JPWO2019163871A1 - 融合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明は、新規薬物送達系（ＤＤＳ）、電子デバイスの作製等の用途に有望な手段を提供する。より具体的には、本発明は、（ａ）フェリチン単量体、および（ｂ）フェリチン単量体におけるＢ領域およびＣ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域中に挿入された機能性ペプチドを含む、融合タンパク質、ならびに（ａ）フェリチン単量体、および（ｂ）フェリチン単量体におけるＢ領域およびＣ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域中に挿入された機能性ペプチドを含む融合タンパク質から構成されており、かつ内腔を有する、多量体などを提供する。

Description

本発明は、融合タンパク質などに関する。
フェリチンは、動植物から微生物まで普遍的に存在する、複数の単量体から構成される内腔を有する球状タンパク質である。ヒト等の動物では、フェリチンとしてＨ鎖およびＬ鎖の２種の単量体が存在すること、およびフェリチンは２４個の単量体から構成される多量体（多くの場合、Ｈ鎖およびＬ鎖の混合物）であることが知られている。一方、微生物では、フェリチンは、Ｄｐｓ（ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｓｔａｒｖｅｄ ｃｅｌｌｓ）とも呼ばれており、１２個の単量体から構成される多量体であることが知られている。フェリチンは、生体あるいは細胞中の鉄元素のホメオスタシスに深く関わっており、その内腔中に鉄を保持できるため、鉄の輸送・貯蔵等の生理学的機能の役割を担うことが知られている。フェリチンは、鉄以外にも、ベリリウム、ガリウム、マンガン、リン、ウラン、鉛、コバルト、ニッケル、クロムなどの金属の酸化物、また、セレン化カドミウム、硫化亜鉛、硫化鉄、硫化カドミウムなどの半導体・磁性体などのナノ粒子を人工的に貯蔵できることが示されており、半導体材料工学分野や医療分野での応用研究が盛んに行われている（非特許文献１）。
現在までに、フェリチン単量体とペプチドとの融合タンパク質として、（１）フェリチン単量体の末端領域にペプチドを付加した融合タンパク質、および（２）フェリチン単量体の内部領域（末端領域以外の領域）にペプチドを挿入した融合タンパク質が幾つか報告されている。
例えば、上記（１）の融合タンパク質として、以下の報告がある。
特許文献１および非特許文献１は、フェリチン単量体の一方の末端領域に酸化チタンを付加した融合タンパク質を調製したこと、ならびに調製した融合タンパク質が電子デバイス（例、半導体）の作製に有用であることを開示している。
特許文献２は、Ｄｐｓの両方の末端領域に所定のペプチドを付加した融合タンパク質を調製したこと、ならびに調製した融合タンパク質が特殊な多孔質構造を有する電子デバイスの作製に有用であることを開示している。
上記（２）の融合タンパク質としては、ヒトフェリチンＬ鎖のＤ領域およびＥ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域（フェリチン単量体のＮ末端から数えて５番目および６番目のα−ヘリックスの間の領域）に所定のペプチドを挿入した融合タンパク質の報告がある。
例えば、非特許文献２および３、ならびに特許文献３は、ヒトフェリチンＬ鎖におけるＤ領域およびＥ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域中に所定のペプチド（例、インターロイキン−４受容体（ＩＬ−４Ｒ）標的ペプチド）を挿入した融合タンパク質の多量体（例、ＡＰ１−ＰＢＮＣ）を調製したこと、ならびに当該多量体が癌等の疾患の治療に有用であることを開示している。
非特許文献４は、ヒトフェリチンＬ鎖におけるＤ領域およびＥ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域中にプロテアーゼ分解性ペプチドを挿入した融合タンパク質の多量体を調製したこと、ならびに当該多量体がプロテアーゼ応答性送達系として有用であることを開示している。
国際公開第２００６／１２６５９５号 国際公開第２０１２／０８６６４７号 米国特許出願公開第２０１６／００６０３０７号明細書
Ｋ．Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００７，ｖｏｌ．７．ｐ．３２００． Ｊａｅ Ｏｇ Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ（２０１３），７（９），７４６２−７４７１． Ｓｏｏｊｉ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１６），１７（３），１１５０−１１５９． Ｙｏｕｎｇ Ｊｉ Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１２），１３（１２），４０５７−４０６４．
本発明の目的は、新規薬物送達系（ＤＤＳ）、電子デバイスの作製等の用途に有望な手段を提供することである。
本発明者らは、鋭意検討した結果、各種生物のフェリチン単量体で高度に保存されているＢ領域およびＣ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域中に機能性ペプチドを挿入した融合タンパク質から構成される多量体が標的と強く相互作用できることを見出した。例えば、このような多量体は、各種生物のフェリチン単量体で高度に保存されているＤ領域以降の領域〔例、先行技術で報告されている、Ｄ領域とＥ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域〕中に機能性ペプチドを挿入した融合タンパク質から構成される多量体に比し、標的とより強く相互作用できる。したがって、このような多量体は、新規薬物送達系（ＤＤＳ）、電子デバイスの作製等の用途に有望であることを見出し、本願発明を完成するに至った。
すなわち、本願発明は、以下のとおりである。
〔１〕（ａ）フェリチン単量体、および（ｂ）フェリチン単量体におけるＢ領域およびＣ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域中に挿入された機能性ペプチドを含む、融合タンパク質。
〔２〕フェリチン単量体がヒトフェリチン単量体である、〔１〕の融合タンパク質。
〔３〕ヒトフェリチン単量体がヒトフェリチンＨ鎖である、〔１〕または〔２〕の融合タンパク質。
〔４〕ヒトフェリチン単量体がヒトフェリチンＬ鎖である、〔１〕または〔２〕の融合タンパク質。
〔５〕フェリチン単量体がＤｐｓ単量体である、〔１〕の融合タンパク質。
〔６〕機能性ペプチドが、標的材料に対する結合能を有するペプチドである、〔１〕〜〔５〕のいずれかの融合タンパク質。
〔７〕標的材料が無機物である、〔６〕の融合タンパク質。
〔８〕標的材料が金属材料である、〔７〕の融合タンパク質。
〔９〕標的材料が有機物である、〔６〕の融合タンパク質。
〔１０〕有機物が生体有機分子である、〔９〕の融合タンパク質。
〔１１〕生体有機分子がタンパク質である、〔１０〕の融合タンパク質。
〔１２〕システイン残基、またはシステイン残基含有ペプチドが、融合タンパク質のＣ末端に付加されている、〔１〕〜〔１１〕のいずれかの融合タンパク質。
〔１３〕（ａ）フェリチン単量体、および（ｂ）フェリチン単量体におけるＢ領域およびＣ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域中に挿入された機能性ペプチドを含む融合タンパク質から構成されており、かつ
内腔を有する、多量体。
〔１４〕（１）〔１３〕の多量体、および（２）標的材料を含み、
標的材料が、前記融合タンパク質中の機能性ペプチドに結合している、複合体。
〔１５〕〔１〕〜〔１２〕のいずれかの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１６〕〔１５〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔１７〕〔１５〕のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
フェリチン単量体におけるＢ領域およびＣ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域中に機能性ペプチドを挿入した、フェリチン単量体および機能性ペプチドの融合タンパク質を含む多量体は、標的と非常に強く相互作用することができる。本発明により、このような相互作用能力に優れた多量体のみならず、このような多量体の調製に用いることができる単量体である融合タンパク質、およびこのような多量体を用いて提供することができる複合体が提供される。また、本発明により、このような融合タンパク質、多量体および複合体の調製に有用であるポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。
図１−１は、動的光散乱法（ＤＬＳ）によるＦＴＨ−ＢＣ−ＴＢＰの粒径および溶液分散性の評価を示す図である。ＦＴＨ−ＢＣ−ＴＢＰは、フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域にチタン認識ペプチド（ｍｉｎＴＢＰ１）が挿入融合されたヒト由来フェリチンＨ鎖である。 図１−２は、動的光散乱法（ＤＬＳ）によるＦＴＨ−Ｄ−ＴＢＰの粒径および溶液分散性の評価を示す図である。ＦＴＨ−Ｄ−ＴＢＰは、フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて４番目と５番目の間のフレキシブルリンカー領域に金認識ペプチド（ＧＢＰ１）が挿入融合されたヒト由来フェリチンＨ鎖である。 図２は、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）法による、チタン成膜に対するＦＴＨ−ＢＣ−ＴＢＰおよびＦＴＨ−Ｄ−ＴＢＰの吸着性の評価を示す図である。 図３は、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）法により測定された、ＦＴＨ−ＢＣ−ＴＢＰおよびＦＴＨ−Ｄ−ＴＢＰ濃度に対する周波数の変化を示す図である。各濃度に対する周波数の変化を測定し、次いで、各濃度の逆数と周波数変化の逆数との相関関係をプロットし、その傾きから解離平衡定数ＫＤ値を求めた。 図４は、ＦＨＢｃについて、３％りんタングステン酸染色による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像（カゴ状形状）を示す図である。ＦＨＢｃは、フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に癌認識ＲＧＤペプチドが挿入融合され、Ｃ末端にシステインが追加されたヒト由来フェリチンＨ鎖である。 図５は、動的光散乱法（ＤＬＳ）による、酸化鉄ナノ粒子を封入したＦＨＢｃの粒径および溶液分散性の評価を示す図である。 図６−１は、動的光散乱法（ＤＬＳ）によるＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰの粒径および溶液分散性の評価を示す図である。ＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰは、フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に金認識ペプチド（ＧＢＰ１）が挿入融合されたヒト由来フェリチンＨ鎖である。 図６−２は、動的光散乱法（ＤＬＳ）によるＦＴＨ−Ｄ−ＧＢＰの粒径および溶液分散性の評価を示す図である。ＦＴＨ−Ｄ−ＧＢＰは、フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて４番目と５番目の間のフレキシブルリンカー領域に金認識ペプチド（ＧＢＰ１）が挿入融合されたヒト由来フェリチンＨ鎖である。 図７は、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）法による、金薄膜に対するＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰおよびＦＴＨ−Ｄ−ＧＢＰの吸着性の評価を示す図である。各濃度に対する周波数の変化を測定し、次いで、各濃度の逆数と周波数変化の逆数との相関関係をプロットし、その傾きから解離平衡定数ＫＤ値を求めた。 図８は、ＦＴＬ−ＢＣ−ＧＢＰの模式的立体構造を示す図である。ＦＴＬ−ＢＣ−ＧＢＰは、フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に金認識ペプチド（ＧＢＰ１）が挿入融合されたヒト由来フェリチンＬ鎖である。 図９は、ＦＴＬ−ＤＥ−ＧＢＰの模式的立体構造を示す図である。ＦＴＬ−ＤＥ−ＧＢＰは、フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて５番目と６番目の間のフレキシブルリンカー領域に金認識ペプチド（ＧＢＰ１）が挿入融合されたヒト由来フェリチンＬ鎖である。 図１０は、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）法による、金薄膜に対するＦＴＬ−ＢＣ−ＧＢＰおよびＦＴＬ−ＤＥ−ＧＢＰの吸着性の評価を示す図である。ＦＴＬ−ＢＣ−ＧＢＰおよびＦＴＬ−ＤＥ−ＧＢＰ濃度に対する周波数の変化を測定し、次いで、各濃度の逆数と周波数変化の逆数との相関関係をプロットし、その傾きから解離平衡定数ＫＤ値を求めた。 図１１は、ＢＣＤｐｓ−ＣＳ４について、３％りんタングステン酸染色による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像（カゴ状形状）を示す図である。ＢＣＤｐｓ−ＣＳ４は、フェリチンの対応領域とＣ末端に異種ペプチドが挿入されたＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ由来のＤｐｓである。 図１２は、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）法による、金薄膜に対するＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰおよびＦＴＨ−ＤＥ−ＧＢＰの吸着性の評価を示す図である。ＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰおよびＦＴＨ−ＤＥ−ＧＢＰ濃度に対する周波数の変化を測定し、次いで、各濃度の逆数と周波数変化の逆数との相関関係をプロットし、その傾きから解離平衡定数ＫＤ値を求めた。
本発明は、（ａ）フェリチン単量体、および（ｂ）フェリチン単量体におけるＢ領域およびＣ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域中に挿入された機能性ペプチドを含む、融合タンパク質を提供する。
フェリチン（多量体タンパク質）は、種々の生物に普遍的に存在する。したがって、本発明では、フェリチンを構成するフェリチン単量体として、種々の生物のフェリチン単量体を使用することができる。フェリチン単量体が由来する生物としては、例えば、動物、昆虫、魚類、植物等の高等生物、および微生物が挙げられる。動物としては、哺乳動物または鳥類（例、ニワトリ）が好ましく、哺乳動物がより好ましい。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、齧歯類（例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、家畜および使役用の哺乳動物（例、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）が挙げられる。フェリチン単量体としては、Ｈ鎖またはＬ鎖のいずれも使用することができる。フェリチン単量体としては、天然に生じるフェチリン単量体、またはその変異体のいずれも使用することができる。
一実施形態では、フェリチン単量体は、ヒトフェリチン単量体である。ヒトへの臨床応用の観点より、フェリチン単量体としてヒトフェリチン単量体を用いることが好ましい。ヒト由来フェリチン単量体として、ヒトフェリチンＨ鎖、またはヒトフェリチンＬ鎖のいずれも使用することができる。
好ましくは、ヒトフェリチンＨ鎖は、以下であってもよい：
（Ａ１）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ１）配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる、１もしくは数個のアミノ酸残基の修飾を含むアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、２４量体）形成能を有するタンパク質；または
