PT1455190E - Processo para a determinação do efeito hormonal de substâncias por meio da interacção entre o receptor de androgénio e a proteína do sarcoma de ewing - Google Patents

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DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A DETERMINAÇÃO DO EFEITO HORMONAL DE SUBSTÂNCIAS POR MEIO DA INTERACÇÃO ENTRE O RECEPTOR DE ANDROGÉNIO E A PROTEÍNA DO SARCOMA DE EWING" A invenção refere-se a um processo para a determinação do efeito hormonal de substâncias bem como a um processo para a determinação de perturbações no mecanismo de co-modulação do receptor de androgénio. Além disso, a invenção refere-se à utilização de proteina do sarcoma de Ewing (EWS) ou de derivados de EWS que apresentam os aminoácidos 319 até 656 da sequência descrita na sequência ID N°. 1 bem como a ácidos nucleicos que codificam para os mesmos.

Na apreciação de substâncias para uma possível utilização farmacêutica, é geralmente habitual verificar estas substâncias no que se refere a uma eventual actividade hormonal, em especial no que se refere a uma actividade androgénica ou antiandrogénica possivelmente existente. No caso de administração de substâncias farmacologicamente activas, são importantes os conhecimentos sobre os seus efeitos hormonais, em especial efeitos androgénicos ou antiandrogénicos, para a apreciação de eventuais efeitos secundários. Para a verificação da actividade hormonal de substâncias são utilizados, por exemplo, processos nos quais é medida a capacidade das substâncias de se ligarem aos receptores de hormonas e de activar a sua actividade de transcrição.

Os conhecimentos sobre os efeitos hormonais de substâncias 1 são, no entanto, não apenas de interesse em fármacos potenciais, mas também em substâncias não farmacêuticas, uma vez que se admite que muitas substâncias que ocorrem no ambiente possam apresentar em parte da população uma actividade androgénica ou antiandrogénica ou estrogénica ou antiestrogénica. Possivelmente resulta deste modo uma acção prejudicial indesejável.

Uma dificuldade especial reside na identificação e na caracterização de efeitos sobre as actividades mediadas por hormonas esteróides, uma vez que as cascatas de sinalização e os entrelaçamentos, que por último comandam a regulação da transcrição mediada pelas hormonas, assumem neste caso formas especialmente complexas. A razão para isso reside na formação muito semelhante das sequências alvo de ADN, às quais os diferentes receptores de hormonas esteróides se ligam após activação por ligandos. Isto implica que os receptores nucleares dependem, para desencadearem uma resposta dirigida, da interacção com co-factores especiais, que fortalecem, entre outros, a especificidade da activação da transcrição mediada pelos receptores.

Para a identificação de substâncias que actuam sobre determinadas vias de sinais induzidos por hormonas, são necessários, por conseguinte, sistemas e processos de ensaio que podem detectar, de modo dirigido, a função de componentes individuais do entrelaçamento de sinais celulares para a mediação de efeitos esteroidais.

Subsiste, por conseguinte, uma necessidade de um processo com o qual se possa, de um modo seguro, sensivel, simples, económico e rápido, encontrar uma informação sobre o efeito hormonal de substâncias. Os processos conhecidos até agora não 2 satisfazem esta necessidade. A presente invenção tem, por isso, como objectivo proporcionar um processo com o qual se possa de um modo seguro, sensivel, simples, económico e rápido encontrar uma informação sobre o efeito hormonal das substâncias a ensaiar.

Este objectivo é alcançado de acordo com a invenção por meio de um processo para a determinação do efeito hormonal de substâncias com os passos de fazer contactar a proteina do sarcoma de Ewing (EWS) ou um derivado desta que apresente os aminoácidos 319 até 656 da sequência descrita na Seq. ID N°. 1 com o receptor de androgénio e uma substância a ensaiar e a. determinação da influência da substância em ensaio sobre a ligação de EWS ou do seu derivado e do receptor de androgénio, ou b. determinação da influência da substância em ensaio sobre a actividade induzida por ligandos do receptor de androgénio.

Como derivado de uma proteina ou de um polipeptídeo entende-se no âmbito da presente invenção qualquer variante da proteina ou do polipeptideo, p. ex., obtida por meio de eliminação, substituição, inserção, inversão, adição ou permuta de aminoácidos. Dentre estes, são preferidos os derivados que possuem conservada a capacidade da proteína/polipeptideo não modificados, p. ex., de influenciar ou, pelo menos, de se ligarem a outras proteinas (derivados funcionais). A invenção baseia-se na constatação surpreendente de que a proteina do sarcoma de Ewing bem como os seus derivados que 3 abrangem os aminoácidos 319 até 656 da sequência descrita em Seq. ID N°.1 (doravante designada por EWS) possuem a capacidade de interagir com o receptor de androgénio e modular a sua actividade. Araya et ai. (JBC, 2003, vol. 278, 5427-5432 revelam a interacção entre EWS e o receptor nuclear HNF4 alfa. A superfamilia dos receptores nucleares (NRs), a que pertencem mais de 50 diferentes proteínas, é um grupo de factores de transcrição aparentados que comandam a transcrição do respectivo gene alvo como reacção a ligandos específicos, p. ex. hormonas. A família pode ser dividida em várias subfamílias segundo determinadas características, como p. ex. estado de dimerização, tipo do ligando ou estrutura do elemento de reacção de ADN (Beato et ai., 2000, Human Reproduct. Update, 6, 225- 236). É uma característica distintiva dos NRs a estrutura concordante do domínio funcional (com as designações de A a F) com uma região terminal em N fortemente variável, apenas fracamente conservada com função de activação constitutiva autónoma (AF-1), um domínio de ligação de ADN fortemente conservado (DBD), que é responsável pelo reconhecimento de elementos de reacção de ADN especiais e que é constituído por dois motivos denteados, um domínio de charneira variável e um domínio de ligação de um ligando terminal em C multifuncional conservado (LBD) com função de transactivação (AF-2) dependente de dimerização e dos ligandos. Em ligação com aqueles, segue a região terminal em C mais distante, cuja função não é conhecida e em que faltam receptores, como p. ex. PR (receptor da progesterona), PPAR (receptor activado de proliferação de peroxissoma) e RXR (receptor X de retinóide) (Mangelsdorf &

Evans, 1995; Cell, 83, 841-850; Robyr et ai., 2000, Mol.

