JP4742032B2 - アディポネクチン発現誘導剤およびその利用 - Google Patents
アディポネクチン発現誘導剤およびその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4742032B2 JP4742032B2 JP2006511817A JP2006511817A JP4742032B2 JP 4742032 B2 JP4742032 B2 JP 4742032B2 JP 2006511817 A JP2006511817 A JP 2006511817A JP 2006511817 A JP2006511817 A JP 2006511817A JP 4742032 B2 JP4742032 B2 JP 4742032B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- adiponectin
- klf9
- expression
- adipocytes
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6875—Nucleoproteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity
Description
(1)配列番号:2記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(2)配列番号:2記載のアミノ酸配列において、一以上のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
2.下記(1)または(2)記載のDNAまたは該DNAを保持したベクターを含有する、アディポネクチン発現誘導剤。
(a)配列番号:1記載の塩基配列を有するDNA
(b)配列番号:1記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA。
3.上記1または2に記載のアディポネクチン発現誘導剤を有効成分とする、代謝性疾患または心疾患の予防・治療用医薬組成物。
4.下記(1)または(2)からなるエンハンサーエレメントを少なくとも備えたレポーター遺伝子を保持した、アディポネクチン発現誘導物質のスクリーニング用細胞。
(1)配列番号:5記載の塩基配列からなるDNA
(2)配列番号:5記載の塩基配列において、1塩基以上の欠失、付加、置換または挿入を有する塩基配列からなるDNA
5.さらにKLF9をコードしたDNAを保持した、上記4記載の細胞。
6.脂肪細胞である、上記4または5記載の細胞。
7.肥大脂肪細胞である、上記4または5記載の細胞。
8.下記(1)から(3)の工程を含む、アディポネクチン発現誘導物質のスクリーニング方法。
(1)上記4記載の細胞に被検物質を作用させる工程
(2)レポーター遺伝子の発現を検出する工程
(3)被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
9.下記(1)から(3)の工程を含む、アディポネクチン発現誘導物質のスクリーニング方法。
(1)上記5記載の細胞に被検物質を作用させる工程
(2)レポーター遺伝子の発現を検出する工程
(3)被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
10.下記(1)から(3)の工程を含む、肥満症またはこれに関連する疾患の予防・治療用薬剤のスクリーニング方法。
(1)上記4記載の細胞に被検物質を作用させる工程
(2)レポーター遺伝子の発現を検出する工程
(3)被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
11.下記(1)から(3)の工程を含む、肥満症またはこれに関連する疾患の予防・治療用薬剤のスクリーニング方法。
(1)上記5記載の細胞に被検物質を作用させる工程
(2)レポーター遺伝子の発現を検出する工程
(3)被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
なお、上記ストリンジェントな条件とは、例えば 6×SSC、40%ホルムアミド、25℃でのハイブリダイゼーションと、1×SSC、55℃での洗浄といった条件を示すことができる。ストリンジェンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に左右されるが、当業者であればこれらの条件を必要なストリンジェンシーを得られるように設定することは自明である。
KLF9と機能的に同等なタンパク質が、実際に配列番号:2記載のKLF9と同等な機能、すなわち、アディポネクチン発現誘導活性を有するかを確認は、本願実施例に示すルシフェラーゼ解析などを用いて実施し得る。
KLF9をコードしたDNAは断片の状態で用いてもよく、またベクターに接続しても用いてもよい。ベクターは目的に応じて適宜選択し得る。例えば、ヒト細胞、組織内のアディポネクチン遺伝子の発現を誘導する目的では、ヒトなどの哺乳動物細胞等で機能し得るベクター、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、pcDNAI、pcDNAI/Amp(Invitrogen社)等がある。
上記使用態様(1)、(2)の場合には、例えば、ベクターに保持させたKLF9をコードしたDNAを構成成分としたアディポネクチン発現誘導剤を用いることが好適である。細胞、組織等への遺伝子導入は、ウイルスベクターの投与や既存の導入技術(エレクトロポーレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法等)を用いて行うことができる。また、使用態様(3)の場合には、DNAを保持したベクターまたはKLF9タンパク質のいずれを構成成分とするものであってもよい。
(1)上記第一の態様の細胞に被検物質を作用させる工程
(2)レポーター遺伝子の発現を検出する工程
(3)被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
(1)上記第二の態様の細胞に被検物質を作用させる工程、
(2)レポーター遺伝子の発現を検出する工程
(3)被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
