 내지 94번)의 아미노산 잔기로 이루어진 영역 중의 임의의 위치를 이용할 수 있다. 실시예에서 구축된 각종 융합 단백질에서는, 다양한 기능성 펩티드(예, 티타늄 인식 펩티드, 아암 인식 펩티드, 금 인식 펩티드)가, 이하의 표 2에 나타내는 바와 같이, 소정의 페리틴 단량체 중의 원하는 부위에 삽입되어 있다.

기능성 펩티드로서는, 목적 단백질과 융합된 경우에 임의의 기능을 목적 단백질에 부가할 수 있는 펩티드를 사용할 수 있다. 이러한 펩티드로서는, 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드, 프로테아제 분해성 펩티드, 세포 투과성 펩티드, 안정화 펩티드를 들 수 있다. 본 발명에서는, 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드를 페리틴의 제2 및 제3 α-헬릭스 사이의 영역에 삽입한 융합 단백질로 구성되는 다량체가, 동 펩티드를 페리틴의 제5 및 제6 α-헬릭스 사이의 영역에 삽입한 융합 단백질로 구성되는 다량체에 비해, 표적 재료의 결합능이 뛰어나다는 것이 밝혀졌다. 이것은, 제2 및 제3 α-헬릭스 사이의 영역에 삽입된 펩티드가, 제5 및 제6 α-헬릭스 사이의 영역에 삽입된 펩티드에 비해, 표적과 보다 강하게 상호 작용할 수 있는 것을 나타낸다. 따라서, 기능성 펩티드로서, 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드를 사용한 경우뿐만 아니라, 다른 펩티드(예, 프로테아제 분해성 펩티드)를 사용한 경우도, 표적(예, 프로테아제)과 강하게 상호 작용할 수 있다고 생각되기 때문에, 본 발명은, 이러한 다른 펩티드를 기능성 펩티드로서 사용하는 경우도 유용하다.

상술한 영역 중에 삽입되는 기능성 펩티드는, 원하는 기능을 갖는 1개의 펩티드만이라도 좋고, 또는 원하는 기능을 갖는 동종 혹은 이종의 복수(예, 2개, 3개 혹은 4개 등의 수개)의 펩티드라도 좋다. 기능성 펩티드가 상기와 같은 복수의 펩티드인 경우, 복수의 기능성 펩티드는, 임의의 순서로 삽입되어, 페리틴 단량체와 융합할 수 있다. 융합은, 아미드 결합을 통해서 달성할 수 있다. 융합은, 아미드 결합에 의해 직접적으로 달성되어도 좋고, 혹은 1개의 아미노산 잔기(예, 메티오닌) 또는 수개(예를 들면 2 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2, 3, 4 또는 5개)의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드(펩티드 링커)가 개재된 아미드 결합에 의해 간접적으로 달성되어도 좋다. 다양한 펩티드 링커가 알려져 있으므로, 본 발명에서도, 이러한 펩티드 링커를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상술한 영역 중에 삽입되는 펩티드의 전체의 길이는, 20개의 아미노산 잔기 이하이다.

기능성 펩티드로서, 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드를 사용하는 경우, 표적 재료로서는, 예를 들면, 유기물 및 무기물(예, 도체, 반도체 및 자성체)을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 이러한 표적 재료로서는, 생체 유기 분자, 금속 재료, 실리콘 재료, 탄소 재료, 단백질 정제용 태그(예, 히스티딘 태그, 말토오스 결합 단백질 태그, 글루타티온-S-트랜스페라아제)와 상호 작용할 수 있는 재료(예, 니켈, 말토오스, 글루타티온), 표지 물질(예, 방사성 물질, 형광 물질, 색소), 폴리머(예, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리에틸렌옥사이드 또는 폴리(L-락트산) 등의 소수성 유기 폴리머 또는 전도성 폴리머)를 들 수 있다.

생체 유기 분자로서는, 예를 들어, 단백질(예, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드), 핵산(예, DNA 또는 RNA, 혹은 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드), 당질(예, 모노사카라이드, 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드), 지질을 들 수 있다. 생체 유기 분자는 또한, 세포 표면 항원(예, 암 항원, 심 질환 마커, 당뇨병 마커, 신경 질환 마커, 면역 질환 마커, 염증 마커, 호르몬, 감염증 마커)이라도 좋다. 생체 유기 분자는 또한, 질환 항원(예, 암 항원, 심 질환 마커, 당뇨병 마커, 신경 질환 마커, 면역 질환 마커, 염증 마커, 호르몬, 감염증 마커)이라도 좋다. 이러한 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 다양한 펩티드가 보고되고 있다. 예를 들어, 단백질에 대한 결합능을 갖는 펩티드(예, F.Danhier et al., Mol. Pharmaceutics, 2012, vol.9, No.11, p.2961., C-H.Wu et al., Sci. Transl. Med., 2015, vol.7, No.290, 290ra91. L.Vannucci et. al. Int. J. Nanomedicine. 2012, vol.7, p.1489, J.Cutrera et al., Mol. Ther. 2011, vol.19(8), p.1468, R. Liu et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2017, vol.110-111, p.13을 참조), 핵산에 대한 결합능을 갖는 펩티드(예, R. Tan et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol.92, p.5282, R. Tan et. al. Cell, 1993, vol.73, p.1031, R. Talanian et. al. Biochemistry. 1992, vol.31, p.6871을 참조), 당질에 대한 결합능을 갖는 펩티드(예, K.Oldenburg et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol.89, No.12, p.5393-5397., K.Yamamoto et. al., J.Biochem., 1992, vol.111, p.436, A.Baimiev et. al., Mol. Biol. (Moscow), 2005, vol.39, No.1, p.90.을 참조), 지질에 대한 결합능을 갖는 펩티드(예, O.Kruse et. al., B Z. Naturforsch., 1995, vol.50c, p.380, O.Silva et. al., Sci.Rep., 2016, vol.6, 27128., A.Filoteo et. al., J.Biol.Chem., 1992, vol.267, No.17, p.11800을 참조) 등의 다양한 펩티드가 보고되고 있다.

바람직하게는, 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 단백질에 대한 결합능을 갖는 펩티드라도 좋다. 단백질에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 예를 들면, 문헌(참조: Danhier et al., Mol. Pharmaceutics, 2012, vol.9, No.11, p.2961)에 개시되는 RGD 함유 펩티드나 그 개변 서열(예, RGD(서열 번호 37), ACDCRGDCFCG(서열 번호 38), CDCRGDCFC(서열 번호 39), GRGDS(서열 번호 40), 및 ASDRGDFSG(서열 번호 16)), 및 기타 인테그린 인식 서열(예, EILDV(서열 번호 41), 및 REDV(서열 번호 42)), L.Vannucci et.al.Int.J.Nanomedicine. 2012, vol.7, p.1489에 개시되는 펩티드(예, SYSMEHFRWGKP(서열 번호 43)), J.Cutrera et al., Mol. Ther. 2011, vol.19, No.8, p.1468에 개시되는 펩티드(예, VNTANST(서열 번호 44)), 문헌(참조: R. Liu et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2017, vol.110-111, p.13에 개시되는 펩티드(예, DHLASLWWGTEL(서열 번호 45), 및 NYSKPTDRQYHF(서열 번호 46), IPLPPPSRPFFK(서열 번호 47), LMNPNNHPRTPR(서열 번호 48), CHHNLTHAC(서열 번호 49), CLHHYHGSC(서열 번호 50), CHHALTHAC(서열 번호 51), SPRPRHTLRLSL(서열 번호 52), TMGFTAPRFPHY(서열 번호 53), NGYEIEWYSWVTHGMY(서열 번호 54), FRSFESCLAKSH(서열 번호 55), YHWYGYTPQNVI(서열 번호 56), QHYNIVNTQSRV(서열 번호 57), QRHKPRE(서열 번호 58), HSQAAVP(서열 번호 59), AGNWTPI(서열 번호 60), PLLQATL(서열 번호 61), LSLITRL(서열 번호 62), CRGDCL(서열 번호 63), CRRETAWAC(서열 번호 64), RTDLDSLRTYTL(서열 번호 65), CTTHWGFTLC(서열 번호 66), APSPMIW(서열 번호 67), LQNAPRS(서열 번호 68), SWTLYTPSGQSK(서열 번호 69), SWELYYPLRANL(서열 번호 70), WQPDTAHHWATL(서열 번호 71), CSDSWHYWC(서열 번호 72), WHWLPNLRHYAS(서열 번호 73), WHTEILKSYPHE(서열 번호 74), LPAFFVTNQTQD(서열 번호 75), YNTNHVPLSPKY(서열 번호 76), YSAYPDSVPMMS(서열 번호 77), TNYLFSPNGPIA(서열 번호 78), CLSYYPSYC(서열 번호 79), CVGVLPSQDAIGIC(서열 번호 80), CEWKFDPGLGQARC(서열 번호 81), CDYMTDGRAASKIC(서열 번호 82), KCCYSL(서열 번호 83), MARSGL(서열 번호 84), MARAKE(서열 번호 85), MSRTMS(서열 번호 86), WTGWCLNPEESTWGFCTGSF(서열 번호 87), MCGVCLSAQRWT(서열 번호 88), SGLWWLGVDILG(서열 번호 89), NPGTCKDKWIECLLNG(서열 번호 90), ANTPCGPYTHDCPVKR(서열 번호 91), IVWHRWYAWSPASRI(서열 번호 92), CGLIIQKNEC(서열 번호 93), MQLPLAT(서열 번호 94), CRALLRGAPFHLAEC(서열 번호 95), IELLQAR(서열 번호 96), TLTYTWS(서열 번호 97), CVAYCIEHHCWTC(서열 번호 98), THENWPA(서열 번호 99), WHPWSYLWTQQA(서열 번호 100), VLWLKNR(서열 번호 101), CTVRTSADC(서열 번호 102), AAAPLAQPHMWA(서열 번호 103), SHSLLSS(서열 번호 104), ALWPPNLHAWVP(서열 번호 105), LTVSPWY(서열 번호 106), SSMDIVLRAPLM(서열 번호 107), FPMFNHWEQWPP(서열 번호 108), SYPIPDT(서열 번호 109), HTSDQTN(서열 번호 110), CLFMRLAWC(서열 번호 111), DMPGTVLP(서열 번호 112), DWRGDSMDS(서열 번호 113), VPTDTDYS(서열 번호 114), VEEGGYIAA(서열 번호 115), VTWTPQAWFQWV(서열 번호 116), AQYLNPS(서열 번호 117), CSSRTMHHC(서열 번호 118), CPLDIDFYC(서열 번호 119), CPIEDRPMC(서열 번호 120), RGDLATLRQLAQEDGVVG(서열 번호 121), SPRGDLAVLGHK(서열 번호 122), SPRGDLAVLGHKY(서열 번호 123), CQQSNRGDRKRC(서열 번호 124), CMGNKCRSAKRP(서열 번호 125), CGEMGWVRC(서열 번호 126), GFRFGALHEYNS(서열 번호 127), CTLPHLKMC(서열 번호 128), ASGALSPSRLDT(서열 번호 129), SWDIAWPPLKVP(서열 번호 130), CTVALPGGYVRVC(서열 번호 131), ETAPLSTMLSPY(서열 번호 132), GIRLRG(서열 번호 133), CPGPEGAGC(서열 번호 134), CGRRAGGSC(서열 번호 135), CRGRRST(서열 번호 136), CNGRCVSGCAGRC(서열 번호 137), CGNKRTRGC(서열 번호 138), HVGGSSV(서열 번호 139), RGDGSSV(서열 번호 140), SWKLPPS(서열 번호 141), CRGDKRGPDC(서열 번호 142), GGKRPAR(서열 번호 143), RIGRPLR(서열 번호 144), CGFYWLRSC(서열 번호 145), RPARPAR(서열 번호 146), TLTYTWS(서열 번호 147), SSQPFWS(서열 번호 148), YRCTLNSPFFWEDMTHEC(서열 번호 149), KTLLPTP(서열 번호 150), KELCELDSLLRI(서열 번호 151), IRELYSYDDDFG(서열 번호 152), NVVRQ(서열 번호 153), VECYLIRDNLCIY(서열 번호 154), CGGRRLGGC(서열 번호 155), WFCSWYGGDTCVQ(서열 번호 156), NQQLIEEIIQILHKIFEIL(서열 번호 157), KMVIYWKAG(서열 번호 158), LNIVSVNGRH(서열 번호 159), QMARIPKRLARH(서열 번호 160), 및 QDGRMGF(서열 번호 161)) 또는 그들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 혹은 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.

