JP2013503625A - 多数の部位で改変されたsp1ポリペプチドおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
カーボンナノチューブはグラファイト炭素原子のナノスケールの中空円筒物である。カーボンナノチューブは、どの知られている材料の中でも最大のヤング率(剛性)、最大の熱伝導性、最大の電気伝導性および最大の電流密度をもたらし、一方で、低い密度を有する。カーボンナノチューブは、2つの形態で、すなわち、単層カーボンナノチューブおよび多層カーボンナノチューブとして入手できる。単層カーボンナノチューブは、より強い、より柔軟な、より透明な、かつ、より良好な電気導体である傾向があり、また、より透明であるが、大きい製造コストのために、多層カーボンナノチューブが複合材料においてより広範囲に使用される。
i)配列番号1に対する少なくとも65%のアミノ酸相同性、
ii)安定ダイマー形成能、および
iii)配列番号4のアミノ酸9〜11、アミノ酸44〜46および/またはアミノ酸65〜73に対応する少なくとも1つの領域における少なくとも1つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられる、単離されたキメラポリペプチドが提供される。
i)配列番号1に対する少なくとも65%のアミノ酸相同性、
ii)安定ダイマー形成能、および
iii)配列番号4のアミノ酸9〜11、アミノ酸44〜46および/またはアミノ酸65〜73に対応する少なくとも1つの領域における少なくとも1つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられる、単離されたポリヌクレオチドが提供される。同様に提供されるものが、単離されたポリヌクレオチドを、その組換え発現を行わせるために少なくとも1つのプロモーターに転写的に連結されて含む核酸構築物である。
i)配列番号4に対する少なくとも65%のアミノ酸相同性、
ii)安定ダイマー形成能、および
iii)配列番号4のアミノ酸9〜11、アミノ酸44〜46および/またはアミノ酸65〜73に対応する少なくとも1つの領域における少なくとも1つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられ、
かつ、カオトロピック剤がグアニジニウム塩酸塩であるとき、改変アミノ酸配列はNi結合Hisタグを含まない、組成物が提供される。
i)配列番号4に対する少なくとも65%のアミノ酸相同性、
ii)安定ダイマー形成能、および
iii)配列番号4のアミノ酸9〜11、アミノ酸44〜46および/またはアミノ酸65〜73に対応する少なくとも1つの領域における少なくとも1つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられる、単離されたキメラポリペプチドが提供される。
i)配列番号4に対する少なくとも65%のアミノ酸相同性、
ii)安定ダイマー形成能、および
iii)配列番号4のアミノ酸9〜11、アミノ酸44〜46および/またはアミノ酸65〜73に対応する少なくとも1つの領域における少なくとも1つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられ、非同一モノマーがそれらの無機物質結合配列において異なる、ヘテロマー組成物が提供される。
i)配列番号4に対する少なくとも65%のアミノ酸相同性、
ii)安定ダイマー形成能、および
iii)配列番号4のアミノ酸9〜11、アミノ酸44〜46および/またはアミノ酸65〜73に対応する少なくとも1つの領域における少なくとも1つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられる、組成物が提供される。
前記複合体を、溶液または懸濁物を形成するように溶媒と接触させること;
それにより、前記物質を前記溶媒に分散させること
を含む、方法が提供される。
下記に示される研究では、SP1変化体の結合特性(すなわち、様々な基体に対するSP1変化体の親和性およびアビディティー)を変化させ、また、様々な表面におけるSP1の固定化を制御するための2つの戦略が明らかにされる。親和性およびアビディティーは、非共有結合性相互作用の強さ、すなわち、特定の原子または分子が凝集または結合しやすい現象を記述するためにタンパク質生化学において使用される2つの用語である。
国際公開WO2007/007325は、Sarikaya他[Ann.Rev.Mater.Res.、2004、34、373〜408]から改編された、無機のイオン性物質との複合体を形成するペプチドの限定されない列挙を提供する。これらの比較的短いペプチドは、SP1ポリペプチドの改変の一部としてのSP1タンパク質への融合のために好適である。種々の材料に対する大きい親和性を有するペプチドのさらに多くの例が文献には開示される。
システインアミノ酸を介するタンパク質の金標識化は、広く知られている技術である。そのN末端が欠失されたSP1変化体を、N末端からの妨害を防止するために使用した(ΔNSP1、配列番号64)。システイン残基を中央空洞または縁のどちらかでタンパク質に導入した(表1を参照のこと)(それぞれ、M43CおよびL81C)。超平坦な金表面に対するこれら2つの変異体の結合親和性を動的モードの原子間力顕微鏡法(AFM)トポグラフィー画像化(Dulcinea顕微鏡、NanoTec、Madrid)によって求め、フラッディング画像分析技術を使用して、新しい変異体の表面被覆率を求めた。
