DE60120656T2

DE60120656T2 - Synergistische aktivierung regulatorischer elemente durch rel proteine und steroidrezeptoren

Info

Publication number: DE60120656T2
Application number: DE60120656T
Authority: DE
Inventors: J. Christine BOERSMA; Theodorus Paulus VAN DER SAAG; Sacha Wissink; Bart Van Der Burg
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 2000-03-08
Filing date: 2001-03-06
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2021-03-07
Also published as: CA2399055A1; CN1411556A; IL150869A0; ES2266179T3; AU4419801A; US7252934B2; MXPA02008102A; EP1266227A1; ATE330227T1; JP2003526346A; US20080014585A1; WO2001067110A1; BR0109010A; EP1266227B1; US20030119717A1; DE60120656D1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die fähig sind, einen neuentdeckten Mechanismus zu modulieren, bei dem ein Steroid-Rezeptor und ein Rel-Protein in synergistischer Weise agieren, um ein regulatorisches Element zu aktivieren. Die Erfindung betrifft auch eine Zelle, die mit der Nukleinsäure transfektiert ist, und die Verwendung dieser Zelle in einem Assay für die Identifizierung von Verbindungen, die das Niveau der Gen-Expression unter der Steuerung des regulatorischen Elementes moduliert, sowohl als auch die medizinische Verwendung von Verbindungen, welche in einem solchen Assay identifiziert sind.
Mitglieder der Nuklearfaktor-κB (NF-κB)/Rel-Familie von Transkriptions-Aktivator-Proteinen sind in enger Weise mit ihren inhibitorischen Proteinen (I-κB) verbunden und befinden sich im Cytoplasma. Sie können durch pro-inflammatorische Zytokine induziert werden und sind wesentlich in immunologischen und inflammatorischen Prozessen, weil sie die Transkription von Chemoattraktanden, Zytokinen (umfassend die NF-κB induzierten Zytokine selber), Zytokin-Rezeptoren und Zell-Adhäsions-Moleküle ausrichten. Bei der Induktion dimerisieren Rel-Proteine und wandern zum Nukleus, wo sie ihre ZielGene durch ein NF-κB Bindungsmotiv in dem Promotor dieser Gene aktivieren. Die Untersuchung von DNS-Sequenzen, die durch verschiedene NF-κB Dimere erkannt werden, zeigt, dass die bevorzugten Zielorte sich für die bestehenden Dimer-Kombinationen von Rel-Proteinen wenig unterscheiden (Chen et al., Nature Struct. Biol. 5: 67–73, 1998; Kunsch et al., Mol. Cell Biol. 12: 4412–4421, 1992; Parry und Mackman, J. Biol. Chem. 269: 20823–20825, 1994), erklärend die grosse Variation der NF-κB Antwort-Elemente, die in verschiedenen Promotorn identifiziert worden sind.
Die Dimerisierung und nukleare Translokation von Rel-Proteinen wird durch eine grosse Anzahl von Agenzien induziert, umfassend bakterielle und virale Pathogene, immune und inflammatorische Zytokine und eine Vielzahl von Agenzien, welche Zellen schädigen. Eine nochmals grössere Anzahl von Genen erscheinen als Ziele für die Aktivierung von Rel-Proteinen, da diese Familie von Transkriptions-Faktoren gefunden wurde, dass sie mit Steroid-Rezeptoren wie Östrogen-Rezeptoren und Glucocorticoid-Rezeptoren interagieren, was in der Unterdrückung von Ziel-Genen resultiert.
Östrogen und andere Steroide haben wesentliche Wirkungen auf das zentrale Nervensystem (1). Insbesondere ergibt sich aus der Fähigkeit von Östrogen, das Gehirn-Serotonin-System zu modulieren, dass Östrogene eine Rolle in dem Mechanismus spielen können, der der Depression und ihrer Behandlung zuzuordnen ist (2, 3). Da jedoch die ER-Expression weit verbreitet ist, ist es nicht überraschend, dass Östrogene einige andere vorteilhafte Wirkungen aufweisen, umfassend den Schutz gegen Artherosklerose, Alzheimer Dementia und Osteoporose. Um das Risiko in Bezug auf Nebenwirkungen zu begrenzen, wie das erhöhte Risiko für Brust- und Darmkrebs aufgrund der Behandlung mit Östrogenen, wird ein wesentlicher Anteil von Anstrengungen in die Recherche für gewebeselektive ER-bindende Verbindungen investiert.
Abgesehen von Östrogenen besteht viel Interesse an gewebeselektiven Wirkungen von anderen Steroid-Rezeptoren. Auch für diese Steroid-Rezeptoren ist die Entwicklung von Verbindungen, die ausschliesslich auf einen bestimmten Satz von Geweben oder Organen zielen (beispielsweise das Gehirn für psychiatrische Krankheiten) betreffend), durch die breite Gewebe-Verteilung der meisten Arten von Steroid-Rezeptoren behindert worden. Aus diesem Grund besteht viel Interesse in Assays, die das Screenen für Steroid-Rezeptor vermittelte Wirkungen in einer gewebeselektiven Weise gestatten würden.
Die Wirkungen von Östrogen sind bekannt, dass sie durch zwei Östrogen-Rezeptoren (ER α und β) vermittelt werden, dass sie zur Überfamilie der nuklearen Hormon-Rezeptoren (15–18) gehören. Die zwei ER's teilen sich eine wohlbehaltene modulare Struktur. Während der DNS-Bindungsbereich im Wesentlichen zwischen ER α und β (96% Identität) konserviert ist und der Liganden-bindende Bereich im Wesentlichen gut konserviert ist (58% Identität), ist der A/B Bereich nur schwach zwischen den beiden Rezeptoren konserviert (20% Identität). Bei der Liganden-Bindung dimerisiert der aktive Rezeptor und wechselwirkt mit spezifischen DNS-Sequenzen, die als Östrogen-Antwort-Elemente (ERE = Estrogen Response Elements) benannt werden, die in dem regulatorischen Bereich der Ziel-Gene angeordnet sind. Der DNS-gebundene Rezeptor kann dann die Transkription entweder positiv oder negativ regulieren. Es ist für ERα bekannt, dass die Regulierung der Transkription durch zwei Transaktivierungs-Bereiche vermittelt wird: AF-1 angeordnet in dem A/B Bereich und AF-2 angeordnet im Liganden-bindenden Bereich. Die zwei Transaktivierungs-Bereiche können in unabhängiger Weise funktionieren oder kooperieren, abhängig vom Zellen- und Promotor-Zusammenhang (19, 20). Erst kürzlich sind einige andere Mechanismen entdeckt worden, durch die Östrogen Ziel-Gene reguliert. Diese umfassen Gene, die regulatorische Elemente benutzen, wie die Ziel-Sequenz der ER-Wirkung (21) oder Gene, die durch ER über die Wechselwirkung mit anderen Transkriptions-Faktoren reguliert werden, die mit ihren jeweiligen DNS-Bindungsorten verbunden sind, wie AP-1 und SP-1 (22–23, 36–38).
Wir berichten hier die Entdeckung eines Mechanismus, in dem NF-κB und Mitglieder der Steroid-Rezeptor-Familie in synergistischer Weise zusammen agieren, um die Gen-Expression durch Wechselwirkung mit einer Vielzahl von regulatorischen Elementen zu aktivieren. Solche synergistische Aktivierung ist bis jetzt noch nicht beschrieben worden, viele Berichte jedoch behandeln die gegenseitige Unterdrückung von Rel-Proteinen und Steroid-Rezeptoren. Der neuentdeckte Mechanismus liefert die notwendigen Werkzeuge, um Verbindungen zu entwickeln, welche die Expression der regulatorischen Elemente modulieren. Abhängig von dem regulatorischen Element, können solche Verbindungen durch überall auftretende Steroid-Rezeptoren agieren und immer noch eine gewebeselektive Antwort liefern.
Als ein erstes Beispiel untersuchen wir den molekularen Mechanismus, durch den Östrogen das Serotonin-System moduliert. Insbesondere haben wir den Effekt eines Östrogens auf das 5-HT1A Rezeptor-Gen untersucht. Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) ist in der Steuerung einer Vielzahl von Verhaltens-Prozessen (4) involviert. Die Fehl-Regulierung des Serotonin-Systems, so nimmt man an, spielt eine wesentliche Rolle bei neuropsychiatrischen Störungen, wie Depression und Angstzuständen (5, 6). Die komplexe Wirkung des Serotonins wird vermittelt durch eine grosse Familie von diesbezüglichen Rezeptoren (7). Besondere Aufmerksamkeit ist auf den 5-HT1A Rezeptor gelegt worden, welcher ein G-Protein gekoppelter Rezeptor ist, der in negativer Weise die Adenylat-Zyklase (8) reguliert. Der 5-HT1A Rezeptor wird in einem verengten Bereich des Gehirns exprimiert und hohe Niveaus von Rezeptoren sind in den limbischen Bereichen, dem cerebralen Cortex und den Raphe Nukleus des Gehirns (9–11) beobachtet worden. Hier zeigen wir, dass ERα in synergistischer Weise mit NF-κB zusammenwirkt, um den 5-HT1A Rezeptor-Promotor zu aktivieren. Diese Aktivierung ist bereits in Abwesenheit von Hormonen aufgetreten und konnte weiter induziert werden durch die Hinzufügung von entweder 17β-Estradiol (E₂) oder 4-Hydroxytamoxifen (OH-T), aber nicht durch ICI 164384. ERβ ist auch fähig, diesen Effekt zu vermitteln, obwohl die Wirkung von ERα in diesem Beispiel viel weitgehender war. Weiterhin fanden wir, dass diese synergistische Aktivierung sowohl von den Transaktivierungs-Bereichen der p65 Untereinheit des NF-κB als auch von den A/B Bereichen des ERα abhängig gewesen ist, welcher AF1 enthält. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Östrogene die Exprimierung des 5-HT1A Rezeptors über einen neuen Mechanismus ermöglichen können, der die synergistische Aktivierung durch NF-κB mit ER involviert.