Endocrinol., 14, 329-347). Para alguns NRs (p. ex. o receptor de androgénio (AR)), foi detectado que a região terminal em N tem a 4 capacidade de interagir com a região terminal em C (Brinkmann et al., 1999, J. Steroid Blochem. and Mol. Biol., 69, 307-313) . Os receptores de hormonas esteróides como, p. ex., os receptores de estrogénios (ER), de progesterona (PR), de glucocorticóides (GR) , de mineralcorticóides (MR) e de androgénios (AR) , ligam ligandos esteroidais que derivam da pregnenolona, como as progestinas, os estrogénios, os glucocorticóides e os mineralcorticóides, bem como androgénios. A ligação de ligandos activa o receptor e comanda a expressão dos correspondentes genes alvo. A EWS é conhecida como proto-oncogene do sarcoma de Ewing e de outras neoplasias, como p. ex. o sarcoma das células claras de tendões e aponeuroses, os tumores intra-abdominais desmoplásicos de células pequenas e redondas bem como condrossarcoma extraesqueléticos (Delattre, O., Zucman, J., Plougastel, B., Desmaze, C., Melot, T., Peter, M., Kovar, H., Joubert, 1., de Jong, P., Rouleau, G., Aurias, A., e Thomas, G., 1992, Nature 359: 162-165, Zucman, J., Delattre, O., Desmaze, C., Epstein, A. L., Stenman, G., Speleman, F., Fletchers, C.D., Aurias, A., e Thomas, G; 1993, Nature Genet. 4: 341-345, Gerald, W. L, Rosai, J. e Ladanyi, M., 1995, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 1028-1032, Laballe, Y., Zucman, J., Stenman, G., Kindblom, L.G., Knight, J., Turc-Carel, C., Dockhom-Dwomiszak, B., Mandahl, N., Desmaze, C., Peter, M., Aurias, A., Delattre, O., e Thomas, G., 1995, Hum. Mol. Genet. 4: 2219-2226). Em todos estes tumores o local do gene da EWS está rearranjado, de modo que a extremidade dos aminoácidos (terminal N) da proteína se funde com um domínio de ligação de ADN de FLI1, ERG1, ATFl ou WT1. Esta extremidade N-terminal da proteína de fusão contém os exões da EWS la7oula8oula9. Quando o ponto de ruptura se situa entre o exão 7 e o exão 8, a fraeção de EWS da proteína 5 resultante da fusão não apresenta qualquer concordância com o domínio de ligação do receptor de androgénio aqui definido. Quando pelo contrário o ponto de ruptura se situa entre os exões 8 e 9 ou 9 e 10, apenas há concordância de 5 ou 20 aminoácidos de ambas as proteínas de fusão de EWS oncogénicas com a fracção de EWS que contém o domínio de ligação do receptor de androgénio. Daqui conclui-se que as proteínas de fusão de EWS rearranjadas perderam a capacidade para a ligação a receptores de androgénio.

Na análise de ARN do timo por meio de RT-PCR foi encontrada uma variante de EWS (EWSl-c) na qual faltam 17 aminoácidos (Figura 3) . Evidentemente, trata-se neste caso de uma variante de ensambladura, uma vez que estavam disponíveis todas as sequências de consenso necessárias nos pontos de junção entre intrões e exões. O resultado foi um encurtamento do exão 15 (exão 15b) . Do estado da técnica são além disso conhecidas outras variantes de ensambladura. Uma (Ohno, T., Ouchida, M., Lee, L., Gatalica, Z., Rao, V.N., e Reddy, E.S., 1994, Oncogene 9: 3087-3097) representa uma transcrição de EWS encurtada em 200 pb (EWSl-b) e foi encontrada em linfócitos em repouso ou estimulados por meio de fito-hemaglutinina (PHA). À EWSl-b faltam os exões 8 e 9. Uma outra variante (Melot, T., Dauphinot, L., Sevenet, N., Radvanyi, F., Delattre, O. (2001), Eur. J. Biochem. 268, 3483-3489) contém um exão adicional 4' entre os exões 4 e 5 e é designada como uma isoforma específica do cérebro. A EWS pertence a um grupo de proteínas que se ligam a ARN, às quais é atribuída no estado da técnica uma implicação em processos da síntese ou de processamento de ARN, mas, além disso, até agora apenas pouco se conhecia sobre a função 6 fisiológica da EWS somática de tipo selvagem. Em especial, no estado da técnica não era conhecido gue a EWS possuísse a capacidade de ligar receptores nucleares e de modular a sua actividade, pelo gue é agregada à classe dos co-moduladores de NR.

Uma estirpe de E. coli com a designação de Escherichia coli EWS-10 CMX foi depositada sob o número DSM 15417 em 24 de Janeiro de 2003 na deutschen Sammlung von Mikrooganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ). A estirpe Escherichia coli EWS-10 CMX contém o comprimento total do ADNc de EWS, gue pode ser utilizado no processo de acordo com a invenção.

Os chamados co-moduladores são uma classe de proteínas que servem de moléculas ponte na activação (co-activadores) ou na repressão (co-repressores) da transcrição genética entre o complexo de iniciação de transcrição e os NRs (McKenna et al., 1999, Endocr. Rev., 20, 321-347). Um co-activador deve ser capaz de fortalecer a função do receptor e de interagir directamente na presença de um agonista com o domínio de activação de NRs. Deve também interagir com o aparelho de transcrição basal e por fim não deve por si próprio fortalecer a actividade de transcrição basal. A maioria dos co-moduladores interage com o auxílio de um ou vários motivos LXXLL (caixas NR) com o domínio AF-2 de NRs, no entanto foram também descritos alguns co--moduladores que interagem com outras regiões de NR (Ding et al., 1998, Mol. Endocrinol., 12, 302-313). Além disso, foram identificados muitos co-moduladores que interagem de modo semelhante com muitos NRs diferentes. O processo de acordo com a invenção pode decorrer tanto in vitro (por conseguinte, p. ex., como análise puramente 7 bioquímica pura ou biofísica, em solução ou em matrizes sólidas apropriadas, etc.) como também parcial ou completamente no sistema celular. Estes diferentes sistemas de ensaio são suficientemente conhecidos do especialista.