また、上記本発明のスクリーニング方法は、アディポネクチン発現誘導物質をスクリーニングし得るのみならず、さらには、肥満症またはそれに関連した疾患の予防・治療用の薬剤の候補物質を探索するために応用することができる。肥満症に関連した疾患としては、上記において繰返し記載している通り、例えば、糖尿病、インスリン抵抗性などの代謝性疾患、動脈硬化症などの心疾患などである。これら疾患では、低アディポネクチン血症が見られる場合多く存在する。低アディポネクチン血症が、これら疾患の発症を決定づける一要素、あるいは病態の進行を進める要因等となっている場合には、上記スクリーニング方法により得られる物質は、患者における低アディポネクチン血症を改善させ、肥満症またはこれに関連する疾患の予防、治療、病体の緩和を誘導し得ることが期待される。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
〔材料及び方法〕
1. 材料及び一般的方法
3−イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX)及びデキサメタゾン(DEX)、NAC並びにSP600125は、シグマ社から購入した。その他の材料は、すべて、引用文献(27、35及び36)に示された供給源から購入した。DNA配列決定は、PRISM染料ターミネーターサイクル配列決定キット及びABIPRISM310ジェネティックアナライザー(Applied Biosystems社)で実施した。
KLF9欠損マウスは既に報告されている(Morita, M. et al., Mol. Cell. Biol. 23, 2489-2500 (2003).)。15週齢のob/obマウス及びその野生型のC57BL/6マウスは、Charles River Breeding Laboratories(Wilmington, MA)から入手した。マウスは、コロニーケージ内に収容し、光源下12時間/暗所12時間の周期を維持した。血漿グルコースレベルは、グルコースB試験(和光純薬化学、大阪市)を用いて決定した。血漿アディポネクチンレベルは、マウスアディポネクチン・ラジオイムノアッセイ(RIA)キット(LINCO Research Inc.)によって決定した。
cDNAライブラリーは、A. Saltielから提供されたものを用いた。このライブラリーは完全に分化した3T3−L1脂肪細胞から採取したcDNAをpGAD-GH GAL4ベクター内に挿入することにより構築された(Ribon, V. et al., Mol. Cell. Biol. 18, 872-879 (1998).)。ライブラリーにはすべてが1.5〜3kbの大きさのcDNAインサートを有する、10,000,000個体の形質転換体が含まれていた。
酵母におけるone-hybridクローニングの一般的方法及び関連する実験的操作は、すでに報告されている手順で実施した(Almoguera, C. et al., J. Biol. Chem. 277, 43866-43872 (2002).)。one-hybridクローニングのためにYM4271(Clontech社)の酵母誘導株を構築した。具体的には、プラスミドpHISi(Clontech社)のXbaI部位(クレノウDNAポリメラーゼで末端充填)とEcoR1部位との間に、下記に示すアディポネクチンプロモータ配列由来の32塩基(−188位〜−157位、図3b、配列番号:5)からなるトップ鎖オリゴヌクレオチドとその相補鎖とのアニーリングによって生成されたDNAフラグメントを挿入した。
5'-GAAGCCCAAGCTGGGTTGTACCAGGTTCCCTA-3'(トップ鎖)
上記反応産物をYM4271(Clontech社)に形質転換し、上記アニーリング断片が三量体となったインサートを含むHIS3リポーター遺伝子コンストラクト((G4HSE)x3::HIS3)を含むクローンを得た。
one-hybridスクリーニングのため、1,660,000のプライマリークローンの増幅後に、胚cDNAライブラリーから調製したDNAで(32bp)x3::HIS3リポーター酵母株を形質転換した。500万の酵母形質転換体を15mM3−アミノトリアゾール(SD−、His−、Leu+)上で培養した。30℃で4〜8日間増殖させた後、22の陽性と推定される酵母クローンを選び、更に分析した。二つのcDNAが、同じKLF9をコードしていた。
ルシフェラーゼアッセイは、以前に報告した方法に従い12ウエルプレートで培養した細胞を用いて実施した(Yamauchi, T. et al., Nature 423, 762-769 (2003).、Shindo, T. et al., Nat. Med. 8, 856-863 (2002).)。それぞれ指定量の発現プラスミドとともに、ルシフェラーゼリポータープラスミド(0.25μg)及びpSV-βgal(0.1〜0.4μg)を同時に導入した。各トランスフェクションでのDNAの総量を、対照のベクターDNAで1.5μg/ウェルに調整した。形質転換体のルシフェラーゼ活性の量を標準的キット(Promega)により測定した。測定値はβ−ガラクトシダーゼ活性を基準に標準化した。
ゲル移動度シフトアッセイは、以前に記載したとおりに実施した(Almoguera, C. et al., J. Biol. Chem. 277, 43866-43872 (2002).)。
293T細胞若しくは3T3L1脂肪細胞又は白色脂肪組織から核酸抽出物を報告されている方法に従い調製した(Almoguera, C. et al., J. Biol. Chem. 277, 43866-43872 (2002).)。ゲル移動度シフトアッセイに用いた二本鎖オリゴヌクレオチドは、両鎖をアニーリングすることによって調製した。標識化プローブ(3,000〜10,000cpm)および核酸抽出物を反応液(20μl:10mMトリスHCl(pH7.6)、50mMKCl、0.05mMEDTA、2.5mMMgCl2、8.5%グリセリン、1mMジチオトレイトール、0.5μg/mlのポリ(dI−dC)、0.1%トリトンX及び1mg/mlの脱脂乳)中で混合し、氷上で30分間インキュベーションした。DNA−タンパク質複合体を、4.6%ポリアクリルアミド上、140V、4℃で1時間分画した。ゲルを乾燥し、BAStationソフトウェア付きのBAS2000フィルター(富士写真フィルム)に露光させた。
競合実験の場合には、標識化DNAに対して少なくとも100倍過剰モルの非標識化DNAを先ず上記反応液に加え、その後、標識化プローブを加えた。スーパーシフト実験では、最初に、KLF9、KLF3又はNF−κBp65に対するポリクローナル抗体(2〜10μg)とともに氷上でインキュベーションして、ゲルシフト反応を行った。