（Ｃ１）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、２４量体）形成能を有するタンパク質。
好ましくは、ヒトフェリチンＬ鎖は、以下であってもよい：
（Ａ２）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ２）配列番号４のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる、１もしくは数個のアミノ酸残基の修飾を含むアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、２４量体）形成能を有するタンパク質；または
（Ｃ２）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、２４量体）形成能を有するタンパク質。
別の実施形態では、フェリチン単量体は、微生物フェリチン単量体である。微生物フェリチンは、Ｄｐｓとも呼ばれる。Ｄｐｓは、それが由来する細菌の種類によってはＮａｐＡ、バクテリオフェリチン、ＤｌｐまたはＭｒｇＡと称呼される場合があり、また、Ｄｐｓには、ＤｐｓＡ、ＤｐｓＢ、Ｄｐｓ１、Ｄｐｓ２等のサブタイプが知られている（Ｔ．Ｈａｉｋａｒａｉｎｅｎ ａｎｄ Ａ．Ｃ．Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｎ， Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，２０１０ ｖｏｌ．６７，ｐ．３４１を参照）。したがって、本発明では、微生物フェリチン単量体として、Ｄｐｓまたは上記別称タンパク質の単量体を使用することができる。
微生物フェリチンとしては、種々の微生物のフェリチンが知られている（例、国際公開第２０１２／０８６６４７号）。このような微生物としては、例えば、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、エスケリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、サーモシネココッカス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびデイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ならびにコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が挙げられる。リステリア属に属する細菌としては、例えば、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）が挙げられる。スタフィロコッカス属に属する細菌としては、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ）が挙げられる。バチルス属に属する細菌としては、例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。ストレプトコッカス属に属する細菌としては、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）が挙げられる。ビブリオ属に属する細菌としては、例えば、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）が挙げられる。エスケリシア属に属する細菌としては、例えば、エスケリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が挙げられる。ブルセラ属に属する細菌としては、例えば、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ Ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）が挙げられる。ボレリア属に属する細菌としては、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）が挙げられる。マイコバクテリウム属に属する細菌としては、例えば、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）が挙げられる。カンピロバクター属に属する細菌としては、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）が挙げられる。サーモシネココッカス属に属する細菌としては、例えば、サーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ Ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）が挙げられる。デイノコッカス属に属する細菌としては、例えば、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）が挙げられる。コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が挙げられる。したがって、本発明では、微生物フェリチン単量体として、このような微生物のフェリチン単量体を使用することができる。
好ましくは、微生物フェリチン単量体は、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）フェリチン（Ｄｐｓ）単量体であってもよい。リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）フェリチン（Ｄｐｓ）単量体は、以下であってもよい：
（Ａ３）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ３）配列番号６のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる、１もしくは数個のアミノ酸残基の修飾を含むアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、１２量体）形成能を有するタンパク質；または
（Ｃ３）配列番号６のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、１２量体）形成能を有するタンパク質。
タンパク質（Ｂ１）〜（Ｂ３）では、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる１、２、３または４種の修飾により、１個または数個のアミノ酸残基を改変することができる。アミノ酸残基の修飾は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１または数個」は、タンパク質の活性を大きく損なわない個数を示す。用語「１または数個」が示す数は、例えば１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、さらにより好ましくは１〜２０個、特に好ましくは１〜１０個または１〜５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。
タンパク質（Ｃ１）〜（Ｃ３）では、対象のアミノ酸配列に対する相同性の程度は、好ましくは９２％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、さらにより好ましくは９７％以上であり、最も好ましくは９８％以上または９９％以上である。アミノ酸配列の相同性（即ち、同一性または類似性）は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、相同性を計算してもよい。また、相同性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ Ｓｉｚｅ ｔｏ Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定で類似性をｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。あるいは、相同性は、ＮＥＥＤＬＥプログラム（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９７０；４８：４４３−４５３）検索において、デフォルト設定のパラメータ（Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５、Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２）を用いて得られた値（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）であってもよい。これらの計算で導き出される相同性％の値のうち、最も低い値を採用してもよい。相同性％としては、好ましくは同一性％が利用される。
アミノ酸配列において変異を導入すべきアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであるが、配列アライメントをさらに参考にして特定されてもよい。具体的には、当業者は、１）複数のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、配列アライメントを利用することによりアミノ酸配列において変異を導入すべき位置を特定でき、また、既知の二次および三次構造情報を併用して、アミノ酸配列において変異を導入すべきアミノ酸残基の位置を特定することもできる。
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
高等生物のフェリチン単量体は、種々の高等生物間で高度に保存された６つのα−ヘリックスを有すること、および高等生物のフェリチン単量体としてＨ鎖およびＬ鎖の２種の単量体が存在することが知られている。一方、微生物のフェリチン単量体（Ｄｐｓ単量体）は、種々の微生物間で高度に保存された５つのα−ヘリックスを有すること、および微生物のフェリチン単量体としては１種の単量体が存在することが知られている。高等生物および微生物のフェリチン単量体は、Ａ領域、Ｂ領域、Ｃ領域、およびＤ領域中のα−ヘリックスが高度に保存されている。高等生物のフェリチン単量体では、微生物のフェリチン単量体に存在するＢ領域とＣ領域の境界中のα−ヘリックスの欠損が認められる。一方、微生物のフェリチン単量体では、高等生物のフェリチン単量体に存在するＥ領域中のα−ヘリックスの欠損が認められる。高等生物のフェリチン単量体としてヒトフェリチン単量体、微生物のフェリチン単量体としてリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）フェリチン単量体を例に挙げて、α−ヘリックスの位置を要約すると、以下の表１に示すとおりである。
各種生物のフェリチン単量体で高度に保存されているＢ領域およびＣ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域（ヒト等の高等生物では、フェリチン単量体のＮ末端から数えて２番目および３番目のα−ヘリックスの間の領域；および微生物では、フェリチン（Ｄｐｓ）単量体のＮ末端から数えて２番目および４番目のα−ヘリックスの間の領域）に機能性ペプチドを挿入した融合タンパク質から構成される多量体は、各種生物のフェリチン単量体で高度に保存されているＤ領域以降の領域〔例、先行技術で報告されている、Ｄ領域とＥ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域（例、フェリチン単量体のＮ末端から数えて５番目および６番目のα−ヘリックスの間の領域）〕に機能性ペプチドを挿入した融合タンパク質から構成される多量体に比し、標的とより強く相互作用することができる。
フェリチン単量体におけるＢ領域およびＣ領域のα−ヘリックスは、当該分野において周知であり、また、当業者であれば、各種生物由来のフェリチン単量体において、Ｂ領域およびＣ領域のα−ヘリックスの位置を適宜特定することができる。したがって、本発明において機能性ペプチドが挿入されるＢ領域およびＣ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域もまた、当該分野において周知であり、また、当業者であれば適宜特定することができる。例えば、ヒトフェリチンＨ鎖（配列番号２）等の高等等物フェリチンＨ鎖に対する機能性ペプチドのこのような挿入位置としては、７８〜９６位（好ましくは８３〜９１位）のアミノ酸残基からなる領域中の任意の位置を利用することができる。また、ヒトフェリチンＬ鎖（配列番号４）等の高等等物フェリチンＬ鎖に対する機能性ペプチドのこのような挿入位置としては、７４〜９２位（好ましくは７９〜８７位）のアミノ酸残基からなる領域中の任意の位置を利用することができる。さらに、リステリア・イノキュアＤｐｓ（配列番号６）等の微生物フェリチン単量体Ｄｐｓに対する機能性ペプチドのこのような挿入位置としては、６７〜９４位（好ましくは８２〜９４位）のアミノ酸残基からなる領域中の任意の位置を利用することができる。実施例で構築された各種融合タンパク質では、種々の機能性ペプチド（例、チタン認識ペプチド、癌認識ペプチド、金認識ペプチド）が、以下の表２に示すとおり、所定のフェリチン単量体中の所望の部位に挿入されている。
機能性ペプチドとしては、目的タンパク質と融合された場合に任意の機能を目的タンパク質に付加することができるペプチドを用いることができる。このようなペプチドとしては、標的材料に対する結合能を有するペプチド、プロテアーゼ分解性ペプチド、細胞透過性ペプチド、安定化ペプチドが挙げられる。本発明では、標的材料に対する結合能を有するペプチドをフェリチンの第２および第３α−ヘリックスの間の領域に挿入した融合タンパク質から構成される多量体が、同ペプチドをフェリチンの第５および第６α−ヘリックスの間の領域に挿入した融合タンパク質から構成される多量体に比し、標的材料の結合能に優れることが見出されている。これは、第２および第３α−ヘリックスの間の領域に挿入されたペプチドが、第５および第６α−ヘリックスの間の領域に挿入されたペプチドに比し、標的とより強く相互作用できることを示す。したがって、機能性ペプチドとして、標的材料に対する結合能を有するペプチドを用いた場合のみならず、他のペプチド（例、プロテアーゼ分解性ペプチド）を用いた場合も、標的（例、プロテアーゼ）と強く相互作用し得ると考えられることから、本発明は、このような他のペプチドを機能性ペプチドとして用いる場合も有用である。
上述した領域中に挿入される機能性ペプチドは、所望の機能を有する１個のペプチドのみであってもよいし、または所望の機能を有する同種もしくは異種の複数（例、２個、３個もしくは４個等の数個）のペプチドであってもよい。機能性ペプチドが上記のような複数のペプチドである場合、複数の機能性ペプチドは、任意の順序で挿入されて、フェリチン単量体と融合することができる。融合は、アミド結合を介して達成することができる。融合は、アミド結合により直接的に達成されてもよいし、あるいは１個のアミノ酸残基（例、メチオニン）または数個（例えば２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸残基からなるペプチド（ペプチドリンカー）が介在したアミド結合により間接的に達成されてもよい。種々のペプチドリンカーが知られているので、本発明でも、このようなペプチドリンカーを使用することができる。好ましくは、上述した領域中に挿入されるペプチド全体の長さは、２０個のアミノ酸残基以下である。
機能性ペプチドとして、標的材料に対する結合能を有するペプチドを用いる場合、標的材料としては、例えば、有機物および無機物（例、導体、半導体および磁性体）が挙げられる。より具体的には、このような標的材料としては、生体有機分子、金属材料、シリコン材料、炭素材料、タンパク質精製用タグ（例、ヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）と相互作用できる材料（例、ニッケル、マルトース、グルタチオン）、標識物質（例、放射性物質、蛍光物質、色素）、ポリマー（例、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリエチレンオキシドまたはポリ（Ｌ−乳酸）等の疎水性有機ポリマーまたは伝導性ポリマー）が挙げられる。