De um modo preferido, pelo menos um dos passos processuais decorre no sistema celular, uma vez que os efeitos da activação da transcrição mediada por esteróides podem ser representados de modo especialmente satisfatório no contexto fisiológico da célula. Portanto, são especialmente adequadas para a invenção células eucarióticas, podendo ser utilizadas tanto células primárias como também linhagens celulares estabelecidas. A utilização de linhagens celulares estabelecidas possibilita uma reprodutibilidade especialmente boa e económica, a utilização de células primárias evita, por outro lado, artefactos de cultura celular condicionados essencialmente por meio de mutação e selecção clonal. São especialmente apropriadas células da próstata, células nervosas, células gliais, fibroblastos, células sanguíneas, osteoblastos, osteoclastos, hepatócitos, células epiteliais ou células musculares. 0 efeito hormonal aqui determinado (isto é, identificado, quantificado ou caracterizado) pode ser de natureza tanto de activação como, também, de inibição e além da acção sobre a ligação receptor-co-modulador cobre também qualquer outro passo da acção de NR, p. ex. a transactivação induzida por ligandos mas, também, a localização nuclear do NR.

De acordo com uma forma de realização preferida, o processo de acordo com a invenção abrange os seguintes passos: a. Em primeiro lugar, as células que expressam a EWS ou um derivado desta que apresenta os aminoácidos 319 até 656 da sequência descrita em Seq. ID N°. 1 e o receptor de androgénio, são expostas à substância a ensaiar. b. Segue-se então a determinação da influência da substância sobre a interacção entre o receptor e a EWS ou o seu derivado atrás mencionado por meio de medição da interacção proteina-proteína ou da interacção proteina-proteina-ADN. A expressão de um ou de ambos os componentes que interagem entre si (EWS/derivado por um lado e NR/derivado por outro lado) pode ter lugar na célula naturalmente ou em consequência de transfecção transiente ou estável com vectores de expressão adequados. A selecção de tipos de células apropriados e eventualmente sistemas de vectores representa uma medida familiar do especialista competente. Para a expressão no sistema eucariota são adequados, por exemplo, como vectores pCMX ou pSG5 . A medição da interacção proteina-proteina entre receptor ou derivado e EWS ou derivado ou da interacção proteina-proteina-ADN, dos componentes atrás citados com a sequência alvo de ADN tem lugar por meio de medidas conhecidas do especialista. Para esse fim, são apropriadas, por exemplo, técnicas como o sistema Two-Hybrid, a co-imunoprecipitação, GST-Pull-down-Assays, análises de FRET e análises ABDC ou análises de retardamento em gel para a análise de interacções proteina-proteina-ADN.

Uma forma de realização preferida do processo de acordo com a invenção abrange os passos de: a. expor células que expressam a EWS ou um derivado desta 9 que apresenta os aminoácidos 319 até 656 da sequência descrita em Seq. ID N°. 1 e o receptor de androgénio e são transfectadas com uma construção de gene relator ao ligando do receptor de androgénio e à substância a ensaiar, b. determinar a actividade de transcrição do receptor de androgénio por meio de medição da actividade do gene relator e c. comparação com a actividade da transcrição na realização dos passos a e b na ausência da substância a ensaiar.

Os genes relatores são genes ou fragmentos genéticos que codificam para produtos genéticos o mais possível facilmente detectáveis, p. ex. por via fotométrica por meio de reacções coradas. Os genes relatores frequentemente utilizados são o gene para a β-galactosidase, o gene para a fosfatase alcalina, o gene para a acetiltransferase de cloranfenicol, o gene para a dioxigenase de catecol, o gene para a "green" ou "blue fluorescent protein", bem como diferentes sequências que apresentam genes da luciferase, que podem tornar as células luminosas. Por meio de intercalação de um elemento de controlo adequado, p. ex. uma sequência promotor-intensificador, que está sob o controlo de um factor de transcrição determinado ou de uma cascata de transdução de sinal determinada, é possível, por exemplo, determinar a actividade do factor de transcrição ou da cascata por meio da quantidade do produto genético expresso.

De modo habitual, introduzem-se os genes relatores deste tipo em vectores apropriados intercalando a sequência promotor-intensif icador de interesse nas células. Para a análise da actividade esteroidal de substâncias, são adequadas - dependendo 10 do NR a analisar - todas as sequências alvo de NR conhecidas. Um exemplo de um tal vector é o vector da luciferase de MMTV, que é utilizado para a medição da actividade androgénica de substâncias.

As substâncias com um efeito hormonal, de um modo preferido um efeito androgénico/antiandrogénico, são então reconhecíveis pela expressão aumentada ou reduzida do gene relator em comparação com amostras experimentadas sem adição da substância a ensaiar.

