JP2005500047A - Ｇタンパク質共役型レセプターＣｈｅｍＲ２３の天然リガンドとその使用 - Google Patents

Ｇタンパク質共役型レセプターＣｈｅｍＲ２３の天然リガンドとその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ誘導遺伝子２の生産物ポリペプチドで、Ｇ結合タンパクレセプター（ＧＰＣＲ）の天然リガンドとしてのＴＩＧ２の同定に関する。本発明は、Ｃｈｅｍ２３レセプターの活性をモジュレートする物質のスクリーニング分析としてのＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドとＴＩＧ２ポリペプチドの相互作用の使用に拡張する。また本発明は、ＣｈｅｍＲ２３／ＴＩＧ２相互作用に基づく診断分析方法、診断分析用キット、スクリーニング分析にも拡張される。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、オーファンＧタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）ＣｈｅｍＲ２３のための天然リガンドの同定とその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲｓ）は、細胞内でのシグナル伝達を担うタンパク質である。ＧＰＣＲｓは、通常、７回膜貫通型ドメインを有している。細胞外側部位又はＧＰＣＲのフラグメントへリガンドが結合すると、細胞内でシグナルが伝達され、その結果、細胞の生物学的または生理学的性質における変化すなわち細胞の挙動となる。ＧＰＣＲｓは、Ｇタンパク質及びエフェクター（細胞内酵素とＧタンパク質によってモジュレートされたチャネル）と一緒に、細胞内セカンドメッセンジャーの状態を細胞外への入力伝達に接続するモジュラーシグナリングシステムの構成要素である。
【０００３】
ＧＰＣＲ遺伝子および遺伝子産物は、様々な生理学上プロセスをモジュレートすることができ、疾病の原因物質である可能性がある。ＧＰＣＲｓは、中枢神経系及び抹消神経系双方に大変重要らしい。
【０００４】
ＧＰＣＲタンパク質スーパーファミリーは、５つのファミリーで表される：ファミリーＩはロドプシンやベータ２アドレナリンレセプターに代表されるレセプターや現在では２００を超える独特のメンバーによって代表されるレセプター；ファミリーＩＩは、副甲状腺ホルモン／カルシトニン／セクレチンレセプターファミリーであり；ファミリーＩＩＩは代謝刺激に反応するグルタミン酸塩レセプターであり；ファミリーＩＶはＣＡＭＰレセプターファミリーで化学走性及びD.discoideumの発育に重要であり；ファミリーＶはＳＴＥ２などの菌類交配フェロモンレセプターである。
【０００５】
Ｇタンパク質は、グアニンヌクレオチドに結合するα、β及びγサブユニットからなる３量体タンパク質のファミリーに代表される。これらのタンパク質は、通常、シグナル伝達のために細胞表面レセプター（７回膜貫通型ドメインを含むレセプター）に連結される。実際は、リガンドがＧＰＣＲに結合すると、Ｇタンパク質が構造変化して、これにより、αサブユニットに結合したＧＤＰ分子がＧＴＰ分子へ変換し、βγサブユニット群からαサブユニットを引き離す。
【０００６】
α，β及びγサブユニット群のＧＴＰ結合形は、典型的には、エフェクターモジュレーティング部分として機能し、セカンドメッセンジャーの産生を導く。セカンドメッセンジャーとしては、ｃＡＭＰ（例えばアデニルシクラーゼの活性化によって）やジアシルグリセロールやイノシトールフォスフェートなどがある。
【０００７】
２０以上の異なるタイプのα−サブユニットが、ヒトでは、知られている。これらのαサブユニットは、βサブユニットとγサブユニットの小さなプールと結合する。哺乳類のＧタンパク質としては、Ｇｉ，Ｇｏ，Ｇｑ，Ｇｓ及びＧｔがある。Ｇタンパク質は、Lodishら,Molecular Cell Biology（サイエンティフィック・アメリカンブックス社，ニュヨーク州ニューヨーク，1995年；及びDownesとGautam，1999年，The G‐Protein Subunit Gene Families. Genomics 62:544-552）に広範囲に説明されており、いずれの内容も参照により本明細書に組み入れられる。
【０００８】
知られているが特徴づけされていないＧＰＣＲｓは、現在のところ、薬剤の作用及び発達のための主たるターゲットとなる。予防薬としての可能性や治療特性を有する新規なアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニングに用いられることができる新しいＧタンパク質共役型レセプターの同定に努力し続けている。
【０００９】
３００以上のＧＰＣＲｓが、鼻腔レセプターファミリーを除いて、クローン化され確定している。機構上、臨床上関連ある全ての薬剤の約５０〜６０％は、様々なＧＰＣＲｓの機能をモジュレートすることによって作用している（Cudermannら,J.Mol.Med.,73:51-63,1995年）。
【００１０】
ＣｈｅｍＲ２３は、Ｄｅｚとも呼ばれ〔配列ＩＤ Ｎｏ：１（ヒトのポリヌクレオチド配列、図１）；２（ヒトのアミノ酸配列，図２）；３（マウスのポリヌクレオチド配列，図３）；４（マウスのアミノ酸配列，図３）；５（ラットのポリヌクレオチド配列；図４）；及び６（ラットのアミノ酸配列，図４）〕は、ＧＰＲ‐１（全体アミノ酸の３８％アイデンティティ）に関連するオーファンＧタンパク共役型レセプター、Ｃ３ａレセプター（３８％）、Ｃ５ａアナフィラトキシンレセプター（３６％）及びフォルミルＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅレセプター（３５％）として説明された。ＣｈｅｍＲ２３は、ケモカインレセプターサブファミリーともっと遠い関係にある（Methner A,Hermey G,Schinke B,Hermans‐Borgmeyer I.(1997年)Biochem Biophys Res Commun 233:336-42；Samson M,Edinger AL,Stordeur P,Rucker J,Verhasselt V,Sharron M, Govaerts C,Mollereau C,Vassart G,Doms RW,Parmentier M.(1998年)Eur J Immunol 28:1689-700）。ＣｈｅｍＲ２３転写物（トランスクリプト）は、ＬＰＳでの処理によりあるいは処理しなくても、モノサイト由来の樹枝状細胞及びマクロファージの中で多く見出される。また低発現であっても、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球の中で、逆転写ＰＣＲによって検出されることができる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験は、発育の間、骨組織及び軟骨組織の発達中の目立った発現を伴って、レセプターが特異的に制御されることを示した。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、また、ホスホカリック（phosphocalic）代謝中可能な機能を示すことも副甲状腺中で検出可能である。
【００１１】
ＣｈｅｍＲ２３をコードする遺伝子は、ヒト１２番染色体のｑ２１．２−２１．３領域、化学誘因物質レセプターのためにこれまでに同定された遺伝子クラスターの外側に、ラディエーションハイブリッドマッピングによって割り当てられた。ＣｈｅｍＲ２３は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶウィルス株の範囲によって、可能性あるコレセプター活性についての融合アッセイの中でテストされた。いくつかのＳＩＶ株（ＳＩＶｍａｃ３１６、ＳＩＶｍａｃ２３９、ＳＩＶｍａｃ１７Ｅ−Ｆｒ及びＳＩＶｓｍ６２Ａ）は、プライマリーＨＩＶ−１株（９２ＵＧ０２４−２）と同様に、コレセプターとして、ＣｈｅｍＲ２３を有効に用いた。従って、このレセプターは、ケモカインレセプターに属しない免疫欠損ウィルスに対するコレセプターらしい。これはまた、化学誘因物質レセプターと推定され、ロイコサイト細胞集団の採用又は買い付けに重要な役割を果たすだろう。
【００１２】
ＴＩＧ２（Tazarotene誘導遺伝子２〔配列ＩＤ Ｎｏ：７（ヒトＴＩＧ２ポリヌクレオチド配列、図６）；８（ヒトアミノ酸配列、図６）；９（マウスポリヌクレオチド配列、図７）；及び１０（マウスアミノ酸配列、図７）〕は、ｃＤＮＡとして同定された。このＴＩＧ２の発現は、皮膚のラフト培養の処理によって、レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）ベータ／ガンマ−選択のアンチ−乾癬合成レチノイドであるタザロテン（tazarotene）によって上向きに調節される〔ＡＧＮ１９０１６８／エチル６−〔２‐〔４，４ジメチルチオクロマンー６−イル〕−エチニル〕ニコチン酸塩〕（Nagpal S,Patel S,Jacobe H,DiSepio D,Ghosn C,Malhotra M,Teng M,Duvic M,Chandrantna RA.(1997年)J Invet Dermatol 109:91-5）。ＴＩＧ２の発現におけるレチノイド仲介上向き調節は、ノザンブロット分析によって確認された。ＴＩＧ２ｃＤＮＡは長さ８３０塩基対で、１６４アミノ酸からなる推定上のタンパク質産物をコードする。ＴＩＧ２は、ケラチノサイトと繊維芽細胞とが組織のような３次元構造を形成するときだけ、培地内で、タザロテンによって発現され、誘導される。ＲＡＲ特異的レチノイドも、ＴＩＧ２のｍＲＮＡレベルを増大させることも示された。逆に、ＲＸＲ特異的レチノイドも１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３も、これらの細胞内ではＴＩＧ２レベルを増大しなかった。ＴＩＧ２は、また非損傷乾癬肌の中では高レベルで発現されるが、乾癬損傷の中ではより低いレベルで発現され、その発現は、タザロテンの局所適用後に乾癬損傷の中で上向き調節される。更に、ＴＩＧ２は、破骨支持ストローマ細胞内で、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３とデキサメタゾンによって劇的に上向き調節されることが示された（Adams AE,Abu-Amer Y,Chappel J,Stueckle S,Ross FP,Teitelbaum SL,Suva LJ.(1999年)J Cell Biochem 74:587-95）。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
本発明は、ＴＩＧ２、すなわちタザロテン（Tazarotene）誘導遺伝子２のポリペプチド産物を、ＣｈｅｍＲ２３ ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役型レセプター：Ｇ−protein coupled receptor）の天然のリガンドとして、同定することに関する。本発明は、ＣｈｅｍＲ２３レセプターの活性をモジュレートする物質のスクリーニングアッセイの基礎として、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドとＴＩＧ２ポリペプチドとの相互作用の使用にも拡張する。また本発明は、ＣｈｅｍＲ２３／ＴＩＧ２相互作用に基づく診断分析に拡張されるとともに、診断分析及びスクリーニングアッセイを実行するためのキットにも拡張する。
【００１４】
本発明は、ＣｈｅｍＲ２３の機能をモジュレートする物質（以下「ＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質」という）の同定方法に拡張する。その方法は、ａ）ＴＩＧ２ポリペプチドがＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドへ結合するのを許す状態下で、候補モジュレーターの存在及び不在下で、ＣｈｅｍＲ２３とＴＩＧ２ポリペプチドとを接触させる工程；ｂ）ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのＴＩＧ２ポリペプチドへの結合を測定し、候補モジュレーターの不在下における結合に対して、候補モジュレーターの存在下における結合が減少していれば、候補モジュレーターを、ＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質として同定する工程を含む方法である。
【００１５】
本発明は、さらに、サンプル中で、当該サンプル中のＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質の存在を検出する方法に拡張する。この方法は、ａ）ＴＩＧ２ポリペプチドがＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに結合するのを許す状態下、サンプルの存在及び不在下で、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドとＴＩＧ２ポリペプチドとを接触させる工程；及びｂ）ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドとＴＩＧ２ポリペプチドとの結合を測定し、候補モジュレーターの不在下での結合に対して、サンプル存在下での結合が減少していれば、サンプル内にＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質が存在しているとする工程を含む方法である。
【００１６】
上記方法のいずれかの好ましい態様では、その測定工程は、ラベル置換，表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギートランスファー、蛍光消光、及び蛍光分極からなる群より選ばれる方法を用いて実行される。
【００１７】
本発明は、さらに、ＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質を同定する下記方法に拡張する。その方法は、ａ）候補モジュレーターの存在及び不在下でＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドとＴＩＧ２ポリペプチドとを接触させる工程；及びｂ）ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリング活性を測定し、候補モジュレーターの不在下でのシグナリング活性に対して、候補モジュレーターの存在下でのシグナリング活性が変化していれば、当該候補モジュレーターをＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質であると同定する工程を含む。
【００１８】
本発明は、さらに、ＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質の下記同定方法にも拡張する。その方法は、ａ）ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドと候補モジュレーターとを接触させ工程；ｂ）候補モジュレーターの存在下でＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリング活性を測定する工程；及びｃ）ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドとＴＩＧ２ポリペプチドとがそのＥＣ５０で接触しているサンプルにおいて測定された活性と、候補モジュレーターの存在下で測定された活性とを比較し、候補モジュレーターの存在下で測定された活性量がそのＥＣ５０で存在するＴＩＧ２ポリペプチドによって誘導される量の少なくとも５０％であるときに、その候補モジュレーターがＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質であると同定する工程を含む。
【００１９】
本発明は、さらにＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質の存在を、サンプル中で検出する下記方法に拡張する。その方法は、ａ）サンプルの存在及び不在下で、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドとＴＩＧ２ポリペプチドとを接触させる工程；ｂ）ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリング活性を測定する工程；及びｃ）サンプルなしでＣｈｅｍＲ２３とＴＩＧ２ポリペプチドを含む反応中で測定された活性量と、ＣｈｅｍＲ２３，ＴＩＧ２及び当該サンプルを含む反応中で測定された活性量とを比較し、当該サンプルの不在下での活性に対して、当該サンプルの存在下で活性が変化していれば、そのサンプルにおいて、ＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質が存在することを示しているとする工程を含む。
【００２０】
本発明は、さらに、サンプル中でＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質の存在を検出する下記方法に拡張する。その方法は、ａ）サンプルとＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドとを接触させる工程；ｂ）当該サンプルの存在下でＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリング活性を測定する工程：及びｃ）当該サンプルの存在下で測定されたシグナリング活性と、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドがそのＥＣ５０で存在しているＴＩＧ２ポリペプチドと接触している反応中で測定されたシグナリング活性とを比較し、そのサンプルの存在下で測定された活性量がそのＥＣ５０で存在するＴＩＧ２ポリペプチドによって誘導される量の少なくとも５０％であれば、ＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質が検出されたとする工程を含む。
【００２１】
上記各方法の好ましい態様では、ＴＩＧ２ポリペプチドは検出可能に標識されている。好ましくは、ＴＩＧ２ポリペプチドは、ラジオアイソトープ、発蛍光団、蛍光物質の消光剤、酵素、アフィニティタグ及びエピトープタグからなる群より選ばれる部分で検出可能に標識される。
【００２２】
上記いずれかの方法のある好ましい態様では、その接触工程は、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現している細胞内又は細胞上で行われる。
【００２３】
上記いずれかの方法の他の好ましい態様では、その接触工程は、合成リポソームの中又は合成リポソ−ム上で行われる（Tajibら，2000年,Nature Biotechnology 18:649-654参照、この文献は参照として本明細書に組み込まれる）あるいは、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを含むウィルス誘導された出芽している膜上でおこなわれる（WO0102551,2001年，参照として組み入れられる）。
【００２４】
上記いずれかの方法の他の好ましい態様では、その方法は、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現する細胞からの膜画分を用いて達成される。
【００２５】
他の態様において、当該物質（ＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質）は、ペプチド，ポリペプチド，抗体，その抗体の抗原結合フラグメント，脂質，炭水化物，核酸及び有機低分子からなる群より選ばれる。
【００２６】
他の態様において、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリング活性を測定する工程は、セカンドメッセンジャーのレベル変化を検出する工程を含む。
【００２７】
他の態様において、シグナリング活性の測定工程は、グアニンヌクレオチド結合又は変換，アデニレートシクラーゼ活性，ｃＡＭＰ，プロテインキナーゼＣ活性，フォスファチジルイノシトール（phosphatidylinosotol）分解，ジアシルグリセロール，イノシトール三燐酸，細胞内カルシウム，アラキノイド酸（arachinoid acid），ＭＡＰキナーゼ活性，チロシンキナーゼ活性，又はレポータ遺伝子発現を含む。
【００２８】
好ましい態様では、シグナリング活性の測定工程は、エクオリンベースアッセイの使用工程を含む。
【００２９】
本発明は、更に、細胞内でＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドの活性をモジュレートする方法に拡張する。その方法は、ＣｈｅｍＲ２３の活性がモジュレートされるような、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド活性をモジュレートする物質を細胞に配達する工程を含む。
【００３０】
さらに本発明は、ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患若しくは疾病の診断方法に拡張される。その方法は、ａ）ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに対して特異的な抗体と組織サンプルを接触させる工程；ｂ）その組織サンプルの抗体の結合を検出する工程；及びｃ）標準と工程（ｂ）で検出された結合とを比較し、その標準に対して結合に差があれば、ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患若しくは疾病の徴候であるとする工程を含む。
【００３１】
さらに本発明は、ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患若しくは疾病の下記診断方法に拡張される。その方法は、ａ）ＴＩＧ２ポリペプチドに対して特異的な抗体と組織サンプルを接触させる工程；ｂ）その組織サンプルの抗体の結合を検出する工程；及びｃ）標準と工程（ｂ）で検出された結合とを比較し、その標準に対して結合に差があれば、ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患若しくは疾病の徴候であるとする工程を含む。
【００３２】
本発明は更にＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の下記診断方法に拡張される。その方法は、ａ）組織サンプルと、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに特異的な抗体及びＴＩＧ２ポリペプチドに特異的な抗体とを接触させる工程；ｂ）前記抗体と前記組織サンプルとの結合を検出する工程；及びｃ）工程ｂ）で検出された結合と標準とを比較し、前記標準に対して、抗体の一方又は双方との結合に差があれば、ＣｈｅｍＲ２３の調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候であるとする工程を含む。
【００３３】
さらに本発明は、ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良によって特徴づけられる病気又は疾患の下記診断方法に拡張される。その方法は、ａ）組織サンプルから核酸を単離する工程；ｂ）鋳型としてその核酸を用いて、ＣｈｅｍＲ２３ポリヌクレオチドを増幅する工程；及びｃ）工程（ｂ）で生産されたＣｈｅｍＲ２３ポリヌクレオチドの増幅量と標準とを比較し、その標準に対して、ＣｈｅｍＲ２３ポリヌクレオチドの増幅量に差があれば、ＣｈｅｍＲ２３の調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候であるとする方法を含む。好ましい態様では、増幅工程は、ＲＴ／ＰＣＲを含む。他の好ましい態様においては、増幅量の比較工程がマイクロアレイ上で行われる。
【００３４】
本発明はさらに、ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の下記診断方法に拡張される。その方法は、ａ）ある組織サンプルから核酸を単離する工程；ｂ）鋳型としてその核酸を用いてＣｈｅｍＲ２３ポリヌクレオチドを増幅する工程；及びｃ）工程ｂ）で生産された増幅されたＣｈｅｍＲ２３ポリヌクレオチドの配列と標準とを比較し、当該標準に対してその配列に差異があれば、ＣｈｅｍＲ２３の調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の徴候であるとする工程を含む方法である。１つの好ましい態様においては、増幅工程には、ＲＴ／ＰＣＲを含む。他の好ましい態様では、前記標準は配列ＩＤ ＮＯ：１である。他の好ましい態様では、配列の比較工程は、ミニ配列決定（minisequensing）を含む。他の好ましい態様では、その配列比較工程は、マイクロアレイ上で行われる。
【００３５】
本発明は、さらに、ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良によって特徴づけられる病気又は疾患の診断方法に拡張される。その方法は、ａ）ある組織サンプルから核酸を単離する工程；ｂ）鋳型としてその核酸を用いて、ＴＩＧ２ポリヌクレオチドを増幅する工程；及びｃ）工程（ｂ）で生産されたＴＩＧ２ポリヌクレオチドの増幅量と標準とを比較し、標準に対してＴＩＧ２ポリペプチドの増幅量に差があれば、ＣｈｅｍＲ２３の調節不良によって特徴づけられる疾病又は疾患の徴候とする工程を含む。好ましい態様では、前記増幅工程は、ＲＴ／ＰＣＲを含む。他の好ましい態様では上記増幅量の比較工程は、マイクロアレイ上で行われる。
【００３６】
さらに本発明は、ＣｈｅｍＲ２３調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の下記診断方法に拡張される。この方法は、ａ）組織サンプルから核酸を単離する工程；ｂ）鋳型としてその核酸を用いてＴＩＧ２ポリヌクレオチドを増幅する工程；及びｃ）工程ｂ）で生産された増幅ＴＩＧ２ポリヌクレオチド配列と標準とを比較し、該標準に対して、当該配列に差異があれば、ＣｈｅｍＲ２３の調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候であるとする工程を含む。好ましい態様では、前記増幅工程は、ＲＴ／ＰＣＲを含む。他の好ましい態様では、前記標準は配列ＩＤ ＮＯ：７である。他の好ましい態様では、その比較工程は、ミニ配列決定（minisequencing）を含む。他の好ましい態様では、前記配列比較工程は、マイクロアレイ上で行われる。