바람직하게는, 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 핵산에 대한 결합능을 갖는 펩티드라도 좋다. 핵산에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 예를 들면, 문헌(참조: R. Tan et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol.92, p.5282)에 개시되는 펩티드(예, TRQARRN(서열 번호 162), TRQARRNRRRRWRERQR(서열 번호 163), TRRQRTRRARRNR(서열 번호 164), NAKTRRHERRRKLAIER(서열 번호 165), MDAQTRRRERRAEKQAQWKAA(서열 번호 166), 및 RKKRRQRRR)(서열 번호 167)), R. Tan et. al. Cell, 1993, vol.73, p.1031에 개시되는 펩티드(예, TRQARRNRRRRWRERQR(서열 번호 168)), 문헌(참조: Talanian et. al. Biochemistry. 1992, vol.31, p.6871)에 개시되는 펩티드(예, KRARNTEAARRSRARK(서열 번호 169)), 또는 그들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 혹은 이와 같은 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.

바람직하게는, 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 당질에 대한 결합능을 갖는 펩티드라도 좋다. 당질 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 예를 들면, 문헌(참조: K.Oldenburg et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol.89, No12, p.5393-5397.에 개시되는 펩티드(예, DVFYPYPYASGS(서열 번호 170), 및 RVWYPYGSYLTASGS(서열 번호 171)), 문헌(참조: K. Yamamoto et. al., J. Biochem., 1992, vol.111, p.436)에 개시되는 펩티드(예, DTWPNTEWS(서열 번호 172), DSYHNIW(서열 번호 173), DTYFGKAYNPW(서열 번호 174), 및 DTIGSPVNFW(서열 번호 175)), 문헌 (참조: A. Baimiev et. al., Mol. Biol.(Moscow), 2005, vol.39, No.1, p.90)에 개시되는 펩티드(TYCNPGWDPRDR(서열 번호 176), 및 TFYNEEWDLVIKDEH(서열 번호 177)) 또는 그것들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 혹은 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.

바람직하게는, 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 지질에 대한 결합능을 갖는 펩티드라도 좋다. 지질에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 예를 들면, 문헌(참조: O. Kruse et. al., Z. Naturforsch., 1995, vol.50c, p.380에 개시되는 펩티드(예, MTLILELVVI(서열 번호 178), MTSILEREQR(서열 번호 179), 및 MTTILQQRES(서열 번호 180)), 문헌(참조: O. Silva et. al., Sci. Rep., 2016, vol.6, 27128)에 개시되는 펩티드(예, VFQFLGKIIHHVGNFVHGFSHVF(서열 번호 181)), 문헌(참조: A. Filoteo et. al., J. Biol. Chem., 1992, vol.267(17), p.11800)에 개시되는 펩티드(예, KKAVKVPKKEKSVLQGKLTRLAVQI(서열 번호 182)) 또는 그것들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 혹은 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.

금속 재료로서는, 예를 들면, 금속 및 금속 화합물을 들 수 있다. 금속으로서는, 예를 들어, 티타늄, 금, 크롬, 아연, 납, 망간, 칼슘, 구리, 칼슘, 게르마늄, 알루미늄, 갈륨, 카드뮴, 철, 코발트, 은, 백금, 팔라듐, 하프늄, 텔루르를 들 수 있다. 금속 화합물로서는, 예를 들어, 이러한 금속의 산화물, 황화물, 탄산화물, 비화물, 염화물, 불화물 및 요오드화물, 및 금속간 화합물을 들 수 있다. 이러한 금속 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 다양한 펩티드가 보고되고 있다(예, 국제공개 제2005/010031호; 국제공개 제2012/086647호; K.Sano et al., Langmuir, 2004, vol.21, p.3090; S.Brown, Nat.Biotechnol., 1997, vol.15. p.269; K.Kjaergaard et al., Appl.Environ.Microbiol., 2000, vol.66. p.10; Umetsu et al., Adv.Mater., 17, 2571-2575(2005); M.B.Dickerson et al., Chem. Commun., 2004, vol.15. p.1776.; C.E.Flynn et al., J.Mater.Chem., 2003, vol.13. p.2414). 따라서, 본 발명에서는, 이러한 다양한 펩티드를 사용할 수 있다. 또한, 금속에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 금속의 석출(mineralization) 작용을 가질 수 있는 것, 및 금속 화합물에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 금속 화합물의 석출 작용을 가질 수 있는 것이 알려져 있다(예, K.Sano et al., Langmuir, 2004, vol.21, p.3090., M.Umetsu et al., Adv.Mater., 2005, vol.17, p.2571). 따라서, 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서, 금속 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드를 사용하는 경우, 금속 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 이러한 석출 작용을 가질 수 있다.

바람직하게는, 금속 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 티타늄 또는 티타늄 화합물(예, 산화티탄) 등의 티타늄 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드, 및 금 또는 금 화합물 등의 금 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드라도 좋다. 티타늄 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 예를 들면, 후술하는 실시예 및 국제공개 제2006/126595호에 개시되는 펩티드(예, RKLPDA(서열 번호 7), 문헌(참조: M.J.Pender et al., Nano Lett., 2006, vol.6, No.1, p.40-44)에 개시되는 펩티드(예, SSKKSGSYSGSKGSKRRIL(서열 번호 183)), 문헌(참조: I.Inoue et al., J.Biosci.Bioeng., 2006, vol.122, No.5, p.528)에 개시되는 펩티드(예, AYPQKFNNNFMS(서열 번호 184)), 및 국제공개 제2006/126595호에 개시되는 펩티드(예, RKLPDAPGMHTW(서열 번호 185), 및 RALPDA(서열 번호 186)), 또는 그것들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 혹은 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다. 금 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 예를 들면, 후술하는 실시예 및 문헌(참조: S.Brown, Nat. Biotechnol. 1997, vol.15, p.269)에 개시되는 펩티드(예, MHGKTQATSGTIQS(서열 번호 21)), 문헌(참조: J.Kim et.al., Acta Biomater., 2010, Vol.6, No.7, p.2681)에 개시되는 펩티드(예, TGTSVLIATPYV(서열 번호 187), 및 TGTSVLIATPGV(서열 번호 188)), 및 문헌(참조: K.Nam et.al., Science, 2006, vol.312, No.5775, p.885.)에 개시되는 펩티드(예, LKAHLPPSRLPS(서열 번호 189)), 또는 그것들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 혹은 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.

실리콘 재료로서는, 예를 들어, 실리콘 또는 실리콘 화합물을 들 수 있다. 실리콘 화합물로서는, 예를 들면, 실리콘의 산화물(예, 일산화규소(SiO), 이산화규소(SiO₂)), 탄화규소(SiC), 실란(SiH₄), 실리콘 고무를 들 수 있다. 이러한 실리콘 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 다양한 펩티드가 보고되어 있다(예, 국제공개 제2006/126595호; 국제공개 제2006/126595호; M.J.Pender et al., Nano Lett., 2006, vol.6, No.1, p.40-44). 따라서, 본 발명에서는, 이러한 다양한 펩티드를 사용할 수 있다.

바람직하게는, 실리콘 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 실리콘 또는 실리콘 화합물(예, 실리콘의 산화물)에 대한 결합능을 갖는 펩티드라도 좋다. 이러한 펩티드로서는, 예를 들면, 국제공개 제2006/126595호에 개시되는 펩티드(예, RKLPDA(서열 번호 7)), 문헌(참조: M.J.Pender et al., Nano Lett., 2006, vol.6, No.1, p.40-44에 개시되는 펩티드(예, SSKKSGSYSGSKGSKRRIL(서열 번호 190)), 및 국제공개 제2006/126595호에 개시되는 펩티드(MSPHPHPRHHHT(서열 번호 191), TGRRRRLSCRLL(서열 번호 192), 및 KPSHHHHHTGAN(서열 번호 193)), 또는 그것들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 혹은 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.

탄소 재료로서는, 예를 들면, 카본 나노 재료(예, 카본 나노 튜브(CNT), 카본 나노혼(CNH)), 풀러렌(C60), 그래핀 시트, 그래파이트를 들 수 있다. 이러한 탄소 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 다양한 펩티드가 보고되고 있다(예, 일본 공개특허공보 특개2004-121154호; 일본 공개특허공보 특개2004-121154호; M.J.Pender et al., Nano Lett., 2006, vol.6, No.1, p.40-44). 따라서, 본 발명에서는, 이러한 다양한 펩티드를 사용할 수 있다.

바람직하게는, 탄소 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드는, 카본 나노 튜브(CNT) 또는 카본 나노혼(CNH) 등의 카본 나노 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드라도 좋다. 이러한 펩티드로서는, 예를 들면, 후술하는 실시예 및 일본 공개특허공보 특개2004-121154호에 개시되는 펩티드(예, DYFSSPYYEQLF(서열 번호 194)), 문헌(참조: M. J. Pender et al., Nano Lett., 2006, vol.6, No.1, p.40-44에 개시되는 펩티드(HSSYWYAFNNKT(서열 번호 195)), 및 일본 공개특허공보 특개2004-121154호에 개시되는 펩티드(예, YDPFHII(서열 번호 196)), 또는 그들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 혹은 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.

기능성 펩티드로서 프로테아제 분해성 펩티드가 사용되는 경우, 프로테아제로서는, 예를 들어, 카스파아제나 카텝신 등의 시스테인 프로테아제(D. McIlwain1 et al., Cold Spring Harb Perspect Biol., 2013, vol.5, a008656, V.Stoka et al., IUBMB Life.2005, vol.57, No.4-5 p.347), 콜라게나아제(G.Lee et al., Eur J Pharm Biopharm., 2007, vol.67, No.3), p.646), 트롬빈이나 Xa 인자(R.Jenny et al., Protein Expr.Purif., 2003, vol.31, p.1, H.Xu et al., J.Virol., 2010, vol.84, No.2, p.1076), 바이러스 유래 프로테아제(C.Byrd et al., Drug Dev. Res., 2006, vol.67, p.501)를 들 수 있다.