生体有機分子としては、例えば、タンパク質（例、オリゴペプチドまたはポリペプチド）、核酸（例、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）、糖質（例、モノサッカリド、オリゴサッカリドまたはポリサッカリド）、脂質が挙げられる。生体有機分子はまた、細胞表面抗原（例、癌抗原、心疾患マーカー、糖尿病マーカー、神経疾患マーカー、免疫疾患マーカー、炎症マーカー、ホルモン、感染症マーカー）であってもよい。生体有機分子はまた、疾患抗原（例、癌抗原、心疾患マーカー、糖尿病マーカー、神経疾患マーカー、免疫疾患マーカー、炎症マーカー、ホルモン、感染症マーカー）であってもよい。このような生体有機分子に対する結合能を有するペプチドとしては、種々のペプチドが報告されている。例えば、タンパク質に対する結合能を有するペプチド（例、Ｆ．Ｄａｎｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１２，ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１１，ｐ．２９６１．、Ｃ−Ｈ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，２０１５，ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２９０，２９０ｒａ９１．Ｌ．Ｖａｎｎｕｃｃｉ ｅｔ．ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２，ｖｏｌ．７，ｐ．１４８９、Ｊ．Ｃｕｔｒｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，ｖｏｌ．１９（８），ｐ．１４６８、Ｒ．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１７，ｖｏｌ．１１０−１１１，ｐ．１３を参照）、核酸に対する結合能を有するペプチド（例、Ｒ．Ｔａｎ ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５、ｖｏｌ．９２，ｐ．５２８２、Ｒ．Ｔａｎ ｅｔ．ａｌ．Ｃｅｌｌ、１９９３、ｖｏｌ．７３， ｐ．１０３１、Ｒ．Ｔａｌａｎｉａｎ ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２，ｖｏｌ．３１，ｐ．６８７１を参照）、糖質に対する結合能を有するペプチド（例、Ｋ．Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，ｖｏｌ．８９，Ｎｏ．１２，ｐ．５３９３−５３９７．，Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌ．１１１，ｐ．４３６，Ａ．Ｂａｉｍｉｅｖ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｃｏｗ），２００５，ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．１，ｐ．９０．を参照）、脂質に対する結合能を有するペプチド（例、Ｏ．Ｋｒｕｓｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｂ Ｚ． Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，１９９５，ｖｏｌ．５０ｃ，ｐ．３８０，Ｏ．Ｓｉｌｖａ ｅｔ．ａｌ．， Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，ｖｏｌ．６，２７１２８．， Ａ．Ｆｉｌｏｔｅｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌ．２６７，Ｎｏ．１７，ｐ．１１８００を参照）等の種々のペプチドが報告されている。
好ましくは、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドは、タンパク質に対する結合能を有するペプチドであってもよい。タンパク質に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、Ｄａｎｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１２，ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１１，ｐ．２９６１に開示されるＲＧＤ含有ペプチドやその改変配列（例、ＲＧＤ（配列番号３７）、ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ（配列番号３８）、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号３９）、ＧＲＧＤＳ（配列番号４０）、およびＡＳＤＲＧＤＦＳＧ（配列番号１６））、ならびにその他のインテグリン認識配列（例、ＥＩＬＤＶ（配列番号４１）、およびＲＥＤＶ（配列番号４２））、Ｌ．Ｖａｎｎｕｃｃｉ ｅｔ．ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２，ｖｏｌ．７，ｐ．１４８９に開示されるペプチド（例、ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰ（配列番号４３））、Ｊ．Ｃｕｔｒｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．８，ｐ．１４６８に開示されるペプチド（例、ＶＮＴＡＮＳＴ（配列番号４４））、Ｒ．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１７，ｖｏｌ．１１０−１１１，ｐ．１３に開示されるペプチド（例、ＤＨＬＡＳＬＷＷＧＴＥＬ（配列番号４５）、およびＮＹＳＫＰＴＤＲＱＹＨＦ（配列番号４６）、ＩＰＬＰＰＰＳＲＰＦＦＫ（配列番号４７）、ＬＭＮＰＮＮＨＰＲＴＰＲ（配列番号４８）、ＣＨＨＮＬＴＨＡＣ（配列番号４９）、ＣＬＨＨＹＨＧＳＣ（配列番号５０）、ＣＨＨＡＬＴＨＡＣ（配列番号５１）、ＳＰＲＰＲＨＴＬＲＬＳＬ（配列番号５２）、ＴＭＧＦＴＡＰＲＦＰＨＹ（配列番号５３）、ＮＧＹＥＩＥＷＹＳＷＶＴＨＧＭＹ（配列番号５４）、ＦＲＳＦＥＳＣＬＡＫＳＨ（配列番号５５）、ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（配列番号５６）、ＱＨＹＮＩＶＮＴＱＳＲＶ（配列番号５７）、ＱＲＨＫＰＲＥ（配列番号５８）、ＨＳＱＡＡＶＰ（配列番号５９）、ＡＧＮＷＴＰＩ（配列番号６０）、ＰＬＬＱＡＴＬ（配列番号６１）、ＬＳＬＩＴＲＬ（配列番号６２）、ＣＲＧＤＣＬ（配列番号６３）、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号６４）、ＲＴＤＬＤＳＬＲＴＹＴＬ（配列番号６５）、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（配列番号６６）、ＡＰＳＰＭＩＷ（配列番号６７）、ＬＱＮＡＰＲＳ（配列番号６８）、ＳＷＴＬＹＴＰＳＧＱＳＫ（配列番号６９）、ＳＷＥＬＹＹＰＬＲＡＮＬ（配列番号７０）、ＷＱＰＤＴＡＨＨＷＡＴＬ（配列番号７１）、ＣＳＤＳＷＨＹＷＣ（配列番号７２）、ＷＨＷＬＰＮＬＲＨＹＡＳ（配列番号７３）、ＷＨＴＥＩＬＫＳＹＰＨＥ（配列番号７４）、ＬＰＡＦＦＶＴＮＱＴＱＤ（配列番号７５）、ＹＮＴＮＨＶＰＬＳＰＫＹ（配列番号７６）、ＹＳＡＹＰＤＳＶＰＭＭＳ（配列番号７７）、ＴＮＹＬＦＳＰＮＧＰＩＡ（配列番号７８）、ＣＬＳＹＹＰＳＹＣ（配列番号７９）、ＣＶＧＶＬＰＳＱＤＡＩＧＩＣ（配列番号８０）、ＣＥＷＫＦＤＰＧＬＧＱＡＲＣ（配列番号８１）、ＣＤＹＭＴＤＧＲＡＡＳＫＩＣ（配列番号８２）、ＫＣＣＹＳＬ（配列番号８３）、ＭＡＲＳＧＬ（配列番号８４）、ＭＡＲＡＫＥ（配列番号８５）、ＭＳＲＴＭＳ（配列番号８６）、ＷＴＧＷＣＬＮＰＥＥＳＴＷＧＦＣＴＧＳＦ（配列番号８７）、ＭＣＧＶＣＬＳＡＱＲＷＴ（配列番号８８）、ＳＧＬＷＷＬＧＶＤＩＬＧ（配列番号８９）、ＮＰＧＴＣＫＤＫＷＩＥＣＬＬＮＧ（配列番号９０）、ＡＮＴＰＣＧＰＹＴＨＤＣＰＶＫＲ（配列番号９１）、ＩＶＷＨＲＷＹＡＷＳＰＡＳＲＩ（配列番号９２）、ＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ（配列番号９３）、ＭＱＬＰＬＡＴ（配列番号９４）、ＣＲＡＬＬＲＧＡＰＦＨＬＡＥＣ（配列番号９５）、ＩＥＬＬＱＡＲ（配列番号９６）、ＴＬＴＹＴＷＳ（配列番号９７）、ＣＶＡＹＣＩＥＨＨＣＷＴＣ（配列番号９８）、ＴＨＥＮＷＰＡ（配列番号９９）、ＷＨＰＷＳＹＬＷＴＱＱＡ（配列番号１００）、ＶＬＷＬＫＮＲ（配列番号１０１）、ＣＴＶＲＴＳＡＤＣ（配列番号１０２）、ＡＡＡＰＬＡＱＰＨＭＷＡ（配列番号１０３）、ＳＨＳＬＬＳＳ（配列番号１０４）、ＡＬＷＰＰＮＬＨＡＷＶＰ（配列番号１０５）、ＬＴＶＳＰＷＹ（配列番号１０６）、ＳＳＭＤＩＶＬＲＡＰＬＭ（配列番号１０７）、ＦＰＭＦＮＨＷＥＱＷＰＰ（配列番号１０８）、ＳＹＰＩＰＤＴ（配列番号１０９）、ＨＴＳＤＱＴＮ（配列番号１１０）、ＣＬＦＭＲＬＡＷＣ（配列番号１１１）、ＤＭＰＧＴＶＬＰ（配列番号１１２）、ＤＷＲＧＤＳＭＤＳ（配列番号１１３）、ＶＰＴＤＴＤＹＳ（配列番号１１４）、ＶＥＥＧＧＹＩＡＡ（配列番号１１５）、ＶＴＷＴＰＱＡＷＦＱＷＶ（配列番号１１６）、ＡＱＹＬＮＰＳ（配列番号１１７）、ＣＳＳＲＴＭＨＨＣ（配列番号１１８）、ＣＰＬＤＩＤＦＹＣ（配列番号１１９）、ＣＰＩＥＤＲＰＭＣ（配列番号１２０）、ＲＧＤＬＡＴＬＲＱＬＡＱＥＤＧＶＶＧ（配列番号１２１）、ＳＰＲＧＤＬＡＶＬＧＨＫ（配列番号１２２）、ＳＰＲＧＤＬＡＶＬＧＨＫＹ（配列番号１２３）、ＣＱＱＳＮＲＧＤＲＫＲＣ（配列番号１２４）、ＣＭＧＮＫＣＲＳＡＫＲＰ（配列番号１２５）、ＣＧＥＭＧＷＶＲＣ（配列番号１２６）、ＧＦＲＦＧＡＬＨＥＹＮＳ（配列番号１２７）、ＣＴＬＰＨＬＫＭＣ（配列番号１２８）、ＡＳＧＡＬＳＰＳＲＬＤＴ（配列番号１２９）、ＳＷＤＩＡＷＰＰＬＫＶＰ（配列番号１３０）、ＣＴＶＡＬＰＧＧＹＶＲＶＣ（配列番号１３１）、ＥＴＡＰＬＳＴＭＬＳＰＹ（配列番号１３２）、ＧＩＲＬＲＧ（配列番号１３３）、ＣＰＧＰＥＧＡＧＣ（配列番号１３４）、ＣＧＲＲＡＧＧＳＣ（配列番号１３５）、ＣＲＧＲＲＳＴ（配列番号１３６）、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号１３７）、ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１３８）、ＨＶＧＧＳＳＶ（配列番号１３９）、ＲＧＤＧＳＳＶ（配列番号１４０）、ＳＷＫＬＰＰＳ（配列番号１４１）、ＣＲＧＤＫＲＧＰＤＣ（配列番号１４２）、ＧＧＫＲＰＡＲ（配列番号１４３）、ＲＩＧＲＰＬＲ（配列番号１４４）、ＣＧＦＹＷＬＲＳＣ（配列番号１４５）、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号１４６）、ＴＬＴＹＴＷＳ（配列番号１４７）、ＳＳＱＰＦＷＳ（配列番号１４８）、ＹＲＣＴＬＮＳＰＦＦＷＥＤＭＴＨＥＣ（配列番号１４９）、ＫＴＬＬＰＴＰ（配列番号１５０）、ＫＥＬＣＥＬＤＳＬＬＲＩ（配列番号１５１）、ＩＲＥＬＹＳＹＤＤＤＦＧ（配列番号１５２）、ＮＶＶＲＱ（配列番号１５３）、ＶＥＣＹＬＩＲＤＮＬＣＩＹ（配列番号１５４）、ＣＧＧＲＲＬＧＧＣ（配列番号１５５）、ＷＦＣＳＷＹＧＧＤＴＣＶＱ（配列番号１５６）、ＮＱＱＬＩＥＥＩＩＱＩＬＨＫＩＦＥＩＬ（配列番号１５７）、ＫＭＶＩＹＷＫＡＧ（配列番号１５８）、ＬＮＩＶＳＶＮＧＲＨ（配列番号１５９）、ＱＭＡＲＩＰＫＲＬＡＲＨ（配列番号１６０）、およびＱＤＧＲＭＧＦ（配列番号１６１））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
好ましくは、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドは、核酸に対する結合能を有するペプチドであってもよい。核酸に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、Ｒ．Ｔａｎ ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５、ｖｏｌ．９２，ｐ．５２８２に開示されるペプチド（例、ＴＲＱＡＲＲＮ（配列番号１６２）、ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（配列番号１６３）、ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ（配列番号１６４）、ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ（配列番号１６５）、ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡ（配列番号１６６）、およびＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（配列番号１６７））、Ｒ．Ｔａｎ ｅｔ．ａｌ．Ｃｅｌｌ、１９９３、ｖｏｌ．７３，ｐ．１０３１に開示されるペプチド（例、ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（配列番号１６８））、Ｔａｌａｎｉａｎ ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２，ｖｏｌ．３１，ｐ．６８７１に開示されるペプチド（例、ＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫ（配列番号１６９））、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
好ましくは、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドは、糖質に対する結合能を有するペプチドであってもよい。糖質に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、Ｋ．Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，ｖｏｌ．８９，No１２，ｐ．５３９３−５３９７．に開示されるペプチド（例、ＤＶＦＹＰＹＰＹＡＳＧＳ（配列番号１７０）、およびＲＶＷＹＰＹＧＳＹＬＴＡＳＧＳ（配列番号１７１））、Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌ．１１１，ｐ．４３６に開示されるペプチド（例、ＤＴＷＰＮＴＥＷＳ（配列番号１７２）、ＤＳＹＨＮＩＷ（配列番号１７３）、ＤＴＹＦＧＫＡＹＮＰＷ（配列番号１７４）、およびＤＴＩＧＳＰＶＮＦＷ（配列番号１７５））、Ａ．Ｂａｉｍｉｅｖ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｃｏｗ），２００５，ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．１，ｐ．９０に開示されるペプチド（ＴＹＣＮＰＧＷＤＰＲＤＲ（配列番号１７６）、およびＴＦＹＮＥＥＷＤＬＶＩＫＤＥＨ（配列番号１７７））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
好ましくは、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドは、脂質に対する結合能を有するペプチドであってもよい。脂質に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、Ｏ．Ｋｒｕｓｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，１９９５，ｖｏｌ．５０ｃ，ｐ．３８０に開示されるペプチド（例、ＭＴＬＩＬＥＬＶＶＩ（配列番号１７８）、ＭＴＳＩＬＥＲＥＱＲ（配列番号１７９）、およびＭＴＴＩＬＱＱＲＥＳ（配列番号１８０））、Ｏ．Ｓｉｌｖａ ｅｔ．ａｌ．， Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，ｖｏｌ．６，２７１２８に開示されるペプチド（例、ＶＦＱＦＬＧＫＩＩＨＨＶＧＮＦＶＨＧＦＳＨＶＦ（配列番号１８１））、Ａ．Ｆｉｌｏｔｅｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌ．２６７（１７），ｐ．１１８００に開示されるペプチド（例、ＫＫＡＶＫＶＰＫＫＥＫＳＶＬＱＧＫＬＴＲＬＡＶＱＩ（配列番号１８２））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
