ES2260548T3 - Procedimiento para el ensayo del efecto hormonal de ciertas sustancias. - Google Patents
Procedimiento para el ensayo del efecto hormonal de ciertas sustancias.Info
- Publication number
- ES2260548T3 ES2260548T3 ES03012914T ES03012914T ES2260548T3 ES 2260548 T3 ES2260548 T3 ES 2260548T3 ES 03012914 T ES03012914 T ES 03012914T ES 03012914 T ES03012914 T ES 03012914T ES 2260548 T3 ES2260548 T3 ES 2260548T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- receptor
- foxg1c
- cells
- fragment
- modulator
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/743—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Procedimiento para ensayar el efecto hormonal, en particular el efecto andrógeno o antiandrógeno, de ciertas sustancias, en el que a) unas células, que son transfectadas con dos vectores, conteniendo uno de los vectores un ADN, que codifica una proteína de receptor nuclear o un fragmento de la misma, que tiene las propiedades funcionales de la proteína de receptor nuclear, y conteniendo el otro vector un ADN, que codifica el co-modulador FOXG1C (Genbank XM_007233) o un fragmento del mismo, que tiene las propiedades funcionales del co-modulador, se someten a la acción de la sustancia, y b) la actividad de transcripción, que desencadena el receptor nuclear o su fragmento, que tiene las propiedades funcionales del receptor, en presencia del co- modulador o de su fragmento, que tiene las propiedades funcionales del co-modulador, y/o la influencia de la sustancia sobre la interacción entre el receptor o su fragmento, que tiene las propiedades funcionales del receptor, y el co-modulador o su fragmento, que tiene las propiedades funcionales del co-modulador, se mide mediante la interacción de una proteína con otra proteína o la interacción de una proteína, otra proteína y un ADN.
Description
Procedimiento para el ensayo del efecto hormonal
de ciertas sustancias.
El invento se refiere a un procedimiento para el
ensayo del efecto hormonal de ciertas sustancias y a un
procedimiento para la determinación de trastornos en el mecanismo
de co-modulación de receptores de andrógenos por el
co-activador denominado Forkhead Box G1C
(FOXG1C).
En la evaluación de ciertas sustancias para una
posible aplicación farmacéutica es por lo general usual probar
estas sustancias para descubrir un eventual efecto hormonal, en
particular para descubrir una actividad andrógena o antiandrógena
posiblemente presente. Al realizar la administración de sustancias
eficaces farmacológicamente presentan importancia en algunos casos
los conocimientos acerca de efectos hormonales, en particular
efectos andrógenos o antiandrógenos, de estas sustancias, puesto
que éstos pueden provocar efectos colaterales indeseados en el
paciente. Para la prueba del efecto hormonal de ciertas sustancias
pasan a emplearse en particular unos procedimientos, en los cuales
se mide la capacidad de las sustancias para fijarse a los receptores
de hormonas y activar su actividad de transcripción.
Sin embargo, los conocimientos acerca de efectos
hormonales de ciertas sustancias presentan interés no solamente en
el caso de potenciales fármacos sino también en el caso de
sustancias no farmacéuticas, puesto que de muchas sustancias
presentes en el medio ambiente se supone que pueden tener, en partes
de la población, una actividad andrógena o antiandrógena y
respectivamente estrógena o antiestrógena. Posiblemente, se provoca
de esta manera un indeseado efecto dañino.
Existe, por lo tanto, una necesidad muy
considerable de un procedimiento con el que, de una manera
confiable, sensible, sencilla, barata y rápida, se pueda efectuar
una declaración acerca del efecto hormonal de ciertas sustancias.
Los procedimientos conocidos hasta ahora no cumplen este
objetivo.
El presente invento se basa por lo tanto en la
misión de poner a disposición un procedimiento, con el cual, de un
modo confiable, sensible, sencillo, barato y rápido, se pueda
efectuar una declaración acerca del efecto hormonal de las
sustancias que se han de ensayar.
Conforme al invento, esto se consigue, de una
manera sorprendente, mediante un procedimiento para ensayar el
efecto hormonal, en particular el efecto andrógeno o antiandrógeno,
de ciertas sustancias, en el que
a) unas células, que son transfectadas con dos
vectores, conteniendo uno de los vectores un ADN que codifica una
proteína de receptor nuclear o un fragmento de la misma, en
particular una proteína de receptor nuclear humano o un fragmento
de la misma, y conteniendo el otro vector un ADN que codifica el
co-modulador FOXG1C o un fragmento del mismo, se
someten a la acción de la sustancia, y
b) la actividad de transcripción, que
desencadena el receptor nuclear o su fragmento, en presencia del
co-modulador o de su fragmento, y/o la influencia
de la sustancia sobre la interacción entre el receptor o su
fragmento y el co-modulador o su fragmento, se mide
mediante la interacción de una proteína con otra proteína o la
interacción de una proteína, otra proteína y un ADN.