107個のPlat−Eパッケージング細胞(Morita, S. et al., Gene Ther. 7, 1063-1066 (2000).)に10μgのマウスKLF9をLipofectamine PLUS(Life Technology)を用いて一時的に導入し、24時間のインキュベーションの後に上清(10ml)を採集した。10μg/mlのポリブレン(臭化ヘキサジメトリン、Sigma社)を添加して20倍希釈した上清を用い、推定多重感染度0.3にて3T3L1脂肪細胞を感染させた。
アディポネクチンプロモータの1367bp(−1367から+35;配列番号:4)、527bp(−527から+35)、217bp(−217から+35)及び127bp(−127から+35)のフラグメントを有するルシフェラーゼ遺伝子構成体(それぞれ、「pAdiponectin1367-Luc」、「pAdiponectin527-Luc」、「pAdiponectin217-Luc」及び「pAdiponectin127-Luc」)をpGL2ベーシック又はpGL2プロモータベクター(Promega社)内にサブクローニングした。
pCDNA3.1のEcoR1/Not部位に結合することによって、KLF3又はKLF9発現ベクターを構成した。293T又は3T3L1脂肪細胞へのDNAトランスフェクションは「Lipofectamine PLUS」(Gibco BRL)を用いたリポフェクション法によって実施した。
3T3L1細胞を10%ウシ胎児血清とともにDMEM中で培養し、すでに報告されている方法に従って(Yamauchi, T. et al., Nat. Genet. 30, 221-226 (2002).)、脂肪合成性細胞への分化誘導を行った。簡略的に説明すると、先ず、3T3L1細胞を培養し、密集するまで増殖させた。2日後、培地を標準分化誘導培地(0.5mMIBMX、1μMDEX、5μg/mlのインスリン、10%FBS、50単位/mlのペニシリン及び50μg/mlのストレプトマイシン含有)に交換し、一両日ごとに培地交換を行った。既知の方法でグルコース摂取を決定した(Yamauchi, T. et al., Nat. Med. 8, 1288-1295 (2002).)。細胞溶解物を抽出し、そのTG含量を、既知の方法(Yamauchi, T. et al., Nat. Med. 7, 941-946 (2001).)で決定した。
相補的な一本鎖RNAをそれぞれ化学的に合成し、互いにアニーリングしてsiRNAを調整した。60〜70%程度まで密集した3T3L1脂肪細胞にLipofectamine PLUS(Life Technology)を用いてsiRNAを導入した(Yamauchi, T. et al., Nature 423, 762-769 (2003).)。これらKLF9及びKLF3に対するsiRNA配列は、それぞれ予めその導入によりKLF9およびKLF3の発現を抑制し得ることが確認できているものを用いた。siRNAのトランスフェクション72、96時間後に、細胞を溶解して発現産物等の解析を行った。
細胞又は組織からのトータルRNAの調製は、TRIzol(Gibco/BRL)を用い、製造者のインストラクションに従って行った。ノーザンブロット分析のために、各群のトータルRNAを等量づつ分取し、これらをプールして(総量10μg)、ホルマリン変性アガロース電気泳動にかけた。泳動後、ナイロン膜(Hybond N;Amersham Pharmacia Biotech)に転写した。フィルターは、マウスKLF9及びマウスKLF3cDNAを[32P]dCTPで標識化したcDNAプローブそれぞれとハイブリダイズさせた。得られたバンドをBAStationソフトウェア付きのBAS2000フィルター(富士写真フィルム)に感光させ視覚化した。mRNAの定量は、リアルタイムPCR法により実施した(Yamauchi, T. et al., Nature 423, 762-769 (2003).)。プライマーセット及びプローブは、ソフトウェア「Primer Express 1.5a」を用いて設計し、ABI(ABI Prism;Perkin-Elmer Applied Biosytems, Foster City, California)から購入した。相対的な量は同じcDNA中のアクチン転写物の量で標準化した(Yamauchi, T. et al., Nature 423, 762-769 (2003).)。
既知の方法に従って(Almoguera, C. et al., J. Biol. Chem. 277, 43866-43872 (2002).)、核抽出物を調製した。核タンパク質(30μg)のサンプルは、KLF9(Zhang, D. et al., Endocrinology 143, 62-73 (2002).)又はKLF3(Crossley, M. et al., Mol. Cell Biol. 16, 1695-1705 (1996).)に対するウサギ免疫グロブリンG(IgG)、次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合マウス又はウサギIgG及びECLキット(Amersham Pharmacia Biotech)による免疫ブロット法により解析された。
休止状態の3T3L1脂肪細胞を1%ホルムアルデヒド中で固定化した。固定化された染色体サンプルは既知の免疫沈降法(Shindo, T. et al., Nat. Med. 8, 856-863 (2002).)に多少の変更を加えた方法で解析した。沈降物を回収するためにプロテインA(Upstate)を用いた。
カイマン化学抗酸化性解析(Cayman Chemical Antioxidant Assay)を血漿(plasma)、血清、尿、便あるいは細胞溶解物のトータル抗酸化能を測定するために使用した。水溶性および脂溶性抗酸化剤はこのプロトコールで分けることができない。そのため、ビタミン、タンパク質、脂質、グルタチオン、尿酸などを含む成分全てを組合わせた抗酸化活性が分析される。解析は、試料中の抗酸化剤がメトミオグロビン(metmyoglobin)によるABTSR (2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulphonate])から ABTSR・+への酸化を阻害する活性を測定することに基づいている。試料の量は、その濃度に従い750nmにおける吸収阻害を誘導する。試料中におけるABTSの酸化を阻害し得る抗酸化活性は、水溶性トコフェロール類似体であるTroloxの抗酸化活性と対比し、ミリモル濃度のTrolox,で標準化することより定量化する。