金属材料としては、例えば、金属および金属化合物が挙げられる。金属としては、例えば、チタン、金、クロム、亜鉛、鉛、マンガン、カルシウム、銅、カルシウム、ゲルマニウム、アルミニウム、ガリウム、カドミウム、鉄、コバルト、銀、プラチナ、パラジウム、ハフニウム、テルルが挙げられる。金属化合物としては、例えば、このような金属の酸化物、硫化物、炭酸化物、砒化物、塩化物、フッ化物およびヨウ化物、ならびに金属間化合物が挙げられる。このような金属材料に対する結合能を有するペプチドとしては、種々のペプチドが報告されている（例、国際公開第２００５／０１００３１号；国際公開第２０１２／０８６６４７号；Ｋ．Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．；Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，ｖｏｌ．１５．ｐ．２６９．；Ｋ．Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，ｖｏｌ．６６．ｐ．１０．；Ｕｍｅｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，１７，２５７１−２５７５（２００５）；Ｍ．Ｂ．Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４，ｖｏｌ．１５．ｐ．１７７６．；Ｃ．Ｅ．Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００３，ｖｏｌ．１３．ｐ．２４１４．）。したがって、本発明では、このような種々のペプチドを用いることができる。また、金属に対する結合能を有するペプチドは、金属の析出（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）作用を有し得ること、および金属化合物に対する結合能を有するペプチドは、金属化合物の析出作用を有し得ることが知られている（例、Ｋ．Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．、Ｍ．Ｕｍｅｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，２００５，ｖｏｌ．１７，ｐ．２５７１．）。したがって、標的材料に対する結合能を有するペプチドとして、金属材料に対する結合能を有するペプチドを用いる場合、金属材料に対する結合能を有するペプチドは、このような析出作用を有することができる。
好ましくは、金属材料に対する結合能を有するペプチドは、チタンまたはチタン化合物（例、酸化チタン）等のチタン材料に対する結合能を有するペプチド、および金または金化合物等の金材料に対する結合能を有するペプチドであってもよい。チタン材料に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、後述する実施例および国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるペプチド（例、ＲＫＬＰＤＡ（配列番号７）、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４に開示されるペプチド（例、ＳＳＫＫＳＧＳＹＳＧＳＫＧＳＫＲＲＩＬ（配列番号１８３））、Ｉ．Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００６，ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．５，ｐ．５２８に開示されるペプチド（例、ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＦＭＳ（配列番号１８４））、ならびに国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるペプチド（例、ＲＫＬＰＤＡＰＧＭＨＴＷ（配列番号１８５）、およびＲＡＬＰＤＡ（配列番号１８６））、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。金材料に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、後述する実施例およびＳ．Ｂｒｏｗｎ，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９７，ｖｏｌ．１５， ｐ．２６９に開示されるペプチド（例、ＭＨＧＫＴＱＡＴＳＧＴＩＱＳ（配列番号２１））、Ｊ．Ｋｉｍ ｅｔ．ａｌ．，Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．，２０１０，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．７，ｐ．２６８１に開示されるペプチド（例、ＴＧＴＳＶＬＩＡＴＰＹＶ（配列番号１８７）、およびＴＧＴＳＶＬＩＡＴＰＧＶ（配列番号１８８））、ならびにＫ．Ｎａｍ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，ｖｏｌ．３１２，Ｎｏ．５７７５，ｐ．８８５．に開示されるペプチド（例、ＬＫＡＨＬＰＰＳＲＬＰＳ（配列番号１８９））、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
シリコン材料としては、例えば、シリコンまたはシリコン化合物が挙げられる。シリコン化合物としては、例えば、シリコンの酸化物（例、一酸化ケイ素（ＳｉＯ）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2））、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、シラン（ＳｉＨ４）、シリコーンゴムが挙げられる。このようなシリコン材料に対する結合能を有するペプチドとしては、種々のペプチドが報告されている（例、国際公開第２００６／１２６５９５号；国際公開第２００６／１２６５９５号；Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４）。したがって、本発明では、このような種々のペプチドを用いることができる。
好ましくは、シリコン材料に対する結合能を有するペプチドは、シリコンまたはシリコン化合物（例、シリコンの酸化物）に対する結合能を有するペプチドであってもよい。このようなペプチドとしては、例えば、国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるペプチド（例、ＲＫＬＰＤＡ（配列番号７））、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４に開示されるペプチド（例、ＳＳＫＫＳＧＳＹＳＧＳＫＧＳＫＲＲＩＬ（配列番号１９０））、ならびに国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるペプチド（ＭＳＰＨＰＨＰＲＨＨＨＴ（配列番号１９１）、ＴＧＲＲＲＲＬＳＣＲＬＬ（配列番号１９２）、およびＫＰＳＨＨＨＨＨＴＧＡＮ（配列番号１９３））、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
炭素材料としては、例えば、カーボンナノ材料（例、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、カーボンナノホン（ＣＮＨ））、フラーレン（Ｃ６０）、グラフェンシート、グラファイトが挙げられる。このような炭素材料に対する結合能を有するペプチドとしては、種々のペプチドが報告されている（例、特開２００４−１２１１５４号公報；特開２００４−１２１１５４号公報；Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４）。したがって、本発明では、このような種々のペプチドを用いることができる。
好ましくは、炭素材料に対する結合能を有するペプチドは、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）またはカーボンナノホン（ＣＮＨ）等のカーボンナノ材料に対する結合能を有するペプチドであってもよい。このようなペプチドとしては、例えば、後述する実施例および特開２００４−１２１１５４号公報に開示されるペプチド（例、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１９４））、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４に開示されるペプチド（ＨＳＳＹＷＹＡＦＮＮＫＴ（配列番号１９５））、ならびに特開２００４−１２１１５４号公報に開示されるペプチド（例、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号１９６））、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
機能性ペプチドとしてプロテアーゼ分解性ペプチドが用いられる場合、プロテアーゼとしては、例えば、カスパーゼやカテプシンなどのシステインプロテアーゼ（Ｄ． ＭｃＩｌｗａｉｎ１ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．，２０１３，ｖｏｌ．５，ａ００８６５６、Ｖ．Ｓｔｏｋａ ｅｔ ａｌ．，ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ．２００５，ｖｏｌ．５７，Ｎｏ．４−５ｐ．３４７）、コラゲナーゼ（Ｇ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，２００７，ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．３） ，ｐ．６４６）、トロンビンやＸａ因子（Ｒ．Ｊｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２００３，ｖｏｌ．３１，ｐ．１、Ｈ．Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．， ２０１０，ｖｏｌ．８４，Ｎｏ．２，ｐ．１０７６）、ウイルス由来プロテアーゼ（Ｃ．Ｂｙｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｒｅｓ．，２００６，ｖｏｌ．６７，ｐ．５０１）が挙げられる。
プロテアーゼ分解性ペプチドとしては、例えば、Ｅ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２０１５，ｖｏｌ．２５，ｐ．１２７９に開示されるペプチド（例、ＧＲＲＧＫＧＧ（配列番号１９７））、Ｇ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，２００７，ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．３），ｐ．６４６に開示されるペプチド（例、ＧＰＬＧＶ（配列番号１９８）、およびＧＰＬＧＶＲＧ（配列番号１９９））、Ｙ．Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１２，ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．１２，ｐ．４０５７に開示されるペプチド（例、ＧＧＬＶＰＲＧＳＧＡＳ（配列番号２００））、Ｒ．Ｔａｌａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，ｖｏｌ．２７２，ｐ．９６７７に開示されるペプチド（例、ＹＥＶＤＧＷ（配列番号２０１）、ＬＥＶＤＧＷ（配列番号２０２）、ＶＤＱＭＤＧＷ（配列番号２０３）、ＶＤＶＡＤＧＷ（配列番号２０４）、ＶＱＶＤＧＷ（配列番号２０５）、およびＶＤＱＶＤＧＷ（配列番号２０６））、Ｊｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２００３，ｖｏｌ．３１，ｐ．１に開示されるペプチド（例、ＥＬＳＬＳＲＬＲＤＳＡ（配列番号２０７）、ＥＬＳＬＳＲＬＲ（配列番号２０８）、ＤＮＹＴＲＬＲＫ（配列番号２０９）、ＹＴＲＬＲＫＱＭ（配列番号２１０）、ＡＰＳＧＲＶＳＭ（配列番号２１１）、ＶＳＭＩＫＮＬＱ（配列番号２１２）、ＲＩＲＰＫＬＫＷ（配列番号２１３）、ＮＦＦＷＫＴＦＴ（配列番号２１４）、ＫＭＹＰＲＧＮＨ（配列番号２１５）、ＱＴＹＰＲＴＮＴ（配列番号２１６）、ＧＶＹＡＲＶＴＡ（配列番号２１７）、ＳＧＬＳＲＩＶＮ（配列番号２１８）、ＮＳＲＶＡ（配列番号２１９）、ＱＶＲＬＧ（配列番号２２０）、ＭＫＳＲＮＬ（配列番号２２１）、ＲＣＫＰＶＮ（配列番号２２２）、およびＳＳＫＹＰＮ（配列番号２２３））、Ｈ．Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１０，ｖｏｌ．８４，Ｎｏ．２，ｐ．１０７６に開示されるペプチド（例、ＬＶＰＲＧＳ（配列番号２２４））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
機能性ペプチドとして安定化ペプチドが用いられる場合、安定化ペプチドとしては、例えば、Ｘ．Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，２０１１，ｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，ｐ．９７７に開示されるペプチド（例、ＣＣＡＬＮＮ（配列番号２２５））、ならびにＥ．Ｆａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１６，ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．２，ｐ．５１４に開示されるペプチド（例、ＰＡＳ（配列番号２２６））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
機能性ペプチドとして細胞透過性ペプチドが用いられる場合、細胞透過性ペプチドとしては、例えば、Ｚ．Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｐ．，２０１６，ｖｏｌ．４，Ｎｏ．５，ｐ．５２８に開示されるペプチド（例、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号２２７）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２２８）、ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ（配列番号２２９）、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２３０）、ＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号２３１）、ＧＬＡＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭ（配列番号２３２）、ＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２３３）、ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（配列番号２３４）、ＭＶＲＲＦＬＶＴＬ（配列番号２３５）、ＲＩＲＲＡＣＧＰＰＲＶＲＶ（配列番号２３６）、ＭＶＫＳＫＩＧＳＷＩＬＶＬＦＶ（配列番号２３７）、ＳＤＶＧＬＣＫＫＲＰ（配列番号２３８）、ＮＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＱＲ（配列番号２３９）、ＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＱ（配列番号２４０）、ＤＰＫＧＤＰＫＧＶＴＶＴ（配列番号２４１）、ＶＴＶＴＶＴＧＫＧＤＰＫＰＤ（配列番号２４２）、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫ（配列番号２４３）、ＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２４４）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧ（配列番号２４５）、ＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２４６）、ＲＬＳＧＭＮＥＶＬＳＦＲＷ（配列番号２４７）、ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ（配列番号２４８）、およびＰＩＥＶＣＭＹＲＥＰ（配列番号２４９））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
機能性ペプチドとしては、標的材料に対する結合能を有するペプチドが好ましい。標的材料に対する結合能を有するペプチドの好ましい例は、有機物に対する結合能を有するペプチドである。有機物に対する結合能を有するペプチドとしては、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドが好ましく、タンパク質に対する結合能を有するペプチドがより好ましい。標的材料に対する結合能を有するペプチドの別の好ましい例は、無機物に対する結合能を有するペプチドである。無機物に対する結合能を有するペプチドとしては、金属材料に対する結合能を有するペプチドが好ましく、チタン材料または金材料に対する結合能を有するペプチドがより好ましい。