Para a utilização no âmbito da presente invenção são adequadas, além da EWS de tipo selvagem, derivados da EWS que apresentam os aminoácidos 319 até 656 da sequência descrita em sequência ID N°.1 e, em especial, derivados da EWS funcionais que apresentam os aminoácidos 319 até 656 da sequência descrita em sequência ID N°.l, que possuem conservada a capacidade de modular a actividade de pelo menos um receptor nuclear, em especial a dos receptores de androgénio, ou pelo menos de se ligarem a este (de modo detectável e a não descurar por meio de métodos apropriados - p. ex. em análises de interacção proteína--proteína como EMSA; o especialista competente pode aqui diferenciar). A EWS e os ácidos nucleicos que codificam para a EWS são já conhecidos no estado da técnica (ver acima). Para a utilização no âmbito da presente invenção é de um modo preferido apropriada uma EWS codificada por meio de ácidos nucleicos de acordo com a Seq. ID N°. 1 ou um derivado desta apropriado (em especial um derivado funcional), que apresentam os aminoácidos 319 até 656 da sequência descrita em sequência ID N°. 1. É especialmente preferido um derivado da EWS que apresenta os aminoácidos 319 11 até 656 da sequência descrita em Seq. ID N°. 1, em especial um fragmento que é constituído por estes aminoácidos. A invenção refere-se, em conformidade, também à utilização da EWS ou dos seus derivados que apresentam os aminoácidos 319 até 656 da sequência descrita em sequência ID N°. 1 para a identificação e caracterização de substâncias que influenciam a actividade do receptor de androgénio. 0 processo de acordo com a invenção ou a utilização de acordo com a invenção das proteínas referidas ou dos ácidos nucleicos referidos é especialmente apropriada para a análise do efeito hormonal de substâncias sobre receptores de androgénio. Com base na actividade especialmente bem caracterizada da EWS ou dos derivados da EWS atrás mencionados sobre o receptor de androgénio, este é utilizado em formas de realização da invenção especialmente preferidas.

Para além disso, a EWS pode encontrar utilização como indicador clínico de doenças causadas por androgénios. São doenças relevantes causadas por androgénios, p. ex., o cancro da próstata, a formação de alopecia, o acne ou o hipogonadismo, bem como síndromes de resistência aos androgénios, como p. ex. a feminização testicular. Estas dependem provavelmente de defeitos no mecanismo da co-modulação entre o receptor de androgénio (AR) e a EWS. Uma possibilidade plausível de diagnóstico em doentes com perturbações deste tipo consiste, por conseguinte, na medição das quotas relativas de AR e EWS. Isto é possível por meio de utilização de processos quantitativos para a medição da quantidade relativa de ambas as moléculas no tecido alvo no respectivo doente. 12 A invenção é seguidamente elucidada mais em pormenor com base num exemplo com referência às figuras.

Representa-se: na Figura 1 uma representação esquemática do gene para o receptor de androgénio (AR) e o fragmento AR2,

na Figura 2 uma representação esquemática do gene para a proteína do sarcoma de Ewing (EWS), na Figura 3 as sequências de exões e proteínas de EWS na Figura 4 a co-activação do sinal de AR em células SH-SY5Y, A Figura 5 mostra a distribuição nos tecidos da transcrição de EWS (Fig. 5a) e da transcrição de AR (Fig. 5b).

Exemplo 1:

Oligonucleótidos utilizados:

Iniciador para a amplificação por PCR da biblioteca de inserções:

Act2c5050Eco: gattacgctagcttgggtgg (SEQ ID N°. 3)

Act2-4939Xho: gttgaagtgaacttggcgggg (SEQ ID N°. 4)

Iniciador para a amplificação de ADNc de EWS no comprimento integral: EWS-8-Sal: gggtcgacggacgttgagagaacgagg (SEQ ID N°. 5) cESW-c2032-Eco: gggaattctgcggggtctctgcatctagtaggg (SEQ ID N°. 6)

Iniciador de sequenciação: XII-139a1: gcttgggtggtcatatgg (SEQ ID N°. 7) 13

Vectores utilizados: pACT2 (número de acesso no Genbank U29899) para a biblioteca; derivados de pGBT9 para as sondas: pGBT9rev e pGBT(+l)rev (Roder, K. H.; Wolf, S.S.; Schweizer, M., 1996, Analytical

Biochemistry 241, 260-62); vector pCR2.1Topo (firma Invitrogen) para a clonagem de fragmentos de PCR; vector CMX para a expressão em células de mamífero; pAHluc para a análise por gene relator (contém o promotor de MMTV e um gene relator de luciferase; firma A. Cato); pSGSAR (pSG5 com o gene humano do receptor de androgénio; número de acesso no Genbank AAA51775).

Organismos utilizados:

Estirpes de leveduras: Y187 e PJ69-2A Estirpe de E. coli: DH5a Células de mamífero: SH-SYSY (Deutsche Sammlung von

Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ): DSM ACC209); PC3 (American type Culture Collection (ATCC): CRL-1435); PC3AR: PC3 transfectado de forma estável com pSGSAR (firma A. Cato, Karlsruhe, Alemanha).

Para a identificação de novos co-moduladores do receptor de androgénio, submeteu-se a selecção, com o auxílio do sistema de dois híbridos de levedura, uma biblioteca de ADNc humano ("Matchmaker" da firma Clontech; N°. HY4028AH) de cérebro fetal 14 com três diferentes fragmentos do receptor de androgénio (AR) como sonda.

Para esse fim, cindiu-se o vector pSG5AR, que contém o ADNc para o AR humano (Genbank AAA51775), com o auxilio da endonuclease PstI, de tal modo que resultaram três diferentes fragmentos de ADN de AR. O mais curto destes fragmentos (AR4) codifica para o terminal em N do receptor (AA 1-56) , o médio (AR3) para a parte média com os domínios de activação (AA 57-324) e o mais comprido (AR2) para o terminal em C (AA 325-918) com o domínio de ADN e o domínio de ligação ao ligando (DBD e LBD; compare-se com a resenha na Figura 1). O AR2 foi clonado no vector pGBT9(+1)rev, depois de este ter sido linearizado com o auxílio de PstI.

Em seguida teve lugar a transformação do vector pGBT, que continha o fragmento AR, na estirpe de levedura Pj69-23A. Os transformadores positivos (Trp+) foram incubadas de acordo com as instruções do fabricante (Clontech) com uma biblioteca de ADNc obtida a partir de cérebro fetal (Humane Multiple-Tissue-cDNA (MTC), Panei II da firma Clontech; N°. de catálogo K1421-1). Em concordância com as instruções do fabricante (Clontech), submeteram-se a selecção 3xl06 clones. Os clones positivos foram seleccionados e ensaiados no que se refere à sua actividade de β-galactosidase de acordo com as instruções do fabricante (Clontech). As inserções de colónias azuis provenientes da biblioteca foram amplificadas por meio de PCR e com utilização dos iniciadores Act2c5050Eco e Act 2-4939Xho directamente a partir de células de levedura.