Derselbe synergistische Effekt ist in erstaunlicher Weise gefunden worden, dass er eine Rolle in der Aktivierung des E-Selektin Promotor durch NF-κB und Steroid-Rezeptoren wie dem Mineralcortocoid-Rezeptor (MR) spielt. Dies ist in der 7 und dem nachfolgenden Text beschrieben. Wie es nun den Anschein hat, dass synergistische Wirkungen mit NF-κB über regulatorische Elemente nicht auf ER beschränkt sind, sondern auch mit MR beobachtet werden können, können ähnliche Ergebnisse mit anderen Steroid-Rezeptoren erwartet werden.
Die vorliegende Erfindung eröffnet die Möglichkeit, Screening Assays für die Identifizierung von Verbindungen herzustellen, die fähig sind, die neuentdeckten Mechanismen zu modulieren. Beispielsweise, da der 5HT1A-Rezeptor ausschliesslich im Gehirn-Gewebe vorhanden ist und E-Selektin nur in endothelialen Zellen exprimiert, können Liganden, die in solchen Assays gefunden werden, in spezifischer Weise eingesetzt werden, um CNS-Krankheiten und/oder kardiovaskuläre Krankheiten zu behandeln und somit die Identifikation der Verbindungen erlauben, welche in gewebeselektiver Weise wirken. Assays für die Deselektion von solchen Liganden, die auf andere Gewebe zielen, sind verfügbar und dem Fachmann wohl bekannt.
In der vorliegenden Studie zeigen wir auch, dass der cis-regulatorische Bereich des 5-HT1A Rezeptors zwei mögliche NF-κB Bindungsorte umfasst und das Vorhandensein von NF-κB Proteinen kritisch ist für die synergistische Induktion durch ER. Dies zeigt, dass NF-κB Komplexe mit ER zusammenwirken, um in synergistischer Weise 5-HT1A Rezeptor-Gen-Exprimierung zu regulieren.
In den meisten Systemen, die bis jetzt untersucht worden sind, sind die Östrogen- und NF-κB Signalisier-Pfade gegenseitig antagonistisch. Beispielsweise ist die Regulierung des IL-6 Promotors in intensiver Weise studiert worden und die NF-κB induzierte Aktivierung dieses Gens konnte in klarer Weise durch Östrogen (33, 34) unterdrückt worden. Es ist konsistent mit diesen Feststellungen, dass wir gezeigt haben, dass auf einem künstlichen NF-κB Reporter-Konstrukt und auf dem E-Selektin Promotor (7) Östrogen die NF-κB Aktivität unterdrückt. Dennoch verbessert Östrogen weiterhin auf dem 5-HT1A Rezeptor Promotor die NF-κB induzierte Aktivität, darauf hinweisend, dass positive oder negative Regulierung durch Östrogen von dem Promotor-Umfeld abhängt.
ERα und ERβ zeigen einen hohen Grad von Homologie in dem DNS-Bindungsbereich und moderate Homologie in dem Liganden-Bindungsbereich, dennoch ist der A/B-Bereich nur wenig zwischen den zwei Rezeptoren beibehalten. Basierend auf verschiedenen unterschiedlichen Zugängen ist die synergistische Aktivierung des 5-HT1A Promotors durch NF-κB und ER von dem N-terminalen Bereich von ERα abhängig befunden worden, der AF-1 enthält. Zuerst ergab der Ersatz des A/B Bereichs von ERβ mit dem A/B Bereich von ERα (ERβ/α) einen chimerischen Rezeptor, der noch potenter war als das Wild-Typ ERα bei der Aktivierung des 5-HT1A Rezeptor-Promotors. Dennoch schaffte der Ersatz des A/B Bereichs von ERα mit dem A/B Bereich von ERβ (ERβ/α) fast in vollständiger Weise die Fähigkeit des Rezeptors ab, den Promotor in synergistischer Weise zu aktivieren. Zweitens war die synergistische Aktivierung durch ERα 1–339, einer AF-2 defektiven Mutante, zum Wildtyp ERα vergleichbar, während die Wirkungen von ERα 121–599, einer AF-1 defektiven Mutante, mit dem Wildtypus ERβ vergleichbar waren. Drittens waren Wirkungen von ERβ bei der Weitervermittlung dieser synergistischen Effekte im Vergleich zu ERα sehr viel kleiner. Viertens war das Teil-Anti-Östrogen OH-T, welches nur AF-2 blockiert, so potent wie E₂ bei der Aktivierung des 5-HT1a Rezeptor-Promotors. Zu dem durch AF-1 vermittelte agonistische Effekt der Anti-Östrogene ist kürzlich berichtet worden, dass er über den A/B-Bereich von ERα vermittelt wird, aber nicht über den A/B-Bereich von ERβ (28). Diese Unterschiede zwischen ERα und ERβ lassen verschiedene regulatorische Funktionen für die zwei ER-Untertypen vermuten. Zusammengenommen zeigen diese Daten ein klares Einbinden von ERα AF-1 in der 5-HT1A Rezeptor Promotor Regulierung.
Unsere Ergebnisse zeigen klar die entscheidende Rolle der NF-κB Komplexe und der NF-κB Bindungsorte bei der synergistischen Aktivierung des 5-HT1A Rezeptor Promotors durch ER. Dennoch schaffte die Mutation der zwei NF-κB Elemente in dem –901luc Konstrukt die NF-κB Wirkung ab, während der ER-Effekt beibehalten wurde. Eine Erklärung könnte sein, dass NF-κB Proteine als Monomere mit diesen mutierten κB-Elementen binden. Dieser NF-κB-DNS Komplex, der unfähig ist, die Transkription in dieser Ausgestaltung zu aktivieren, könnte durch ER stabilisiert werden und demgemäss in einer Aktivierung resultieren, möglicherweise im Zusammenspiel mit anderen Antwort-Sequenzen in dem Promotor des 5-HT1A Rezeptor-Gens. Weiterhin ist es klar durch den Einsatz der ERα Mutanten und Chimeren, dass, obwohl ein funktionaler DNS-Bindungsbereich von ERα erforderlich ist, keine klare Korrelation zwischen ERα Aktivität auf dem ERE Reporter und dem 5-HT1A Rezeptor Promotor besteht. Daher ist die am Wahrscheinlichsten anzusehende Erklärung für die synergistische Aktivierung des 5-HT1A Rezeptor Promotors, dass ER diesen Promotor nicht über die direkte Bindung an DNS sondern über Protein-Protein Wechselwirkungen aktiviert. Dieses Modell wird durch die Tatsache gestützt, dass sowohl der DNS-Bindungsbereich des ERα und ein intaktes RHD von p65 für die synergistische Aktivierung erforderlich sind, da ERα beschrieben worden ist, direkt mit p65 wechselzuwirken, umfassend den DNS-Bindungsbereich von ERα und den RHD von p65 (34). Weiterhin sind sowohl die Transaktivations-Bereiche von p65 und AF-1 von ERα wesentlich für diese Antwort. Daher lässt das vorliegende Ergebnis vermuten, dass NF-κB Komplexe mit ER zusammenwirken, um Coaktivatoren in den Komplex über AF-1 zu rekrutieren und damit in synergistischer Weise den 5-HT1A Rezeptor Promotor zu aktivieren.
Zusätzlich zu den klassischen Hormon-Aktivierungs-Wegen über Signal-Transduktions-Wege ist beschrieben worden, um eine Anzahl von Steroid Rezeptoren zu regulieren, umfassend ERα, unabhängig vom hormonalen Liganden. Für nukleare Rezeptoren ist gezeigt worden, dass sie durch nonsteroidale Agenten aktiviert werden, wie Dopamin, Wachstums-Fakturen und PKA-Aktivatoren über Phosphorylierung (39). Für die Phosphorylierung von ERα ist gezeigt worden, dass sie die Rezeptor-Aktivität erhöht und hauptsächliche Phosphorylierungs-Orte sind in dem A/B Bereich des Rezeptors angeordnet (40, 41). Kürzlich ist gezeigt worden, dass die Phosphorylierung von ERβ AF-1 die Kofaktorrekrutierung und die Gen-Aktivierung durch nonsteroidale Aktivatoren reguliert (42), wohingegen die Phosphorylierung des A/B Bereichs von durch Peroxisom verbreitungs-aktivierter Rezeptor γ seine transkriptionale Aktivität vermindert (43). Das Vorhandensein von einigen Kinase-Orten innerhalb des A/B Bereichs von ERα und ERβ lässt darauf schliessen, dass die differentielle Phosphorylierung des AF-1 Bereichs in verschiedenen Antworten der Rezeptoren durch verschiedene Aktivatoren resultieren kann. Das Bestehen dieses zusätzlichen Weges zeigt die Wesentlichkeit von AF-1 in der hormonunabhängigen Rezeptor-Aktivierung.