アディポネクチンmRNAレベルは、肥満症で低下しており、それが、肥満症関連インスリン抵抗性の発達の原因となる役割を果たすことが報告されている。本発明の課題は、肥満症におけるアディポネクチン発現の低下の原因となる、転写因子を単離することである。この課題に検討するために、in vitroでの肥大脂肪細胞モデルを用い、脂肪細胞肥大化がアディポネクチン遺伝子の発現に与える影響を解析した。
興味深いことに、脂肪細胞分化の誘導19日後(第19日)の3T3L1の脂肪細胞は、トリグリセリド含量が増大し(図1a)、インスリンに応答してグルコース摂取の低下のようなインスリン抵抗性を示し(図1b)、レジスチンのようなアディポカインを誘導する一層高度なインスリン抵抗性を発現し(図1c)、さらには、脂肪細胞分化の誘導10日後(第10日)の3T3L1脂肪細胞と比較して、アディポネクチンmRNA発現が低下する(図1c)ことが見出された。mRNAレベルで観察された変化と同様に、脂肪細胞肥大はアディポネクチンのタンパク発現レベルも低下していた(データ示されず)。これらより肥大脂肪細胞におけるアディポネクチン遺伝子の発現低下の原因は、転写レベルの低下であることを示唆する。
以前のアディポネクチン遺伝子の5’フランキング領域のプロモータ分析によって、脂肪細胞特異的な発現を誘導するC/EBP転写因子が特定された(Schaffler, A. et al., Biochim. Biophys. Acta. 1399, 187-197 (1998).、Saito, K. et al., Biol. Pharm. Bull. 22, 1158-1162 (1999).)。しかし、肥満症で観察される肥大脂肪細胞におけるアディポネクチン発現低下を決定づける上流因子がどこにあるかは、同定されていない。興味深いことに、ルシフェラーゼ遺伝子に連結させたアディポネクチンプロモータ領域の−1367から+35までを含む領域のプロモータ活性は、前駆脂肪細胞(第0日)又は大型脂肪細胞(第19日)と比較して、小型の脂肪細胞(第10日)の方が高く(図2a)、それはアディポネクチンの発現レベルと相関した。
アディポネクチン発現を低下させることが示されているTNFαは肥大脂肪細胞で増加する。そのため、TNFαが肥大脂肪細胞におけるアディポネクチンの発現を低下させる原因因子であるとの予測は合理的である(Barth, N. et al., Diabetologia 45, 1425-1433 (2002).)。
小型脂肪細胞(第10日)をTNFαとともにインキュベーションすることは、実際に、アディポネクチン遺伝子のプロモータ活性を低下させた(図2b)。しかし、TNFαを抗体により中和した場合の効果は、肥大脂肪細胞(第19日)で低下したアディポネクチン遺伝子のプロモータ活性に対して何ら影響を与えなかった(図2c)。これらデータは、肥大脂肪細胞におけるアディポネクチン発現の低下の原因となるシグナル伝達経路として、TNFα以外が存在し得ることを示唆した。
肥大脂肪細胞におけるアディポネクチン遺伝子の不応答性に関与するプロモータ領域を特定するために、ファンクショナル5’ディリーション解析を実施した。これまでの研究で−1367から−217領域の欠損は、第19日目の3T3L1脂肪細胞におけるアディポネクチンプロモータ活性に対して実質的に影響しないことが明らかにされた(図3a)。対照的に、第19日目の3T3L1脂肪細胞において、さらに90ヌクレオチドを欠質させると、アディポネクチンプロモータ活性が回復した。このことから−217/−127に必須の調節エレメントが含まれることが示唆された。
転写因子が結合するエレメントを同定するために、EMSAを用いて、ファンクショナル5’ディリーション解析を更に実施した。EMSAを用いた−217/−127プロモータ領域の解析において、第19日の3T3L1脂肪細胞よりも第10日目の3T3L1脂肪細胞で一つの主要な複合体がこのエレメントに多く結合することが示された(図3b)。−217から−189領域の欠失は、第10日目の3T3L1脂肪細胞由来の核抽出物中の結合タンパク質の量に実質的に影響しなかった(図3b)。対照的に、さらに32ヌクレオチドを欠質させると、第10日目の3T3L1脂肪細胞内での結合タンパク質の量を顕著に減少させ(図3b)、−188/−157が必須結合エレメントを含むことを示唆した。重要なことに、32bpのエレメント(−188/−157)に結合した主要複合体は、痩せた対照のC57B6マウスおよび第10日の3T3L1脂肪細胞よりも、肥満モデルであるob/obマウスおよび第19日目の3T3L1脂肪細胞では少なかった(図3c)。
このプロモータ領域のエンハンサー特性を詳細に調べるために、このエレメントをプロモータ系に組み込み、機能解析を行った(図3d)。この−188/−157エレメントの存在は、第10日目の3T3L1脂肪細胞では、対照であるpGL-2-tk-Lucベクターのみと比較して基底転写活性を5倍上昇させたが、第19日目の細胞では同様の上昇は観察されなかった(図3d)。
肥大脂肪細胞においてアディポネクチン遺伝子プロモータの下方調節しているトランス因子を単離するために、酵母one-hybridクローニングアプローチを用いた(Almoguera, C. et al., J. Biol. Chem. 277, 43866-43872 (2002).)。32bpをバイトとして用いた。この配列を三量体化してHIS3レポーター遺伝子の上流に組み込み、酵母細胞に導入して(32bp)x3::HIS3リポーター酵母株を作成した。
22の陽性コロニーを得た。これらクローンは、異なる群が含まれていた。ヌクレオチド及び推定アミノ酸の配列から、二つの群に分けられた。一つの群は、10個の独立したcDNA単離体と2個の独立したcDNA単離体とでそれぞれ、クルッペル様転写因子(KLF)ファミリー(Shindo, T. et al., Nat. Med. 8, 856-863 (2002).、Morita, M. et al., Mol. Cell. Biol. 23, 2489-2500 (2003).)3及び9に属する転写因子をコードしていた。他の一群は、4個の独立したcDNA単離体によるもので、転写因子であるNF−κBp65(Suzawa, M. et al., Nat. Cell Biol. 5, 224-230 (2003).)をコードしている。