M43CΔNSP1のN末端へのケイ素結合性ペプチド(RKLPDAA、配列番号5、Nano Lett.、2007、6、1579〜1579)の融合により、変化体mtbSP1(配列番号3)がもたらされる(表1および表2を参照のこと)。mtbSPシリカ結合のSDS−PAGE分析は、本明細書中下記で議論されるが、mtbSP1変化体がシリカビーズに結合し、一方、野生型SP1は結合しないことを示した。12コピーのこれらのペプチドの、SP1のN末端への融合は、融合された結合性ペプチドが露出し、基体に接近可能であるならば、より大きい結合アビディティーの結果として、遊離ペプチドと比較した場合、より大きい結合能をもたらすことが予想された。GuHCl、すなわち、カオトロピック剤(タンパク質変性剤)は、非常に安定なSP1複合体のN末端への一定の柔軟性を可能にし、結果的には、ケイ素結合性ペプチドを露出させ、それにより、シリカへのその結合を容易にすることが示唆された。mtbSPおよび遊離ペプチドの両方についての見かけの解離定数を本明細書中下記で示されるように求めた。mtbSP1変化体は、本明細書中下記で示されるように、遊離ペプチド(86μM)よりもはるかに低いKd値(0.3μM)を明らかにした。このことは、このペプチドがSP1足場に呈示されるとき、シリカに対するその親和性が2桁〜3桁増大することを意味する。
下記に示される実施例は、CNTに結合することができ、それにより、これらのタンパク質被覆CNTの水性分散を可能にするCNT結合性ペプチドに融合されるSP1変化体を提供する。CNT結合性ペプチドとしてファージ・ディスプレー・ライブラリーから単離された短いペプチドのいくつかの例が文献には開示される。例えば、Nature materials、2003、2、196;Nano lett.、2006、6、40〜44;およびLangmuir、2004、20、8939〜8941を参照のこと。
CNTを他の媒体(例えば、エポキシ樹脂など)に分散し、先進材料(例えば、KEVLAR(商標)など)に結合する本発明の実施形態のSP1変化体の能力が、本明細書中下記で詳しく示されるように研究され、明らかにされた。
細菌株および培養条件:
大腸菌株DH5αをクローニングのために使用し、大腸菌株BL21(DE3)を発現のために使用した。細胞の成長を、Luria Bertani培地(ΔNSP1、M43CΔNSP1およびL81CΔNSP1)、Terrificブロス(L1−SP1、L2−SP1、L3−SP1、L6−SP1)、あるいは、交換可能であるが、LuriaブロスまたはTerrifcブロスのどちらか(天然SP1、mtbSP1)のいずれかにおいて37℃で行った(28℃で成長したL1−SP1を除く)。イソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)による誘導(天然SP1、mtbSP1、ΔNSP1、M43CΔNSP1、L81CΔNSP1、L1−SP1およびL6−SP1については1mM、L3−SP1については0.5mM、L2−SP1については0.1mM)の後、細菌をさらに4時間成長させ、その後、14000Xgでの15分間の遠心分離によって集めた。
M43CΔNSP1変異体およびL81CΔNSP1変異体の両方を、ΔNSP1コード配列(配列番号7)テンプレート(これはMedalsy他[Nano lett.、8、473〜477、2008]によって以前に記載された)に対する部位特異的変異誘発を使用して構築した。この部位特異的変異誘発は、PfuTurbo DNAポリメラーゼまたはDeep−vent DNAポリメラーゼを用いて、Stratagene Quickchange(Stratagene、La Jolla、CA)プロトコルに従って行われた。
遠心分離後、細胞ペレットを溶解緩衝液(50mM TrisHCL、1mM EDTA、10mM MgCl2、pH8)に再懸濁し、パルス的バーストにより数分間、氷上で超音波処理した。変化体が可溶性タンパク質として発現され[mtbSP(配列番号3)、L1−SP1(配列番号6)、L6−SP1(配列番号15)]、または、封入体に凝集された[L2 SP1(配列番号14)およびL3−SP1(配列番号8)]。
Hitrap Q Sepharose XLカラム(1ml)(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ、米国)を使用して、タンパク質を精製した。サンプルを、20mMピペラジン(pH6.3)緩衝液を3ml/分の流速を使用してカラムに負荷した。溶出を、同じ緩衝液における1M NaClのグラジエントにより行い、27%〜33%の塩において特定した。
mTBPペプチド(配列番号5)がBioSight ltd.(Karmiel、イスラエル)によって合成的に製造された。
3つの異なる安定性分析を野生型SP1(配列番号4)およびそれぞれの変異タンパク質に対して行った。
1.熱処理(H.T)、80℃で30分間;
2.煮沸処理(B.T.)、100℃で30分間;および
3.プロテイナーゼK(PK)によるタンパク質分解に対する抵抗性、酵素の50ug/mlの濃度において37℃で1時間。PKが5分間のB.T.によって除かれた。
mtbSP1(配列番号3)を、3MのGuHClとともに、または、伴うことなく、10mM MES(pH6.5)、150mM NaClにおいて10mgのシリカゲル(製造物番号:28860−8、Sigma−Aldrich、米国)と混合した。その後、溶液を室温において回転式振とう機で1時間インキュベーションした。その後、シリカを、GuHClを含まない同じ緩衝液により3回洗浄した。結合したタンパク質を、SDS−PAGEによるか、または、MicroBCA(商標)タンパク質アッセイキット(Pierce、Rockford、米国)を使用してタンパク質濃度を測定することによるかのどちらかによって分析した。
