KR20060120612A - 키메라 ｇａｂａｂ 수용체 - Google Patents

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카린 알폰신 아스트리드 스만스
헨리쿠스 야코부스 마리아 기즈센
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얀센 파마슈티카 엔.브이.
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Abstract

본 발명은 GABAB 수용체가 고친화성의 작용제 결합 부위 1개 및 저친화성 작용제 결합 부위 1개를 갖는 것을 특징으로 하는, 적어도 하나의 GABABR1a 서브유니트 및 적어도 하나의 GABABR2 서브유니트를 포함하는 분리된 GABAB 수용체 단백질을 제공한다. 특히, 수탁 번호 LMBP 6046CB로, 2003년 8월 22일에 CHO-K1 h-GABA-b R1a/R2 클론으로서 벨기안 코디네이티드 콜렉션 오브 마이크로오가니즘(BCCM)에 기탁된 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주에 의해 발현된 분리된 재조합 GABAB 수용체 단백질. 본 발명의 목적은 수탁 번호 LMBP 6046CB로, 2003년 8월 22일에 CHO-K1 h-GABA-b R1a/R2 클론으로서 벨기안 코디네이티드 콜렉션 오브 마이크로오가니즘(BCCM)에 기탁된 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주를 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 기능 또는 결합 에세이를 사용하여 GABAB 수용체 작용제를 확인하는 방법에서 상기 언급된 세포주의 용도를 제공하는 것이다.

Description

키메라 ＧＡＢＡＢ 수용체{CHIMERIC GABAB RECEPTOR}
본 발명은 재조합 GABABR1a/R2 수용체 발현 세포에서 3H-GABA 결합 에세이를 사용하여 GABAB 수용체의 작용제인 물질을 확인하는 신규한 방법을 제공한다.
GABA(γ-아미노-부티르산)은 2개의 상이한 수용체 패밀리; 고속의 시냅스전달에 대한 이온지향성 GABAA 및 GABAc 수용체, 및 저속의 시냅스전달을 조절하는 대사성 GABAB 수용체를 활성화시키는, 중추 신경계(CNS)내에 가장 광범위하게 분포하는 아미노산 저해 신경전달물질이다.
GABAB 수용체는 신경세포 K+ 또는 Ca+2과 커플링된 7개의 막 G-단백질 커플링 수용체 슈퍼패밀리 멤버이다. 시냅스전 GABAB 수용체 활성화는 일반적으로 Ca+2 전도도를 저해시켜 신경전달물질의 유발된 방출을 감소시키는 것으로 보고되었다. 시냅스 후 GABAB 수용체 활성화의 주요 작용은 칼륨 채널을 열고, 이로써 시냅스 후 저해능을 형성한다.
GABAB 수용체의 발현은 포유동물의 신경세포 축에 광범위하게 분포하고, 특히, 소뇌, 다리사이핵, 전두피질, 후각핵, 시상핵, 측두핵, 큰솔기 및 척수 분자층에 고수준으로 존재한다. GABAB 수용체는 또한 감각신경 및 부교감신경상 모두의 말초 신경계에 존재한다. 이들 신경을 조절하는 능력은 폐, GI관 및 방광의 질환에서 표적으로서의 잠재력을 제공한다(Belley et al. , 1999,Biorg. Med. Chem. 7:2697-2704).
다수의 약물학적 활성은 GABAB 수용체 활성화, 예로서, 진통, 체온저하, 긴장증, 저혈압, 기억의 응고화 감퇴 및 정체, 및 인슐린, 성장 호르몬 및 글루카곤 방출 자극 때문이다(참조, Bowery,1989, Trends Pharmacol. Sci. 10: 401-407 for a review). GABAB 수용체 작용제 및 길항제는 근강직증후군, 위식도역류, 신경병, 실금과 같은 징후, 및 기침 및 코카인 중독 치료에 약물학적으로 유용하다고 인정받았다. 예를 들면, GABAB 수용체 작용제 바클로펜은 일과성 하부식도괄약근이완(TLESR)을 저하시키는 것으로 나타났고, 이로써, TLESR동안 대부분의 역류 에피소드 발생시 역류 치료에 유용하다. 그러나, 현 GABAB 수용체 작용제, 예로서 바클로펜은 상대적으로 비특이성이고 예로서 진정 및 호흡 억제와 같이 다양하고 바람직하지 못한 행동 작용을 나타낸다. 특이성이 개선되고 상기 언급한 바람직하지 못한 효과는 감소된 더 많은 GABAB 수용체 작용제를 개발하는 것이 바람직할 수 있다.
현재의 약물 검색 방법은 일반적으로 특정 표적에 대한 원하는 활성을 갖는 소수의 화합물을 확인하기 위하여 10만 또는 100만개의 화합물의 생물학적 활성을 평가하는 것, 즉, 고효율 검색(HTS)를 포함한다. 통상의 HTS 관련 검색 포맷에서, 에세이는 소스 물질(즉, 재조합 GABAB 수용체를 발현시키는 세포의 막 시료)의 유용성을 포함하는, 실시하고자 하는 에세이의 셋업을 특별히 제한하면서 다중-웰 마이크로플레이트, 예로서 96,384 또는 1536개의 웰 플레이트에서 수행된다. HTS 관련 스크린은 바람직하게, 단기간의 사이클 시간을 필요로 하고, 재현성 및 실시가능성 결과를 갖는, 에세이에서 시험되는 각 화합물에 대한 단일 측정법을 사용하여 실온에서 수행된다.
GABAB 수용체의 작용제로서 화합물을 확인하는 현 시험관내 선별법은 자연발생된, 덜 풍부한 리소스, 예로서 래트 뇌 막에서의 결합 에세이에 의존하고, 기능성 선별 에세이, 예로서, Ca2+ 반응, c-AMP 반응 및 재조합 GABAB 수용체를 발현시키는 세포에서 수행되는 Ca2+ 및 K+ 채널에 대한 효능으로 구성된다. 몇몇 기능성 에세이에서 GABAB 수용체는 G-단백질 커플링을 증가시키면서 G-단백질, 예로서, Gα16 또는 Gqi5, 또는 키메라 G-단백질 Gαq-z5로 공-형질감염시킬 수 있다(Brauner-Osborne & Krogsgaard-Larsen, 1999, Br. J. Pharmacol. 128: 1370-1374). 그러나, 추가로 HTS 사이클 시간을 단축시키고, 생화학물질 예로서, 재조합 단백질의 리소스를 감소시키는 GABAB 작용제 결합 에세이는 현재 이용할 수 있다.
본 발명은 인간 GABAB 수용체 서브유니트 GABABR1a 및 GABABR2를 공-발현시키는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주의 개발을 기술하고, 놀랍게도 이로써, 방사능리간드 결합 실험에서 작용제 결합을 입증할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.추가로, 본 발명자는 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주는 발현된 재조합 GABAB 수용체에서 고친화성의 작용제 결합 부위 1개 및 저친화성 작용제 결합 부위 1개를 갖는다. 따라서, 본 발명에 의해 제공되는 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주는 화합물 선별을 가능케 할뿐만 아니라, 화합물-수용체 상호작용 성질의 특징화에 대한 유용한 도구를 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 GABAB 수용체가 고친화성의 작용제 결합 부위 1개 및 저친화성 작용제 결합 부위 1개를 갖는 것을 특징으로 하는, 적어도 하나의 GABABR1a 서브유니트 및 적어도 하나의 GABABR2 서브유니트를 포함하는 분리된 GABAB 수용체 단백질을 제공한다. 특히, hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주에 의해 발현된 분리된 재조합 GABAB 수용체 단백질을 수탁 번호 LMBP 6046CB로, 2003년 8월 22일에 CHO-K1 h-GABA-b R1a/R2 클론으로서 벨전 코디네이티드 콜렉션 오브 마이크로오거니즘(BCCM)에 기탁하였다. 따라서, 본 발명의 목적은 수탁 번호 LMBP 6046CB로, 2003년 8월 22일에 CHO-K1 h-GABA-b R1a/R2 클론으로서 벨전 코디네이티드 콜렉션 오브 마이크로오거 니즘(BCCM)에 기탁된 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 기능성 또는 결합 에세이를 사용하여 GABAB 수용체 작용제를 확인하는 방법에서 상기 언급된 세포주의 용도를 제공하는 것이다. 특히, 방사능리간드-결합 에세이에서 방사능표지된 작용제 예로서, 3H-GABA 또는 3H-바클로펜의 사용을 포함한다.
본 발명은 추가로 시험 화합물을 상기 언급된 세포주와 접촉시키고, 시험 화합물과 GABAB 수용체의 결합을 측정하는 것을 포함하는 GABAB 수용체 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 특히, 상기 방법은 시험 화합물의 존재 및 부재하에 표지된 GABAB 작용제에 상기 언급된 세포를 노출시키고, 본 발명에 따른 세포와 표지된 리간드의 결합을 측정하여, 시험 화합물의 존재하에서 표지된 리간드의 결합량이 더 적을 경우, 화합물은 GABAB 수용체의 효능이 있는 작용제인 것으로 결정하는 방사능리간드 결합 에세이로 구성된다.
본 발명의 목적은 시험 화합물의 존재 및 부재하에 상기 언급된 세포를 GABA, 바클로펜 및 3-아미노프로필포스핀산 (3-APPA 소위 APMPA)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방사능 표지된 작용제와 접촉시키고 본 발명에 따른 세포와 표지된 리간드의 결합을 측정하여, 시험 화합물의 존재하에서 고친화성 결합 부위와의 표지된 리간드의 결합량이 더 적을 경우, 화합물은 GABAB 수용체의 효능이 있는 고 친화성 작용제인 것으로 결정하는 것을 포함하는, 고친화성 GABAB 수용체 작용제를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
다르게는, 상기 언급된 결합 에세이는 세포 추출물, 특히 수탁 번호 LMBP 6046CB로, 2003년 8월 22일에 CHO-K1 h-GABA-b R1a/R2 클론으로서 벨전 코디네이티드 콜렉션 오브 마이크로오거니즘(BCCM)에 기탁된 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주상에서 수행된다.
또다른 일면에서 본 발명은 시험하고자 하는 화합물과 상기 언급된 세포주를 접촉시키고, 화합물이 세포에서 GABAB 수용체 작용 반응을 활성화시키는지 여부를 결정하는 것을 포함하는, GABAB 수용체 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 특히, 작용 반응은 이하 설명하는 바, 세포내 메신저 또는 이온 채널 활성 조절로 구성된다.
본 발명의 본 일면 및 추가의 일면은 이하 더욱 상세히 설명될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 양성 알로스테릭 조절제 CGP7930 > 의 존재 및 부재하의 최대 GABA 자극의 퍼센트로서 표시되는 GABA에 의한 막 자극시의 GTPγ35S-결합.
도 2는 작용제(바클로펜, GABA & APMPA) 및 길항제 (SCH50911 & CGP54626)에 의한 3H-GABA의 대체.
도 3은 막 시료와 독립적인 재현가능한 IC50 값(n=5).
도 4는 10μM CGP54626 (a) 또는 JNJ 4309747-AAD (b)의 존재 또는 부재하의 2 사이드 3H-GABA 작용제 결합 곡선.
본 발명을 설명하기 위한 목적으로: 본 명세서에서 사용되는 바, GABABR1a 또는 h GABABR1a는 [Kaupmann et al, 1998,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14991-14996]에서 GABABR1a로서 공지된 인간 GABAB 수용체 서브유니트, 및 그의 포유동물의 오르토로그(orthologs)를 언급하고, 그의 아미노산 서열(서열번호: 2)은 GenBank Accession no. AJ225028에서 찾아볼 수 있다. GABABR1a는 또한 아미노산 서열상에 있어 상기 기술된 것과 최소한의 변형을 갖되, 단, 다른 GABAB 수용체 서브유니트는 상기 기술된 서브유니트와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는, 다른 GABAB 수용체 서브유니트를 언급한다. GABABR1a 서브유니트는 서열번호: 2와 적어도 80%가 일치하는, 바람직하게 적어도 95%가 일치하는, 더욱 바람직하게 적어도 97%가 일치하는, 및 가장 바람직하게 적어도 99%가 일치하는 아미노산 서열을 갖는다면 상기는 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖고, GABA, GABAB 수용체 작용제, 예로서 바클로펜 및 가바펜틴, 또는 GABAB 수용체 길항제, 예로서 CGP54626A, SCH 50911, 사클로펜 및 파클로펜에 대하여 Kd 또는 EC50이 GABA 또는 동일한 GABAB 수용체 작용제 또는 GABAB 수용체 길항제에 대한 선천 GABAB 수용체의 Kd 또는 EC50보다 5배 이하로 우수한 Kd 또는 EC50를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바, GABABR2는 [White et al. , 1998, Nature 396: 679-682]에 공지된 바와 같은, 인간 GABAB 수용체 서브유니트, 및 그의 포유동물의 오르토로그를 언급하고, 그의 아미노산 서열(서열번호: 4)을 GenBank accession no. AF058795에서 찾아볼 수 있다. GABABR2는 또한 아미노산 서열에서 상기 기술된 것과 최소한의 변형을 갖되, 단, 상기 기술된 서브유니트와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 다른 GABAB 수용체 서브유니트를 언급한다. GABABR2 서브유니트는 서열번호: 4와 적어도 80%가 일치하는, 바람직하게 적어도 95%가 일치하는, 더욱 바람직하게 적어도 97%가 일치하는, 및 가장 바람직하게 적어도 99%가 일치하는 아미노산 서열을 갖는다면 상기는 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖고, GABABR1 서브유니트와 함께, GABA, GABAB 수용체 작용제 예로서 바클로펜 및 가바펜틴 또는 GABAB 수용체 길항제 예로서 CGP54626A, SCH 50911, 사클로펜 및 파클로펜에 대한 Kd 또는 EC50이 GABA 또는 동일한 GABAB 수용체 작용제 또는 GABAB 수용체 길항제에 대한 선천 GABAB 수용체의 Kd 또는 EC50보다 5배 이하로 우수한 Kd 또는 EC50를 갖는다.
선천 GABAB 수용체의 Kd 및 EC50 값은 본 분야의 기술자에 공지된 방법, 특히, [Cross & Horton, 1987 Eur. J. Pharmacol. 141 (1) :159-162]에 기술된 조직 시료에 대한 경쟁 결합 연구를 사용하여 측정된다. 간략하게, 전체 뇌의 균질화, 원심분리(30,000 x g, 20분), 및 대량 세척에 의해 조 시냅스막을 제조한다. 3H-GABA 또는 3H-바클로펜과 막을 인큐베이션시켜 총 결합을 측정하고, 동시에 비특이 결합은 100μM 바클로펜의 존재하에 측정한다. 여과에 의해 비결합 리간드를 제거할 때, Topcount Harvester (Packhard) 또는 계수기에서 필터를 계수한다. 경쟁 실험의 경우 비표지 화합물의 농도를 증가시킬 경우 결합된다.