本発明の融合タンパク質は、そのＮ末端領域および／またはＣ末端領域において改変されていてもよい。ヒトフェリチン単量体等の動物フェリチン単量体のＮ末端は多量体の表面上に露出され、そのＣ末端は表面上に露出し得ない。したがって、動物フェリチン単量体のＮ末端に付加されるペプチド部分は多量体の表面に露出して、多量体の外部に存在する標的材料と相互作用できるものの、動物フェリチン単量体のＣ末端に付加されるペプチド部分は多量体の表面に露出せず、多量体の外部に存在する標的材料と相互作用することができない（例、国際公開第２００６／１２６５９５号）。しかし、動物フェリチン単量体のＣ末端は、そのアミノ酸残基を改変することで、多量体の内腔中への薬剤の封入に利用できることが報告されている（例、Ｙ．Ｊ．Ｋａｎｇ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１２，ｖｏｌ．１３（１２），４０５７を参照）。一方、微生物フェリチン単量体（すなわちＤｐｓ）は、そのＮ末端およびＣ末端の双方が多量体の表面に露出し得る。したがって、微生物フェリチン単量体のＮ末端およびＣ末端の双方に付加されるペプチド部分はそれぞれ、多量体の表面に露出して、多量体の外部に存在する異なる標的材料と相互作用することができる（例、国際公開第２０１２／０８６６４７号）。
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、そのＮ末端領域における改変として、Ｎ末端にペプチド部分が付加されていてもよい。付加されるべきペプチド部分としては、例えば、上述したような機能性ペプチドが挙げられる。あるいは、付加されるべきペプチド部分としてはまた、例えば、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ−ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能を有するペプチド成分（例、全長タンパク質またはその一部）、ならびにリンカーが挙げられる。融合タンパク質のＮ末端に付加されるペプチド部分として、第２および第３α−ヘリックスの間の領域に挿入される機能性ペプチドと同じまたは異なるペプチドを利用することができるが、異なる標的材料への相互作用の実現等の観点から、異なるペプチドを利用することが好ましい。好ましくは、本発明の融合タンパク質のＮ末端に付加されるペプチド部分は、上述したような機能性ペプチドである。Ｎ末端に付加されるペプチド部分はまた、開始コドンに対応するアミノ酸残基（例、メチオニン残基）をＮ末端に含むように設計することが好ましい。このような設計により、本発明の融合タンパク質の翻訳を促進することができる。
別の好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、そのＣ末端領域における改変として、Ｃ末端領域におけるアミノ酸残基が反応性アミノ酸残基に置換されていてもよく、Ｃ末端領域において反応性アミノ酸残基が挿入されていてもよく、またはＣ末端に反応性アミノ酸残基またはその含有ペプチド（例えば２〜１２個、好ましくは２〜５個のアミノ酸残基からなるペプチド）が付加されていてもよい。このようなＣ末端領域としては、例えば、ヒトフェリチンＨ鎖については１７５〜１８３番目（好ましくは１７９〜１８３番目）のアミノ酸残基からなる領域、およびヒトフェリチンＬ鎖については１７１〜１７５番目（好ましくは１７３〜１７５番目）のアミノ酸残基からなる領域が挙げられる。このような改変により、反応性アミノ酸残基および所定の物質（例、薬物、標識物質）を反応させることができ、それにより多量体の内腔中に所定の物質を共有結合を介して封入することができる。このような反応性アミノ酸残基としては、例えば、チオール基を有するシステイン残基、アミノ基を有するリジン残基、アルギニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基が挙げられるが、システイン残基が好ましい。好ましくは、本発明の融合タンパク質のＣ末端領域の改変は、反応性アミノ酸残基またはその含有ペプチドのＣ末端への付加である。
本発明の融合タンパク質は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞（本発明の宿主細胞）を用いて、融合タンパク質を宿主細胞に産生させることで入手することができる。本発明の融合タンパク質を産生させるための宿主細胞としては、例えば、動物、昆虫、魚類、植物、または微生物に由来する細胞が挙げられる。動物としては、哺乳動物または鳥類（例、ニワトリ）が好ましく、哺乳動物がより好ましい。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、齧歯類（例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、家畜および使役用の哺乳動物（例、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）が挙げられる。
好ましい実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞、またはヒトタンパク質の産生に汎用されている細胞（例、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞）である。融合タンパク質としてヒトフェリチン単量体および機能性ペプチドの融合タンパク質を用いる場合、ヒトへの臨床応用の観点より、このような宿主細胞を用いることが好ましい。
別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、微生物である。融合タンパク質の大量生産等の観点より、このような宿主細胞を用いてもよい。微生物としては、例えば、細菌および真菌が挙げられる。細菌としては、宿主細胞として用いられている任意の細菌を使用することができ、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌〔例、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌〔（例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌〔例、シェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）〕、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌（例、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ））が挙げられる。真菌としては、宿主細胞として用いられている任意の真菌を使用することができ、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属真菌〔例、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属真菌〔例、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）〕が挙げられる。あるいは、微生物として、糸状菌を用いてもよい。糸状菌としては、例えば、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）／タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アルペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、エメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、およびハイポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）に属する細菌が挙げられる。
本発明の宿主細胞は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに加えて、当該ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含むことが好ましい。用語「発現単位」とは、タンパク質として発現されるべき所定のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む、当該ポリヌクレオチドの転写、ひいては当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生を可能にする単位をいう。発現単位は、ターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。発現単位は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。発現単位は、微生物（宿主細胞）においてゲノム領域（例、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドが固有に存在する天然ローカスである天然ゲノム領域、もしくは当該天然ローカスではない非天然ゲノム領域）、または非ゲノム領域（例、細胞質内）に含まれることができる。発現単位は、１または２以上（例、１、２、３、４、または５）の異なる位置においてゲノム領域中に含まれていてもよい。非ゲノム領域に含まれる発現単位の具体的な形態としては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、および人工染色体が挙げられる。
発現単位を構成するプロモーターは、その下流に連結されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を宿主細胞で発現させることができるものであれば特に限定されない。例えば、プロモーターは、宿主細胞に対して同種であっても異種であってもよいが、好ましくは異種である。例えば、組換えタンパク質の産生に汎用される構成または誘導プロモーターを用いることができる。このようなプロモーターは、用いられる宿主細胞の種類（例、ヒト細胞等の哺乳動物細胞、微生物）に応じて、哺乳動物由来のプロモーター、微生物由来のプロモーター、ウイルス由来のプロモーター等のプロモーターを適宜選択することができる。
本発明の宿主細胞は、当該分野において公知の任意の方法により作製することができる。例えば、本発明の宿主細胞は、発現ベクターを用いる方法（例、コンピテント細胞法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈澱法）、またはゲノム改変技術により作製することができる。発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じる組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれることができる。一方、発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じない非組込み型ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれず、宿主細胞内において、発現ベクターの状態のまま、ゲノムＤＮＡから独立して存在できる。あるいは、ゲノム編集技術（例、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ））によれば、発現単位を宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むこと、および宿主細胞が固有に備える発現単位を改変することが可能である。
発現ベクターは、発現単位として上述した最小単位に加えて、宿主細胞で機能するターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。発現ベクターはまた、宿主細胞のゲノムＤＮＡとの相同組換えのために、宿主細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする領域をさらに含んでいてもよい。例えば、発現ベクターは、それに含まれる発現単位が一対の相同領域（例、宿主細胞のゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。発現単位が導入されるべき宿主細胞のゲノム領域（相同領域の標的）としては、特に限定されないが、宿主細胞において発現量が多い遺伝子のローカスであってもよい。
発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、または人工染色体であってもよい。発現ベクターはまた、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても非組込み型ベクターであってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクター、またはＲＮＡベクター（例、レトロウイルス）であってもよい。このような発現ベクターは、用いられる宿主細胞の種類（例、ヒト細胞等の哺乳動物細胞、微生物）に応じて、適宜選択することができる。
宿主細胞を培養するための培地は公知であり、宿主細胞の種類に応じた適切な培地を用いることができる。このような培地には、所定の成分（例、炭素源、窒素源、ビタミン）が添加されてもよい。宿主細胞は、通常１６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で、通常５〜１６８時間、好ましくは８〜７２時間培養される。培養方法としては、例えば、バッチ培養法、流加培養法、連続培養法が挙げられる。あるいは、誘導剤を用いて、融合タンパク質の発現を誘導してもよい。
産生された目的タンパク質は、塩析、沈殿法（例、等電点沈殿法、溶媒沈殿法）、分子量差を利用する方法（例、透析、限外濾過、ゲル濾過）、特異的親和性を利用する方法（例、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）、疎水度の差を利用する方法（例、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー）、またはこれらの組み合わせにより、宿主細胞またはその含有培地から精製および単離することが可能である。本発明の融合タンパク質が宿主細胞内に蓄積される場合、本発明の融合タンパク質は、まず、宿主細胞を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）または溶解（例、リゾチーム処理）し、次いで、得られた破砕物および溶解物を、上述した方法で処理することにより、得ることができる。
本発明はまた、本発明の融合タンパク質の作製に用いることができる、上述したような、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびにそれを含む発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。
本発明はまた、多量体を提供する。本発明の多量体は、融合タンパク質から構成されており、かつ内腔を有することができる。本発明の多量体を構成する融合タンパク質の詳細は、上述したとおりである。本発明の多量体は、本発明の融合タンパク質を発現させることで、自律的に生成することができる。本発明の多量体を構成する単量体単位の数は、本発明の融合タンパク質に含まれるフェリチンの由来により決定することができる。例えば、フェリチンがヒト等の動物に由来する場合、本発明の多量体は、２４量体である。一方、フェリチンが微生物に由来する場合（例、Ｄｐｓ）、本発明の多量体は、１２量体である。
本発明の多量体は、単量体単位として、単一の融合タンパク質から構成されるホモ多量体であってもよいが、異なる複数の種類（例、２種）の融合タンパク質から構成されるヘテロ多量体であってもよい。例えば、ヒト等の動物では、フェリチンの多くは、２種類のサブユニット（Ｈ鎖およびＬ鎖）からなるヘテロ多量体として存在することが知られている。したがって、本発明の多量体としても、ヘテロ多量体を使用することができる。
異なる複数の種類の融合タンパク質から構成される多量体は、例えば、異なる種類の融合タンパク質をコードする複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を用いて、異なる種類の融合タンパク質を産生させることにより、得ることができる。このような多量体はまた、単一の融合タンパク質から構成される第１の単量体と、単一の融合タンパク質（第１の多量体を構成する融合タンパク質とは異なる）から構成される第２の単量体とを、同一の媒体（例、緩衝液）中で共存させ、放置することにより、得ることができる。融合タンパク質の単量体は、例えば、本発明の多量体を、低ｐＨの緩衝液下に放置することにより調製することができる（例、Ｂ．Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，ｖｏｌ．２１，ｐ．４４５６０２を参照）。