【００３７】
本発明は、さらに単離されたＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドと単離されたＴＩＧ２ポリペプチドを含む組成物に拡張される。
【００３８】
本発明は、更に、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド又はＴＩＧ２ポリペプチドに特異的な抗体に拡張される。
【００３９】
本発明は、さらに、ＣｈｅｍＲ２３シグナリングをモジュレートする物質のスクリーニングキット、あるいはＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドの調節不良によって特徴づけられる疾患又は病気の診断スクリーニングキットであって、分離されたＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドとそのパッケージング材料を含むキットに拡張される。好ましい態様においては、そのキットは、さらにＴＩＧ２ポリペプチドを含む。本発明によれば診断キットは、例えば、組織サンプル又は組織サンプルから調整される抽出物がＴＩＧ２若しくはＣｈｅｍＲ２３のレベル若しくは活性が上昇するかどうかを決定することを許す。そのキットは、また、ＣｈｅｍＲ２３若しくはＴＩＧ２をコードする遺伝子における変異の同定及びＣｈｅｍＲ２３若しくはＴＩＧ２をコードする核酸の異常レベルの検出も許す。
【００４０】
本発明は、さらに、ＣｈｅｍＲ２３シグナリングをモジュレートする物質のスクリーニングキット又はＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドの調節不良によって特徴づけられる疾患又は病気の診断用のスクリーニングキットであって、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド及びそのパッケージング材料を含むキットに拡張される。好ましい態様では、そのキットは、さらにＴＩＧ２ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００４１】
本発明はさらに、ＣｈｅｍＲ２３シグナリングをモジュレートする物質のスクリーニングキット又はＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドの調節不良によって特徴づけられる疾患又は病気の診断用のスクリーニングキットであって、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞及びそのパッケージング材料を含むキットに拡張される。好ましい態様では、そのキットは、さらに、ＴＩＧ２ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド又はＴＩＧ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を含む。
【００４２】
本発明は、さらに、ＣｈｅｍＲ２３をコードする遺伝子内でのホモ接合型ヌル突然変異（null mutation）を有する非ヒト哺乳類に拡張される。
【００４３】
本発明は、さらにＣｈｅｍＲ２３ポリヌクレオチドのための非ヒト哺乳類のトランスジェニックに拡張される。
【００４４】
本発明は、さらに、ＴＩＧ２ポリヌクレオチドのための非ヒト哺乳類のトランスジェニックに拡張される。
【００４５】
ここで用いられている用語「ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド」は、２つの本質的特性を有するポリペプチドをいう。その２つの特性とは、１）ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：２と、少なくとも７０％のアミノ酸のアイデンティティ、好ましくは８０％，９０％，９５％又はこれ以上、１００％のアミノ酸のアイデンティティを含む、及び２）ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドはＣｈｅｍＲ２３活性を含む、すなわちポリペプチドはＴＩＧ２ポリペプチド又はその機能フラグメントに結合するという特性である。最も望ましくは、「ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド」は、また、ここで定義されるようなＣｈｅｍＲ２３シグナリング活性を有する。
【００４６】
ここで用いられる用語「ＣｈｅｍＲ２３ポリヌクレオチド」は、ここで定義されるＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをいう。
【００４７】
ここで用いられている用語「ＣｈｅｍＲ２３活性」は、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドによるＴＩＧ２ポリペプチド又はその機能フラグメントの特異的結合をいう。
【００４８】
ここで用いられている用語「ＣｈｅｍＲ２３シグナリング活性」は、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドによるシグナリングの開始又は増殖をいう。ＣｈｅｍＲ２３シグナリング活性は、以下の1又はそれ以上のものを分析することによってシグナリングカスケードにおいて検出され得る工程を測定することによってモニターされる。分析対象は、Ｇタンパク質上でのＧＴＰ変換のためのＧＤＰの刺激；アデニレートシクラーゼ活性の変更；プロテインキナーゼＣモジュレーション；ホスファチジルイノシトール分解（生じたセカンドメッセンジャーであるジアシルグリセロール及びイノシトール三リン酸）；細胞内カルシウムフラックス；ＭＡＰキナーゼの活性；チロシンキナーゼのモジュレーション；あるいは遺伝子又はレポータ遺伝子活性のモジュレーションである。もし測定可能な活性が、後述のＣｈｅｍＲ２３活性分析のいずれかに対して、ＴＩＧ２ポリペプチドの実質的不在下で作られるベースラインの１０％以上高く又は低く修正されるなら、シグナリングカスケードにおける検出可能な工程が、開始又は仲介と考えられる。測定可能な活性は、例えば、ｃＡＭＰ又はジアシルグリセロールレベルの測定において、直接測定されることができる。かわりに、その測定可能な活性は、例えばレポータ遺伝子分析において、間接的に測定されることができる。
【００４９】
ここで用いられている用語「検出可能な工程」は、例えば、セカンドメッセンジャーの測定又はモディファイ（例えばリン酸化）されたタンパク質の検出によって直接的に、あるいは例えばその工程の流れに沿って効果をモニターすることによって非直接的に、いずれかで測定されることができる工程をいう。例えば、アデニレートシクラーゼ活性は結果としてｃＡＭＰを生成する。アデニレートシクラーゼ活性は、例えば、分析におけるｃＡＭＰの産生をモニターする分析によって直接的に、あるいはｃＡＭＰの活性レベルの測定によって間接的に測定されることができる。
【００５０】
ここで、用いられている「単離された」という語は、違った性質の分子による汚染が５０（重量）％未満であり、好ましくは４０％未満であり、もっとも好ましくは２％以下である分子集団、例えばポリペプチド又はポリヌクレオチド，又は組成物をいう。用語「単離された」が、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに適用されるとき、とりわけ脂質膜に結合された又は脂質膜に埋設されたＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに拡張することを意味する。
【００５１】
ここで用いられている用語「ＴＩＧ２ポリペプチド」は、配列ＩＤ ＮＯ：８によって表されるポリペプチドと少なくとも３１％アイデンティティ（又は４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％またはほぼ１００％というようなアイデンティティ）を有するポリペプチドをいう。配列ＩＤ ＮＯ：８によって表されるポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：２の配列を有するＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに特異的に結合し、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリング活性を活性化する。用語「特異的結合」とは、ＴＩＧ２ポリペプチドがＥＣ５０，ＩＣ５０，１００ｍＭ以下のＫｄを有していることをいう。「ＴＩＧ２ポリペプチド」は、また上記定義にあうポリペプチドの断片をいう。ここで、その断片は、結合活性及び配列ＩＤ ＮＯ：８の全長ポリペプチドシグナリング活性のレベルの少なくとも５０％を保持している。最終的に得られるポリペプチドが、配列ＩＤ ＮＯ：８によって表される全長ポリペプチドの結合活性及びシグナリング活性の少なくとも５０％を保持する限りは、ＴＩＧ２ポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ８に対して、付加、挿入、欠失又は置換を含むことができる。１つの態様において、「ＴＩＧ２ポリペプチド」は、図１７で示される配列ＩＤ ＮＯ：４８の末端切断型ＴＩＧ２配列にさらに拡張される（図１７に示されたヌクレオチド配列は、末端切断されたＴＩＧ２ポリペプチドをコードするもので、配列ＩＤ ＮＯ：４９である）。
【００５２】
誘導体は、類似のポリペプチド、融合タンパク、またはその欠如でありえる。本発明は、配列ＩＤ ＮＯ：４８で表される末端切断のポリペプチドは、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに特異的に結合し、そのシグナリング伝達経路を活性化することを示す。従って、本発明は、また配列ＩＤ ＮＯ：４８で表される末端切断されたＴＩＧ２ポリペプチド配列；上記末端切断されたＴＩＧ２ポリペプチドまたはその誘導体をコードする配列ＩＤ ＮＯ：４９で表されるヌクレオチド配列にも関する。
【００５３】
配列ＩＤ ＮＯ：８又は図９（ＴＩＧ２）で表されるような配列と、配列ＩＤ ＮＯ：４８で与えられるような配列とを比べると、末端切断が「ＫＡＬＰＲＳ」−テールの欠失の中にあることが明確になる。ラットの配列は、「ＰＲＳ」−テールを喪失し、ｇａｌｌｕｓ配列は「ＲＳ」テール又は参照配列と考えられている配列に依存しているその「ＲＳ」テールの等価物を喪失している。この比較から、ＴＩＧ２ポリペプチドのＣ末端が長さを変更し得る証拠になる。本発明は、更に、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに関しては機能的ペプチドを結果として生じる上記テールにおけるさらなる欠失が存在しえることを提案する。従って、本発明は、さらに図１８に示される配列ＩＤ ＮＯ：５０乃至６０のいずれかで表されるＴＩＧ２関連ポリペプチドに関する。図９に従った番号で、部位１８−１９，１１１−１１２，１２２での挿入も可能である。
【００５４】
ＣｈｅｍＲ２３への結合及びＣｈｅｍＲ２３シグナリング活性の活性化に必要な配列に加えて、ＴＩＧ２ポリペプチドは、末端切断されたＴＩＧ２ポリペプチドも含めて、例えば、ＴＩＧ２融合タンパク質のような付加的配列を含むことができる。融合パートナーの制限のない例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルト−ス結合タンパク質、アルカリフォスファターゼ、チオレドキシン、緑の蛍光タンパク（ＧＦＰ）、ヒスチジンタグ（例えば、６Ｘまたはこれより大きいＨｉｓ）またはエピトープタグ（例えばＭｙｃタグ，ＦＬＡＧタグ）が含まれる。
【００５５】
ここで用いられている用語「ＴＩＧ２ポリヌクレオチド」は、ここで定義されているＴＩＧ２ポリペプチド又はその補体をコードするポリヌクレオチドをいう。「ＴＩＧ２ポリヌクレオチド」は、末端切断されたＴＩＧ２ポリペプチド、例えば図１７で示される末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドまたは図１８に示すようなポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列をいう。配列ＩＤ ＮＯ：４８によって表されるような末端切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、図１７で示され、配列ＩＤ ＮＯ：４９で表されている。各アミノ酸が当業者によって知られたヌクレオチドの特異的トリプレット（特異的セット）によってコードされ得ることから、図１８で示されるポリペプチド及び配列ＩＤ ＮＯ：５０〜６０のいずれかで表される。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当業者によって相当するアミノ酸配列から誘導され得る。
【００５６】
本発明はまた、上記で説明されるような方法によって同定または検出される物質に関する。さらに、本発明は、上記物質を含む組成物に関する。
【００５７】
本発明は、さらに本発明に従った物質及び組成物の薬物調製のための使用を意図する。；特に、ＣｈｅｍＲ２３に関連する病気又はＣｈｅｍＲ２３関連症の治療としての薬剤の調製を意図する。ここで上記疾病又は疾患には、癌、腫瘍転移、炎症性疾患、自己免疫疾患、受け継がれた又は獲得した免疫の欠損、骨粗鬆症、骨治癒、骨組織移植、移植片拒絶反応、乾癬、湿疹、皮膚の炎症性感染及び栄養疾患、ウイルス感染、バクテリア感染、寄生虫感染、女性の不育症、卵巣癌及び子宮ガンからなる群より選ばれることが好ましい。；あるいはＴＩＧ２関連疾患又はＴＩＧ２関連疾病の治療のための薬剤の調製のための物質又は組成物の使用を意図する。ここで、これらの疾患又は疾病は、骨粗鬆症、骨治癒、骨組織移植、移植片拒絶反応、乾癬、湿疹、炎症性感染及び皮膚の栄養疾患、ウイルス感染、バクテリア感染、寄生虫感染、女性の不育症、卵巣癌及び子宮ガンからなる群から選ばれるれことが好ましい。
【００５８】
本発明は、さらに、配列ＩＤ ＮＯ：４８によって表される末端切断ＴＩＧ２ペプチドに関する。または配列ＩＤ ＮＯ：５０〜６０のいずれかで表される末端切断ＴＩＧ２ペプチドに関する。上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体に関する。本発明は、さらに配列ＩＤ ＮＯ：４８で表される末端切断ＴＩＧ２ポリペプチドをコードする配列ＩＤ ＮＯ：４９によって表されるヌクレオチドに関する。
【００５９】
本発明は、また、末端切断ＴＩＧ２ポリペプチド又は上述のポリヌクレオチド配列の使用に関する。好ましくは、本発明によればある方法においての使用に関する。全長ＴＩＧ２ポリペプチド又はこの全長ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、また本発明の方法の一つで用いられてもよい。
【００６０】
本発明の末端切断ＴＩＧ２ポリペプチド又は全長ＴＩＧ２ポリペプチドは、単離されたＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド及び単離されたＴＩＧ２ポリペプチドを含む組成物の産生にも用いられることができる。かわりに、前記末端切断ＴＩＧ２ポリペプチドまたは全長ＴＩＧ２ポリペプチドは、抗体の産生のために、あるいはＣｈｅｍＲ２３のシグナリングをモジュレートする物質のスクリーニング試薬キットの生産のために、あるいはＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良によって特徴づけられる病気の診断用キット生産のために、用いられてもよい。
【００６１】
本発明は、ＣｈｅｍＲ２３のリガンドとして、上記末端切断されたＴＩＧ２ポリペプチド又は全長ＴＩＧ２ポリペプチドの使用にも関する。
【００６２】
さらに本発明は、上記末端切断されたＴＩＧ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はＣｈｅｍＲ２３に対するリガンドの生成のための全長ＴＩＧ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の使用に関する。
【００６３】
本発明はまた、末端切断されたＴＩＧ２の使用、本発明者によれば、薬剤生産のための全長ＴＩＧ２ポリペプチドの使用にも関する。上記薬剤は、ＣｈｅｍＲ２３関連の病気、又はＣｈｅｍＲ２３関連の疾病の治療にも適用されえる。ここで、上記疾病又は疾患は、好ましくは、癌、腫瘍転移、炎症性病気、自己免疫疾患、受け継がれた又は獲得した免疫の欠損、骨粗鬆症、骨治癒、骨組織移植、移植片拒絶反応、乾癬、湿疹、皮膚の炎症性感染及び栄養疾患、ウイルス感染、バクテリア感染、寄生虫感染、女性の不育症、卵巣癌及び子宮ガンからなる群より選ばれることが好ましい。；あるいは上記薬剤は、ＴＩＧ２関連疾患又はＴＩＧ２関連疾病の治療に適用されることができ、ＴＩＧ２関連疾患又は疾病は、骨粗鬆症、骨治療、骨組織移植術、移植片拒絶反応、乾癬、湿疹、炎症性感染及び皮膚の栄養疾患、ウイルス感染、バクテリア感染、寄生虫感染、女性の不育症、卵巣癌及び子宮ガンからなる群より選ばれる疾患又は疾病であることが好ましい。
【００６４】
ここで用いられている用語「候補化合物」及び「候補モジュレーター」は、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに結合するリガンドをモジュレートする能力又はＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドの活性をモジュレートする能力のために評価される組成物をいう。候補モジュレーターは、天然化合物又は合成化合物でありえる。例えば、低分子；動物、植物、バクテリア、又は菌類細胞の抽出物に含まれる化合物；これらの細胞からのならし培地も同様に含まれる。
【００６５】
ここで用いられている用語「低分子」とは、３０００ダルトン未満、好ましくは２０００または１５００未満、より好ましくは１０００ダルトン未満、最も好ましくは６００ダルトン未満の分子量を有する化合物をいう。「有機低分子」は炭素を含む低分子である。
【００６６】
ここで用いられる用語「結合の変化」又は「活性の変化」及び同意義の用語「結合の相違」又は「活性の相違」は、与えられた分析における結合またはシグナリング活性において少なくとも１０％増加又は減少することをいう。
【００６７】
ここで用いられている用語「ＣｈｅｍＲ２３とＴＩＧ２との結合を許容する条件」とは、例えば、ＴＩＧ２がＣｈｅｍＲ２３に結合する下での温度、塩濃度、ｐＨ、及びタンパク質濃度の条件をいう。正確な結合条件は、分析の特性に依存して変化する。例えばその分析が、生細胞又は細胞膜画分だけを用いるか否かにかかわらない。しかしながら、ＣｈｅｍＲ２３が細胞表面タンパク質であるから、またＴＩＧ２は細胞表面でＣｈｅｍＲ２３と相互作用する分泌ポリペプチドなので、好ましい条件は、一般に生理的な塩（９０ｍＭ）とｐＨ（約７．０乃至８．０）を含むだろう。結合のための温度は１５〜３７℃で変化でき、好ましくは室温と３０℃との間で変化する。反応系におけるＴＩＧ２及びＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドも変り、これらの濃度は、好ましくは約０．１ｐＭ（例えば放射性ラベルされたトレーサＴＩＧ２との反応において、その濃度が一般にＫｄ未満のとき）乃至１μＭ（例えば競争相手としてのＴＩＧ２）であろう。一例として、ＣｈｅｍＲ２３発現細胞及び精製され組替えられた標識ＴＩＧ２ポリペプチドを用いる結合分析では、０．１ｎＭの標識ＴＩＧ２、１００ｎMのコールドＴＩＧ２及び２５０００細胞を用いて、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１ｍＭのＣａＣｌ２及び０．５％脂肪酸フリーＢＳＡからなる結合バッファー２５０μｌ中、２７℃で、結合が行われる。
【００６８】
ここで用いられている用語「サンプル」は、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドへの結合又はＣｈｅｍＲ２３のシグナリング活性をモジュレートする物質の存在のためにテストされる分子源をいう。サンプルは、環境のサンプル；動物、植物酵母若しくはバクテリア細胞若しくは組織の天然抽出物；臨床的サンプル；合成サンプル；あるいは組替え細胞又は発酵過程からのならし培地であり得る。用語「組織サンプル」は、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド、ＴＩＧ２ポリペプチド、ＣｈｅｍＲ２３若しくはＴＩＧ２をコードする核酸、又はＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのリガンド結合若しくは活性をモディファイする物質の存在、量、定性又は活性をテストされる組織をいう。
【００６９】
ここで用いられる「組織」は、生物の特定の機能を行う細胞の集合体である。ここで用いられている用語「組織」は、特定の生理学的領域からの細胞材料をいう。特定組織における細胞は、いくつかの異なる細胞タイプを含む。この制限のないサンプルは、さらに神経及びグリア細胞を含む脳組織も、毛細血管の内皮細胞及び血球、与えられた組織断片又はサンプルに含まれる全てであり得る。固体組織に加えて、用語「組織」は、血液のような非固体組織にも拡張されることを意図している。
【００７０】
ここで用いられている「膜画分」は、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを含む細胞脂質膜の調製物をいう。ここで用いられている用語として、「膜画分」は、膜に結合していない細胞構成成分の少なくとも一部（例えば少なくとも１０％、好ましくは１０％以上）が除去された細胞ホモゲネートと区別される。用語「膜に結合した」は、脂質膜の中に統合される、あるいは脂質膜の中に統合される成分と物理的に結合される細胞の構成成分に結合したことをいう。
【００７１】
ここで用いられている用語「結合の減少」は、ＴＩＧ２ポリペプチドの結合の少なくとも１０％の減少；あるいはここで説明されている結合分析の中で測定されたＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに対する他のアゴニストの結合の少なくとも１０％の減少をいう。
【００７２】
ここで用いられている用語「セカンドメッセンジャー」は、Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）の活性化によって濃度の変化を発生又は生じさせる分子で、ＧＰＣＲからのシグナル伝達に参加する分子をいう。セカンドメッセンジャーの制限のないサンプルは、ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸及び細胞内カルシウムを含む。用語「セカンドメッセンジャーのレベル変化」は、候補モジュレーターの不在下で行われる分析において検出される量に関して与えられるセカンドメッセンジャーの検出レベルの少なくとも１０％の増加又は減少をいう。
【００７３】
ここで用いられている「エクオリンベース分析」は、活性化されたＧＰＣＲｓによって誘導される細胞内カルシウムフラックスを測定するＧＰＣＲ活性のための分析をいう。ここで、細胞内カルシウムフラックスは、細胞の中で発現されるエクオリンの発光によって測定される。
【００７４】
ここで用いられている用語「結合」は、リガンド（例えばＴＩＧ２ポリペプチド）とレセプター（例えばＣｈｅｍＲ２３）の物理的連結をいう。この用語がここで用いられているように、もし、ＥＣ５０又は１００ｎＭ以下のＫｄ、一般に１００ｎＭ乃至１０ｐＭの領域で起これば、結合は「特異的」である。例えば、ＥＣ５０又はＫｄが１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、９５０ｐＭ、９００ｐＭ、８５０ｐＭ、８００ｐＭ、７５０ｐＭ、７００ｐＭ、６５０ｐＭ、６００ｐＭ、５５０ｐＭ、５００ｐＭ、４５０ｐＭ、４００ｐＭ、３５０ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、７５ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、１０ｐＭ以下であれば、結合は特異的である。
【００７５】
ここで用いられている「ＥＣ５０」は、ＴＩＧ２ポリペプチドの結合又は他のリガンドの結合及びＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドの機能的活性を含む与えられた活性での物質濃度が、同じ分析を用いて測定可能なＣｈｅｍＲ２３活性のための最大値の５０％のときをいう。換言すると、「ＥＣ５０」は、もっとアゴニストを添加しても増加しない活性量で１００％活性がセットされるとき、５０％活性を与える物質の濃度をいう。「ＴＩＧ２ポリペプチドのＥＣ５０」は、ＴＩＧ２ポリペプチドの同定とともに変わることに留意すべきである。例えば、種々のＴＩＧ２ポリペプチド（すなわち挿入、欠失、置換、または上記ＴＩＧ２ポリペプチドの定義を満足するこれらの変異体及びヒト以外の種からのＴＩＧ２分子を含む他のペプチドとの融合）は、野生型ＴＩＧ２より高いか低いかまたは等しい値のＥＣ５０を有する。従って、ＴＩＧ２の変異配列は、野生型ＴＩＧ２の配列ＩＤ ＮＯ８と異なるところでは、当業者は、従来方法に従ってＴＩＧ２の変異体のＥＣ５０を決めることができる。与えられたＴＩＧ２ポリペプチドのＥＣ５０は、ＣｈｅｍＲ２３応答が飽和又は最大となるまで少なくとも増大し続けるＴＩＧ２の投与量存在下でＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドの固定量の活性に対する分析を実行することによって測定され、そして、ＴＩＧ２ポリペプチドの濃度に対して測定されたＣｈｅｍＲ２３活性をプロットする。
【００７６】
ここで用いられている用語「ＩＣ５０」は、ＣｈｅｍＲ２３レセプターの最大活性を５０％減らすアンタゴニストまたは逆のアゴニストの濃度である。
【００７７】
ここで用いられている用語「検出可能に標識された」は、たやすく検出できる機能グループ（標識）を組み入れた構造的修飾を有する分子（例えばＴＩＧ２ポリペプチド又は他のＣｈｅｍＲ２３リガンド）の性質をいう。検出可能な標識には、蛍光化合物、等方性化合物、化学ルミネセンス化合物、量子ドットラベル、ビオチン、酵素、電子濃密試薬、及び抗血清又はモノクローナル抗体が有効であるためのハプテンやタンパクが含まれるが、これらに限定されない。検出の種々の手段には、スペクトル分析、光化学、放射性化学、生化学、免疫化学、または化学的手段が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