본 발명의 목적은 추가로, 고친화성 및 저친화성 작용제 결합 부위 둘 모두를 갖는 것을 특징으로 하는, 적어도 하나의 GABABR1a 및 적어도 하나의 GABABR2 서브유니트에 의해 형성된 분리된 GABAB 수용체 단백질을 제공하는 것이다. 추가의 일면에서, 분리된 GABAB 수용체는 세포에 의해 발현되는 기능성 GABAB 수용체로서, 상기 세포는 정상적으로는 GABAB 수용체를 발현시키지 못한다. 상업적으로 이용가능한 적절한 세포는 제한하는 것은 아니지만, L-세포, HEK-293 세포, COS 세포, CHO 세포, HeLa 세포 및 MRC 세포, 특히, GABAB 수용체는 서열번호 1로 구성된 올리고뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 적어도 하나의 GABABR1a 서브유니트 및 서열번호 3으로 구성된 올리고뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 적어도 하나의 GABABR2 서브유니트를 포함하는 CHO 세포를 포함한다. 더욱 특정의 일면에서 본 발명에 따른 분리된 GABAB 수용체는 수탁 번호 LMBP 6046CB로, 2003년 8월 22일에 CHO-K1 h-GABA-b R1a/R2 클론으로서 벨전 코디네이티드 콜렉션 오브 마이크로오거니즘(BCCM)에 기탁된 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주에 의해 발현되는 수용체 단백질로 구성된다.
"기능성 GABAB 수용체"는 GABAB 수용체를 정상적으로 발현시키지 못하는 세포내에서의 GABABR2 및 GABABR1a의 공발현에 의해 형성된 GABAB 수용체로서, 가장 바람직하게 GABABR2 및 GABABR1a의 헤테로다이머를 형성하되, 상기 기능성 GABAB 수용체는 GABAB 수용체 작용제 GABA에 노출될 경우 적어도 하나의 작용 반응을 매개한다. 작용 반응의 일례는 제노퍼스 멜라닌보유세포에서의 색소 응집, cAMP 수준의 음성 조절, 내부 정류(rectifying) 칼슘 채널과의 커플링, 뉴론에서의 후기억제시냅후전위의 매개, 칼륨 전도도 증가, 칼슘 전도도 감소, MAPKinase 활성화, 세포외 pH 산성화 및 G-단백질 커플링 수용체의 통상적인 다른 작용 반응이다. 본 분야의 기술자는 GABAB 수용체와 같은 G-단백질 커플링 수용체의 작용 반응을 측정하는 다양한 방법에 익숙할 것이다(참고, 예: Lerner, 1994, Trends Neurosci. 17 : 142-146 [멜라닌보유세포에서의 색소 분포 변화];Yokomizo et al. , 1997, Nature 387: 620-624 [cAMP 또는 칼슘 농도 변화; 주화성] ; Howard et al. , 1996, Science 273: 974-977 [제노퍼스 난모세포에서 막 전류 변화]; McKee etal., 1997, Mol. Endocrinol. 11 :415-423 [에쿼린 에세이를 사용하여 측정된 칼슘 농도 변화];Offermanns & Simon, 1995, J. Biol. Chem. 270 : 15175-15180 [이노시톨 포스페이트 수준 변화]). GABABR2 및 GABABR1a의 헤테로다이머가 발현되는 세포, 및 그렇게 형성된 기능성 GABAB 수용체와 커플링하는 G-단백질에 따라 상기 방법중 일부는 상기 기능성 GABAB 수용체의 작용 반응을 측정하기에 적절할 수 있다. 주어지 실험 시스템에 대한 작용 반응을 측정하는 적절한 방법을 선별하는 것은 본 분야의 기술자의 능력내 존재한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "화합물", "시험 화합물", "약제" 또는 "후보 약제"는 여러 형태의 분자, 예로서, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 GABAB 수용체 작용제로서의 활성에 대하여 연구할 수 있는 소분자를 포함하고, 약제은 그를 투여받은 대상자에게 치료적 잇점을 제공할 수 있다. 후보 약제은 각각 예를 들면, 경구 또는 비경구, 예로서 정맥내, 근육내, 피하, 안와내, 포내, 복강내, 직장내, 수조내, 또는 예를 들면, 피부용 패취 또는 경피 이온삼투요법을 사용하는 피부를 통한 수동 또는 촉진 흡수를 포함하는 다양한 경로로 개체내로 투여될 수 있다. 추가로, 화합물은 주사, 삽관 또는 국소적으로 투여될 수 있고, 후자의 경우 이는 예를 들면, 연고의 직접 적용에 의해 수동적일 수 있거나, 비강용 분무제 또는 흡입제를 사용하여 활성일 수 있고, 이 경우 조성물의 성분은 적절한 분사제이다. 화합물의 투여 경로는 부분적으로 화합물의 화학 구조에 의존한다. 펩티드 및 뉴클레오티드는 소화관에서 분해될 수 있기 때문에 예를 들면, 경구 투여시에는 특히 바람직하지 못한다. 그러나, 예를 들면, 분해에 덜 민감하다록 하는, 펩티드를 화학적으로 변형시키는 방법은 잘 공지되어 있고, 이는 D-아미노산의 사용 펩티도모사물질에 기초한 영역의 사용, 또는 펩토이드 예로서 비닐 위치(vinylogous) 펩토이드의 사용을 포함한다.
선별 방법에 사용된 약제는 약제학적으로 허용가능한 담체중에 사용될 수있다. (참고, [예: Remington's Plaarnaceutical Sciences, latest edition, by E. W. Martin Mack Pub. Co. , Easton, PA], 상기에는 약제 제형의 제조와 함께 사용될 수 있는 약제학적 조성물의 통상의 방법이 전형적인 담체가 기술되어 있고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 인용된다).
세포
앞서 기술한 바, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 GABAB 수용체 서브유니트 GABABR1a 및 GABABR2를 발현시키는 발현 벡터로 안정적으로 형질감염된 세포주를 제공한다. 특히 CHO 세포는 상기 발현 벡터로 형질감염된다. 발현 벡터는 분자생물 분야에서 통상적으로 작제되고, 단백질을 발현시킬 수 있도록 하기 위하여 필요할 수 있고, 정확한 방향으로 위치하는 플라스미드 DNA 및 적절한 개시자, 프로모터, 인핸서 및 밀 다른 요소의 사용을 포함한다. 일반적으로, 숙주에서 폴리펩티드를 생산하는 폴리뉴클레오티드를 유지, 증식 또는 발현시키기에 적절한 시스템 또는 벡터를 사용할 수 있다. 적절하게 뉴클레오티드 서열, 즉, 상기 정의된 바와 같이 인간 GABABR1a 또는 GABABR2 서브유니트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 잘 공지되어 있고 통상적인 다양한 기술, 예로서, [in Current Protocol in Molecular Biology, Ausbel et al. eds. , John Wiley & Sons, 1997.]에 기술된 것에 의해 발현 시스템내로 삽입시킬 수 있다.
특정 일면에서 본 발명에 따른 CHO 세포는 각각 인간 GABABR1a (서열번호:1) 및 인간 GABABR2 (서열번호: 3)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 상업적으로 이용가능한 발현 벡터 pcDNA3.1로 공-형질감염시킨다. 더욱 바람직하게 본 발명은 수탁 번호 LMBP 6046CB로, 2003년 8월 22일에 CHO-K1 h-GABA-b R1a/R2 클론으로서 벨전 코디네이티드 콜렉션 오브 마이크로오거니즘(BCCM)에 기탁된 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주를 제공한다. 본 세포주는 CHO 세포주내 기능성 GABAB 수용체가 GABAB 수용체 작용제에 대하여 고친화성 및 저친화성 결합 부위 둘 모두를 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 세포를 사용하하는 것으로 화합물 선별을 가능하게 하고, 화합물-수용체 상호작용, 즉, GABAB 수용체의 저친화성 또는 고친화성 작용제 결합 부위와 상호작용은 성질의 특징화에 대한 유용한 도구를 제공한다.
핵산 작제물의 제조와 관련된 더욱 상세한 설명을 위해, 돌연변이화, 서열화, DNA의 세포내로의 도입, 및 유전자 발현, 및 단백질 분석을 예를 들면, [Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al. , 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참고한다.
에세이
본 발명은 또한 본 발명의 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주에 의해 발현되는 GABAB 수용체를 제공하고, 상기 수용체를 추정의 결합 화합물과 접촉시키고; 상기 화합물이 수용체와 상호작용하는지를 결정하는 것을 포함하는, 본 발명의 기능성 GABAB 수용체와 상호작용할 수 있는 화합물에 대한 에세이를 제공한다.
에세이의 일면에서, 수용체 또는 수용체의 서브유니트는 결합 에세이에 사용될 수 있다. 결합 에세이는 경쟁 또는 비경쟁일 수 있다. 상기 에세이는 존재하는 경우, 화합물이 폴리펩티드에 결합할 수 있는지를 결정화기 위하여 다수의 화합물을 신속하게 선별할 수 있도록 할 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명은
a) GABAB 수용체에 결합하는 것으로 공지되어 있는 화합물의 존재 및 부재하에서 기능성 GABAB 수용체를 발현시키되, GABAB 수용체를 정상적으로 발현시키지 못하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키고,
b) 기준 화합물로서 GABAB 수용체에 결합하는 것으로 공지된 화합물을 사용하여 시험 화합물과 GABAB 수용체의 결합을 측정하는 것을 포함하는, 시험 화합물이 본 발명의 GABAB 수용체 단백질에 결합하는지를 확인하고, 이로써 GABAB 수용체의 효능있는 작용제인지 또는 길항제인지를 확인하는 방법을 제공한다.
시험 화합물, 또는 이하 기준 화합물로서 언급되는 GABAB 수용체에 결합하는 것으로 공지된 화합물의 결합은 단백질-리간드 상호작용 연구에 대한 본 분야의 공지된 방법을 사용하여 평가한다. 예를 들면, 상기 결합은 표지 물질 또는 기준 화합물을 사용하여 측정할 수 있다. 시험 화합물 또는 기준 화합물을 본 분야에 공지된 통상의 방식, 예로서, 방사능, 형광 또는 효소적으로 표지할 수 있다. 상기 언급한 방법의 특정 일면으로 GABAB 수용체에 결합하는 것으로 공지된 화합물, 이른바, 기준 화합물은 검출가능하게 표지되고, 상기 표지를 사용하여 GABAB 수용체와 시험 화합물의 결합을 측정한다. 방사능표지, 형광 표지 또는 효소적 표지, 더욱 바람직하게 방사능표지를 사용하여 기준 화합물을 표지한다. 더욱 특정 일면에서, 본 발명은 GABAB 수용체에 결합하는 것으로 공지된 화합물을 사용하는 것을 포함하며, 기준 화합물은 3H-GABA, 3H-바클로펜, 3H-3-APPA, 3H-CGP542626 및 3H-SCH50911로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 시험 화합물이 GABAB 수용체에 결합하는지를 확인하는 방법을 제공한다.
이어서, 더욱 상세한 에세이는 추가로 본 발명의 폴리펩티드의 작용제 또는 길항제로서 작용하는지를 결정하기 위하여 결합하는 것으로 밝혀진 화합물을 사용하여 수행할 수 있다.
따라서, 추가의 일면으로 본 발명은
a) 시험 화합물의 존재 및 부재하에 기능성 GABAB 수용체를 발현시키되, GABAB 수용체를 정상적으로 발현시키지 못하는 세포를 표지된 GABAB 작용제에 노출시키고,
b) 세포와 표지된 작용제의 결합을 측정하는 것을 포함하되, 표지된 작용제의 결합량이 시험 화합물 존재하에서 더욱 적은 경우, 화합물은 GABAB 수용체의 효능이 있는 작용제인, GABAB 수용체 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 일반 결합 에세이에 대하여 상기에 앞서 기술된 바와 같이, GABAB 수용체 작용제의 결합은 단백질-리간드 연구에 대한 본 분야의 공지된 방법을 사용하여 평가된다. 표지는 일반적으로 방사능 표지, 형광 표지, 또는 효소적 표지로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 특히 방사능 표지이고, 여기에서, 작용제는 3H-GABA, 3H-바클로펜 및 3H-3-APPA로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
유사하게, 본 발명은
a) 시험 화합물의 존재 및 부재하에 기능성 GABAB 수용체를 발현시키되, GABAB 수용체를 정상적으로 발현시키지 못하는 세포를 표지된 GABAB 길항제에 노출시키고,
b) 세포와 표지된 길항제의 결합을 측정하는 것을 포함하되, 표지된 길항제의 결합량이 시험 화합물 존재하에서 더욱 적은 경우, 화합물은 GABAB 수용체의 효능이 있는 길항제인, GABAB 수용체 길항제를 확인하는 방법을 제공한다. 일반 결합 에세이에 대하여 상기에 앞서 기술된 바와 같이, GABAB 수용체 길항제의 결합은 단백질-리간드 연구에 대한 본 분야의 공지된 방법을 사용하여 평가된다. 표지는 일반적으로 방사능 표지, 형광 표지, 또는 효소적 표지로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 특히 방사능 표지이고, 여기에서, 길항제는 3H-CGP542626 및 3H-SCH50911로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 대체 일면에서, 상기 언급된 결합 에세이는 상기 정의된 바와 같은 GABAB 수용체를 포함하는 세포 추출물, 세포 분획 또는 세포 기관과 같은 세포 조성물상에서 수행된다. 더욱 특히, 상기 언급된 결합 에세이는 세포 조성물, 즉, 세포 추출물, 세포 분획 또는 세포 기관은 기능성 GABAB 수용체를 발현시키되, GABAB 수용체를 정상적으로 발현시키지 못하는 세포로부터 수득되는, 상기 정의된 바와 같은 GABAB 수용체를 포함하는 세포 추출물, 세포 분획 또는 세포 기관과 같은 세포 조성물상에서 수행된다. 더욱 바람직하게, 세포 조성물, 즉, 세포 추출물, 세포 분획 또는 세포 기관은 수탁 번호 LMBP 6046CB로, 2003년 8월 22일에 CHO-K1 h-GABA-b R1a/R2 클론으로서 벨전 코디네이티드 콜렉션 오브 마이크로오거니즘(BCCM)에 기탁된 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주로부터 수득된다.
따라서, 본 발명의 목적은
a) 검출가능하게 표지된 GABAB 수용체의 작용제 또는 길항제의 존재하에 기능성 GABAB 수용체를 발현시키되, GABAB 수용체를 정상적으로 발현시키지 못하는 세포의 세포 조성물에 화합물을 투여하고,
b) 표지된 작용제 또는 길항제와 세포 조성물의 결합을 측정하는 것을 포함하되, 표지된 작용제 또는 길항제의 결합량이 시험 화합물 존재하에서 더욱 적은 경우, 화합물은 각각 GABAB 수용체의 효능이 있는 작용제 또는 길항제인, GABAB 수용체 작용제 또는 길항제로서 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 일반 결합 에세이에 대하여 상기에 앞서 기술된 바와 같이, GABAB 수용체 작용제 또는 길항제의 결합은 단백질-리간드 연구에 대한 본 분야의 공지된 방법을 사용하여 평가된다. 표지는 일반적으로 방사능 표지, 형광 표지, 또는 효소적 표지로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 특히 방사능 표지이고, 여기에서, 작용제는 3H-GABA, 3H-바클로펜 및 3H-3-APPA로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 길항제는 3H-CGP542626 및 3H-SCH50911로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 더욱 특정의 일면에서, 상기 언급된 결합 에세이는 본 발명에 따른 세포 막 분획으로 구성된 세포 조성물, 특히, 수탁 번호 LMBP 6046CB로, 2003년 8월 22일에 CHO-K1 h-GABA-b R1a/R2 클론으로서 벨전 코디네이티드 콜렉션 오브 마이크로오거니즘(BCCM)에 기탁된 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주의 막 분획상에서, 하나 이상의 상기 언급된 방사능 표지된 작용제 및/또는 길항제를 사용하여 수행된다.