Se encontró, de modo sorprendente, que con el
procedimiento conforme al invento se puede ensayar, de un modo
confiable, sensible, sencillo, rápido y barato, si ciertas
sustancias, que pueden ser por ejemplo relevantes para el medio
ambiente o de interés farmacológico, ejercen un efecto hormonal, en
particular un efecto andrógeno o antiandrógeno.
En el procedimiento conforme al invento, se
emplean células transformadas con un vector, teniendo los vectores
un ADN que codifica una proteína de receptor nuclear o un fragmento
de la misma.
La superfamilia de los receptores nucleares
(NRs, de Nuclear Receptors), a la que pertenecen más de 50
diferentes proteínas, es un grupo de factores de transcripción
afines que controlan la transcripción de respectivo gen diana como
reacción a ligandos específicos, p.ej. hormonas. La familia se puede
subdividir, de acuerdo con determinadas características, tales
como, p.ej., el estado de dimerización, el tipo del ligando o la
estructura del elemento de reacción al ADN, en varias subfamilias
(Beato y colaboradores, 2000, Human Reproduct. Update, 6,
225-236). Una particularidad característica de los
NRs es la estructura coincidente de los dominios funcionales (con
las denominaciones A hasta F) con una región terminal en N
fuertemente variable, sólo débilmente conservada, con una función
de activación constitutiva autónoma (AF-1), con un
dominio de fijación a ADN (DBD de DNA Bindung Domäne) fuertemente
conservado, que es responsable del reconocimiento de elementos
especiales de reacción a ADN y que consiste en dos motivos de dedo
de zinc, en un dominio de bisagra variable y en un dominio de
fijación a ligando (LBD de Ligand Bindung Domäne) terminal en C,
multifuncional y conservado, con una función de transactivación
(AF-2) dependiente de la dimerización y del ligando.
A continuación de esto, sigue la región situada más lejana en el
terminal de C, cuya función no es conocida y que falta en el caso de
receptores tales como p.ej. el PR (de Progesteron Receptor =
receptor de progesterona), el PPAR (de Peroxisom Proliferator
aktivierter receptor = receptor activado por proliferadores de
peroxisomas) y RXR (de Retinoid X Receptor = receptor X de
retinoides) (Mangelsdorf & Evans, 1995; Cell, 83,
841-850; Robyr y colaboradores, 2000, Mol.
Endocrinol., 14, 329-347). Para algunos NRs (p.ej.
el receptor de andrógenos (AR de Androgen Rezeptor) se comprobó que
la región terminal de N está en situación de interactuar con la
región terminal de C (Brinkmann y colaboradores, 1999, J. Steroid
Biochem. and Mol. Biol., 69, 307-313). Los
receptores de hormonas esteroides, tales como p.ej. los receptores
de estrógenos (ER), de progesterona (PR), glucocorticoides (GR),
mineralocorticoides (MR) y andrógenos (AR), fijan a ligandos
esteroideos, que se derivan de pregnenolona, tales como las
progestinas, los estrógenos, los glucocorticoides y los
mineralocorticoides, así como a andrógenos. La fijación a un ligando
activa al receptor y controla la expresión de correspondientes
genes
dianas.
dianas.
Tal como se expuso precedentemente, en la etapa
a) del procedimiento conforme al invento se utilizan unas células,
que además contienen un vector, el cual contiene un ADN que codifica
el co-modulador FOXG1C o un fragmento del
mismo.
Los denominados co-moduladores
son una clase de proteínas que, al realizar la activación
(co-activadores) y respectivamente la represión
(co-represores) de la transcripción de genes sirven
como moléculas de puente entre el complejo de iniciación de la
transcripción y los NRs (McKenna y colaboradores, 1999, Endocr.
Rev., 20, 321-347). Un co-activador
debe ser capaz de reforzar la función de los receptores y, en
presencia de un agonista, de interactuar directamente con el
dominio de activación de los NRs. Éste debe interactuar también con
el aparato de transcripción basal, y finalmente no debe reforzar por
sí mismo la actividad de transcripción basal. La mayor parte de los
co-moduladores interactúan con ayuda de uno o varios
motivo(s) LXXLL (cajas de NR) con el dominio
AF-2 de los NRs, pero se describieron también
algunos co-moduladores, que interactúan con otras
regiones de NR (Ding y colaboradores, 1998, Mol. Endocrinol., 12,
302-313). Además, se identificaron muchos
co-moduladores, que interactúan de una manera
similar con varios diferentes NRs, por lo que de una manera más
favorable se debería ensayar el grado de especificidad de cada
co-modulador.
En el procedimiento conforme al invento, se
emplea el co-modulador designado por FOXG1C o el
fragmento de FOXG1C que tiene los aminoácidos 175 hasta 489. Se
describió la secuencia de ADNc (ADN cromosómico) (Genbank (banco de
genes) XM_007233) y ésta codifica 489 aminoácidos (Li & Vogl,
1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90,
4490-4494). Un clon DH5 alfa de E. coli, que
contiene un plásmido que codifica los aminoácidos
175-489 de FOXG1C, se depositó bajo el número DSM
15043 el 5 de Junio de 2002 en la Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección alemana para
microorganismos y cultivos celulares).
En el caso de utilizarse estas proteínas, el
procedimiento conforme al invento se puede llevar a cabo de una
manera especialmente confiable, sensible, sencilla, barata y rápida.
Además, los fragmentos de FOXG1C, en particular el fragmento de
FOXG1C que tiene los aminoácidos 175 a 489, presentan la ventaja de
que son manipulables y clonables con mayor facilidad, pero todavía
presentan las propiedades funcionales del FOXG1C.
En el caso del FOXG1C se trata de un
co-activador para el receptor humano de andrógenos y
para otros receptores nucleares, que refuerza la interacción entre
un andrógeno y el receptor. La secuencia de FOXG1C ya ha sido
descrita en el Genbank XM_007233; no obstante, no se indica allí
ninguna interacción con receptores nucleares, en particular con el
AR. El presente invento se basa en el sorprendente reconocimiento de
que se presenta una interacción entre receptores nucleares, en
particular el AR, por una parte, y el FOXG1C, por otra parte, así
como se pudo comprobar un refuerzo de la transactivación mediada por
el AR. El FOXG1C es una proteína que funciona como
co-mediadora, al reforzar o reprimir el efecto de
transcripción después de una fijación de esteroides al receptor
nuclear, y además de ello favorece la fijación y la activación del
receptor nuclear a moléculas, a las que con anterioridad no se
atribuía ningún efecto hormonal.
La proteína FOXG1C constituye un
co-activador para el receptor de andrógenos y para
otros receptores nucleares, tales como el receptor \alpha de
estrógenos, el receptor \beta de estrógenos, el receptor A de
progesterona, el receptor B de progesterona, el receptor de
glucocorticoides, el receptor de mineralocorticoides, el receptor
de la hormona tiroidea, el receptor de vitamina D, el receptor
activado por proliferadores de peroxisomas, el receptor de ácido
retínico, el receptor X de retinoides y receptores huérfanos; en el
procedimiento conforme al invento, estos receptores se emplean de
una manera preferente, puesto que con ellos se pueden conseguir de
una manera especialmente favorable las precedentes ventajas del
procedimiento conforme al invento.
En el procedimiento conforme al invento se
pueden emplear también vectores, que codifican fragmentos de las
precedentes proteínas. Bajo la expresión de "fragmentos" en
conexión con las precedentes proteínas se entienden los que tienen
un aminoácido o varios aminoácidos menos que las proteínas en su
plena longitud, y que presentan todavía las propiedades funcionales
de un receptor nuclear o de un co-modulador.
Tal como ya se ha señalado precedentemente, en
el procedimiento conforme al invento se emplean, en la etapa a),
unas células que son transfectadas con dos vectores, que contienen
un ADN que codifica proteínas especiales. Estas células están por
lo tanto en situación de expresar estas dos proteínas
diferentes.
Preferiblemente, las células son linajes
celulares establecidos y/o células eucarióticas, en particular
células de próstata, células nerviosas, células de glia,
fibroblastos, células sanguíneas (glóbulos), osteoblastos,
osteoclastos, hepatocitos, células epiteliales o células musculares.
Con los linajes celulares consagrados, el procedimiento conforme al
invento se puede llevar a cabo de una manera especialmente barata y
rápida. En el caso de utilizarse células eucarióticas, en
particular las células eucarióticas precedentemente expuestas, se
pueden obtener con el procedimiento conforme al invento, de una
manera ventajosa, resultados de valor informativo especialmente
grande.
En una forma preferida de realización del
procedimiento conforme al invento, se emplean vectores de expresión
eucarióticos, p.ej. pCMX o pSG5. En el caso de la utilización de
estos vectores, en particular en vinculación con los precedentes
linajes celulares consagrados y/o las precedentes células
eucarióticas, el procedimiento conforme al invento se puede llevar
a cabo de una manera especialmente favorable y rápida, y se obtienen
resultados de valor informativo especialmente grande.