프로테아제 분해성 펩티드로서는, 예를 들어, 문헌(참조: E. Lee et al., Adv. Funct. Mater., 2015, vol.25, p.1279)에 개시되는 펩티드(예, GRRGKGG(서열 번호 197)), 문헌(참조: G. Lee et al., Eur J Pharm Biopharm., 2007, vol.67, No.3), p.646)에 개시되는 펩티드(예, GPLGV(서열 번호 198), 및 GPLGVRG(서열 번호 199)), 문헌(참조: Y.Kang et al., Biomacromolecules, 2012, vol.13, No.12, p.4057)에 개시되는 펩티드(예, GGLVPRGSGAS(서열 번호 200)), 문헌(참조: R. Talanian et al., J. Biol. Chem., 1997, vol.272, p.9677)에 개시되는 펩티드(예, YEVDGW(서열 번호 201), LEVDGW(서열 번호 202), VDQMDGW(서열 번호 203), VDVADGW(서열 번호 204), VQVDGW(서열 번호 205), 및 VDQVDGW(서열 번호 206)), 문헌(참조: Jenny et al., Protein Expr. Purif., 2003, vol.31, p.1에 개시되는 펩티드(예, ELSLSRLRDSA(서열 번호 207), ELSLSRLR(서열 번호 208), DNYTRLRK(서열 번호 209), YTRLRKQM(서열 번호 210), APSGRVSM(서열 번호 211), VSMIKNLQ(서열 번호 212), RIRPKLKW(서열 번호 213), NFFWKTFT(서열 번호 214), KMYPRGNH(서열 번호 215), QTYPRTNT(서열 번호 216), GVYARVTA(서열 번호 217), SGLSRIVN(서열 번호 218), NSRVA(서열 번호 219), QVRLG(서열 번호 220), MKSRNL(서열 번호 221), RCKPVN(서열 번호 222), 및 SSKYPN(서열 번호 223)), 문헌(참조: H. Xu et al., J. Virol., 2010, vol.84, No.2, p.1076)에 개시되는 펩티드(예, LVPRGS(서열 번호 224)) 또는 그것들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 혹은 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.

기능성 펩티드로서 안정화 펩티드가 사용되는 경우, 안정화 펩티드로서는, 예를 들어 문헌(참조: X.Meng et al., Nanoscale, 2011, vol.3, No.3, p.977에 개시되는 펩티드(예, CCALNN(서열 번호 225)), 및 문헌(참조: E.Falvo et al., Biomacromolecules, 2016, vol.17, No.2, p.514)에 개시되는 펩티드(예, PAS(서열 번호 226)) 또는 그것들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 혹은 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.

기능성 펩티드로서 세포 투과성 펩티드가 사용되는 경우, 세포 투과성 펩티드로서는, 예를 들어, 문헌(참조: Z.Guo et al. Biomed. Rep., 2016, vol.4, No.5, p.528)에 개시되는 펩티드(예, GRKKRRQRRRPPQ(서열 번호 227), RQIKIWFQNRRMKWKK(서열 번호 228), CGYGPKKKRKVGG(서열 번호 229), RRRRRRRR(서열 번호 230), KKKKKKKK(서열 번호 231), GLAFLGFLGAAGSTM(서열 번호 232), GAWSQPKKKRKV(서열 번호 233), LLIILRRRIRKQAHAHSK(서열 번호 234), MVRRFLVTL(서열 번호 235), RIRRACGPPRVRV(서열 번호 236), MVKSKIGSWILVLFV(서열 번호 237), SDVGLCKKRP(서열 번호 238), NAATATRGRSAASRPTQR(서열 번호 239), PRAPARSASRPRRPVQ(서열 번호 240), DPKGDPKGVTVT(서열 번호 241), VTVTVTGKGDPKPD(서열 번호 242), KLALKLALK(서열 번호 243), ALKAALKLA(서열 번호 244), GWTLNSAGYLLG(서열 번호 245), KINLKALAALAKKIL(서열 번호 246), RLSGMNEVLSFRW(서열 번호 247), SDLWEMMMVSLACQY(서열 번호 248), 및 PIEVCMYREP(서열 번호 249)) 또는 그것들의 변이 펩티드(예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 혹은 이러한 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩티드를 들 수 있다.

기능성 펩티드로서는, 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드가 바람직하다. 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드의 바람직한 예는, 유기물에 대한 결합능을 갖는 펩티드이다. 유기물에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩티드가 바람직하고, 단백질에 대한 결합능을 갖는 펩티드가 보다 바람직하다. 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드의 다른 바람직한 예는, 무기물에 대한 결합능을 갖는 펩티드이다. 무기물에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 금속 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드가 바람직하고, 티타늄 재료 또는 금 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드가 보다 바람직하다.

본 발명의 융합 단백질은, 그 N 말단 영역 및/또는 C 말단 영역에서 개변되어 있어도 좋다. 인간 페리틴 단량체 등의 동물 페리틴 단량체의 N 말단은 다량체의 표면 위에 노출되고, 그 C 말단은 표면 위에 노출될 수 없다. 따라서, 동물 페리틴 단량체의 N 말단에 부가되는 펩티드 부분은 다량체의 표면에 노출되어, 다량체의 외부에 존재하는 표적 재료와 상호 작용할 수 있지만, 동물 페리틴 단량체의 C 말단에 부가되는 펩티드 부분은 다량체의 표면에 노출되지 않아, 다량체의 외부에 존재하는 표적 재료와 상호 작용할 수 없다(예, 국제공개 제2006/126595호). 그러나, 동물 페리틴 단량체의 C 말단은, 그 아미노산 잔기를 개변함으로써, 다량체의 내강 중으로의 약제의 봉입에 이용할 수 있는 것이 보고되고 있다(예, Y.J.Kang, Biomacromolecules. 2012, vol.13(12), 4057을 참조). 한편, 미생물 페리틴 단량체(즉 Dps)는, 그 N 말단 및 C 말단의 쌍방이 다량체의 표면에 노출될 수 있다. 따라서, 미생물 페리틴 단량체의 N 말단 및 C 말단의 쌍방에 부가되는 펩티드 부분은 각각, 다량체의 표면에 노출되어, 다량체의 외부에 존재하는 다른 표적 제료와 상호 작용할 수 있다(예, 국제공개 제2012/086647호).

바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 융합 단백질은, 그 N 말단 영역에서의 개변으로서, N 말단에 펩티드 부분이 부가되어 있어도 좋다. 부가되어야 할 펩티드 부분으로서는, 예를 들어, 상술한 바와 같은 기능성 펩티드를 들 수 있다. 혹은, 부가되어야 할 펩티드 부분으로서는 또한, 예를 들어, 목적 단백질의 가용성을 향상시키는 펩티드 성분(예, Nus-tag), 샤페론으로서 작용하는 펩티드 성분(예, 트리거 팩터), 다른 기능을 갖는 펩티드 성분(예, 전장 단백질 또는 그 일부), 및 링커를 들 수 있다. 융합 단백질의 N 말단에 부가되는 펩티드 부분으로서, 제2 및 제3 α-헬릭스 사이의 영역에 삽입되는 기능성 펩티드와 동일 또는 다른 펩티드를 이용할 수 있지만, 다른 표적 재료에 대한 상호 작용의 실현 등의 관점에서, 다른 펩티드를 이용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질의 N 말단에 부가되는 펩티드 부분은, 상술한 바와 같은 기능성 펩티드이다. N 말단에 부가되는 펩티드 부분은 또한, 개시 코돈에 대응하는 아미노산 잔기(예, 메티오닌 잔기)를 N 말단에 포함하도록 설계하는 것이 바람직하다. 이러한 설계에 의해, 본 발명의 융합 단백질의 번역을 촉진할 수 있다.

다른 바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 융합 단백질은, 그 C 말단 영역에서의 개변으로서, C 말단 영역에서의 아미노산 잔기가 반응성 아미노산 잔기로 치환되어 있어도 좋고, C 말단 영역에 있어서 반응성 아미노산 잔기가 삽입되어 있어도 좋고, 또는 C 말단에 반응성 아미노산 잔기 또는 그 함유 펩티드(예를 들면 2 내지 12개, 바람직하게는 2 내지 5개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드)가 부가되어 있어도 좋다. 이러한 C 말단 영역으로서는, 예를 들어, 인간 페리틴 H쇄에 대해서는 175 내지 183번째(바람직하게는 179 내지 183번째)의 아미노산 잔기로 이루어진 영역, 및 인간 페리틴 L쇄에 대해서는 171 내지 175번째(바람직하게는 173 내지 175번째)의 아미노산 잔기로 이루어진 영역을 들 수 있다. 이러한 개변에 의해, 반응성 아미노산 잔기 및 소정의 물질(예, 약물, 표지 물질)을 반응시킬 수 있으며, 그로 인해 다량체의 내강 중에 소정의 물질을 공유 결합을 통해서 봉입할 수 있다. 이러한 반응성 아미노산 잔기로서는, 예를 들어, 티올기를 갖는 시스테인 잔기, 아미노기를 갖는 리신 잔기, 아르기닌 잔기, 아스파라긴 잔기, 글루타민 잔기를 들 수 있지만, 시스테인 잔기가 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질의 C 말단 영역의 개변은, 반응성 아미노산 잔기 또는 그 함유 펩티드의 C 말단으로의 부가이다.

본 발명의 융합 단백질은, 본 발명의 융합 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포(본 발명의 숙주 세포)를 사용하여, 융합 단백질을 숙주 세포로 생산시킴으로써 입수할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질을 생산시키기 위한 숙주 세포로서는, 예를 들면, 동물, 곤충, 어류, 식물, 또는 미생물에 유래하는 세포를 들 수 있다. 동물로서는, 포유 동물 또는 조류(예, 닭)가 바람직하고, 포유 동물이 보다 바람직하다. 포유 동물로서는, 예를 들어, 영장류(예, 인간, 원숭이, 침팬지), 설치류(예, 생쥐, 쥐, 햄스터, 기니피그, 토끼), 가축 및 사역용의 포유 동물(예, 소, 돼지, 양, 염소, 말)을 들 수 있다.

바람직한 실시형태에서는, 숙주 세포는, 인간 세포, 또는 인간 단백질의 생산에 범용되고 있는 세포(예, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 태아 신장 유래 HEK293세포)이다. 융합 단백질로서 인간 페리틴 단량체 및 기능성 펩티드의 융합 단백질을 사용하는 경우, 인간에 대한 임상 응용의 관점에서, 이러한 숙주 세포를 사용하는 것이 바람직하다.

다른 바람직한 실시형태에서는, 숙주 세포는, 미생물이다. 융합 단백질의 대량 생산 등의 관점에서, 이러한 숙주 세포를 사용해도 좋다. 미생물로서는, 예를 들면, 세균 및 진균을 들 수 있다. 세균으로서는, 숙주 세포로서 사용되고 있는 임의의 세균을 사용할 수 있고, 예를 들어, 바실러스(Bacillus)속 세균〔예, 고초균(Bacillus subtilis)〕, 코리네박테리움(Corynebacterium)속 세균〔(예, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)〕, 에스케리시아(Escherichia)속 세균〔예, 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli)〕, 판토에아(Pantoea)속 세균(예, 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis))을 들 수 있다. 진균으로서는, 숙주 세포로서 사용되고 있는 임의의 진균을 사용할 수 있고, 예를 들어, 사카로미세스(Saccharomyces)속 진균〔예, 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)〕, 및 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces)속 진균〔예, 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)〕을 들 수 있다. 혹은, 미생물로서, 사상균을 사용해도 좋다. 사상균으로서는, 예를 들면, 아크레모늄속(Acremonium)/탈라로미세스속(Talaromyces), 트리코데르마속(Trichoderma), 아스페르길루스속(Aspergillus), 뉴로스포라속(Neurospora), 푸사리움속(Fusarium), 크리소스포리움속(Chrysosporium), 후미콜라속(Humicola), 에메리셀라속(Emericella), 및 하이포크레아속(Hypocrea)에 속하는 세균을 들 수 있다.