추가의 일면으로 본 발명은 본 발명에 따른 세포에서 GABAB-수용체 활성을 조절하는 화합물을 확인하기 위한 기능성 에세이를 제공한다. 본 발명의 세포를 사용하여 에세이를 수행하며, 즉, 인간 GABABR1a 및 인간 GABABR2 서브유니트로 공형질감염시킨다. GABAB-수용체 활성을을 조절하는 화합물의 능력이 공지된 적어도 하나의 기준 화합물과 세포를 접촉시킨다. 이후, 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, 기준 화합물과 비교하여 시험 화합물이 GABAB 수용체 활성을 조절하는지를 결정한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "기준 화합물"은 GABAB 수용체에 결합하고/거나 GABAB 수용체 활성을 조절하는 것으로 공지되어 있는 화합물이다.
본 발명의 폴리펩티드의 "활성을 조절하는" 화합물 또는 시그날은 화합물 또는 시그날의 부재하에서보다 화합물 또는 시그날의 존재하에서 상이하게 작용하도록 폴리펩티드의 활성을 변화시키는 화합물 또는 시그날을 언급한다. 조절에 작용하는 화합물은 작용제 및 길항제이다. GABAB 수용체의 작용제는 GABAB 수용체 작용을 활성화시키는 화합물, 예로서 GABA, 바클로펜 및 3-APPA를 포함한다.
다르게는, 길항제는 GABAB 수용체 작용을 방해하는 화합물을 포함한다. 전형적으로 길항제의 효과는 작용제-유도성 수용체 활성화의 차단으로서 관찰된다. 길항제는 경쟁 및 비경쟁 길항제를 포함한다. 경쟁 길항제 (경쟁 차단제)는 작용제 결합에 특이적인 부위와 또는 그에 가까운 부위와 상호작용한다. 비경쟁 길항제 또는 차단제는 작용제 상호작용 부위외의 다른 부위와 상호작용하여 수용체의 작용을 불활성화시킨다.
일면에서, 본 발명은
a) GABAB 수용체의 활성화를 허용하는 조건하에서 기능성 GABAB 수용체를 발현시키되, GABAB 수용체를 정상적으로 발현시키지 못하는 세포를 적어도 하나의 기준 화합물과 접촉시키고;
b) GABAB 수용체의 활성화를 허용하는 조건하에서 단계 a)의 세포와 시험 화합물을 접촉시키고,
c) 시험 화합물이 기준 화합물과 비교되는 GABAB 수용체의 활성을 조절하는지를 측정하는 것을 포함하는, GABAB 수용체의 활성을 조절하는 능력을 갖는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다.
GABAB 수용체의 활성을 조절하는 화합물의 능력을 결정하는 방법은 G-단백질 커플링된 수용체의 작용 반응에 이용가능한 다양한 에세이(상기 참고), 특히 칼륨 흐름의 변화, 칼슘 농도의 변화, cAMP의 변화 및 GTPγS 결합 변화를 측정하는 에세이에 기초한다. 일반적으로 본 분야에 공지된 GABAB 수용체의 활성화를 허용하는 조건은, 예로서, 길항제 선별시, 상기 조건은 에세이 시스템에서 GABAB 수용체 작용제의 존재를 포함한다. 활성 에세이에서 사용되는 통상의 GABAB 수용체 작용제는 GABA, 바클로펜 또는 3-APPA이다. 더욱 특히, GTPγS 에세이에서 이하 더욱 상세히 설명되는 바, GABAB 수용체 단백질을 불활성화시키는 시험 화합물의 능력을 평가하기 위하여 GABA를 사용하여 GABAB 수용체를 활성화시킨다.
상기 언급된 에세이에서 시험 화합물의 존재하에 GTPγS 결합의 증가는 화합물이 GABAB 수용체 활성을 활성화시키고, 이로써, 상기 시험 화합물은 GABAB 수용체 단백질의 효능있는 작용제임을 나타내는 표시가 된다. 시험 화합물의 존재하에 GTPγS 결합의 감소는 화합물이 GABAB 수용체 단백질을 활성화시키고, 이로써, 상기 시험 화합물은 GABAB 수용체 단백질의 효능있는 길항제임을 나타내는 표시가 된다.
특히, 바람직한 에세이 타입은 하기와 같이 수행될 수 있는 기능성 에세이 및 결합 에세이를 포함한다
결합 에세이
본 발명의 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주에 의해 발현되는 GABAB 수용체의 과잉 발현을 사용하여 리간드 결합 연구를 위한 상기 수용체(편이상, 본 섹션에서 GABAB 결합 수용체로 언급함)를 수반하는 막 시료를 생산할 수 있다. 막 시료를 통상의 필터-결합 에세이(예: Brandel 필터 에세이 장치 사용) 또는 고성능 Scintillation Proximity 타입 결합 에세이(SPA 및 Cytostar-T 섬광플레이트 기술; Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 방사능 표지된 GABAB 리간드(3H-GAE, 3H-바클로펜, 3H-3-APPA, 3H-CGP542626, 3H-SCH50911 포함) 결합 및 라디도-리간드의 결합 부위에 대한 경쟁자에 의한 대체를 검출할 수 있다. 방사능은 Packard Topcount, 또는 96-, 384-, 1536-의 마이크로티터 웰 포맷으로부터 신속하게 측정할 수 있는 유사한 장치로 측정할 수 있다. SPA/Cytostar-T 기술은 고성능 선별법으로 수정될 수 있고, 따라서, 이 기술은 표준 리간드를 대체시킬 수 있는 화합물 사용에서 사용하기 적절할 수 있다.
선척적 상태와 유사한 환경에서 리간드와 GABAB 결합 수용체 단백질의 결합을 연구하기 위한 또다른 접근법에서 Biacore 장치(Biacore)에서 이용되는 표면 플라스몬 공명효과를 이용한다. 막 시표 또는 전체 세포내 GABAB 결합 수용체는 Biacore의 바이오센서 침에 부착될 수 있고, 리간드의 결합을 화합물의 존재 및 부재하에 조사하여 결합 부위의 경쟁자를 확인할 수 있다.
기능성 에세이
GABAB 수용체는 GIRK (내부 정류 칼슘 채널)와 커플링하는 패밀리 G-단백질 커플링된 수용체에 포함되기 때문에, 칼륨 이온의 흐름은 이들 수용체의 활성화에 대한 결과이어야 한다. 이온 흐름은 특정 화합물의 작용 또는 길항 효과를 측정하기 위한 다양한 기술을 사용하여 실시간으로 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포주에서 발현되는 재조합 GABAB 결합 수용체 단백질은 관심의 대상이 되는 화합물의 작용 메커니즘을 측정하는 전체 및 단일 채널 전기생리학을 사용하여 특징화될 수 있다. GABAB 결합 수용체에 대하여 활성인 화합물에 대한 전기생리학적 선별은 이용가능한 경우 통상의 전기생리학적 기술을 사용하여 수행되고, 신규한 고성능 방법은 현재 개발중에 있다.
Ca2+ 채널에 대한 GABAB 수용체 활성화의 시냅스전 효과가 제공되면, 대체 기능성 선별에서 화합물의 조절 효과는 세포내 칼슘상의 변화를 통해 평가한다. 칼슘 흐름은 수개의 이온-민감성 형광 염료, 예로서, fluo-3, fluo-4, fluo-5N, fura 레드 및 Molecular Probes를 포함하는 공급원으로부터의 다른 유사하 프로브를 사용하여 측정할 수 있다. GABAB 수용체 활성화의 결과로서 칼슘 유입 저해는 이미지 분석 알고리즘과 컴바인된 레이저 동촛점 방법을 포함하거나 포함하지 않는, 형광현미경을 포함하는 형광측정 및 형광 이미지 기술을 사용하여 실시간으로 특징화될 수 있다.
또다른 접근법은 칼슘 과도전류(transients)에 영향을 주는 작용제 또는 조절제로서 활성인 화합물에 대한 고성능 선별 에세이이다. 에세이는 FLuorescence Imaging Plate Reader((RLIPR®), Molecular Devices Corporation)으로 명명되는 장치에 기초한다. 그의 대부분의 공통되는 설정에 있어 상기는 여기시키고, 플루오레세인-기초 염로에 의해 방출되는 형광을 측정한다. 488nm에서 형광단의 고성능 여기를 생산하는 아르곤-이온 레이저, 방출된 형광을 포착하는 고감도의 냉각형 카메라 및 96-/384-웰 플레이트의 바닥 상을 신속하게 스캐닝하는 광학 시스템을 사용한다. 또한, 장치가 시험 약제 용액을 96-/384-웰 플레이트의 웰내로 전달할 수 있도록 하는 96-/384-웰 파이펫팅 헤드를 포함한다. FLIPR 에세이는 화합물의 추가전, 추가시 및 추가 후의 모든 96-/384-웰로부터 세포 군집으로부터의 형광 시그날을 동시에 실시간으로 측정하기 위하여 디자인되었다. FLIPR 에세이를 사용하여 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주에서 기능적으로 활성인 화합물을 선별하고 특징화할 수 있다.
특히 GABAB 작용제 확인에 유용한 고성능 선별 에세이는 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포에 적절하게 형광 염로가 적재되고, 시험 화합물과 함께 인큐베이션되고, 상호작용을 위해 허용되는 충분한 시간(8-24시간, 통상 12-24시간, 특히 24시간)후 상대적인 형광 유니트의 변화를 자동 형광 플레이트 판독기 예로서 FLIPR 또는 Ascent Fluoroskan (Thermo Labsystems(Brussel, Belgium)으로부터 상업적으로 이용가능함)을 사용하여 측정하는 장치로 구성될 수 있다.
추가의 일면으로 기능성 에세이는 GABAB 결합 수용체에 대한 GTPγS 결합의 변화에 기초한다. 특히, 방사능표지된 GTPγS의 대체를 결정하는 경쟁 결합 에세이를 사용한다. 일반적으로 GABAB 수용체 작용제를 확인하는 방법은 본 발명의 hGABABR1a/GABABR2 헤테로다이머를 발현시키는 세포로부터 막 분획을 제조하고, GABAB 수용체의 활성화를 허용하는 조건하에서 막 시료를 시험하고자 하는 화합물과 방사능표지된 GTPγS의 존재하에서 접촉시키고, 막 분획과 GTPγS 결합을 검출하는 것을 포함한다. 화합물의 존재하에 GTPγS 결합의 증가는 화합물이 hGABABR1a/GABABR2 수용체를 활성화시키는 것을 나타낸다. 화합물의 존재하에 GTPγS 결합의 감소는 화합물이 hGABABR1a/GABABR2 수용체를 불활성화시키는 것을 나타낸다. 바람직하게 GTPγS 결합 에세이는 수탁 번호 LMBP 6046CB로, 2003년 8월 22일에 CHO-K1 h-GABA-b R1a/R2 클론으로서 벨전 코디네이티드 콜렉션 오브 마이크로오거니즘(BCCM)에 기탁된 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주로부터 수득한 막 분획상에서 실시된다. 추가로, GABAB 수용체의 활성화를 허용하는 조건은 에세이 시스템중 GABAB 수용체 작용제, 예로서 GABA, 바클로펜 및 3-APPA, 특히 GABA의 존재를 포함한다.
상기 및 다른 기능성 선별 에세이는 이하 실시예에서 제공된다.
GABA B 수용체 작용제
추가의 일면으로, 본 발명은 하기 화학식(I)의 화합물의 상기 언급된 선별 에세이중 하나를 사용하여 확인된 GABAB 수용체 작용제, 그의 N-옥사이드 형태, 약제학적으로 허용가능한 부가염 및 입체화학적 이성체 형태를 제공한다:
Figure 112006013371094-PCT00001
상기 식에서,
=Z1-Z2=Z3-Z4=는
=N-CH=CH-N=(a), =N-CH=N-CH=(b), =CH-N=CH-N=(c), =CH-CH=CH-CH=(d),
=N-CH=CH-CH=(e), =CH-N=CH-CH=(f), =CH-CH=N-CH=(g) 및 =CH-CH=CH-N=(h)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 2가 라디칼을 나타내고;
R1은 수소, 할로, 하이드록실, 시아노, C1-6알킬, CF3, 아미노 또는 모노-또는 디(C1-4알킬)아미노를 나타내고;
R2는 수소, C1-6알킬 또는 하이드록시카보닐-C1-6알킬-을 나타낸다.
특히, 화학식(I)의 화합물은 하나 이상의 하기 조건을 만족하는 화합물이다:
(i) =Z1-Z2=Z3-Z4=는
=N-CH=CH-N=(a), =N-CH=N-CH=(b), =CH-N=CH-N=(c) 및 =CH-CH=CH-CH=(d)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 2가 라디칼을 나타내거나;
(ii) R1은 할로, 아미노 또는 모노-또는 디(C1-4알킬)아미노를 나타내거나;
(iii) R2는 부티르산을 나타낸다.
또한, 관심의 대상이 되는 것은
(i) R1이 Z1 위치에 결합하고/거나
(ii) =Z1-Z2=Z3-Z4=는 (a), (b) 또는 (d)를 나타내거나, 더욱 바람직하게
=Z1-Z2=Z3-Z4=가 (d)를 나타내는 화학식(I)의 화합물이다.
상기 정의 및 하기에 사용되는 바, 할로는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도에 대한 일반명이고; C1-4알킬은 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소 라디칼을 정의하고, 예로서, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 1-메틸에틸, 2-메틸프로필, 2, 2-디메틸에틸 등을 포함하고; C1-4알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소 라디칼을 정의하고, 예로서, 펜틸, 헥실, 3-메틸누틸, 2-메틸펜틸 등을 포함한다.
상기 언급된 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 부가염은 화학식(I)의 화합물이 형성할 수 있는 치료학적으로 활성인 비독성 산 부가염 형태를 포함한다. 후자는 염기 형태를 적절한 산으로 처리하여 용이하게 수득할 수 있다. 적절한 산으로서, 예를 들면, 염화수소산 또는 브롬화수소과 같은 할로수소산; 황산; 질산; 인산 등과 같은 무기산; 또는 예컨대, 아세트산, 프로판산, 하이드록시아세트산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 시클람산, 살리실산, p-아미노-살리실산, 팜산 등의 유기산을 포함한다.
상기 언급한 약제학적으로 허용가능한 부가염은 화학식(I)의 화합물이 형성할 수 있는 치료학적으로 활성인 비독성 염기 부가염 형태를 포함하는 것을 의미한다. 염기 부가염 형태의 예로서, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘 염, 및 약제학적으로 허용가능한 아민, 예로서, 암모니아, 알킬아민, 벤자틴, N-메틸-D-글루카민, 하이드라바민, 아미노산, 예컨대, 알키닌, 리신과의 염이다.
역으로 상기 산 부가 염 형태는 적합한 염기의 처리에 의해 유리 염기 형태로 전환될 수 있다.
용어 부가 염은 또한 화학식(I)의 화합물, 및 그의 염이 형성할 수 있는 용매화물을 포함한다. 용해화물의 예로서, 수화물, 알콜화물 등이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 입체화학적 이성체 형태는 화학식(I)의 화합물이 가질 수 있는 구조 형태, 및 가능한 상이한 이성체를 정의한다. 다르게 언급되거나 지시되지 않는 한, 화합물의 화학적 명명은 기본 분자 구조의 모든 디아스테레오머, 에난티오머 및/또는 컨포머를 포함하는, 모든 가능한 입체이성체 및 구조 이성체 형태의 혼합물을 언급한다. 순수한 형태 및 서로의 혼합물 형태 모두의, 화학식(I)의 화합물의 모든 입체이성체 형태도 본 발명의 범주내 포함시키고자 한다.
화학식(I)의 화합물의 N-옥사이드 형태는 하나 또는 수개의 질소 원자가 소위, N-옥사이드로 산화된 화학식(I)의 화합물을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 7,8-디하이드로-페노티아진 유도체는 [Nemeryuk M. P. et al.,Khimiko-Farmatsevticheskii Zhurnal(1985), 19(8), 964-968]에 기술된 바와 같이 통상적으로 제조된다. 간단하게, 적절한 용매, 예로서 에탄올 또는 N-메틸피롤리돈중 2개의 반응물을 가열하여 공지된 오르토-아미노 치환된 (헤테로)아르네-티올(Ⅱ)을 적절하게 2-브로모-5,5-디메틸-3-옥소-사이클로헥스-1-에닐아미노 유도체(Ⅲ)로 축합시킨다. 표준 후처리 및 정제를 통해 화학식(I)의 바람직한 산물을 제공한다(도식 1).
도식 1
Figure 112006013371094-PCT00002
여기에서, =Z1-Z2=Z3-Z4=, R1 및 R2는 상기 화학식(I)의 화합물에 정의된 바와 같다.
본 분야에 공지된 아민환 조건하에서 화학식(Ⅳ)의 적절한 아민으로 5,5-디메틸-1, 3-사이클로헥산디온을 아민화시킨 후, N-브로모숙신이미드로 브롬화하여 적절한 2-브로모-5, 5-디메틸-3-옥소-사이클로헥스-1-에닐아미노 유도체(Ⅲ)를 일반적으로 수득할 수 있다(도식 2).
도식 2
Figure 112006013371094-PCT00003
여기에서, R2는 상기 화학식(I)의 화합물에 정의된 바와 같다.
R2가 부티르산인 화학식(I)의 화합물인 화학식(I')의 화합물의 경우, 상기 화합물은 적절한 용매, 예로서 에탄올 또는 N-메틸피롤리돈중에서 2개의 반응물을 가열시켜 본 분야에 공지된 조건을 사용하여 오르토-아미노 치환된 (헤테로)아렌-티올(Ⅱ)을 4-(2-브로모-5,5-디메틸-3-옥소-사이클로헥스-1-에닐아미노)-부티르산 또는 에스테르 유도체 예로서, t-부틸에스테르(V)으로 축합시켜 수득한다. 표준 후처리 및 정제를 통해 원하는 산물, 또는 에스테르 유도체를 수득하고, 산성 또는 염기 조건하에서 가수분해하여 원하는 부티르산(I')을 수득할 수 있다(도식3).
도식 3
Figure 112006013371094-PCT00004
상기 언급한 합성 방법을 사용하여 화학식(I)의 화합물을 합성하기 위한 추가의 일례를 이하 실험부에 제공한다.
필요하거나 바람직한 경우, 하나 이상의 하기의 추가 단계를 순서에 따라 수행할 수 있다:
(i) 잔여 보호 그룹(들)을 제거하고;
(ii) 화학식(I)의 화합물 또는 그의 보호된 형태를 추가의 화학식(I)의 화합물 또는 그의 보호된 형태로 전환시키고;
(iii) 화학식(I)의 화합물 또는 그의 보호된 형태를 화학식(I)의 화합물의 N-옥사이드, 염, 4급 아민 또는 용해화물 또는 그의 보호된 형태로 전환시키고;
(iv) 화학식(I)의 화합물의 N-옥사이드, 염, 4급 아민 또는 용해화물 또는 그의 보호된 형태를 화학식(I)의 화합물 또는 그의 보호된 형태로 전환시키고;
(v) 화학식(I)의 화합물의 N-옥사이드, 염, 4급 아민 또는 용해화물 또는 그의 보호된 형태를 화학식(I)의 또다른 N-옥사이드, 약제학적으로 허용가능한 부가염 4급 아민 또는 용해화물 또는 그의 보호된 형태로 전환시킨다.
본 분야의 기술자는 상기 기술된 공정에서 중간체 화합물의 작용성 그룹은 보호 그룹에 의해 차단될 필요가 있을 수 있다.
보호하는 것이 바람직할 수 있는 작용성 그룹은 하이드록시, 아미노 및 카복실산을 포함한다. 하이드록시에 대한 적절한 보호 그룹은 트리알킬실릴 그룹(예: t-부틸디메틸실릴 t-부틸디페닐실릴 또는 트리메틸실릴), 벤질 및 테트라하이드로피라닐을 포함한다. 아미노에 대한 적절한 보호 그룹은 t-부틸옥시카보닐 또는 벤질옥시카보닐을 포함한다. 카복실산에 대한 적절한 보호 그룹은 C(1-6)알킬 또는 벤질 에스테르를 포함한다.
작용성 그룹의 보호 및 탈보호는 반응 단계 전, 후에 수행될 수 있다.
보호 그룹의 사용은 전체적으로 ['Protective Groups in Organic Synthesis' 3rd edition, T W Greene & P G M Wutz, John Wiley & Sons Inc. (June1999)]에 기술되어 있다.
추가로, 화학식(I)의 화합물에서 N-원자는 적절한 용매 예로서, 2-프로파논, 테트라하이드로푸란 또는 디메틸포름아미드중 CH3-I을 사용하여 본 분야의 공지된 방법에 의해 메틸화될 수 있다.
상기 언급된 반응 공정에 사용되는 바와 같은 일부의 중간체 및 출발 물질은 공지된 화합물이고, 본 분야에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.
치료 방법
본 발명은 또한 예로서 근강직증후군, 위식도역류, 신경병, 실금과 같은 징후 치료, 및 기침 및 코카인 중독 치료용 약제의 제조에서, 상기 언급된 에세이중 하나를 사용하여 GABAB 수용체 활성 조절제를 사용하여 확인된 화합물, 특히, 상기 기술된 바와 같은 화학식(I)의 화합물의 사용을 제공한다. 특히 하부식도괄약근이완(TLESR)을 저하시키는 약제의 제조에서 사용된다. 따라서, 본 발명의 목적은 예로서 근강직증후군, 위식도역류, 신경병, 실금과 같은 징후, 및 기침 및 코카인 중독, 특히 TLESR로 고생하는 인간을 포함하는 포유동물과 같은 온혈동물의 치료, 및 치료 방법에 제공한다.
상기 방법은 본 발명의 방법을 사용하여 GABAB 수용체 조절제로서 확인된 화합물을 유효량으로 그를 필요로 하는 온혈동물에 투여하는 것을 포함한다. 특히 본 발명에 따른 화합물을 유효량으로 인간을 포함하는 온혈동물에 전신 또는 국소 투여한다.
상기 약제는 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 약제를 포함하는 조성물로 제조될 수 있다. 약제는 생리학적 기능성 유도체 형태, 예로서 에스테르 또는 염, 예로서 산 부가염 또는 염기성 금속 염, 또는 N 또는 S 옥사이드일 수 있다. 조성물은 투여 수단 및 적절한 경로에 따라 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 경구, 직장, 비강, 흡식, 국소(구강 및 설하 포함), 질내 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 진피내, 경막내 및 경질막외 포함) 투여에 적절한 제형으로 사용되는 것을 포함한다. 담체 또는 희석제의 선택는 약제 및 그의 치료 목적에 따라 다른 제안된 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 제형은 용이하게 단위 투여 형태로 존재할 수 있고 의약 분야에 잘 공지되어 있는 방법에 의해 제조도리 수 있다. 상기 방법은 하나 이상의 부속 성분으로 구성된 담체와 활성 성분을 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 액상 담체 또는 미세하게 분할된 고체 담체 또는 둘 모두와 함께 균일하고 밀접하게 혼합하여 합성하고, 필요한 경우 제품으로 성형화하여 제조한다.
고형 조성물의 경우, 통상의 비독성 고형 담체는 예로서,
약제학적 등급의 만닛톨, 락토오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 활석, 글루코오스, 수크로오스, 마그네슘 카보네이트 등을 사용할 수 있다. 상기 정의된 바와 같은 활성 화합물은 담체로서, 예를 들면 폴리알킬렌 글리콜, 아세틸화된 트리글리세리드 등을 사용하여 좌제로서 제형화도리 수 있다. 액상의 약제학적으로 투여가능한 조성물은 예를 들면 상기 정의된 바와 같은 활성 성분 및 임의의 약제학적 애주번트를 담체 예로서, 물, 덱스트로스 염수 용액, 글리세롤, 에탄올 등에 용해, 분산 등을 시켜 액제 또는 현탁제등을 형성시킴으로써 제조할 수 있다. 원하는 경우, 투여하고자 하는 약제학적 조성물은 또한 최소량의 비독성 보조 물질, 예로서 습윤제 또는 유제, pH 완충제 등, 예로서, 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트 등을 포함할 수 있다. 상기 제제를 제조하는 실질적인 방법은 공지되어 있거나, 본 분야의 기술자에게는 자명한 것이다; 예로서, 참고, [Gennaro et al. , Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania,18th Edition, 1990].
투여하고자 하는 조성물 또는 제제는 치료하고자 하는 대상의 증상을 완화시키기에 유효한 양의 충분한 양으로 활성 화합물(들)을 포함할 것이다.
비독성 담체로부터 구성된 0. 25 내지 95% 범위의 밸런스로 활성 성분을 포함하는 제제 또는 조성물을 제조할 수 있다.
경구 투여용으로 약제학적으로 허용가능한 비독성 조성물은 일반적으로 상요된 부형제, 예로서, 약제학적 등급의 만닛톨, 락토오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 소듐 크로스카멜로오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 활석, 글루코오스, 수크로오스, 마그네슘, 카보네이트 등을 혼입하여 제조한다. 상기 조성물은 액제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 분제, 지효성 제제 등의 형태를 취한다. 상기 조성물은 1%-95%의 활성 성분, 더욱 바람직하게 2-50%, 가장 바람직하제 5-8%를 포함할 수 있다.
비경구 투여는 통상 피하, 근육내 또는 정맥내에 의해 것으로 특징화된다. 주사제는 통상의 제형으로, 액상 액제 또는 현탁제, 주사전 액상의 액제 또는 현탁제로서 적절한 고형 형태, 또는 유제로서 제조될 수 있다. 적절할 부형제는 예로서, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 또한, 바람직한 경우, 투여하고자 하는 약제학적 조성물은 또한 최소량의 비독성 보조 물질, 예로서 습윤제 또는 유제, pH 완충제 등, 예로서, 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소듐 아세테이트 드을 포함할 수 있다.
상기 비경구 조성물중 포함된 활성 화합물의 퍼센트는 그의 특정 성질, 및 화합물의 활성 및 대상자의 필요에 따라 고도로 달라질 수 있다. 그러나, 액제중 1% 내지 10%의 화합물이 사용될 수 있고, 조성물은 고형이 이후 상기 퍼센트로 희석되는 고형인 경우, 그보다 높을 것이다. 바람직하게, 조성물은 액제중 0.2-2%의 활성제를 포함할 것이다.
본 명세서에서 용어 "표준 방법", "표준 프로토콜" 및 "표준 공정"이 분자 생물학 기술과 관련하여 사용될 때 일반 실험실 매뉴얼, 예로서, [Current Protocol in Molecular Biology, editors F. Ausubel et al. , John Wiley and Sons, Inc.1994, or Sambrook, J.,Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989]의 프로토콜 및 공정로서 이해될 것이다.
본 발명은 하기 실험 설명을 참고로 하여 더욱 이해될 것이며, 본 분야의 기술자는 하기 청구범위에서 더욱 전체적으로 기술된 바, 이는 단지 본 발명의 일례라는 것을 이해할 것이다. 추가로, 본 명세서에서 다양한 공개문헌을 인용하다. 공개문헌은 본 발명이 포함하는 본 분야의 상탤르 더욱 전체적으로 설명하기 위하여 본 명세서에 참고문헌으로서 인용된다.
실험부
I GABA B 작용제의 합성
하기 기술하는 공정에서 하기 약어를 사용하였다: "DIPE"는 디이소프로필에테르를 나타내고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 나타낸다.
일부 화학 물질에서 화학식, 예로서, CH3CN은 아세토니트릴, NH3은 암모니아, CH2Cl2는 디클로로메탄, MgSO4는 황산마그네슘, 및 HCl은 염산으로서 사용되었다.
A. 중간체 제조
실시예 A.1
Figure 112006013371094-PCT00005
및
Figure 112006013371094-PCT00006
의 제조
4-아미노부타노산 1,1-디메틸에틸 에스테르 [50479-22-6] (14g, 0.087mol) 및 5,5-디메틸-1,3-사이클로헥산디온 [126-81-8] (12.26g, 0.087mol)을 트리클로로메탄 (250 ml)에 용해시키고 N,N-디에틸에탄아민(0,5ml)을 가하였다. 반응 혼합물 을 3일동안 교반하고 3분량의 250ml의 물로 연속 세척하였다. 유기층을 MgS04상에서 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 DIPE/CH3CN에서 재결정화하여 18.6g (76%)의 중간체 1을 수득하였다.
이 산물을 메탄올 (250 ml) 및 물(100 ml)에 용해시켰다. 1-브로모-2, 5-피롤리딘디온(11.8g, 0.066 mol)을 30분동안 적가하였다. 추가의 1시간동안 교반한 후, 500 ml 물을 가하였다. 혼합물을 3분량의 디클로로메탄으로 추출하였다. 혼합된 유기층을 MgS04상에서 건조시키고 감압하에 농축시켜 22g (92%)의 중간체 2를 수득하였다.
유사한 방식으로
Figure 112006013371094-PCT00007
을 수득하였다.
실시예 A. 2
Figure 112006013371094-PCT00008
의 제조
에탄올 (q.s.)중 5, 6-디아미노-4(1H)-피리미딘티온 [2846-89-1](0.0027 mol) 및 중간체 2 (0. 0027 mol) 혼합물을 2시간동안 85℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 용매를 증발시켰다. 잔류물을 고성능 액상 크로마토그래피에 의 해 정제하였다. 산물 분획을 수거하고 용매(CH3CN)을 증발시켰다. 수층을 EtOAc으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고 용매를 증발시시켜, 0.400 g(30%)의 중간체 4를 수득하였다.
실시예 A. 3 .
Figure 112006013371094-PCT00009
의 제조
1-메틸-2-피롤리디논 [872-50-4] (15ml)중 2-아미노벤젠티올 [137-07-5] (0.004 mol) 및 중간체 2 (0.004 mol) 혼합물을 1시간동안 140℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고 층을 EtOAc/H20(NH3)로 분리하였다. 유기층을 건조시키고(MgS04), 여과하고 용매를 증발시켰다. 잔류물을 고성능 액상 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 산물 분획을 수거하고 용매(CH3CN)를 증발시켰다. 수층을 EtOAc으로 추출하고 유기층을 건조시키고(MgSO4), 여과하고 용매를 증발시켜 0.6 g (40%)의 중간체 5를 수득하였다.
B. 화합물의 제조
실시예 B.1
Figure 112006013371094-PCT00010
의 제조
트리플루오로아세트산 (5ml) 및 디클로로메탄 (5ml)중 중간체 4 (0.001 mol) 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 질소 흐름하에 건조시켰다. 디에틸 에테르에서 생성된 잔류물을 현탁시켰다. 바람직한 산물을 여과하고 30℃에서 건조(진공)시켜 0.120 g (23%)의 화합물 2의 트리플루오로아세트산 염을 수득하였다.
유사한 방식으로
Figure 112006013371094-PCT00011
의 하이드로브롬산 염 및
Figure 112006013371094-PCT00012
의 트리플루오로아세트산 염을 제조하였다:
실시예 B. 2
Figure 112006013371094-PCT00013
의 제조
트리플루오로아세트산 (5ml) 및 디클로로메탄 (5ml)중 중간체 5 (0.00155 mol) 혼합물을 20시간동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 질소 흐름하에 건조시켰다. 생성된 잔류물을 디에틸 에테르에서 고형화시켰다. 바람직한 산물을 여과하고 30℃에서 건조(진공)시켜 0.320 g (67%)의 화합물 3의 트리플루오로아세트산 염을 수득하였다.
II.GABA B -CHO-K1의 개발
재료 및 방법
리포펙트아민 PLUS를 사용한 CHO-K1에서의 GABA B RI a 및 GABA B R2의 영구 형질감염:
CHO-세포를 hGABABR1a/pcDNA3.1로 형질감염시켰다. 모노클로날 안정성 R1a-발현 세포를 hGABABR2/pcDNA3.1Hygro+로 형질감염시켰다. 800μg 젠티신 + 800μg 하이그로마이신/ml을 사용하여 클론을 선별하였다.
막 시료:
PBS로 단시간 세정한 후, 부티레이트-자극된(최종, 5 mM) 세포를 50 mM TrisHCl pH7.4 스크랩핑하고 23500g에서 10분동안 4℃에서 원심분리하였다. 펠릿을 5mM TrisHCl pH 7.4에서 Ultra-Turrax(24000 rpm)에 의해 균질화한 후 20분동안 4℃에서 30000g에서 원심분리하였다. 50mM TrisHCl pH 7.4에서 생성된 펠릿을 재현탁시키고 다시 균질화시켰다. Bradford 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.
GTPγ35S 활성화 에세이:
10μg의 막 시료를 20분동안 37℃에서 1mM GABA을 포함하거나 포함하지 않는(바클로펜 부재하의 기초 활성), 20 mM Hepes pH 7.4, 100 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.25nM GTPγ35S, 3μM GDP, 10μg 사포닌/ml의 250㎕에서 인큐베이션시켰다. Harvester (Packard)에서 96-웰 GF/B 필터 플레이트상에서 여과를 수행하였다. 냉 10 mM 포스페이트 완충액 pH 7.4를 사용하여 필터를 6회 세정하고, 밤새도록 건조시키고 30㎕의 Microscint O를 첨가하고 Topcount (Packard, 1분/웰)에서 측정하였다.
3H-작용제 결합:
30-60μg의 막 시료를 20℃에서 500㎕의 50 mM TrisHCl pH 7.4, 2.5 mM CaCl2, 10 nM 3H-GABA 또는 20 nM 3H-바클로펜에서 인큐베이션시켰다. 100μM 바클로펜의 존재하에 비특이적 결합을 측정하였다. 90분후 혼합물을 Harvester (Packard)에 의해 96-웰 GF/B 필터플레이트상으로 이동시켰다. 필터를 냉 50mM Tris HCl pH 7.4, 2.5mM CaCl2로 6회 세척하고 밤새도록 건조시키고 30㎕의 Microscint O를 첨가하고 Topcount (Packard, 1분/웰)에서 측정하였다.
결과
GTPγ 35 S 활성화 에세이
안정하게 hGABABR1a-형질감염된 CHO-세포 막에서 길항제 3H-CGP54626의 결합을 측정하였다. 가장 고도한 길항제 결합을 갖는 R1a-클론에서 hGABABR2를 함께 형질감염시켰다. 서브클로닝한 후, GABA에 의한 막 자극시 GTPγ35S-결합 에세이에서 작용 활성을 나타내는 안정성 클론을 수득하고, 여기에서 상기 활성은 양성 조절제 CGP7930의 존재하에서 효능은 증가하였다(Urwyler S.,et al., 2001, Molecular Pharmacology60 :963-971)(도 1).
작용제 필터 결합 에세이
96-웰 GF/B 필터플레이트에서 작용제 필터 결합 에세이를 진행하였다. 공지된 작용제 및 길항제의 IC50을 측정하였다(도 2).
안정성 hGABABR1a 또는 일시적 hGABABR2 모노머 GABAB 수용체 발현 세포는 작용제 3H-GABA 또는 3H-바클로펜와 결합하지 않았지만(데이타를 나타내지 않음), 예상외로 본 hGABABR1a/R2 헤테로다이머 클론에서는 두개의 리간드와의 작용제 결합이 검출되었다. 포화 실험에서 3H-바클로펜, 3H-GABA, 및 3H-CGP54626에 대한 Kd를 측정하고 조직 시료에서 수득된 공개된 결과와 비교하였다(표 1).
Figure 112006013371094-PCT00014
작용제에 대한 효능의 순서는 AMPA > GABA > 바클로펜이고, 길항제의 경우에는 CGP54626 > SCH50911이었다(도 2). 수득한 IC50는 상이한 막 시료 사이에서 재현가능하였다(도 3).
전체 실험실 선별시 본 발명자는 기준 화합물 GABA 및 바클로펜의 비교가능한 효능을 사용하여 결합 및 시그날 트랜스덕션 성질을 갖는 일부 화합물을 확인하였다(표 2).
Figure 112006013371094-PCT00015
표 2: 기준 화합물 및 HTS 히트에 대한 GABA 리간드 결합, 및 GTPγS 시그날 트랜스덕션 에세이에서의 pIC50 및 효능(%).
작용제 원심분리 결합 에세이 대체 결합 에세이에서 여과 대신 원심분리에 의해 막으로부터 비결합 리간드를 분리하였다. 단 10분동안 12500rpm에서 미세원심분리기에서 원심분리하여 비결합 리간드를 막으로부터 분리하는 것을 제외하고 앞 서 기술된 필터 결합 에세이에 따라 에세이를 수행하였다. 상등액을 버리고, 펠릿을 세척 완충액으로 세정하고 200㎕의 물에 용해시켰다. 섬광액을 가하고 결합된 3H-GABA를 Topcount (Packhard, 1분/웰)에서 측정하였다.
3H-GABA (최종 1-400nM)의 농도를 증가시킨 포화 에세이에서 본 발명자는 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주에 의해 발현된 GABAB 수용체는 친화력이 낮고 높은 결합 부위를 갖는다는 것을 발견하게 되었다. 포화 및 포화 분석 결과를 표 3에 요약하였다. 10μM의 GABAB 길항제 CGP54626 또는 본 발명의 GABAB 작용제중 하나(화합물 1)의 존재하에 포화 에세이를 수행하였을 때 친화력이 낮고 높은 결합 부위에 대한 3H-GABA 결합은 차단되었다(도 4a,b).
표 3
Figure 112006013371094-PCT00016
본 발명자가 아는 바로는, 필터 결합 에세이에서 고친화성 및 저친화성 결합 부위와의 작용제 결합을 나타내는 재조합 hGABAB 수용체에 대하여 앞서 보고된 바 없었다. HTS 작용제 필터 결합 선별이 3H-GABA를 사용하여 개발되었다. 본 발명자는 막 시료와는 무관한 공지된 작용제 및 길항제에 대한 재현가능한 Ki 값을 밝혀냈 다.
또한, 재조합 GABAB 수용체는 2개의 작용제 결합 부위, 고친화성 결합 부위 1개 및 저친화성 결합 부위 1개를 갖는 것으로 입증되었다. GABAB 수용체의 고친화성 작용제는 저친화성 작용제와 비교되는 상이한 반응을 유도할 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 세포는 GABAB 수용체를 확인할 수 있도록 할 뿐만 아니라, 화합물 수용체 상호작용의 성질을 특징화는 유용한 도구를 제공한다.
Figure 112006013371094-PCT00017
Figure 112006013371094-PCT00018
Figure 112006013371094-PCT00019
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Pharmaceutica N.V. <120> CHIMERIC GABAb RECEPTOR <130> PRD 2108 <150> PCT/ EP03/10263 <151> 2003-09-13 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 2886 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(2886) <223> <400> 1 atg ttg ctg ctg ctg cta ctg gcg cca ctc ttc ctc cgc ccc ccg ggc 48 Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Pro Leu Phe Leu Arg Pro Pro Gly 1 5 10 15 gcg ggc ggg gcg cag acc ccc aac gcc acc tca gaa ggt tgc cag atc 96 Ala Gly Gly Ala Gln Thr Pro Asn Ala Thr Ser Glu Gly Cys Gln Ile 20 25 30 ata cac ccg ccc tgg gaa ggg ggc atc agg tac cgg ggc ctg act cgg 144 Ile His Pro Pro Trp Glu Gly Gly Ile Arg Tyr Arg Gly Leu Thr Arg 35 40 45 gac cag gtg aag gct atc aac ttc ctg cca gtg gac tat gag att gag 192 Asp Gln Val Lys Ala Ile Asn Phe Leu Pro Val Asp Tyr Glu Ile Glu 50 55 60 tat gtg tgc cgg ggg gag cgc gag gtg gtg ggg ccc aag gtc cgc aag 240 Tyr Val Cys Arg Gly Glu Arg Glu Val Val Gly Pro Lys Val Arg Lys 65 70 75 80 tgc ctg gcc aac ggc tcc tgg aca gat atg gac aca ccc agc cgc tgt 288 Cys Leu Ala Asn Gly Ser Trp Thr Asp Met Asp Thr Pro Ser Arg Cys 85 90 95 gtc cga atc tgc tcc aag tct tat ttg acc ctg gaa aat ggg aag gtt 336 Val Arg Ile Cys Ser Lys Ser Tyr Leu Thr Leu Glu Asn Gly Lys Val 100 105 110 ttc ctg acg ggt ggg gac ctc cca gct ctg gac gga gcc cgg gtg gat 384 Phe Leu Thr Gly Gly Asp Leu Pro Ala Leu Asp Gly Ala Arg Val Asp 115 120 125 ttc cgg tgt gac ccc gac ttc cat ctg gtg ggc agc tcc cgg agc atc 432 Phe Arg Cys Asp Pro Asp Phe His Leu Val Gly Ser Ser Arg Ser Ile 130 135 140 tgt agt cag ggc cag tgg agc acc ccc aag ccc cac tgc cag gtg aat 480 Cys Ser Gln Gly Gln Trp Ser Thr Pro Lys Pro His Cys Gln Val Asn 145 150 155 160 cga acg cca cac tca gaa cgg cgc gca gtg tac atc ggg gca ctg ttt 528 Arg Thr Pro His Ser Glu Arg Arg Ala Val Tyr Ile Gly Ala Leu Phe 165 170 175 ccc atg agc ggg ggc tgg cca ggg ggc cag gcc tgc cag ccc gcg gtg 576 Pro Met Ser Gly Gly Trp Pro Gly Gly Gln Ala Cys Gln Pro Ala Val 180 185 190 gag atg gcg ctg gag gac gtg aat agc cgc agg gac atc ctg ccg gac 624 Glu Met Ala Leu Glu Asp Val Asn Ser Arg Arg Asp Ile Leu Pro Asp 195 200 205 tat gag ctc aag ctc atc cac cac gac agc aag tgt gat cca ggc caa 672 Tyr Glu Leu Lys Leu Ile His His Asp Ser Lys Cys Asp Pro Gly Gln 210 215 220 gcc acc aag tac cta tat gag ctg ctc tac aac gac cct atc aag atc 720 Ala Thr Lys Tyr Leu Tyr Glu Leu Leu Tyr Asn Asp Pro Ile Lys Ile 225 230 235 240 atc ctt atg cct ggc tgc agc tct gtc tcc acg ctg gtg gct gag gct 768 Ile Leu Met Pro Gly Cys Ser Ser Val Ser Thr Leu Val Ala Glu Ala 245 250 255 gct agg atg tgg aac ctc att gtg ctt tcc tat gga tcc agc tca cca 816 Ala Arg Met Trp Asn Leu Ile Val Leu Ser Tyr Gly Ser Ser Ser Pro 260 265 270 gcc ctg tca aac cgg cag cgt ttc ccc act ttc ttc cga acg cac cca 864 Ala Leu Ser Asn Arg Gln Arg Phe Pro Thr Phe Phe Arg Thr His Pro 275 280 285 tca gcc aca ctc cac aac cct acc cgc gtg aaa ctc ttt gaa aag tgg 912 Ser Ala Thr Leu His Asn Pro Thr Arg Val Lys Leu Phe Glu Lys Trp 290 295 300 ggc tgg aag aag att gct acc atc cag cag acc act gag gtc ttc act 960 Gly Trp Lys Lys Ile Ala Thr Ile Gln Gln Thr Thr Glu Val Phe Thr 305 310 315 320 tcg act ctg gac gac ctg gag gaa cga gtg aag gag gct gga att gag 1008 Ser Thr Leu Asp Asp Leu Glu Glu Arg Val Lys Glu Ala Gly Ile Glu 325 330 335 att act ttc cgc cag agt ttc ttc tca gat cca gct gtg ccc gtc aaa 1056 Ile Thr Phe Arg Gln Ser Phe Phe Ser Asp Pro Ala Val Pro Val Lys 340 345 350 aac ctg aag cgc cag gat gcc cga atc atc gtg gga ctt ttc tat gag 1104 Asn Leu Lys Arg Gln Asp Ala Arg Ile Ile Val Gly Leu Phe Tyr Glu 355 360 365 act gaa gcc cgg aaa gtt ttt tgt gag gtg tac aag gag cgt ctc ttt 1152 Thr Glu Ala Arg Lys Val Phe Cys Glu Val Tyr Lys Glu Arg Leu Phe 370 375 380 ggg aag aag tac gtc tgg ttc ctc att ggg tgg tat gct gac aat tgg 1200 Gly Lys Lys Tyr Val Trp Phe Leu Ile Gly Trp Tyr Ala Asp Asn Trp 385 390 395 400 ttc aag atc tac gac cct tct atc aac tgc aca gtg gat gag atg act 1248 Phe Lys Ile Tyr Asp Pro Ser Ile Asn Cys Thr Val Asp Glu Met Thr 405 410 415 gag gcg gtg gag ggc cac atc aca act gag att gtc atg ctg aat cct 1296 Glu Ala Val Glu Gly His Ile Thr Thr Glu Ile Val Met Leu Asn Pro 420 425 430 gcc aat acc cgc agc att tcc aac atg aca tcc cag gaa ttt gtg gag 1344 Ala Asn Thr Arg Ser Ile Ser Asn Met Thr Ser Gln Glu Phe Val Glu 435 440 445 aaa cta acc aag cga ctg aaa aga cac cct gag gag aca gga ggc ttc 1392 Lys Leu Thr Lys Arg Leu Lys Arg His Pro Glu Glu Thr Gly Gly Phe 450 455 460 cag gag gca ccg ctg gcc tat gat gcc atc tgg gcc ttg gca ctg gcc 1440 Gln Glu Ala Pro Leu Ala Tyr Asp Ala Ile Trp Ala Leu Ala Leu Ala 465 470 475 480 ctg aac aag aca tct gga gga ggc ggc cgt tct ggt gtg cgc ctg gag 1488 Leu Asn Lys Thr Ser Gly Gly Gly Gly Arg Ser Gly Val Arg Leu Glu 485 490 495 gac ttc aac tac aac aac cag acc att acc gac caa atc tac cgg gca 1536 Asp Phe Asn Tyr Asn Asn Gln Thr Ile Thr Asp Gln Ile Tyr Arg Ala 500 505 510 atg aac tct tcg tcc ttt gag ggt gtc tct ggc cat gtg gtg ttt gat 1584 Met Asn Ser Ser Ser Phe Glu Gly Val Ser Gly His Val Val Phe Asp 515 520 525 gcc agc ggc tct cgg atg gca tgg acg ctt atc gag cag ctt cag ggt 1632 Ala Ser Gly Ser Arg Met Ala Trp Thr Leu Ile Glu Gln Leu Gln Gly 530 535 540 ggc agc tac aag aag att ggc tac tat gac agc acc aag gat gat ctt 1680 Gly Ser Tyr Lys Lys Ile Gly Tyr Tyr Asp Ser Thr Lys Asp Asp Leu 545 550 555 560 tcc tgg tcc aaa aca gat aaa tgg att gga ggg tcc ccc cca gct gac 1728 Ser Trp Ser Lys Thr Asp Lys Trp Ile Gly Gly Ser Pro Pro Ala Asp 565 570 575 cag acc ctg gtc atc aag aca ttc cgc ttc ctg tca cag aaa ctc ttt 1776 Gln Thr Leu Val Ile Lys Thr Phe Arg Phe Leu Ser Gln Lys Leu Phe 580 585 590 atc tcc gtc tca gtt ctc tcc agc ctg ggc att gtc cta gct gtt gtc 1824 Ile Ser Val Ser Val Leu Ser Ser Leu Gly Ile Val Leu Ala Val Val 595 600 605 tgt ctg tcc ttt aac atc tac aac tca cat gtc cgt tat atc cag aac 1872 Cys Leu Ser Phe Asn Ile Tyr Asn Ser His Val Arg Tyr Ile Gln Asn 610 615 620 tca cag ccc aac ctg aac aac ctg act gct gtg ggc tgc tca ctg gct 1920 Ser Gln Pro Asn Leu Asn Asn Leu Thr Ala Val Gly Cys Ser Leu Ala 625 630 635 640 tta gct gct gtc ttc ccc ctg ggg ctc gat ggt tac cac att ggg agg 1968 Leu Ala Ala Val Phe Pro Leu Gly Leu Asp Gly Tyr His Ile Gly Arg 645 650 655 aac cag ttt cct ttc gtc tgc cag gcc cgc ctc tgg ctc ctg ggc ctg 2016 Asn Gln Phe Pro Phe Val Cys Gln Ala Arg Leu Trp Leu Leu Gly Leu 660 665 670 ggc ttt agt ctg ggc tac ggt tcc atg ttc acc aag att tgg tgg gtc 2064 Gly Phe Ser Leu Gly Tyr Gly Ser Met Phe Thr Lys Ile Trp Trp Val 675 680 685 cac acg gtc ttc aca aag aag gaa gaa aag aag gag tgg agg aag act 2112 His Thr Val Phe Thr Lys Lys Glu Glu Lys Lys Glu Trp Arg Lys Thr 690 695 700 ctg gaa ccc tgg aag ctg tat gcc aca gtg ggc ctg ctg gtg ggc atg 2160 Leu Glu Pro Trp Lys Leu Tyr Ala Thr Val Gly Leu Leu Val Gly Met 705 710 715 720 gat gtc ctc act ctc gcc atc tgg cag atc gtg gac cct ctg cac cgg 2208 Asp Val Leu Thr Leu Ala Ile Trp Gln Ile Val Asp Pro Leu His Arg 725 730 735 acc att gag aca ttt gcc aag gag gaa cct aag gaa gat att gac gtc 2256 Thr Ile Glu Thr Phe Ala Lys Glu Glu Pro Lys Glu Asp Ile Asp Val 740 745 750 tct att ctg ccc cag ctg gag cat tgc agc tcc agg aag atg aat aca 2304 Ser Ile Leu Pro Gln Leu Glu His Cys Ser Ser Arg Lys Met Asn Thr 755 760 765 tgg ctt ggc att ttc tat ggt tac aag ggg ctg ctg ctg ctg ctg gga 2352 Trp Leu Gly Ile Phe Tyr Gly Tyr Lys Gly Leu Leu Leu Leu Leu Gly 770 775 780 atc ttc ctt gct tat gag acc aag agt gtg tcc act gag aag atc aat 2400 Ile Phe Leu Ala Tyr Glu Thr Lys Ser Val Ser Thr Glu Lys Ile Asn 785 790 795 800 gat cac cgg gct gtg ggc atg gct atc tac aat gtg gca gtc ctg tgc 2448 Asp His Arg Ala Val Gly Met Ala Ile Tyr Asn Val Ala Val Leu Cys 805 810 815 ctc atc act gct cct gtc acc atg att ctg tcc agc cag cag gat gca 2496 Leu Ile Thr Ala Pro Val Thr Met Ile Leu Ser Ser Gln Gln Asp Ala 820 825 830 gcc ttt gcc ttt gcc tct ctt gcc ata gtt ttc tcc tcc tat atc act 2544 Ala Phe Ala Phe Ala Ser Leu Ala Ile Val Phe Ser Ser Tyr Ile Thr 835 840 845 ctt gtt gtg ctc ttt gtg ccc aag atg cgc agg ctg atc acc cga ggg 2592 Leu Val Val Leu Phe Val Pro Lys Met Arg Arg Leu Ile Thr Arg Gly 850 855 860 gaa tgg cag tcg gag gcg cag gac acc atg aag aca ggg tca tcg acc 2640 Glu Trp Gln Ser Glu Ala Gln Asp Thr Met Lys Thr Gly Ser Ser Thr 865 870 875 880 aac aac aac gag gag gag aag tcc cgg ctg ttg gag aag gag aac cgt 2688 Asn Asn Asn Glu Glu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Glu Lys Glu Asn Arg 885 890 895 gaa ctg gaa aag atc att gct gag aaa gag gag cgt gtc tct gaa ctg 2736 Glu Leu Glu Lys Ile Ile Ala Glu Lys Glu Glu Arg Val Ser Glu Leu 900 905 910 cgc cat caa ctc cag tct cgg cag cag ctc cgc tcc cgg cgc cac cca 2784 Arg His Gln Leu Gln Ser Arg Gln Gln Leu Arg Ser Arg Arg His Pro 915 920 925 ccg aca ccc cca gaa ccc tct ggg ggc ctg ccc agg gga ccc cct gag 2832 Pro Thr Pro Pro Glu Pro Ser Gly Gly Leu Pro Arg Gly Pro Pro Glu 930 935 940 ccc ccc gac cgg ctt agc tgt gat ggg agt cga gtg cat ttg ctt tat 2880 Pro Pro Asp Arg Leu Ser Cys Asp Gly Ser Arg Val His Leu Leu Tyr 945 950 955 960 aag tga 2886 Lys <210> 2 <211> 961 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Pro Leu Phe Leu Arg Pro Pro Gly 1 5 10 15 Ala Gly Gly Ala Gln Thr Pro Asn Ala Thr Ser Glu Gly Cys Gln Ile 20 25 30 Ile His Pro Pro Trp Glu Gly Gly Ile Arg Tyr Arg Gly Leu Thr Arg 35 40 45 Asp Gln Val Lys Ala Ile Asn Phe Leu Pro Val Asp Tyr Glu Ile Glu 50 55 60 Tyr Val Cys Arg Gly Glu Arg Glu Val Val Gly Pro Lys Val Arg Lys 65 70 75 80 Cys Leu Ala Asn Gly Ser Trp Thr Asp Met Asp Thr Pro Ser Arg Cys 85 90 95 Val Arg Ile Cys Ser Lys Ser Tyr Leu Thr Leu Glu Asn Gly Lys Val 100 105 110 Phe Leu Thr Gly Gly Asp Leu Pro Ala Leu Asp Gly Ala Arg Val Asp 115 120 125 Phe Arg Cys Asp Pro Asp Phe His Leu Val Gly Ser Ser Arg Ser Ile 130 135 140 Cys Ser Gln Gly Gln Trp Ser Thr Pro Lys Pro His Cys Gln Val Asn 145 150 155 160 Arg Thr Pro His Ser Glu Arg Arg Ala Val Tyr Ile Gly Ala Leu Phe 165 170 175 Pro Met Ser Gly Gly Trp Pro Gly Gly Gln Ala Cys Gln Pro Ala Val 180 185 190 Glu Met Ala Leu Glu Asp Val Asn Ser Arg Arg Asp Ile Leu Pro Asp 195 200 205 Tyr Glu Leu Lys Leu Ile His His Asp Ser Lys Cys Asp Pro Gly Gln 210 215 220 Ala Thr Lys Tyr Leu Tyr Glu Leu Leu Tyr Asn Asp Pro Ile Lys Ile 225 230 235 240 Ile Leu Met Pro Gly Cys Ser Ser Val Ser Thr Leu Val Ala Glu Ala 245 250 255 Ala Arg Met Trp Asn Leu Ile Val Leu Ser Tyr Gly Ser Ser Ser Pro 260 265 270 Ala Leu Ser Asn Arg Gln Arg Phe Pro Thr Phe Phe Arg Thr His Pro 275 280 285 Ser Ala Thr Leu His Asn Pro Thr Arg Val Lys Leu Phe Glu Lys Trp 290 295 300 Gly Trp Lys Lys Ile Ala Thr Ile Gln Gln Thr Thr Glu Val Phe Thr 305 310 315 320 Ser Thr Leu Asp Asp Leu Glu Glu Arg Val Lys Glu Ala Gly Ile Glu 325 330 335 Ile Thr Phe Arg Gln Ser Phe Phe Ser Asp Pro Ala Val Pro Val Lys 340 345 350 Asn Leu Lys Arg Gln Asp Ala Arg Ile Ile Val Gly Leu Phe Tyr Glu 355 360 365 Thr Glu Ala Arg Lys Val Phe Cys Glu Val Tyr Lys Glu Arg Leu Phe 370 375 380 Gly Lys Lys Tyr Val Trp Phe Leu Ile Gly Trp Tyr Ala Asp Asn Trp 385 390 395 400 Phe Lys Ile Tyr Asp Pro Ser Ile Asn Cys Thr Val Asp Glu Met Thr 405 410 415 Glu Ala Val Glu Gly His Ile Thr Thr Glu Ile Val Met Leu Asn Pro 420 425 430 Ala Asn Thr Arg Ser Ile Ser Asn Met Thr Ser Gln Glu Phe Val Glu 435 440 445 Lys Leu Thr Lys Arg Leu Lys Arg His Pro Glu Glu Thr Gly Gly Phe 450 455 460 Gln Glu Ala Pro Leu Ala Tyr Asp Ala Ile Trp Ala Leu Ala Leu Ala 465 470 475 480 Leu Asn Lys Thr Ser Gly Gly Gly Gly Arg Ser Gly Val Arg Leu Glu 485 490 495 Asp Phe Asn Tyr Asn Asn Gln Thr Ile Thr Asp Gln Ile Tyr Arg Ala 500 505 510 Met Asn Ser Ser Ser Phe Glu Gly Val Ser Gly His Val Val Phe Asp 515 520 525 Ala Ser Gly Ser Arg Met Ala Trp Thr Leu Ile Glu Gln Leu Gln Gly 530 535 540 Gly Ser Tyr Lys Lys Ile Gly Tyr Tyr Asp Ser Thr Lys Asp Asp Leu 545 550 555 560 Ser Trp Ser Lys Thr Asp Lys Trp Ile Gly Gly Ser Pro Pro Ala Asp 565 570 575 Gln Thr Leu Val Ile Lys Thr Phe Arg Phe Leu Ser Gln Lys Leu Phe 580 585 590 Ile Ser Val Ser Val Leu Ser Ser Leu Gly Ile Val Leu Ala Val Val 595 600 605 Cys Leu Ser Phe Asn Ile Tyr Asn Ser His Val Arg Tyr Ile Gln Asn 610 615 620 Ser Gln Pro Asn Leu Asn Asn Leu Thr Ala Val Gly Cys Ser Leu Ala 625 630 635 640 Leu Ala Ala Val Phe Pro Leu Gly Leu Asp Gly Tyr His Ile Gly Arg 645 650 655 Asn Gln Phe Pro Phe Val Cys Gln Ala Arg Leu Trp Leu Leu Gly Leu 660 665 670 Gly Phe Ser Leu Gly Tyr Gly Ser Met Phe Thr Lys Ile Trp Trp Val 675 680 685 His Thr Val Phe Thr Lys Lys Glu Glu Lys Lys Glu Trp Arg Lys Thr 690 695 700 Leu Glu Pro Trp Lys Leu Tyr Ala Thr Val Gly Leu Leu Val Gly Met 705 710 715 720 Asp Val Leu Thr Leu Ala Ile Trp Gln Ile Val Asp Pro Leu His Arg 725 730 735 Thr Ile Glu Thr Phe Ala Lys Glu Glu Pro Lys Glu Asp Ile Asp Val 740 745 750 Ser Ile Leu Pro Gln Leu Glu His Cys Ser Ser Arg Lys Met Asn Thr 755 760 765 Trp Leu Gly Ile Phe Tyr Gly Tyr Lys Gly Leu Leu Leu Leu Leu Gly 770 775 780 Ile Phe Leu Ala Tyr Glu Thr Lys Ser Val Ser Thr Glu Lys Ile Asn 785 790 795 800 Asp His Arg Ala Val Gly Met Ala Ile Tyr Asn Val Ala Val Leu Cys 805 810 815 Leu Ile Thr Ala Pro Val Thr Met Ile Leu Ser Ser Gln Gln Asp Ala 820 825 830 Ala Phe Ala Phe Ala Ser Leu Ala Ile Val Phe Ser Ser Tyr Ile Thr 835 840 845 Leu Val Val Leu Phe Val Pro Lys Met Arg Arg Leu Ile Thr Arg Gly 850 855 860 Glu Trp Gln Ser Glu Ala Gln Asp Thr Met Lys Thr Gly Ser Ser Thr 865 870 875 880 Asn Asn Asn Glu Glu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Glu Lys Glu Asn Arg 885 890 895 Glu Leu Glu Lys Ile Ile Ala Glu Lys Glu Glu Arg Val Ser Glu Leu 900 905 910 Arg His Gln Leu Gln Ser Arg Gln Gln Leu Arg Ser Arg Arg His Pro 915 920 925 Pro Thr Pro Pro Glu Pro Ser Gly Gly Leu Pro Arg Gly Pro Pro Glu 930 935 940 Pro Pro Asp Arg Leu Ser Cys Asp Gly Ser Arg Val His Leu Leu Tyr 945 950 955 960 Lys <210> 3 <211> 2823 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(2823) <223> <400> 3 atg gct tcc ccg cgg agc tcc ggg cag ccc ggg ccg ccg ccg ccg ccg 48 Met Ala Ser Pro Arg Ser Ser Gly Gln Pro Gly Pro Pro Pro Pro Pro 1 5 10 15 cca ccg ccg ccc gcg cgc ctg cta ctg cta ctg ctg ctg ccg ctg ctg 96 Pro Pro Pro Pro Ala Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu 20 25 30 ctg cct ctg gcg ccc ggg gcc tgg ggc tgg gcg cgg ggc gcc ccc cgg 144 Leu Pro Leu Ala Pro Gly Ala Trp Gly Trp Ala Arg Gly Ala Pro Arg 35 40 45 ccg ccg ccc agc agc ccg ccg ctc tcc atc atg ggc ctc atg ccg ctc 192 Pro Pro Pro Ser Ser Pro Pro Leu Ser Ile Met Gly Leu Met Pro Leu 50 55 60 acc aag gag gtg gcc aag ggc agc atc ggg cgc ggt gtg ctc ccc gcc 240 Thr Lys Glu Val Ala Lys Gly Ser Ile Gly Arg Gly Val Leu Pro Ala 65 70 75 80 gtg gaa ctg gcc atc gag cag atc cgc aac gag tca ctc ctg cgc ccc 288 Val Glu Leu Ala Ile Glu Gln Ile Arg Asn Glu Ser Leu Leu Arg Pro 85 90 95 tac ttc ctc gac ctg cgg ctc tat gac acg gag tgc gac aac gca aaa 336 Tyr Phe Leu Asp Leu Arg Leu Tyr Asp Thr Glu Cys Asp Asn Ala Lys 100 105 110 ggg ttg aaa gcc ttc tac gat gca ata aaa tac ggg ccg aac cac ttg 384 Gly Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Ala Ile Lys Tyr Gly Pro Asn His Leu 115 120 125 atg gtg ttt gga ggc gtc tgt cca tcc gtc aca tcc atc att gca gag 432 Met Val Phe Gly Gly Val Cys Pro Ser Val Thr Ser Ile Ile Ala Glu 130 135 140 tcc ctc caa ggc tgg aat ctg gtg cag ctt tct ttt gct gca acc acg 480 Ser Leu Gln Gly Trp Asn Leu Val Gln Leu Ser Phe Ala Ala Thr Thr 145 150 155 160 cct gtt cta gcc gat aag aaa aaa tac cct tat ttc ttt cgg acc gtc 528 Pro Val Leu Ala Asp Lys Lys Lys Tyr Pro Tyr Phe Phe Arg Thr Val 165 170 175 cca tca gac aat gcg gtg aat cca gcc att ctg aag ttg ctc aag cac 576 Pro Ser Asp Asn Ala Val Asn Pro Ala Ile Leu Lys Leu Leu Lys His 180 185 190 tac cag tgg aag cgc gtg ggc acg ctg acg caa gac gtt cag agg ttc 624 Tyr Gln Trp Lys Arg Val Gly Thr Leu Thr Gln Asp Val Gln Arg Phe 195 200 205 tct gag gtg cgg aat gac ctg act gga gtt ctg tat ggc gag gac att 672 Ser Glu Val Arg Asn Asp Leu Thr Gly Val Leu Tyr Gly Glu Asp Ile 210 215 220 gag att tca gac acc gag agc ttc tcc aac gat ccc tgt acc agt gtc 720 Glu Ile Ser Asp Thr Glu Ser Phe Ser Asn Asp Pro Cys Thr Ser Val 225 230 235 240 aaa aag ctg aag ggg aat gat gtg cgg atc atc ctt ggc cag ttt gac 768 Lys Lys Leu Lys Gly Asn Asp Val Arg Ile Ile Leu Gly Gln Phe Asp 245 250 255 cag aat atg gca gca aaa gtg ttc tgt tgt gca tac gag gag aac atg 816 Gln Asn Met Ala Ala Lys Val Phe Cys Cys Ala Tyr Glu Glu Asn Met 260 265 270 tat ggt agt aaa tat cag tgg atc att ccg ggc tgg tac gag cct tct 864 Tyr Gly Ser Lys Tyr Gln Trp Ile Ile Pro Gly Trp Tyr Glu Pro Ser 275 280 285 tgg tgg gag cag gtg cac acg gaa gcc aac tca tcc cgc tgc ctc cgg 912 Trp Trp Glu Gln Val His Thr Glu Ala Asn Ser Ser Arg Cys Leu Arg 290 295 300 aag aat ctg ctt gct gcc atg gag ggc tac att ggc gtg gat ttc gag 960 Lys Asn Leu Leu Ala Ala Met Glu Gly Tyr Ile Gly Val Asp Phe Glu 305 310 315 320 ccc ctg agc tcc aag cag atc aag acc atc tca gga aag act cca cag 1008 Pro Leu Ser Ser Lys Gln Ile Lys Thr Ile Ser Gly Lys Thr Pro Gln 325 330 335 cag tat gag aga gag tac aac aac aag cgg tca ggc gtg ggg ccc agc 1056 Gln Tyr Glu Arg Glu Tyr Asn Asn Lys Arg Ser Gly Val Gly Pro Ser 340 345 350 aag ttc cac ggg tac gcc tac gat ggc atc tgg gtc atc gcc aag aca 1104 Lys Phe His Gly Tyr Ala Tyr Asp Gly Ile Trp Val Ile Ala Lys Thr 355 360 365 ctg cag agg gcc atg gag aca ctg cat gcc agc agc cgg cac cag cgg 1152 Leu Gln Arg Ala Met Glu Thr Leu His Ala Ser Ser Arg His Gln Arg 370 375 380 atc cag gac ttc aac tac acg gac cac acg ctg ggc agg atc atc ctc 1200 Ile Gln Asp Phe Asn Tyr Thr Asp His Thr Leu Gly Arg Ile Ile Leu 385 390 395 400 aat gcc atg aac gag acc aac ttc ttc ggg gtc acg ggt caa gtt gta 1248 Asn Ala Met Asn Glu Thr Asn Phe Phe Gly Val Thr Gly Gln Val Val 405 410 415 ttc cgg aat ggg gag aga atg ggg acc att aaa ttt act caa ttt caa 1296 Phe Arg Asn Gly Glu Arg Met Gly Thr Ile Lys Phe Thr Gln Phe Gln 420 425 430 gac agc agg gag gtg aag gtg gga gag tac aac gct gtg gcc gac aca 1344 Asp Ser Arg Glu Val Lys Val Gly Glu Tyr Asn Ala Val Ala Asp Thr 435 440 445 ctg gag atc atc aat gac acc atc agg ttc caa gga tcc gaa cca cca 1392 Leu Glu Ile Ile Asn Asp Thr Ile Arg Phe Gln Gly Ser Glu Pro Pro 450 455 460 aaa gac aag acc atc atc ctg gag cag ctg cgg aag atc tcc cta cct 1440 Lys Asp Lys Thr Ile Ile Leu Glu Gln Leu Arg Lys Ile Ser Leu Pro 465 470 475 480 ctc tac agc atc ctc tct gcc ctc acc atc ctc ggg atg atc atg gcc 1488 Leu Tyr Ser Ile Leu Ser Ala Leu Thr Ile Leu Gly Met Ile Met Ala 485 490 495 agt gct ttt ctc ttc ttc aac atc aag aac cgg aat cag aag ctc ata 1536 Ser Ala Phe Leu Phe Phe Asn Ile Lys Asn Arg Asn Gln Lys Leu Ile 500 505 510 aag atg tcg agt cca tac atg aac aac ctt atc atc ctt gga ggg atg 1584 Lys Met Ser Ser Pro Tyr Met Asn Asn Leu Ile Ile Leu Gly Gly Met 515 520 525 ctc tcc tat gct tcc ata ttt ctc ttt ggc ctt gat gga tcc ttt gtc 1632 Leu Ser Tyr Ala Ser Ile Phe Leu Phe Gly Leu Asp Gly Ser Phe Val 530 535 540 tct gaa aag acc ttt gaa aca ctt tgc acc gtc agg acc tgg att ctc 1680 Ser Glu Lys Thr Phe Glu Thr Leu Cys Thr Val Arg Thr Trp Ile Leu 545 550 555 560 acc gtg ggc tac acg acc gct ttt ggg gcc atg ttt gca aag acc tgg 1728 Thr Val Gly Tyr Thr Thr Ala Phe Gly Ala Met Phe Ala Lys Thr Trp 565 570 575 aga gtc cac gcc atc ttc aaa aat gtg aaa atg aag aag aag atc atc 1776 Arg Val His Ala Ile Phe Lys Asn Val Lys Met Lys Lys Lys Ile Ile 580 585 590 aag gac cag aaa ctg ctt gtg atc gtg ggg ggc atg ctg ctg atc gac 1824 Lys Asp Gln Lys Leu Leu Val Ile Val Gly Gly Met Leu Leu Ile Asp 595 600 605 ctg tgt atc ctg atc tgc tgg cag gct gtg gac ccc ctg cga agg aca 1872 Leu Cys Ile Leu Ile Cys Trp Gln Ala Val Asp Pro Leu Arg Arg Thr 610 615 620 gtg gag aag tac agc atg gag ccg gac cca gca gga cgg gat atc tcc 1920 Val Glu Lys Tyr Ser Met Glu Pro Asp Pro Ala Gly Arg Asp Ile Ser 625 630 635 640 atc cgc cct ctc ctg gag cac tgt gag aac acc cat atg acc atc tgg 1968 Ile Arg Pro Leu Leu Glu His Cys Glu Asn Thr His Met Thr Ile Trp 645 650 655 ctt ggc atc gtc tat gcc tac aag gga ctt ctc atg ttg ttc ggt tgt 2016 Leu Gly Ile Val Tyr Ala Tyr Lys Gly Leu Leu Met Leu Phe Gly Cys 660 665 670 ttc tta gct tgg gag acc cgc aac gtc agc atc ccc gca ctc aac gac 2064 Phe Leu Ala Trp Glu Thr Arg Asn Val Ser Ile Pro Ala Leu Asn Asp 675 680 685 agc aag tac atc ggg atg agt gtc tac aac gtg ggg atc atg tgc atc 2112 Ser Lys Tyr Ile Gly Met Ser Val Tyr Asn Val Gly Ile Met Cys Ile 690 695 700 atc ggg gcc gct gtc tcc ttc ctg acc cgg gac cag ccc aat gtg cag 2160 Ile Gly Ala Ala Val Ser Phe Leu Thr Arg Asp Gln Pro Asn Val Gln 705 710 715 720 ttc tgc atc gtg gct ctg gtc atc atc ttc tgc agc acc atc acc ctc 2208 Phe Cys Ile Val Ala Leu Val Ile Ile Phe Cys Ser Thr Ile Thr Leu 725 730 735 tgc ctg gta ttc gtg ccg aag ctc atc acc ctg aga aca aac cca gat 2256 Cys Leu Val Phe Val Pro Lys Leu Ile Thr Leu Arg Thr Asn Pro Asp 740 745 750 gca gca acg cag aac agg cga ttc cag ttc act cag aat cag aag aaa 2304 Ala Ala Thr Gln Asn Arg Arg Phe Gln Phe Thr Gln Asn Gln Lys Lys 755 760 765 gaa gat tct aaa acg tcc acc tcg gtc acc agt gtg aac caa gcc agc 2352 Glu Asp Ser Lys Thr Ser Thr Ser Val Thr Ser Val Asn Gln Ala Ser 770 775 780 aca tcc cgc ctg gag ggc cta cag tca gaa aac cat cgc ctg cga atg 2400 Thr Ser Arg Leu Glu Gly Leu Gln Ser Glu Asn His Arg Leu Arg Met 785 790 795 800 aag atc aca gag ctg gat aaa gac ttg gaa gag gtc acc atg cag ctg 2448 Lys Ile Thr Glu Leu Asp Lys Asp Leu Glu Glu Val Thr Met Gln Leu 805 810 815 cag gac aca cca gaa aag acc acc tac att aaa cag aac cac tac caa 2496 Gln Asp Thr Pro Glu Lys Thr Thr Tyr Ile Lys Gln Asn His Tyr Gln 820 825 830 gag ctc aat gac atc ctc aac ctg gga aac ttc act gag agc aca gat 2544 Glu Leu Asn Asp Ile Leu Asn Leu Gly Asn Phe Thr Glu Ser Thr Asp 835 840 845 gga gga aag gcc att tta aaa aat cac ctc gat caa aat ccc cag cta 2592 Gly Gly Lys Ala Ile Leu Lys Asn His Leu Asp Gln Asn Pro Gln Leu 850 855 860 cag tgg aac aca aca gag ccc tct cga aca tgc aaa gat cct ata gaa 2640 Gln Trp Asn Thr Thr Glu Pro Ser Arg Thr Cys Lys Asp Pro Ile Glu 865 870 875 880 gat ata aac tct cca gaa cac atc cag cgt cgg ctg tcc ctc cag ctc 2688 Asp Ile Asn Ser Pro Glu His Ile Gln Arg Arg Leu Ser Leu Gln Leu 885 890 895 ccc atc ctc cac cac gcc tac ctc cca tcc atc gga ggc gtg gac gcc 2736 Pro Ile Leu His His Ala Tyr Leu Pro Ser Ile Gly Gly Val Asp Ala 900 905 910 agc tgt gtc agc ccc tgc gtc agc ccc acc gcc agc ccc cgc cac aga 2784 Ser Cys Val Ser Pro Cys Val Ser Pro Thr Ala Ser Pro Arg His Arg 915 920 925 cat gtg cca ccc tcc ttc cga gtc atg gtc tcg ggc ctg 2823 His Val Pro Pro Ser Phe Arg Val Met Val Ser Gly Leu 930 935 940 <210> 4 <211> 941 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Ser Pro Arg Ser Ser Gly Gln Pro Gly Pro Pro Pro Pro Pro 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ala Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu 20 25 30 Leu Pro Leu Ala Pro Gly Ala Trp Gly Trp Ala Arg Gly Ala Pro Arg 35 40 45 Pro Pro Pro Ser Ser Pro Pro Leu Ser Ile Met Gly Leu Met Pro Leu 50 55 60 Thr Lys Glu Val Ala Lys Gly Ser Ile Gly Arg Gly Val Leu Pro Ala 65 70 75 80 Val Glu Leu Ala Ile Glu Gln Ile Arg Asn Glu Ser Leu Leu Arg Pro 85 90 95 Tyr Phe Leu Asp Leu Arg Leu Tyr Asp Thr Glu Cys Asp Asn Ala Lys 100 105 110 Gly Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Ala Ile Lys Tyr Gly Pro Asn His Leu 115 120 125 Met Val Phe Gly Gly Val Cys Pro Ser Val Thr Ser Ile Ile Ala Glu 130 135 140 Ser Leu