Einige Beweislinien lassen vermuten, dass Östrogen auch die 5-HT1A Rezeptor Exprimierung in dem CNS regulieren könnte. Beispielsweise ist der Abfall des Östrogens vor der Niederkunft und dem Einsetzen der Menopause mit negativen Wirkungen korreliert (44), während die Östrogen-Ersatztherapie in manchen Fällen die Depression oder die Angstzustände bei Frauen vermindern können (45, 46). Weiterhin führte die Ovariektomie zum Abfall in 5-HT Bindungen und 5-HT Transporter Bindungsorten (12, 14), während der Ersatz des Östrogens für ovariektomisierte Ratten diesen Abfall umkehrte. Sowohl ERα als auch ERβ sind in vielfachen Bereichen des Gehirns identifiziert worden, umfassend den Cortex, den Hippocampus und den Raphe Nuclei (47). Zusätzlich ist für NF-κB auch beschrieben worden, dass es aktiv im Gehirn ist, insbesondere in dem Cortex und dem Hippocampus (48). Zur selben Zeit zeigt sich, dass NF-κB nicht nur in Immun-Zellen wirkt, sondern einzigartige Rollen auch in Prozessen spielt, wie der neuronalen Plastizität, der Neuro-Degeneration und der neuronalen Entwicklung (49). Daher können diese Transkriptions-Faktoren und Wege einen wesentlichen Anteil in der Regulierung der 5-HT1A Rezeptor-Gen Exprimierung im Gehirn spielen. Der Fähigkeit von Östrogen, die serotorische Rezeptor-Funktion zu modulieren, kann mindestens zum Teil die Tiefenwirkungen dieses Hormons auf Stimmung und mentalen Zustand unterfüttern.
Die synergistische Aktivierung zwischen Steroid-Rezeptoren und Rel-Proteinen ist auch mit dem E-Selektin Promotor gefunden worden. Um die Wirkungen der Mineralkortikoide auf die E-Selektin Promotor-Aktivität zu bestimmen, haben wir transient U-2 OS Zellen mit einem Luziferase Reporter Konstrukt transfektiert, welches Teile des E-Selektin Promotors enthält, zusammen mit einem Expressionsvektor, der MR kodiert. Wie in der 7A dargestellt, ist die IL-1β induzierte Promotor Aktivität durch MR in einer synergistischen Weise stimuliert worden. Diese NF-κB induzierte Aktivität des E-Selektin Promotors in Gegenwart von MR konnte weiterhin durch Zufügung von Aldosteron verbessert werden. Die Selektivität dieses Mechanismus zeigte sich durch Wiederholung des Experiments mit einem Luziferase-Vektor ohne den E-Selektin Promotor. Keine Wirkungen von IL-1β und/oder MR sind beobachtet worden (7B).
Interessanterweise hat sich ergeben, dass, falls Erα anstelle von MR kotransfektiert worden ist, keine synergistischen Wirkungen auf die E-Selektin Promotor-Aktivität beobachtet werden konnten. Anstelle war unter diesen Bedingungen die IL-1β induzierte Promotor-Aktivität durch Erα in Abwesenheit von Liganden unterdrückt worden, welche Wirkung weiterhin durch Hinzufügen von 17β-Estradiol (7C) erhöht werden konnte. Diese Ergebnisse zeigen wiederum, dass die synergistischen Wirkungen der Liganden-aktivierten Steroid Rezeptoren mit NF-κB's von dem spezifischen Promotor-Umfeld abhängen und die Selektivität für eine bestimmte Steroid Rezeptor – Promotor Kombination besteht.
Der E-Selektin Promotor enthält vielfache NF-κB Übereinstimmungsorte (Collins, T., Williams, A., Johnston, G. I., Kim, J., Eddy, R., Shows, T., Gimbrone, M. A., Bevilacqua, M. P. (1991) J. Biol. Chem. 266: 2466–2473), die in wesentlicher Weise für die synergistischen Effekte der Mineralcorticoide auf dem E-Selektin Pro motor verantwortlich ist. Die Rolle von NF-κB in den oben beschriebenen synergistischen Wirkungen mit MR wurde durch Studien bestätigt, bei denen die Wirkungen der Mineralcorticoide auf einem 3·NF-κB-TK Reporter getestet worden sind, einem synthetischen Reporter-Konstrukt, welches 3 Kopien eines konsensuellen NF-κB Bindungsortes vor dem TK Promotor (7D) enthält. Wie durch die benutzte Skalierung der 7D zu ersehen, ist der synthetische 3·NF-κB-TK Reporter viel empfindlicher für sowohl die Stimulierung durch IL-1β und den synergistischen Effekt von MR. Dies ist nicht überraschend, da der Reporter Vielfach-Wiederholungen von NF-κB Antwort-Elementen enthält. Synergistische Wirkungen der Rel-Proteine und MR sind weiter nicht verbessert durch Zufügung von Aldosteron, was aufgrund des grossen synergistischen Effektes von IL-1β und MR in Abwesenheit von Aldosteron auftritt. Das Auffinden, dass MR und ER fähig sind, die Promotor-Aktivität in Abwesenheit von IL-1β zu induzieren oder zu unterdrücken (siehe 7A, C und D dritter und vierter Balken) lässt vermuten, dass U-2 OS Zellen in konstitutiver Weise NF-κB Aktivität in Abwesenheit von Zytokinen enthält. Alternativ können U-2 OS Zellen selber Zytokine produzieren oder die Zytokin-Aktivität kann aus dem Serum abgeleitet werden, in dem die Zellen wachsen. Obwohl nicht ausgeschlossen werden kann, dass auch andere Arten von Transkriptions-Faktoren in der Modulierung des E-Selektin Promotors und 3·NF-κB-TK Reportern involviert sind (Kaszubska, W., Hooft van Huijsduijnen, R., Ghersa, P., De-Raemy-Schenk, A.-M., Chen, B. P., Hai, T., Delamarter, J. F., Whelan, J. Mol. Cell. Biol. 13: 7180–7190), zeigen die obengenannten Ergebnisse wenigstens, dass NF-κB's eine wesentliche Rolle in der Stimulierung dieser Promotor-Reporter durch Mineralcorticoide spielen. Die oben beschriebenen Unterschiede zwischen ERα und MR, in entweder ihrer Synergie oder dem Antagonismus mit IL-1β induzierten Rel-Proteinen, sind wahrscheinlich auch auf die unterschiedlichen Aktivitäten der Komplexe zurückzuführen, die entweder ERα oder MR und verschiedene Typen von NF-κB's umfassen. Zusätzlich zeigt die vorliegende Studie, dass verschiedene Typen von nuklearen Rezeptoren synergistische Wirkungen mit NF-κB's auf NF-κB Antwort-Promotoren haben können. Die genaue Natur dieser Wirkung ist klar abhängig von der Kombination des Steroid-Rezeptor Typs und der Art und Weise des Promotors.
Nachdem nun verschiedene bestimmte Ausführungsbeispiele der Erfindung beschrieben worden sind, ist es klar, dass ein Fachmann nun fähig ist, andere regulatorische Elemente auszuwählen, die in synergistischer Weise durch Rel-Proteine und Steroid-Rezeptoren aktiviert werden. Kurz gesagt kann dies am besten durch Kotransfektion des bestimmten regulatorischen Elementes, welches betrachtet wird, und funktional mit einem Reporter-Gen verbunden ist, zusammen mit Expressionsvektoren erreicht werden, die ein Rel-Protein und einen Steroid-Rezeptor kodieren. Insbesondere können Expressionsvektoren, welche NF-κB und einen Steroid-Rezeptor kodieren, für diesen Zweck geeignet sein. Der Steroid-Rezeptor kann ERα oder MR sein, aber auch ERβ oder eine Kombination von ERα und ERβ. Die Beispiele liefern das notwendige Werkzeug, um weiterhin regulatorische Elemente auszuwählen, die fähig sind, in synergistischer Weise gemäss der Erfindung aktiviert zu werden.
Die Entdeckung eines neuen Mechanismus, bei dem Rel-Proteine und Steroid-Rezeptoren wechselwirken, um in synergistischer Weise ein regulatorisches Element zu aktivieren, eröffnet die Möglichkeit, Verbindungen zu screenen, die in spezifischer Weise mit diesem neuen Mechanismus wechselwirken. Die Erfindung gemäss einem Aspekt bezieht sich daher auf ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die fähig sind, einen synergistischen Effekt eines Steroid-Rezeptors und eines Rel-Proteins auf regulatorischen Elementen zu modulieren, umfassend die Schritte des:

– des Lieferens einer Zelle, welche ein regulatorisches Element umfasst und fähig ist, in synergistischer Weise durch einen Steroid-Rezeptor und ein Rel-Protein aktiviert zu werden, wobei diese Zelle zusätzlich ausreichende Niveaus des besagten Steroid-Rezeptors und des besagten Rel-Proteins oder funktioneller Äquivalente davon umfasst, um die synergistische Aktivierung auf dem regulatorischen Element zu gestatten,
– des Kontaktierens der besagten Zelle mit mindestens einer Verbindung,
– des Bestimmens, ob die Aktivierung des regulatorischen Elementes durch die Verbindung moduliert wird.

Verbindungen, die fähig sind, den synergistischen Effekt eines Rel-Proteins und eines Steroid-Rezeptors zu modulieren, können Verbindungen sein, die den synergistischen Effekt stimulieren oder inhibieren. Beispiele von bekannten Verbindungen, die fähig sind, den synergistischen Effekt von manchen Steroid-Rezeptoren und Rel-Proteinen auf den Promotor des Serotonin 1A Rezeptors oder den E-Selektin Promotor zu stimulieren, sind in den Beispielen gegeben.