본 발명의 숙주 세포는, 본 발명의 융합 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드에 더해서, 당해 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 단위를 포함하는 것이 바람직하다. 용어 「발현 단위」란, 단백질로서 발현될 소정의 폴리뉴클레오티드 및 그것에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 당해 폴리뉴클레오티드의 전사, 나아가서는 당해 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질의 생산을 가능하게 하는 단위를 말한다. 발현 단위는, 터미네이터, 리보솜 결합 부위, 및 약제 내성 유전자 등의 엘리멘트를 추가로 포함하고 있어도 좋다. 발현 단위는, DNA라도 RNA라도 좋지만, DNA인 것이 바람직하다. 발현 단위는, 미생물(숙주 세포)에 있어서 게놈 영역(예, 상기 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 고유하게 존재하는 천연 유전자좌인 천연 게놈 영역, 혹은 당해 천연 유전자좌가 아닌 비천연 게놈 영역), 또는 비게놈 영역(예, 세포질 내)에 포함될 수 있다. 발현 단위는, 1 또는 2 이상(예, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 다른 위치에서 게놈 영역 중에 포함되어 있어도 있다. 비게놈 영역에 포함되는 발현 단위의 구체적인 형태로서는, 예를 들면, 플라스미드, 바이러스 벡터, 파아지, 및 인공 염색체를 들 수 있다.

발현 단위를 구성하는 프로모터는, 그 하류에 연결된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질을 숙주 세포에서 발현시킬 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 프로모터는, 숙주 세포에 대하여 동종이라도 이종이라도 좋지만, 바람직하게는 이종이다. 예를 들어, 재조합 단백질의 생산에 범용되는 구성 또는 유도 프로모터를 사용할 수 있다. 이러한 프로모터는, 사용되는 숙주 세포의 종류(예, 인간 세포 등의 포유 동물 세포, 미생물)에 따라서, 포유 동물 유래의 프로모터, 미생물 유래의 프로모터, 바이러스 유래의 프로모터 등의 프로모터를 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 숙주 세포는, 당해 분야에 있어서 공지의 임의의 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 숙주 세포는, 발현 벡터를 사용하는 방법(예, 컴피텐트 세포법, 일렉트로포레이션법, 인산칼슘 침전법), 또는 게놈 개변 기술에 의해 제작할 수 있다. 발현 벡터가 숙주 세포의 게놈 DNA와 상동성 재조합을 일으키는 통합형(integrative) 벡터인 경우, 발현 단위는, 형질 전환에 의해, 숙주 세포의 게놈 DNA에 통합될 수 있다. 한편, 발현 벡터가 숙주 세포의 게놈 DNA와 상동성 재조합을 일으키지 않는 비통합형 벡터인 경우, 발현 단위는, 형질 전환에 의해, 숙주 세포의 게놈 DNA에 통합되지 않고, 숙주 세포 내에서, 발현 벡터의 상태인 채로, 게놈 DNA로부터 독립적으로 존재할 수 있다. 혹은, 게놈 편집 기술(예, CRISPR/Cas 시스템, 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제(Transcription Activator-Like Effector Nucleases)(TALEN))에 의하면, 발현 단위를 숙주 세포의 게놈 DNA에 통합하는 것, 및 숙주 세포가 고유하게 구비하는 발현 단위를 개변하는 것이 가능하다.

발현 벡터는, 발현 단위로서 상술한 최소 단위에 더해서, 숙주 세포에서 기능하는 터미네이터, 리보솜 결합 부위, 및 약제 내성 유전자 등의 엘리멘트를 추가로 포함하고 있어도 좋다. 약제 내성 유전자로서는, 예를 들어, 테트라사이클린, 암피실린, 카나마이신, 하이그로마이신, 포스피노트리신 등의 약제에 대한 내성 유전자를 들 수 있다. 발현 벡터는 또한, 숙주 세포의 게놈 DNA와의 상동성 재조합을 위해서, 숙주 세포의 게놈과의 상동성 재조합을 가능하게 하는 영역을 추가로 포함하고 있어도 좋다. 예를 들어, 발현 벡터는, 그것에 포함되는 발현 단위가 한 쌍의 상동성 영역(예, 숙주 세포의 게놈 중의 특정 서열에 대하여 상동성인 호모로지 아암, loxP, FRT) 사이에 위치하도록 설계되어도 좋다. 발현 단위가 도입되어야 할 숙주 세포의 게놈 영역(상동성 영역의 표적)으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 숙주 세포에 있어서 발현량이 많은 유전자의 유전자좌라도 좋다.

발현 벡터는, 플라스미드, 바이러스 벡터, 파아지, 또는 인공 염색체라도 좋다. 발현 벡터는 또한, 통합형(integrative) 벡터라도 비통합형 벡터라도 좋다. 통합형 벡터는, 그 전체가 숙주 세포의 게놈에 통합되는 타입의 벡터라도 좋다. 혹은, 통합형 벡터는, 그 일부(예, 발현 단위)만이 숙주 세포의 게놈에 통합되는 타입의 벡터라도 좋다. 발현 벡터는 또한, DNA 벡터, 또는 RNA 벡터(예, 레트로바이러스)라도 좋다. 이러한 발현 벡터는, 사용되는 숙주 세포의 종류(예, 인간 세포 등의 포유 동물 세포, 미생물)에 따라서, 적절하게 선택할 수 있다.

숙주 세포를 배양하기 위한 배지는 공지이며, 숙주 세포의 종류에 따른 적절한 배지를 사용할 수 있다. 이러한 배지에는, 소정의 성분(예, 탄소원, 질소원, 비타민)이 첨가되어도 좋다. 숙주 세포는, 통상 16 내지 42℃, 바람직하게는 25 내지 37℃에서, 통상 5 내지 168시간, 바람직하게는 8 내지 72시간 배양된다. 배양 방법으로서는, 예를 들어, 배치 배양법, 유가 배양법, 연속 배양법을 들 수 있다. 혹은, 유도제를 사용하여, 융합 단백질의 발현을 유도해도 좋다.

생산된 목적 단백질은, 염석, 침전법(예, 등전점 침전법, 용매 침전법), 분자량 차를 이용하는 방법(예, 투석, 한외 여과, 겔 여과), 특이적 친화성을 이용하는 방법(예, 친화성 크로마토그래피, 및 이온 교환 크로마토그래피), 소수성의 차이를 이용하는 방법(예, 소수성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피), 또는 이것들의 조합에 의해, 숙주 세포 또는 그 함유 배지로부터 정제 및 단리하는 것이 가능하다. 본 발명의 융합 단백질이 숙주 세포 내에 축적되는 경우, 본 발명의 융합 단백질은, 우선, 숙주 세포를 파쇄(예, 초음파처리, 균질화) 또는 용해(예, 리소자임 처리)하고, 이어서, 얻어진 파쇄물 및 용해물을, 상술한 방법으로 처리함으로써, 얻을 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 융합 단백질의 제작에 사용할 수 있는, 상술한 바와 같은, 본 발명의 융합 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 다량체를 제공한다. 본 발명의 다량체는, 융합 단백질로 구성되어 있고, 또한 내강을 가질 수 있다. 본 발명의 다량체를 구성하는 융합 단백질의 세부사항은, 상술한 바와 같다. 본 발명의 다량체는, 본 발명의 융합 단백질을 발현시킴으로써, 자율적으로 생성할 수 있다. 본 발명의 다량체를 구성하는 단량체 단위의 수는, 본 발명의 융합 단백질에 포함되는 페리틴의 유래에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 페리틴이 인간 등 동물에 유래하는 경우, 본 발명의 다량체는, 24량체이다. 한편, 페리틴이 미생물로부터 유래하는 경우(예, Dps), 본 발명의 다량체는, 12량체이다.

본 발명의 다량체는, 단량체 단위로서, 단일의 융합 단백질로 구성되는 호모 다량체라도 좋지만, 다른 복수의 종류(예, 2종)의 융합 단백질로 구성되는 헤테로 다량체라도 좋다. 예를 들어, 인간 등의 동물에서는, 페리틴의 대부분은, 2종류의 서브 유닛(H쇄 및 L쇄)으로 이루어진 헤테로 다량체로서 존재하는 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 다량체로서도, 헤테로 다량체를 사용할 수 있다.

다른 복수의 종류의 융합 단백질로 구성되는 다량체는, 예를 들어, 다른 종류의 융합 단백질을 코드하는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 사용하여, 다른 종류의 융합 단백질을 생산시킴으로써, 얻을 수 있다. 이러한 다량체는 또한, 단일의 융합 단백질로 구성되는 제1 단량체와, 단일의 융합 단백질(제1 다량체를 구성하는 융합 단백질과는 다른)로 구성되는 제2 단량체를, 동일한 매체(예, 완충액) 중에서 공존시켜, 방치함으로써, 얻을 수 있다. 융합 단백질의 단량체는, 예를 들어, 본 발명의 다량체를, 저pH의 완충액 하에 방치함으로써 조제할 수 있다(예, B.Zheng et al., Nanotechnology, 2010, vol.21, p.445602를 참조).

본 발명의 다량체를 구성하는 단량체의 조제(예, 재조합 단백질의 입수)의 부담 경감 등의 관점에서는, 본 발명의 다량체는 호모 다량체인 것이 바람직하다. 본 발명의 호모 다량체를 구성하는 융합 단백질 중의 페리틴 단량체 부분은, 상술한 바와 같지만, 동물 페리틴 H쇄 혹은 동물 페리틴 L쇄 중 어느 하나인 동물 페리틴 단량체, 또는 미생물 페리틴 단량체(Dps 단량체)인 것이 바람직하고, 인간 페리틴 H쇄 혹은 인간 페리틴 L쇄 중 어느 하나인 인간 페리틴 단량체, 또는 리스테리아 이노쿠아 페리틴 단량체(Dps 단량체)인 것이 보다 바람직하고, 상기 (A1) 내지 (C1) 혹은 상기 (A2) 내지 (C2) 중 어느 하나, 또는 상기 (A3) 내지 (C3) 중 어느 하나인 것이 보다 더욱 바람직하다. 본 발명의 호모 다량체를 구성하는 융합 단백질 중의 기능성 펩티드는, 상술한 바와 같지만, 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드가 바람직하다. 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드의 바람직한 예는, 유기물에 대한 결합능을 갖는 펩티드이다. 유기물에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩티드가 바람직하고, 단백질에 대한 결합능을 갖는 펩티드가 보다 바람직하다. 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드의 다른 바람직한 예는, 무기물에 대한 결합능을 갖는 펩티드이다. 무기물에 대한 결합능을 갖는 펩티드로서는, 금속 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드가 바람직하고, 티타늄 재료 또는 금 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드가 보다 바람직하다.

본 발명의 다량체를 구성하는 융합 단백질은, 그 N 말단 영역 및/또는 C 말단 영역에서 개변되어 있어도 좋다. 바람직하게는, 본 발명의 다량체를 구성하는 융합 단백질은, 상술한 바와 같은 N 말단 영역에서의 개변으로서, N 말단 영역에 펩티드 부분이 부가되어 있어도 좋다. 부가되어야 할 펩티드 부분으로서는, 예를 들어, 상술한 바와 같은 것을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 다량체를 구성하는 융합 단백질은, 그 상술한 바와 같은 C 말단 영역에서의 개변으로서, C 말단 영역에서의 아미노산 잔기가 상술한 바와 같은 반응성 아미노산 잔기로 치환되어 있어도 좋고, C 말단 영역에 있어서 반응성 아미노산 잔기가 삽입되어 있어도 좋고, 또는 C 말단에 반응성 아미노산 잔기 또는 이를 함유하는 펩티드(상술한 것과 동일함)가 부가되어 있어도 좋다. 바람직하게는, 본 발명의 다량체를 구성하는 융합 단백질의 C 말단 영역의 개변은, 반응성 아미노산 잔기 또는 그 함유 펩티드의 C 말단으로의 부가이다.