本発明の多量体を構成する単量体の調製（例、組換えタンパク質の入手）の負担軽減等の観点からは、本発明の多量体はホモ多量体であることが好ましい。本発明のホモ多量体を構成する融合タンパク質中のフェリチン単量体部分は、上述したとおりであるが、動物フェリチンＨ鎖もしくは動物フェリチンＬ鎖のいずれかである動物フェリチン単量体、または微生物フェリチン単量体（Ｄｐｓ単量体）であることが好ましく、ヒトフェリチンＨ鎖もしくはヒトフェリチンＬ鎖のいずれかであるヒトフェリチン単量体、またはリステリア・イノキュア・フェリチン単量体（Ｄｐｓ単量体）であることがより好ましく、上記（Ａ１）〜（Ｃ１）もしくは上記（Ａ２）〜（Ｃ２）のいずれか、または上記（Ａ３）〜（Ｃ３）のいずれかであることがさらにより好ましい。本発明のホモ多量体を構成する融合タンパク質中の機能性ペプチドは、上述したとおりであるが、標的材料に対する結合能を有するペプチドが好ましい。標的材料に対する結合能を有するペプチドの好ましい例は、有機物に対する結合能を有するペプチドである。有機物に対する結合能を有するペプチドとしては、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドが好ましく、タンパク質に対する結合能を有するペプチドがより好ましい。標的材料に対する結合能を有するペプチドの別の好ましい例は、無機物に対する結合能を有するペプチドである。無機物に対する結合能を有するペプチドとしては、金属材料に対する結合能を有するペプチドが好ましく、チタン材料または金材料に対する結合能を有するペプチドがより好ましい。
本発明の多量体を構成する融合タンパク質は、そのＮ末端領域および／またはＣ末端領域において改変されていてもよい。好ましくは、本発明の多量体を構成する融合タンパク質は、上述したようなＮ末端領域における改変として、Ｎ末端にペプチド部分が付加されていてもよい。付加されるべきペプチド部分としては、例えば、上述したようなものが挙げられる。また、本発明の多量体を構成する融合タンパク質は、その上述したようなＣ末端領域における改変として、Ｃ末端領域におけるアミノ酸残基が上述したような反応性アミノ酸残基に置換されていてもよく、Ｃ末端領域において反応性アミノ酸残基が挿入されていてもよく、またはＣ末端に反応性アミノ酸残基またはその含有ペプチド（上述したものと同様）が付加されていてもよい。好ましくは、本発明の多量体を構成する融合タンパク質のＣ末端領域の改変は、反応性アミノ酸残基またはその含有ペプチドのＣ末端への付加である。
本発明の多量体は、共有結合または非共有結合の様式において、内腔中に物質を含んでいてもよい。例えば、共有結合の様式における本発明の多量体の内腔中への物質の封入は、反応性アミノ酸残基を利用して、本発明の融合タンパク質のＣ末端領域を上述したように改変することにより行うことができる。また、非共有結合の様式における本発明の多量体の内腔中への物質の封入は、物質（例、ナノ粒子）を取り込むことができるフェリチンの特性を利用することにより行うことができる。当業者は、本発明の多量体の内腔のサイズ、および本発明の多量体における物質の取り込みに関与し得る領域（例、Ｃ末端の領域：Ｒ．Ｍ．Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２６，ｐ．１３２８２を参照）中のアミノ酸残基の電荷特性等を考慮することにより、本発明の多量体に封入され得る物質を適切に選択できる。例えば、ヒトフェリチンは、外径１２ｎｍ（内径７ｎｍ）の程度の内腔を有するかご状構造を形成する。また、微生物フェリチン（Ｄｐｓ）は、外径９ｎｍ（内径４．５ｎｍ）の程度の内腔を有するかご状構造を形成する。したがって、このような多量体に封入され得る物質のサイズは、このような内腔中に封入されることを可能にするサイズであり得る。また、多量体における物質の取り込みに関与し得る領域中の電荷特性（例、正または負に荷電し得る側鎖を有するアミノ酸残基の種類および数）を変化させることにより、多量体の内腔中への物質の取り込みをより促進できることが報告されているので（例、Ｒ．Ｍ．Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２６，ｐ．１３２８２を参照）、本発明においても、電荷特性が変化された領域を有する融合タンパク質の多量体を用いることができる。非共有結合の様式において本発明の多量体に封入され得る物質としては、例えば、上述した標的材料と同様の無機材料が挙げられる。具体的には、非共有結合の様式において本発明の多量体に封入され得る物質としては、酸化鉄、ニッケル、コバルト、マンガン、リン、ウラン、ベリリウム、アルミニウム、硫化カドミウム、セレン化カドミウム、パラジウム、クロム、銅、銀、ガドリウム錯体、白金コバルト、酸化シリコン、酸化コバルト、酸化インジウム、白金、金、硫化金、セレン化亜鉛、カドミウムセレンが挙げられる。非共有結合の様式における本発明の多量体の内腔中への物質の封入は、周知の方法により行うことができ、例えば、多量体の内腔中への物質の封入方法（例、Ｉ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．，ｌｅｔｔ．，２００５．ｖｏｌ．３３，ｐ．１１５８を参照）と同様にして行うことができる。具体的には、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液中に、本発明の多量体（または本発明の融合タンパク質）および封入されるべき物質を共存させ、次いで適切な温度（例、０〜３７℃）で放置することにより、本発明の多量体の内腔中に物質を封入させることができる。
本発明の多量体は、内腔中に物質を含む場合、異なる複数の種類（例、２種、３種または４種）の物質を含む、異なる複数の種類の多量体のセットとして提供されてもよい。例えば、本発明の多量体が２種の物質を含む２種の多量体のセットとして提供される場合、このようなセットは、各々別々に調製された、第１の物質を封入する第１の多量体と、第１の物質とは異なる第２の物質を封入する第２の多量体とを、組み合せることにより、得ることができる。上述したような融合タンパク質の多様なパターンと、封入物質の多様なパターンとを適宜組み合せることにより、非常に多様性に富む本発明の多量体を得ることができる。
好ましい実施形態では、本発明の多量体は、（ａ）ヒトフェリチン単量体、および（ｂ）ヒトフェリチン単量体におけるＢ領域およびＣ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域中に挿入された機能性ペプチドを含む融合タンパク質から構成されており、かつ内腔を有しており、機能性ペプチドが生体有機分子に対する結合能を有する、多量体である。融合タンパク質中のフェリチン単量体としてヒトフェリチン単量体が利用される場合、多量体は２４量体であり得る。本発明の多量体は、内腔中に薬物を有していてもよい。このような多量体は、上述したように薬物を内腔中に封入することができ、また、機能性ペプチドの標的である生体有機分子に結合することができるので、生体有機分子が存在する生体標的部位に対して薬物を特異的に送達することができる。したがって、本発明の多量体は、例えば、薬物送達系（ＤＤＳ）として有用である。本発明の多量体はまた、それに含まれるヒトフェリチン単量体がヒトに対する抗原性および免疫原性を有しないことに照らすと、臨床応用において安全性に優れるという利点も有する。
別の好ましい実施形態では、本発明の多量体は、（ａ）フェリチン単量体、および（ｂ）フェリチン単量体におけるＢ領域およびＣ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域中に挿入された機能性ペプチドを含む融合タンパク質から構成されており、かつ内腔を有しており、機能性ペプチドが金属材料、シリコン材料、または炭素材料に対する結合能を有する、多量体である。融合タンパク質は、金属材料、シリコン材料、または炭素材料に対する結合能（好ましくは、機能性ペプチドが結合する材料と異なるものに対する結合能）を有するペプチド部分をＮ末端および／またはＣ末端に有していてもよい。融合タンパク質中のフェリチン単量体として動物フェリチン単量体が利用される場合、多量体は２４量体であり得、融合タンパク質中のフェリチン単量体として微生物フェリチン単量体が利用される場合、多量体は１２量体であり得る。このような多量体は、例えば、電子デバイス（例、光電変換素子（例、色素増感太陽電池等の太陽電池）、水素発生素子、水浄化材料、抗菌材料、半導体メモリ素子）の作製等の用途に有用である（例、国際公開第２００６／１２６５９５号；国際公開第２０１２／０８６６４７号；Ｋ．Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００７，ｖｏｌ．７．ｐ．３２００．）。
本発明はまた、複合体を提供する。本発明の複合体は、本発明の多量体、および標的材料を含む。本発明の複合体では、標的材料が、本発明の多量体を構成する融合タンパク質中の機能性ペプチドに結合している。本発明の多量体、およびそれを構成する融合タンパク質、ならびに標的材料の例および好ましい例は、上述したとおりである。標的材料はまた、他の物体に含まれていてもよく、また、他の物体と結合した状態であってもよい。例えば、標的材料として、生体有機分子（例、細胞表面抗原分子）を含む細胞、またはこのような細胞を含む組織を利用することができる。また、標的材料として、固相（例、ウェルプレート等のプレート、支持体、基板、素子、デバイス）上に固定されたものを利用することができる。
好ましい実施形態では、本発明の複合体は、（１）（ａ）ヒトフェリチン単量体、および（ｂ）ヒトフェリチン単量体におけるＢ領域およびＣ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域中に挿入された機能性ペプチドを含む融合タンパク質から構成されており、かつ内腔を有しており、機能性ペプチドが生体有機分子に対する結合能を有するものである本発明の多量体、ならびに（２）生体有機分子を含み、生体有機分子が機能性ペプチドに結合している、複合体である。このような複合体は、例えば、ＤＤＳの研究および開発（例、薬物送達機構の解析）に有用である。
別の実施形態では、本発明の複合体は、（１）（ａ）フェリチン単量体、および（ｂ）フェリチン単量体におけるＢ領域およびＣ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域中に挿入された機能性ペプチドを含む融合タンパク質から構成されており、かつ内腔を有しており、機能性ペプチドが金属材料、シリコン材料、または炭素材料に対する結合能を有するものである本発明の多量体、ならびに（２）金属材料、シリコン材料、または炭素材料を含み、金属材料、シリコン材料、または炭素材料が機能性ペプチドに結合している、複合体である。このような複合体は、例えば、電子デバイス（例、光電変換素子（例、色素増感太陽電池等の太陽電池）、水素発生素子、水浄化材料、抗菌材料、半導体メモリ素子）の作製等の用途に有用である（例、国際公開第２００６／１２６５９５号；国際公開第２０１２／０８６６４７号；Ｋ．Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００７，ｖｏｌ．７．ｐ．３２００．）。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１：多機能性フェリチンの構築（１）＞
フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域にチタン認識ペプチド（ｍｉｎＴＢＰ１：ＲＫＬＰＤＡ（配列番号７））が挿入融合されたヒト由来フェリチンＨ鎖（ＦＴＨ−ＢＣ−ＴＢＰ（配列番号８および９））をコードするＤＮＡを全合成した。全合成されたＤＮＡを鋳型として、５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＴＣＧ−３’（配列番号１０）および５’−ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧＴＣ−３’（配列番号１１）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型として、５’−ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ−３’（配列番号１２）および５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号１３）をプライマーとしてＰＣＲを行った。各々得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）で、５０℃、１５分間のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ酵素処理することで、ＦＴＨ−ＢＣ−ＴＢＰをコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＦＴＨ−ＢＣ−ＴＢＰ）を構築した。
また、フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて４番目と５番目の間のフレキシブルリンカー領域にチタン認識ペプチド（ｍｉｎＴＢＰ１）が挿入融合されたヒト由来フェリチンＨ鎖（ＦＴＨ−Ｄ−ＴＢＰ、配列番号２５０および２５１）をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＦＴＨ−Ｄ−ＴＢＰ）についても、全合成されたＦＴＨ−Ｄ−ＴＢＰ遺伝子をコードするＤＮＡを鋳型として、ＦＴＨ−ＢＣ−ＴＢＰと同じプライマーと反応系を用いて構築した。
続いて、構築したｐＥＴ２０−ＦＴＨ−ＢＣ−ＴＢＰを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ−ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３７℃で２４時間フラスコ培養した。得られた菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、目的タンパク質を分離精製した。そのタンパク質を含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０−１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによってＦＴＨ−ＢＣ−ＴＢＰを分離精製した。ＦＴＨ−Ｄ−ＴＢＰも同様にＥ．ｃｏｌｉにて発現させ、精製した。
得られたフェリチンの粒径と溶液分散性は、ゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社）を用いた動的光散乱法（ＤＬＳ）によって評価した。図１−１および１−２に示すようにＦＴＨ−ＢＣ−ＴＢＰとＦＴＨ−Ｄ−ＴＢＰは、共に平均直径が１２ｎｍ前後の単分散を示し、２４量体の高次構造を形成し、その２４量体同士は凝集していないことが分かった。
＜実施例２：多機能性フェリチンの活性評価（１）＞
２種類のフェリチン変異体ＦＴＨ−ＢＣ−ＴＢＰとＦＴＨ−Ｄ−ＴＢＰのチタン成膜に対する吸着性を水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）法により評価した。
はじめに、チタン成膜センサーセル（ＱＣＭＳＣ−ＴＩ、イニシアム社）のチタン成膜表面にピラニア液（濃硫酸と過酸化水素水が３対１で混合した溶液）２μｌを載せ、５分間放置した後、水５００μｌで５回洗浄した。その洗浄を計２回繰り返すことで、チタン成膜表面の有機物を除去した。続いて、そのチタン成膜センサーセルをＡＦＦＩＮＩＸ ＱＮμ（イニシアム社）にセットし、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を４９０μｌあるいは４９５μｌを載せた。その後、測定温度２５℃、回転数１０００ｒｐｍで撹拌しながら、３０分程度放置し、センサーから出力される値を安定化させた。各測定は、液中のフェリチン濃度が終濃度１．９ｎＭとなるようにチタン成膜センサーセル上の緩衝液に１００ｍｇ／Ｌに調製された各フェリチン変異体溶液を各々投入した。評価に用いたフェリチン溶液の濃度はプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）を用いて、ウシアルブミンを標準として決定した。測定は、フェリチン２４量体の分子量として５２９ｋＤａ、反応温度２５℃、撹拌回転数１０００ｒｐｍ、周波数２７ＭＨｚ、測定間隔５秒で行い、チタン成膜表面への吸着量をＱＣＭの周波数変化で評価した。
その結果、ＦＴＨ−ＢＣ−ＴＢＰあるいはＦＴＨ−Ｄ−ＴＢＰを含む緩衝液の投入によるＱＣＭの周波数変化を確認することができ、これらのフェリチン変異体はチタン成膜への吸着性を発現していることが分かった（図２）。