32bpに結合する核内因子を更に特定するために、KLF3、KLF9又はNF−κBp65を認識する特異的な抗体を用いて、EMSA超シフト実験を実施した。これらの研究で、3T3L1脂肪細胞(第10日)内で複合体Iが、KLF9タンパク質を含むことが特定された(図4a右、レーン1及び2)。対照的に、KLF3(図4b)はもとよりNF−κBp65(図4a右、レーン1及び3)も、in vitroでは小型脂肪細胞内では検出されなかった。対照EMSAでは、293T細胞の核抽出物をプローブである標識KLF9コンセンサス部位とともに用いることにより、KLF9抗体の特異性が確認された(図4c)。KLF3抗体(図4b左)又はNF−κBp65抗体(図4a左)の機能は、コグネイトタンパク質である核抽出物を発現する293Tを、それぞれ、放射性標識プローブとしてKLF3コンセンサス部位又はNF−κBコンセンサス部位(p65部位)とともに用いたスーパーシフトアッセイにより確認された。重要なことに、KLF9抗体は32bp結合タンパク質の量を減少させ(図4d)、in vivoでも32bp結合タンパク質(複合体)にKLF9が含まれることを示唆した。
これらの結果を確認するために、EMSA競合解析を実施した。複合体Iは、過剰量のKLF共通配列であるBTEによって完全に競合阻害されることが見出された。(データ示されず)。対照的に、NF−κB共通配列は、明らかに、効果的ではなかった(データ示されず)。
これらの知見を更に確認するために、染色質免疫沈降アッセイを実施した。KLF9は、実際に、32bp部位を含む内在性アディポネクチンプロモータ領域に結合することが見出された(図4e)。さらに、精製したKLF9によっても、脂肪細胞又は脂肪組織から調製した核抽出物による32bpフラグメントの阻害とほぼ同じ阻害が見られた(図4f)。
次に、脂肪細胞の分化の過程、及び脂肪細胞の肥大化の過程におけるKLF3及び9の発現を調べた。KLF9の発現は、脂肪細胞の分化の過程で増大したが、脂肪細胞の肥大の過程では逆に低下した(図5a、下)。対照的に、KLF3の発現レベルは、脂肪細胞の分化と肥大との双方の過程で低下した(図5a、上)。さらに、KLF9のmRNAレベル(図5a)及びタンパク質レベル(図5b)は肥満したob/obマウスよりも、痩せた対照C57BL6マウスで高かった。この結果は32bp結合タンパク質の量と相関すると予想され、KLF9の発現レベルがアディポネクチンのプロモータ活性、及びアディポネクチンの発現レベルを調節し得るという可能性が強く示唆された。
3T3L1脂肪細胞(第19日)(図6a〜c)又はレトロウイルスを用いて3T3L1脂肪細胞(第19日)内で(図6d〜f)、KLF9を一過的に過剰発現させ、エンハンサー活性、アディポネクチンプロモータ活性、32bp結合タンパク質量、およびアディポネクチン発現量を解析した(図6)。3T3L1脂肪細胞(第19日)でのKLF9の過剰発現は、アディポネクチンプロモータ活性(−1367/+35)(図6a)、32bp(−188/−157)エンハンサー活性(図6c右パネル)及び32bp結合タンパク質の量(図6e)を増大させた。KLF9は、アディポネクチンプロモータ活性を増大し得ること(図6a)及び32bpエレメントがKLF9に高い反応性を有すること(図6c、e)を立証した。
さらに、3T3L1脂肪細胞内でのレトロウイルスによるKLF9の定常的な過剰発現(図6d)は、アディポネクチン発現を増大させた(図6f)。これらのデータは、3T3L1脂肪細胞(第19日)におけるKLF9の過剰発現が、32bp結合タンパク質の量、32bpエンハンサー活性、アディポネクチンプロモータ活性及びアディポネクチン発現を3T3L1脂肪細胞(第10日)で観察されたレベルまで回復できることを示唆した。
次に、アディポネクチン発現に対するKLF9の機能的重要性を調べるために、KLF9発現を低下させた際の効果を検討した。KLF9発現抑制の手法として、siRNA(Miyagishi, M. & Taira, K. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).)を用いた。siRNAによるKLF9発現の抑制(図7a)は、KLF3発現には大きな影響はなかった(図7a)。一方、32bp結合タンパク質の発現レベルは、KLF9発現抑制により、顕著に低下し(7b)、これと同時に、3T3L1脂肪細胞(第10日)におけるアディポネクチン発現を大幅に低下させた(図7a)。これらのデータは、KLF9が32bpエンハンサー結合タンパク質複合体の形成及びアディポネクチン発現に必要であることを示す。
次に、in vivoでのアディポネクチン発現とKLF9との機能的関連性を調べるために、KLF9ノックアウトマウスの表現型を解析した(図8)(Morita, M. et al., Mol. Cell. Biol. 23, 2489-2500 (2003).)。興味深いことに、32bp結合タンパク質は、KLF9ノックアウトマウス「WAT」由来の核抽出物中には検出されなかった(図8)。重要なことに、KLF9ノックアウトマウスの体重は対照の野生型同腹仔よりも少なかったにもかかわらず、KLF9ノックアウトマウスの血漿アディポネクチンレベルは対照の野生型同腹仔よりも低かった(図8)。対照的に、KLF3ノックアウトマウスとその対照の野生型同腹仔との間では、血漿アディポネクチンレベルの差は無かった(データ示されず)。これらのデータは、KLF9がin vivoでアディポネクチンレベルの調節に重要な役割を果たすことを示唆した。
次に、脂肪細胞の肥大化が脂肪細胞におけるKLF9発現を調節する機序であるか否かを解析した。KLF9発現は、エネルギー消費に関与することが知られている甲状腺ホルモンにより誘導されると報告されている(Morita, M. et al., Mol. Cell. Biol. 23, 2489-2500 (2003).)。そのため、先ず甲状腺ホルモンレセプターαの発現をin vitro及びin vivoで調べた。興味深いことに、甲状腺ホルモンレセプターαの発現レベルは、3T3L1大型脂肪細胞(第19日)又は肥満モデルob/obマウスでは、それぞれ、3T3L1小型脂肪細胞(第10日)又は痩せた対照のC57BL6マウスと比較すると低下していた(図9a、b)。その上、甲状腺ホルモンと3T3L1脂肪細胞(第19日)とのインキュベーションは、KLF9発現を増大させた(図9c)。