ここで用いられる用語「アフィニティタグ」は、興味ある分子（例えばＴＩＧ２ポリペプチドまたは他のＣｈｅｍＲ２３リガンド）に付着する標識で、標識を結合する試薬によって特異的に結合される可能性を、標識した分子に与える。アフィニティタグは、抗体のためのエピト−プ（「エピトープタグ」として既知）、ビオチン、６ＸＨｉｓ、及びＧＳＴを含むが、これらに限定されない。アフィニティタグは検出に用いられることができ、標識された種の精製のためにも用いられることができる。
【００７９】
ここで用いられている用語「結合の低下」は、既知または疑いあるモジュレーターを欠く分析で検出される結合に対して、ＣｈｅｍＲ２３の既知又は疑いあるモジュレーターを用いて与えられた分析で検出された結合量の少なくとも１０％の減少をいう。
【００８０】
ここで用いられている薬物又は薬剤に関して用いられるときの「配達（Delivering）」の語は、分析混合物に又は培地の細胞に、薬物又は薬剤を添加することを意味する。この用語は、動物に対する薬物又は薬剤の投与も意味する。このような投与は、例えば注射（例えば、滅菌生理食塩水又は滅菌水のような好適なキャリアにおける）またはインハレーション、または経口、経皮、直腸、膣又は薬物投与の他の共通のルートによってされることができる。
【００８１】
ここで用いられている用語「有効量」は、ここで定義されるＣｈｅｍＲ２３活性における変化（例えばＣｈｅｍＲ２３活性の少なくとも１０％の増加又は減少）をもたらすＣｈｅｍＲ２３モジュレーティング物質又は薬の量をいう。
【００８２】
ここで用いられている用語「標準」は、ＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２活性の調節不良によって特徴付けられた疾患又は疾病によって影響されない個体から入手したサンプルをいう。この「標準」は、ＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２ポリペプチドあるいはｍＲＮＡレベルと質の比較（すなわち突然変異型ｖｓ野性型）のための参照として、ＣｈｅｍＲ２３活性の比較の参照の場合にも同様に用いられる。
【００８３】
ここで用いられている、核酸配列に適用するときの用語「増幅している」は、鋳型核酸から１以上の核酸配列のコピーが生産されるプロセスとみなす。好ましい「増幅」方法はＰＣＲ又は逆ＰＣＲ（ＲＴ／ＰＣＲ）である。
【００８４】
ここで用いられている用語「実質的不在」は、ここで開示されている又は当業者に既知の与えられている分析によって測定される少なくとも１０％、ＧＰＣＲ機能を活性化又は阻害するのに必要なレベルより低い活性レベル又は阻害因子をいう。
【００８５】
ここで用いられている用語「Ｇタンパク質共役型レセプター（Ｇ−protein Coupled receptor）」、すなわち「ＧＰＣＲ」は、７αヘリカル膜貫通ドメインを伴う膜関連（membrane-associated）ポリペプチドをいう。機能的なＧＰＣＲはリガンド又はアゴニストと結合し、また活性なＧタンパク質とも結合してＧタンパク質を活性化する。ＣｈｅｍＲ２３はＧＰＣＲである。
【００８６】
ここで用いられている用語「ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド機能モジュレート物質」とは、ＣｈｅｍＲ２３活性を増大又は低減する分子又は化合物であり、ＴＩＧ２ポリペプチド又は他のアゴニストの結合を変化させる化合物やＣｈｅｍＲ２３ダウンストリームシグナリング活性を変化させる化合物を含む。
【００８７】
ここで用いられている用語「トランスジェニック動物」は、当業者によく知られたトランスジェニック技術などによって、動物の１つ以上の細胞がヒトの仲介を通って導入されたヘテロ接合型核酸を含むいずれの動物をいい、動物としては好ましくは非ヒト哺乳類、鳥類、魚類、又は両生類をいう。この核酸は、マイクロインジェクション又は組換えウィルスを用いた感染などの意図的な遺伝的操作の手段により、細胞の前駆体の中への導入によって直接または間接的に、細胞内に組み入れられる。遺伝的操作という用語は、古典的な交配やインビトロでの受精は含まず、むしろ組替え体ＤＮＡ分子の導入に向けられている。この分子は、染色体内で統合されてもよく、染色体外でＤＮＡ複製していてもよい。ここで説明される典型的トランスジェニック動物は、トランス遺伝子が細胞に、被検ポリペプチドの１つの組換え形、例えばアゴニスト型又はアンタゴニスト型を発現させる。しかしながら、組換え遺伝子がサイレントになっているトランスジェニック動物は、例えば、下記で説明される構成体依存のＦＬＰ又はＣＲＥとして、意図される。さらに、「トランスジェニック動物」は、また、１以上の遺伝子の遺伝子分裂がヒトの仲介によってもたらされているこれらの組換え動物を含み、組換及びアンチセンス技術の双方を含む。
【００８８】
ここで用いられている「抗体」は、従来の免疫グロブリン分子であり、また、その支配下にあるポリペプチドの一つと特異的に反応もする抗体のフラグメントでもある。抗体は、従来技術及び抗体全体に対して明細書中に後で述べるのと同様の方法で、有用性のためにスクリーンされた断片を用いて断片化されることができる。例えば、Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、ペプシンを用いて抗体を処理することによって生産される。結果として生じるＦ（ａｂ）２フラグメントは、ジスルフィド架橋を減じる処理をすると、Ｆａｂフラグメントを生産することができる。本発明の抗体は、さらに二重特異的で単一鎖で、キメラで、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって与えられたポリペプチドに対して親和性を有するヒト化分子を含むことを意図する。好ましい態様では、抗体は、そこに結合された標識を含み、検出されることができる（例えば、その標識は放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、又は酵素コファクター）。
【００８９】
ここで用いられている用語「ヌル突然変異（null mutation）」は、ポリペプチドが発現されないように、ポリペプチドをコードする染色体の配列を修飾する挿入、欠失、又は置換をいう。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
図１は、ヒトＣｈｅｍＲ２３／Ｄｅｚｂ／ＣＭＫＲＬ１（ＡＣ０７５７４８）のヌクレオチド（配列ＩＤ ＮＯ：１）及びこれより導き出されたアミノ酸配列を示す。
【００９１】
図２は、ヒトＣｈｅｍＲ２３／Ｄｅｚｂ／ＣＭＫＲＬ１（３７１アミノ酸）（配列ＩＤ ＮＯ：２）のアミノ酸配列を示す。予言された７回膜貫通型ドメインはアンダーラインされている。Ｎ末端でＮリンクされたグリコシレーション（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）のための一致配列はボールドされ、Ｃ末端でのＰＫＣ（Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｒ／Ｋ）によるリン酸化のポテンシャル部位は、イタリックで示されている。
【００９２】
図３は、マウスＤｅｚであるマウスＣｈｅｍＲ２３（ＡＣｕ７９５２５）のオルソローグ（orthologue）のヌクレオチド（配列ＩＤ ＮＯ：３）及びこれから導き出されるアミノ酸配列（配列ＩＤ ＮＯ：４）を示している。
【００９３】
図４は、ラットＧタンパク質共役型化学誘引物質―１であるラットのＣｈｅｍＲ２３／Ｄｅｚｂ／ＣＭＫＲＬ１（ACNM_022218）のオルソローグ（orthologue）のヌクレオチド（配列ＩＤ ＮＯ：５）とこれから導き出されるアミノ酸配列（配列ＩＤ ＮＯ：６）を示している。
【００９４】
図５は、ＣｈｅｍＲ２３／Ｄｅｚｂ／ＣＭＫＲＬ１のアミノ酸配列とＡＴ２、Ｃ３ａ、ｃ５ａ及びｆＭＬＰレセプターの配列とClustalXアルゴリズムを用いて達成される選択されたケモカインレセプター配列との間での構造上の類似性を示している。ｆＭＬＰレセプターとも構造上の類似性を示している。その樹状図は、TreeViewアルゴリズムを用いて構成される。
【００９５】
図６は、ヒトＴＩＧ２（ACQ99969）のヌクレオチド（配列ＩＤ ＮＯ：７）及びこれから導き出されるアミノ酸配列（配列ＩＤ ＮＯ：８）を示している。
【００９６】
図７は、マウスＴＩＧ２の推定上のヌクレオチド（配列ＩＤ ＮＯ：９）及びこれから導き出されるアミノ酸配列（配列ＩＤ ＮＯ：１０）を示している。
【００９７】
図８は、ヒトのＴＩＧ２アミノ酸配列（配列ＩＤ ＮＯ：８）とマウスのＴＩＧ２アミノ酸配列（配列ＩＤ ＮＯ：１０）とを並べたものである。全く同一のアミノ酸と保存された進化部分は、ボックスで囲まれている。
【００９８】
図９は、ヒトのＴＩＧ２配列（≪ｔｉｇ２）≫配列ＩＤ ＮＯ：３１）、ラットのＴＩＧ２配列（配列ＩＤ ＮＯ：３２）、マウスのＴＩＧ２配列（配列ＩＤ ＮＯ：３３）、ｓｕｓＴＩＧ２配列（sus Scrofa）（配列ＩＤ ＮＯ：３４）、ｂｏｓのＴＩＧ２配列（BOS taurus）（配列ＩＤ ＮＯ：３５）、及びｇａｌｌｕｓのＴＩＧ２配列（Gallus gallus）（配列ＩＤ ＮＯ：３６）を示す。この図は、リストに挙げたいずれの２つの種も交差するアミノ酸のアイデンティティ％を提供する。
【００９９】
図１０は、腹水流体由来のＴＩＧ２の５番目の精製工程の部分的クロマトグラムを示している。先の工程の活性な画分（約２８％ＣＨ３ＣＮで溶出）は、Ｈ２Ｏ中の０．１％ＴＦＡで６倍に希釈され、Ｈ２Ｏ中の５％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡを用いて予め平衡化したＣ１８逆相カラム（１ｍｍ×５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ）上に、室温で０．１ｍｌ／ｍｉｎの流速で、直接ロードした。０．１％ＴＦＡ中で５−９５％グラディエントのＣＨ３ＣＮを、２５％と４５％の間で０．３％／ｍｉｎの傾きで適用する。その活性は、４０％ＣＨ３ＣＮで溶出された（黒の水平線によって示される）。
【０１００】
図１１は、ヒト卵巣腹水の分画化から得られるＨＰＬＣ画分のスクリーニングに続くＣｈｅｍＲ２３のための特異的応答の同定を示す。ヒト卵巣腹水の順流分画化で得られた異なる画分は、分析バッファ中で５倍に希釈され、ＣｈｅｍＲ２３を発現する細胞ライン（白丸）又は関係ないレセプターを発現する細胞ライン（黒三角及び黒四角）についてエクオリン分析でテストされた。各画分に対して得られた応答は、各細胞ラインのＡＴＰ応答を用いて規格化された。
【０１０１】
図１２は、ＴＩＧ２で一時的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のならし培地によるＣｈｅｍＲ２３の活性化を示す。２９３Ｔ細胞は、ｐｃＤＮＡ３−ＴＩＧ２又はｐｃＤＮＡ３だけで一時的にトランスフェクトされた（モックトランスフェクト（mock-transfented））。トランスフェクト後４日後に、集められた上澄み液の増加量が、ＣｈｅｍＲ２３を発現するＣＨＯ細胞を用いたエクオリンベース分析内でのマイクロルーマットを用いて分析された。この分析は、三つ組の中で行われ、ＳＤが示される。代表的実験が示される。
【０１０２】
図１３は、フローサイトメトリ−によってＣｈｅｍＲ２３に対して向けられた抗体の特徴づけを示す。２／３がＣｈｅｍＲ２３ＣＨＯ細胞組替え体と１／３がＨＣＲ ＣＨＯ細胞組替え体（ネガテイブコントロール）からなる組換え細胞の混合物は、抗ＣｈｅｍＲ２３ ５Ｃ１Ｈ２モノクローナル抗体の上澄み（太線）又は未知の抗体活性を伴う上澄み（薄線、グレー塗りつぶし）のいずれかと反応させる。ＦＩＴＣで標識した抗マウスＩｇで染色した後、これらの調製物が、フローサイトメトリーで分析された。結果は、与えられた蛍光（ＦＬ１−Ｈ軸）を発現する細胞数（イベント軸）のヒストグラムとして表される。モノクローナル５Ｃ１Ｈ２は、両タイプの細胞の相対割合によって明白にされるように、ネガティブコントロール細胞由来の細胞のＣｈｅｍＲ２３組替え体の亜集団を区別するのを許した。この分析のバックグラウンド蛍光は、２番目の染色（グレー塗りつぶし）によって与えられる。
【０１０３】
図１４は、実施例１１で説明されるように決められた、末端切断型ｈＴＩＧ２ポリペプチドによるＣｈｅｍＲ２３の活性化に対するＥＣ５０を示す。
【０１０４】
図１５は、実施例１０で説明されるように決められた、ｈＴＩＧ２のｍＲＮＡの組織配分を示す。
【０１０５】
図１６は、実施例１０で説明されるように、決められたＣｈｅｍＲ２３ｍＲＮＡの組織配分を示す。ＤＣはデンドライド細胞を表す。
【０１０６】
図１７は、末端切断型ヒトＴＩＧ２のポリペプチド（配列ＩＤ ＮＯ：４８）とポリヌクレオチド（配列ＩＤ ＮＯ：４９）を示す。
【０１０７】
図１８は、他の末端切断型ヒトＴＩＧ２ポリペプチド（配列ＩＤ ＮＯ５０乃至６０）のポリペプチド配列と、配列ＩＤ ＮＯ：４８のＴＩＧ２及び全長ＴＩＧ２（配列ＩＤ ＮＯ：８）との比較を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０８】
本発明の詳細な説明
本発明は、ＴＩＧ２ポリペプチドがオーファンＣｈｅｍＲ２３ ＧＰＣＲの天然リガンドであるという発見に関する。ＣｈｅｍＲ２３ＧＰＣＲとＴＩＧ２ポリペプチドの相互作用及びそのようなＣｈｅｍＲ２３の機能をモジュレートする物質のためのスクリーニング分析に、この相互作用は有用である。既知のリガンド及び当該リガンドレセプターとの相互作用は、また調節不良レセプター活性を含む状態の診断を提供する。
【０１０９】
Ｉ．ＣｈｅｍＲ２３の活性をモジュレートする物質の同定のための分析
レセプターのＴＩＧ２との相互作用を利用する多くの方法の中で、ＣｈｅｍＲ２３の活性をモジュレートする物質（ＣｈｅｍＲ２３活性モジュレーター物質）は、同定されることができる。例えば、インビトロでの培養細胞上又はインビボのいずれかでＣｈｅｍＲ２３／ＴＩＧ２結合を再構築する可能性は、その結合を分離する物質の同定のための標的を提供する。結合の分離に基づく分析は、そのような分子のライブラリー又はコレクションから、有機低分子のような物質を同定することができる。その代わりに、そのような分析は、サンプル又は天然源からの抽出物（例えば植物、菌類若しくはバクテリアの抽出物）又はヒト組織サンプル（例えば腫瘍組織）において、物質を同定することができる。ある面において、その抽出物は、種々の核酸、ペプチド、又は例えばＴＩＧ２ポリペプチド自体の変体を含むポリペプチドのライブラリーを発現する細胞から作られることができる。ＣｈｅｍＲ２３／ＴＩＧ２結合のモジュレーターが、そのとき、結合分析またはレセプターを通してのダウンストリームシグナリングを測定する機能的分析を用いてスクリーニングされることができる。結合分析及び機能分析の双方は、ＴＩＧ２ポリペプチドを用いて実証される。
【０１１０】
ＣｈｅｍＲ２３／ＴＩＧ２相互作用を用いてＣｈｅｍＲ２３機能をモジュレートする物質をもっと直接的に同定するもうひとつのアプローチは、候補物質又は候補モジュレーターによって誘導されるＣｈｅｍＲ２３ダウンストリームシグナリングの変化を測定する。これらの機能的分析は、単離された細胞膜画分またはこれらの表面でレセプターを発現する細胞上で行われることができる。
【０１１１】
以下の説明は、ＣｈｅｍＲ２３とＴＩＧ２の相互作用に基づく結合分析及び機能的分析の双方の方法を提供する。
【０１１２】
A ．ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド
ＣｈｅｍＲ２３とＴＩＧ２の相互作用を用いる分析は、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド源を要求する。ヒトＣｈｅｍＲ２３のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、本明細書の中で、配列ID NO：１及び２として示されている。ヒトＣｈｅｍＲ２３ポリヌクレオチド配列は、またジーンバンク（GenBank）承認Ｎｏ．Y14838で入手可能であり、Samsonら1998年、Eur.J.Immunol.28:1689-1700に報告され、この内容は本明細書に組み入れられる。ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド配列は、またスイスプロットデータベースの中の承認Ｎｏ．Ｏ７５７４８及びＣＡＡ７５１１２で記録されている。関連配列は、ＣＭＫＲＬ１（ジーンバンク承認Ｎｏ．XM_006864及びNM004072（ヌクレオチド配列）及びスイスプロット承認Ｎｏ．Q99788（ポリペプチド配列））、ヒトＤＥＺｂ（ジーンバンク承認Ｎｏ．U79527（ヌクレオチド配列））、ヒトＤＥＺａ（ジーンバンク承認Ｎｏ．U79526（ヌクレオチド配列）、マウスＤＥＺ（（ジーンバンク承認Ｎｏ．U79525（ヌクレオチド配列）及びスイスプロット承認Ｎｏ．P97468（ポリペプチド配列））及びラットＣｈｅｍＲ２３（ジーンバンク承認Ｎｏ．AJ002745（ヌクレオチド配列）とスイスプロット承認Ｎｏ．035786（ポリペプチド配列）。
【０１１３】
当業者は、基礎的なＰＣＲ及び既知配列からデザインされるプライマー又はプローブを用いた分子クローニング技術を通じて、タンパク質をコードするｍＲＮＡを含むサンプルからＣｈｅｍＲ２３配列をたやすく増幅することができる。
【０１１４】
組替え体ポリペプチドの発現は、その分野でよく知られている。当業者は、真核細胞又は原核細胞における発明に従うと有用であるＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドの発現に対するベクター及び発現コントロール配列をたやすく選択できる。ＣｈｅｍＲ２３は、結合またはシグナリング機能を有するために、細胞膜または合成リソゾームのような界面活性剤と連結されなければならない。細胞膜機能の調整方法は、その分野でよく知られている。例えば、Hubbard＆Cohn,1975年，J.cell Biol.64:461-479によって報告された方法であり、本明細書に参照として組み入れられる。ＣｈｅｍＲ２３を含む細胞膜を生産するために、あるものは、ＣｈｅｍＲ２３を遺伝子外または組換え的に発現するような技術の適用だけを必要とする。代わりに、膜フリーＣｈｅｍＲ２３は、ポリペプチドの界面活性剤溶液の希釈によって膜調製の中に統合される（Salamonら，1996年，Biophys.J.71;283-294参照、これは本明細書に組み入れられる）。
【０１１５】
Ｂ．ＴＩＧ２ポリペプチド
ヒトＴＩＧ２ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ、本明細書では、配列ＩＤ ＮＯ：７及び８で与えられる。ＴＩＧ２配列もジーンバンクから入手可能できる（例えばヒトポリヌクレオチド配列は承認Ｎｏ．XM004765，U77594，NM002889，ヒトポリペプチド配列は承認Ｎｏ．Q99969，BAA76499，AAB47975，NP002880及びXP004765で入手でき；Gallus gallusポリヌクレオチド配列は、承認Ｎｏ．BG713704，BG713614を含むポリヌクレオチドで；マウスポリヌクレオチドは、BF020273，AW113641及びbf018000に含まれ；ラットポリヌクレオチド配列はAW915104に含まれ；Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａポリヌクレオチド配列はBF078978及びBF713092に含まれる（重複している断片（ＥＳＴｓ）、BF713092におけるＴＩＧ２配列の最後の７アミノ酸）；及びBOS taurusポリヌクレオチド配列はBG691132に含まれる）。ＴＩＧ２配列のアライメントは図９に示されている。
【０１１６】
ＣｈｅｍＲ２３とともに、ＴＩＧ２ポリヌクレオチドは、増幅源であるプライマーまたはプローブとして既知配列を用いた標準ＰＣＲと分子クローニング技術を通じてクローン化されることができる。同様に、クローン化されたＴＩＧ２ポリペプチドは、当該分野で知られた原核細胞又は真核細胞で発現させることができる。制限のないサンプルとして、哺乳類ＴＩＧ２発現ベクターシステムは、ヒトＥＦ１α（Mishizuma＆Nagata，1990年，Nucl.Acids.Res.18:5322）のプロモータを含む二重シストロン性（bicistromic）発現ベクター、ポリリンカー、ＥＣＭＶ内側リボゾームエントリー部位（IRES,Ghattasら，１９９１年，Mol.Cell.Biol.11:5848-5859）及びＳＶ４０ポリＡシグナルに続くネオマイシン耐性遺伝子を含むことができる。酵母中での発現のためのＴＩＧ２発現構造物は、実施例４で説明されている。
【０１１７】
ＴＩＧ２は、インビトロでの転写及び翻訳を通じてインビトロで発現されることができる。さらに、もし、与えられた分析または技術のために要求されれば、本発明によれば有用なＴＩＧ２ポリペプチドは、融合タンパク質又は断片化タンパク質として生産されることができる。例えば、全長ＴＩＧ２又はその一部分（すなわち少なくとも１０アミノ酸、好ましくは２０アミノ酸またはそれ以上、全長ＴＩＧ２より１アミノ酸少ないものまで）のいずれかは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、分泌されたアルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、又は６Ｘ−Ｈｉｓペプチドに一体化させて、ＴＩＧ２ポリペプチドの精製又は検出を促進する。断片化された又は融合タンパク質の生産のための方法及びベクターは、このような融合された又は断片化されたタンパク質を単離し検出する方法として、当該分野でよく知られている。
【０１１８】
ＴＩＧ２ポリペプチド及び特に末端切断型は、また当該分野で既知の化学合成によって調製されることができる。
【０１１９】
ＴＩＧ２ポリペプチド組替え体は、精製された形で用いられることができる。あるいは、ＴＩＧ２トランスフェクト細胞由来のならし培地が用いられることができる。本発明によれば、与えられた結合又は機能的分析の中で必要なＴＩＧ２の量は、分析に依存して変化するが、一般に分析あたり、１ｐＭ乃至１ｎＭの標識ＴＩＧ２と１０ｐＭ乃至１μＭの非標識ＴＩＧ２のを用いる。ＣｈｅｍＲ２３のための断片化されたＴＩＧ２ポリペプチドの親和性及びＥＣ５０は、全長野生型ＴＩＧ２ポリペプチドの親和性及びＥＣ５０に対して、変化しえる。そして、与えられた分析に必要な量は、したがって、野生型の値に比例して、適合されることができる。もし、与えられた分析に必要であれば、ＴＩＧ２は、合成の間に、培地内で放射性物質で標識したアミノ酸（例えば、３５Ｓ−Ｍｅｔ，１４Ｃ−Ｌｅｕ又はふさわしい他のもの）を組み入れることによって、標識されることができる。１２５Ｉを用いた化学的標識方法は、この分野で知られている。蛍光物質標識は、ＴＩＧ２ポリペプチド又は標準的な標識付け技術を用いたほかのＣｈｅｍＲ２３リガンドに付けられることもできる。
【０１２０】
Ｃ．ＣｈｅｍＲ２３活性のモジュレーターを同定する分析
ＴＩＧ２がＣｈｅｍＲ２３レセプターのリガンドであるという発見は、アゴニスト、アゴニスト、及びレセプター活性の逆アゴニストを同定するスクリーニング分析をもたらす。このスクリーニング分析は、２つの一般的アプローチを有する。
【０１２１】
１）リガンド結合分析：この分析においては、ＣｈｅｍＲ２３を発現する細胞、このような細胞からの膜抽出物、又はＣｈｅｍＲ２３を含む固定された脂質膜が、標識ＴＩＧ２ポリペプチド及び候補化合物に曝される。培養に続いて、その反応混合物が、ＣｈｅｍＲ２３レセプターに対する標識ＴＩＧ２ポリペプチドの特異的結合のために測定される。標識ＴＩＧ２ポリペプチドと干渉するあるいは置換する化合物は、アゴニスト、アンタゴニスト又はＣｈｅｍＲ２３活性の逆アゴニストであることができる。機能的分析は、陽性化合物上で行われて、これらの化合物がこれらのカテゴリーのいずれに適合するかを決めることができる。
【０１２２】
２）機能分析：この分析においては、ＣｈｅｍＲ２３のシグナリング活性が測定される。
ａ）アゴニストスクリーニングのためにＣｈｅｍＲ２３を発現する細胞、又はこれらの細胞から調製される膜が、候補物質とともに培養され、ＣｈｅｍＲ２３のシグナリング活性が測定される。この分析は、アゴニストとしてのＴＩＧ２ポリペプチドを用いて有効になり、レセプター活性をモジュレートする化合物によって誘導される活性がＴＩＧ２によって誘導された活性と比較される。アゴニスト又は部分的アゴニストが１０×Ｍ以下で存在するとき、アゴニスト又は部分的アゴニストは、野生型ヒトＴＩＧ２の最大活性の少なくとも１０％に相当する最大生物活性を有する。好ましくはアゴニスト又は部分的アゴニストは、野生型ヒトＴＩＧ２の生物活性の５０％、７５％、１００％以上、又は２倍、５倍、１０倍以上を有する。
【０１２３】
ｂ）アンタゴニスト又は逆アゴニストスクリーニングのために、ＣｈｅｍＲ２３を発現する細胞又はこれらから分離された膜は、候補物質とともに又は候補物質を伴わずに、ＴＩＧ２ポリペプチドの存在下で、シグナリング活性のために分析される。アンタゴニスト又は逆アゴニストは、アンタゴニスト又は逆アゴニストを不足している反応に対して、ＴＩＧ２で刺激されたレセプター活性のレベルを少なくとも１０％減少させる。
【０１２４】
ｃ）逆アゴニストスクリーニングのために、構成成分であるＣｈｅｍＲ２３活性を発現する細胞又はこれらから単離された膜が、候補化合物の存在又は不在下でレセプターの活性を測定する機能的分析の中で用いられる。逆アゴニストは、レセプターの構成成分の活性を少なくとも１０％減じるこれらの化合物である。ＣｈｅｍＲ２３の過剰発現（例えばインビボでマクロファージ中で自然に発現されるレベルに対して５倍以上のＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを過剰発現）は、構成成分の活性化を導き得る。ＣｈｅｍＲ２３は、強い構成成分プロモータ（例えばＣＭＶ早期プロモータ）の制御下でそれを配置することによって過剰発現させることができる。あるいは、保持されたＧＰＣＲアミノ酸又はアミノ酸ドメインのある突然変異が、構成成分活性を導く傾向にある。例えば、Kjelsbergら、1992年J.Biol.Chem.267:1430;McWhinneyら、2000年J.Biol.Chem.275:2087；Renら、1993年J.Biol.Chem.268:16483；Samamaら、J.Biol.Chem.268:4625；Parmaら、1993年、Nature356:649;Parmaら、1998年J.Pharmacol.Exp.Ther.286:85；及びParentら、1996年J.Biol.Chem.271:7949を参照。