続いて、同様の条件で液中のフェリチン濃度が終濃度０．２ｎＭから５．６ｎＭとなるようにチタン成膜センサーセル上の緩衝液に１００ｍｇ／Ｌに調製された各フェリチン変異体溶液を各々投入し、周波数変化を測定した。そして、各濃度の逆数と周波数変化の逆数との相関関係をプロットし、その傾きから解離平衡定数ＫＤ値を求めた。
その結果、ＦＴＨ−ＢＣ−ＴＢＰのＫＤ値は０．９７ｎＭであり、ＦＴＨ−Ｄ−ＴＢＰのＫＤ値３．７７ｎＭの１／４程度の低さであった（図３）。この差を共分散分析したところ、有意確率ｐ値が１％以下での有意差を確認できた。すなわち、フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域にチタン認識ペプチドを提示したフェリチンは、４番目と５番目の間にペプチドを提示したフェリチンよりも、標的材料に対する吸着性能が高いことが示された。
＜実施例３：多機能性フェリチンの構築（２）＞
フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー部に癌認識ＲＧＤペプチド（ＡＳＤＲＧＤＦＳＧ（配列番号１４））が挿入融合され、Ｃ末端にシステインが追加されたヒト由来フェリチンＨ鎖（ＦＨＢｃ（配列番号１５および１６））の遺伝子を全合成した。全合成された遺伝子を鋳型として、５’−ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＴＣＧ−３’（配列番号１７）および５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧ−３’（配列番号１８）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型として、５’−ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ−３’（配列番号１２）および５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号１３）をプライマーとしてＰＣＲを行った。各々得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＤｐｎＩとＢａｍＨＩ、ＮｄｅＩで消化し、ライゲーションすることで、ＦＨＢｃをコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＦＨＢｃ）を構築した。
続いて、構築したｐＥＴ２０−ＦＨＢｃを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ−ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３７℃で２４時間フラスコ培養した。得られた菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、目的タンパク質を分離精製した。そのタンパク質を含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０−１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによってＦＨＢｃを分離精製した。
＜実施例４：多機能性フェリチンの高次構造確認（１）＞
得られたＦＨＢｃが自己組織化によりカゴ状形状を示すことは、図４に示すように、３％りんタングステン酸染色による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像によって確認した。この時のＦＴＢｃの直径は１２ｎｍであり、天然型ヒトフェリチンと同じサイズであり、２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域にペプチドが挿入された場合でもカゴ状を形成でき、タンパク質の高次構造が大きく損なわれないこと分かった。
続いて、ＦＨＢｃがフェリチンとしての機能を有し、内部に空孔を維持していることを示すために、各フェリチンの内腔での酸化鉄ナノ粒子の形成を試みた。
ＦＴＢｃを含むＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．５ｍｇ／ｍＬ ＦＴＢｃ、３００ｍＭ ＮａＣｌそして１ｍＭ 硫酸アンモニウム鉄を各々終濃度で含む）を１０ｍＬ調製し、４℃で３０分間放置すると溶液がオレンジ色に変化し、フェリチン内部に酸化鉄ナノ粒子が形成されたことが示唆された。冷蔵放置後、遠心分離（６，５００ｒｐｍ、１５分間）し、上清を回収した後、溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０−１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、酸化鉄ナノ粒子を封入したＦＨＢｃを分離精製した。
得られたナノ粒子封入フェリチンの粒径と溶液分散性を、ゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社）を用いた動的光散乱法（ＤＬＳ）によって評価した。図５に示すように酸化鉄ナノ粒子を封入したＦＨＢｃは、平均直径も１６ｎｍ以下の単分散を示し、凝集していないことが分かった。
＜実施例５：多機能性フェリチンの構築（３）＞
フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に金認識ペプチド（ＧＢＰ１：ＭＨＧＫＴＱＡＴＳＧＴＩＱＳ（配列番号１９））が挿入融合されたヒト由来フェリチンＨ鎖（ＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰ（配列番号２０および２１））をコードするＤＮＡを全合成した。全合成されたＤＮＡを鋳型として、５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＴＣＧ−３’（配列番号１０）および５’−ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧＴＣ−３’（配列番号１１）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型として、５’−ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ−３’（配列番号１２）および５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号１３）をプライマーとしてＰＣＲを行った。各々得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）で、５０℃、１５分間のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ酵素処理することで、合成遺伝子が搭載された発現プラスミドを構築した。このプラスミドに搭載された合成遺伝子の核酸配列を確認したところ、金認識ペプチドＧＢＰ１のアミノ酸配列先頭のメチオニンが欠落していた。このメチオニンの欠落を修正するために、構築されたプラスミドを鋳型ＤＮＡ、５’−ＡＴＧＣＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＣＡＧＧＣＧＡＣＣＡＧ−３’（配列番号２２）および５’−ＡＣＣＣＴＴＧＡＴＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡ−３’（配列番号２３）をプライマーとしてＰＣＲを行った。続いて、得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社）で、３７℃、３０分間で放置し、ＰＣＲ産物の５’末端をリン酸化した。そのＤＮＡをセルフライゲーションすることで、ＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰが搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰ）を構築した。
また、フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて４番目と５番目の間に金認識ペプチド（ＧＢＰ１）が挿入融合されたヒト由来フェリチンＨ鎖（ＦＴＨ−Ｄ−ＧＢＰ（配列番号２５２および２５３））をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＦＴＨ−Ｄ−ＧＢＰ）についても、全合成されたＦＴＨ−Ｄ−ＧＢＰ遺伝子をコードするＤＮＡを鋳型として、ＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰと同じプライマーと反応系を用いて構築した。この金認識ペプチドＧＢＰ１のアミノ酸配列先頭のメチオニンが欠落していたため、ＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰの場合と同様に、５’−ＡＴＧＣＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＣＡＧＧＣＧＡＣＣＡＧ−３’（配列番号２２）と５’−ＡＴＧＴＧＴＣＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号２５４）をプライマーしたＰＣＲとＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ処理により、ＦＴＨ−Ｄ−ＧＢＰが搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＦＴＨ−Ｄ−ＧＢＰ）を構築した。
続いて、構築したｐＥＴ２０−ＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ−ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３７℃で２４時間フラスコ培養した。得られた菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、目的タンパク質を分離精製した。そのタンパク質を含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０−１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによってＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰを分離精製した。ＦＴＨ−Ｄ−ＧＢＰも同様にＥ．ｃｏｌｉにて発現させ、精製した。
得られたフェリチンの粒径と溶液分散性は、ゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社）を用いた動的光散乱法（ＤＬＳ）によって評価した。図６−１および６−２に示すようにＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰとＦＴＨ−Ｄ−ＧＢＰは、平均直径が１２ｎｍ前後の単分散を示し、２４量体の高次構造を形成し、その２４量体同士は凝集していないことが分かった。
＜実施例６：多機能性フェリチンの活性評価（２）＞
２種類のフェリチン変異体ＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰとＦＴＨ−Ｄ−ＧＢＰの金薄膜に対する吸着性を水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）法により評価した。
はじめに、金成膜センサーセル（ＱＣＭＳＣ−ＡＵ、イニシアム社）の金成膜表面にピラニア液（濃硫酸と過酸化水素水が３対１で混合した溶液）２μｌを載せ、５分間放置した後、水５００μｌで５回洗浄した。その洗浄を計２回繰り返すことで、金成膜表面の有機物を除去した。続いて、その金成膜センサーセルをＡＦＦＩＮＩＸ ＱＮμ（イニシアム社）にセットし、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を４９０μｌあるいは４９５μｌを載せた。その後、測定温度２５℃、回転数１０００ｒｐｍで撹拌しながら、３０分程度放置し、センサーから出力される値を安定化させた。続いて、液中のフェリチン濃度が終濃度０．３ｎＭから５．４ｎＭとなるように金成膜センサーセル上の緩衝液に１００ｍｇ／Ｌに調製された各フェリチン変異体溶液を各々投入し、周波数変化を測定した。評価に用いたフェリチン溶液の濃度はプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）を用いて、ウシアルブミンを標準として決定した。測定は、フェリチン２４量体の分子量として５４６ｋＤａ、ＱＣＭの周波数２７ＭＨｚ、測定間隔５秒で行い、金成膜表面への吸着量を周波数変化で評価した。そして、各濃度の逆数と周波数変化の逆数との相関関係をプロットし、その傾きから解離平衡定数ＫＤ値を求めた。
その結果、ＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰのＫＤ値は０．４２ｎＭであり、ＦＴＨ−Ｄ−ＧＢＰのＫＤ値３．１０ｎＭの１／７程度の低さであった（図７）。この差を共分散分析したところ、有意確率ｐ値が１％以下での有意差を確認できた。すなわち、Ｈ鎖フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に金認識ペプチドを提示したフェリチンは、４番目と５番目にペプチドを提示したフェリチンよりも、標的材料に対する吸着性能が高いことが示された。
＜実施例７：多機能性フェリチンの構築（４）＞
フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に金認識ペプチド（ＧＢＰ１：ＭＨＧＫＴＱＡＴＳＧＴＩＱＳ（配列番号１９））が挿入融合されたヒト由来フェリチンＬ鎖（ＦＴＬ−ＢＣ−ＧＢＰ（配列番号２４および２５）、図８）をコードするＤＮＡを全合成した。全合成されたＤＮＡを鋳型として、５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＴＣＧＴＣＡＧ−３’（配列番号２６）および５’−ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧ−３’（配列番号２７）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型として、５’−ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ−３’（配列番号１２）および５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号１３）をプライマーとしてＰＣＲを行った。各々得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）で、５０℃、１５分間のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ酵素処理することで、合成遺伝子が搭載された発現プラスミドを構築した。このプラスミドに搭載された合成遺伝子の核酸配列を確認したところ、金認識ペプチドＧＢＰ１のアミノ酸配列先頭のメチオニンが欠落していた。このメチオニンの欠落を修正するために、構築されたプラスミドを鋳型ＤＮＡ、５’−ＡＴＧＣＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＣＡＧＧＣＧＡＣＣＡＧ−３’（配列番号２２）および５’−ＡＣＣＣＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡ−３’（配列番号２８）をプライマーとしてＰＣＲを行った。続いて、得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社）で、３７℃、３０分間で放置し、ＰＣＲ産物の５’末端をリン酸化した。そのＤＮＡをセルフライゲーションすることで、ＦＴＬ−ＢＣ−ＧＢＰが搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＦＴＬ−ＢＣ−ＧＢＰ）を構築した。
また、フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて５番目と６番目の間のフレキシブルリンカー領域に金認識ペプチド（ＧＢＰ１）が挿入融合されたヒト由来フェリチンＬ鎖（ＦＴＬ−ＤＥ−ＧＢＰ（配列番号２９および３０）、図９）をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＦＴＬ−ＤＥ−ＧＢＰ）についても、全合成されたＦＴＬ−ＤＥ−ＧＢＰ遺伝子をコードするＤＮＡを鋳型として、ＦＴＬ−ＢＣ−ＧＢＰと同じプライマーと反応系を用いて構築した。この金認識ペプチドＧＢＰ１のアミノ酸配列先頭のメチオニンが欠落していたため、ＦＴＬ−ＢＣ−ＧＢＰの場合と同様に、５’−ＡＴＧＣＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＣＡＧＧＣＧＡＣＣＡＧ−３’（配列番号２２）と５’−ＣＡＴＡＣＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＡＧＧＴ−３’（配列番号３１）をプライマーしたＰＣＲとＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ処理により、ＦＴＬ−ＤＥ−ＧＢＰが搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＦＴＬ−ＤＥ−ＧＢＰ）を構築した。