ケイ素表面(0.5cm2)を75℃の加熱イソプロパノールとともに20分間超音波処理し、3回蒸留水により洗浄し、乾燥窒素により乾燥した。処理された表面を3分間プラズマ清浄化し(Femto Inc.、Jettingen、ドイツ)、その後、サンプルを置いた。3MのGuHClを伴うか、または伴わない、6.5のpHのMES緩衝液における約2mg/mlのタンパク質の最終濃度における5μlのタンパク質サンプルを表面に20秒間置き、その後、3回蒸留水により静かに洗浄し、乾燥窒素により乾燥した。
アラミドへのSP1/CNT結合を、3つの方法を使用して評価した:
1.布地へのその結合の前後における溶液(懸濁物)中のCNT含有量の差の測定。懸濁物のCNT含有量が、SP1/CNTを、(洗浄溶液と組み合わされる)布地とのそのインキュベーションの前後において、グアニジニウム塩酸塩(100mM)またはHCl(0.3%)を使用して懸濁物のサンプルから沈殿させ、ペレット化されたCNTを乾燥し、重量測定することによって求められる;
2.分光法:CNT含有量を、分光学的方法を使用して、すなわち、走査型電子顕微鏡下での高分解能(HR−SEM)における、CNTによって被覆される布地または表面の可視化による光透過率を使用して評価することができる;および
3.表面抵抗率−被覆された布地または表面のCNT含有量を、電流の流れに対する表面抵抗率を測定することによって評価することができる(この方法は、非処理布地が絶縁体または非常に不良な導体である場合にだけ関連性がある)。
SP1変異体の金標識化
タンパク質の金標識化を、システイン側鎖を介して達成することができる。しかしながら、野生型SP1(天然SP1)(配列番号4)はシステインアミノ酸をそのペプチド配列に有しておらず、したがって、平坦な金表面へのシステイン置換SP1タンパク質の結合を試験することによって、折り畳まれたオリゴマータンパク質構造における特定の領域の重要性を調べることができ、また、それらの利用可能性を決定することができる。その目的のために、2つの異なるSP1変異体を、標準的な部位特異的変異誘発技術を使用して構築した。第1の変異体において、タンパク質の内側のリング(細孔)に位置するメチオニン43をシステインにより置換した(変異体名:M43CΔNSP1、配列番号1)。第2の変異体において、タンパク質の外縁に位置するロイシン81をシステインにより置換した(変異体名:L81CΔNSP1、配列番号2)。
シリカ表面へのSP1変異体の結合
SP1の残基または配列に対するリガンドの結合が、SP1オリゴマーの三次元立体配座に影響を及ぼすことによって制御され得るかどうかを評価するために、M43CΔNSP1(配列番号1)を、ケイ素結合性ペプチドをその内側細孔に呈示するようにさらに操作した。ケイ素結合性ヘキサペプチドmTBP(配列番号5)をコードするポリヌクレオチドを、M43CΔNSP1遺伝子のN末端コード部分に読み枠を合わせて遺伝子融合し、得られるポリペプチドを大腸菌において発現させた。得られたタンパク質(mtbSP1、配列番号3)はリング形状のホモドデカマーであり、これは、6個がリングのそれぞれの側に存在する12個のケイ素酸化物結合性ペプチドをその内側細孔に呈示する(図4を参照のこと)。
SP1変化体によるカーボンナノチューブ(CNT)分散
材料および方法:
多層カーボンナノチューブ(MWCNT)を、Arkema Inc.(フランス;GRAPHISTRENGTH(商標)C100)またはBayer MaterialScience AG(ドイツ;Baytubes C150P)のどちらかから得た。単層カーボンナノチューブ(SWCNT)をTeijin,Ltd(ヤマグチ、日本)から得た。
本明細書中上記の表2はCNT分散実験の結果を示す。表2に記載されるSP1変化体は熱に安定であり、また、一般にプロテアーゼ抵抗性である。しかしながら、アルカラーゼ(1000倍希釈)とのインキュベーションは、アルカラーゼにより処理されていないサンプルと比較して、分子量における変化を引き起こす。すべての場合において、アルカラーゼ処理されたSP1変化体の見かけ分子量は依然として、天然SP1の見かけ分子量よりも大きく、このことは、CNT結合性ペプチドに由来するアミノ酸のすべてではないが、その一部が除かれたことを示している。
エポキシ樹脂におけるSP1/MWCNT複合体の分散
タンパク質−エポキシ相互作用についての十分に研究されているモデルが、生物活性タンパク質(例えば、酵素など)の固定化のために使用されるエポキシ活性化ポリマー担体である。しかしながら、可溶性タンパク質は、中性pH値ではエポキシ基との反応性がほとんどない。エポキシにおけるSP1−CNT溶解性能力はpH依存性である:SP1−CNTは、pH8.0で乾燥されるときには沈殿し、また、10.5を超えるpHで乾燥されるときには、安定で、透明な、しかし、暗い溶液を形成する。
一般的プロトコル「A」:エポキシとのSP1/CNT相互作用を評価するために、
1.SP1/CNT(0.1%〜0.5%のCNT)を、本明細書中上記のような超音波処理を使用して水に分散させた;
2.高濃度のSP1/CNT懸濁物を、透析を使用して、限外ろ過(30kDaのカットオフ)およびpHを増大させるための緩衝液交換(NaPi(10mM;pH8.0)からNa2CO3(10mM;pH≒11)への)を使用して調製した。
3.脱水:乾燥した微細なSP1/CNTペレットを得るために、冷凍乾燥(凍結乾燥)をサンプルの脱水のために使用した。