본 발명의 다량체는, 공유 결합 또는 비공유 결합의 양식에 있어서, 내강 중에 물질을 포함하고 있어도 좋다. 예를 들어, 공유 결합의 양식에서의 본 발명의 다량체의 내강 중으로의 물질의 봉입은, 반응성 아미노산 잔기를 이용하여, 본 발명의 융합 단백질의 C 말단 영역을 상술한 바와 같이 개변함으로써 행할 수 있다. 또한, 비공유 결합의 양식에서의 본 발명의 다량체의 내강 중으로의 물질의 봉입은, 물질(예, 나노 입자)을 융합할 수 있는 페리틴의 특성을 이용함으로써 행할 수 있다. 당업자는, 본 발명의 다량체의 내강의 사이즈, 및 본 발명의 다량체에서의 물질의 융합에 관여할 수 있는 영역(예, C 말단의 영역: R.M.Kramer et al., 2004, J.Am.Chem.Soc., vol.126, p.13282를 참조) 중의 아미노산 잔기의 전하 특성 등을 고려함으로써, 본 발명의 다량체에 봉입될 수 있는 물질을 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 인간 페리틴은, 바깥 직경 12nm(안쪽 직경 7nm) 정도의 내강을 갖는 바구니상 구조를 형성한다. 또한, 미생물 페리틴(Dps)은, 바깥 직경 9nm(안쪽 직경 4.5nm) 정도의 내강을 갖는 바구니상 구조를 형성한다. 따라서, 이러한 다량체에 봉입될 수 있는 물질의 사이즈는, 이러한 내강 중에 봉입되는 것을 가능하게 하는 사이즈일 수 있다. 또한, 다량체에서의 물질의 융합에 관여할 수 있는 영역 중의 전하 특성(예, 양 또는 음으로 하전될 수 있는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 종류 및 수)을 변화시킴으로써, 다량체의 내강 중으로의 물질의 융합을 보다 촉진할 수 있는 것이 보고되고 있으므로(예, R.M.Kramer et al., 2004, J.Am.Chem.Soc., vol.126, p.13282를 참조), 본 발명에 있어서도, 전하 특성이 변화된 영역을 갖는 융합 단백질의 다량체를 사용할 수 있다. 비공유 결합의 양식에 있어서 본 발명의 다량체에 봉입될 수 있는 물질로서는, 예를 들어, 상술한 표적 재료와 동일한 무기 재료를 들 수 있다. 구체적으로는, 비공유 결합의 양식에 있어서 본 발명의 다량체에 봉입될 수 있는 물질로서는, 산화철, 니켈, 코발트, 망간, 인, 우라늄, 베릴륨, 알루미늄, 황화카드뮴, 셀렌화카드뮴, 팔라듐, 크롬, 구리, 은, 가돌리늄 착체, 백금코발트, 산화실리콘, 산화코발트, 산화인듐, 백금, 금, 황화금, 셀렌화아연, 카드뮴셀레늄을 들 수 있다. 비공유 결합의 양식에서의 본 발명의 다량체의 내강 중으로의 물질의 봉입은, 주지의 방법에 의해 행할 수 있으며, 예를 들면, 다량체의 내강 중으로의 물질의 봉입 방법(예, I.Yamashita et al., Chem., lett., 2005. vol.33, p.1158을 참조)과 동일하게 하여 행할 수 있다. 구체적으로는, HEPES 완충액 등의 완충액 중에, 본 발명의 다량체(또는 본 발명의 융합 단백질) 및 봉입될 물질을 공존시키고, 이어서 적절한 온도(예, 0 내지 37℃)에서 방치함으로써, 본 발명의 다량체의 내강 중에 물질을 봉입시킬 수 있다.

본 발명의 다량체는, 내강 중에 물질을 포함하는 경우, 다른 복수의 종류(예, 2종, 3종 또는 4종)의 물질을 포함하는, 다른 복수의 종류의 다량체의 세트로서 제공되어도 좋다. 예를 들어, 본 발명의 다량체가 2종의 물질을 포함하는 2종의 다량체의 세트로서 제공되는 경우, 이러한 세트는, 각각 따로따로 조제된, 제1 물질을 봉입하는 제1 다량체와, 제1 물질과는 다른 제2 물질을 봉입하는 제2 다량체를, 조합함으로써, 얻을 수 있다. 상술한 바와 같은 융합 단백질의 다양한 패턴과, 봉입 물질의 다양한 패턴을 적절히 조합함으로써, 매우 다양성이 풍부한 본 발명의 다량체를 얻을 수 있다.

바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 다량체는, (a) 인간 페리틴 단량체, 및 (b) 인간 페리틴 단량체에서의 B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역 중에 삽입된 기능성 펩티드를 포함하는 융합 단백질로 구성되어 있고, 또한 내강을 갖고 있으며, 기능성 펩티드가 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는, 다량체이다. 융합 단백질 중의 페리틴 단량체로서 인간 페리틴 단량체가 이용되는 경우, 다량체는 24량체 일 수 있다. 본 발명의 다량체는, 내강 중에 약물을 갖고 있어도 좋다. 이러한 다량체는, 상술한 바와 같이 약물을 내강 중에 봉입할 수 있고, 또한, 기능성 펩티드의 표적인 생체 유기 분자에 결합할 수 있으므로, 생체 유기 분자가 존재하는 생체 표적 부위에 대하여 약물을 특이적으로 송달할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다량체는, 예를 들어, 약물 송달계(DDS)로서 유용하다. 본 발명의 다량체는 또한, 그것에 포함되는 인간 페리틴 단량체가 인간에 대한 항원성 및 면역원성을 갖지 않는 것에 비추어 보면, 임상 응용에 있어서 안전성이 뛰어나다는 이점도 있다.

다른 바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 다량체는, (a) 페리틴 단량체, 및 (b) 페리틴 단량체에서의 B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역 중에 삽입된 기능성 펩티드를 포함하는 융합 단백질로 구성되어 있고, 또한 내강을 갖고 있으며, 기능성 펩티드가 금속 재료, 실리콘 재료, 또는 탄소 재료에 대한 결합능을 갖는, 다량체이다. 융합 단백질은, 금속 재료, 실리콘 재료, 또는 탄소 재료에 대한 결합능(바람직하게는, 기능성 펩티드가 결합하는 재료와 다른 것에 대한 결합능)을 갖는 펩티드 부분을 N 말단 및/또는 C 말단에 갖고 있어도 좋다. 융합 단백질 중의 페리틴 단량체로서 동물 페리틴 단량체가 이용되는 경우, 다량체는 24량체일 수 있고, 융합 단백질 중의 페리틴 단량체로서 미생물 페리틴 단량체가 이용되는 경우, 다량체는 12량체일 수 있다. 이러한 다량체는, 예를 들면 전자 디바이스(예, 광전 변환 소자(예, 색소 증감 태양 전지 등의 태양 전지), 수소 발생 소자, 물 정화 재료, 항균 재료, 반도체 메모리 소자)의 제작 등의 용도에 유용하다(예, 국제공개 제2006/126595호; 국제공개 제2012/086647호; K.Sano et al., Nano Lett., 2007, vol.7.p.3200).

본 발명은 또한, 복합체를 제공한다. 본 발명의 복합체는, 본 발명의 다량체, 및 표적 재료를 포함한다. 본 발명의 복합체에서는, 표적 재료가, 본 발명의 다량체를 구성하는 융합 단백질 중의 기능성 펩티드에 결합하고 있다. 본 발명의 다량체, 및 그것을 구성하는 융합 단백질, 및 표적 재료의 예 및 바람직한 예는, 상술한 바와 같다. 표적 재료는 또한, 다른 물체에 포함되어 있어도 좋고, 또한, 다른 물체와 결합한 상태라도 좋다. 예를 들어, 표적 재료로서, 생체 유기 분자(예, 세포 표면 항원 분자)를 포함하는 세포, 또는 이러한 세포를 포함하는 조직을 이용할 수 있다. 또한, 표적 재료로서, 고상(예, 웰플레이트 등의 플레이트, 지지체, 기판, 소자, 디바이스) 위에 고정된 것을 이용할 수 있다.

바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 복합체는, (1) (a) 인간 페리틴 단량체, 및 (b) 인간 페리틴 단량체에서의 B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역 중에 삽입된 기능성 펩티드를 포함하는 융합 단백질로 구성되어 있고, 또한 내강을 갖고 있으며, 기능성 펩티드가 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 것인 본 발명의 다량체, 및 (2) 생체 유기 분자를 포함하고, 생체 유기 분자가 기능성 펩티드에 결합되어 있는, 복합체이다. 이러한 복합체는, 예를 들어, DDS의 연구 및 개발(예, 약물 송달 기구의 해석)에 유용하다.

다른 실시형태에서는, 본 발명의 복합체는, (1) (a) 페리틴 단량체, 및 (b) 페리틴 단량체에서의 B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역 중에 삽입된 기능성 펩티드를 포함하는 융합 단백질로 구성되어 있고, 또한 내강을 갖고 있으며, 기능성 펩티드가 금속 재료, 실리콘 재료, 또는 탄소 재료에 대한 결합능을 갖는 것인 본 발명의 다량체, 및 (2) 금속 재료, 실리콘 재료, 또는 탄소 재료를 포함하고, 금속 재료, 실리콘 재료, 또는 탄소 재료가 기능성 펩티드에 결합되어 있는, 복합체이다. 이러한 복합체는, 예를 들면, 전자 디바이스(예, 광전 변환 소자(예, 색소 증감 태양 전지 등의 태양 전지), 수소 발생 소자, 물 정화 재료, 항균 재료, 반도체 메모리 소자)의 제작 등 용도에 유용하다(예, 국제공개 제2006/126595호; 국제공개 제2012/086647호; K.Sano et al., Nano Lett., 2007, vol.7.p.3200.).

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명하지만, 본 발명은, 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 다기능성 페리틴의 구축 (1)>

페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 티타늄 인식 펩티드(minTBP1: RKLPDA(서열 번호 7))가 삽입 융합된 인간 유래 페리틴 H쇄(FTH-BC-TBP(서열 번호 8 및 9))를 코드하는 DNA를 전체 합성하였다. 전체 합성된 DNA를 주형으로 해서, 5'-GAAGGAGATATACATATGACGACCGCGTCCACCTCG-3'(서열 번호 10) 및 5'-CTCGAATTCGGATCCTTAGCTTTCATTATCACTGTC-3'(서열 번호 11)를 프라이머로 해서 PCR을 행했다. 또한, pET20(머크사)을 주형으로 해서, 5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3'(서열 번호 12) 및 5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3'(서열 번호 13)를 프라이머로 해서 PCR을 행했다. 각각 얻어진 PCR 산물을 Wizard DNA Clean-Up System(프로메가사)으로 정제한 후, In-Fusion HD Cloning Kit(타카라 바이오사)로, 50℃, 15분간의 In-Fusion 효소 처리함으로써, FTH-BC-TBP를 코드하는 유전자가 탑재된 발현 플라스미드(pET20-FTH-BC-TBP)를 구축했다.