KLF9プロモータがAP−1部位を含むと報告されている(Chen, A. et al., Mol. Cell. Biol. 20, 2818-2826 (2000).)ことから、酸化ストレスが脂肪細胞肥大によるKLF9の発現制御に関与し得るとの仮説を立てた。興味深いことに、c−junN末端キナーゼ(JNK)/ストレス活性化タンパク質キナーゼ(SAPK)のインヒビターは、また抗酸化性N−アセチルシステイン(NAC)とともに、KLF9(図9d)と同時にアディポネクチン(9e)の発現を増大させた。これらの発現増大には甲状腺ホルモンレセプターαの関与はなかった(データ示されず)。これらのデータは、KLF9発現を増大させる上流の機序が、少なくとも部分的には、二つの経路(一方は、甲状腺ホルモンレセプター(TR)αシグナル伝達経路であり、他方は、TRαの発現とは無関係であるが、酸化ストレスに依存する)からなる可能性があることが示唆された。
Claims (3)
- 下記(1)〜(2)のいずれかに記載のタンパク質を含有する、アディポネクチン発現誘導剤。
(1)配列番号:2記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(2)配列番号:2記載のアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アディポネクチン遺伝子を誘導する活性を有するタンパク質 - 下記(a)〜(c)のいずれかに記載のDNAまたは該DNAを保持したベクターを含有する、アディポネクチン発現誘導剤。
(a)配列番号:1記載の塩基配列を有するDNA
(b)配列番号:1記載の塩基配列と高度にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アディポネクチン遺伝子を誘導する活性を有するタンパク質をコードする、DNA
(c)配列番号:1記載の塩基配列と90%以上の同一性を有し、かつ、アディポネクチン遺伝子を誘導する活性を有するタンパク質をコードする、DNA - 請求項1または2に記載のアディポネクチン発現誘導剤を有効成分とする、代謝性疾患または心疾患の予防・治療用医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US55770804P | 2004-03-31 | 2004-03-31 | |
US60/557,708 | 2004-03-31 | ||
PCT/JP2005/006357 WO2005094866A1 (ja) | 2004-03-31 | 2005-03-31 | アディポネクチン発現誘導剤およびその利用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2005094866A1 JPWO2005094866A1 (ja) | 2008-02-14 |
JP4742032B2 true JP4742032B2 (ja) | 2011-08-10 |
Family
ID=35063525
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006511817A Expired - Fee Related JP4742032B2 (ja) | 2004-03-31 | 2005-03-31 | アディポネクチン発現誘導剤およびその利用 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7741080B2 (ja) |
EP (1) | EP1757302B1 (ja) |
JP (1) | JP4742032B2 (ja) |
WO (1) | WO2005094866A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1757302B1 (en) | 2004-03-31 | 2016-10-05 | Toudai Tlo, Ltd. | Adiponectin expression inducer and utilization of the same |
JPWO2006070873A1 (ja) * | 2004-12-28 | 2008-06-12 | 味の素株式会社 | アディポネクチン誘導剤又は分泌促進剤 |
US20090117198A1 (en) * | 2006-05-31 | 2009-05-07 | Hiroshi Kawakami | Visceral fat accumulation inhibitor, and agent for promoting the increase in and/or inhibiting the decrease in blood adiponectin level |
WO2008053487A2 (en) * | 2006-11-01 | 2008-05-08 | The Medical Research Fund At The Tel-Aviv Sourasky Medical Center | Adipocyte-specific constructs and methods for inhibiting platelet-type 12 lipoxygenase expression |
EP2020447A1 (en) * | 2007-08-03 | 2009-02-04 | Zeltia, S.A. | Method for identifying compounds modulating adiponectin gene expression |
JP5432567B2 (ja) * | 2008-04-16 | 2014-03-05 | 花王株式会社 | アディポネクチン分泌調節剤の評価又は選択方法 |
EP2213286A1 (en) * | 2009-02-02 | 2010-08-04 | Zeltia, S.A. | N-(phenyl or pyridyl)prenylamine derivatives for the treatment of obesity, diabetes and cardiovascular diseases |
US20100215660A1 (en) * | 2009-02-23 | 2010-08-26 | Sarwar Hashmi | Kruppel-like factors and fat regulation |
US9101618B2 (en) | 2011-12-15 | 2015-08-11 | Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science | Method for treating and/or preventing neurodegenerative disease by adiponectin receptor agonist |