【０１２５】
リガンド結合と置換分析
ＴＩＧ２がＣｈｅｍＲ２３に結合することを阻害する化合物をスクリーニングするために、ＴＩＧ２ポリペプチドとともに、細胞上で発現されるＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド、又はレセプターポリペプチドを含む単離された膜を用いることができる。結合又はＴＩＧ２ポリペプチド置換だけを測定する分析において同定されたとき、化合物は、機能テストにさらされて、当該化合物がアゴニストとして作用するか、アンタゴニストとして作用するか、または逆アゴニストとして作用するかを決めなければならない。
【０１２６】
置換実験のために、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現する細胞（一般に分析あたり２５０００細胞又は１〜１００μｇの膜抽出物）が、結合バッファー（例えば、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）；１ｍＭのＣａＣｌ２；０．５％ウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）脂肪酸フリー；及び０．５ｍＭのＭｇＣｌ２）中で１．５時間（例えば２７℃で）、濃度が増大した候補モジュレーターの存在又は不在下で、標識ＴＩＧ２ポリペプチドとともに培養される。その解析を有効にし、修正するために、濃度が増大する非標識ＴＩＧ２ポリペプチドの増大する濃度を用いる調節競争反応が行われることができる。培養後、細胞は広範囲に洗浄され、結合され、標識ＴＩＧ２が、与えられた標識にふさわしく測定される（例えば、シンチレーションカウンティング、酵素分析、蛍光など）。候補モジュレーターの存在下で結合された標識ＴＩＧ２ポリペプチド量の少なくとも１０％減少していると、候補モジュレーターにより結合が置換したことを示している。もし、候補モジュレーターが１０μＭ以下の濃度（すなわちＥＣ５０は１０μＭ以下である）で、標識ＴＩＧ２の５０％（飽和に近いＴＩＧ２投与量）を置換するなら、候補モジュレーターは、本明細書で説明されているこの分析又は他の分析で特異的に結合すると考えられる。
【０１２７】
あるいは、結合又は結合の置換は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってモニターされることができる。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析は、その結合によってもたらされる固定されたセンサーの近くでの質量の変化によって、２分子間結合を測定する定量的方法として用いられることができる。あるいは水相から膜内に保持されたＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドまでの、センサ上での、ＴＩＧ２ポリペプチドの結合ロスによって、２分子間結合を測定する定量的方法として用いられることができる。この質量変化は、ＴＩＧ２ポリペプチド又は候補モジュレーターの注入又は除去後に、時間に対する共鳴ユニットとして測定され、バイアコア・バイオセンサ（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ）を用いて測定される。ＣｈｅｍＲ２３は、Ｓａｌａｍｏｎらによって説明される方法によれば、薄層脂質膜の中で、センサーチップ上で保持されることができる（Salamonら，1996年，Biophys J.71:283-219；Salamonら，2001年Biophys.J.80:1557-1567；Salamonら，1999年，Trends Biochem.Sci.24:213-219、これらは夫々参考として、本明細書に組み入れられる）。Ｓａｒｒｉｏらは、チップ上での脂質層の中で保持されたＧＰＣＲ Ａ（１）アデノシンレセプターに結合するリガンドを検出するのに、ＳＰＲが用いられることを立証した（Sarrioら、2000年，Mol.Cell.Biol.20:5164-5174，本明細書に参考として組み入れられる）。ＳＰＲ分析で、ＴＩＧ２がＣｈｅｍＲ２３に結合する条件は、開始点として、Ｓａｒｒｉｏらによって報告された条件を用いて、当業者によって微調整されることができる。
【０１２８】
ＳＰＲは、少なくとも２つの方法で、結合のモジュレーターとして分析することができる。最初に、ＴＩＧ２ポリペプチドが保持されたＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに予め結合されて、ついで約１０μｌ／ｍｉｎ流速で、１ｎＭから１００μＭ、好ましくは約１μＭの範囲の濃度で、候補モジュレーターが注入される。結合されたＴＩＧ２の置換は、定量され、モジュレーター結合の検出を許容する。あるいは、膜に結合したＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドは、予め候補モジュレーターとともに培養されることができ、ＴＩＧ２ポリペプチドを用いてやってみることができる。予めモジュレーターに暴露されていないチップ上でのＣｈｅｍＲ２３とＴＩＧ２との結合に対して、モジュレーターにさらされたＣｈｅｍＲ２３とＴＩＧ２結合が相違していれば、モジュレーター結合を示しているであろう。いずれかの分析では、候補モジュレーターの存在下でのＴＩＧ２ポリペプチド結合量が、候補モジュレーターの不在下でのＴＩＧ２ポリペプチド結合量に対して１０％以上低下していれば、候補モジュレーターがＣｈｅｍＲ２３とＴＩＧ２との相互作用を阻害することを示している。
【０１２９】
ＴＩＧ２ポリペプチドのＣｈｅｍＲ２３との結合の阻害を測定するもうひとつの方法は、蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＦＲＥＴ）を用いる。蛍光ドナー（Ｄ）の励起スペクトルが蛍光アクセプター（Ａ）の励起スペクトルと重複するならば、ＦＲＥＴは、互いに近く（通常、分離の１００Ａ未満）まで近接しているときに蛍光ドナー（Ｄ）と蛍光アクセプター（Ａ）との間で起こる量子機構現象である。テストされる分子、例えばＴＩＧ２ポリペプチド及びＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドが、ドナーとアクセプターの完全な1対の発蛍光団で標識付けされる。ＣｈｅｍＲ２３：ＴＩＧ２相互作用によってともに近接結合している間、ドナー発蛍光団の励起で放出される蛍光は、ポリペプチドが結合されないときの励起波長に応答して放出される波長とは異なる波長を有する各波長での放出密度の測定により結合されないポリペプチドに対する結合されたポリペプチド量を提供する。発蛍光団のドナー：アクセプター対が、ポリペプチドを標識するのに用いられることが、その分野でよく知られている。特別な興味は、シアンＦＰ（ＣＦＰ，ドナー（Ｄ））及びイエローＦＰ（ＹＦＰ，アクセプター（Ａ））として知られているＡ．ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰの変異体（variant）である。このＧＦＰ変異体（variant）は、結合対の相対的メンバーとの融合タンパク質として作られて、タンパク−タンパク相互作用を測定するＦＲＥＴスキームの中でのＤ−Ａ対として役立つ。融合としてのＧＦＰ変異体（variant）の発現のためのベクターは、その分野で知られている。サンプルとしては、ＣＦＰ−ＴＩＧ２融合とＹＦＰ−ＣｈｅｍＲ２３融合を作ることができる。標識ＴＩＧ２タンパク質と標識ＣｈｅｍＲ２３タンパク質との混合物へ候補モジュレーターを添加した結果、エネルギートランスファーを阻害し、このことは、例えば、候補モジュレーターなしのサンプルに対するＹＦＰ蛍光の減少によって立証される。ＣｈｅｍＲ２３：ＴＩＧ２相互作用の検出のためにＦＲＥＴを用いる分析において、候補モジュレーターなしのサンプルに対して、候補モジュレーターを含むサンプルの中でアクセプター波長での蛍光放出密度が１０％以上減少すれば、候補モジュレーターがＣｈｅｍＲ２３：ＴＩＧ２相互作用を阻害することを示している。
【０１３０】
ＦＲＥＴの変異体（variant）は、蛍光消光を用いて、分子相互作用をモニターする。相互作用対における一方の分子は発蛍光団で標識付けされることができ、他方の分子は相互作用対がぴったり寄せたときに発蛍光団の蛍光を消光する分子で標識付けされることができる。励起における蛍光の変化は、発蛍光団：消光剤対を用いてタグ付けされた分子の会合における変化を表す。一般に、標識ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドの蛍光が増加すると、消光剤を運ぶＴＩＧ２ポリペプチドが置換されたことを示す。消光分析のために、候補モジュレーターを含むサンプルにおける蛍光発光の密度が、候補モジュレーターなしでのサンプルに対して１０％以上増加すると、候補モジュレーターがＣｈｅｍＲ２３：ＴＩＧ２相互作用を阻害することを示す。
【０１３１】
表面プラズモン共鳴とＦＲＳＴ方法に加えて、蛍光分極測定が、タンパク−タンパク結合の定量に有用である。蛍光的にタグ付けされた分子に対する蛍光分極値は、回転の相関時間又は転動速度に依存する。蛍光標識されたＴＩＧ２ポリペプチドと結びつくＣｈｅｍＲ２３によって形成されるようなタンパク質複合体は、複合化されていない、標識ＴＩＧ２よりも高い分極値を有する。ＣｈｅｍＲ２３：ＴＩＧ２相互作用の候補阻害剤を含む場合、候補阻害剤がＣｈｅｍＲ２３のＴＩＧ２との相互作用を崩壊又は阻害していれば、候補阻害剤なしの混合物に対して蛍光分極化が減少するようになる。蛍光分極化は、ポリペプチド又はタンパク質複合体の形成を崩壊する低分子の同定によく適している。候補モジュレーターが不足しているサンプル内での蛍光分極に対して候補モジュレーターを含むサンプルの蛍光分極が、１０％以上減少していれば、候補モジュレーターがＣｈｅｍＲ２３：ＴＩＧ２相互作用を阻害することを示している。
【０１３２】
ＣｈｅｍＲ２３：ＴＩＧ２相互作用をモニタするもう一つの取りえる道は、バイオセンサー分析を使用することである。ＩＣＳバイオセンサーは、ＡＭＢＲＩ（オーストラリアン・メンブレン・バイオテクノロジーリサーチインスティチュート；http//www.ambri.com.au/）。この技術では、ＣｈｅｍＲ２３やＴＩＧ２のような巨大分子の結びつきは、懸濁された二重膜の中で、グラマシヂン促進されたイオンチャネルに接近して共役する。このようにして、バイオセンサーのアドミッタンス（インピーダンスと同様）の変化が測定可能となる。このアプローチは、アドミッタンス変化の大きさの６オーダーを超える線形となり、低分子組合せライブラリーの大規模、高効率スクリーニングに、理論上適している。候補モジュレーターを不足しているサンプルのアドミッタンスに対して、候補モジュレーターを含むサンプルの中のアドミッタンスにおける１０％以上の変化（増加又は減少）は、候補モジュレーターがＣｈｅｍＲ２３とＴＩＧ２の相互作用を阻害することを示している。
【０１３３】
タンパク質−タンパク質相互作用の分析において、相互作用のモジュレーターが必要とし得ることは物理的に相互作用するタンパク質のドメインと必ずしも直接的に相互作用するわけでないことに留意することが重要である。モジュレーターがタンパク質−タンパク質相互作用の部位から除去された位置で相互作用し、例えば、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド内での構造的変化をもたらすこともできる。この方式で作用するモジュレーター（阻害剤又はアゴニスト）は、それにもかかわらず、ＣｈｅｍＲ２３の活性をモジュレートする物質として興味がある。
【０１３４】
ここで説明されている結合分析のいずれも、ＣｈｅｍＲ２３の非ＴＩＧ２リガンド（例えば、アゴニスト、アンタゴニストなど）、例えばここで説明されているように同定された低分子を用いて行われることができる。実際に、低分子リガンド又は他の非ＴＩＧ２リガンドを使用すると、非ポリペプチド化学物質が、ＴＩＧ２のようにポリペプチドよりも一般に安価で容易く精製形で製造することができるという利益を有している。このように、アゴニスト、アンタゴニスト又は逆アゴニストの同定にとって、非ＴＩＧ２リガンドは、全長ＴＩＧ２よりも高効率な分析により適してる。しかしながら、このような分析は非ＴＩＧ２リガンドの最初の同定に良好に適しているので、その有利性は、ＴＩＧ２を用いる分析の重要性をどんなことがあっても徐々に破壊する。
【０１３５】
説明された結合分析のいずれも、ＣｈｅｍＲ２３レセプター分子に結合するサンプル又はＣｈｅｍＲ２３レセプターとＴＩＧ２の結合に影響するサンプル、例えば組織サンプル内での物質の存在を決定するのに用いられることができる。そうすると、サンプルの存在又は不在下で、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドがＴＩＧ２ポリペプチド又は他のリガンドと反応させられ、ＴＩＧ２又は結合しているリガンドが、用いられる結合分析にふさわしいものとして測定される。ＴＩＧ２又は他のリガンドの結合における１０％以上の減少は、当該サンプルが、ＴＩＧ２モジュレート物質又はレセプターポリペプチドに結合しているリガンドを含むことを示す。
【０１３６】
レセプター活性の機能分析
ｉ．ＧＴＰａｓｅ／ＧＴＰ結合分析：
ＣｈｅｍＲ２３のようなＧＰＣＲｓのために、レセプター活性測定が、レセプターを含む細胞膜によるＧＴＰの結合である。TrayerとNahorskiによって1995年，Mol.Pharmacol.47:848-854で説明されている方法（この方法は、参考としてここに組み入れられる）において、膜とＧタンパク質との共役は、標識されたＧＴＰの結合を測定することによって、膜とＧタンパク質との共役が、実質的に測定される。ＧＴＰ結合分析のために、レセプターを発現する細胞から単離された膜は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのＭｇＣｌ２，８０ｐＭの３５Ｓ−ＧＴＰγＳ及び３μＭのＧＤＰを含むバッファー中で培養される。この分析混合物は、ＧＦ／Ｂフィルター上でのろ過によって結合していない標識ＧＴＰが除去された後、３０℃で６０分間培養される。結合した標識ＧＴＰは、液体シンチレーションカウントによって測定される。ＴＩＧ２誘導されたＣｈｅｍＲ２３活性のモジュレーションを分析するために、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現する細胞から調製された膜がＴＩＧ２ポリペプチドと混合され、ＧＴＰ結合分析が、ＣｈｅｍＲ２３活性の候補モジュレーターの存在及び不在下で行われる。標識ＧＴＰ結合が、候補モジュレーターを含むこの種の分析におけるシンチレーションカウントによって測定されるように、モジュレーターなしの分析に対して１０％以上減少すると、候補モジュレーターがＣｈｅｍＲ２３活性を阻害することを示す。
【０１３７】
類似のＧＴＰ結合分析は、ＴＩＧ２なしで行われ、アゴニストとして作用する化合物を同定する。この場合、ＴＩＧ２で刺激されるＧＴＰ結合は、標準として用いられる。ある化合物が１μＭ以下で存在するとき、その化合物が、全長野生型ＴＩＧ２によって誘導されるＧＴＰ結合のレベルの少なくとも５０％を誘導するならば、好ましくはＴＩＧ２によって誘導されるよりも同等以上のＧＴＰ結合レベルを誘導するならば、その化合物はアゴニストと考えられる。
【０１３８】
ＧＴＰａｓｅ活性は、γ３２Ｐ―ＧＴＰを伴うＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを含む膜を培養することによって測定される。活性ＧＴＰａｓｅが、無機リン酸塩としてその標識を離し、その標識は、２０ｍＭのＨ３ＰＯ４中で活性化された木炭の５％懸濁液中の遊離無機リン酸塩の分離によって検出され、続いてシンチレーションカウントされる。コントロールは、候補化合物の生じえる非特異的効果を排除するために、ＣｈｅｍＲ２３を発現しない（モックトランスフェクトされた（mock-transfected））細胞から単離された膜を用いる分析を含む。
【０１３９】
ＣｈｅｍＲ２３調節されたＧＴＰａｓｅ活性上における候補モジュレーターの効果を分析するために、モジュレーターとともに及びモジュレーターを伴わずに、膜サンプルがＴＩＧ２ポリペプチドとともに培養され、続いてＧＴＰａｓｅ分析を行う。モジュレーターなしのサンプルに対する、ＧＴＰ結合レベル又はＧＴＰａｓｅ活性レベルにおける１０％以上の変化（増加又は減少）は、候補モジュレーターによるＣｈｅｍＲ２３のモジュレーションを示す。
【０１４０】
ｉｉ．ダウンストリームパスウェイ活性化分析：
ａ．カルシウムフラックス−エクオリンベース分析
エクオリン分析は、ＧＰＣＲｓの活性化によって誘導される細胞内カルシウム放出に対するミトコンドリアのエクオリン応答を利用している（Stablesら，1997年，Anal.Biochem.252:115-126；Detheuxら，2000年，J.Exp.Med.,192 1501-1508；これらはいずれも参考として本明細書に組み入れられる）。要するに、ＣｈｅｍＲ２３発現クローンは、トランスフェクトされ、ミトコンドリアのアポエクオリンとＧα１６を共同発現する。細胞は、５μＭのエレンテラジンＨ（モレキュラープローブス社）とともに、室温で４時間培養され、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地内で洗浄され、０．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁される。そして、細胞は、テストアゴニストペプチドと混合され、エクオリンによる光放出が３０秒間ルミノメータを用いて記録される。結果は、相対光ユニット（ＲＬＵ）として発現される。候補化合物の生じえる非特異的効果を排除するために、コントロールは、ＣｈｅｍＲ２３を発現しない細胞（モックトランスフェクトされた（mock-transfected）細胞）から単離された膜を用いる分析を含む。
【０１４１】
光密度が、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現して候補モジュレーターで処理された細胞サンプル中で、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現するが候補モジュレーターで処理されない細胞のサンプルに対して、あるいはＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現しないが（モックトランスフェクトされた（mock-transfected）候補モジュレーターで処理される細胞のサンプルに対して、光密度が１０％以上増加又は減少するならば、エクオリン活性又は細胞内カルシウムが「変化」させられる。
【０１４２】
ＴＩＧ２ポリペプチドの不在下で行われるとき、その分析は、ＣｈｅｍＲ２３活性のアゴニストを同定するのに用いられることができる。その分析が、ＴＩＧ２ポリペプチドの存在下で行われるとき、ＴＩＧ２がアンタゴニストの分析に用いられることができる。
【０１４３】
ｂ．アデニレートシクラ−ゼ分析：
アデニレートシクラ−ゼの分析は、Kenimer＆Nirenberg，1981年，Mol.Pharmacol.20:585-591に説明されている（参考として本明細書に組み入れらる）。この分析は、Solomonらによって、1974年,Anal.Biochem.58:541-548（これも参考として本明細書に組み入れらる）によって教示された分析の一部変更である。要するに、１００μｌ反応は、５０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５），５ｍＭのＭｇＣｌ２，２０ｍＭのクレアチンリン酸塩（二ナトリウム塩），１０ユニット（７１μｇのタンパク質）のクレアチンホスホキナーゼ，１ｍＭのα‐３２Ｐ−ＡＴＰ（四ナトリウム塩，２μＣｉ），０．５ｍＭのサイクリックＡＭＰ（約１００００ｃｐｍ），０．５ｍＭのＲｏ２０−１７２４，０．２５％エタノール，及び５０−２００μｇのタンパク質ホモゲネート（すなわちＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現又は発現しない細胞由来で、候補モジュレーターと共に又は伴わずにＴＩＧ２ポリペプチドで処理され又は処理されないホモゲネート）を含んで、テストされる。反応混合物が一般に、３７℃で６分間培養される。培養に続いて、反応混合物は、０．９ｍｌの冷６％トリクロロ酢酸の添加によって脱タンパクされる。試験管は１８００×ｇで２０分間遠心分離され、各上澄み液がＤｏｗｅｘ ＡＧ５０Ｗ−Ｘ４カラムに添加される。このカラムからのｃＡＭＰ画分が、０．１ｍＭイミダゾール塩酸（ｐＨ７．５）４ｍｌで、計数薬ビンに溶出される。分析は、３回行われるべきである。コントロール反応は、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現しない細胞由来のタンパク質ホモゲネートを用いても行われるべきである。
【０１４４】
本発明によれば、候補モジュレーターで処理しない細胞の同様のサンプルに対して、又はＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現しない細胞（モックトランスフェクト細胞）であるが候補モジュレーターで処理した細胞に対して、ＣｈｅｍＲ２３活性の候補モジュレーターで処理される細胞から取得されたサンプル内で１０％以上増加又は減少していれば、アデニレートシクラーゼ活性が「変化した」とする。
【０１４５】
ｃ．ｃＡＭＰ分析：
細胞内又は細胞外ｃＡＭＰは、当該分野で広く知られている方法に従って、ｃＡＭＰラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はｃＡＭＰ結合タンパク質を用いて測定される。例えば、Horton＆Baxendale,1995年，Methods Mol.Biol.41:91-105（参考のために本明細書に組み入れられる）は、ｃＡＭＰ用ＲＩＡを説明している。
【０１４６】
たくさんのｃＡＭＰの測定キットが上市されており、ＬＪＬバイオシステムズ社とＮＥＮライフサイエンスプロダクツ社によって売り出されている「高効率蛍光分極化ベース均一アッセイ」などがある。コントロール反応は、モックトランスフェクト細胞の抽出物を用いて行われ、いくつかの候補モジュレーターの考えられる非特異的効果を排除する。
【０１４７】
ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現し、ＣｈｅｍＲ２３活性の候補モジュレーターで処理された細胞（又はそのような細胞抽出物）内で、Horton＆Baxendra,1995年のＲＩＡベースの分析を用いて検出されるｃＡＭＰレベルが、候補モジュレーターで処理されない同様の細胞中のｃＡＭＰに対して少なくとも１０％増加又は減少するならば、ｃＡＭＰのレベルが「変化」したとする。
【０１４８】
ｄ．リン脂質分解、ＤＡＧ生産及びイノシトール三リン酸レベル：
既知のあるいは疑いあるＣｈｅｍＲ２３モジュレーターの活性による変化を、リン脂質分解をモニターすることによって、リン脂質の分解を活性化するレセプターがモニタされ、その結果として、セカンドメッセンジャーＤＡＧ及び／又はイノシトール三燐酸（ＩＰ３）を生産する。これらの各測定方法は、Ian M.Bird.Totowa,NJ,Humana Press,1988年によって編集された「リン脂質シグナリングプロトコル」（これは参考として本明細書に組み入れられる）で説明されている。Rudolphら，1999年，J.Biol.Chem.274:11824-11831も参照。これは、ホスファチジルイノシトール分解の分析も説明していて、参考として本明細書に組み入れられる。分析は、ＣｈｅｍＲ２３を発現する細胞又は細胞抽出物を用いて、候補モジュレーターと共に又は伴わずに、ＴＩＧ２ポリペプチドで処理又は処理せずに用いて行われる。コントロール反応は、いくつかの候補モジュレーターの考えられる非特異的効果を排除するために、モックトランスフェクト細胞又はその細胞抽出物を用いて行われる。
【０１４９】
本発明によれば、ホスファチジルイノシトール分解並びにジアシルグリセロール及び／又はイノシトール三リン酸レベルがＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現し、候補モジュレーターで処理された細胞由来のサンプル中で、候補モジュレーターで処理されないＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現する細胞由来のサンプル中で観察されたレベルに対して、少なくとも１０％増加又は減少すれば、ホスファチジルイノシトール分解並びにジアシルグリセロール及び／又はイノシトール三リン酸レベルが「変化された」とする。
【０１５０】
ｅ．ＰＫＣ活性化分：
リン脂質‐及びカルシウム活性化プロテインキナーゼファミリーであるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化を含む経路を通って、成長因子レセプターチロシンキナーゼは、シグナルを送る傾向にある。ＰＫＣ活性化は、ついには、ｃ−ｆｏｓ，ｃ−ｍｙｃ及びｃ−ｊｕｎなどのプロトオンコジーン転写因子コード遺伝子；プロテアーゼ；コラゲナーゼ（タイプＩ）及びプラスミノーゲン活性化阻害剤などのプロテアーゼ阻害剤；細胞内付着分子Ｉ（ＩＣＡＭ Ｉ）などの付着分子のアレーの転写の中で生じる。ＰＫＣによって誘導される遺伝子産物における増加を検出するように設計された分析は、ＰＫＣ活性化及びこれによるレセプター活性をモニターするのに用いられることができる。さらに、ＰＫＣ経由でシグナルを送るレセプター活性は、ＰＫＣ活性によって活性化されるコントロール配列によって作動されるレポータ遺伝子構成成分の使用を通じてモニターされることができる。このタイプのレポータ遺伝子に基づく分析は、さらに詳細に、以下で論じられる。
【０１５１】
ＰＫＣ活性のさらなる直接的測定のために、Kikkawaら，1982年，J.Biol.Chem.257:13341（参考のために本明細書に組み入れられる）の方法が用いられる。この分析は、ＰＫＣ基質ペプチドのリン酸化を測定する。ＰＫＣ基質ペプチドは実質的にホスホセルロース紙へ結合することによって分離される。このＰＫＣ分析システムは、精製されたキナーゼの活性又は粗細胞抽出物における活性を測定するのに用いられることができる。プロテインキナーゼＣサンプルは、分析に先立って、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／２ｍＭのＤＴＴですぐに希釈されることができる。