4.SP1/CNTペレットを、1%(w/w)の濃度を得るために、10分間、エポキシ(Huntsman、LY5052)に激しく混合し、その後、260Wおよび70℃の最大温度での3時間の浴での超音波処理を行った。
5.遠心分離:その後、黒色混合物を遠心分離して(7000rpmで60分間、Sorvall SLA3000ローターを使用する)、分散されていないCNT/SP1を沈殿させる;および
6.CNT懸濁物の濃度を600nmでの透過の測定によって評価した。
1.SP1/CNT(0.1%〜0.5%のCNT)を、本明細書中上記のような超音波処理を使用して水に分散させた;
2.NaOH(0.02Mの最終濃度)の添加によるpH調節;
3.エタノール沈殿:50%〜80%のエタノールに調節し、−20℃で2時間インキュベーションし、その後、7000rpmでの60分間の遠心分離を行う(Sorval遠心分離器でのSorvalローターSLA3000);
4.脱水:乾燥した微細なSP1/CNTペレットを得るために、冷凍乾燥(凍結乾燥)をサンプルの脱水のために使用した。
4.SP1/CNTペレットを、1%(w/w)の濃度を得るために、10分間、エポキシ(Huntsman、LY5052)と激しく混合し、その後、260Wおよび70℃の最大温度での3時間の浴での超音波処理を行った。
5.遠心分離:その後、黒色混合物を遠心分離して(7000rpmで60分間、Sorvall SLA3000ローターを使用する)、分散されていないCNT/SP1を沈殿させる;および
6.CNT懸濁物の濃度を600nmでの透過の測定によって評価した。
アラミド(例えば、KEVLAR(商標))に対するSP1変化体の結合
材料科学者および材料技術者は、カーボンナノチューブを使用して超強靱かつ高性能なポリマー複合材料を作出する可能性によって興奮する。現在、CNT−ポリマー複合材を二次加工するすべての既存の方法は、複雑で、費用がかかる、時間を要求する加工技術、例えば、溶液注型、融解、成形、押出しおよびインサイチュー重合などを伴い、これらは、ナノチューブが、最終製造物(例えば、ヤーン、リボンまたはフィルム)の形成の前に、ポリマー溶液、溶融ポリマーに取り込まれるか、または、最初のモノマーと混合されることを余儀なくする。このことは、不溶性または温度感受性のポリマーには適していない。このようなポリマーは、融解することなく分解するからである。
種々の濃度(10mM NaPi(pH≒8)における22μg/ml、44μg/mlおよび88μg/mlのサンプル)でのL3SP1溶液(配列番号8)を、回転式振とう機において25℃で16時間、100mgのアラミド(KEVLAR(商標))布地とインキュベーションし、その後、溶液が無色になるまで(これはCNTの非存在を示す)、かつ、タンパク質が洗浄液において全く検出されなくなるまで、同じ緩衝液により大々的に洗浄して、微量の非結合のタンパク質およびCNTを除いた。アラミド(KEVLAR(商標))へのCNT結合をアラミド(KEVLAR(商標))繊維の暗色化によって評価した。洗浄されたアラミド(KEVLAR(商標))へのSP1結合を、アラミド(KEVLAR(商標))を2mlのBCAタンパク質アッセイ試薬(Pierce、カタログ番号23227)と37℃で30分間反応し、562nmでの光学濃度を測定することによって求めた。結合したタンパク質の量を計算し、プロットした。結果が図10Aに示される。
L3SP1/CNT複合体とのインキュベーションの後における結合繊維および非結合繊維の比較は、徹底した洗浄の後でさえ、CNTの多大な結合を示した(示されず)。BCAタンパク質アッセイもまた、SP1/布地(w/w)の比率がおよそ2mgタンパク質/g繊維(2/1000)であることを示した。並行した実験では、L−1−SP1(配列番号6)およびL−4 SP1(配列番号9)もまた、アラミド(KEVLAR(商標))に結合することが明らかにされた。L3−SP1/CNTとのインキュベーションの後、アラミド(KEVLAR(商標))繊維は色が濃くなった。このことは、大々的な洗浄の後でさえ、アラミド(KEVLAR(商標))繊維へのCNTの結合を示している。図10Bは、アラミド(KEVLAR(商標))に結合するSP1/CNTのSDS−PAGE分析を示し、CNTおよびタンパク質が繊維に結合することを明らかにする。30mgのアラミドを180/1000(w/w)のL4−SP1−CNT分散物とインキュベーションし、その後、浴での超音波処理(90分、30℃〜70℃の間に及ぶ温度)、繊維除去、(緩衝液を使用する)大々的な洗浄、および、煮沸(60ulにおいて10分)を行って、結合したタンパク質およびCNTを抽出することにより、結合したCNTだけでなく、結合したタンパク質を有する暗色化した繊維がもたらされた(図10B、レーン1〜レーン3)。
カーボン布地へのSP1変化体の結合
カーボン布地は、航空宇宙分野および自動車分野において、同様にまた、帆船およびスポーツ設備において様々な重要な適用を有する広く知られている高強度材料であり、これらにおいては、その大きい強度対重量比が重要である。連続する炭素繊維/エポキシ複合材が、それらの優れた機械的特性に起因して構造的適用のために広範囲に使用されている。ポリマーはほとんどの場合、エポキシであり、しかし、他のポリマー、例えば、ポリエステル、ビニルエステルまたはナイロンなどもまた使用される。しかしながら、それらのマトリックス支配的特性(例えば、面内および層間の剪断特性など)はそれらの繊維支配的特性よりもはるかに弱く、したがって、これらの従来的複合材の利益を制限している。加えて、複合材が、引張り強さよりも低い長さ方向の圧縮強さ(マトリックス支配的特性)を示すことが知られている。
SP1−CBDの溶解された封入体の製造:
SP1−CBDが、米国特許第7253341号(Wang他)に記載されるように、不溶性の封入体(IB)として細菌宿主において発現させられる。簡単に記載すると、108アミノ酸のSP1アミノ酸配列(配列番号88)をコードするSP1のcDNAを、クロストリジウム・セルロボランス(Clostridium cellulovorans)のセルロース結合性タンパク質Aの163アミノ酸のCBDドメインをコードするヌクレオチド配列(配列番号87)を有する発現ベクターにクローン化した。得られた核酸構築物は、ペプチドリンカー(配列番号89)を含むSP1−CBD融合タンパク質をコードした。クローニング後、得られたプラスミドを使用して、大腸菌株BL21(DE3)を形質転換した。組換えCBD−SP1融合タンパク質の合成を、IPTG(イソプロピル−D−チオガラクトシド)を細菌培養物の中期対数期に1mMの最終濃度に加え、その後、37℃でのさらに5時間のインキュベーションを行うことによってBL21(DE3)において誘導した。組換えSP1−CBD融合タンパク質(配列番号86)が封入体(IB)において検出され、封入体を単離および精製した。簡単に記載すると、SP1−CBDを含有するIBを、Trisma塩基(20mM)、NaOH(8mM)に溶解し(氷上で30分、1:200の比率(w/v))、その後、高速遠心分離(13000rpm、30分間)を行った。上清を水に1:10で希釈し、pHを(NaPi緩衝液(100mM、pH=6.8)を使用して)pH=8.2に調節した。
分析目的のために、50mgの炭素繊維(Sigmatex)を1mlのスクリューキャップ・ガラスチューブ(Fisherbrand、カタログ番号:03−338AA、サイズ:12x35mm、1/2DR)に計り取った。L3SP1溶液(配列番号8)(10mM NaPi(pH≒8)における0、1、2、4および8(mg SP1/gCF)に対応する0、50、100、200および400(ug/ml))を、(Elma Transsonic Sonifierを使用して1.5時間)浴型超音波処理装置においてインキュベーションし(浴型超音波処理装置を運転している間、温度が20℃から60℃に上がった)、その後、同じ緩衝液による大々的な洗浄を行って、微量の非結合L3−SP1タンパク質を除いた。洗浄された布地へのSP1結合を、布地を2mlのBCAタンパク質アッセイ試薬(Pierce、カタログ番号23227)と37℃で30分間反応し、562nmでの光学濃度を測定することによって求めた。結合したタンパク質の量を計算し、プロットした。結果が図12Aに示される。図12AはBCAタンパク質アッセイを示し、また、SP1/布地(w/w)の比率が7mgタンパク質/g繊維(0.07%)にまで達することを示す。
1.超音波処理の継続期間にわたる600nmでのL3−SP1/CNT懸濁物の透過率を測定する。この場合、透過率は溶液中のCNT濃度における低下を示し、したがって、布地へのその結合を示す。透過率の値はL3−SP1/CNT標準曲線に従ってCNT濃度と相関した(図14B)。図12Cは、超音波処理時間(0〜5時間)にわたる(600nmでの増大する透過率によって測定されるように、溶液からのCNTの)低下を示す。このことは、L3SP1−CNT複合体が布地に結合することを示している。この「減算」法によって測定されるときの最大CNT結合が4mg CNT/gr布地(0.4%)であった。
2.布地へのCNT結合を評価するためのより直接的な方法が、溶液を(冷凍乾燥を使用して)脱水した後における乾燥物重量測定である。結合前および結合後の乾燥物重量の差が計算された。これは、この方法によって測定されるときの最大CNT結合が、類似する3.6mg/gr布地(0.36%)であり、上記の「減算」法により測定して得られる結果と類似していたことを示している。
電気伝導性の編織物
従来の編織物(天然物および合成物の両方)はほとんど常に絶縁体(電気の不良な導体)である。絶縁体を導体に変換することにおける関心が、静電気遮蔽衣類または電磁遮蔽衣類を得るための必要性から、あるいは、画期的な電子的「スマート」編織物の製造のために生じている。
カーボンナノチューブを2工程の手順で布地/編織物に結合させた。簡単に記載すると、L3SP1(配列番号8)およびSP1−CBD(配列番号86)を可溶性複合体および不溶性封入体(IB)の両方として発現させる。L3SP1のIBをTrisma塩基(20mM)、NaOH(8mM)に溶解し(氷上で30分、1:200の比率(w/v))、その後、高速遠心分離(13000rpm、30分間)を行った。上清を水に1:10で希釈し、pHを(NaPi緩衝液(100mM、pH=6.8)を使用して)pH=8.2に調節した。
配列番号2は、Sp1改変体変異体:アミノ酸2〜6欠失、L81C改変である。
配列番号3は、Sp1(2〜6欠失、M43C改変)のN′に融合されるmTBペプチドである。
配列番号5は、mTBペプチドである。
配列番号6は、L1−Sp1融合ポリペプチドである。
配列番号7は、デルタN′ Sp1コード配列である。
配列番号8は、L3−Sp1融合ポリペプチドである。
配列番号9は、L4−Sp1融合ポリペプチドである。
配列番号10は、L1ペプチドである。
配列番号11は、L2ペプチドである。
配列番号12は、L3ペプチドである。
配列番号13は、L6ペプチドである。
配列番号14は、L2−Sp1融合ポリペプチドである。
配列番号15は、L6−Sp1融合ポリペプチドである。
配列番号16は、L7−Sp1融合ポリペプチドである。
配列番号17は、L5−Sp1融合ポリペプチドである。
配列番号18は、L8−Sp1融合ポリペプチドである。