Os produtos de PCR foram separados segundo o seu comprimento por electroforese em gel e seguidamente analisados 15 por meio de clivagem com Mspl. Pelo menos um exemplar de cada padrão de fragmento de restrição foi sequenciado por utilização de XII-139al como iniciador de sequenciação. As sequências foram comparadas com o Genbank ou com o banco de dados Incyte.

Uma das inserções identificada várias vezes tinha um comprimento de 1500 pb e pôde ser identificada por meio de sequenciação e comparação de sequências com o banco de dados NCBJ como codificando para a parte C-terminal da EWS humana (AA 319-656) (resenha na Figura 2/ sequência de aminoácidos na Figura 3). A Figura 3 mostra a sequência de ADNc da EWS humana juntamente com a sequência de aminoácidos derivada. São representados os exões 1 até 17. As letras em negrito representam o fragmento que se encontra em sistemas de dois híbridos de levedura e se liga à fracção do AR do AA 325 até ao AA 919. Estão sublinhadas as regiões de sequências que faltam nas variantes de splice EWSl-b (sublinhado contínuo) ou EWSl-c (sublinhado a ponteado).

Por meio de PCR e com utilização dos iniciadores EWS-8-Sal e cEWS-c2032-Eco bem como de ADNc de timo ou de baço da firma Clontech, amplificou-se a EWS no comprimento integral, tendo sido isolada a partir do baço a região codificadora integral da transcrição e a partir do timo a variante com o exão 15 B em vez do exão 15. O ADNc amplificado foi então clonado com EcoRI e Sal I no bloco integrado de expressão do vector de expressão de mamífero CMX.

Como resulta do diagrama de barras representado na Figura 4, a EWS é capaz, após transfecção transiente em células 16 SH-SY5Y, de provocar uma forte co-activação da actividade de sinal do AR, em especial a concentrações de androgénio reduzidas de 10“12 a 10“10 mol. Para esse fim, co-transfectaram-se em placas de reacção com, em cada caso, seis poços de reacção, células SH--SY5Y com 0,75 pg de um vector que continha o ADNc para o receptor de androgénio humano (pSG5AR), 1,5 pg da construção de gene relator pAHIuc, que contém o promotor de MMTV antes do gene da luciferase, e 1 pg do vector EWS-CMX. A transfecção foi efectuada com utilização de lipofectina da firma Gibco BRC de acordo com as instruções do fabricante. Vinte e quatro horas depois da transfecção, as células foram incubadas de um dia para o outro com diferentes quantidades de androgénio. As células foram lisadas com um tampão de lise habitual e a actividade de luciferase foi medida no luminómetro Lumistar da BMG Lab Technologies. As actividades de luciferase de EWS-CMX foram comparadas com as actividades do controlo (vector de CMX vazio). A mistura em cada poço foi medida em quatro poços de uma placa de microtitulação. Os valores de controlo da substância sem DHT foram subtraídos. O desvio padrão é representado na Figura 4 por meio de barras. A distribuição pelos tecidos da EWS humana em tecidos humanos normais é visivel na Figura 5a por meio das autorradiografias representadas. Para este fim, marcou-se um fragmento de ADNc de EWS, que codifica para os aminoácidos 244 a 656 da EWS, de acordo com o sistema de marcação de ADN Megaprime™ (Amersham Life Science) com a-32PdATP e o fragmento de Klenow. O fragmento marcado foi purificado numa coluna de Nick (Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante e hibridado com blots humanos; Human Northern Blot (MTN) da firma Clontech (n.oS 7760-1 e 7759-1) da firma Clontech. Como resulta da Figura 5a, o ARN de EWS é expresso predominantemente nos 17 testículos. Além disso, são detectáveis na maioria dos órgãos investigados diferentes quantidades de EWS. A Fig. 5b mostra a distribuição pelos tecidos do AR humano em tecidos humanos normais. A partir das Figs. 5a e 5b é possível avaliar a expressão normal destas duas proteínas no tecido. A Figura 4 mostra a co-activação do sinal de AR em células SH-SY5Y. Numa placa de reacção com seis poços para reacções adicionaram-se por poço 1 pg de co-activador, 1,5 pg de luciferase MMTV e 0,75 pg de plasmídeo pSG5AR. As seis misturas foram colocadas em cada caso em quatro poços de uma placa de microtitulação e aí medidas. O desvio do erro é indicado como DP. Em todos os sinais foram subtraídos os valores dos correspondentes controlos sem DHT. A Figura 5a mostra a distribuição pelos tecidos da transcrição de EWS (Northern Blot MTN da firma Clontech) . De acordo com as instruções do fabricante (Amersham) , foi efectuada uma iniciação aleatória do fragmento de ADNc de EWS, que codificava para os aminoácidos 244 até 656, e uma marcação com a-32PdATP e o fragmento de Klenow. Os blots foram hibridados com as sondas, lavados, depositados sobre uma película e revelados. 18

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> JENAPHARM GmbH & Co. KG <12 0> Processo para substâncias <130> Pat 3684/11 <140> <141> <160> 7 <17 0> Patentln Ver. 2. <210> 1 <211> 2390 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> EWS <221 > CDS <222> (44) . . (2011) <4 0 0> 1 19 agagggagac ggacgttgag agaacgagga ggaaggagag aaa atg gcg tcc acg 55