Funktionale Äquivalente der Rel-Proteine in diesem Bezug sind so zu verstehen, wie ein Protein-Komplex der Rel-Familie, die eine Homologie in dem Rel-Bereich teilen und in der Gen-Regulierung involviert sind (Liou and Baltimore, Current Opinion in Cell Biology, 5: 477–487, 1993) umfassend, aber nicht begrenzt auf NF-κB1, Lyt-10, cRel, RelA und RelB. Auch sind funktionale Äquivalente von NF-κB umfasst, die eine bestimmte biologische Funktion beibehalten, vorzugsweise Fragmente, die mindestens den Transaktivations-Bereich zusammen mit dem DNS-Bindungsbereich von NF-κB enthalten.
Unter „Regulatorischem Element" oder „Promotor" ist eine DNS- Sequenz gemeint, die fähig ist, direkt oder indirekt RNS Polymerase in einer Zelle zu binden und die Transkription einer stromabwärts (3' Richtung) Kodier-Sequenz zu imitieren.
Ein Promotor kann mit einem heterologen Reporter-Gen verbunden sein, welches fähig ist, die Aktivierung des regulatorischen Elementes zu signalisieren. In solch einem Konstrukt beeinflusst der Promotor die Transkription von dem heterologen Gen. Geeignete Reporter-Gene sind beispielsweise Luziferase, Chloramphenicol Acetyl Transferase, Beta Galctosidase und abgegebene plazentale alkaline Phosphatase.
„Funktionale Äquivalente" von ER in diesem Bezug sind so zu verstehen als Fragmente von ER, die mindestens den AF-1 Übertragungsbereich des ERα zusammen mit dem DNS-Bindungsbereich von ERα umfassen.
Der Begriff „Funktionale Äquivalente" im Allgemeinen ist so zu verstehen als ein Molekül, welches fähig ist, dieselbe biologische Funktion wie das Molekül auszuführen, auf welches es sich bezieht.
Levels der Steroid-Rezeptoren und des Rel-Proteins in der Zelle müssen ausreichend sein, um die synergistische Aktivierung des regulatorischen Elementes auszulegen. Dies kann erreicht werden durch Auswahl einer geeigneten Zelle, die in konstitutiver Weise den Steroid-Rezeptor und das Rel-Protein in ausreichenden Niveaus erzeugt oder in der die Steroid-Rezeptor und Rel-Protein Expression durch die Hinzufügung von geeigneten Faktoren induziert werden kann. Alternativ können der Steroid-Rezeptor und das Rel-Protein in die Zelle transfektiert werden unter Einsatz geeigneter rekombinanter DNS-Vektoren und solche Transfektions-Methoden sind im Stand der Technik bekannt.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren wie oben beschrieben, bei dem der besagte Steroid-Rezeptor ausgewählt wird aus der Gruppe, welche aus dem Östrogen-Rezeptor α, dem Östrogen-Rezeptor β und/oder dem Mineralcortocoid-Rezeptor besteht oder funktionalen Äquivalenten davon.
Bei einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel bezieht sich das Verfahren auf ein Verfahren wie oben beschrieben, bei dem das Rel-Protein ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus NF-κB, Lyt10, cRel, RelA und RelB oder funktionalen Äquivalenten davon.
In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel bezieht sich das Verfahren auf ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei das regulatorische Element ein Promotor für das 5HT1-A Rezeptor-Gen oder ein funktionales Äquivalent davon ist.
In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei das regulatorische Element ein Promotor für das E-Selektin Gen oder ein funktionales Äquivalent davon ist.
In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei die besagte Zelle mit einem Reporter-Gen transfektiert wird, welches fähig ist, die Aktivierung des regulatorischen Elementes zu signalisieren.
Die Erfindung betrifft auch eine Zelle, die mit Nukleinsäure transfektiert ist, umfassend einen Promotor für das 5HT1A Rezeptor-Gen oder ein funktionales Äquivalent davon, und ein Repor ter-Gen, welches fähig ist, die Aktivierung des Promotors für das 5HT1A Rezeptor-Gen zu signalisieren, wobei die besagte Zelle weiterhin umfasst:
Nukleinsäure, kodierend einen Steroid-Rezeptor, fähig, in funktionaler Weise den besagten Steroid-Rezeptor oder ein funktionales Äquivalent davon innerhalb der Zelle zu exprimieren, und auch umfassend eine Nukleinsäure, die ein Rel-Protein oder ein funktionales Äquivalent davon kodiert, fähig, in funktionaler Weise das besagte Rel-Protein innerhalb der Zelle zu exprimieren.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zelle gemäss der Erfindung, wobei der besagte Steroid-Rezeptor ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus dem Östrogen-Rezeptor α, dem Östrogen-Rezeptor β und/oder dem Mineralocorticoid-Rezeptor oder funktionalen Äquivalenten davon.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zelle gemäss der Erfindung, bei der das Rel-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NF-κB, Lyt-10, cRel, RelA, und RelB oder funktionalen Äquivalenten davon.
Die Erfindung betrifft auch eine Zelle gemäss der Erfindung, bei der die Nukleinsäure einen Promotor für das 5HT1A Rezeptor-Gen umfasst und die Nukleinsäure einen Steroid-Rezeptor kodiert und/oder die Nukleinsäure ein Rel-Protein kodiert oder funktionale Äquivalente davon, die in die Zelle transfektiert werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zelle, die mit Nukleinsäure transfektiert ist, umfassend einen Promotor für das E-Selektin-Gen oder ein funktionales Äquivalent davon und Nukleinsäure, kodierend einen Steroid-Rezeptor, der fähig ist, in funktionaler Weise den besagten Steroid-Rezeptor oder ein funktiona les Äquivalent davon innerhalb der besagten Zelle zu exprimieren und auch umfassend eine Nukleinsäure, kodierend ein Rel-Protein oder ein funktionales Äquivalent davon, fähig, das besagte Rel-Protein innerhalb der Zelle zu exprimieren.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zelle gemäss der Erfindung, bei der der besagte Steroid-Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Östrogen-Rezeptor α, dem Östrogen-Rezeptor β und/oder dem Mineralocorticoid-Rezeptor oder funktionalen Äquivalenten davon bezieht.
Die Erfindung betrifft ferner eine Zelle gemäss der Erfindung, bei der das Rel-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NF-κB, Lyt-10, CRel, RelA und RelB, oder funktionalen Äquivalenten davon.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zelle gemäss der Erfindung, bei der die besagte Zelle mit einem Reporter-Gen transfektiert ist, welches fähig ist, die Aktivierung des Promotors für das E-Selektin-Gen zu signalisieren.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zelle gemäss der Erfindung, bei der die Nukleinsäure einen Promotor für das E-Selektin-Gen umfasst und die Nukleinsäure einen Steroid-Rezeptor kodiert und die Nukleinsäure ein Rel-Protein kodiert oder funktionale Äquivalente davon mit der Zelle transfektiert werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Zelle wie oben beschrieben für die Identifikation von Verbindungen, die das Niveau des Serotonin-Rezeptors in dem Gehirn modulieren. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel beeinträchtigen die Verbindungen, die den synergistischen Effekt der Steroid-Rezeptoren und der Rel-Proteine modulieren, nicht die Mechanismen, mit de nen Rel-Proteine oder Steroid-Rezeptoren in individueller Weise ein regulatorisches Element beeinflussen. Diese Verbindungen liefern eine Selektivität, die für den klinischen Einsatz der Erfindung höchst wünschenswert ist.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Die synergistische Aktivierung des 5-HT1A Rezeptor-Promotors durch NF-κB und menschliches ERα. (A) COS-1 Zellen sind in transienter Weise mit dem –901luc Reporter-Konstrukt mit leeren Expressionsvektoren oder Expressionsvektoren transfektiert worden, die für p50 und p65 Untereinheiten von NF-κB (weisse Balken) in Kombination mit Expressionsvektoren, die ERα oder ERβ kodieren (gestrichelte Balken) und mit 10^–8 M E₂ (schwarze Balken) während 24 Stunden behandelt worden sind. Dargestellt ist die Induktion der Luziferase-Aktivität, die durch NF-κB hervorgerufen wird, über Zellen, die mit dem leeren Expressionsvektor transfektiert worden sind. Balken bedeuten den Mittelwert von mindestens 3 unabhängigen Experimenten plus/minus einer Standardabweichung (B) COS-1 Zellen sind in transienter Weise mit 4 × NF-κB(HIV)tkluc in Kombination mit einem leeren Expressionsvektor oder Expressionsvektoren transfektiert worden, die p50 und p65 Untereinheiten von NF-κB kodieren, und Expressionsvektoren, die ERα oder ERβ kodieren. Die Zellen sind entweder unbehandelt (weisse Balken) oder mit 10^–8 M E₂ (schwarze Balken) während 24 Stunden behandelt. Dargestellt ist die Induktion der Luziferase-Aktivität, die durch NF-κB hervorgerufen wird, über Zellen, die mit dem leeren Expressionsvektor transfektiert worden sind. Balken bedeuten den Mittelwert von wenigstens drei unabhängigen Experimenten plus/minus einer Standardabweichung.