【０１５２】
この分析に対する基質は、ミリストイル化（myristoylated）アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質タンパク質（ＭＡＲＣＫＳ）から誘導されるペプチドＡｃ‐ＦＫＫＳＦＫＬ−ＮＨ２（配列ＩＤ ＮＯ：３７）である。このペプチドに対する酵素のＫｍは約５０μＭである。この分野で既知のほかの基本的なプロテインキナーゼＣ選択的ペプチドも、この分析で要求されるこれらのＫｍコファクターの少なくとも２−３倍の濃度で、用いられることができる。当該コファクターとしては、カルシウム、マグネシウム、ＡＴＰ、ホスファチジルセリン、及びジアシルグリセロールが含まれる。ユーザーの意向に依存して、この分析は、ＰＫＣ存在量（活性化条件）又は活性ＰＣＫ存在量（非活性化条件）を決めるために行われる。本発明の最も多くの目的は、むしろ、活性化されることができるＰＫＣを測定するよりも、それが単離されるときにサンプル内で活性であるＰＫＣが測定されるように、非活性化条件が用いられることである。非活性化条件のために、分析内でＥＧＴＡを支持して、カルシウムが省かれる。
【０１５３】
この分析は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１．２ｍＭのＤＴＴ，５ｍＭのＭｇＣｌ２，１００μＭのＡＴＰ，〜１μＣｉγ‐３２Ｐ−ＡＴＰ，１００μｇ／ｍｌのペプチド基質（〜１００μＭ），１４０μＭ／３．８μＭホスファチジルセリン／ジアシルグリセロールメンブレンと；１００μＭカルシウム（又は５００μＭのＥＧＴＡ）を含む混合物の中で行われる。４８μｌのサンプルが２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で希釈され、２ｍＭのＤＤＴが最終反応容積の８０μｌの中で用いられる。反応は、３０℃、５−１０分間行われ、続いて１００ｍＭのＡＴＰ２５μｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を添加し、これにより反応を停止する。
【０１５４】
この反応を停止させると、各反応の一部分（８５μｌ）が、ワッツマンＰ８１セルロースホスフェートフィルター上にスポットされ、続いて洗浄される。０．４％リン酸中で５００ｍｌ中を４回（各洗浄あたり５−１０分）洗浄し、最終洗浄は、５００ｍｌの９５％エタノール中で２−５分間行う。結合された放射活性が、シンチレーションカウンターによって測定される。標識ＡＴＰの特異的活性（ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）がＰ８１ろ紙上に反応のサンプルをスポットし、洗浄することなしにカウントすることによって決定される。ＰＫＣ活性ユニットは、分あたりでトランスファーされるｎｍｏｌホスフェートで定義されるように、下記で算出される。ユニット（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ）における活性
【０１５５】
【数１】
Figure 2005500047
【０１５６】
代わりの分析としては、パン・ベラ（PAN Vera）（Cat.#P2747）によって販売されているプロテインキナーゼＣ分析キットを用いて行うことができる。
【０１５７】
分析は、候補モジュレーターと共に又は伴わずに、ＴＩＧ２ポリペプチドで処理又は処理せずに、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド発現細胞からの抽出物について行われる。コントロール反応が、いくつかの候補モジュレーターの考え得る非特異的効果を排除するために、モックトランスフェクト細胞又はこれらの抽出物を用いて行われるべきである。
【０１５８】
本発明によれば、ＣｈｅｍＲ２３を発現し、候補モジュレーターで処理された細胞の抽出物中で、候補モジュレーターで処理されない細胞由来の同様のサンプル上で行われる反応に対して、上記で説明される分析によって測定されたＰＫＣユニットが、少なくとも１０％増加又は減少するとき、ＰＫＣ活性が候補モジュレーターによって「変化した」とされる。
【０１５９】
ｆ．キナーゼ活性
市販されているいくつかのキットのいずれか、例えばニューイングランドバイオラボス（Ｃａｔ＃９８２０）によって販売されているｐ３８ＭＡＰキナーゼ分析キット又はパーキン−エルマー・ライフサイエンスによって販売されているＦｌａｓｈＰｌａｔｅＴＭＭＡＰキナーゼ分析を用いて、分析されることができる。
【０１６０】
ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現し、候補モジュレーターで処理された細胞のサンプル内で、候補モジュレーターで処理されない同様の細胞からのサンプルにおけるＭＡＰキナーゼ活性に対して、活性レベルが１０％以上増加又は減少していれば、ＭＡＰキナーゼ活性が「変化した」とする。
【０１６１】
既知の合成チロシンキナーゼ基質又は天然チロシンキナーゼ基質及び標識づけされたホスフェートを用いるチロシンキナーゼ活性の直接的分析が、他のタイプのキナーゼ（例えばＳｅｒ／Ｔｈｙキナーゼ）に対する同様の分析として、よく知られている。キナーゼ活性は、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現する細胞から調製された精製キナーゼ及び粗抽出物の双方を用いて、ＴＩＧ２ポリペプチドで処理され又は処理されずに、候補モジュレーターとともに又は伴わずに、行われることができる。コントロール反応が、いくつかの候補モジュレーターの考え得る非特異的効果を排除するために、モックトランスフェクト細胞又はこれらの抽出物を用いて行われるべきである。基質は、全長タンパク質又は基質を表す合成ペプチドのいずれかであり得る。Pinna＆Ruzzene（1996年，Biochem.Biophys.Acta1314:191-225,これらは参考として組み入れられる）は、キナーゼ活性測定に有用な多くのリン酸化基質部位を列挙する。多くのキナーゼ基質ペプチドが市販されている。「Ｓｒｃ−関連ペプチド」ＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡＲＧ（配列ＩＤ ＮＯ：１１，シグマ社#A7433から入手）が特に有用であり、これは、たくさんのレセプター及び非レセプターチロシンキナーゼの基質である。下記に説明される分析は、ペプチド基質がフィルターに結合することを要求し、ペプチド基質は、正味陽性に荷電されていて、結合を促進する。一般に、ペプチド基質は、少なくとも２塩基残基及びフリーのアミノ末端を有しているべきである。一般に反応は、０．７−１．５ｍＭのペプチド濃度を用いる。
【０１６２】
分析は、一般に、５μｌの５Ｘキナーゼバッファー（５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ，１５０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５），１００ｍＭのＭｇＣｌ２；ＭｇＣｌ２の代わり又はＭｇＣｌ２に添加して用いられることができるＭｎＣｌ２について分析された正にそのキナーゼに依存している），５μｌの１．０ｍＭのＡＴＰ（最終濃度０．２ｍＭ），γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（１００−５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ），３μｌの１０ｍＭペプチド基質（最終濃度１．２ｍＭ），テストされるキナーゼを含む細胞抽出物（キナーゼ分析に用いられる細胞抽出物がホスファターゼ阻害剤を含むべきである（例えば０．１−１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム））及び２５μｌのＨ２Ｏを含む容量２５μｌの中で実行される。
【０１６３】
キナーゼ反応が３０秒間乃至約３０分間行われ、続いて、４５μｌの氷冷１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）が添加される。サンプルがマイクロ遠心分離機内で２分間回転させられ、３５μｌの上澄み液がワッツマンＰ８１セルロースリン酸フィルターサークル上にスポットされる。フィルターは、５００ｍｌの冷０．５％リン酸で３回洗浄され、続いて５分間室温で２００ｍｌアセトンで１回洗浄される。フィルターが乾燥され、取り込まれた３２Ｐがシンチレーションカウントによって測定される。キナーゼ反応（例えばｃｐｍ／ｐｍｏｌ）のＡＴＰ特異的活性が、反応の小サンプル（２−５μｌ）を、洗浄せずに、Ｐ８１フィルターサークル上に直接スポットして、カウントすることによって決められる。キナーゼ反応（マイナスブランク）の中で得られる分あたりのカウントは、そして、特異的活性によって分割され、反応のホスフェートトランスファーのモルを決定する。
【０１６４】
候補モジュレーターで処理されていない同様の細胞からのサンプル中のキナーゼ活性に対して、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現し、候補モジュレーターで処理された細胞からのサンプル内で、キナーゼ活性レベルが、１０％以上増加又は減少したととき、チロシンキナーゼ活性は、「変化した」とする。
【０１６５】
ｇ．ダウンストリーム経路活性化のための転写レポータ
レセプター（例えばＣｈｅｍＲ２３）にアゴニストが結合することによって開始される細胞内シグナルは、細胞内イベントのカスケードモーションの中で、１以上の遺伝子の転写又は翻訳の中での迅速且つ検出可能な変化である究極的な結果をセットする。従って、レセプターの活性が、ＣｈｅｍＲ２３活性に対して応答するコントロール配列によって駆動されるレポータ遺伝子の発現を測定することによって、モニターされることができる。
【０１６６】
ここで用いられる「プロモータ」は、遺伝子発現のレセプター仲介調節に必要な転写コントロール要素をいい、塩基的プロモータだけでなく、レセプター調節発現に必要なエンハンサー又は転写因子結合部位のいずれも含む。アゴニスト結合から生じる細胞内シグナルに応答するプロモータを選択することによって、また転写、翻訳、又は究極的活性が容易に検出可能及び測定可能であるレポータ遺伝子に、選択されたプロモータを実施可能に連結することによって、レポータ分析に基づく転写が、与えられたレセプターが活性化されるかどうかの迅速な指標を提供する。
【０１６７】
ルシフェラーゼ，ＣＡＴ，ＧＦＰ，β−ラクタマーゼ又はβ−ガラクトシダーゼのようなレポータ遺伝子が、これらの生産物の検出のための分析として、当該分野で知られている。
【０１６８】
レセプター活性のモニターによく適した遺伝子が、特に「すばやい（immediately early）」遺伝子であり、一般にレセプターとエフェクタータンパク又はリガンドとの間での接触から何分かで、迅速に誘導される。すばやい（immediately early）遺伝子転写の誘導は、新しい調節タンパク質の合成を要求しない。リガンド結合に対する迅速な応答に加えて、レポータ構成をつくるのに有用な好ましい遺伝子の特徴には、静止細胞における低い又は検出不能な発現；一過性で新規タンパク質から独立している誘導；新規タンパク質合成を要求する転写の実質的シャットオフ；及びこれらの遺伝子から転写されたｍＲＮＡが短い半減期を有することがある。好ましくは、転写コントロール要素は、それが有用であるようにする、これらの特性の全てを有している。
【０１６９】
多くの異なる刺激に対して応答する遺伝子のサンプルは、ｃ−ｆｏｓがん原遺伝子である。ｃ−ｆｏｓ遺伝子は、成長因子、ホルモン、分化特異剤（differentiation-specific agent）、ストレス、及び他の公知の細胞表面タンパク質の誘導剤によって、タンパク合成から独立した方式で活性化される。ｃ−ｆｏｓ発現の誘導は、極端に速く、しばしばレセプター刺激から数分以内でおこる。この特徴は、レセプター活性化のレポータとしての使用にとって特に魅惑的なｃ−ｆｏｓ調節領域をつくる。
【０１７０】
ｃ−ｆｏｓ調節要素としては次のようなものが含まれる（Vermaら，1987年，Cell 51:513-514参照）。すなわち転写開始に必要なＴＡＴＡボックス；塩基転写のための２つの上流側要素；及びエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、２回対称軸シメトリーを伴う要素を含み、ＴＰＡ，血清，ＥＧＦ及びＰＭＡによる誘導に必要である。
【０１７１】
２０ｂｐのｃ−ｆｏｓ転写エンハンサー要素は、ｃ−ｆｏｓのｍＲＮＡキャップ部位から上流にある−３１７と−２９８ｂｐとの間に位置し、血清欠乏のＮＩＨ３Ｔ３細胞内での血清誘導の本質的要素である。２つの上流要素のひとつは、−６３から−５７までに位置し、ｃＡＭＰ調節に一致する配列に似ている。
【０１７２】
転写因子ＣＲＥＢ（サイクリックＡＭＰ応答要素結合タンパク質）は、名前が意味するように、細胞内ＡＭＰのレベルに応答する、従って、ｃＡＭＰレベルのモジュレーションを経由するシグナル伝達レセプターの活性化は、転写因子の結合又はＣＲＥＢ結合要素（ＣＲＥ又はｃＡＭＰ応答要素と称される）に連結するレポータ遺伝子の発現の何れかを測定することによって、モニタされることができる。ＣＲＥのＤＮＡ配列は、ＴＧＡＣＧＴＣＡ（配列ＩＤ ＮＯ：１２）である。ＣＲＥＢ結合活性に応答するレポータ構成成分は、米国特許５９１９６４９で説明される。
【０１７３】
他のプロモータ及び転写コントロール要素は、ｃ−ｆｏｓ要素及びＣＲＥＢ応答構成成分に加えて、血管に作用する腸のペプチド（ＶＩＰ）遺伝子プロモータ（ｃＡＭＰ応答；Finkら，1988年，Proc.Natl.Acad.Sci.85:6662-6666）；ソマトスタチン遺伝子プロモータ（ｃＡＭＰ応答，Montimingら，1986年，Proc.Natl.Acad.Sci.8.3:6682-6686）；プロエンケファリンプロモータ（ｃＡＭＰに応答、ニコチンアゴニスト、及びホルボールエステル；Combら，1986年,Nature323:353-356）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子プロモータ（ｃＡＭＰ応答；Shortら，1986年，J.Biol.Chem.261:9721ー9726）が含まれる。
【０１７４】
ＧＰＣＲ活性における変化に応答する転写コントロール要素の付加的例には、ＡＰ−１転写因子に応答するものやＮＦ−κＢ活性に応答するものが含まれるが、これらに限定されない。一致するＡＰ−１結合部位は、ＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡのパリンドロームである（Leeら，1987年，Nature 325:368-372;Leeら,1987年,Cell 49:741-752）。ＡＰ−１部位は、ホルボールエステル１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−β−アセテート（ＴＰＡ）のような腫瘍プロモータによる誘導を仲介するためにも応答でき、したがって、時々、ＴＲＥとして、ＴＰＡ応答要素と呼ばれる。ＡＰ−１は、成長刺激に対する細胞の初期の応答に含まれるたくさんの遺伝子を活性化する。ＡＰ−１応答遺伝子の例は、Ｆｏｓ及びＪｕｎ（これらのタンパク質はＡＰ−１活性を自ら作り上げる）のための遺伝子に限定されず、Ｆｏｓ関連抗原（Ｆｒａ）１及び２，ＩκＢα，オルニチンデカルボキシラーゼ及びアネキシンスＩ及びＩＩを含む。
【０１７５】
ＮＦ−κＢ結合要素は、一致配列ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列ＩＤ ＮＯ：３８）を有する。大量の遺伝子が、ＮＦ−κＢ応答として同定され、これらのコントロール要素は、レポータ遺伝子に連結されて、ＧＰＣＲ活性をモニタする。ＮＦ−κＢに応答する遺伝子の小さなサンプルは、ＩＬ−１βをコードする遺伝子（Hiscottら，1993年，Mol.Cell.Biol. 13:6231-6240），ＴＮＦ−α（Shakhovら，1990年，J.Exp.Med.171:35-47），ＣＣＲ５（Liuら，1998年，AIDS Res.Hum.Retroviruses14:1509-1519），Ｐ−セレクチン（Pan＆McEver，1995年,J.Biol.Chem.270:23077-2308３），Ｆａｓリガンド（Matsuiら，1998年，J.Immunol. 161:3469-3473），ＧＭ−ＣＳＦ（Schreck＆Baeuerle，1990年，Mol.Cell.Biol.10:1281-1286）及びＩκＢα（Haskillら，1991年，Cell 65:1281-1289）を含む。これらの参考文献のいずれも参考として本明細書に組み入れられる。ＮＦ−κＢ応答レポータをコードするベクターは、当該分野でも既知で、あるいは例えば合成ＮＦ−κＢ要素及び最小プロモータを用いて、あるいはＮＦ−κＢ調節に従うと知られている遺伝子のＮＦ−κＢ応答配列を用いて当業者によって容易く作られることができる。さらにＮＦ−κＢ応答レポータ構成成分は、例えばクローンテック社から市販されている。
【０１７６】
与えられたプロモータ構成成分は、その構成成分でトランスフェクトされたＣｈｅｍＲ２３発現細胞をＴＩＧ２ポリペプチドにさらすことによって、テストされるべきである。ＴＩＧ２ポリペプチドに応答するレポータの発現における少なくとも２倍増加すれば、そのレポータがＣｈｅｍＲ２３活性の指標であることを示している。
【０１７７】
ＴＩＧ２応答転写レポータ構成成分を用いてＣｈｅｍＲ２３活性を分析するために、安全にＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現する細胞が、レポータ構成成分で安全にトランスフェクトされる。アゴニストをスクリーニングするために、細胞は、未処理のまま候補モジュレーターにさらされ、又はＴＩＧ２ポリペプチドにさらされたままとなり、レポータの発現が測定される。ＴＩＧ２処理培地は、既知のアゴニストによって誘導される転写レベルの標準として供与される。候補モジュレーター存在下でのレポータの発現における少なくとも５０％の増加は、その候補モジュレーターがＣｈｅｍＲ２３活性のモジュレーターであることを示す。アゴニストは、少なくともＴＩＧ２ポリペプチドと同等、好ましくは等量以上のレポータ発現を誘導する。このアプローチは、細胞がＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドをＴＩＧ２又は他のアゴニスト不在下でのレポータの上昇された塩基活性があるようなレベルで発現するときには、逆アゴニストのスクリーニングにも用いられる。候補モジュレーターの存在下でのレポータ活性が、候補モジュレーターの不在に対して、１０％以上減少すると、当該化合物は逆アゴニストであることを示す。
【０１７８】
アンタゴニストのスクリーニングのためには、ＣｈｅｍＲ２３を発現し、そのレポータ構成成分を運ぶ細胞は、候補モジュレーターの存在及び不在下でＴＩＧ２ポリペプチド（又は他のアゴニスト）にさらされる。候補モジュレーターの存在下でのレポータ発現が、候補モジュレーターの不在下での発現に対して１０％以上減少していると、この候補モジュレーターは、ＣｈｅｍＲ２３活性のモジュレーターであることを示す。
【０１７９】
転写分析のコントロールは、ＣｈｅｍＲ２３発現しないがレポータ構成成分を運ぶ細胞も、プロモータなしのレポータ構成成分を伴う細胞も含む。ＣｈｅｍＲ２３調節された転写のモジュレーターとして同定される化合物は、これらの活性の特異性及びスペクトルを決めるために、これらが他の調節配列及び他のレポータによって駆動される転写に影響を与えるかどうかを決めるのに分析されるべきである。
【０１８０】
転写レポータ分析及びほとんどの細胞ベースの分析は、ＣｈｅｍＲ２３活性をモジュレートする物質のためのタンパク質の発現ライブラリーをスクリーニングするのに好適である。例えばこのライブラリーは、天然源、例えば植物、動物、バクテリアなど由来のｃＤＮＡライブラリーであり、これらは、ランダムに発現するライブラリー又は１以上のポリペプチドが体系的に変異した変異体を発現するライブラリーであり得る。ウィルスベクターのゲノムライブラリーは、１細胞又は組織のｍＲＮＡ量を発現するのに用いられることができ、ＣｈｅｍＲ２３のスクリーニングのために用いられる異なるライブラリーの中でも用いられることができる。
【０１８１】
レセプター活性の分析はいずれも、ＧＴＰ結合、ＧＴＰａｓｅ、アデニレートシクラーゼ、ｃＡＭＰ、リン脂質分解、ジアシルグリセロール、イノシトール３リン酸、ＰＫＣ、キナーゼ、及び転写レポータ分析を含み、サンプル（例えば組織サンプル）内で、ＣｈｅｍＲ２３レセプター分子の活性に影響を与える物質の存在を決めるのに用いられることができる。そのようにして、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドは、サンプル又はサンプルの抽出物の存在及び不在下での活性のために分析される。サンプルの不在下に対する、サンプル又は抽出物の存在下でのＣｈｅｍＲ２３活性の増加は、サンプルがレセプター活性のアゴニストを含むことを示している。ＴＩＧ２ポリペプチド単独存在下でのレセプター活性に対して、ＴＩＧ２又は他のアゴニスト及びサンプル存在下でレセプター活性が減少していれば、サンプルがＣｈｅｍＲ２３活性のアンタゴニストを含んでいることを示す。望むならば、サンプルは、次いで分画され、さらにテストされてアゴニスト又はアンタゴニストを単離又は精製することができる。測定された活性において、サンプルがモジュレーターを含むといわれるのに必要な増加又は減少量は、用いられる分析タイプに依存する。一般に、サンプル不在下で行った分析に対する１０％以上の変化（増加又は減少）は、サンプル内でのモジュレーターの存在を示す。ひとつの例外は、転写レポータ分析であり、この分析の中では、シグナルが少なくとも２倍の増加又は１０％減少することが、サンプルがモジュレーターを含むといわれるのに必要である。アゴニストは、野生型ＴＩＧ２に対して、少なくとも５０％好ましくは７５％又は１００％以上、例えば、２倍、５倍、１０倍以上のレセプター活性化を刺激することが好ましい。
【０１８２】
他の機能分析は、例えば、マイクロフィシオメータ又はバイオセンサ分析を含む（Ｈａｆｎｅｒ，２０００年，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１５：１４９−１５８参照。これらは本明細書に参考として組み入れられる）。
【０１８３】
ＩＩ ＣｈｅｍＲ２３とＴＩＧ２の相互作用に基づく診断分析
ＧＰＣＲｓを通じてのシグナリングは、大量の疾患及び疾病病理学に役立つ。ＣｈｅｍＲ２３は、リンパ球由来細胞で発現され、免疫欠損ウィルスのコレセプターとして作用することが示され続け、免疫プロセス、疾患又は疾病に役立つことができる。ＣｈｅｍＲ２３発現パターンは、骨及び軟骨もを含んでいて、このレセプターが疾患、疾病、又はこれらの組織に影響を与えるプロセス（例えば骨折治癒）に役立つことができることを示している。大人の副甲状腺における発現は、ホスホカリック（phosphocalic）代謝に可能な重要性を提案する。
【０１８４】
リンパ球系列細胞におけるその発現のために、ＣｈｅｍＲ２３は、ウィルス感染に対する人体の応答、又はＨＩＶタイプＩ及びＩＩを含む種々のウィルス若しくはバクテリアによって誘導される病気に関係する。ＣｈｅｍＲ２３の発現パターンと、ＧＰＣＲｓによって一般に仲介される疾患に関連する知識は、ＣｈｅｍＲ２３が、細胞移動障害；癌；腫瘍の発達と腫瘍転移；炎症プロセス及び腫瘍性プロセス；損傷と骨治癒と調節成長機能の機能不全；糖尿病；肥満；食欲不振；大食病；急性心不全；低血圧；高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；レステノシス（restenosis）；アテローム硬化病；過剰な平滑筋細胞増殖によって特徴づけられる病気；動脈瘤；平滑筋細胞の喪失又は平滑筋細胞増殖の低下によって特徴付けられる病気；脳卒中；虚血；潰瘍；アレルギー；前立腺肥大症；片頭痛；嘔吐；恐怖や精神分裂症、そううつ、鬱病、譫妄、痴呆及び種々の精神遅滞を含む精神性及び神経学的疾患；消耗疾患；アルツハイマー病やパーキンソン病のような神経退化症；ハンチントン病又はジルトゥラトゥーレット症候群及び他の関連病も含まれる。
【０１８５】
ＣｈｅｍＲ２３とＴＩＧ２の相互作用は、ＣｈｅｍＲ２３シグナリングが関係する疾患、疾病又はプロセスの診断又はモニターのための分析の基礎として用いられることができる。ＣｈｅｍＲ２３関連疾患又は疾病のための診断分析がいくつかの異なる形式を有する。第１に、診断分析が、組織サンプル中でのＣｈｅｍＲ２３及び／又はＴＩＧ２ポリペプチド、遺伝子若しくはｍＲＮＡの量を測定することができる。これらのポリペプチドの何れか一方又は双方をコードするｍＲＮＡ量を測定する分析は、このカテゴリーに適合する。第２に、分析は、レセプター又はリガンドの定性分析をすることができる。例えば、ＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２のいずれか一方又は双方を形成する突然変異体（mutant）若しくは変異体（variant）又は双方を個体が発現するかどうかを決める分析が、診断上で用いられることができる。第３に、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドの１以上の活性を測定する分析が診断上用いられることができる。
【０１８６】
従って、本発明は、前記疾患又は疾病が、癌、腫瘍の転移、炎症疾患、自己免疫疾患、受け継がれた又は獲得した免疫欠損、骨粗鬆症、骨治癒、骨組織移植、移植片拒絶反応、乾癬、湿疹、皮膚の炎症性感染及び栄養疾患、ウィルス感染、バクテリア感染、寄生虫感染、女性の不育症、並びに卵巣癌及び子宮癌からなるなる群より選ばれるＣｈｅｍＲ２３関連疾患又はＣｈｅｍＲ２３関連疾病である本発明の１つの方法に関する。あるいは、本発明は、前記疾患又は疾病が、骨粗鬆症、骨治癒、骨組織移植、移植片拒絶反応、乾癬、湿疹、皮膚の炎症性感染及び栄養疾患、ウィルス感染、バクテリア感染、寄生虫感染、女性の不育症、並びに卵巣癌及び子宮癌からなるなる群より選ばれるＣｈｅｍＲ２３関連疾患又はＣｈｅｍＲ２３関連疾病である本発明の１つの方法に関する。
【０１８７】