配列番号19は、例示的異種チタン結合ペプチドである。
配列番号20〜27は、無機物質に結合する例示的ペプチドである。
配列番号55は、mtbSPコード配列である。
配列番号56は、L1−Sp1コード配列である。
配列番号57は、L2−Sp1コード配列である。
配列番号58は、L3−Sp1コード配列である。
配列番号59は、L6−Sp1コード配列である。
配列番号60は、L4−Sp1コード配列である。
配列番号61は、L5−Sp1コード配列である。
配列番号62は、L7−Sp1コード配列である。
配列番号63は、L8−Sp1コード配列である。
配列番号64は、Sp1改変体変異体:アミノ酸2〜6欠失である。
配列番号65〜68,70〜85は、一本鎖DNAオリゴヌクレオチドである。
配列番号69は、M43CデルタN′ Sp1コード配列である。
配列番号86は、Sp1−CBDキメラポリペプチドである。
配列番号87は、CBDドメインである。
配列番号88は、Sp1ポリペプチドである。
配列番号89は、Sp1−CBD融合タンパク質ペプチドリンカーである。
Claims (53)
- SP1ポリペプチドと、前記SP1ポリペプチドのN末端におけるカーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドとを含む単離されたキメラポリペプチドであって、前記SP1ポリペプチドが、
i)配列番号1に対する少なくとも65%のアミノ酸相同性、
ii)安定ダイマー形成能、および
iii)配列番号4のアミノ酸9〜11、アミノ酸44〜46および/またはアミノ酸65〜73に対応する少なくとも1つの領域における少なくとも1つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられる、単離されたキメラポリペプチド。 - 前記少なくとも1つの保存されたアミノ酸配列は、「HAFESTFES」(配列番号4の65〜73)、「VKH」(配列番号4の9〜11)、および「KSF」(配列番号4の44〜46)からなる群から選択される、請求項1に記載の単離されたキメラポリペプチド。
- 前記カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドは、配列番号10〜配列番号13からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の単離されたキメラポリペプチド。
- 前記SP1ポリペプチドは、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号14〜配列番号18および配列番号86のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の単離されたキメラポリペプチド。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のキメラポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項5に記載の単離されたポリヌクレオチドを、その組換え発現を行わせるために少なくとも1つのプロモータに転写的に連結されて含む核酸構築物。
- カーボンナノチューブまたはグラファイト表面に非共有結合的に結合する、請求項1〜4のいずれかに記載のキメラポリペプチドを含む組成物。
- 前記キメラポリペプチドは、配列番号8に示される通りである、請求項7に記載の組成物。
- SP1−ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地を形成するために、ポリマー、布地またはポリマー布地に結合する少なくとも1つのSP1ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体を含む組成物であって、前記SP1ポリペプチドが、請求項1〜4のいずれかに記載のキメラSP1ポリペプチドである、組成物。
- 前記少なくとも1つのSP1−ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体は、請求項7に記載の組成物を含む、請求項9に記載の組成物。
- 前記SP1−ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地は、SP1−ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化アラミド繊維を含む、請求項9または10に記載の組成物。
- 前記SP1−ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地は、SP1−ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化アラミドの織布または不織布を含む、請求項9〜11のいずれかに記載の組成物。
- 前記SP1−ポリペプチドは、配列番号8に示される通りである、請求項11または12に記載の組成物。
- SP1−CBD融合タンパク質をさらに含む、請求項13に記載の組成物。
- 前記SP1−CBD融合タンパク質は、配列番号86に示される通りである、請求項14に記載の組成物。
- エラストマー物質をさらに含む、請求項9〜12のいずれかに記載の組成物。
- 前記エラストマー物質はゴムである、請求項16に記載の組成物。
- 請求項9〜17のいずれかに記載の組成物を含む成分を有する空気タイヤまたはセミ空気タイヤ。
- 前記成分は、前記SP1ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地とともに形成される複合エラストマー物質である、請求項18に記載のタイヤ。