Met Ala Ser Thr 1 gat tac agt acc tat age caa gct gca gcg cag cag ggc tac agt gct 103 Asp Tyr Ser Thr Tyr Ser Gin Ala Ala Ala Gin Gin Gly Tyr Ser Ala 5 10 15 20 tac acc gcc cag ccc act caa gga tat gca cag acc acc cag gca tat 151 Tyr Thr Ala Gin Pro Thr Gin Gly Tyr Ala Gin Thr Thr Gin Ala Tyr 25 30 35 999 caa caa age tat gga acc tat gga cag ccc act gat gtc age tat 199 Gly Gin Gin Ser Tyr Gly Thr Tyr Gly Gin Pro Thr Asp Vai Ser Tyr 40 45 50 acc cag gct cag acc act gca acc tat 999 cag acc gcc tat gca act 247 Thr Gin Ala Gin Thr Thr Ala Thr Tyr Gly Gin Thr Ala Tyr Ala Thr 55 60 65 tct tat gga cag cct ccc act ggt tat act act cca act gcc ccc cag 295 Ser Tyr Gly Gin Pro Pro Thr Gly Tyr Thr Thr Pro Thr Ala Pro Gin 70 75 80 gca tac age cag cct gtc cag ggg tat 99c act ggt gct tat gat acc 343 Ala Tyr Ser Gin Pro Vai Gin Gly Tyr Gly Thr Gly Ala Tyr Asp Thr 85 90 95 100 20 acc act gct aca gtc acc acc acc cag gcc tcc tat gca gct cag tct 391 Thr Thr Ala Thr val Thr Thr Thr Gin Ala Ser Tyr Ala Ala Gin Ser 105 110 115 gca tat ggc act cag cct gct tat cca gcc tat ggg cag cag cca gca 439 Ala Tyr Gly Thr Gin Pro Ala Tyr Pro Ala Tyr Gly Gin Gin Pro Ala 120 125 130 gcc acc gca cct aca aga ccg cag gat gga aac aag ccc act gag act 487 Ala Thr Ala Pro Thr Arg Pro Gin Asp Gly Asn Lys Pro Thr Glu Thr 135 140 145 agt caa cct caa tct age aca 999 ggt tac aac cag ccc age cta gga 535 Ser Gin Pro Gin Ser Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Gin Pro Ser Leu Gly 150 155 160 tat gga cag agt aac tac agt tat ccc cag gta cct ggg age tac ccc 583 Tyr Gly Gin Ser Asn Tyr Ser Tyr Pro Gin Val Pro Gly Ser Tyr Pro 165 170 175 180 atg cag cca gtc act gca cct cca tcc tac cct cct acc age tat tcc 631 Met Gin Pro Vai Thr Ala Pro Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Ser Tyr Ser 185 190 195 tct aca cag ccg act agt tat gat cag age agt tac tct cag cag aac 679 Ser Thr Gin Pro Thr Ser Tyr Αβρ Gin Ser Ser Tyr Ser Gin Gin Asn 200 205 210 acc tat ggg caa ccg age age tat gga cag cag agt age tat ggt caa 727 Thr Tyr Gly Gin Pro Ser Ser Tyr Gly Gin Gin Ser Ser Tyr Gly Gin 215 220 225 caa age age tat 993 cag cag cct ccc act agt tac cca ccc caa act 775 Gin Ser Ser Tyr Gly Gin Gin Pro Pro Thr Ser Tyr Pro Pro Gin Thr 230 235 240 gga tcc tac age caa gct cca agt caa tat age caa cag age age age 823 Gly Ser Tyr Ser Gin Ala Pro Ser Gin Tyr Ser Gin Gin Ser Ser Ser 245 250 255 260 tac ggg cag cag agt tea ttc cga cag gac cac ccc agt age atg ggt 871 Tyr Gly Gin Gin Ser Ser Phe Arg Gin Asp Hie Pro Ser Ser Met Gly 265 2 70 275 gtt tat ggg cag gag tct gga 99a ttt tcc gga cca gga gag aac cgg 919 Vai Tyr Gly Gin Glu Ser Gly Gly Phe Ser Gly Pro Gly Glu Asn Arg 280 28S 290 age atg agt ggc cct gat aac cgg ggc agg gga aga ggg gga ttt gat 967 Ser Met Ser Gly Pro Asp Asn Arg Gly Arg Gly Arg Gly Gly Phe Asp 295 300 305 cgt gga ggc atg age aga ggt 999 cgg gga gga gga ege ggt gga atg 1015 Arg Gly Gly Met Ser Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Met 310 315 3 20 21 ggc age gct 99» gag cga ggt ggc ttc aat aag cct ggt gga ccc atg 1063 Gly Ser Ala Gly Glu Arg Gly Gly Phe Asn Lys Pro Gly Gly Pro Met 125 330 335 340 gat gaa gga cca gat ctt gat cta ggc cca cct gta gat cca gat gaa 1111 Asp Glu Gly Pro Asp Leu Asp Leu Gly Pro Pro Vai Asp Pro Asp Glu 345 350 355 gac tet gac aac agt gea att tat gta caa gga tta aat gac agt gtg 1159 Asp Ser Asp Asn Ser Ala Ile Tyr Vai Gin Gly Leu Asn Asp Ser vai 360 365 370 act cta gat gat ctg gea gac ttc ttt aag cag tgt ggg gtt gtt aag 1207 Thr Leu Asp Asp Leu Ala Asp Phe Phe Lys Gin Cys Gly vai vai Lys 375 380 385 atg aac aag aga act 999 caa ccc atg ate cac ate tac ctg gac aag 1255 Met Asa Lys Arg Thr Gly Gin Pro Met Ile His ile Tyr Leu Asp Lys 390 3 95 400 gaa aca gga aag ccc aaa ggc gat gee aca gtg tcc tat gaa gac cca 1303 Glu Thr Gly Lys Pro Lys Gly Asp Ala Thr vai Ser Tyr Glu Asp Pro 405 410 415 420 ecc act gee aag gct gee gtg gaa tgg ttt gat ggg aaa gat ttt caa 1351 Pro Thr Ala Lys Ala Ala vai Glu Trp Phe Asp Gly Lys Asp Phe Gin 425 430 435 ggg age aaa ctt aaa gtc tcc ctt gct cgg aag aag cct cca atg aac 1399 Gly Ser Lys Leu Lys Vai Ser Leu Ala Arg Lye Lys Pro Pro Met Asn 440 445 450 agt atg cgg ggt ggt ctg cca ccc cgt gag ggc aga ggc atg cca cca 1447 Ser Met Arg Gly Gly Leu Pro Pro Arg Glu Gly Arg Gly Met Pro Pro 455 460 4 65 cca etc cgt gga ggt cca gga ggc cca gga ggt cct ggg gga ccc atg 1495 Pro Leu Arg Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly Pro Met 470 475 480 ggt ege atg gga ggc cgt gga gga gat aga gga ggc ttc cct cca aga 1543 Gly Arg Met Gly Gly Arg Gly Gly Asp Arg Gly Gly Phe Pro Pro Arg 485 490 495 500 gga ccc cgg ggt tcc cga ggg aac ccc tet gga gga gga aac gtc cag 1591 Gly Pro Arg Gly Ser Arg Gly Asn Pro Ser Gly Gly Gly Asn Vai Gin 505 510 515 cac cga gct gga gac tgg cag tgt ccc aat ccg ggt tgt gga aac cag 1639 His Arg Ala Gly Asp Trp Gin Cys Pro Asn Pro Gly Cys Gly Asn Gin 520 52S 530 aac ttc gee tgg aga aca gag tgc aac cag tgt aag gee cca aag cct 1687 Asn Phe Ala Trp Arg Thr Glu Cys Asn Gin Cys Lys Ala Pro Lys Pro 535 540 545 22 gaa ggc ttc ctc ccg cca ccc ttt ccg 0 0 0 ccg ggt ggt gat cgt ggc 1735 Glu Gly Phe Leu Pro Pro Pro Phe Pro Pro Pro Gly Gly Aep Arg Gly 550 S55 560 aga ggt ggc cct ggt ggc atg cgg 99® gga aga ggt ggc ctc atg gat 1783 Arg Gly Gly Pro Gly Gly Met Arg Gly Gly Arg Gly Gly Leu Met Asp 565 570 575 580 cgt ggt ggt ccc ggt gga atg ttc aga ggt ggc cgt ggt 99a gac aga 1831 Arg Gly Gly Pro Gly Gly Met Phe Arg Gly Gly Arg Gly Gly Aep Arg 585 590 595 ggt ggc ttc cgt ggt ggc cgg ggc atg gac cga ggt ggc ttt ggt gga 1879 Gly Gly Phe Arg Gly Gly Arg Gly Met Asp Arg Gly Gly Phe Gly Gly 600 605 610 gga aga cga ggt ggc cct 999 999 ccc cct gga cct ttg atg gaa cag 1927 Gly Arg Arg Gly Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Leu Met Glu Gin 615 620 625 atg gga gga aga aga gga gga cgt gga gga cct gga aaa atg gat aaa 1975 Met Gly Gly Arg Arg Gly Gly Arg Gly Gly Pro Gly Lys Met Asp Lys 630 635 640 ggc gag cac cgt cag gag cgc aga gat cgg ccc tac tagatgcaga 2021 Gly Glu His Arg Gin Glu Arg Arg Asp Arg Pro Tyr 645 650 655 gaccccgcag agctgcattg actaccagat ttatttttta aaccagaaaa tgtfcttaaat 2081 ttataattcc atatttataa tgttggccac aacattatga ttattccttg tctgtacttt 2141 agtatttttc accatttgtg aagaaacatt aaaacaagtt aaatggtagt gtgcggagtt 2201 tttttttctt ccttctttta aaaatggttg tttaagactt taacaatggg aaccccttgt 2261 gagcatgctc agtatcattg tggagaacca agagggcctc ttaactgtaa caatgttcat 2321 ggttgtgatg tttttttttt ttttttaaaa taaaattcca aatgtttaat aaaaaaaaaa 2381 aaaaaaaaa 2390