US11111284B2 (en) | 2014-08-21 | 2021-09-07 | The General Hospital Corporation | Tumor necrosis factor superfamily and TNF-like ligand muteins and methods of preparing |
WO2019055594A1 (en) * | 2017-09-13 | 2019-03-21 | North Carolina State University | BRUSHING ADIPOSE TISSUE INDUCED LOCALLY BY MICRO-NEEDLE STAMPS FOR THE TREATMENT OF OBESITY |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69938837D1 (de) * | 1998-11-04 | 2008-07-10 | Serono Genetics Inst Sa | Genomische und vollständige cdna sequenzen von menschlichem adipozyten spezifischem apm1 und biallelische marker davon |
WO2001032868A1 (en) * | 1999-11-04 | 2001-05-10 | Genset | Apm1 biallelic markers and uses thereof |
US7125663B2 (en) * | 2001-06-13 | 2006-10-24 | Millenium Pharmaceuticals, Inc. | Genes, compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer |
CN1886423A (zh) * | 2002-01-18 | 2006-12-27 | 普罗特米克斯公司 | 脂联素的糖基同工型及其用途 |
WO2004058970A1 (ja) | 2002-12-26 | 2004-07-15 | Ono Pharmaceutical Co., Ltd. | アディポネクチンプロモーターおよびその用途 |
AU2003242352A1 (en) | 2002-12-29 | 2004-07-29 | Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. | Adiponectin receptor and gene coding for the same |
US20060234957A1 (en) | 2003-03-03 | 2006-10-19 | Takanori Tsuda | Adiponectin expression promoter |
EP1757302B1 (en) | 2004-03-31 | 2016-10-05 | Toudai Tlo, Ltd. | Adiponectin expression inducer and utilization of the same |
-
2005
- 2005-03-31 EP EP05727594.3A patent/EP1757302B1/en not_active Not-in-force
- 2005-03-31 WO PCT/JP2005/006357 patent/WO2005094866A1/ja active Application Filing
- 2005-03-31 US US10/594,969 patent/US7741080B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-03-31 JP JP2006511817A patent/JP4742032B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-04-19 US US12/762,437 patent/US20100273708A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20100273708A1 (en) | 2010-10-28 |
EP1757302A8 (en) | 2007-12-12 |
EP1757302A1 (en) | 2007-02-28 |
US20070203061A1 (en) | 2007-08-30 |
EP1757302B1 (en) | 2016-10-05 |
WO2005094866A1 (ja) | 2005-10-13 |
JPWO2005094866A1 (ja) | 2008-02-14 |
US7741080B2 (en) | 2010-06-22 |
EP1757302A4 (en) | 2009-07-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4742032B2 (ja) | アディポネクチン発現誘導剤およびその利用 | |
Wang et al. | The orphan nuclear receptor SHP regulates PGC-1α expression and energy production in brown adipocytes | |
Hinoi et al. | Nrf2 negatively regulates osteoblast differentiation via interfering with Runx2-dependent transcriptional activation | |
Ma et al. | Temporal orchestration of circadian autophagy rhythm by C/EBPβ | |
Jimenez et al. | Critical role for Ebf1 and Ebf2 in the adipogenic transcriptional cascade | |
Kim et al. | S6 kinase 2 deficiency enhances ketone body production and increases peroxisome proliferator‐activated receptor alpha activity in the liver | |
Mandard et al. | Glycogen synthase 2 is a novel target gene of peroxisome proliferator-activated receptors | |