2. Wichtigkeit der κB-Elemente in der 5-HT1A Rezeptor-Promotor Regulierung durch NF-κB und menschliches ERα. (A) Schematische Darstellung von Luziferase (luc) Reporter-Konstrukten, die eingesetzt worden sind, enthaltend Ratten 5-HT1A Rezeptor (5-HT1AR) Promotor-Löschungen. Die zwei offenen Kreise (O) stellen NF-κB-Bindungsorte dar. (B) COS-1 Zellen sind in transienter Weise mit den verschiedenen Reporter-Konstrukten wie angezeigt transfektiert worden, zusammen mit dem leeren Expressionsvektor oder Expressionsvektoren, welche die p50 und p65 Untereinheiten von NF-κB (weisse Balken) in Kombination mit Expressionsvektoren, die ERα kodieren (gestrichelte Balken) und mit 10^–8 M E₂ (schwarze Streifen) während 24 Stunden behandelt worden sind. Dargestellt ist die Induktion von Luziferase-Aktivität, die durch NF-κB über Zellen hervorgerufen wird, die mit dem leeren Expressionsvektor transfektiert worden sind. Balken stellen den Mittelwert von mindestens drei unabhängigen Experimenten dar plus/minus einer Standardabweichung.
3. OH-T, aber nicht ICI, kann die Aktivität des 5-HT1A Rezeptor-Promoters durch NF-κB und menschliches ERα verbessern. (A) COS-1 Zellen sind transient mit dem 901luc Reporterkonstrukt zusammen mit einem leeren Expressionsvektor oder Expressionsvektoren transfektiert worden, die die p50 und p65 Untereinheiten von NF-κB in Kombination mit Expressionsvektoren kodieren, die ERα kodieren, und mit E₂, OH-T oder ICI für 24 Stunden wie angezeigt behandelt worden. Dargestellt ist die Induktion der Luziferase-Aktivität, die durch NF-κB über Zellen hervorgerufen wird, die mit dem leeren Expressionsvektor transfektiert worden sind. Die Balken entsprechen dem mittleren von mindestens drei unabhängigen Experimenten +/– eine Standardabweichung.
4. Die Transaktivierungs-Funktion von p65 ist erforderlich für die synergistische Aktivierung des 5-HT1A Rezeptor-Promoters durch NF-κB und menschliche ERα. COS-1 Zellen sind transient mit dem –901luc Reporterkonstrukt zusammen mit einem leeren Expressionsvektor oder Expressionsvektoren transfektiert worden, die p50, p65, p65RHD oder p65Nsi wie angezeigt (weisse Balken) in Kombination mit Expressionsvektoren transfektiert worden sind, die ERα (schraffierte Balken) kodiert, und mit 10^–8 M E₂ für 24 Stunden behandelt worden sind (schwarze Balken). Dargestellt ist die Induktion der Luziferase-Aktivität, die durch NF-κB Untereinheiten über Zellen hervorgerufen wird, die mit dem leeren Expressionsvektor transfektiert worden sind. Die Balken entsprechen dem mittleren von mindestens drei unabhängigen Experimenten +/– eine Standardabweichung.
5. Die synergistische Aktivierung des 5-HT1A Rezeptor-Promoters durch Maus ERα tritt in einer AF-2 unabhängigen Art und Weise auf. (A) COS-1 Zellen sind transient mit dem –901luc Reporterkonstrukt zusammen mit einem leeren Expressionsvektor oder Expressionsvektoren transfektiert worden, die die p50 und p65 Untereinheiten NF-κB in Kombination mit Expressionsvektoren kodieren, die Maus ERα, ERβ, ERα 121–599, ERα 1–339 oder ERα C241/244A kodieren. Zellen sind entweder unbehandelt (gestrichelte Balken) oder mit 10^–8 M E₂ (schwarze Balken) für 24 Stunden behandelt worden. Dargestellt ist die Induktion der Luziferase-Aktivität, die durch NF-κB über Zellen hervorgerufen worden ist, die mit dem leeren Expressionsvektor transfektiert worden sind. Balken entsprechen dem Mittelwert von einem von mindestens drei unabhängigen Experimenten +/– Standardabweichung. (B) COS-1 Zellen sind transient mit 3 × ERE-TATAluc in Kombination mit einem leeren Expressionsvektor oder Expressionsvektoren transfektiert worden, die Maus ERα, ERβ, ERα 121–599, ERα 1–339 oder ERα C241/244A kodieren. Zellen sind entweder unbehandelt gewesen (gestrichelte Balken) oder mit 10^–8 M E₂ für 24 Stunden behandelt worden (schwarze Balken). Dargestellt ist die Induktion von Luziferase-Aktivität, die durch ER über Zellen hervorgerufen worden ist, die mit dem leeren Expressionsvektor transfektiert worden sind. Balken entsprechen dem Mittelwert von einem von min destens drei unabhängigen Experimenten +/– eine Standardabweichung.
6. Der A/B Bereich des ERα ist wesentlich für die synegistische Aktivierung des 5-HT1A Rezeptor-Promoters. (A) COS-1 Zellen sind transient mit dem –901luc Reporterkonstrukt zusammen mit einem leeren Expressionsvektor oder Expressionsvektoren transfektiert worden, die p50 und p65 Untereinheiten von NF-κB in Kombination mit Expressionsvektoren kodieren, die ERα, ERβ, ERα/β oder ERα/β kodieren. Zellen sind entweder unbehandelt gelassen worden (gestrichelte Balken) oder für 24 Stunden mit 10^–8 M E₂ behandelt worden (schwarze Balken). Dargestellt ist die Induktion von Luziferase-Aktivität, die durch NF-κB über Zellen hervorgerufen worden ist, die mit leerem Expressionsvektor transfektiert worden sind. Balken stellen den Mittelwert von mindestens einem von drei unabhängigen Experimenten +/– eine Standardabweichung dar. (B) COS-1 Zellen sind transient mit 3 × ERE-TATAluc in Kombination mit einem leeren Expressionsvektor oder Expressionsvektoren transfektiert worden, die menschliches ERα, ERβ, ERα/β oder ERβ/α kodieren. Zellen sind entweder unbehandelt gelassen worden (gestrichelte Balken) oder sind für 24 Stunden mit 10^–8 M E₂ behandelt worden (schwarze Balken). Dargestellt ist die Induktion der Luziferase-Aktivität, die durch ER über Zellen hervorgerufen worden ist, die mit dem leeren Expressionsvektor transfektiert worden sind. Balken stellen den Mittelwert von mindestens einem von drei unabhängigen Experimenten +/– eine Standardabweichung dar.
7. Synergistische Aktivierung oder Transrepression des E-Selektin Promoters durch NF-κBs und bzw. MR oder ERα. (A) U-2 OS-Zellen sind transient mit einem E-Selektin Promoter-Reporter co-transfektiert worden und die Wirkungen sind von IL-1β gemessen worden, die Co-Transfektion von MR oder eine Kombination von IL-1β mit MR in Abwesenheit oder Anwesenheit von 0,1 Mikro M Aldosteron. (B) U-2 OS-Zellen sind transient mit einem Luziferase-Reporter co-transfektiert worden, der nicht den ELAM-Promoter enthält und die Wirkungen sind von IL-1β gemessen worden, Co-Exprimierung von MR, oder einer Kombination IL-1β mit MR in Abwesenheit oder Anwesenheit von 0,1 Mikro M Aldosteron. (C) U-2 OS-Zellen sind transient mit einem E-selektin Promoter-Reporter co-transfektiert worden und die Wirkungen sind bei IL-1β gemessen worden, Co-Transfektion von ERα oder einer Kombination von IL-1β mit ERα in Abwesenheit oder Anwesenheit von 0,1 Mikro M 17β-Estradiol. (D) U-2 OS-Zellen sind transient mit einem synthetischen 3·NF-κB-tk Promoter-Reporter transfektiert worden und die Wirkungen sind von IL-1β gemessen worden, Co-Transfektion von MR oder einer Kombination von IL-1β mit MR in Abwesenheit oder Anwesenheit von 0,1 Mikro M Aldosteron.
Die Ergebnisse sind als gefaltete Induktionen im Vergleich zu unbehandelten Zellen ausgedrückt worden (erster Balken in jeder Figur). Alle Werte stellen Duplikate +/– eine Standardabweichung dar. Man beachte den Unterschied in den Skalen bei A, B, C gegenüber D.
BEISPIELE
Beispiel 1
Benutztes Material und Verfahren
Spezielle Reagenzien. 17β-Estradiol ist von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) erhalten worden. 4-Hydroxytamoxifen und ICI 164384 sind uns freundlicherweise von Dr. A. Wakeling, Zeneca Pharmaceuticals, Grossbritannien, überlassen worden.
Zellkultur. Affen COS-1 Zellen und menschliche 293 embryonale Nierenzellen sind von der American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD, USA) erhalten worden und sind in einer 1:1 Mischung von DMEM und HAM's F-12 Medium (DF; Life Technologies Inc.) kultiviert worden, mit Bikarbonat gepuffert worden und mit 7,5% FCS versetzt worden. Dextran-beschichtete Aktivkohle (DCC)-FCS ist unter Behandlung von FCS mit Dextran-beschichteter Aktivkohle hergestellt worden, um Steroide zu entfernen, wie oben beschrieben (25).