<210>2 <211>656 <212>PRT <213> Homo Sapiens <400>2 23

Met Ala Ser Thr Asp Tyr Ser Thr Tyr Ser Gin Ala Ala Ala Gin Gin 15 10 15

Gly Tyr Ser Ala Tyr Thr Ala Gin Pro Thr Gin Gly Tyr Ala Gin Thr 20 25 30 24

Thr Gin Ala Tyr Gly Gin Gin Ser Tyr Gly Thr Tyr Gly Gin Pro Thr 35 40 45 Asp Vai Ser Tyr Thr Gin Ala Gin Thr Thr Ala Thr Tyr Gly Gin Thr SO 55 60 Ala Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Gin Pro Pro Thr Gly Tyr Thr Thr Pro 65 70 75 80 Thr Ala Pro Gin Ala Tyr Ser Gin Pro Vai Gin Gly Tyr Gly Thr Gly 85 90 95 Ala Tyr Asp Thr Thr Thr Ala Thr Vai Thr Thr Thr Gin Ala Ser Tyr 100 105 110 Ala Ala Gin Ser Ala Tyr Gly Thr Gin Pro Ala Tyr Pro Ala Tyr Gly 115 120 125 Gin Gin Pro Ala Ala Thr Ala Pro Thr Arg Pro Gin Asp Gly Asn tys 130 135 140 Pro Thr Glu Thr Ser Gin Pro Gin Ser Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Gin 145 150 155 160 Pro Ser teu Gly Tyr Gly Gin Ser Asn Tyr Ser Tyr Pro Gin Vai Pro 165 170 175 Gly Ser Tyr Pro Met Gin Pro Vai Thr Ala Pro Pro Ser Tyr Pro Pro 180 185 190 Thr Ser Tyr Ser Ser Thr Gin Pro Thr Ser Tyr Asp Gin Ser Ser Tyr 195 200 205 Ser Gin Gin Asn Thr Tyr Gly Gin Pro Ser Ser Tyr Gly Gin Gin Ser 210 215 220 Ser Tyr Gly Gin Gin Ser Ser Tyr Gly Gin Gin Pro Pro Thr ser Tyr 225 230 235 240 Pro Pro Gin Thr Gly Ser Tyr Ser Gin Ala Pro Ser Gin Tyr Ser Gin 245 250 255 Gin Ser Ser Ser Tyr Gly Gin Gin Ser Ser Phe Arg Gin Asp Kis Pro 26Õ 265 270 ser ser Mefc Gly vai Tyr Gly Gin Glu Ser Gly Gly Phe Ser Gly Pro 27S 280 285 Gly Glu Asn Arg Ser Met Ser Gly Pro Asp Asn Arg Gly Arg Gly Arg 290 295 300 Gly Gly Phe Asp Arg Gly Gly Met Ser Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly 305 310 315 320 Arg Gly Gly Met Gly Ser Ala Gly Glu Arg Gly Gly Phe Asn I»ys Pro 325 330 335 25

Gly Gly Pro Met Asp Glu Gly Pro Asp Leu Asp Leu Gly Pro Pro vai 340 345 350

Asp Pro Asp Glu Asp Ser Asp Asn Ser Ala Ile Tyr Vai Gin Gly Leu 355 360 365

Asn Asp Ser Vai Thr Leu Asp Asp Leu Ala Asp Phe Phe Lys Gin Cys 370 375 380

Gly Vai Vai Lys Met Asn Lys Arg Thr Gly Gin Pro Met Ile His Ile 385 390 395 400

Tyr Leu Asp Lys Glu Thr Gly Lys Pro Lys Gly Asp Ala Thr Vai Ser 405 410 415

Tyr Glu Asp Pro Pro Thr Ala Lys Ala Ala Vai Glu Trp Phe Asp Gly 420 425 430

Lys Asp Phe Gin Gly Ser Lys Leu Lys Vai Ser Leu Ala Arg Lys Lys 435 440 445

Pro Pro Met Asn Ser Met Arg Gly Gly Leu Pro Pro Arg Glu Gly Arg 450 455 460

Gly Met Pro Pro Pro Leu Arg Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly Pro 465 470 475 480

Gly Gly Pro Met Gly Arg Met Gly Gly Arg Gly Gly Asp Arg Gly Gly 485 490 495

Phe Pro Pro Arg Gly Pro Arg Gly Ser Arg Gly Asn Pro Ser Gly Gly 500 505 510

Gly Asn Vai Gin His Arg Ala Gly Asp Trp Gin Cys Pro Asn Pro Gly 515 520 525

Cys Gly Asn Gin Asn Phe Ala Trp Arg Thr Glu Cys Asn Gin Cys Lys 530 535 540

Ala Pro Lys Pro Glu Gly Phe Leu Pro Pro Pro Phe Pro Pro Pro Gly 545 550 555 560

Gly Asp Arg Gly Arg Gly Gly Pro Gly Gly Met Arg Gly Gly Arg Gly 565 570 575

Gly Leu Met Asp Arg Gly Gly Pro Gly Gly Met Phe Arg Gly Gly Arg 580 585 590

Gly Gly Asp Arg Gly Gly Phe Arg Gly Gly Arg Gly Met Asp Arg Gly 595 600 605

Gly Phe Gly Gly Gly Arg Arg Gly Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro 610 615 620

Leu Met Glu Gin Met Gly Gly Arg Arg Gly Gly Arg Gly Gly Pro Gly 625 630 635 640 26

Lys Met Asp Lys Gly Glu His Arg Gin Glu Arg Arg Asp Arg Pro Tyr 645 650 65S <210> 3

<211 > 20 <212> ADN <213> sintético <22 0> iniciador <4 0 0> 3 gattacgcta gcttgggtgg 20

<210> 4 <211 > 21 <212> ADN <213> sintético <22 0> iniciador <400> 4 gttgaagtga acttggcggg g 21

<210> 5 <211> 27 <212> ADN <213> sintético <22 0> iniciador <4 0 0> 5 gggtcgacgg acgttgagag aacgagg 27 27

<210> 6 <211> 33 <212> ADN <213> sintético <22 0> iniciador < 4 Ο Ο > 6 gggaattctg cggggtctct gcatctagta ggg 69

<210> 7 <211> 18 <212> ADN <213> sintético <22 0> iniciador <4 0 0> 7 gcttgggtgg tcatatgg 17

Lisboa, 24 de Janeiro de 2007 28

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a determinação do efeito hormonal de substâncias com os passos de a. fazer contactar a proteína EWS ou um derivado desta que apresenta os aminoácidos 319 até 656 da sequência descrita em Seq. ID N°. 1 com o receptor de androgénio e uma substância a ensaiar e b. determinação da influência da substância em ensaio sobre a ligação da proteína EWS ou de um seu derivado e do receptor de androgénio, ou c. determinação da influência da substância em ensaio sobre a actividade induzida por ligandos do receptor de androgénio, em que o processo não é efectuado no corpo humano ou animal.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos um passo decorre num sistema celular com os seguintes passos: a. células que expressam a proteína EWS ou o seu derivado e o receptor de androgénio são expostas à substância a ensaiar, b. determinação da influência da substância sobre a interacção entre o receptor de androgénio e a proteína EWS ou o seu derivado por meio de medição da interacção 1 proteína-proteína ou da interacção proteína-proteína--ADN.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos um passo decorre num sistema celular com os seguintes passos: a. células que expressam a proteína EWS ou o seu derivado e o receptor de androgénio e são transfectadas com uma construção de gene relator são expostas ao ligando do receptor de androgénio e à substância a ensaiar, b. determinação da actividade de transcrição do receptor de androgénio por meio de medição da actividade do gene relator e c. comparação com a actividade de transcrição na realização dos passos a e b, na ausência da substância a ensaiar.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por as células serem células eucarióticas, de um modo preferido células da próstata, células nervosas, células gliais, fibroblastos, células sanguíneas, osteoblastos, osteoclastos, hepatócitos, células epiteliais ou células musculares. Lisboa, 24 de Janeiro de 2007 2 3