Un experto en la especialidad conoce
procedimientos, y materiales necesarios para ellos, a fin de
introducir el ADN que codifica las precedentes proteínas dentro de
un vector, luego incorporar éste en las células y cultivar las
células así obtenidas en apropiadas condiciones de cultivo, para que
éstas puedan expresar estas proteínas.
De acuerdo con la etapa b) del procedimiento
conforme al invento, se puede medir la actividad de transcripción,
que el receptor nuclear o su fragmento desencadena en presencia del
co-modulador o de su fragmento. Esto puede
efectuarse por ejemplo por medio de la detección de un gen
reportero.
Los genes reporteros son genes o fragmentos de
genes, que se acoplan con otros genes o con secuencias reguladoras,
a fin de hacer detectable la actividad de estas secuencias. Los
genes reporteros generan productos génicos, que son detectables de
una manera lo más sencilla posible, p.ej. fotométricamente mediante
reacciones cromáticas. Genes reporteros frecuentemente utilizados
son el gen para la \beta-galactosidasa, el gen
para la fosfatasa alcalina, el gen para la
acetil-transferasa de cloramfenicol, el gen para la
dioxigenasa de catecol, el gen para la proteína fluorescente verde
("green fluorescent protein"), así como diferentes genes de
luciferasas, que pueden hacer que las células se iluminen.
Tales genes reporteros se pueden incorporar en
las células asimismo mediante vectores, en particular vectores de
expresión eucarióticos. Un ejemplo de un vector, que contiene un ADN
que codifica un gen reportero, es el vector de la luciferasa del
MMTV (virus de tumor mamario murino), que se emplea para la medición
del efecto andrógeno de ciertas sustancias.
Las sustancias con un efecto hormonal, en
particular con un efecto andrógeno o antiandrógeno, son reconocibles
entonces por la actividad aumentada o respectivamente disminuida
del gen reportero.
La medición de la influencia de la sustancia en
ensayo sobre la interacción entre el receptor o su fragmento y el
co-modulador o su fragmento se puede efectuar
también por medio de una determinación de la interacción entre una
proteína y otra proteína, p.ej. mediante sistemas doblemente
híbridos, mediante precipitación inmunitaria, mediante ensayos de
GST-Pull-down (de degradación del
GST), mediante el análisis FRET y mediante el análisis ABCD, así
como mediante determinación de la interacción entre una proteína,
otra proteína y un ADN, tal como mediante ensayos de retardación en
gel.
Se encontró, además, que el FOXG1C se puede
utilizar muy bien como indicador de enfermedades debidas a
andrógenos. Enfermedades relevantes debidas a andrógenos, tales
como p.ej. cáncer de próstata, disfunción eréctil, infertilidad,
formación de calvas, acné o hipogonadismo, así como el síndrome de
resistencia a andrógenos, tal como p.ej. la feminización
testicular, se basan en defectos en el mecanismo de
co-modulación entre un AR y el FOXG1C, al igual que
trastornos de la libido, de la situación de la sensibilidad y en el
caso de trastornos cognitivos. Una posibilidad en el caso de
pacientes con tales trastornos consiste por consiguiente en la
medición de las concentraciones relativas de AR y de FOXG1C,
efectuándose esta medición de una manera favorable
extracorporalmente en líquidos corporales, células corporales o
tejidos corporales. Esto es posible mediante aplicación de
procedimientos cuantitativos para la medición de las cantidades
relativas de ambas moléculas en el respectivo paciente, en los
cuales se pueden emplear por ejemplo anticuerpos tanto contra AR
como también contra FOXG1C, o sondas de ácidos nucleicos contra el
ARNm (ARN mensajero) de éstos. Existen varios procedimientos para la
medición de estas tasas comparativas, que son conocidos para un
experto en la especialidad; también, éste conoce materiales y
dispositivos apropiados para ello, tales como un radioinmunoensayo,
un ensayo de ELISA, una tinción inmunitaria, una
RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa con
transcriptasa inversa), una transferencia de borrón Western, una
transferencia de borrón Northern, un chip de ADN o un chip de
proteína. Además de ello, es posible, con ayuda del ADNc del
FOXG1C, construir de un modo usual sondas para un ensayo de PCR, con
el que, en el caso de determinados pacientes, se pueden detectar
mutaciones de la secuencia normal de un ADN o se pueden generar
transcritos para el ensayo de transferencia de borrón Northern, o
respectivamente un ADN para ensayos de hibridación in
situ.
La relación medida de AR a FOXG1C puede ser en
tal caso mayor o menor que en el caso de personas sanas. El valor
normal existente en personas sanas, se puede determinar de una
manera sencilla, por ejemplo mediante el recurso de que se promedia
la relación de AR a FOXG1C en un gran número de voluntarios sanos.
Mediante la comparación del valor normal con la relación
determinada de AR a FOXG1C en el paciente que se ha de investigar,
se puede comprobar si el valor para la relación determinada es mayor
o menor que el valor normal.
Puesto que la concentración de FOXG1C y/o AR en
un tejido puede ser diversa, p.ej. la concentración de FOXG1C en el
cerebro y en los testículos es muy grande, al contrario de lo cual
es muy pequeña en otros órganos, tales como el hígado, el corazón,
el timo y la próstata, han de tomarse en cuenta para la evaluación
las diferentes concentraciones de tejidos, es decir que el valor de
ensayo y el valor normal deben proceder del mismo tejido. Puesto
que en el caso de la concentración también pueden presentarse
diferencias entre especies, éstas han de tomarse en consideración
también al realizar la evaluación.
Otra posibilidad para la determinación de
defectos en el mecanismo de co-modulación entre un
AR y el FOXG1C puede consistir en medir solamente la concentración
de FOXG1C, partiéndose en tal caso del hecho de que la
concentración de FOXG1C es por lo menos aproximadamente constante.
Si en el presente caso se ha medido una concentración de FOXG1C
menor que la normal, esto quiere decir que se ha desplazado la
relación de AR a FOXG1C, lo cual a su vez apunta como indicio a una
perturbación en el mecanismo de co-modulación.
Es por lo tanto posible, con una sonda
específica para FOXG1C, determinar modificaciones en la expresión de
FOXG1C y por consiguiente en la relación con AR. Tales
modificaciones pueden estar implicadas causalmente en el caso de
diferentes cuadros morbosos o pueden aparecer como un fenómeno de
secuela.
Tales mediciones de la relación de AR/FOXG1C se
basan en el reconocimiento, sorprendente y que se basa en el
hallazgo y la caracterización de FOXG1C, de que por ejemplo un
síndrome de resistencia a andrógenos puede ser debido a un
trastorno del equilibrio entre la prevalencia de AR y la de FOXG1C
en las células dianas. Una cantidad demasiado grande de FOXG1C
podría conducir a una hipersensibilidad del sistema de AR, de manera
tal que éste reacciona a moléculas, que normalmente no tienen
ningún efecto andrógeno. A la inversa, la falta, o una función
ausente, de FOXG1C conduce en todos los planos a la resistencia a
andrógenos. La detección de una cantidad demasiado grande de FOXG1C
en el caso de un paciente hablaría en favor de la utilización de
medios para la regulación en sentido descendente, tal como p.ej.
medicamentos antisentido o similares, con el fin de reducir en
condiciones clínicas el título de FOXG1C en el respectivo paciente.
Lo mismo se puede conseguir mediante moléculas que están en
situación de inhibir la interacción entre AR y FOXG1C. Si un
paciente tiene demasiado poca cantidad de FOXG1C, se le puede
aportar el ADNc, la proteína o el ADN de FOXG1C a través de
diferentes mecanismos de por sí conocidos, con el fin de elevar de
esta manera el título del FOXG1C activo. Es posible también una
elevación de la concentración o de la actividad de FOXG1C mediante
medicamentos de bajo peso molecular o mediante estimulación de la
síntesis propia con ayuda de específicas proteínas de promotores de
FOXG1C.
El invento se explica con más detalle haciendo
referencia a las siguientes Figuras, en las que
la Figura 1 es una representación esquemática
del receptor de andrógenos con caracterización del dominio de
receptor de andrógenos (AR 2) que se extiende desde los aminoácidos
325 hasta 919, el cual está capacitado para la interacción con
FOXG1C en presencia de un andrógeno;
la Figura 2 representa la distribución en
tejidos del FOXG1C, en 2a en diferentes tejidos (seres humanos y
roedores), en 2b en diferentes regiones del cerebro humano y en 2c
en el cerebro de ratas, de animales jóvenes y ancianos; y
la Figura 3 muestra la interacción del FOXG1C o
del SRC-1a con el receptor de andrógenos en células
PC3-ARwt.
Los siguientes Ejemplos ilustran con mayor
detalle el invento, pero sin limitarlo a él.
Mediando utilización de una biblioteca de ADNc
procedente de un cerebro fetal (Clontech MATCHMAKER), y de un
fragmento de AR humano, que codifica los aminoácidos desde 325 hasta
919, como una sonda (Figura 1), se llevó a cabo un escrutinio
mediante un usual sistema de dos levaduras híbridas, en presencia
del andrógeno DHT 10^{-6} M. En coincidencia con las
instrucciones del fabricante (Clontech) el número de los clones
escrutados fue de 2 x 10^{7}. El número de los clones
independientes fue de 3,5 x 10^{6} según los datos del fabricante.
De éstos se escogieron 300 clones positivos y se ensayaron mediante
un ensayo con \beta-galactosidasa, confirmándose
que 40 de ellos eran positivos para lacZ. Los insertos de estos
clones fueron amplificados mediante una PCR. Mediante unos análisis
con fragmentos de restricción y por secuenciación, se identificaron
por lo menos 39 diferentes clones. Uno de ellos era un clon con un
inserto que comprendía 1.553 pb (pares de bases) (739 pb - 2.292
pb) que codifica una parte del ORF (Open reading frame = marco de
lectura abierto) del FOXG1C (número de acceso al Genbank,
XM_007233).
El fragmento que consistía en 1.255 pb (963 pb -
2.218 pb) de la secuencia de ADNc del FOXG1C sirvió como sonda para
borrones Northern humanos. Sendos transcritos (3,2 kb) se
descubrieron en diferentes tejidos (Figura 2). Los borrones
Northern se hibridaron eventualmente con una muestra de
\beta-actina, con el fin de confirmar la carga
eléctrica uniforme del gel.
La Figura 2 muestra la distribución en tejidos
de FOXG1C, que se había investigado de una manera en sí conocida
mediante un análisis por transferencia de borrones Northern. Un ARN
poli-A+, aislado a partir de diferentes tejidos
humanos (2 \mug), se separó con un gel de agarosa que contenía
formaldehído, se transfirió un borrón a una membrana de nylon y se
hibridó con un fragmento de ADNc de FOXG1C marcado (963 - 2.218 pb).
Después del lavado, la membrana se colocó sobre una película y
después de una iluminación se reveló. Tal como se puede deducir de
la Figura 2a, en el cerebro y en los testículos de un ser humano se
comprobó una expresión muy fuerte de FOXG1C, mientras que en
roedores (una rata y un ratón) la expresión de FOXG1C está limitada
en gran medida al cerebro. Además, la expresión de FOXG1C está
disminuida o aumentada en segmentos de cerebros humanos (Figura
2b). En la Figura 2c, 10 \mug de un ARN (banda
1-3) o 0,2 \mug de un ARN poliA+ (banda
4-6) procedente de cerebros de ratas, se separaron
sobre un gel, se transfirieron a una membrana y se hibridaron con un
fragmento (963 - 2.218 pb) marcado de ADNc de FOXG1C. Los cerebros
de ratas procedían de animales con una edad de 3 semanas (bandas 1
y 4), con una edad de 6 semanas (bandas 2 y 5) y con una edad de 2
años (bandas 3 y 6). De este modo se encontró una dependencia de la
edad con la expresión del gen de FOXG1C.
El fragmento de ADNc de FOXG1C, de 739 pb hasta
2.218 pb (aminoácidos 175 - 489), cambiado de clon (transclonado)
desde el vector de levadura, se clonó con las endonucleasas EcoRI y
XbaI de un modo usual dentro del vector CMX-Vp16 y
se transfectó, asimismo de un modo usual, con una luciferasa del
MMTV en células PC3-ARwt, que expresan el AR.
Tal como se puede deducir de la Figura 3, la
transfección transitoria de ADNc de FOXG1C se fusionó dentro del
marco con el dominio de transactivación de Vp16 en células
PC3-ARwt para dar una fuerte
co-activación de la actividad de las señales de AR.
Para esto, en una cubeta de cultivo de células, provista de
cavidades con 3 x 10^{5} células por cavidad, se transfectó 1,0
\mug de plásmido de luciferasa MMTV con 0,43 \mug de la
construcción artificial anterior en CMX-Vp16 o
respectivamente, como testigo negativo, con 0,32 \mug de
CMX-Vp16 o, como testigo positivo, 0,5 \mug de
SRC1a-Vp16 como plásmido testigo, y después de 24
horas se trató con dihidroxi-testosterona (DHT)
como andrógeno en las concentraciones indicadas. Las células
transfectadas se cosecharon después de 24 horas adicionales y se
midió la actividad de luciferasa en el gen reportero.
Adicionalmente, para la normalización, se determinó la cantidad
total de proteínas celulares. Por cada tanda de transfección y para
cada concentración de sustancia, se llevaron a cabo dos experimentos
y cada vez tres mediciones. La desviación de error se indicó como
SD. La actividad se indica en unidades relativas.
Claims (8)
1. Procedimiento para ensayar el efecto
hormonal, en particular el efecto andrógeno o antiandrógeno, de
ciertas sustancias, en el que
a) unas células, que son transfectadas con dos
vectores, conteniendo uno de los vectores un ADN, que codifica una
proteína de receptor nuclear o un fragmento de la misma, que tiene
las propiedades funcionales de la proteína de receptor nuclear, y
conteniendo el otro vector un ADN, que codifica el
co-modulador FOXG1C (Genbank XM_007233) o un
fragmento del mismo, que tiene las propiedades funcionales del
co-modulador, se someten a la acción de la
sustancia, y
b) la actividad de transcripción, que
desencadena el receptor nuclear o su fragmento, que tiene las
propiedades funcionales del receptor, en presencia del
co-modulador o de su fragmento, que tiene las
propiedades funcionales del co-modulador, y/o la
influencia de la sustancia sobre la interacción entre el receptor o
su fragmento, que tiene las propiedades funcionales del receptor, y
el co-modulador o su fragmento, que tiene las
propiedades funcionales del co-modulador, se mide
mediante la interacción de una proteína con otra proteína o la
interacción de una proteína, otra proteína y un ADN.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, teniendo el fragmento del
co-modulador, que tiene las propiedades funcionales
del co-modulador, los aminoácidos 175 a 489 de
FOXG1C (Genbank XM_007233).
3. Procedimiento de acuerdo con una de las
precedentes reivindicaciones, seleccionándose el receptor nuclear
entre un receptor de andrógeno, un receptor \alpha de estrógenos,
un receptor \beta de estrógenos, un receptor A de progesterona,
un receptor B de progesterona, un receptor de glucocorticoides, un
receptor de mineralocorticoides, un receptor de hormona tiroidea,
un receptor de vitamina D, un receptor activado por proliferadores
de peroxisomas, un receptor de ácido retínico, un receptor X de
retinoides X y receptores huérfanos.
4. Procedimiento de acuerdo con una de las
precedentes reivindicaciones, siendo las células linajes celulares
consagrados y/o células eucarióticas.
5. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, seleccionándose las células eucarióticas entre
células de próstata, células nerviosas, células de glia,
fibroblastos, células sanguíneas, osteoblastos, osteoclastos,
hepatocitos, células epiteliales o células musculares.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las
precedentes reivindicaciones, siendo el vector un vector de
expresión eucariótico.
7. Procedimiento para la determinación de
trastornos en el mecanismo de co-modulación entre
receptores de andrógenos y el FOXG1C (Genbank XM_007233),
midiéndose las concentraciones del FOXG1C o de un fragmento del
mismo, que tiene las propiedades funcionales del FOXG1C, y/o de un
receptor de andrógenos o un fragmento del mismo, que tiene las
propiedades funcionales del receptor de andrógenos.
8. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, efectuándose la medición de la concentración
mediante un radioinmunoensayo, ensayos de ELISA, una tinción
inmunitaria, una RT-PCR, una transferencia de borrón
Western, una transferencia de borrón Northern, un chip de ADN o un
chip de proteína.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10226674 | 2002-06-12 | ||
DE10226674A DE10226674B4 (de) | 2002-06-12 | 2002-06-12 | Verfahren zur Testung des hormonellen Effekts von Substanzen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2260548T3 true ES2260548T3 (es) | 2006-11-01 |
Family
ID=27588642
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES03012914T Expired - Lifetime ES2260548T3 (es) | 2002-06-12 | 2003-06-06 | Procedimiento para el ensayo del efecto hormonal de ciertas sustancias. |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040009524A1 (es) |
EP (1) | EP1376136B1 (es) |
JP (1) | JP2004016236A (es) |
AT (1) | ATE320608T1 (es) |
DE (2) | DE10226674B4 (es) |
DK (1) | DK1376136T3 (es) |
ES (1) | ES2260548T3 (es) |
NO (1) | NO20032609D0 (es) |
PT (1) | PT1376136E (es) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2004285964A1 (en) * | 2003-11-03 | 2005-05-12 | Acadia Pharmaceuticals Inc. | High troughput functional assay for G-protein coupled receptors using a rap-ras chimeric protein |
US20060134670A1 (en) * | 2004-11-19 | 2006-06-22 | Fabrice Piu | Enabling tools to identify ligands for hormone nuclear receptors |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NO20021900L (no) * | 2001-05-04 | 2002-11-05 | Jenapharm Gmbh | FremgangsmÕte for analyse av forbindelsers hormonvirkning |
-
2002
- 2002-06-12 DE DE10226674A patent/DE10226674B4/de not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-06-06 EP EP03012914A patent/EP1376136B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-06 AT AT03012914T patent/ATE320608T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-06-06 ES ES03012914T patent/ES2260548T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-06 PT PT03012914T patent/PT1376136E/pt unknown
- 2003-06-06 US US10/456,214 patent/US20040009524A1/en not_active Abandoned
- 2003-06-06 DK DK03012914T patent/DK1376136T3/da active
- 2003-06-06 DE DE50302644T patent/DE50302644D1/de not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-10 NO NO20032609A patent/NO20032609D0/no not_active Application Discontinuation
- 2003-06-12 JP JP2003168262A patent/JP2004016236A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1376136A2 (de) | 2004-01-02 |
NO20032609D0 (no) | 2003-06-10 |
DE50302644D1 (de) | 2006-05-11 |
US20040009524A1 (en) | 2004-01-15 |
ATE320608T1 (de) | 2006-04-15 |
JP2004016236A (ja) | 2004-01-22 |
EP1376136A3 (de) | 2004-01-14 |
DE10226674B4 (de) | 2006-01-05 |
DK1376136T3 (da) | 2006-07-10 |
PT1376136E (pt) | 2006-07-31 |
EP1376136B1 (de) | 2006-03-15 |
DE10226674A1 (de) | 2004-01-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lu et al. | Translational regulatory mechanisms generate N-terminal glucocorticoid receptor isoforms with unique transcriptional target genes | |
Grillo et al. | Lentivirus-mediated downregulation of hypothalamic insulin receptor expression | |
JP4742032B2 (ja) | アディポネクチン発現誘導剤およびその利用 | |
Esumi et al. | BEST1 expression in the retinal pigment epithelium is modulated by OTX family members | |
ES2219601T3 (es) | Procedimiento para comprobar los efectos hormonales de sustancias. | |
Granger et al. | The LIM-homeodomain proteins Isl-1 and Lhx3 act with steroidogenic factor 1 to enhance gonadotrope-specific activity of the gonadotropin-releasing hormone receptor gene promoter | |
Zapater et al. | Alternative splicing of the nuclear progestin receptor in a perciform teleost generates novel mechanisms of dominant-negative transcriptional regulation | |
Wang et al. | Activation of estrogen receptor G protein–coupled receptor 30 enhances cholesterol cholelithogenesis in female mice | |
Mukherjee et al. | Steroid receptor coactivator 2 is required for female fertility and mammary morphogenesis: insights from the mouse, relevance to the human | |
Sun et al. | Regulation of KCNMA1 transcription by Nrf2 in coronary arterial smooth muscle cells | |
Huang et al. | Novel P2 promoter-derived HNF4α isoforms with different N-terminus generated by alternate exon insertion | |
Park et al. | Identification of a variant estrogen receptor lacking exon 4 and its coexpression with wild-type estrogen receptor in ovarian carcinomas. | |
Godmann et al. | Krüppel-like factor 4 is involved in functional differentiation of testicular Sertoli cells | |
ES2260548T3 (es) | Procedimiento para el ensayo del efecto hormonal de ciertas sustancias. | |
Breljak et al. | Renal expression of organic anion transporter Oat5 in rats and mice exhibits the female-dominant sex differences | |
Schiengold et al. | Multidrug resistance gene expression during the murine ontogeny | |
Obendorf et al. | FoxG1, a member of the forkhead family, is a corepressor of the androgen receptor | |
Yanagawa et al. | Deficiency of X-linked protein kinase Nrk during pregnancy triggers breast tumor in mice | |
Kimura et al. | Identification of transcriptional regulatory elements in the human somatostatin receptor sst2 promoter and regions including estrogen response element half-site for estrogen activation | |
Naka et al. | Transcriptional regulation of the human factor IX promoter by the orphan receptor superfamily factors, HNF4, ARP1 and COUP/Ear3 | |
García-Arencibia et al. | Identification of two functional estrogen response elements complexed with AP-1-like sites in the human insulin receptor gene promoter | |
Jeong et al. | Steroid hormone regulation of Clca3 expression in the murine uterus | |
Lambertini et al. | Human estrogen receptor α gene is a target of Runx2 transcription factor in osteoblasts | |
Denolet et al. | Transfection with steroid-responsive reporter constructs shows glucocorticoid rather than androgen responsiveness in cultured Sertoli cells | |
ES2276179T3 (es) | Procedimiento para la determinacion del efecto hormonal de sustancias mediante la interacion entre el receptor de androgenos y la proteina del sarcoma de ewing. |