本発明によれば、前記ＴＩＧ２ポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：８によって表されるポリペプチドに対して少なくとも３１％以上のアイデンティティ、４５％，５５％，６５％，７５％，８５％，９５％またはほぼ１００％のようなアイデンティティを有するポリペプチドであって、前記ＴＩＧ２ポリペプチドが、前記ポリペプチドは配列ＩＤ ＮＯ：２を有するＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに対して特異的に結合し、該ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリング活性を活性化する。あるいは、前記ＴＩＧ２ポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：８の全長ポリペプチドの断片であってもよく、この断片は、配列ＩＤ ＮＯ：８の全長ポリペプチドのシグナリング活性のレベルと結合活性の少なくとも５０％を保持している。本発明によれば、前記ＴＩＧ２ポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：８に関して、１以上の付加、挿入、欠失、又は置換を含んでいてもよい。前記ＴＩＧ２ポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：４８又は配列ＩＤ ＮＯ：５０乃至６０によって表される末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドであってもよく、前記ＴＩＧ２ポリペプチドは、ＴＩＧ２融合タンパク質を形成する付加的配列を含んでいてもよく、該付加的配列は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、アルカリフォスファターゼ、チオレドキシン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒスチジンタグ（例えば６Ｘ又はより大きなＨｉｓ）、又はエピトープタグ（例えばＭｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ）配列からなる群より選ばれることができる。
【０１８８】
Ａ．ＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２の量を測定する分析
ＣｈｅｍＲ２３レベル及びＴＩＧ２レベルは、測定されて、サンプル中でのレセプター又はリガンドの異常レベルがサンプル中に存在するかどうか、ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの起こりえる調節不良を指示するいずれかを決めるために、標準と比較される。例えば、ポリペプチドに対して特異的抗体を用いる免疫組織化学により、ポリペプチドレベルが測定される。ＣｈｅｍＲ２３活性によって特徴づけられる疾患又は疾病の疑いある個体から単離されたサンプルがＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２の抗体と接触させられて、その抗体への結合が当該分野で知られるように、測定される（例えば、二次抗体に結合された酵素の活性測定によって測定される）。
【０１８９】
ＣｈｅｍＲ２３及び／又はＴＩＧ２ポリペプチドレベルの測定に対するもうひとつのアプローチは、影響された組織由来の細胞のフローサイトメトリーを用いる。フローサイトメトリーの方法は、ＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２に特異的抗体の蛍光標識を含んでいて、当該分野でよく知られている。他のアプローチでは、放射性免疫分析又はＥＬＩＺＡがある。これらの各方法は、いずれも当該分野でよく知られている。
【０１９０】
検出された結合量は、健全な個体からの同じ組織のサンプル、又はあまり影響されていない個体の影響された部位由来のサンプルにおける結合と比較される。その標準に対して１０％以上増加していれば、ＣｈｅｍＲ２３調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候である。
【０１９１】
ＣｈｅｍＲ２３及びＴＩＧ２発現は、ある組織サンプルにおけるポリペプチドのいずれか一方又は双方をコードするｍＲＮＡ量を決定することによって測定されることもできる。ｍＲＮＡは、定量又は半定量ＰＣＲによって定量されることができる。「量的」増幅の方法は、当業者によく知られていて、ＣｈｅｍＲ２３及びＴＩＧ２の双方の増幅のためのプライマー配列が、本明細書に開示されている。定量的ＰＣＲの共通の方法は、同じプライマーを用いて、コントロール配列の周知量を一斉に共同増幅（co-amplify）する工程に関連している。これは、ＰＣＲ反応を計測するのに用いられることができる内部標準を提供する。定量ＰＣＲの詳細なプロトコルは、ＰＣＲプロトコルである「方法と応用のガイド」Ｉｎｎｉｓら，アカデミックプレス社，ニューヨーク，（１９９０年）に提示されている（これは、参考のために本明細書に組み入れられる）。健全な個体由来の組織様サンプル又は影響された個体内で影響されていない位置由来の組織サンプル内で発現される量に対して、サンプル内でＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２をコードするｍＲＮＡ量が１０％以上増大すると、ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病のための徴候となる。
【０１９２】
Ｂ．定性分析
ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド又はそれをコードするｍＲＮＡが野生型であるのか否かを評価する分析は、診断上用いられることができる。この方式でＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病を診断するために、あるサンプルから単離されたＲＮＡがＴＩＧ２及び／又はＣｈｅｍＲ２３のＰＣＲ増幅のための鋳型として用いられる。この増幅配列は、ついで、標準方法を用いて直接的に配列決定され、又は最初にベクター内でクローン化され、続いて配列決定される。野生型ＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２配列に対して１以上のコードされたアミノ酸を変化させる配列内での相違は、ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候であり得る。コード配列内での変化がサンプル内で同定されるとき、変異レセプター又はリガンドを発現して、該変異レセプター又はリガンの活性と野生型ＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２の活性とを比較することは、有用である。他の有益な点は、このアプローチが構造的に活性で特徴のないヌル突然変異体（null mutant）などの新規突然変異体を提供できることである。
【０１９３】
標準的配列決定方法に加えて、例えば、野生型と変種配列とを区別する分子標識のハイブリダイゼーションを用いて、増幅された配列について、特異的突然変異が存在するかどうかを分析することができる。１ヌクレオチド程度の小さな変化に基づいて区別するハイブリダイゼーション分析は、その分野でよく知られている。あるいは、多数の「ミニ配列決定」（minisequencing）分析のいずれかを行うことができ、例えば、米国特許５８８８８１９号、６００４７４４号、及び６０１３４３１号（これらは参考に組み入れられる）で説明される分析も含まれる。これらの分析及び当該分野での他の既知の分析は、与えられたサンプル内で、既知の多様性を伴う核酸の存在を決定することができる。
【０１９４】
もし望むなら、アレー又はマイクロアレーに基づく方法が、ＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２配列における発現又は変異の存在を分析するのに用いられることができる。ミニ配列決定のためのアレーベースの方法及び核酸発現の定量のためのアレーベースの方法が、当該分野ではよく知られている。
【０１９５】
Ｃ．機能分析
ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断は、機能分析を用いて行われる。そうすると、組織サンプルから調製された細胞膜又は細胞抽出物は、ここで説明されるように、ＣｈｅｍＲ２３活性の分析で用いられる（例えば、リガンド結合分析、ＧＴＰ結合分析、ＧＴＰａｓｅ分析、アデニレートシクラーゼ分析、ｃＡＭＰ分析、リン脂質分解、ジアシルグリセロール又はイノシトール三リン酸分析、ＰＫＣ活性化分析、又はキナーゼ分析）。検出された活性は、健全個体又は影響された個体上での影響されない部位から取得した標準サンプルにおける活性と比較される。二者択一として、サンプル又はサンプルの抽出物が、ＣｈｅｍＲ２３を発現する細胞に適用されることができ、続いて、標準サンプルに対するＣｈｅｍＲ２３シグナリング活性の測定が行われる。これらの分析のいずれかで測定される活性が、標準の活性に対して１０％以上の差異があると、ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候となる。
【０１９６】
本発明の細胞内でのＣｈｅｍＲ２３活性のモジュレーション
ＣｈｅｍＲ２３のリガンドとしてのＴＩＧ２の発見は、細胞内でのＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドの活性のモジュレート方法を提供する。ＣｈｅｍＲ２３活性は、その細胞に、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド機能モジュレート物質を配達することによって、細胞内でモジュレートされる。このモジュレーションは、付加的モジュレート物質の同定のための分析の一部として、培養細胞又はヒトを含む動物などの中で行われる。物質には、ここで説明されるスクリーニング方法を用いて同定された付加的モジュレータと同様に、ここで定義されるＴＩＧ２ポリペプチドが含まれる
【０１９７】
ある物質は、その物質を培地に添加することによって細胞に配達されることができる。配達量は、その物質のアイデンティティ及びそれが配達される目的に伴って変わる。例えば、ＣｈｅｍＲ２３活性のアンタゴニストを同定する培養分析において、半極大的に（half-maximally）レセプターを活性化するＴＩＧ２ポリペプチドの量を好ましくは添加する（例えば、約ＥＣ５０）、好ましくはレセプター飽和に要求される投与量を超えない量を添加する。この投与量は、ＴＩＧ２ポリペプチド量を滴定することによって決められて、ＴＩＧ２のさらなる添加がＣｈｅｍＲ２３活性上に付加的影響を与えない量で、そのポイントを決める。
【０１９８】
ＣｈｅｍＲ２３活性のモジュレータは、疾患又は疾病の治療のための動物に投与され、投与量は、好ましい出力に基づいて、当業者によって調節される。１つ以上の測定可能な異変の様子（例えば腫瘍細胞の成長、炎症細胞の蓄積）が治療前の様相に対して少なくとも１０％変化させられるとき、継続的治療が行われる。
【０１９９】
本発明に有用な候補モジュレーター
候補化合物は、合成又は天然化合物の大きなライブラリーからスクリーニングされた。多くの手段が、現在のところ、ランダムに用いられ、化合物に基づく糖類、ペプチド、脂質、炭水化物及び核酸の合成に向けられる。合成化合物ライブラリーは、例えば、メイブリッジケミカル社（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，コーンウォール，イギリス）、コムゲネックス（ニュージャジー州プリンストン）、ブランドン・アソシエーツ（ニューハンプシャ州メリマック）、及びミクロソース（コネチカット州ニューミルフォード）などの多くの会社から商業上入手できる。めったにない化学的ライブラリーは、アルドリッチ（ウィスコンシン州ミルウォーキィ）から入手できる。有機低分子のコンビナトリアルライブラリーは入手可能で、調製されることができる。あるいは、バクテリア、菌類、植物及び動物抽出物の形での天然化合物ライブラリーは、例えば、パンラボラトリー（ワシントン州ボスウェル）又はミコサーチ（ノースカロナイナ州）から入手でき、あるいはその分野でよく知られた方法によって容易く製造可能である。さらに、天然及び合成で製造されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的、生化学的手段を通じて容易くモデファイされる。
【０２００】
本明細書において先に述べたように、候補化合物は、既知のポリペプチドの変体（例えばＴＩＧ２，抗体）又は核酸ライブラリーでコードされる核酸（例えばアプタマー）でもあり得る。ライブラリーでトランスフェクトされた細胞（例えばバクテリア、酵母又は酵母より高度な真核細胞）は、抽出物から成長され、調製される。そして、その抽出物は、ＣｈｅｍＲ２３結合分析又はＣｈｅｍＲ２３活性の機能的分析に適用される。
【０２０１】
本発明に有用な抗体
本発明は、ＣｈｅｍＲ２３及びＴＩＧ２に対する抗体を提供する。抗体は、当該分野で既知の標準プロトコルを用いて作られることができる（例えば、Harlow及びLaneによる抗体：「マニュアル化された実験」を参照（コールドスプリング・ハーバープレス社１９８８年））。マウス、ハムスター又はウサギなどのほ乳類は、ペプチドの免疫原の形で免疫性を与えることができる（例えば、ＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２ポリペプチド又は抗体応答を引出すことができる抗原フラグメント又は上記で説明されたような融合タンパク質）。抗体を生じさせる免疫源は、ポリペプチド（例えば単離された組換えポリペプチド又は合成ペプチド）をアジュバントと混合することによって調製される。あるいはＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２ポリペプチド又はペプチドが、融合タンパク質として作られて、より大きな免疫原タンパク質となる。ポリペプチドは、鍵穴笠貝ヘモシアニンのようなより大きな他の免疫原のタンパク質に共有結合されることができる。あるいは、ＣｈｅｍＲ２３若しくはＴＩＧ２又はこれらのタンパク質の断片をコードするプラスミド若しくはウィルスベクターが、ポリペプチドを発現するのに用いられ、Costagliolaら，2000年，J.Clin.Invest. 105:803-811（これは参照としてここに組み入れられる）で説明されているような動物の中で免疫応答を生じさせる。抗体を生じさせるために、免疫原は、典型的には、ウサギ、ヒツジ、マウスのような実験動物の皮膚内に、皮下に又は筋肉内に投与される。上記で述べた抗体に加えて、単鎖抗体のような一般的に設計された抗体誘導体が作られる。
【０２０２】
免疫の発達は、プラズマ又は血清における抗体力価の検出によってモニタされることができる。標準ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー又は他の免疫分析は、抗原としての免疫原と共に用いられて、抗体のレベルを査定する。抗体調製は、単に、免疫化された動物由来の血清であり得るし、または望ましくはポリクローナル抗体が、例えば、固定化された免疫原を用いたアフィニティクロマトグラフィによって血清から単離される。
【０２０３】
モノクローナル抗体生産のために、抗体生産脾球（splenocytes）が免疫化された動物から収穫され、ハイブリドーマ細胞を生成するミエローマ細胞のような不死化細胞とともに標準の体細胞融合処理によって融合されることができる。そのような技術は、当該分野でよく知られている。そのような技術には、例えば、ハイブリドーマ技術（最初はKohler及びMilstein（1975年）Nature,256:495-497によって開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbarら（1983年）Immunology Today,4:72）及びヒトモノクローナル抗体を生産するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Coleら（1985年）モノクローナル抗体と癌治療，Alan・R.Liss,Inc.pp.77-96）を含む。ＴＩＧ２又はＣｈｅｍＲ２３ペプチド又はポリペプチドと特異的に反応する抗体産生のために、ハイブリドーマのような細胞を含む培地から単離されたモノクローナル抗体の産生のために、ハイブリドーマ細胞が免疫化学的にスクリーニングされることができる。
【０２０４】
本発明に有用なトランスジェニック動物
ＣｈｅｍＲ２３若しくはＴＩＧ２を発現するトランスジェニック動物又はその変異体（variant）は、ＣｈｅｍＲ２３の活性をモジュレートする薬剤又は物質の研究と同様に、ＣｈｅｍＲ２３を通じたシグナリングの研究に有用である。トランスジェニック動物は、少なくとも１つの外来遺伝子（トランス遺伝子とよぶ）を含む非ヒト動物であり、トランス遺伝子は、その遺伝的物質の一部分である。トランス遺伝子は、動物の子孫に伝達され得るように動物の生殖系列の中に含まれることが好ましい。動物の遺伝的物質の中にトランス遺伝子を導入するのに、多くの技術が用いることができ、このような技術としては、受精卵の前核（pronuclei）の中へのトランス遺伝子のマイクロインジェクションや、胚性幹細胞のマニピュレーション（WagnerとHoppeによる米国特許Ｎｏ．4873191;PalmiterとBrinster,1986年，Ann.Rev.Genet.,20:465-499；1987年８月７日に発行されたフランス特許出願2593827、これらは全て参考として本明細書に組み入れられる）が挙げられるが、これらに限定されない。トランスジェニック動物は、これらのすべての細胞の中にトランス遺伝子を運び、遺伝的にモザイクとなる。
【０２０５】
従来のトランス遺伝学の方法によれば、正常又はモデファイされた遺伝子の付加的コピーが、接合体の雄の前核（pronucleus）の中へ注入され、レシピエントマウスのゲノムＤＮＡの中へ統合されるようになる。トランス遺伝子は、設立されたトランス遺伝学的株の中へ、メンデルの法則の中で伝えられる。トランス遺伝子は、構造に関して発現されることができ、組織特異的になることができ、テトラサイクリンなどの外因性薬剤に感応することもできる。１つのトランス遺伝子を発現するトランスジェニック動物は、これらの子孫が双方のトランス遺伝子を運んで発現するように、第２のトランス遺伝子を発現する第２のトランスジェニック動物に交差されることができる。
【０２０６】
ノックアウトマウス
ＣｈｅｍＲ２３若しくはＴＩＧ２又はこれらの変異体のいずれかをコードする染色体配列の中でのホモ接合欠失を有する動物は、レセプター及びリガンドの機能の研究に用いられることができる。特別な興味は、ＴＩＧ２ノックアウトが識別できる表現型を有しているかどうかである。この表現型は、ＴＩＧ２がＣｈｅｍＲ２３に結合する唯一のリガンドか否か、それがファミリーのメンバーであるかどうかということを指し示すことができる。さらに特別の興味は、特異的な生理学上及び／又は病理学的プロセスにおけるＣｈｅｍＲ２３／ＴＩＧ２の同定の同定である。
【０２０７】
ｉ．標準的ノックアウト動物
ノックアウトマウスは、相同的組換えで遺伝子欠失を作り出す方法によって製造される。この技術は、胚から誘導される胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の発達に基づき、培養の中で保持されて宿主の胚盤胞の中に誘導されるとき、動物の中の各組織の発達に参加できる可能性を有する。ノックアウト動物は、ＥＳ細胞に特異的な標的遺伝子との相同的組換えを行うことによって製造され、これにより、ヌル対立遺伝子を生産する。ノックアウト動物を生産する技術がよく説明されている（例えば、Huszarら、1997年，Cell,88:131；及びOhki-Hamazakiら，1997年,Nature,390:165,を参照。これらはいずれも参考のために、本明細書に組み入れられる）。当業者は、ＣｈｅｍＲ２３及びＴＩＧ２の配列を用いて、ホモ接合のＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２ノックアウト動物（例えばマウス）を生産し（当該分野で知られており、本明細書に開示されている）、遺伝子標的構成成分をつくることができる。
【０２０８】
ｉｉ．組織特異的ノックアウト
標的とされた相同的組換え方法は、バクテリオファージＰ１部位特異的リコンビナーゼＣｒｅに基づく部位特異的組換えのためのシステムの発展によって改良されてきた。バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼが、明らかにされた組織又は発展的段階で限定される遺伝子ノックアウトを作り出すために、トランスジェニックマウス分析の中で用いられることができる。局所的に限定された遺伝的欠損は、グローバル遺伝子ノックアウトとは反対に、表現型が特定細胞／組織に寄与ことができるという利益を有する（Marth,1996年，Clin.Invest.97:1999年）。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系において、ひとつのトランスジェニックマウス株は、ｌｏｘＰ部位が興味ある遺伝子の１つ以上のエクソンの横に配置されるように、設計される。このための「Ｆｌｏｘｅｄ ｇｅｎｅ」と称されるホモ接合体は、細胞／組織タイプの転写プロモーターのコントロール下、Ｃｒｅ遺伝子を発現する第２のトランスジェニック動物と交差される。そして、Ｃｒｅタンパク質は、ｌｏｘＰ認識配列間のＤＮＡを切開し、効果的に、標的遺伝子の機能を除去する（Sauer,1998年，Methods,14:381）。この方法のインビボの実施例が今ではたくさんある。例えば、ほ乳類の組織特異的遺伝子の誘導可能な不活性化などが挙げられる（Wagnerら，1999年，Nucleic Acids Res.,25.4323）。従って、当業者は、組織特異的ノックアウト動物を生み出すことができ、その組織特異的ノックアウト動物の中で、ＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２を選択された組織又は細胞タイプの中でホモ接合的に排除する。
【０２０９】
本発明に有用なキット
本発明は、ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良に特徴付けられる疾患又は疾病の診断に有用なキットとともに、ＣｈｅｍＲ２３活性のモジュレーターのスクリーニングに有用なキットを提供する。本発明に有用なキットには、単離されたＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド（メンブレン又は細胞に関連するＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド、例えば単離された膜、ＣｈｅｍＲ２３を発現する細胞、又はＳＰＲチップ上を含む）及び単離されたＴＩＧ２ポリペプチドが含まれる。キットは、ＣｈｅｍＲ２３特異的抗体及び／又はＴＩＧ２特異的抗体も含む。あるいは、又はさらに、キットは、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現するように形質転換された細胞及び／又はＴＩＧ２ポリペプチドを発現するように形質転換された細胞を含む。さらなる態様において、本発明のキットは、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド及び／又はＴＩＧ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。さらなる態様では、本発明のキットは、下記に説明されるようなＣｈｅｍＲ２３又はＴＩＧ２の増幅に有用な特異的プライマーを含んでもよい。本発明のキットは全て、提示のべされた項目又はこれらの項目の組合わせ及びこれらをパッケージする材料を含む。キットは、また使用の指示を含む。
【０２１０】
本発明のキットによれば、ＴＩＧ２ポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：８で表されるポリペプチドに対して少なくとも３１％アイデンティティ又はこれより高いアイデンティティ、４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％またはほぼ１００％というようなアイデンティティを有するポリペプチドであり得る。そして、このポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：２の配列を有するＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに特異的に結合するとともに、該ＣｈｅｍＲ２３のシグナリング活性を活性化する。あるいは前記ＴＩＧ２ポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：８の全長ポリペプチドの断片でもあり得る。ここで、この断片は、結合活性の少なくとも５０％を保持し、配列ＩＤ ＮＯ：８の全長ポリペプチドのシグナリング活性のレベルを保持する。本発明によれば、前記ＴＩＧ２ポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：８に対して、１以上の付加、挿入、欠失又は置換を含む。前記ＴＩＧ２ポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：４８又は配列ＩＤ ＮＯ：５０乃至６０のいずれかで表される末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドであり得る。前記ＴＩＧ２ポリペプチドは、ＴＩＧ２融合タンパク質を形成する付加的配列を含み得る。ここで、前記付加的配列は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列、マルトース結合タンパク質配列、アルカリフォスファターゼ配列、チオレドキシン配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列、ヒスチジンタグ（例えば６Ｘ又はより大きなＨｉｓ）配列、又はエピトープタグ（例えばＭｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ）配列からなる群より選ばれることができる。
【実施例】
【０２１１】
下記実施例において、特に言及しなければ、全ての化学物質はシグマ社から入手し、細胞培地は、ギブコＢＲＬから得、そのペプチドは、Ｂａｃｈｅｍから入手した。
【０２１２】
実施例１：ヒトＣｈｅｍＲ２３レセプターのクローニング
ヒトＣｈｅｍＲ２３は、Ｓａｍｓｏｎら（１９９８年）によって説明されるようにしてクローン化した（配列ＩＤ ＮＯ１及びＮＯ２）。１セットの工程の１実施例として、本発明に有用な他のＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドをクローン化するのに用いることができる。その方法はここで説明される。ＣｈｅｍＲ２３配列をクローン化するために、古典的クローン化処理が、ヒトゲノムＤＮＡ上で行われた。ＨＯＰ１０２で指定される１つのクローンは、退化オリゴヌクレオチドを用いることによって、ヒトゲノムＤＮＡから増幅された。ＨＯＰ１０２は、ｆＭＬＰと４５〜５０％アイデンティティを共有していて、Ｃ５ａレセプターと幾分かやや低い類似物はケモカインレセプターファミリーと共有している。この部分的クローンは、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングするプローブとして用いられ、３つの重複するラムダクローンが単離された。このクローンの制限マップは、確立されていて、１．７ｋｂ ＸｂａＩフラグメントは、ｐＢＳ ＳＫ＋（Stratagene）の中でサブクローン化されていて、双方のストランド上で配列化されている。この配列は、１００％アイデンティティを伴ってＨＯＰ１０２プローブ全体を含んでいることが見出された。この新規な遺伝子は、ＣｈｅｍＲ２３と名付けられた（ジーンバンク承認Ｎｏ．Y14838）。
【０２１３】
ＣｈｅｍＲ２３のコード配列の増幅は、１．１ｋｂの断片の中で、起った。この断片は、ｐＣＤＮＡ３（インビトロジェン社）ベクターの中へサブクローン化され、双方のストランド上で配列化されている。
【０２１４】
実施例２：ＣｈｅｍＲ２３の天然リガンドの精製とＴＩＧ２の同定
卵巣癌患者から得た約１リットルのヒトの腹水流体が、プレ濾過され、ついで０．４５μｍのＭｉｌｌｅｘフィルター及び０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘフィルター（ミリポア社）を通じて、連続的に濾過した。
【０２１５】
工程１では、腹水は、５％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡを用いて予め平衡化されたＣ１８逆相カラム（１０ｍｍ×１００ｍｍＰＯＲＯＳ２０Ｒ２ビーズ、アプライド・バイオシステムズ社）の上に、直接、流速２０ｍｌ／分、室温でロードされた。そして、０．１％ＴＦＡ中で、ＣＨ３ＣＮ５〜９５％の勾配で、６％／分の傾きで適用された。５ミリリットルの画分が集められて、２０μｌの各画分を取り置き、ＣｈｅｍＲ２３を発現するＣＨＯ細胞内で〔Ｃａ２＋〕トランジエントを分析した。
【０２１６】
工程２では、活性画分（２５％ＣＨ３ＣＮと４０％ＣＨ３ＣＮの間で溶出されている約１０画分）がプールされ、ｐＨ５に調節され、２０μｍのＭｉｌｌｅｘフィルター（ミリポア社）を通じて濾過され、ｐＨ４．８の酢酸バッファーの中で３倍に希釈されて、次いで、ｐＨ４．８の酢酸バッファーを用いて４℃で予め平衡化されたカチオン交換ＨＰＬＣカラムに適用された（Ｐｏｌｙｃａｔ９．６ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ）。ｐＨ４．８の酢酸バッファー中で０〜１Ｍ勾配のＮａＣｌが、流速４ｍｌ／分で１０％／分を用いて適用された。１ミリリットル画分が集められ、１０ｋＤａカットオフ膜（ウルトラフリー、ミリポア社）上で脱塩された後、各画分から２５μｌアリコットが〔Ｃａ２＋〕分析のために用いられた。
【０２１７】
工程３では、活性画分（約７００ｍＭのＮａＣｌで溶出）がプールされ、約１０ｍＭのＮａＣｌ濃度にまで、１０ｋＤａカットオフのウルトラフリー膜上で脱塩された。別のカチオン交換ＨＰＬＣランからの溶出物がプールされ、ｐＨ４．８の酢酸バッファーを用いて４℃で予め平衡化された第２のカチオン交換ＨＰＬＣカラム（Ｐｏｌｙｃａｔ２．１ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ社）上に、ロードされた。ｐＨ４．８の酢酸バッファー中で０〜１Ｍ勾配のＮａＣｌが、流速１ｍｌ／分で２％／分の傾きで適用された。０．５ミリリットル画分が集められ、各画分からの２０μｌアリコットが、１０ｋＤａカットオフのウルトラフリー膜上で脱塩された後、細胞内カルシウム分析のために用いられた。
【０２１８】
工程４では、活性画分がプールされ、Ｈ２Ｏ／０．１％Ｈ３ＰＯ４を用いて８倍希釈され、予め５％ＣＨ３ＣＮ／０．１％Ｈ３ＰＯ４を用いて平衡化された分析用Ｃ１８逆相カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ）上に、流速１ｍｌ／分、室温で、ロードされた。０．１％Ｈ３ＰＯ４中で５〜９５％勾配のＣＨ３ＣＮが、ＣＨ３ＣＮの２５％と４０％の間で、０．３％／分勾配で適用された。単一の紫外線吸収ピーク（２１４ｎｍ）が手動で集められ、各画分容量の約５％を生物学的活性について分析された。
【０２１９】
工程５では、活性ピーク（約２８％ＣＨ３ＣＮ）が、Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡで６倍に希釈され、予め５％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡを用いて平衡化された第２のＣ１８逆相カラム（１ｍｍ×５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ）上に、流速０．１ｍｌ／分で、室温で、ロードされた。０．１％ＴＦＡ中で５〜９５％勾配のＣＨ３ＣＮが、ＣＨ３ＣＮの３０％と４５％の間で、０．３％／分勾配で適用された。最終ピークが４０％ＣＨ３ＣＮで手動で集められ、質量分析により解析された。卵巣癌腹水流体の８００ｍｌは、５０ｆｍｏｌのＴＩＧ２を生じた。
【０２２０】
活性画分は、スピードｖａｃ内で、完全に乾燥され、ｐＨ８．７で０．１ＭのＴｒｉｓ１０μｌ内で再懸濁された。９５℃で１５分間サンプルを加熱した後、そのサンプルは、３７℃、２５０ｎｇの修飾トリプシン（Promega）の存在下で、一昼夜培養された。ついで、消化されたサンプルは、固相抽出により、Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐ（ミリポア社）の上で、精製された。溶出サンプル（７０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ中で１．。５μｌ）は、１２０ｍｇ／ｍｌのジヒドロキシ−安息香酸マトリクスの存在下で、ＭＡＬＤＩターゲット上に適用され、ＭＡＬＤＩ−Ｑ−ＴＯＦプロトタイプ（マイクロマス）の上で解析された。直接的モノ同位体マスフィンガープリンティングが、７トリプシンペプチド、すなわち配列回復３８．７％を伴う６３アミノ酸を同定することを許した。
【０２２１】
表１：モノ同位体マスフィンガープリンティングで発見されたペプチド配列
アステリスク（＊）でされる２つのペプチドは、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションによってミクロ配列決定された。ペプチドの位置は、ＴＩＧ２アミノ酸配列（配列ＩＤ Ｎｏ：５）と比較して決められる。
【０２２２】
【表１】
Figure 2005500047
【０２２３】
実施例３：ヒトＴＩＧ２のクローニングと組換体の発現
ＴＩＧ２配列（図６、ジーンバンク承認Ｎｏ．Ｑ９９９６９）をクローン化するために、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）が、腎臓ｃＤＮＡ（クローンテックラボラトリー）上で行われた。プライマーは、ヒトＴＩＧ２配列に基づいて合成され、以下のようになる。
【０２２４】
【化１】
Figure 2005500047
【０２２５】
供給者によって説明される状態下で、下記サイクルを用いて、Ｑｉａｇｅｎタグポリメラーゼを用いて増幅された。：９４℃で３分、９４℃で１分を３５サイクル、５８℃で９０セット、及び７２℃で９０セット、続いて、７２℃で１０分間最終培養を行った。この増幅の結果、ＴＩＧ２遺伝子の全体をコードする配列を含む５００ｂｐのフラグメントができた。この断片は、ＤＮＡ配列分析のために、ベクターｐＣＤＮＡ３（インビトロジェン社）の中へサブクローン化された。
【０２２６】
ｍａｘｉｐｒｅｐ（Quiagen社）ＤＮＡは、１０ｃｍプレート上で、大きなＴ抗原（２９３Ｔ）を発現するＨＥＫ２９３細胞とＦｕｇｅｎｅ６を用いて、０ｃｍプレート上で、一過性トランスフェクションの中で用いられた。同時に、トランスフェクションが、同じ細胞ラインの中で、発現ベクターだけ（モックトランスフェクトされた）を用いて、行われた。トランスフェクション２４時間後、培地は、９ｍｌのＤＭＥＭ−Ｆ１２，１％ＢＳＡ、及び３ｍｌの上澄み液によって置換され、２４時間毎に３日間集められた（トランスフェクション後４８時間、７２時間、９６時間）。ＣＨＯ細胞は、同じプラスミドを用いてトランスフェクションされ、トランスフェクトされた細胞はＧ４１８とともに選択された。ならし培地の活性は、エクオリン分析を用いて、ＣｈｅｍＲ２３発現細胞上で立証された。
【０２２７】
実施例４：酵母内での組換え体のＴＩＧ２発現
ヒトとマウスのＴＩＧ２をコードする配列は、下記プライマーを用いるＰＣＲによって増幅される（２つの異なるプライマーがヒトＴＩＧ２の５’端の増幅に用いられ、このタンパク質のシグナルペプチドの異なる予言を考慮する）。
【０２２８】
【化２】
Figure 2005500047
【０２２９】
ＴＩＧ２配列はクローン化され、配列化され、ｐＰＩＣ９Ｋの中に挿入された。ｐＰＩＣ９Ｋは、発現されたタンパクの分泌を管理するシグナルを含んでいる多コピーＰｉｃｈｉａ発現プラスミド（インビトロジェン社）である。形質転換に続いて、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞は、Ｇ４１８抗生物質を用いて、選択される。選択後、２０クローンが、これらの発現のために分析され、最も高い発現を伴うクローンは、振とうフラスコ内で大規模発現で増幅される。培地が集められ、遠心分離され、ＴＩＧ２開始精製のために用いられるものから誘導されるプロトコルを用いて、部分的精製に用いられた（上記参照）。
【０２３０】
実施例５：分泌されたアルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）を用いて融合されたキメラＴＩＧ２組換え体の発現
マウスとヒトＴＩＧ２コードする配列が、ＰＣＲによって増幅され、クローン化され、配列化された。ＰＣＲと配列決定プライマーは下記の通りである。
【０２３１】
【化３】
Figure 2005500047
【０２３２】
クローン化されたＴＩＧ２配列は、次にほ乳類の二重シストロン性（bicistronic）発現ベクター、ｐＥＦＩＮの中へサブクローン化されて、そのカルボキシ末端でＴＩＧ２を用いた融合タンパクを取得し、アルカリフォスファターゼを分泌して、６つのヒスチジン残基（Ｈｉｓ６）を用いてタグ付けした。ＣＯＳ−７，大きなＴ抗原（２９３Ｔ）を発現するＨＥＫ−２９３及びＣＨＯ−Ｋ１細胞を含むほ乳類細胞は、Ｆｕｇｅｎｅ６ＴＭを用いたこのプラスミドでトランスフェクトされて、１０％ウシ胎児血清、；１００ＩＵ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２．５μｇ／ｍｌ、ファンギゾン（アンフォテリシンＢ）を含む完全ＨａｍのＦ１２培地（栄養混合物Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（ライフテクノロジー社）で、３−４日間培養される。ＴＩＧ２−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ６を含む上澄み液が、遠心分離後集められて、濾過され（０．４５μｍ）、２０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）と０．０２％アジ化ナトリウムを添加した後、４℃で保存された。
【０２３３】
ＴＩＧ２融合タンパクのアフィニティ精製ワンステップのために、上澄み液が１ｍｌのＨｉｓｂｏｎｄ樹脂（Qiagen社）に適用される。洗浄後、結合されたＴＩＧ２−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ６が、イミダゾールの勾配を用いて溶出される。単離されたＴＩＧ２−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ６の濃度がサンドイッチタイプの酵素結合免疫吸収分析により決定される。要するに、マイクロタイタープレートが、抗−胎盤アルカリホスファターゼ抗体を用いて塗布される。１ｍｇ／ｍｌの子ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてホスフェートバッファー生理食塩水中でブロックした後、そのサンプルは、滴定されて、室温で１時間培養される。洗浄後、プレートは、ビオチン化されたウサギの抗−胎盤アルカリホスファターゼ抗体とともに培養され、室温で１時間１：５００で希釈され、再度洗浄されて、３０分間、ペルオキシダーゼ抱合したストレプタビジン（streptavidin）とともに培養される。洗浄後、結合されたペルオキシダーゼが、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンと反応する。この反応は、１Ｎ硫酸の添加によって停止され、４５０ｎｍで吸収が測定される。アルカリフォスファターゼ活性は、化学発光分析によって、Ｇｒｅａｔ ＥｓｃａｐｅＴＭ検出キット（クロンテック社）を用いて決定される。精製された胎盤アルカリフォスファターゼが用いられて、標準曲線を作成する。この酵素活性は、相対光ユニット／秒として表現される。
【０２３４】
実施例６：ＣｈｅｍＲ２３の機能分析
ＣｈｅｍＲ２３発現クローンは、共同発現するミトコンドリアのアポエクオリンとＧα１６に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をトランスフェクションすることによって入手され、ノザーンブロッティングによる希釈と選択を限定する。ポジティブクローンは、上記で調製されたヒト子宮癌腹水抽出物を用いるスクリーニングのために用いられる。ミトコンドリアのエクオリンの細胞内Ｃａ２＋遊離の発光に基づく機能分析（Stableら，１９９７年，Anal.Biochem.252:115-126；ここでは参考に組み入れられる）が、説明のために行われた（Detheuxら，2000年，J.Exp.Med.,192 1501-1508；ここでは参考のために組み入れられる）。要するに、細胞は、５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳの中のプレートから集められ、ペレット化され、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中の５×１０１６細胞／ｍｌで再懸濁される。細胞は、次いで、５μＭセレンテラジンＨ（モレキュラープローブス）とともに、４時間室温で培養される。細胞は、次いで、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地内で洗浄され、０．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁される。次に、細胞は、テストアゴニストペプチド又は組織抽出物を含むプレートと混合され、光放出が、マイクロルマット（Microlumat）ルミノメータ（パーキン・エルマー社）を用いて、３０秒間記録された。結果は、相対光ユニット（ＲＬＵ）として表わされる。
【０２３５】
実施例７：ＴＩＧ２組変え体によるＣｈｅｍＲ２３を発現する細胞の活性化
ほ乳類ＴＩＧ２発現ベクターシステム（ｐＣＤＮＡ−ＴＩＧ２）又はｐｃＤＮＡ３単独でトランスフェクトされたＣＯＳー７、ＣＨＯ−Ｋ１及び２９３Ｔ細胞のならし培地が、集められ、ＣｈｅｍＲ２３を発現するＣＨＯ細胞上で、エクオリン分析のために用いた。結果を図１２に示す。ならした上澄みの増大量は、ＣｈｅｍＲ２３を発現するアエクオリンシステム細胞内での発光の増大となった。
【０２３６】
実施例８：ＣｈｅｍＲ２３に特異的抗体の産生
ＣｈｅｍＲ２３に向けられる抗体は、マウスの中でＣｈｅｍＲ２３をコードするプラスミドの繰り返し注入により産生される。第２の注入後、開始して血清が集められ、抗体の力価と特異性が、ＣｈｅｍＲ２３のｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞と、関連しないＧＰＣＲのｃＤＮＡのｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞とを用いて、フローサイトメトリーによって評価された。いくつかの血清は陽性で、免疫組織化学及びヒトプライマリー細胞のフローサイトメトリー分析を含む他の関連する応用に用いられる。
【０２３７】
モノクローナル抗体は、不死化のパートナーとして、ＮＳＯマウスミエローマ細胞ラインを用いた標準ハイブリドーマ技術によって、免疫マウスから取得される。上澄み液は、抗血清を評価するために用いられるテストを用いて、抗ＣｈｅｍＲ２３抗体活性のためにテストされる。陽性ウエルからの細胞は、拡張され、凍結され、その上澄み液が集められた。
【０２３８】
図１３は、ＣｈｅｍＲ２３に対して起る抗体を特徴付ける実験結果を示している。組換えＣｈｅｍＲ２３ＣＨＯ細胞２／３とモックトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ネガティブコントロール）１／３からなる組換え細胞の混合物は、抗ＣｈｅｍＲ２３ ５Ｃ１Ｈ２モノクローナル抗体（太線）を発現する細胞の上澄み液又は未知の抗体活性を有する細胞からの上澄み液（薄線、グレー塗りつぶし）のいずれかと反応させる。ＦＩＴＣ標識された抗マウスＩｇで染色した後、これらの調製物は、フローサイトメトリーで分析された。結果は、与えられた蛍光（ＦＬ−Ｈ軸）を発現する細胞数（イベント軸）のヒストグラムとして、表示される。細胞の双方のタイプの相対集団によって立証されるように、５Ｃ１Ｈ２モノクローナルは、ネガティブコントロール細胞からの細胞のＣｈｅｍＲ２３組換え体亜集団を区別することができる。分析のバックグラウンド蛍光は、第２の染色（グレー塗りつぶし）によって与えられる。
【０２３９】
実施例９：結合置換分析
置換実験のために、ＣｈｅｍＲ２３−ＣＨＯ−Ｋ１細胞（２５０００細胞／チューブ）が、２５０μｌの結合バッファー（５０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）；１ｍＭのＣａＣｌ２；０．５％子ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）脂肪酸フリー；５ｍＭのＭｇＣｌ２）において、標識付けされていないＴＩＧ２の濃度が増大する存在下で、１ｎＭのＳＥＡＰ−ＨＩＳ６又はＴＩＧ２−ＳＥＡＰ−ＨＩＳ６とともに、２７℃で９０分間培養される。飽和実験のために、ＣｈｅｍＲ２３−ＣＨＯ−Ｋ１細胞（２５０００細胞／チューブ）が、１μＭの非標識ＴＩＧ２の存在又は不在下で、ＴＩＧ２−ＳＥＡＰ−ＨＩＳ６の濃度増大を伴って、２７℃で９０分間培養される。培養後、細胞は５回洗浄され、１０ｍＭＴｒｉｓ塩酸（ｐＨ８．０）５０μｌ、１％トリトンＸ１００中で溶解させる。サンプルは、６５℃で１０分間加熱され、細胞のホスファターゼを不活性化した。溶解物が遠心分離によって集められ、２５μｌの溶解物中のアルカリホスファターゼ活性が上記化学発光により決められる。
【０２４０】
実施例１０：ＴＩＧ２とＣｈｅｍＲ２３の組織分布
半定量ＲＴ−ＰＣＲが、種々のヒト組織由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡと全ＲＮＡ（クローンテックとアンビオン）上で、ｈＴＩＧ２とＣｈｅｍＲ２３に対する遺伝子特異的プライマーを用いて、行われた。要するに、血液細胞由来の全ＲＮＡがＲｎｅａｓｙ・Ｍｉｎｉ・キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製された。ｈＴＩＧ２プライマーは、進行方向が（５’−ＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡ−３’；配列ＩＤ ＮＯ：３９）で、ＴａｑＭａｎプローブ（５’−ＡＡＣＣＣＧＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣ−３’；配列ＩＤ ＮＯ：４０）、逆方向は（５’−ＡＧＴＴＴＧＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣ−３’；配列ＩＤ ＮＯ：４１）である。このｈＣｈｅｍＲ２３プライマーは、進行方向が（５’−ＧＴＣＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＣＧＣＡＧ−３’；配列ＩＤ ＮＯ：４２）、ＴａｑＭａｎプローブ（５’−ＴＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＣＣＴＧＣ−３’；配列ＩＤ ＮＯ：４３）、逆方向は、（５’−ＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＴＧ−３’；配列ＩＤ ＮＯ：４４）である。プライマーはハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに進行方向（５’−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ−３’；配列ＩＤ ＮＯ：４５）で、ＴａｑＭａｎプローブ（５’−ＡＧＣＴＣＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＣＴＣＴＧ−３’；配列ＩＤ ＮＯ：４６）で逆方向（５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ−３’；配列ＩＤ ＮＯ：４７）に設計されたプライマーが用いられて、参考ｍＲＮＡプロファイルを製造した。様々な組織内でのｈＴＩＧ２とＣｈｅｍＲ２３の分布は、それぞれ図１５及び図１６に示される。ｈＴＩＧ２又はＣｈｅｍＲ２３の発現レベルは、ＧＡＰＤＨ参考ｍＲＮＡ発現に対するｈＴＩＧ２又はＣｈｅｍＲ２３の比として表される。
【０２４１】
実施例１１：ＣｈｅｍＲ２３に対するリガンドとしての末端切断ヒトＴＩＧ２ポリペプチドの同定
末端切断型ヒトＴＩＧ２ポリペプチドは、卵巣癌患者のヒト腫瘍の腹水流体から単離された。前記単離に用いられた処理は、本特許出願明細書の実施例２に開示され；ペプチド配列決定後という事実を除いて、ポリペプチドが配列ＩＤ ＮＯ：４８によって表されるように明らかにされる。
【０２４２】
前記末端切断ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、実施例３で開示された方法に従って単離された。酵母及びほ乳類細胞中での末端切断ＴＩＧ２の組換え体発現は、実施例４及び５で開示されているように行われた。
【０２４３】
配列ＩＤ ＮＯ：８及び配列ＩＤ ＮＯ：４８で表される双方のＴＩＧ２ポリペプチドは、ＣｈｅｍＲ２３のリガンドであることを、機能分析は明らかにした。前記分析のために後に続けられる方法は、実施例６に開示されている。
【０２４４】
図１４は、ＣＨＯ細胞で発現されるＣｈｅｍＲ２３に対する末端切断ｈＴＩＧ２ペプチド（配列ＩＤ ＮＯ：４８）の濃度応答曲線を示している。この分析は、あとのパラグラフで説明されるように実行される。図に示す通り、末端切断ｈＴＩＧ２分子は、４．２７ｎＭのＥＣ５０で、ＣｈｅｍＲ２３を活性化する。結果は、相対光ユニット（ＲＬＵ）として示される。類似の活性研究、結合置換分析、及び抗体産生は、実施例７，８，９で開示されるように全長ＴＩＧ２ポリペプチドのために行われるように末端切断ＴＩＧ２ペプチドで行われている。
【０２４５】
末端切断ＴＩＧ２ポリペプチドの組織分布は、これが全長ＴＩＧ２ポリペプチドの分布から離れているかどうかを決定するために研究されている。このような研究は、全長型に対する末端切断型の特異的機能を明らかにする。

Claims (76)

  1. ＣｈｅｍＲ２３の機能をモジュレートする物質（以下、「ＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質」という）の同定方法であって、
    ａ）候補モジュレーターの存在及び不在下において、ＴＩＧ２ポリペプチドがＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに結合することを許容する状態下でＴＩＧ２ポリペプチドとＣｈｅｍＲ２３を接触させる工程；及び
    ｂ）前記ＴＩＧ２ポリペプチドと前記ＣｈｅｍＲ２３との結合を測定し、前記候補モジュレーターの不在下での前記結合に対して、前記候補モジュレーターの存在下での前記結合が減少していれば、当該候補モジュレーターを、ＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質であると同定する工程
    を含む同定方法。
  2. サンプル中のＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質の存在を、サンプル中で検出する方法であって、
    ａ）前記サンプルの存在及び不在下において、ＴＩＧ２ポリペプチドが前記ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに結合することをを許容する状態下で、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドとＴＩＧ２ポリペプチドとを接触させる工程；及び
    ｂ）前記ＴＩＧ２ポリペプチドと前記ＣｈｅｍＲ２３の結合を測定し、前記候補モジュレーターの不在下での結合に対して、当該サンプルの存在下での結合が減少していれば、前記サンプル内に、当該ＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質が存在しているとする工程
    を含む検出方法。
  3. ＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質を同定する方法であって、