- 前記SP1ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地は、前記SP1ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地を有しないタイヤと比較した場合、改善された熱伝導性および電気伝導性を与える、請求項18または19に記載のタイヤ。
- 請求項18〜20のいずれかに記載のタイヤを有する車輌を高速化するための方法であって、電流を、前記少なくとも1つの、SP1−ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地に与えて、その結果、前記タイヤの温度を所望される温度に変化させるようにすること、および、前記車輌を高速化することを含む方法。
- 結合したSP1ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体を含む布地基体材料を含む電気伝導性布地であって、前記電気伝導性布地の導電率が、前記結合したSP1ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体を有しない同じ布地基体材料の導電率よりも大きく、前記SP1ポリペプチドが、請求項1〜4のいずれかに記載のキメラSP1ポリペプチドである、電気伝導性布地。
- 前記布地は、綿、ウール、絹、ナイロン、ポリエステル、アラミド、ポリプロピレンおよびエラステインからなる群から選択される織布または不織布である、請求項22に記載の電気伝導性布地。
- 電気伝導性のポリマー、布地またはポリマー布地を製造するための方法であって、布地基体材料を提供すること、SP1ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の組成物を調製すること、および、前記布地基体材料を前記SP1ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の組成物により処理すること、および、前記布地基体材料を洗浄して、電気伝導性SP1ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の組成物の過剰量を除くこと、それにより、前記ポリマー、ポリマー布地または布地基体材料に電気伝導性を与えることを含み、前記SP1ポリペプチドが、請求項1〜4のいずれかに記載のキメラSP1ポリペプチドである、方法。
- SP1ポリペプチドと、前記SP1ポリペプチドのN末端における配列番号5に示される異種のケイ素結合性ペプチドとを含む単離されたキメラポリペプチドであって、前記SP1ポリペプチドが、
i)配列番号4に対する少なくとも65%のアミノ酸相同性、
ii)安定ダイマー形成能、および
iii)配列番号4のアミノ酸9〜11、アミノ酸44〜46および/またはアミノ酸65〜73に対応する少なくとも1つの領域における少なくとも1つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられる、単離されたキメラポリペプチド。 - 前記少なくとも1つの保存されたアミノ酸配列は、「HAFESTFES」(配列番号4の65〜73)、「VKH」(配列番号4の9〜11)、および「KSF」(配列番号4の44〜46)からなる群から選択される、請求項25に記載の単離されたキメラポリペプチド。
- 配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する、請求項25に記載の単離されたキメラポリペプチド。
- 配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するSP1ポリペプチドを含む単離されたポリペプチド。
- 物質と結合することができる改変アミノ酸配列を有する少なくとも1つのSP1ポリペプチドを含むSP1ドデカマーを含む組成物であって、前記改変アミノ酸配列が、SP1ドデカマーの中央の空洞領域に対応する前記SP1ポリペプチドの領域に位置し、前記物質の前記結合がカオトロピック剤の存在下で高まり、組成物がさらに、前記カオトロピック剤を含み、かつ、前記SP1ポリペプチドが、
i)配列番号4に対する少なくとも65%のアミノ酸相同性、
ii)安定ダイマー形成能、および
iii)配列番号4のアミノ酸9〜11、アミノ酸44〜46および/またはアミノ酸65〜73に対応する少なくとも1つの領域における少なくとも1つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられ、
かつ、前記カオトロピック剤がグアニジニウム塩酸塩であるとき、前記改変アミノ酸配列はNi結合Hisタグを含まない、組成物。 - 前記少なくとも1つの保存されたアミノ酸配列は、「HAFESTFES」(配列番号4の65〜73)、「VKH」(配列番号4の9〜11)、および「KSF」(配列番号4の44〜46)からなる群から選択される、請求項29に記載の組成物。
- 前記改変アミノ酸配列は、カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチド、ケイ素結合性ペプチドおよびセルロース結合性ドメインペプチドからなる群から選択される異種ペプチドを含むために改変される、請求項29に記載の組成物。
- 前記カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドは、配列番号10〜配列番号13からなる群から選択される、請求項31に記載の組成物。
- 前記ケイ素結合性ペプチドは、配列番号5および配列番号19からなる群から選択される、請求項31に記載の組成物。