続いて、構築したｐＥＴ２０−ＦＴＬ−ＢＣ−ＧＢＰを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ−ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３０℃で２４時間フラスコ培養した。得られた菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、目的タンパク質を分離精製した。そのタンパク質を含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０−１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによってＦＴＬ−ＢＣ−ＧＢＰを分離精製した。ＦＴＬ−ＤＥ−ＧＢＰも同様にＥ．ｃｏｌｉにて発現させ、精製した。
＜実施例８：多機能性フェリチンの活性評価（３）＞
２種類のフェリチン変異体ＦＴＬ−ＢＣ−ＧＢＰとＦＴＬ−ＤＥ−ＧＢＰの金薄膜に対する吸着性を水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）法により各々評価した。
はじめに、金成膜センサーセル（ＱＣＭＳＣ−ＡＵ、イニシアム社）の金成膜表面にピラニア液（濃硫酸と過酸化水素水が３対１で混合した溶液）２μｌを載せ、５分間放置した後、水５００μｌで５回洗浄した。その洗浄を計２回繰り返すことで、金成膜表面の有機物を除去した。続いて、その金成膜センサーセルをＡＦＦＩＮＩＸ ＱＮμ（イニシアム社）にセットし、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を４９０μｌあるいは４９５μｌを載せた。その後、測定温度２５℃、回転数１０００ｒｐｍで撹拌しながら、３０分程度放置し、センサーから出力される値を安定化させた。各測定は、液中のフェリチン濃度が終濃度０．２ｎＭから４．９ｎＭとなるように金成膜センサーセル上の緩衝液に１００ｍｇ／Ｌに調製された各フェリチン変異体溶液を各々投入し、周波数変化を測定した。評価に用いたフェリチン溶液の濃度はプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）を用いて、ウシアルブミンを標準として決定した。測定は、フェリチン２４量体の分子量として５１８ｋＤａ、ＱＣＭの周波数２７ＭＨｚ、測定間隔５秒で行い、金成膜表面への吸着量を周波数変化で評価した。そして、各濃度の逆数と周波数変化の逆数との相関関係をプロットし、その傾きから解離平衡定数ＫＤ値を求めた。
その結果、ＦＴＬ−ＢＣ−ＧＢＰのＫＤ値は１．１５ｎＭであり、ＦＴＬ−ＤＥ−ＧＢＰのＫＤ値１．６８ｎＭの７０％の低さであった（図１０）。この差を共分散分析したところ、有意確率ｐ値が５％以下での有意差を確認できた。すなわち、Ｌ鎖フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に金認識ペプチドを提示したフェリチンは、５番目と６番目の間のフレキシブルリンカー領域にペプチドを提示したフェリチンよりも、標的材料に対する吸着性能が高いことが示された。
以上の結果から、α−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に挿入されたペプチドはヒトフェリチンのＨ鎖とＬ鎖の両方で非常に効果的であることがわかった。
＜実施例９：多機能性微生物由来フェリチン（Ｄｐｓ）の構築＞
微生物の持つフェリチンのホモログタンパク質のＤｐｓは、フェリチンと類似構造を持つ単量体が１２個集まって、フェリチンよりも一回り小さい外径９ｎｍ、内径４．５ｎｍのかご状を形成する。フェリチンとＤｐｓの単量体の立体構造は非常によく似ているが、フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域にあたるＤｐｓのフレキシブルリンカー領域には７アミノ酸からなる小さなα−ヘリックスが形成されていることが知られている（Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｓｃｉ． ２０１１； １２（８）： ５４０６−５４２１.）。そこで、フェリチンと同等の領域とＣ末端に異種ペプチド（ＱＶＮＧＬＧＥＲＳＱＱＭ（配列番号３２））が挿入されたＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ由来のＤｐｓ（ＢＣＤｐｓ−ＣＳ４、配列番号３３および３４）の構築を行った。
はじめに、ＢＣＤｐｓ−ＣＳ４の遺伝子の一部を全合成した。全合成された遺伝子を鋳型として、５’−ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＣＡＧＴＡＧ−３’（配列番号３５）および５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡＣＴＣＣＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＡＴＴＣＡＣＣＴＧＴＴＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＧ−３’（配列番号３６）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型として、５’−ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ−３’（配列番号１２）および５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号１３）をプライマーとしてＰＣＲを行った。各々得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＤｐｎＩとＢａｍＨＩ、ＮｄｅＩで消化し、ライゲーションすることで、ＢＣＤｐｓ−ＣＳ４をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＢＣＤｐｓ−ＣＳ４）を構築した。
続いて、構築したｐＥＴ２０−ＢＣＤｐｓ−ＣＳ４を導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ−ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３７℃で２４時間フラスコ培養した。得られた菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、目的タンパク質を分離精製した。そのタンパク質を含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０−１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによってＢＣＤｐｓ−ＣＳ４を分離精製した。
＜実施例１０：多機能性Ｄｐｓの高次構造確認＞
得られたＢＣＤｐｓ−ＣＳ４が自己組織化によりカゴ状形状を示すことは、図１１に示すように、３％りんタングステン酸染色による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像によって確認した。この時のＢＣＤｐｓ−ＣＳ４の直径は９ｎｍであり、天然型Ｄｐｓと同じサイズであった。このことから、ヒトフェリチンの２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域にあたる部位にペプチドが挿入された場合でもＤｐｓは、天然と同等のカゴ状構造を形成でき、タンパク質の高次構造が大きく損なわれないこと分かった。
＜実施例１１：多機能性フェリチンの構築（５）＞
フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて５番目と６番目の間のフレキシブルリンカー領域に金認識ペプチド（ＧＢＰ１：ＭＨＧＫＴＱＡＴＳＧＴＩＱＳ（配列番号１９））が挿入融合されたヒト由来フェリチンＨ鎖（ＦＴＨ−ＤＥ−ＧＢＰ（配列番号２５５および２５６））をコードするＤＮＡを全合成した。全合成されたＤＮＡを鋳型として、５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＴＣＧ−３’（配列番号１０）および５’−ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧＴＣ−３’（配列番号１１）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型として、５’−ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ−３’（配列番号１２）および５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号１３）をプライマーとしてＰＣＲを行った。各々得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）で、５０℃、１５分間のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ酵素処理することで、多機能性フェリチンの構築ＦＴＨ−ＤＥ−ＧＢＰが搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＦＴＨ−ＤＥ−ＧＢＰ）を構築した。
続いて、構築したｐＥＴ２０−ＦＴＨ−ＤＥ−ＧＢＰを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ−ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３７℃で２４時間フラスコ培養した。得られた菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、目的タンパク質を分離精製した。そのタンパク質を含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０−１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによってＦＴＨ−ＤＥ−ＧＢＰを分離精製した。
＜実施例１２：多機能性フェリチンの活性評価（４）＞
２種類のフェリチン変異体ＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰとＦＴＨ−ＤＥ−ＧＢＰの金薄膜に対する吸着性を水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）法により評価した。
はじめに、金成膜センサーセル（ＱＣＭＳＣ−ＡＵ、イニシアム社）の金成膜表面にピラニア液（濃硫酸と過酸化水素水が３対１で混合した溶液）２μｌを載せ、５分間放置した後、水５００μｌで５回洗浄した。その洗浄を計２回繰り返すことで、金成膜表面の有機物を除去した。続いて、その金成膜センサーセルをＡＦＦＩＮＩＸ ＱＮμ（イニシアム社）にセットし、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を４９０μｌあるいは４９５μｌを載せた。その後、測定温度２５℃、回転数１０００ｒｐｍで撹拌しながら、３０分程度放置し、センサーから出力される値を安定化させた。続いて、液中のフェリチン濃度が終濃度０．２ｎＭから２．６ｎＭとなるように金成膜センサーセル上の緩衝液に１００ｍｇ／Ｌに調製された各フェリチン変異体溶液を各々投入し、周波数変化を測定した。評価に用いたフェリチン溶液の濃度はプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）を用いて、ウシアルブミンを標準として決定した。測定は、フェリチン２４量体の分子量として５４６ｋＤａ、ＱＣＭの周波数２７ＭＨｚ、測定間隔５秒で行い、金成膜表面への吸着量を周波数変化で評価した。そして、各濃度の逆数と周波数変化の逆数との相関関係をプロットし、その傾きから解離平衡定数ＫＤ値を求めた。
その結果、ＦＴＨ−ＤＥ−ＧＢＰのＫＤ値は１．９０ｎＭであり、実施例６で測定されたＦＴＨ−ＢＣ−ＧＢＰのＫＤ値の０．４２ｎＭの１／５程度の低さであった（図１２）。この差を共分散分析したところ、有意確率ｐ値が５％以下での有意差を確認できた。すなわち、Ｈ鎖フェリチン単量体を構成する６つのα−ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に金認識ペプチドを提示したフェリチンは、５番目と６番目にペプチドを提示したフェリチンよりも、標的材料に対する吸着性能が高いことが示された。
本発明の多量体は、新規薬物送達系（ＤＤＳ）、電子デバイスの作製等の用途に有望である。例えば、本発明の多量体を構成する融合タンパク質におけるフェリチン単量体がヒトフェリチン単量体である場合、本発明の多量体は、ＤＤＳとして有用である。また、ヒトフェリチン単量体がヒトに対する抗原性および免疫原性を有しないことに照らすと、本発明の多量体は、臨床応用において安全性に優れるという利点も有する。一方、このフェリチン単量体が微生物フェリチンである場合、本発明の多量体は、電子デバイスの作製に有用である。
本発明の融合タンパク質は、例えば、本発明の多量体の調製に有用である。
本発明の複合体は、例えば、新規薬物送達系（ＤＤＳ）の研究および開発、電子デバイスの作製等の用途に有用である。
本発明のポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞は、本発明の融合タンパク質を容易に調製することを可能にする。したがって、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞は、例えば、本発明の多量体の調製に有用である。

Claims (17)

  1. （ａ）フェリチン単量体、および（ｂ）フェリチン単量体におけるＢ領域およびＣ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域中に挿入された機能性ペプチドを含む、融合タンパク質。
  2. フェリチン単量体がヒトフェリチン単量体である、請求項１記載の融合タンパク質。
  3. ヒトフェリチン単量体がヒトフェリチンＨ鎖である、請求項１または２記載の融合タンパク質。
  4. ヒトフェリチン単量体がヒトフェリチンＬ鎖である、請求項１または２記載の融合タンパク質。
  5. フェリチン単量体がＤｐｓ単量体である、請求項１記載の融合タンパク質。
  6. 機能性ペプチドが、標的材料に対する結合能を有するペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  7. 標的材料が無機物である、請求項６記載の融合タンパク質。
  8. 無機物が金属材料である、請求項７記載の融合タンパク質。
  9. 標的材料が有機物である、請求項６記載の融合タンパク質。
  10. 有機物が生体有機分子である、請求項９記載の融合タンパク質。
  11. 生体有機分子がタンパク質である、請求項１０記載の融合タンパク質。
  12. システイン残基、またはシステイン残基含有ペプチドが、融合タンパク質のＣ末端に付加されている、請求項１〜１１のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  13. （ａ）フェリチン単量体、および（ｂ）フェリチン単量体におけるＢ領域およびＣ領域のα−ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域中に挿入された機能性ペプチドを含む融合タンパク質から構成されており、かつ
    内腔を有する、多量体。
  14. （１）請求項１３記載の多量体、および（２）標的材料を含み、
    標的材料が、前記融合タンパク質中の機能性ペプチドに結合している、複合体。
  15. 請求項１〜１２のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  16. 請求項１５記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  17. 請求項１５記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
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