    ａ）候補モジュレーターの存在及び不在下でＴＩＧ２ポリペプチドとＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを接触させる工程；及び
    ｂ）前記ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリング活性を測定し、前記候補モジュレーターの不在下での該シグナリング活性に対して、前記候補モジュレーターの存在下での該シグナリング活性が変化していれば、前記候補モジュレーターを、ＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質であると同定する工程
    を含む方法。
  4. ＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質の同定方法であって、
    ａ）ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを候補モジュレーターと接触させる工程；
    ｂ）前記候補モジュレーターの存在下でのＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリング活性を測定する工程；及び
    ｃ）前記候補モジュレーターの存在下で測定されたシグナル活性と、前記ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドがＴＩＧ２ポリペプチドとそのＥＣ５０で接触しているサンプル内で測定されたシグナル活性とを比較し、前記候補モジュレーターの存在下で測定された前記シグナリング活性量が前記ＥＣ５０で存在する前記ＴＩＧ２ポリペプチドによって誘導されるシグナリング活性量の少なくとも５０％であれば、前記候補モジュレーターをＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質であると同定する工程
    を含む方法。
  5. サンプル中での、ＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質の存在を検出する方法であって、
    ａ）そのサンプルの存在及び不在下でＴＩＧ２ポリペプチドとＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを接触させる工程；
    ｂ）前記ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリング活性を測定する工程；及び
    ｃ）ＣｈｅｍＲ２３及びＴＩＧ２ポリペプチドを含み前記サンプルは含まない反応で測定された前記活性量と、ＣｈｅｍＲ２３，ＴＩＧ２及び前記サンプルを含む反応で測定される前記活性量とを比較し、前記サンプルの不在下での活性に対して前記サンプルの存在下での当該活性が変化していれば、前記サンプル内にＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質が存在しているとする工程
    を含む方法。
  6. サンプル内でのＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質の存在を検出する方法であって、
    ａ）前記サンプルとＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを接触させる工程；
    ｂ）前記サンプルの存在下で前記ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリング活性を測定する工程；及び
    ｃ）前記サンプルの存在下で測定されたシグナリング活性と、前記ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドがそのＥＣ５０で存在するＴＩＧ２ポリペプチドと接触する反応において測定されるシグナリング活性とを比較し、前記サンプルの存在下で測定される前記活性量がそのＥＣ５０で存在する前記ＴＩＧ２ポリペプチドによって誘導された量の少なくとも５０％であれば、ＣｈｅｍＲ２３機能モジュレート物質が検出されたとする工程
    を含む方法。
  7. 前記ＴＩＧ２ポリペプチドが検出可能な標識で標識付けされている請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  8. 前記ＴＩＧ２ポリペプチドが、ラジオアイソトープ、発蛍光団、蛍光消光剤、酵素、アフィニティタグ及びエピトープタグからなる群より選ばれる１種で検出可能に標識付けされている請求項７に記載の方法。
  9. 前記ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現する細胞内または細胞上で、前記接触が行われる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  10. 合成リポソーム内又は合成リポソーム上で、前記接触が行われる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  11. ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを含む、ウィルス誘導されて出芽している膜内または膜上で、前記接触が行われる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  12. 前記方法は、前記ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドを発現する細胞からの膜画分を用いて行われる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  13. 前記測定は、標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギートランスファー、蛍光消光、及び蛍光分極から選択される方法を用いて行われる請求項１又は２のいずれかの方法。
  14. 前記物質は、ペプチド、ポリペプチド、抗体又は抗体の抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、及び有機低分子からなる群より選ばれる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  15. 前記ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリング活性の測定工程は、セカンドメッセンジャーのレベル変化の検出工程を含む請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
  16. シグナリング活性の前記測定工程は、グアニンヌクレオチドの結合若しくは変換、アデニレートシクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、アラキノイド酸（arachinoid acid）、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、又はレポータ遺伝子発現の測定を含む請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
  17. 前記シグナリング活性の測定工程は、エクオリンベース分析（aequorin-based assay）を用いる工程を含む請求項１６に記載の方法。
  18. 細胞内のＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドの活性をモジュレートする方法であって、ＣｈｅｍＲ２３の活性がモジュレートするように、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドの活性をモジュレートする物質を前記細胞に配達する工程を含む方法。
  19. 前記ＴＩＧ２ポリペプチドが配列ＩＤ ＮＯ：８によって表されるポリペプチドに対して少なくとも３１％以上のアイデンティティ、４５％，５５％，６５％，７５％，８５％，９５％またはほぼ１００％のようなアイデンティティを有するポリペプチドであって、前記ポリペプチドは配列ＩＤ ＮＯ：２の配列を有するＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに特異的に結合し、該ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドのシグナリング活性を活性化する請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
  20. 前記ＴＩＧ２ポリペプチドは、該ＴＩＧ２ポリペプチドの断片であって、該ＴＩＧ２ポリペプチド断片が、配列ＩＤ ＮＯ：８の全長ポリペプチドのシグナリング活性のレベル及び結合活性の少なくとも５０％を保持している請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ＴＩＧ２ポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：８に関して、１以上の付加、挿入、欠失、又は置換を含んでいる請求項１９又は２０に記載の方法。
  22. 前記ＴＩＧ２ポリペプチドが、配列ＩＤ ＮＯ：４８又は配列ＩＤ ＮＯ：５０乃至６０によって表される末端切断されたＴＩＧ２ポリペプチドである請求項１９又は２０に記載の方法。
  23. ＴＩＧ２ポリペプチドが、ＴＩＧ２融合タンパク質を形成する付加的配列を含む請求項１９〜２２のいずれかである方法。
  24. 前記付加的配列は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列、マルトース結合タンパク質配列、アルカリフォスファターゼ配列、チオレドキシン配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列、ヒスチジンタグ（例えば６Ｘ又はより大きなＨｉｓ）配列、又はエピトープタグ（例えばＭｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ）配列からなる群より選ばれることができる請求項２３に記載の方法。
  25. 請求項１〜２４のいずれかに記載の方法によって同定又は検出される物質。
  26. 請求項２５に記載の物質に含まれる組成物。
  27. 薬物の調製のための、請求項２５又は２６に記載の物質又は組成物の使用。
  28. ＣｈｅｍＲ２３関連疾患又はＣｈｅｍＲ２３関連疾病、好ましくは、癌、腫瘍の転移、炎症疾患、自己免疫疾患、受け継がれた又は獲得した免疫欠損、骨粗鬆症、骨治癒、骨組織移植、移植片拒絶反応、乾癬、湿疹、皮膚の炎症性感染及び栄養疾患、ウィルス感染、バクテリア感染、寄生虫感染、女性の不育症、並びに卵巣癌及び子宮癌からなるなる群より選ばれる疾患又は疾病の治療に用いられる薬剤の調製のための請求項２７に記載の物質又は組成物の使用。
  29. ＣｈｅｍＲ２３関連疾患又はＣｈｅｍＲ２３関連疾病、好ましくは、骨粗鬆症、骨治癒、骨組織移植、移植片拒絶反応、乾癬、湿疹、皮膚の炎症性感染及び栄養疾患、ウィルス感染、バクテリア感染、寄生虫感染、女性の不育症、並びに卵巣癌及び子宮癌からなるなる群より選ばれる疾患又は疾病の治療に用いられる薬剤の調製のための請求項２７に記載の物質又はは組成物の使用。
  30. 配列ＩＤ ＮＯ：４８又は配列ＩＤ ＮＯ５０乃至６０のいずれかで表される末端切断ＴＩＧ２ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体。
  31. 配列ＩＤ ＮＯ：４８によって表される末端切断ＴＩＧ２ポリペプチドをコードする配列ＩＤ ＮＯ：４９によって表されるヌクレオチド配列。
  32. 請求項３０若しくは３１に記載の末端切断ＴＩＧ２ポリペプチド又はヌクレオチド配列、又は全長ＴＩＧ２ポリペプチド、又は請求項１〜２４のいずれかに記載の方法で全長ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の使用。
  33. 単離されたＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド及び単離されたＴＩＧ２ポリペプチドを含む組成物調製のための、請求項３０に記載の末端切断ＴＩＧ２ポリペプチド又は全長ＴＩＧ２ポリペプチドの使用。
  34. 抗体の調製のための、請求項３０に記載の末端切断ＴＩＧ２ポリペプチド又は全長ＴＩＧ２ポリペプチドの使用。
  35. ＣｈｅｍＲ２３のシグナリングをモジュレートする物質のスクリーニング用キットの製造のための、又はＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節解除（deregulation）によって特徴づけられた病気の診断用キットの製造ための、請求項３０に記載の末端切断ＴＩＧ２ポリペプチド又は全長ＴＩＧ２ポリペプチドの使用。
  36. ＣｈｅｍＲ２３のリガンドとしての、請求項３０に記載の末端切断ＴＩＧ２ポリペプチド又は全長ＴＩＧ２ポリペプチドの使用。
  37. 請求項３０に記載の末端切断ＴＩＧ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はＣｈｅｍＲ２３のリガンド調製のための全長ＴＩＧ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の使用。
  38. 薬剤調製のための請求項３０に記載のポリペプチド又は全長ＴＩＧ２ポリペプチドの使用。
  39. 前記薬剤は、ＣｈｅｍＲ２３関連疾患又はＣｈｅｍＲ２３関連疾病の治療のために用いられ；前記疾患又は疾病は、好ましくは癌、腫瘍転移、炎症疾患、自己免疫疾患。受け継がれた又は獲得した免疫欠損、骨粗鬆症、骨治癒、骨組織移植、移植片拒絶反応、乾癬、湿疹、皮膚の炎症性感染及び栄養疾患、ウィルス感染、バクテリア感染、寄生虫感染、女性の不育症、並びに卵巣癌及び子宮癌からなる群より選ばれる、請求項３８に記載の使用。
  40. 前記薬物は、ＴＩＧ２関連疾患又はＴＩＧ２関連疾病の治療のために用いられ；前記疾患又は疾病は、好ましくは、骨粗鬆症、骨治癒、骨組織移植、移植片拒絶反応、乾癬、湿疹、皮膚の炎症性感染及び栄養疾患、ウィルス感染、バクテリア感染、寄生虫感染、女性の不育症、並びに卵巣癌及び子宮癌からなるなる群より選ばれる、請求項３８に記載の使用。
  41. ＣｈｅｍＲ２３シグナリング調節不良（dysregulation）によって特徴付けられる疾患又は疾病の診断方法であって、
    ａ）組織サンプルをＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに特異的抗体と接触させる工程；
    ｂ）前記抗体と前記組織サンプルとの結合を検出する工程；
    ｃ）工程（ｂ）で検出された上記結合を標準と比較し、前記標準に対する結合の差異がＣｈｅｍＲ２３の調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候とする工程
    を含む方法。
  42. ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法であって、
    ａ）組織サンプルをＴＩＧ２ポリペプチドに特異的抗体と接触させる工程；
    ｂ）前記抗体と前記組織サンプルとの結合を検出する工程；
    ｃ）工程（ｂ）で検出された上記結合を標準と比較し、前記標準に対する結合の差異がＣｈｅｍＲ２３の調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候とする工程
    を含む方法。
  43. ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法であって、
    ａ）組織サンプルと、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドの特異的抗体及びＴＩＧ２ポリペプチドの特異的抗体とを接触させる工程；
    ｂ）前記抗体と前記組織サンプルとの結合を検出する工程；
    ｃ）工程（ｂ）で検出された上記結合を標準と比較し、前記標準に対する抗体のいずれか一方又は双方との結合の差異が、ＣｈｅｍＲ２３の調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候とする工程
    を含む方法。
  44. ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法であって、
    ａ）組織サンプルから核酸を単離する工程；
    ｂ）鋳型として、該核酸を用いて、ＣｈｅｍＲ２３ポリヌクレオチドを増幅する工程；
    ｃ）工程（ｂ）で製造された、増幅させたＣｈｅｍＲ２３ポリヌクレオチドの量と、標準とを比較し、前記標準に対して前記増幅させたＣｈｅｍＲ２３ポリヌクレオチド量との差異があれば、ＣｈｅｍＲ２３の調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候とする工程
    を含む方法。
  45. ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法であって、
    ａ）組織サンプルから核酸を単離する工程；
    ｂ）鋳型として、該核酸を用いて、ＣｈｅｍＲ２３ポリヌクレオチドを増殖する工程；
    ｃ）工程（ｂ）で製造された、増殖させたＣｈｅｍＲ２３ポリヌクレオチドの配列と標準とを比較し、前記標準に対して前記配列に差異があれば、ＣｈｅｍＲ２３の調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候とする工程
    を含む方法。
  46. 前記標準は、配列ＩＤ ＮＯ：１である請求項４５に記載の方法。
  47. ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法であって、
    ａ）組織サンプルから核酸を単離する工程；
    ｂ）鋳型として該核酸を用いて、ＴＩＧ２ポリヌクレオチドを増幅する工程；及び
    ｃ）工程（ｂ）で製造され、増幅させたＴＩＧ２ポリヌクレオチドの量と標準とを比較し、前記標準に対して前記増幅させたＴＩＧ２ポリヌクレオチド量に差異があれば、ＣｈｅｍＲ２３の調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候とする工程
    を含む方法。
  48. ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法であって、
    ａ）組織サンプルから核酸を単離する工程；
    ｂ）鋳型として核酸を用いて、ＴＩＧ２ポリヌクレオチドを増殖する工程；
    ｃ）工程（ｂ）で製造された、増殖させたＴＩＧ２ポリヌクレオチドの配列と標準とを比較し、前記標準に対する前記配列の差異が、ＣｈｅｍＲ２３の調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候とする工程
    を含む方法。
  49. 前記配列比較工程は、ミニ配列決定（minisequencing）を含む請求項４５又は４８に記載の方法。
  50. 前記標準は、配列ＩＤ ＮＯ：７である請求項４５に記載の方法。
  51. 前記量の比較は、マイクロアレー上で行われる請求項４４又は４７に記載の方法。
  52. 前記配列の比較は、マイクロアレー上で行われる請求項４５又は４８に記載の方法。
  53. 前記疾患又は疾病は、癌、腫瘍転移、炎症疾患、自己免疫疾患、受け継がれた又は獲得した免疫欠損、骨粗鬆症、骨治癒、骨組織移植、移植片拒絶反応、乾癬、湿疹、皮膚の炎症性感染及び栄養疾患、ウィルス感染、バクテリア感染、寄生虫感染、女性の不育症、並びに卵巣癌及び子宮癌からなるなる群より選ばれるＣｈｅｍＲ２３関連疾患又はＣｈｅｍＲ２３関連疾病である請求項４１〜５２のいずれかに記載の方法。
  54. 前記疾患又は疾病は、骨粗鬆症、骨治癒、骨組織移植、移植片拒絶反応、乾癬、湿疹、皮膚の炎症性感染及び栄養疾患、ウィルス感染、バクテリア感染、寄生虫感染、女性の不育症、並びに卵巣癌及び子宮癌からなるなる群より選ばれるＣｈｅｍＲ２３関連疾患又はＣｈｅｍＲ２３関連疾病である請求項４１〜５２のいずれかに記載の方法。
  55. 単離されたＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドと単離されたＴＩＧ２ポリペプチドを含む組成物。
  56. ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに対して特異的な抗体。
  57. ＴＩＧ２ポリペプチドに特異的な抗体。
  58. ＣｈｅｍＲ２３のシグナリング活性をモジュレートする物質をスクリーニングするためのキットであって、単離されたＣｈｅｍＲ２３ポリペプチド及び該ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドをパッケージングする材料を含んでいるキット。
  59. さらにＴＩＧ２ポリペプチドを含む請求項５８に記載のキット。
  60. ＣｈｅｍＲ２３のシグナリング活性をモジュレートする物質をスクリーニングするためのキットであって、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドと、該ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドをパッケージングする材料を含んでいるキット。
  61. ＴＩＧ２ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに含む請求項６０に記載のキット。
  62. ＣｈｅｍＲ２３のシグナリング活性をモジュレートする物質をスクリーニングするキットであって、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞と、該細胞をパッケージングする材料を含んでいるキット。
  63. ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法であって、単離されたＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドと該ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドをパッケージングする材料を含んでいるキット。
  64. 前記請求項のいずれかで定義されるＴＩＧ２ポリペプチドをさらに含む請求項６３のキット。
  65. ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法であって、ＣｈｅｍＲ２３をコードする単離されたポリヌクレオチドと該ポリヌクレオチドをパッケージングする材料を含んでいるキット。
  66. 前記請求項のいずれかで定義されるＴＩＧ２ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを、さらに含む請求項６５に記載のキット。
  67. ＣｈｅｍＲ２３シグナリングの調節不良（dysregulation）によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法であって、ＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞と、該細胞をパッケージングする材料を含んでいるキット。
  68. ＣｈｅｍＲ２３をコードする遺伝子におけるホモ接合型ヌル変異を有する非ヒトほ乳類。
  69. ＣｈｅｍＲ２３ポリヌクレオチドのためのトランスジェニック非ヒトほ乳類。
  70. 前記請求項のいずれかで定義されたＴＩＧ２ポリヌクレオチドのためのトランスジェニック非ヒトほ乳類。
  71. 前記ＴＩＧ２ポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：８で表されるポリペプチドに対して、少なくとも３１％以上のアイデンティティ、４５％，５５％，６５％，７５％，８５％，９５％またはほぼ１００％のアイデンティティを有するポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：２の配列を有するＣｈｅｍＲ２３ポリペプチドに特異的に結合して、該ＣｈｅｍＲ２３のシグナリング活性を活性化する、請求項４１〜５４のいずれかに記載の方法、請求項５５に記載の組成物、又は請求項５８〜６７に記載のキット。
  72. 前記ＴＩＧ２ポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：８の全長ポリペプチドの断片であって、該断片は、配列ＩＤ ＮＯ：８の全長ポリペプチドのシグナリング活性レベル及び結合活性の少なくとも５０％を保持している、請求項４１〜５４のいずれかに記載の方法、請求項５５に記載の組成物、又は請求項５８〜６７に記載のキット。
  73. 前記ＴＩＧ２ポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：８に関して１以上の付加、挿入、欠失、又は置換を含んでいる請求項４１〜５４のいずれかに記載の方法、請求項５５に記載の組成物、又は請求項５８〜６７に記載のキット。
  74. 前記ＴＩＧ２ポリペプチドは、配列ＩＤ ＮＯ：４８又は配列ＩＤ ＮＯ：５０乃至６０のいずれかで表される末端切断型ＴＩＧ２ポリペプチドである請求項４１〜５４のいずれかに記載の方法、請求項５５に記載の組成物、又は請求項５８〜６７に記載のキット。
  75. 前記ＴＩＧ２ポリペプチドは、ＴＩＧ２融合タンパク質を形成する付加的配列を含んでいる請求項４１〜５４のいずれかに記載の方法、請求項５５に記載の組成物、又は請求項５８〜６７に記載のキット。
  76. 前記付加的配列は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列、マルトース結合タンパク質配列、アルカリフォスファターゼ配列、チオレドキシン配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列、ヒスチジンタグ（例えば６Ｘ又はより大きなＨｉｓ）配列、又はエピトープタグ（例えばＭｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ）配列からなる群より選ばれることができる請求項７５に記載の方法。
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