Gln Gly Trp Asn Leu Val Gln Leu Ser Phe Ala Ala Thr Thr 145 150 155 160 Pro Val Leu Ala Asp Lys Lys Lys Tyr Pro Tyr Phe Phe Arg Thr Val 165 170 175 Pro Ser Asp Asn Ala Val Asn Pro Ala Ile Leu Lys Leu Leu Lys His 180 185 190 Tyr Gln Trp Lys Arg Val Gly Thr Leu Thr Gln Asp Val Gln Arg Phe 195 200 205 Ser Glu Val Arg Asn Asp Leu Thr Gly Val Leu Tyr Gly Glu Asp Ile 210 215 220 Glu Ile Ser Asp Thr Glu Ser Phe Ser Asn Asp Pro Cys Thr Ser Val 225 230 235 240 Lys Lys Leu Lys Gly Asn Asp Val Arg Ile Ile Leu Gly Gln Phe Asp 245 250 255 Gln Asn Met Ala Ala Lys Val Phe Cys Cys Ala Tyr Glu Glu Asn Met 260 265 270 Tyr Gly Ser Lys Tyr Gln Trp Ile Ile Pro Gly Trp Tyr Glu Pro Ser 275 280 285 Trp Trp Glu Gln Val His Thr Glu Ala Asn Ser Ser Arg Cys Leu Arg 290 295 300 Lys Asn Leu Leu Ala Ala Met Glu Gly Tyr Ile Gly Val Asp Phe Glu 305 310 315 320 Pro Leu Ser Ser Lys Gln Ile Lys Thr Ile Ser Gly Lys Thr Pro Gln 325 330 335 Gln Tyr Glu Arg Glu Tyr Asn Asn Lys Arg Ser Gly Val Gly Pro Ser 340 345 350 Lys Phe His Gly Tyr Ala Tyr Asp Gly Ile Trp Val Ile Ala Lys Thr 355 360 365 Leu Gln Arg Ala Met Glu Thr Leu His Ala Ser Ser Arg His Gln Arg 370 375 380 Ile Gln Asp Phe Asn Tyr Thr Asp His Thr Leu Gly Arg Ile Ile Leu 385 390 395 400 Asn Ala Met Asn Glu Thr Asn Phe Phe Gly Val Thr Gly Gln Val Val 405 410 415 Phe Arg Asn Gly Glu Arg Met Gly Thr Ile Lys Phe Thr Gln Phe Gln 420 425 430 Asp Ser Arg Glu Val Lys Val Gly Glu Tyr Asn Ala Val Ala Asp Thr 435 440 445 Leu Glu Ile Ile Asn Asp Thr Ile Arg Phe Gln Gly Ser Glu Pro Pro 450 455 460 Lys Asp Lys Thr Ile Ile Leu Glu Gln Leu Arg Lys Ile Ser Leu Pro 465 470 475 480 Leu Tyr Ser Ile Leu Ser Ala Leu Thr Ile Leu Gly Met Ile Met Ala 485 490 495 Ser Ala Phe Leu Phe Phe Asn Ile Lys Asn Arg Asn Gln Lys Leu Ile 500 505 510 Lys Met Ser Ser Pro Tyr Met Asn Asn Leu Ile Ile Leu Gly Gly Met 515 520 525 Leu Ser Tyr Ala Ser Ile Phe Leu Phe Gly Leu Asp Gly Ser Phe Val 530 535 540 Ser Glu Lys Thr Phe Glu Thr Leu Cys Thr Val Arg Thr Trp Ile Leu 545 550 555 560 Thr Val Gly Tyr Thr Thr Ala Phe Gly Ala Met Phe Ala Lys Thr Trp 565 570 575 Arg Val His Ala Ile Phe Lys Asn Val Lys Met Lys Lys Lys Ile Ile 580 585 590 Lys Asp Gln Lys Leu Leu Val Ile Val Gly Gly Met Leu Leu Ile Asp 595 600 605 Leu Cys Ile Leu Ile Cys Trp Gln Ala Val Asp Pro Leu Arg Arg Thr 610 615 620 Val Glu Lys Tyr Ser Met Glu Pro Asp Pro Ala Gly Arg Asp Ile Ser 625 630 635 640 Ile Arg Pro Leu Leu Glu His Cys Glu Asn Thr His Met Thr Ile Trp 645 650 655 Leu Gly Ile Val Tyr Ala Tyr Lys Gly Leu Leu Met Leu Phe Gly Cys 660 665 670 Phe Leu Ala Trp Glu Thr Arg Asn Val Ser Ile Pro Ala Leu Asn Asp 675 680 685 Ser Lys Tyr Ile Gly Met Ser Val Tyr Asn Val Gly Ile Met Cys Ile 690 695 700 Ile Gly Ala Ala Val Ser Phe Leu Thr Arg Asp Gln Pro Asn Val Gln 705 710 715 720 Phe Cys Ile Val Ala Leu Val Ile Ile Phe Cys Ser Thr Ile Thr Leu 725 730 735 Cys Leu Val Phe Val Pro Lys Leu Ile Thr Leu Arg Thr Asn Pro Asp 740 745 750 Ala Ala Thr Gln Asn Arg Arg Phe Gln Phe Thr Gln Asn Gln Lys Lys 755 760 765 Glu Asp Ser Lys Thr Ser Thr Ser Val Thr Ser Val Asn Gln Ala Ser 770 775 780 Thr Ser Arg Leu Glu Gly Leu Gln Ser Glu Asn His Arg Leu Arg Met 785 790 795 800 Lys Ile Thr Glu Leu Asp Lys Asp Leu Glu Glu Val Thr Met Gln Leu 805 810 815 Gln Asp Thr Pro Glu Lys Thr Thr Tyr Ile Lys Gln Asn His Tyr Gln 820 825 830 Glu Leu Asn Asp Ile Leu Asn Leu Gly Asn Phe Thr Glu Ser Thr Asp 835 840 845 Gly Gly Lys Ala Ile Leu Lys Asn His Leu Asp Gln Asn Pro Gln Leu 850 855 860 Gln Trp Asn Thr Thr Glu Pro Ser Arg Thr Cys Lys Asp Pro Ile Glu 865 870 875 880 Asp Ile Asn Ser Pro Glu His Ile Gln Arg Arg Leu Ser Leu Gln Leu 885 890 895 Pro Ile Leu His His Ala Tyr Leu Pro Ser Ile Gly Gly Val Asp Ala 900 905 910 Ser Cys Val Ser Pro Cys Val Ser Pro Thr Ala Ser Pro Arg His Arg 915 920 925 His Val Pro Pro Ser Phe Arg Val Met Val Ser Gly Leu 930 935 940

Claims (29)

  1. GABAB 수용체가 고친화성의 작용제 결합 부위 1개 및 저친화성 작용제 결합 부위 1개를 갖는 것을 특징으로 하는, 적어도 하나의 GABABR1a 서브유니트 및 적어도 하나의 GABABR2 서브유니트를 포함하는, 분리된 GABAB 수용체 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, GABABR1a 서브유니트는 서열번호 1로 구성된 올리고뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고 GABABR2 서브유니트는 서열번호 3으로 구성된 올리고뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 GABAB 수용체 단백질.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 수탁 번호 LMBP 6046CB로, 2003년 8월 22일에 CHO-K1 h-GABA-b R1a/R2 클론 20으로서, 벨전 코디네이티드 콜렉션 오브 마이크로오거니즘(BCCM)에 기탁된 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주에 의해 발현된 GABAB 수용체 단백질.
  4. GABAB 수용체 작용제 또는 길항제를 확인하는 방법에서 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 따른 GABAB 수용체 단백질의 용도.
  5. 수탁 번호 LMBP 6046CB로, 2003년 8월 22일에 CHO-K1 h-GABA-b R1a/R2 클론 20으로서, 벨전 코디네이티드 콜렉션 오브 마이크로오거니즘(BCCM)에 기탁된 hGABABR1a/GABABR2 CHO 세포주.
  6. a) GABAB 수용체에 결합하는 것으로 공지되어 있는 화합물의 존재 및 부재하에서, 기능성 GABAB 수용체를 발현시키되, GABAB 수용체를 정상적으로 발현시키지 못하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키고,
    b) 기준 화합물로서 GABAB 수용체에 결합하는 것으로 공지된 화합물을 사용하여 시험 화합물과 GABAB 수용체의 결합을 측정하는 것을 포함하는, 시험 화합물이 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 따른 GABAB 수용체 단백질에 결합하는지를 확인하고, 이로써 GABAB 수용체의 효능있는 작용제인지 또는 길항제인지를 확인하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, GABAB 수용체에 결합하는 것으로 공지된 화합물을 검출가능하게 표지하고, 표지를 사용하여 GABAB 수용체와 시험 화합물의 결합을 측정하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, GABAB 수용체에 결합하는 것으로 공지된 화합물이 3H-GABA, 3H-바클로펜, 3H-3-APPA, 3H-CGP542626 및 3H-SCH50911로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  9. a) 시험 화합물의 존재 및 부재하에 기능성 GABAB 수용체를 발현시키되, GABAB 수용체를 정상적으로 발현시키지 못하는 세포를 표지된 GABAB 작용제에 노출시키고,
    b) 세포와 표지된 작용제의 결합을 측정하는 것을 포함하되, 표지된 작용제의 결합량이 시험 화합물 존재하에서 더욱 적은 경우, 화합물은 GABAB 수용체의 효능이 있는 작용제인, GABAB 수용체 작용제를 확인하는 방법.
  10. 제 10항에 있어서, 표지된 작용제가 3H-GABA, 3H-바클로펜 및 3H-3-APPA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  11. a) 시험 화합물의 존재 및 부재하에 기능성 GABAB 수용체를 발현시키되, GABAB 수용체를 정상적으로 발현시키지 못하는 세포를 표지된 GABAB 길항제에 노출 시키고,
    b) 세포와 표지된 길항제의 결합을 측정하는 것을 포함하되, 표지된 길항제의 결합량이 시험 화합물 존재하에서 더욱 적은 경우, 화합물은 GABAB 수용체의 효능이 있는 길항제인, GABAB 수용체 길항제를 확인하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 표지된 길항제가 3H-CGP542626 및 3H-SCH50911로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  13. a) 검출가능하게 표지된 GABAB 수용체의 작용제의 존재하에 제 5항에 따른 세포의 세포 조성물에 화합물을 투여하고,
    b) 표지된 작용제와 세포 조성물의 결합을 측정하는 것을 포함하되, 표지된 작용제의 결합량이 시험 화합물 존재하에서 더욱 적은 경우, 화합물은 GABAB 수용체의 효능이 있는 작용제인, GABAB 수용체 작용제로서 화합물을 확인하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 세포 조성물이 제 5항에 따른 세포의 막 분획으로 구성된 방법.
  15. 제 13항 또는 제 14항에 있어서, 표지된 작용제가 3H-GABA, 3H-바클로펜 및 3H-3-APPA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  16. a) 검출가능하게 표지된 GABAB 수용체의 길항제의 존재하에 제 5항에 따른 세포의 세포 조성물에 화합물을 투여하고,
    b) 표지된 길항제와 세포 조성물의 결합을 측정하는 것을 포함하되, 표지된 길항제의 결합량이 시험 화합물 존재하에서 더욱 적은 경우, 화합물은 GABAB 수용체의 효능이 있는 길항제인, GABAB 수용체 길항제로서 화합물을 확인하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 세포 조성물이 제 5항에 따른 세포의 막 분획으로 구성된 방법.
  18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 표지된 길항제가 3H-CGP542626 및 3H-SCH50911로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  19. a) GABAB 수용체의 활성화를 허용하는 조건하에서 기능성 GABAB 수용체를 발현시키되, GABAB 수용체를 정상적으로 발현시키지 못하는 세포를 적어도 하나의 기준 화합물과 접촉시키고;
    b) GABAB 수용체의 활성화를 허용하는 조건하에서 단계 a)의 세포와 시험 화합물을 접촉시키고,
    c) 시험 화합물이 기준 화합물과 비교되는 GABAB 수용체의 활성을 조절하는지를 측정하는 것을 포함하는, GABAB 수용체의 활성을 조절하는 능력을 갖는 화합물을 확인하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, GABAB 수용체의 활성을 조절하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법은 칼륨 흐름(current) 변화, 칼슘 농도 변화, cAMP 변화 및 GTPγS 결합 변화로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 작용 반응을 사용하여 측정되는 방법.
  21. a) GABAB 수용체의 활성화를 허용하는 조건하에 방사능표지된 GTPγS의 존재하에서 제 5항에 따른 세포의 막 분획을 시험하고자 하는 화합물과 접촉시키고,
    b) 막 분획과 GTPγS 결합을 측정하는 것을 포함하되,
    화합물의 존재하에 GTPγS 결합의 증가는 화합물이 GABAB 수용체 활성을 활성화시킨다는 것을 나타내는, GABAB 수용체 활성을 조절하는 능력을 갖는 화합물을 확인하는 방법.
  22. a) GABAB 수용체의 활성화를 허용하는 조건하에 방사능표지된 GTPγS의 존재하에서 제 5항에 따른 세포의 막 분획을 시험하고자 하는 화합물과 접촉시키고,
    b) 막 분획과 GTPγS 결합을 측정하는 것을 포함하되,
    화합물의 존재하에 GTPγS 결합의 감소는 화합물이 GABAB 수용체 활성을 불활성화시킨다는 것을 나타내는, GABAB 수용체 활성을 조절하는 능력을 갖는 화합물을 확인하는 방법.
  23. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, GABAB 수용체의 활성화를 허용하는 조건은GABAB 수용체 작용제의 존재를 포함하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, GABAB 수용체 작용제가 GABA, 바클로펜 및 3-APPA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  25. 근강직증후군, 위식도역류, 신경병, 실금과 같은 징후 치료, 및 기침 및 코카인 중독 치료용 약제의 제조에서, 하기 화학식(I)의 화합물, 그의 N-옥사이드 형태, 약제학적으로 허용가능한 부가염 및 입체화학적 이성체 형태의 용도:
    Figure 112006013371094-PCT00020
    상기 식에서,
    =Z1-Z2=Z3-Z4=는
    =N-CH=CH-N=(a), =N-CH=N-CH=(b), =CH-N=CH-N=(c), =CH-CH=CH-CH=(d),
    =N-CH=CH-CH=(e), =CH-N=CH-CH=(f), =CH-CH=N-CH=(g) 및 =CH-CH=CH-N=(h)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 2가 라디칼을 나타내고;
    R1은 수소, 할로, 하이드록실, 시아노, C1-6알킬, CF3, 아미노 또는 모노-또는 디(C1-4알킬)아미노를 나타내고;
    R2는 수소, C1-6알킬 또는 하이드록시카보닐-C1-6알킬-을 나타낸다.
  26. 일과성 하부식도괄약근이완(TLESR)을 저하시키는 약제의 제조에서 화학식(I)의 화합물의 용도.
  27. =Z1-Z2=Z3-Z4=가 (a), (b), 또는 (d)를 나타내거나, 더욱 바람직하게, =Z1-Z2=Z3-Z4=가 (d)를 나타내는 화학식(I)의 화합물.
  28. 제 27항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 화합물.
  29. 일과성 하부식도괄약근이완(TLESR)을 저하시키는 약제의 제조에서 제 27항에 따른 화합물의 용도.
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