Plasmide. –901luc ist erzeugt worden durch teilweise Auflassung von –1588luc, einer freundlichen Gabe von Dr. O. Meijer (Leiden, die Niederlande) mit StyI, einfüllen und Ligation von pGL3, aufgeschlossen mit SmaI, wieder aufgeschlossen mit HindIII und Religation; –81luc ist erzeugt worden durch Auflassung von –1588luc mit StyI, einfüllen und weiterem aufschliessen mit BglII und Ligation in pGL3, aufgeschlossen mit SmaI/BglII; –901 365Mluc und –901 64 Mluc sind hergestellt worden durch das Einfügen von Punktmutationen in die original Promoter-Konstrukte durch ortsgerichtete Mutagenese unter Einsatz der Oligonukleotide 5'-gagccgaattctacagactaa-3' beziehungsweise 5'-aactgcaaggagatctacatcgcccctcg-3'. –901 365/64Mluc ist unter Aufschliessen von –901 64Mluc mit SacI/HindIII und Ligation in –901 365Mluc aufgeschlossen mit SacII/HindIII erzeugt worden; –81 64Mluc ist hergestellt worden durch teilweises Aufschliessen von –901 64Mluc mit StyI und Religation. Die CMV4 Expressionsvektoren, die Volllängen cDNAs enthalten, welche menschliches p65 (RelA), p50 (NF-κB) und p65RHD (1–305), p65Nsi (1–551E39I) kodieren, sind zuvor beschrieben worden (26, 27). Die Expressionsvektoren, die menschliches ERα kodieren (pSG5-HEGO) und menschliches ERβ (pSG5-ERβ530) sind freundliche Gaben von Dr. Chambon (Strasbourg, Frankreich) beziehungsweise Dr. Gustafsson (Stockholm, Schweden). Chimerische menschliche ERα/ERβ und ERβ/ERα Rezeptoren sind beschrieben worden (28) und enthalten den A/B Bereich von ERα und die Bereiche C, D, E, F von ERβ in der ERα/ERβ Chimäre und enthielten den A/B Bereich von ERβ und die Bereiche C, D, E, F, von ERα in der ERβ/ERα Chimäre. Maus ERα (pMT2MOR), ERα 1–339, ERα 121–599 und ERα C241/244A (29) sind uns freundlicherweise von Dr. Parker (London, Grossbritannien) zur Verfügung gestellt worden. Die Reporterplasmide, die eingesetzt worden sind, 4 × NF-κB(HIV)tkluc und 3 × ERE/TATA-luc, sind oben beschrieben worden (30,31).
Transiente Transfektionen. Für transiente Transfektionen sind COS-1 Zellen und 293 Zellen in 24-Probenplatten in DF+ versetzt mit 5% DCC-FCS kultiviert worden. Die Zellen sind transfektiert worden unter Einsatz von Calciumphosphat Co-Ausfällung mit 0,4 Mikrogramm von Luziferase-Reporter, 0,6 Mikrogramm von PDMlacZ und 0,2 Mikrogramm der angezeigten Exprimierungs-Plasmide. PBluescript SK ist eingesetzt worden, um die Gesamtmenge von 1,8 Mikrogramm von DNS/je Proben zu erhalten. Nach 16 Stunden ist das Medium aufgefüllt worden und angezeigte Hormone sind hinzugefügt worden. Die Zellen sind 24 Stunden später geerntet worden und für Luziferase-Aktivität unter Einsatz des Luclite Luziferase-Reporter-Gen Assay kit (Packard Instruments, CT) gemäss den Vorgaben des Protokolls des Herstellers und dem Topcount Flüssig Szintillationszähler (Packard Instruments, CT) geassayt worden. Werte sind für die Transfektionseffizienz durch Messung der beta-galactosidase Aktivität korrigiert worden (32).
Beispiel 2
Synergistische Aktivierung des 5-HT1A Rezeptor-Promoters durch NF-κB und ER.
Um die Wirkung der Östrogene auf die 5-HT1A Rezeptor-Promoter Aktivität zu bestimmen, haben wir in transienter Weise COS-1 Zellen mit einem Reporterkonstrukt transfektiert, welches den 5HT1A Rezeptor-Promoter zusammen mit einem Expressionsvektor enthalten hat, der ERα oder ERβ kodiert. Wie in der 1A dargestellt, hatte die Co-Transfektion von ERα oder ERβ und die Behandlung der Zellen mit 17β-Estradiol (E₂) kaum eine Wirkung auf die 5-HT1A Promoter Aktivität. Dennoch zielt, neben direkter Regulierung ER Zielgene indirekt durch die Wechselwirkung von ER mit anderen Transkriptionsfaktoren. Es ist gezeigt worden, dass die vermeintlichen NF-κB Bindungsorte in dem –901luc 5HT1A Rezeptor-Promoterkonstrukt vorhanden sind (siehe 2A) und Transfektion dieses Reporterkonstrukts mit Expressionsvektorens, die p50 und p65 Untereinheiten von NF-κB kodieren, resultieren in einer zehnfachen Induktion des Reporters. Interessanterweise ergab die Co-Transfektion vom ERα in Kombination mit NF-κB nun eine enorme Induktion der Promoter-Aktivität, die weiter verbessert werden konnte durch Hinzufügen von E₂ (1A). Im Gegensatz zu ERα zeigte ERβ eine sehr viel kleinere Induktion, wenn es mit NF-κB co-transfektiert worden ist und keine Wirkung von E₂ konnte beobachtet werden. Ähnliche Ergebnisse sind in 293 Zellen (Resultate nicht dargestellt) erhalten worden, obwohl der Aktivierungslevel von ERα weniger hoch war als der verglichen mit den COS-1 Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass der 5-HT1A Rezeptor-Promoter in synergistischer Weise durch NF-κB und ER aktiviert werden konnte.
In der Vergangenheit haben verschiedene Gruppen eine unterdrückende Wirkung von Östrogenen auf die NF-κB Aktivität berichtet (33–35). Daher haben wir auch die Wirkung von Östrogen auf ein Reporterkontrakt studiert, welches vier NF-κB Elemente aus dem HIV-LTR vor dem Thymidin-Kinasepromoter enthalten hat, welches mit Luziferase gekoppelt worden ist, in Kombination mit Exprimierungs-Konstrukten, die ERα oder ERβ kodieren und die p50 und p65 Untereinheiten von NF-κB. Auf diesem Reporter-Konstrukt resultierte die Co-Transfektion ERα in der Repression der transkriptionalen Aktivität von NF-κB bereits in Abwesenheit vom Hormon, während die Hinzufügung von Hormon in einer weiteren Repression resultiert (1B). Die Co-Transfektion von ERβ zeigte auch einige Repression der NF-κB Aktivität. Ähnliche Ergebnisse sind in den 293 Zellen (Resultate nicht dargestellt) erhalten. Diese Ergebnisse zeigen an, dass, während ER als ein transkriptionaler Unterdrücker von NF-κB auf ein synthetischen NF-κB Reporter-Konstrukt wirkt, welches auf einer gemeinsamen Antwort-Element von dem ICAM-Promoter basiert, ER als ein transkriptionaler Aktivator mit NF-κB auf dem 5-HT1A Rezeptor-Promoter wirkt.
Beispiel 3
Involvieren von NF-κB Elementen in 5-HT1A Rezeptor-Promoter Regulierung durch NF-κB und ER.
Um die Wirkung von ER auf dem 5-HT1A Rezeptor-Promoter zu lokalisieren, sind verschiedene Promoter-Löschungskonstrukte eingesetzt worden (2A). Die Mutation von beiden NF-κB Elementen (–901 365/64Mluc) hob die Wirkung von NF-κB auf den 5-HT1A Rezeptor-Promotor vollkommen auf (2B). Dennoch war ERα nur in Verbindung mit NF-κB immer noch fähig, die Promoter-Aktivität so effizient zu induzieren, wie auf dem Wildtyp-Promoter (–901luc). In gleicher Weise konnte das Promoter-Konstrukt –81luc nicht durch NF-κB induziert werden, obwohl es immer noch ein NF-κB Element enthalten hat. Dennoch war auch bei diesem Promoter-Konstrukt die Wirkung von ERα mit NF-κB beibehalten worden. Wenn das einzige NF-κB Element, welches in dem 81luc Konstrukt vorhanden war, mutierte (–81 64Mluc), war die ERα Wirkung fast vollständig aufgehoben. So involvierte die synergistische Aktivierung des 5-HT1A Rezeptor-Promoters NF-κB Bindungsorte, obwohl die Aktivierung des Promoters durch NF-κB selbst nicht erforderlich war für die Wirkung von ER. Diese Ergebnisse suggerieren, dass die synergistische Promoter-Aktivierung durch ER unabhängig von der DNS-Bindung ist und Protein-Proteinwechselwirkungen um fasst.
Beispiel 4
Wirkung von Antiöstrogenen auf den 5-HT1A Rezeptor-Promoter.
Antiöstrogene sind beschrieben worden, dass sie unterschiedliche Wirkungen abhängig vom Promoter-Kontext und der Rezeptor-Untertypen hat. In Transaktivierungsexperimenten unterdrückte OH-T die Transkription der Gene, die durch eine klassische ERE reguliert worden sind, während es, wie E₂, die Transkription der Gene aktivierte, die unter der Steuerung eines AP-1 Elementes mit ERα sind (22). Wir untersuchten die Wirkung der Antiöstrogene auf den 5-HT1A Rezeptor-Promoter unter Einsatz des partiellen Antagonisten OH-T, welcher AF-2 blockiert und den „reinen" Antagonisten ICI 164384 (ICI), welcher AF-1 und AF-2 blockiert. Wie in der 3 dargestellt verbesserte die ICI-Behandlung nicht die Aktivität des 5-HT1A Rezeptor-Promoters durch ERα und NF-κB, während OH-T in der transkriptionalen Aktivierung so potent wie E₂ gewesen ist. Diese Daten zeigen an, dass der partielle Antagonist OH-T, immer fähig, AF-1 zu aktivieren, so potent wie E₂ in synergistischer Aktivierung des 5-HT1A Rezeptor-Promoters durch Erα ist.
Beispiel 5
Bereiche von NF-κB und ER, die in der synergistischen Aktivierung des 5-HT1A Rezeptor-Promoters involviert sind.
Um die Wesentlichkeit der Transaktivierungsfunktion von NF-κB zu bestimmen, wurde die Wirkung der Löschung der Transaktivierungsbereiche oder das Verhindern der DNS-Bindungsfunktion der p65-Untereinheit von NF-κB auf die Fähigkeit hin untersucht, in synergistischerweise die 5-HT1A Rezeptor-Promoter mit ER in einem transienten Transfektions-Assay zu aktivieren. Während die Co-Transfektion von p50 und p65 oder p65 alleine in starker Weise den Promoter in Kombination mit ERα und E₂ aktiviert, hat die Co- Transfektion mit p50 alleine, welche noch keine Transaktivierungsfunktion hat, kaum eine Wirkung. Die Löschung der Transaktivierungsbereiche von p65 resultierte in einem Konstrukt, das nur die Rel-Homolgiebereich (p65RHD) enthalten hat. P65RHD war immer noch fähig, mit der DNS (27) zu binden, war aber unfähig, den Promoter sowohl in Abwesenheit oder auch in Anwesenheit von ERα und E₂ zu aktivieren. Die DNS-bindungsdefektive Mutante (p65Nsi) enthielt immer noch intakte Transaktivierungsbereiche, war aber auch unfähig, um in synergistischer Weise den Promoter zu aktivieren. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass sowohl die Transaktivierungsfunktion als auch die DNS-Bindungsfunktion von p65 wesentlich sind für die synergistische Aktivierung des 5-HT1A Rezeptor-Promoters durch ER.
Um die Bereiche von ERα zu identifizieren, die in de Aktivierung des 5-HT1A Rezeptor-Promoters involviert ist, sind Löschungs-Konstrukte von Maus ERα eingesetzt worden, denen ein Teil des A/B-Bereichs fehlt, enthaltend AF-1, oder denen ein Teil des Liganden-Bindungsbereichs fehlt, enthaltend AF-2. Während die Löschung des A/B-Bereichs (ERα 121–599) vollständig die synergistische Aktivierung des Promoters unterbindet, resultierte die Löschung des Liganden-Bindungsbereichs (ERα 1–339) in einem Rezeptor, der mindestens so aktiv war wie das ERα Wild-Typus (5A). Die DNS-bindende fehlerhafte Mutante von ERα (ERα C241/244A) war unfähig, den 5-HT1A-Rezeptor-Promoter zu aktivieren, möglicherweise aufgrund dessen, dass ein funktionaler DNS-Bindungsbereich notwendig ist für die Wechselwirkung mit NF-κB (34). Man beachte, dass in Gegensatz zu menschlichem ERα, keine Liganden-Abhängigkeit für Maus-ERα in der synergistischen Aktivierung des 5-HT1A Rezeptor Promoters beobachtet werden konnte. Diese synergistische Aktivierung des Promoters durch ERα konnte nur in Kombination mit NF-κB beobachtet werden, obwohl in Abwesenheit von NF-κB eine kleine Aktivierung des Promoters mit ERα 1–339 (Ergebnisse nicht dargestellt) gefunden werden konnte. In einem Kontroll-Experiment sind ERα, ERβ und die Löschungs-Mutanten mit einem Reporter-Konstrukt co-transfektiert worden, welches drei Kopien eines Consensus-ERE und einer TATA-Box enthalten hat, welche mit Luziferase verbunden worden ist, um ihre Fähigkeit festzustellen, die Transkription aus einem klassischen ERE zu aktivieren. Wie in der 5B dargestellt, stimulieren sowohl ERα als auch ERβ die Transkription von 3 × ERE-TATA-luc, obwohl die transkriptionale Aktivität von ERβ signifikant geringer war als diejenige von ERα, was ein Phänomen ist, welches bereits vorgängig beschrieben worden ist (28). Beide Löschungs-Mutanten, entweder mit fehlendem AF-1 oder fehlendem AF-2, stimulierten die Transkription aber sehr viel weniger effizient als das Wild-Tpyus ERα, darauf hinweisend, dass die Transaktivierungs-Bereiche fähig sind, dieses Promoter-Konstrukt zu synergisieren. Weiterhin ist gezeigt worden, dass ERα 1–339 bereits maximal in Abwesenheit des Liganden aktiviert worden ist, klar die Liganden-unabhängige Aktivität von AF-1 anzeigend. Wie erwartet, war die DNS-bindende fehlerhafte Mutante ERα C241/244A unfähig, dieses Reporter-Konstrukt zu aktivieren.
Da Unterschiede zwischen –ERα und ERβ in Bezug auf ihre Potenz der Aktivierung von 5-HT1A Rezeptor-Promoter beobachtet worden sind, sind chimäre Konstrukte mit ERα und ERβ eingesetzt worden, um weiterhin die Bereiche von ERα und ERβ zu bestimmen, die in diese Aktivierung involviert sind. Der Ersatz des A/B-Bereichs von ERβ mit dem A/B-Bereich von ERα (ERα/β) resultierte in einem chimären Rezeptor, der noch potenter war als das Wild-Typus ERα bei der Aktivierung des 5-HT1A Rezeptor Promoters (6A). Dennoch unterdrückte der Ersatz des A/B-Bereichs von ERα mit dem A/B-Bereich von ERβ (ERβ/α) fast vollständig die Fähigkeit des Rezeptors, in synergistischer Weise den Promoter zu aktivieren. Wiederum konnte diese synergistische Aktivierung des Promoters durch ERα und ERα/β nur in der Kombination mit NF-κB beobachtet werden, obwohl in Abwesenheit von NF-κB eine kleine Liganden-unabhängige Aktivierung des Promoters mit ERα/β gesehen werden konnte (Ergebnisse nicht dargestellt). In einem Kontroll-Experiment sind beide chimäre Konstrukte fähig gewesen, die Transkription aus 3 × ERE-TATA-luc so effizient wie das Wild-Typus ERα zu aktivieren, während manche Liganden-unabhängige Aktivität nur mit ERα/β beobachtet werden konnte (6B). Diese Ergebnisse führen dazu, dass die synergistische Aktivierung des 5-HT1A Rezeptor-Promoters durch ERα und NF-κB unabhängig von dem DNS-Bindungsbereich und dem A/B-Bereich von ERα ist, welcher AF-1 enthält. Zusammengefasst übt Östrogen wesentliche Wirkungen auf die Gemütsverfassung und den Seelenzustand aus. Die Fähigkeit von Östrogen, die serotonergischen Funktionen zu modulieren, erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass es eine Rolle in den Mechanismen spielt, die mit Depression und deren Behandlung verbunden sind. Ein zellularer Mechanismus für Östrogen, um die Gemütsverfassung zu beeinflussen, könnte durch die Regulierung durch Gene geschehen, die zu unterschiedlichen Niveaus des Serotonin-Systems gehören. Hier berichten wir, das Östrogen die Exprimierung des Serotonin 1A-Rezeptors über einen neuen Mechanismus auf regulieren kann, der die synergistische Aktivierung durch NF-κB mit dem Östrogen-Rezeptor umfasst. Das teilweise Anti-Östrogen 4-Hydroxytamoxifen hat dieselbe Wirkung wie ein Östrogen. Zusätzlich zeigte die Mutations-Analyse, dass sowohl die Transaktivierungs-Funktion von p65 und die Aktivierungs-Funktion 1 des Östrogen-Rezeptors α wesentlich sind für die synergistische Regulierung. Daher schlagen wir vor, das NF-κB Komplexe mit dem Östrogen-Rezeptor kooperieren, um Co-Faktoren in dem Komplex herzustellen und damit in synergistischer Weise den Serotonin-1A Rezeptor-Promoter durch nicht-klassische Östrogen-Antwort-Elemente durch einen Mechanismus zu aktivieren, der nicht die direkte Rezeptor-Bindung an die DNS involviert.
Beispiel 6
Materialien und Methoden
Spezielle Reagenzien. Aldosteron (N. V. Organon) ist in einer Konzentration von 0.1 Mikromol eingesetzt worden. Rekombinantes menschliches IL-1β ist von Genzyme gekauft worden und ist in einer Konzentration von 100 μ/ml eingesetzt worden.
Zell-Kultur. Menschliche Osteosarkom U-2 OS-Zellen sind aus der American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD) erhalten worden und sind in M505 kultiviert worden, einer 1:1 Mischung von Phenolrot-freiem DMEM und Ham's F-12 Medium (DF; Life Technologies Inc.), gepuffert mit Bicarbonat und versehen mit 10% FCS.
Plasmide.
PGL3-ELAM ist konstruiert worden durch Klonen des Teils des E-Selektin-Promoters in SacI und Xho I-Orten des PGL3-basic (Promega). Der E-Selektin Promoter-Bereich ist durch PCR aus menschlicher genomischer DNS erhalten worden, einsetzend die Oligonukleotid Primer 5'ctgcagatctgagtttctgacatcattgta-3' und 5'atcattcgaagaagtcagccaagaacagct-3'. Das PCR-Produkt ist in pCR^TM2.1 (TA-Cloning kit, Invitrogen) subkloniert worden, aufgeschlossen mit SacI und XhoI und nachfolgend in pGL3-basic angebunden worden.
Das Luziferase Reporter Plasmid 3·NF-κB-TK ist konstruiert worden durch Einführen von drei Wiederholungen des NF-κB Bindungsortes von dem ICAM Promoter (van de Stolpe, A., Caldenhoven, E., Stade, B. G., Koendermans, L., Raaijmakers, J. A. M., Johnson, J. P. & van der Saag, P. T. (1994) J. Biol. Chem. 269: 6185–6192) vor dem Herpes Simplex Virus Thymidin Kinase (HSV-TK) Promoter. Der TK Promoter ist in dem BgI II-Ort von pGL3-basic (Promega) geklont worden. Die dreifache Wiederholung von NF-κB Bindungsorten ist konstruiert worden durch Annealierung der Oligonukleotid Primer 5'catacggtaagcttggggtcatcgccctgccaccgccgcccgattgctttagcttggaaattccgga-3' und 5'gtatgccaaagcttctccggaatttccaagctccggaatttccaagctccggaatttccaagctaaa-3' gefolgt von der PCR-Verstärkung und dem Subklonieren in dem PCR^TM2.1 Vektor. Der Einsatz ist unter Einsatz von HindIII herausgeschnitten worden, mit Klenow DNS-Polymerase aufgefüllt und in den SmaI Ort von pGL3-tk-luc angebunden worden.
Der pNGV1-hMR Expressionsvektor enthält das Wild-Typus menschlicher MR unter Steuerung des SV40 Promoters und der PKCRE-ERα Expressionsvektor enthält das Wild-Tpyus menschliches ER unter Steuerung des SV40 Promoters.
Transiente Transfektionen.
Für transiente Transfektionen sind U-2 OS Zellen in sechs Probenplatten gesät worden. Nach zwei oder drei Tagen sind die Zellen mit Reporter, Expressionsvektoren und β-Galactosidase Kontroll-Vektor transfektiert worden. Zwei unterschiedliche Experimentier-Aufbauten sind eingesetzt worden. Um die synergistischen Effekte von MR mit IL-1β zu testen, sind Zellen mit 1 Mikrogramm pGL3-ELAM oder 3·NF-κB-TK, 1 Mikrogramm pNGV1-hMR oder 1 Mikrogramm PKCRE-ERα und 0.25 Mikrogramm von β-Galactosidase Kontroll-Plasmid transfektiert worden. Verschiedene Mengen von transfektierter DNS sind mit dem Expressionsvektor ohne Einsatz korrigiert worden. Transiente Transfektion ist unter Einsatz eines Lipofektin-Reagenz (Life Technologies) durchgeführt worden. Transiente Transfektionen mit Lipofektin sind gemäss den Vorschlägen des Herstellers mit einigen kleineren Änderungen durchgeführt worden. Je Mikrogramm von zu transfektierender DNS sind 5 Mikroliter Lipofektin eingesetzt worden und die Zellen sind mit der Transfektions-Mischung während 5 Stunden inkubiert wor den, wonach die Transfektions-Mischung abgesaugt und durch M505 + 10% DCC-FCS ersetzt worden ist. Die transfektierten Zellen sind über Nacht mit Testverbindungen inkubiert worden (beispielsweise verschiedenen. Kombinationen von IL-1β, Dexamethason und Aldosteron) vor der Zellenlyse. Messungen von Luziferase und β-Galactosidase Aktivität sind durchgeführt worden unter Einsatz des Luziferase Assay Systems (Promega) und Galacto-light plus (Tropix) entsprechend den Protokollen der Hersteller und gemessen mit dem Vektor 1420 Multilabel Counter, Wallac. Erfassung der β-Galactosidase Aktivität ist zur Kontrolle der Transfektions-Effizienz eingesetzt worden.
Druckschriften

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Claims

Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die fähig sind, eine synergistische Wirkung eines Steroidrezeptors und eines Rel Proteins auf regulatorische Elemente zu modulieren, umfassend die Schritte des: – Vorsehens einer Zelle umfassend ein regulatorisches Element, fähig, durch einen Steroidrezeptor und ein Rel Protein synergistisch aktiviert zu werden, wobei die besagte Zelle zusätzlich ausreichende Niveaus des besagten Steroidrezeptors und des besagten Rel Proteins oder funktionale Äquivalente von diesen umfasst, um die synergistische Aktivierung des regulatorischen Elements zu gestatten, – Kontaktierens der besagten Zelle mit mindestens einer Verbindung, – Bestimmens, ob die Aktivierung des regulatorischen Elements durch die Verbindung moduliert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der besagte Steroidrezeptor aus der Gruppe ausgewählt wird, die umfasst: den Östrogenrezeptor α, den Östrogenrezeptor β und den Mineralkortikoidrezeptor oder funktionale Äquivalente von diesen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Rel Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die umfasst: NF-κB1, Lyt-10, cRel, RelA und RelB oder funktionale Äquivalente von diesen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das regulatorische Element ein Promoter für das 5HT1-A Rezeptorgen ist oder von einem funktionalen Äquivalent von diesem.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das re gulatorische Element ein Promoter für das E-Selectin Gen ist oder von einem funktionalen Äquivalent von diesem.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die besagte Zelle mit einem Reportergen transfektiert ist, welches fähig ist, die Aktivierung des regulatorischen Elementes zu signalisieren.
Zelle, transfektiert mit einer Nukleinsäure, umfassend einen Promoter für das 5HT1-A Rezeptorgen oder von einem funktionalen Äquivalent von diesem und ein Reportergen, welches fähig ist, die Aktivierung des Promoters des 5HT1-A Rezeptorgens zu signalisieren, wobei die Zelle weiterhin umfasst: – Nukleinsäure, kodierend einen Steroidrezeptor, der fähig ist, in funktionaler Weise den besagten Steroidrezeptor oder ein funktionales Äquivalent von diesem in dieser Zelle zu exprimieren, und auch umfassend – Nukleinsäure, kodierend ein Rel Protein, oder ein funktionales Äquivalent von dieser, fähig, in funktionaler Weise das besagte Rel Protein in dieser Zelle zu exprimieren.
Zelle nach Anspruch 7, wobei der besagte Steroidrezeptor aus der Gruppe ausgewählt ist, die umfasst: den Östrogenrezeptor α, den Östrogenrezeptor β und/oder den Mineralkortikoidrezeptor oder funktionale Äquivalente von diesen.
Zelle nach Anspruch 7 oder 8, wobei das besagte Rel Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die umfasst: NF-κB1, Lyt-10, cRel, RelA und RelB oder funktionale Äquivalente von diesen.
Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die Nukleinsäure, die einen Promoter für das 5HT1-A Rezeptorgen umfasst und/oder die Nukleinsäure, die einen Steroidrezeptor kodiert, und/oder die Nukleinsäure, die ein Rel Protein kodiert, oder funktionale Äquivalente von diesen, in die Zelle transfektiert werden.
Zelle, die mit Nukleinsäure transfektiert ist, umfassend einen Promoter für das E-Selectin Gen oder einem funktionalen Äquivalent von diesem, und – Nukleinsäure, kodierend einen Steroidrezeptor, der fähig ist, in funktionaler Weise den besagten Steroidrezeptor oder ein funktionales Äquivalent von diesem in dieser Zelle zu exprimieren, wobei die besagte Zelle weiterhin umfasst – Nukleinsäure, kodierend ein Rel Protein oder ein funktionales Äquivalent von dieser, fähig, in funktionaler Weise das besagte Rel Protein in dieser Zelle zu exprimieren.
Zelle nach Anspruch 11, wobei der der besagte Steroidrezeptor aus der Gruppe ausgewählt ist, die umfasst: den Östrogenrezeptor α, den Östrogenrezeptor β und/oder den Mineralkortikoidrezeptor oder funktionale Äquivalente von diesen.
Zelle nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Rel Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die umfasst: NF-κB1, Lyt-10, cRel, RelA und RelB oder funktionale Äquivalente von diesen.
Zelle nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die besagte Zelle mit einem Reportergen transfektiert ist, welches fähig ist, die Aktivierung des Promoters für das E-Selectin Gen zu signalisieren.
Zelle nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei die Nukleinsäure, die einen Promoter für das E-Selectin Gen umfasst, und die Nukleinsäure, die einen Steroidrezeptor kodiert, und die Nukleinsäure, die ein Rel Protein kodiert, oder funktionale Äquivalente von diesen, in die Zelle transfektiert werden.
Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 15 zur Identifikation von Verbindungen, die das Niveau des Serotoninrezeptors im Gehirn modulieren.
Zelle, die transfektiert ist mit Nukleinsäure, umfassend einen Promoter für das E-Selectin Gen oder eines funktionalen Äquivalentes, und Nukleinsäure, die einen Steroidrezeptor kodiert, fähig, in funktionaler Weise den besagten Steroidrezeptor oder eines funktionalen Äquivalentes davon in der Zelle zu exprimieren, wobei die Zelle weiterhin umfasst: – Nukleinsäure, die ein Rel Protein kodiert, oder ein funktionales Äquivalent davon, fähig, in funktionaler Weise das besagte Rel Protein in der besagten Zelle zu exprimieren, wobei das besagte Rel Protein durch Stimulieren der besagten Zelle mit pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL-1β aktiviert ist.