또한, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 4번째와 5번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 티타늄 인식 펩티드(minTBP1)가 삽입 융합된 인간 유래 페리틴 H쇄(FTH-D-TBP, 서열 번호 250 및 251)를 코드하는 유전자가 탑재된 플라스미드(pET20-FTH-D-TBP)에 대해서도, 전체 합성된 FTH-D-TBP 유전자를 코드하는 DNA를 주형으로 해서, FTH-BC-TBP와 동일한 프라이머와 반응계를 사용하여 구축했다.

계속해서, 구축한 pET20-FTH-BC-TBP를 도입한 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli) BL21(DE3)을 LB 배지(10g/l의 박토-트립톤(Bacto-tryptone), 5g/l 박토-효모 추출물(Bacto-yeast extract), 5g/l의 NaCl, 100mg/l의 암피실린 포함함) 100ml, 37℃에서 24시간 플라스크 배양했다. 얻어진 균체를 초음파 파쇄한 후, 상청을 60℃에서 20분간 가열했다. 가열 후 얻어진 상청을, 50mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPerp Q HP 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 0mM에서 500mM NaCl을 포함하는 50mM TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 염 농도 구배를 적용함으로써, 목적 단백질을 분리 정제했다. 그 단백질을 포함하는 용액의 용매를 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과에서 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 치환했다. 그 용액을, 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼(GE healthcare사)에 주입하여, 사이즈에 따라서 FTH-BC-TBP를 분리 정제했다. FTH-D-TBP도 마찬가지로 이. 콜라이(E.coli)에서 발현시켜, 정제했다.

얻어진 페리틴의 입자 직경과 용액 분산성은, 제타사이저 나노 ZS(말번사)를 사용한 동적 광산란법(DLS)에 의해서 평가했다. 도 1-1 및 1-2에 나타내는 바와 같이 FTH-BC-TBP와 FTH-D-TBP는, 모두 평균 직경이 12nm 전후의 단분산을 나타내고, 24량체의 고차 구조를 형성하고, 그 24량체끼리는 응집하고 있지 않은 것을 알 수 있었다.

<실시예 2: 다기능성 페리틴의 활성 평가 (1)>

2종류의 페리틴 변이체 FTH-BC-TBP와 FTH-D-TBP의 티타늄 성막에 대한 흡착성을 수정 진동자 마이크로밸런스(QCM)법에 의해 평가했다.

먼저, 티타늄 성막 센서 셀(QCMSC-TI, 이니티움사)의 티타늄 성막 표면에 피라나액(농황산과 과산화수소수가 3대 1로 혼합된 용액) 2μl를 부가하여, 5분간 방치한 후, 물 500μl로 5회 세정했다. 그 세정을 계 2회 반복함으로써, 티타늄 성막 표면의 유기물을 제거했다. 계속해서, 그 티타늄 성막 센서 셀을 AFFINIX QNμ(이니티움사)에 세팅하고, 50mM TrisHCl 완충액(pH8.0)을 490μl 혹은 495μl를 부가하였다. 그 후, 측정 온도 25℃, 회전수 1000rpm으로 교반하면서, 약 30분 정도 방치하여, 센서로부터 출력되는 값을 안정화시켰다. 각 측정은, 용액 중의 페리틴 농도가 최종 농도 1.9nM가 되도록 티타늄 성막 센서 셀 위의 완충액에 100mg/L로 조제된 각 페리틴 변이체 용액을 각각 투입했다. 평가에 사용한 페리틴 용액의 농도는 단백질 검정 CBB 용액(나카라이 테스크사)을 사용하여, 소 알부민을 표준으로 해서 결정했다. 측정은, 페리틴 24량체의 분자량으로서 529kDa, 반응 온도 25℃, 교반 회전수 1000rpm, 주파수 27MHz, 측정 간격 5초로 행하여, 티타늄 성막 표면으로의 흡착량을 QCM의 주파수 변화로 평가했다.

그 결과, FTH-BC-TBP 혹은 FTH-D-TBP를 포함하는 완충액의 투입에 의한 QCM의 주파수 변화를 확인할 수 있고, 이러한 페리틴 변이체는 티타늄 성막으로의 흡착성을 나타내고 있는 것을 알 수 있었다(도 2).

계속해서, 동일한 조건으로 용액 중의 페리틴 농도가 최종 농도 0.2nM에서 5.6nM가 되도록 티타늄 성막 센서 셀 위의 완충액에 100mg/L로 조제된 각 페리틴 변이체 용액을 각각 투입하고, 주파수 변화를 측정했다. 그리고, 각 농도의 역수와 주파수 변화의 역수와의 상관 관계를 플롯하고, 그 기울기로부터 해리 평형 상수 KD값을 구했다.

그 결과, FTH-BC-TBP의 KD값은 0.97nM이고, FTH-D-TBP의 KD값 3.77nM의 1/4 정도로 낮았다(도 3). 이 차를 공분산 분석한 바, 유의적 확률 p값이 1% 이하에서의 유의적인 차이를 확인할 수 있었다. 즉, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 티타늄 인식 펩티드를 제시한 페리틴은, 4번째와 5번째의 사이의 펩티드를 제시한 페리틴보다도, 표적 재료에 대한 흡착 성능이 높은 것으로 나타났다.

<실시예 3: 다기능성 페리틴의 구축 (2)>

페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째의 사이의 플랙시블 링커부에 아암 인식 RGD 펩티드(ASDRGDFSG(서열 번호 14))가 삽입 융합되고, C 말단에 시스테인이 추가된 인간 유래 페리틴 H쇄(FHBc(서열 번호 15 및 16))의 유전자를 전체 합성했다. 전체 합성된 유전자를 주형으로 해서, 5'-TTTCATATGACGACCGCGTCCACCTCG-3'(서열 번호 17) 및 5'-TTTGGATCCTTAACAGCTTTCATTATCACTG-3'(서열 번호 18)를 프라이머로 해서 PCR을 행했다. 또한, pET20(머크사)을 주형으로 해서, 5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3'(서열 번호 12) 및 5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3'(서열 번호 13)를 프라이머로 해서 PCR을 행했다. 각각 얻어진 PCR 산물을, 제한 효소 DpnI와 BamHI, NdeI로 분해하고, 연결함으로써, FHBc를 코드하는 유전자가 탑재된 발현 플라스미드(pET20-FHBc)를 구축했다.

계속해서, 구축한 pET20-FHBc를 도입한 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli) BL21(DE3)을 LB 배지(10g/l의 박토-트립톤, 5g/l 박토-효모 추출물, 5g/l의 NaCl, 100mg/l의 암피실린을 포함함) 100ml, 37℃에서 24시간 플라스크 배양했다. 얻어진 균체를 초음파 파쇄한 후, 상청을 60℃에서 20분간 가열했다. 가열 후 얻어진 상청을, 50mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPerp Q HP 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 0mM에서 500mM NaCl을 포함하는 50mM TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 염 농도 구배를 적용함으로써, 목적 단백질을 분리 정제했다. 그 단백질을 포함하는 용액의 용매를 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과에서 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 치환했다. 그 용액을, 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼(GE healthcare사)에 주입하여, 사이즈에 따라서 FHBc를 분리 정제했다.

<실시예 4: 다기능성 페리틴의 고차 구조 확인 (1)>

얻어진 FHBc가 자기 조직화에 의해 바구니상 형상을 나타내는 것은, 도 4에 나타내는 바와 같이, 3% 인텅스텐산 염색에 의한 투과형 전자 현미경(TEM)하에 확인했다. 이 때의 FTBc의 직경은 12nm이고, 천연형 인간 페리틴과 동일한 사이즈이며, 2번째와 3번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 펩티드가 삽입된 경우라도 바구니상을 형성할 수 있고, 단백질의 고차 구조가 크게 손상되지 않는 것을 알 수 있었다.

계속해서, FHBc가 페리틴로서의 기능을 갖고, 내부에 공공(空孔)을 유지하고 있는 것을 나타내기 위해서, 각 페리틴의 내강에서의 산화철 나노 입자의 형성을 시도했다.

FTBc를 포함하는 TrisHCl 완충액(50mM TrisHCl(pH8.5), 0.5mg/mL FTBc, 300mM NaCl 그리고 1mM 황산암모늄철을 각각 최종 농도로 포함함)을 10mL 조제하고, 4℃에서 30분간 방치하면 용액이 오렌지색으로 변화하여, 페리틴 내부에 산화철 나노 입자가 형성된 것으로 시사되었다. 냉장 방치 후, 원심 분리(6,500rpm, 15분)하여, 상청을 회수한 후, 용매를 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과에서 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 치환했다. 그 용액을, 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼(GE healthcare사)에 주입하여, 산화철 나노 입자를 봉입한 FHBc를 분리 정제했다.

얻어진 나노 입자 봉입 페리틴의 입자 직경과 용액 분산성을, 제타사이저 나노 ZS(말번사)를 사용한 동적 광산란법(DLS)에 의해서 평가했다. 도 5에 나타내는 바와 같이 산화철 나노 입자를 봉입한 FHBc는, 평균 직경도 16nm 이하의 단분산을 나타내어, 응집하고 있지 않은 것을 알 수 있었다.

<실시예 5: 다기능성 페리틴의 구축 (3)>

페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 금 인식 펩티드(GBP1: MHGKTQATSGTIQS(서열 번호 19))가 삽입 융합된 인간 유래 페리틴 H쇄(FTH-BC-GBP(서열 번호 20 및 21))를 코드하는 DNA를 전체 합성하였다. 전체 합성된 DNA를 주형으로 해서, 5'-GAAGGAGATATACATATGACGACCGCGTCCACCTCG-3'(서열 번호 10) 및 5'-CTCGAATTCGGATCCTTAGCTTTCATTATCACTGTC-3'(서열 번호 11)를 프라이머로 해서 PCR을 행했다. 또한, pET20(머크사)을 주형으로 해서, 5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3'(서열 번호 12) 및 5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3'(서열 번호 13)를 프라이머로 해서 PCR을 행했다. 각각 얻어진 PCR 산물을 Wizard DNA Clean-Up System(프로메가사)으로 정제한 후, In-Fusion HD Cloning Kit(타카라 바이오사)로, 50℃, 15분간의 In-Fusion 효소 처리함으로써, 합성 유전자가 탑재된 발현 플라스미드를 구축했다. 이 플라스미드에 탑재된 합성 유전자의 핵산 서열을 확인한 바, 금 인식 펩티드 GBP1의 아미노산 서열 개시 부위의 메티오닌이 결실되어 있었다. 이 메티오닌의 결실을 수정하기 위해서, 구축된 플라스미드를 주형 DNA, 5'-ATGCATGGCAAAACCCAGGCGACCAG-3'(서열 번호 22) 및 5'-ACCCTTGATATCCTGAAGGA-3'(서열 번호 23)를 프라이머로 하는 PCR을 행했다. 계속해서, 얻어진 PCR 산물을 Wizard DNA Clean-Up System(프로메가사)으로 정제한 후, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(Polynucleotide Kinase)(타카라 바이오사)로 37℃, 30분간 방치하여, PCR 산물의 5' 말단을 인산화했다. 그 DNA를 셀프 연결함으로써, FTH-BC-GBP가 탑재된 발현 플라스미드(pET20-FTH-BC-GBP)를 구축했다.

또한, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 4번째와 5번째의 사이에 금 인식 펩티드(GBP1)가 삽입 융합된 인간 유래 페리틴 H쇄(FTH-D-GBP(서열 번호 252 및 253))를 코드하는 유전자가 탑재된 발현 플라스미드(pET20-FTH-D-GBP)에 대해서도, 전체 합성된 FTH-D-GBP 유전자를 코드하는 DNA를 주형으로 해서, FTH-BC-GBP와 동일한 프라이머와 반응계를 사용하여 구축했다. 이 금 인식 펩티드 GBP1의 아미노산 서열 개시부위의 메티오닌이 결실되어 있었기 때문에, FTH-BC-GBP의 경우와 동일하게, 5'-ATGCATGGCAAAACCCAGGCGACCAG-3'(서열 번호 22)와 5'-ATGTGTCTCAATGAAGTCACACAA-3'(서열 번호 254)를 프라이머한 PCR과 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 처리에 의해, FTH-D-GBP가 탑재된 발현 플라스미드(pET20-FTH-D-GBP)를 구축했다.

계속해서, 구축한 pET20-FTH-BC-GBP를 도입한 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli) BL21(DE3)을 LB 배지(10g/l의 박토-트립톤, 5g/l 박토-효모 추출물, 5g/l의 NaCl, 100mg/l의 암피실린을 포함함) 100ml, 37℃에서 24시간 플라스크 배양했다. 얻어진 균체를 초음파 파쇄한 후, 상청을 60℃에서 20분간 가열했다. 가열 후 얻어진 상청을, 50mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPerp Q HP 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 0mM에서 500mM NaCl을 포함하는 50mM TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 염 농도 구배를 적용함으로써, 목적 단백질을 분리 정제했다. 그 단백질을 포함하는 용액의 용매를 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과에서 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 치환했다. 그 용액을, 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 사이즈에 따라서 FTH-BC-GBP를 분리 정제했다. FTH-D-GBP도 동일하게 이. 콜라이(E. coli)에서 발현시켜, 정제했다.

얻어진 페리틴의 입자 직경과 용액 분산성은, 제타사이저 나노 ZS(말번사)를 사용한 동적 광산란법(DLS)에 의해서 평가했다. 도 6-1 및 6-2에 나타내는 바와 같이 FTH-BC-GBP와 FTH-D-GBP는, 평균 직경이 12nm 전후의 단분산을 나타내고, 24량체의 고차 구조를 형성하여, 그 24량체끼리는 응집하고 있지 않는 것을 알 수 있었다.

<실시예 6: 다기능성 페리틴의 활성 평가 (2)>

2종류의 페리틴 변이체 FTH-BC-GBP와 FTH-D-GBP의 금 박막에 대한 흡착성을 수정 진동자 마이크로밸런스(QCM)법에 의해 평가했다.

먼저, 금 성막 센서 셀(QCMSC-AU, 이니티움사)의 금 성막 표면에 피라니아액(농황산과 과산화수소수가 3대 1로 혼합된 용액) 2μl를 얹고, 5분간 방치한 후, 물 500μl로 5회 세정했다. 그 세정을 계 2회 반복함으로써, 금 성막 표면의 유기물을 제거했다. 계속해서, 그 금 성막 센서 셀을 AFFINIX QNμ(이니티움사)에 세팅하고, 50mM 인산 완충액(pH6.0)을 490μl 혹은 495μl로 부가하였다. 그 후, 측정 온도 25℃, 회전수 1000rpm으로 교반하면서, 30분 정도 방치하여, 센서로부터 출력되는 값을 안정화시켰다. 계속해서, 용액 중의 페리틴 농도가 최종 농도 0.3nM에서 5.4nM가 되도록 금 성막 센서 셀 위의 완충액에 100mg/L로 조제된 각 페리틴 변이체 용액을 각각 투입하고, 주파수 변화를 측정했다. 평가에 사용한 페리틴 용액의 농도는 단백질 검정 CBB 용액(나카라이테스크사)을 사용하여, 소 알부민을 표준으로 해서 결정했다. 측정은, 페리틴 24량체의 분자량으로서 546kDa, QCM의 주파수 27MHz, 측정 간격 5초로 행하여, 금 성막 표면으로의 흡착량을 주파수 변화로 평가했다. 그리고, 각 농도의 역수와 주파수 변화의 역수와의 상관 관계를 플롯하고, 그 기울기로부터 해리 평형 상수 KD값을 구했다.

그 결과, FTH-BC-GBP의 KD값은 0.42nM이고, FTH-D-GBP의 KD값 3.10nM의 1/7 정도로 낮았다(도 7). 이 차를 공분산 분석한 바, 유의적 확률 p값이 1% 미만에서의 유의적 차이를 확인할 수 있었다. 즉, H쇄 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 금 인식 펩티드를 제시한 페리틴은, 4번째와 5번째에 펩티드를 제시한 페리틴보다도, 표적 재료에 대한 흡착 성능이 높은 것으로 나타났다.

<실시예 7: 다기능성 페리틴의 구축 (4)>

페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 금 인식 펩티드(GBP1: MHGKTQATSGTIQS(서열 번호 19))가 삽입 융합된 인간 유래 페리틴 L쇄(FTL-BC-GBP(서열 번호 24 및 25), 도 8)를 코드하는 DNA를 전체 합성했다. 전체 합성된 DNA를 주형으로 해서, 5'-GAAGGAGATATACATATGAGCTCCCAGATTCGTCAG-3'(서열 번호 26) 및 5'-CTCGAATTCGGATCCTTAGTCGTGCTTGAGAGTGAG-3'(서열 번호 27)를 프라이머로 해서 PCR을 행했다. 또한, pET20(머크사)을 주형으로 해서, 5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3'(서열 번호 12) 및 5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3'(서열 번호 13)를 프라이머로 해서 PCR을 행했다. 각각 얻어진 PCR 산물을 Wizard DNA Clean-Up System(프로메가사)으로 정제한 후, In-Fusion HD Cloning Kit(타카라 바이오사)로, 50℃, 15분간의 In-Fusion 효소 처리함으로써, 합성 유전자가 탑재된 발현 플라스미드를 구축했다. 이 플라스미드에 탑재된 합성 유전자의 핵산 서열을 확인한 바, 금 인식 펩티드 GBP1의 아미노산 서열 개시 부위의 메티오닌이 결실되어 있었다. 이 메티오닌의 결실을 수정하기 위해서, 구축된 플라스미드를 주형 DNA, 5'-ATGCATGGCAAAACCCAGGCGACCAG-3'(서열 번호 22) 및 5'-ACCCTTGATGTCCTGGAAGAGA-3'(서열 번호 28)를 프라이머로 해서 PCR을 행했다. 계속해서, 얻어진 PCR 산물을 Wizard DNA Clean-Up System(프로메가사)으로 정제한 후, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(타카라 바이오사)로, 37℃, 30분간 방치하여, PCR 산물의 5' 말단을 인산화했다. 그 DNA를 자가 연결함으로써, FTL-BC-GBP가 탑재된 발현 플라스미드(pET20-FTL-BC-GBP)를 구축했다.

또한, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 5번째와 6번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 금 인식 펩티드(GBP1)가 삽입 융합된 인간 유래 페리틴 L쇄(FTL-DE-GBP(서열 번호 29 및 30), 도 9)를 코드하는 유전자가 탑재된 발현 플라스미드(pET20-FTL-DE-GBP)에 대해서도, 전체 합성된 FTL-DE-GBP 유전자를 코드하는 DNA를 주형으로 해서, FTL-BC-GBP와 동일한 프라이머와 반응계를 사용하여 구축했다. 이 금 인식 펩티드 GBP1의 아미노산 서열 개시 부위의 메티오닌이 결실되어 있었기 때문에, FTL-BC-GBP의 경우와 마찬가지로, 5'-ATGCATGGCAAAACCCAGGCGACCAG-3'(서열 번호 22)와 5'-CATACCCAGCCTGTGGAGGT-3'(서열 번호 31)를 프라이머로 하는 PCR과 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 처리에 의해, FTL-DE-GBP가 탑재된 발현 플라스미드(pET20-FTL-DE-GBP)를 구축했다.

계속해서, 구축한 pET20-FTL-BC-GBP를 도입한 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli) BL21(DE3)을 LB 배지(10g/l의 박토-트립톤, 5g/l 박토-효모추출물, 5g/l의 NaCl, 100mg/l의 암피실린을 포함함) 100ml, 30℃에서 24시간 플라스크 배양했다. 얻어진 균체를 초음파 파쇄한 후, 상청을 60℃에서 20분간 가열했다. 가열 후 얻어진 상청을, 50mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPerp Q HP 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 0mM에서 500mM NaCl을 포함하는 50mM TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 염 농도 구배를 적용함으로써, 목적 단백질을 분리 정제했다. 그 단백질을 포함하는 용액의 용매를 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과에서 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 치환했다. 그 용액을, 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼(GE healthcare사)에 주입하여, 사이즈에 따라서 FTL-BC-GBP를 분리 정제했다. FTL-DE-GBP도 마찬가지로 E. coli에서 발현시켜, 정제했다.

<실시예 8: 다기능성 페리틴의 활성 평가 (3)>

2종류의 페리틴 변이체 FTL-BC-GBP와 FTL-DE-GBP의 금 박막에 대한 흡착성을 수정 진동자 마이크로밸런스(QCM)법에 의해 각각 평가했다.

먼저, 금 성막 센서 셀(QCMSC-AU, 이니티움사)의 금 성막 표면에 피라니아액(농황산과 과산화수소수가 3대 1로 혼합된 용액) 2μl를 얹고, 5분간 방치한 후, 물 500μl로 5회 세정했다. 그 세정을 계 2회 반복함으로써, 금 성막 표면의 유기물을 제거했다. 계속해서, 그 금 성막 센서 셀을 AFFINIX QNμ(이니티움사)에 세팅하고, 50mM 인산 완충액(pH6.0)을 490μl 혹은 495μl를 얹었다. 그 후, 측정 온도 25℃, 회전수 1000rpm으로 교반하면서, 30분 정도 방치하여, 센서로부터 출력되는 값을 안정화시켰다. 각 측정은, 용액 중의 페리틴 농도가 최종 농도 0.2nM에서 4.9nM가 되도록 금 성막 센서 셀 위의 완충액에 100mg/L로 조제된 각 페리틴 변이체 용액을 각각 투입하고, 주파수 변화를 측정했다. 평가에 사용한 페리틴 용액의 농도는 단백질 검정 CBB 용액(나카라이테스크사)을 사용하여, 소 알부민을 표준으로 해서 결정했다. 측정은, 페리틴 24량체의 분자량으로서 518kDa, QCM의 주파수 27MHz, 측정 간격 5초로 행하여, 금 성막 표면으로의 흡착량을 주파수 변화로 평가했다. 그리고, 각 농도의 역수와 주파수 변화의 역수와의 상관 관계를 플롯하고, 그 기울기로부터 해리 평형 상수 KD값을 구했다.

그 결과, FTL-BC-GBP의 KD값은 1.15nM이고, FTL-DE-GBP의 KD값 1.68nM의 70%로 낮았다(도 10). 이 차를 공분산 분석한 바, 유의 확률 p값이 5% 이하에서의 유의적 차이를 확인할 수 있었다. 즉, L쇄 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 금 인식 펩티드를 제시한 페리틴은, 5번째와 6번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 펩티드를 제시한 페리틴보다도, 표적 재료에 대한 흡착 성능이 높은 것이 나타나졌다.

이상의 결과로부터, α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 삽입된 펩티드는 인간 페리틴의 H쇄와 L쇄의 양쪽에서 매우 효과적인 것을 알 수 있었다.

<실시예 9: 다기능성 미생물 유래 페리틴(Dps)의 구축>

미생물이 갖는 페리틴의 호모로그 단백질의 Dps는, 페리틴과 유사 구조를 갖는 단량체가 12개 모여서, 페리틴보다도 한층 작은 바깥 직경 9nm, 안쪽 직경 4.5nm의 바구니상을 형성한다. 페리틴과 Dps의 단량체의 입체 구조는 매우 유사하지만, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 해당하는 Dps의 플랙시블 링커 영역에는 7개 아미노산으로 이루어진 작은 α-헬릭스가 형성되어 있는 것이 알려져 있다(Int. J. Mol. Sci. 2011; 12(8): 5406-5421). 그래서, 페리틴과 동등한 영역과 C 말단에 이종 펩티드(QVNGLGERSQQM(서열 번호 32))가 삽입된 리스테리아 이노쿠아 유래의 Dps(BCDps-CS4, 서열 번호 33 및 34)의 구축을 행했다.

먼저, BCDps-CS4의 유전자의 일부를 전체 합성하였다. 전체 합성된 유전자를 주형으로 해서, 5'-TTTCATATGAAAACAATCAACTCAGTAG-3'(서열 번호 35) 및 5'-TTTGGATCCTTACATCTGCTGACTCCGCTCACCCAAACCATTCACCTGTTCTAATGGAGCTTTTCCAAG-3'(서열 번호 36)를 프라이머로 해서 PCR을 행했다. 또한, pET20(머크사)을 주형으로 해서, 5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3'(서열 번호 12) 및 5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3'(서열 번호 13)를 프라이머로 해서 PCR을 행했다. 각각 얻어진 PCR 산물을, 제한 효소 DpnI와 BamHI, NdeI로 분해하여, 연결함으로써, BCDps-CS4를 코드하는 유전자가 탑재된 발현 플라스미드(pET20-BCDps-CS4)를 구축했다.

계속해서, 구축한 pET20-BCDps-CS4를 도입한 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli) BL21(DE3)을 LB 배지(10g/l의 박토-트립톤, 5g/l 박토-효모 추출물, 5g/l의 NaCl, 100mg/l의 암피실린을 포함함) 100ml, 37℃에서 24시간 플라스크 배양했다. 얻어진 균체를 초음파 파쇄한 후, 상청을 60℃에서 20분간 가열했다. 가열 후 얻어진 상청을, 50mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPerp Q HP 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 0mM에서 500mM NaCl을 포함하는 50mM TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 염 농도 구배를 적용함으로써, 목적 단백질을 분리 정제했다. 그 단백질을 포함하는 용액의 용매를 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과에서 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 치환했다. 그 용액을, 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼(GE healthcare사)에 주입하여, 사이즈에 따라서 BCDps-CS4를 분리 정제했다.

<실시예 10: 다기능성 Dps의 고차 구조 확인>

얻어진 BCDps-CS4가 자기 조직화에 의해 바구니상 형상을 나타내는 것은, 도 11에 나타내는 바와 같이, 3% 인텅스텐산 염색에 의한 투과형 전자 현미경(TEM)상에 의해 확인했다. 이 때의 BCDps-CS4의 직경은 9nm이며, 천연형 Dps와 동일한 사이즈였다. 이 때문에, 인간 페리틴의 2번째와 3번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 해당하는 부위에 펩티드가 삽입된 경우라도 Dps는, 천연과 동등한 바구니상 구조를 형성할 수 있고, 단백질의 고차 구조가 크게 손상되지 않는 것을 알 수 있었다.

<실시예 11: 다기능성 페리틴의 구축 (5)>

페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 5번째와 6번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 금 인식 펩티드(GBP1: MHGKTQATSGTIQS(서열 번호 19))가 삽입 융합된 인간 유래 페리틴 H쇄(FTH-DE-GBP(서열 번호 255 및 256))를 코드하는 DNA를 전체 합성했다. 전체 합성된 DNA를 주형으로 해서, 5'-GAAGGAGATATACATATGACGACCGCGTCCACCTCG-3'(서열 번호 10) 및 5'-CTCGAATTCGGATCCTTAGCTTTCATTATCACTGTC-3'(서열 번호 11)를 프라이머로 해서 PCR을 행했다. 또한, pET20(머크사)을 주형으로 해서, 5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3'(서열 번호 12) 및 5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3'(서열 번호 13)를 프라이머로 해서 PCR을 행했다. 각각 얻어진 PCR 산물을 Wizard DNA Clean-Up System(프로메가사)으로 정제한 후, In-Fusion HD Cloning Kit(타카라 바이오사)로, 50℃, 15분간의 In-Fusion 효소 처리함으로써, 다기능성 페리틴의 구축 FTH-DE-GBP가 탑재된 발현 플라스미드(pET20-FTH-DE-GBP)를 구축했다.

계속해서, 구축한 pET20-FTH-DE-GBP를 도입한 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli) BL21(DE3)을 LB 배지(10g/l의 박토-트립톤, 5g/l 박토-효모 추출물, 5g/l의 NaCl, 100mg/l 의 암피실린을 포함함) 100ml, 37℃에서 24시간 플라스크 배양했다. 얻어진 균체를 초음파 파쇄한 후, 상청을 60℃에서 20분간 가열했다. 가열 후 얻어진 상청을, 50mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPerp Q HP 컬럼(GE healthcare사)에 주입하고, 0mM에서 500mM NaCl을 포함하는 50mM TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 염 농도 구배를 적용함으로써, 목적 단백질을 분리 정제했다. 그 단백질을 포함하는 용액의 용매를 Vivaspin 20-100K(GE healthcare사)를 사용한 원심 한외 여과에서 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 치환했다. 그 용액을, 10mM의 TrisHCl 완충액(pH8.0)으로 평형화된 HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼(GE healthcare사)에 주입하여, 사이즈에 따라서 FTH-DE-GBP를 분리 정제했다.

<실시예 12: 다기능성 페리틴의 활성 평가 (4)>

2종류의 페리틴 변이체 FTH-BC-GBP와 FTH-DE-GBP의 금 박막에 대한 흡착성을 수정 진동자 마이크로밸런스(QCM)법에 의해 평가했다.

먼저, 금 성막 센서 셀(QCMSC-AU, 이니티움사)의 금 성막 표면에 피라니아액(농황산과 과산화수소수가 3대 1로 혼합된 용액) 2μl를 얹어, 5분간 방치한 후, 물 500μl로 5회 세정했다. 그 세정을 계 2회 반복함으로써, 금 성막 표면의 유기물을 제거했다. 계속해서, 그 금 성막 센서 셀을 AFFINIX QNμ(이니티움사)에 세팅하고, 50mM 인산 완충액(pH6.0)을 490μl 혹은 495μl로 부가하였다. 그 후, 측정 온도 25℃, 회전수 1000rpm에서 교반하면서, 30분 정도 방치하여, 센서로부터 출력되는 값을 안정화시켰다. 계속해서, 용액 중의 페리틴 농도가 최종 농도 0.2nM에서 2.6nM가 되도록 금 성막 센서 셀 위의 완충액에 100mg/L로 조제된 각 페리틴 변이체 용액을 각각 투입하여, 주파수 변화를 측정했다. 평가에 사용한 페리틴 용액의 농도는 단백질 검정 CBB 용액(나카라이테스크사)을 사용하여, 소 알부민을 표준으로 해서 결정했다. 측정은, 페리틴 24량체의 분자량으로서 546kDa, QCM의 주파수 27MHz, 측정 간격 5초로 행하여, 금 성막 표면으로의 흡착량을 주파수 변화로 평가했다. 그리고, 각 농도의 역수와 주파수 변화의 역수와의 상관 관계를 플롯하고, 그 기울기로부터 해리 평형 상수 KD값을 구했다.

그 결과, FTH-DE-GBP의 KD값은 1.90nM이며, 실시예 6에서 측정된 FTH-BC-GBP의 KD값의 0.42nM의 1/5 정도로 낮았다(도 12). 이 차를 공분산 분석한 바, 유의적 확률 p값이 5% 이하에서의 유의적 차이를 확인할 수 있었다. 즉, H쇄 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단에서부터 세어 2번째와 3번째의 사이의 플랙시블 링커 영역에 금 인식 펩티드를 제시한 페리틴은, 5번째와 6번째에 펩티드를 제시한 페리틴보다도, 표적 재료에 대한 흡착 성능이 높은 것으로 나타났다.

[산업상의 사용 가능성]

본 발명의 다량체는, 신규 약물 송달계(DDS), 전자 디바이스의 제작 등의 용도로 유망하다. 예를 들어, 본 발명의 다량체를 구성하는 융합 단백질에서의 페리틴 단량체가 인간 페리틴 단량체인 경우, 본 발명의 다량체는, DDS로서 유용하다. 또한, 인간 페리틴 단량체가 인간에 대한 항원성 및 면역원성을 갖지 않는 것에 비추어 보면, 본 발명의 다량체는, 임상 응용에 있어서 안전성이 뛰어나다는 이점도 갖는다. 한편, 이 페리틴 단량체가 미생물 페리틴인 경우, 본 발명의 다량체는, 전자 디바이스의 제조에 유용하다.

본 발명의 융합 단백질은, 예를 들어, 본 발명의 다량체의 제조에 유용하다.

본 발명의 복합체는, 예를 들어, 신규 약물 송달계(DDS)의 연구 및 개발, 전자 디바이스의 제작 등의 용도에 유용하다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 및 숙주 세포는, 본 발명의 융합 단백질을 용이하게 조제하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 및 숙주 세포는, 예를 들어, 본 발명의 다량체의 조제에 유용하다.

Claims

(a) 페리틴 단량체, 및 (b) 페리틴 단량체에서의 B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역 중에 삽입된 기능성 펩티드를 포함하는, 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 페리틴 단량체가 인간 페리틴 단량체인, 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인간 페리틴 단량체가 인간 페리틴 H쇄인, 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인간 페리틴 단량체가 인간 페리틴 L쇄인, 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 페리틴 단량체가 Dps 단량체인, 융합 단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 펩티드가, 표적 재료에 대한 결합능을 갖는 펩티드인, 융합 단백질.
제6항에 있어서, 상기 표적 재료가 무기물인, 융합 단백질.
제7항에 있어서, 상기 무기물이 금속 재료인, 융합 단백질.
제6항에 있어서, 상기 표적 재료가 유기물인, 융합 단백질.
제9항에 있어서, 상기 유기물이 생체 유기 분자인, 융합 단백질.
제10항에 있어서, 상기 생체 유기 분자가 단백질인, 융합 단백질.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인 잔기, 또는 상기 시스테인 잔기 함유 펩티드가, 융합 단백질의 C 말단에 부가되어 있는, 융합 단백질.
(a) 페리틴 단량체, 및 (b) 페리틴 단량체에서의 B 영역 및 C 영역의 α-헬릭스 사이의 플랙시블 링커 영역 중에 삽입된 기능성 펩티드를 포함하는 융합 단백질로 구성되어 있고, 또한 내강(internal cavity)을 갖는, 다량체.
(1) 제13항에 기재된 다량체, 및 (2) 표적 재료를 포함하고,
상기 표적 재료가, 상기 융합 단백질 중의 기능성 펩티드에 결합되어 있는, 복합체.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제15항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제15항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.