- 前記SP1ポリペプチドはN末端欠失を含む、請求項29〜33のいずれかに記載の組成物。
- 前記カオトロピック剤は、グアニジニウム塩酸塩、尿素および過塩素酸リチウムからなる群から選択される、請求項29に記載の組成物。
- 前記SP1ポリペプチドは、配列番号1〜配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号9および配列番号14〜配列番号18ならびに配列番号86のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する、請求項29に記載の組成物。
- 物質と結合することができる改変アミノ酸配列を有する少なくとも第1および少なくとも第2の非同一SP1ポリペプチドモノマーを含むヘテロマー組成物であって、前記第1および第2のSP1モノマーの前記改変アミノ酸配列が互いに非同一であり、前記SP1ポリペプチドが、
i)配列番号4に対する少なくとも65%のアミノ酸相同性、
ii)安定ダイマー形成能、および
iii)配列番号4のアミノ酸9〜11、アミノ酸44〜46および/またはアミノ酸65〜73に対応する少なくとも1つの領域における少なくとも1つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられ、前記非同一モノマーがそれらの無機物質結合配列において異なる、ヘテロマー組成物。 - 前記少なくとも1つの保存されたアミノ酸配列は、「HAFESTFES」(配列番号4の65〜73)、「VKH」(配列番号4の9〜11)、および「KSF」(配列番号4の44〜46)からなる群から選択される、請求項37に記載のヘテロマー組成物。
- 前記改変アミノ酸配列は、カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチド、ケイ素結合性ペプチド、SP1−CBD融合タンパク質およびシステイン置換体からなる群から選択される、請求項37に記載のヘテロマー組成物。
- 前記第1および第2のSP1モノマーの前記改変配列は非同一の物質と結合する、請求項37に記載のヘテロマー組成物。
- ドデカマーである、請求項37〜40のいずれかに記載のヘテロマー組成物。
- 改変SP1ポリペプチドドデカマーと複合体化された第1の無機物質と、前記改変SP1ポリペプチドドデカマーと複合体化された第2の無機物質とを含む組成物であって、前記第1の無機物質および第2の無機物質が前記SP1ポリペプチドドデカマーの第1および第2の結合領域を介して複合体化され、かつ、前記SP1ポリペプチドが、
i)配列番号4に対する少なくとも65%のアミノ酸相同性、
ii)安定ダイマー形成能、および
iii)配列番号4のアミノ酸9〜11、アミノ酸44〜46および/またはアミノ酸65〜73に対応する少なくとも1つの領域における少なくとも1つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられる、組成物。 - 前記第1または第2の無機物質のうちの少なくとも一方が非共有結合性の結合によって前記改変SP1ポリペプチドドデカマーと複合体化される、請求項42に記載の組成物。
- 前記第1または第2の無機物質のうちの少なくとも一方が共有結合性の結合によって前記改変SP1ポリペプチドドデカマーと複合体化される、請求項42に記載の組成物。
- 前記結合領域の少なくとも1つがカーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドであり、前記第2の結合領域がカーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドではない、請求項42に記載の組成物。
- 前記第1の無機物質がカーボンナノチューブまたはグラファイト表面であり、前記第2の無機物質が、ポリマー、布地またはポリマー布地である、請求項42〜45のいずれかに記載の組成物。
- 前記第1の結合領域がカーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドであり、第2の結合領域がケイ素結合性ペプチドである、請求項42〜45のいずれかに記載の組成物。
- 前記SP1ポリペプチドドデカマーは、配列番号1〜配列番号3、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号14〜配列番号18および配列番号86のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するSP1ポリペプチドを含む、請求項42〜47のいずれかに記載の組成物。
- 前記第1の無機物質がカーボンナノチューブまたはグラファイト表面である、請求項42〜48のいずれかに記載の組成物。
- 物質を溶媒に分散させる方法であって、前記物質を、請求項1〜4,7,8,25,29および37のいずれかに記載の組成物または単離されたキメラSP1ポリペプチドと接触させて、前記物質と、前記組成物または前記単離されたキメラSP1ポリペプチドとの間での複合体を形成させること、および
前記複合体を、溶液または懸濁物を形成するように溶媒と接触させること;
それにより、前記物質を前記溶媒に分散させること
を含む、方法。 - 前記溶媒は水性溶媒または有機溶媒である、請求項50に記載の方法。
- 前記溶媒はエポキシである、請求項50に記載の方法。
- 前記物質はカーボンナノチューブである、請求項50に記載の方法。
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