Min et al. | Orphan nuclear receptor Nur77 mediates fasting-induced hepatic fibroblast growth factor 21 expression | |
Ohoka et al. | The orphan nuclear receptor RORα restrains adipocyte differentiation through a reduction of C/EBPβ activity and perilipin gene expression | |
JP2000217576A (ja) | 脂肪細胞への分化を誘導する方法、並びに脂肪細胞への分化を制御する化合物およびそのスクリーニング方法 | |
Chung et al. | Regulation of human resistin gene expression in cell systems: an important role of stimulatory protein 1 interaction with a common promoter polymorphic site | |
Ka et al. | Neuronatin is associated with an anti-inflammatory role in the white adipose tissue | |
Chen et al. | LIM-homeodomain transcription factor Isl-1 mediates kisspeptin's effect on insulin secretion in mice | |
Nomoto et al. | Inhibition of small Maf function in pancreatic β-cells improves glucose tolerance through the enhancement of insulin gene transcription and insulin secretion | |
Yoshiga et al. | Adaptor protein SH2-B linking receptor-tyrosine kinase and Akt promotes adipocyte differentiation by regulating peroxisome proliferator-activated receptor γ messenger ribonucleic acid levels | |
Dhar-Mascareno et al. | Hexim1, a novel regulator of leptin function, modulates obesity and glucose disposal | |
Rampler et al. | Evaluation of the therapeutic potential of PPARα agonists for X-linked adrenoleukodystrophy | |
US20100076059A1 (en) | METHOD OF EVALUATING COMPOUND EFFICACIOUS IN TREATING OBESITY BY USING Slc25a10 | |
Ohtsuka et al. | Prolactin regulatory element binding protein as a potential transcriptional factor for the insulin gene in response to glucose stimulation | |
Huo et al. | Modulation of calmodulin gene expression as a novel mechanism for growth hormone feedback control by insulin-like growth factor in grass carp pituitary cells | |
Timmer et al. | Triiodothyronine affects the alternative splicing of thyroid hormone receptor alpha mRNA | |
JP3507512B2 (ja) | 熱ショック蛋白質の発現誘導制御物質のスクリーニング方法 | |
Kageyama et al. | Fasting increases gene expressions of uncoupling proteins and peroxisome proliferator-activated receptor-γ in brown adipose tissue of ventromedial hypothalamus-lesioned rats | |
JPWO2017195901A1 (ja) | 肝分泌型代謝制御因子阻害作用による肥満関連疾患治療剤 | |
US20060174355A1 (en) | Method of screening drug |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080131 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080131 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101202 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110127 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110224 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110330 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110421 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110509 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140513 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |