CN107075575B - 用于生物实体中的构象的高通量分析的系统和方法 - Google Patents

用于生物实体中的构象的高通量分析的系统和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了利用表面选择性非线性光学检测技术对生物分子或其他生物实体中的构象变化进行高通量分析的方法、装置和系统。

Description

用于生物实体中的构象的高通量分析的系统和方法
交叉引用
本申请要求提交于2014年6月30日的美国临时申请第62/019,285号的权益，该申请通过引用而并入于此。
关于联邦资助研究的声明
本发明是基于美国国家科学基金会第IIP-1256619号拨款，在联邦政府的支持下而进行的。
背景技术
过去二十年里，高通量实验的出现已经改变了进行生命科学和生物医学研究的方式。诸如基因工程、有机化学、材料科学、微加工和微电子等领域的技术融合已经带来了新的技术平台(例如，微阵列技术、微流体装置和系统、基于微珠的组合化合物库和测定系统，以及基于微板的测定系统)以应对从用于新药研发的化合物库高通量筛选到全基因组快速测序的范围内的各种应用。
用于新药研发的高通量筛选系统的实例包括用于运行连续流测定的基于微流体的平台技术(例如，用于鉴别受体激动剂的受体-配体结合测定和基于细胞的测定)，和其中以微孔板形式运行结合反应、酶促反应或基于细胞的测定的基于微板的系统，以及提供自动化样品制备、测定和检测步骤的自动化液体分配站和板装卸机器人。大多数用于新药研发的现有高通量平台技术利用基于荧光的光学检测。虽然荧光技术提供了非常高的检测灵敏度，并且总体上比二十年前在生物测定方法中占主导地位的、更传统的基于放射性同位素的手段环保得多，但采用荧光尚存在很多缺点。例子包括：(i)需要复杂的光源、检测器和光学系统，上述各项的性能通常对偏差或仪器漂移敏感；和(ii)光漂白现象，其可在经过反复测量的样品中导致信号随时间推移而变差。
现有高通量筛选技术的另一更严重局限性来自于对以下情况的日益增多的认知：很多从生物学角度看是有吸引力的靶标的潜在治疗靶标(例如，潜在的癌症治疗靶标)从化学观点来看是困难的(“无法用药”)，原因在于它们通常不适用于常规新药研发途径。这些蛋白质靶标在与其他蛋白质相互作用(即，通过蛋白质-蛋白质相互作用)时通常具有相对较大的接触面积或者是由于其拥有以极高亲和力与蛋白质的活性位点结合的配体这一事实。在任一情况下，寻找阻断该相互作用(即，干扰和/或隐藏蛋白质-蛋白质相互作用情况中的大接触面积，或者取代高亲和力配体)的常规小分子或生物(蛋白质)候选药物非常困难。针对此类“无法用药”靶标的变构调节剂提供了有吸引力的治疗解决方案。根据定义，变构分子与并非蛋白活性位点的位点相结合，从而改变具有伴随功能效应(例如，受体的活化)的蛋白质构象。靶蛋白质的变构调节具有无需依赖于对天然配体与蛋白质的结合进行抑制或与之竞争(这可能导致非预期的临床副作用)的额外益处。然而，很难利用目前可用的常规技术来鉴别变构调节剂。例如，从X射线晶体学或NMR方法获得的结构信息常常由于低通量、低灵敏度、所采用的非生理条件、适用于该技术的蛋白质大小以及许多其他因素而对于新药研发用途的价值有限。因此，所需要的是用于筛选候选化合物组群以便快速鉴别出例如能够对靶蛋白质的构象进行变构调节的药剂的高通量技术。
如下文进行更详尽地描述，二次谐波发生(second harmonic generation，SHG)是一种非线性光学过程，其可被配置成表面选择性检测技术，实现对蛋白质和其他生物靶标中的构象变化的检测(如前文所述，例如在美国专利第6,953,694号和美国专利申请第13/838,419号中有述)。为了进行基于SHG的高通量形式构象变化检测，可能有利的是针对用于递送激发光的光学系统来设计新颖机制以快速、精确且可互换地定位基底(包含所要分析的生物靶标)，该机制同时确保激发光与基底表面之间保持有效的光耦合。用于生物样品的高通量光学探查的一种优选形式为玻璃底微孔板。本文公开的系统和方法提供了以与高通量分析系统要求相一致的方式通过全内反射，将SHG和其他非线性光学技术所需高强度激发光结合到基底(例如，玻璃底微孔板中的玻璃基底)的机制。
发明内容
本文公开了用于检测生物实体与测试实体之间相互作用的方法，包括：(a)使至少4种生物实体中的每一种与至少一种测试实体相接触；(b)利用表面选择性光学技术，以一个或多个激发光束照射所述至少4种生物实体中的每一种；以及(c)测定在所述至少4种生物实体中的每一种中是否通过与所述至少一种测试实体相接触而诱导出构象变化；其中以每小时至少10种测试实体的平均速率进行构象变化测定。在一些实施方式中，以每小时至少100种测试实体的平均速率进行构象变化测定。
在一些实施方式中，所述至少4种生物实体相同。在一些实施方式中，所述至少4种生物实体不相同。在一些实施方式中，所述生物实体选自细胞、蛋白质、肽、受体、酶、抗体、DNA、RNA、寡核苷酸、小分子和碳水化合物，或者其任意组合。在一些实施方式中，所述生物实体是药物靶标或其部分。
在一些实施方式中，所述至少4种生物实体中的每一种位于基底上的不同非连续区域中。在一些实施方式中，每个非连续区域包含基底表面上多达约100mm2的面积。在一些实施方式中，每个非连续区域包含支撑磷脂双层膜(supported lipid bilayer)。在一些实施方式中，所述生物实体拴系到或嵌入在所述支撑磷脂双层膜内。
在一些实施方式中，所述至少一种测试实体选自细胞、蛋白质、肽、受体、酶、抗体、DNA、RNA、寡核苷酸、小分子和碳水化合物，或者其任意组合。在一些实施方式中，所述测试实体是候选药物或其部分。
在一些实施方式中，该接触步骤发生在溶液中，并且包括利用预编程流体分配单元来分配所述至少一种测试实体。在一些实施方式中，该接触步骤包括使所述至少4种生物实体中的每一种与不同的测试实体相接触。在一些实施方式中，该接触步骤包括使所述至少4种生物实体中的每一种依序与至少100种不同测试实体相接触。在一些实施方式中，该接触步骤包括使所述至少4种生物实体中的每一种依序与至少10000种不同测试实体相接触。
在一些实施方式中，由一个或多个激光器提供所述一个或多个激发光束。在一些实施方式中，表面选择性光学检测技术包括利用至少一个激发光束从平面基底表面的全内反射。
在一些实施方式中，该测定步骤还包括分析非线性光信号。在一些实施方式中，所述非线性光信号选自二次谐波光、和频光以及差频光。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括相对于所述一个或多个激发光束的一个或多个外部源来移动所述基底。在一些实施方式中，每个非连续区域光耦合到与所述基底的底表面相集成的入口棱镜和不同的出口棱镜。在一些实施方式中，该照射步骤包括将入射激发光引导至定位成邻近所述非连续区域中的每一个但不位于其正下方的入口棱镜上。在一些实施方式中，所述方法还包括使用定位成邻近所述非连续区域中的每一个但不位于其正下方的出口棱镜收集当照射时在所述非连续区域中的每一个处生成的非线性光信号，并将所述非线性光信号引导至检测器。在一些实施方式中，所述方法进一步包括在所述接触步骤之后多次重复该照射步骤和测定步骤，从而确定作为时间函数的所述至少4种生物实体中的每一个中的构象变化。
本文还公开了装置，包括；(a)基底，所述基底包括：(i)形成于所述基底的表面上的非连续区域的M×N阵列，其中M是所述阵列中非连续区域的行数而N是非连续区域的列数，并且每个非连续区域被配置用于容纳生物实体，以及(ii)与所述基底相集成并且光耦合到所述非连续区域的棱镜的R×S阵列，其中R是所述阵列中棱镜的行数而S是棱镜的列数；其中R＝M+2并且S＝N，或者R＝M并且S＝N+2。
在一些实施方式中，所述非连续区域中的每一个光耦合到至少一个输入棱镜和至少一个输出棱镜，并且其中所述输入棱镜和所述输出棱镜在空间位置上不同。在一些实施方式中，M＝8并且N＝12。在一些实施方式中，M＝16并且N＝24。在一些实施方式中，M＝32并且N＝48。在一些实施方式中，M大于4并且N大于4。在一些实施方式中，每个非连续区域包含支撑磷脂双层膜，或者被配置用于促进支撑磷脂双层膜的形成。在一些实施方式中，所述装置进一步包括结合到所述基底的顶表面的孔形成组件，以便将每个非连续区域隔离在单独的孔中。在一些实施方式中，所述非连续区域中的每一个包括多达约100mm2的面积。在一些实施方式中，每个非连续区域或孔位于与所述基底相集成的棱镜阵列的单个棱镜的正上方。在一些实施方式中，所述基底包含玻璃、熔融石英或塑料。
本文公开了用于从塑料制造棱镜阵列部件的注射成型工艺，该工艺包括在模具脱除步骤期间利用两个或更多个脱模器件来向所述棱镜阵列部件施加均匀压力。
在一些实施方式中，所述塑料选自环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)和丙烯酸。在一些实施方式中，所述两个或更多个脱模器件仅在其中所述部件的光学性能不重要的区域中碰触所述棱镜阵列部件。在一些实施方式中，所述两个或更多个脱模器件包括m×n个刀刃状脱模器特征的阵列。在一些实施方式中，m大于2并且小于20。在一些实施方式中，n大于2并且小于20。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利及专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附的权利要求书中予以具体阐述。通过参考以下对其中利用了本发明原理的说明性实施方式加以阐述的详细描述以及附图，将获得对本发明的特征和优点的更好的理解，附
图中：
图1A提供了荧光(吸收过程)的能级图的示意图。
图1B提供了二次谐波发生(双光子散射过程)的能级图的示意图。
图2提供了由配体的结合诱导的蛋白质中的构象变化(用非线性-活性标签标明)的示意图，以及该构象变化对非线性-活性标签相对于该蛋白质所附接到的光学界面的距离和/或取向的影响。
图3A-图3D示出了数据，其说明利用二次谐波光发生对在α-突触核蛋白中的精胺诱导或亚精胺诱导的构象变化的检测。图3A示出了当α-突触核蛋白暴露于5mM精胺时的实时SHG响应。箭头表示精胺添加。SHG强度的变化以即将注射之前的值进行归一化。图3B示出了通过SHG测量(SHG浓度变化被量化为移位百分比)的针对在α-突触核蛋白中的精胺诱导构象变化的剂量响应曲线(按对数标度绘图)。图3C示出了当α-突触核蛋白暴露于3mM亚精胺时的实时SHG响应。箭头表示亚精胺添加。SHG强度的变化以即将注射之前的值进行归一化。图3D示出了通过SHG测量(SHG浓度变化被量化为移位百分比)的针对在α-突触核蛋白中的亚精胺诱导构象变化的剂量响应曲线(按对数标度进行绘图)。误差线＝SEM。N＝3。
图4图示了用于基于非线性光学检测来测定生物分子或其他生物实体中的构象变化的高通量分析系统的系统架构的一个示例。
图5示出了用于利用非线性光学检测对生物分子中的构象变化进行分析的光学设施的一个示例的示意图。
图6示出了用于利用非线性光学检测对生物分子中的构象变化进行分析的光学设施的照片。
图7示出了描绘利用棱镜来以适当的入射角引导激发光从而使激发光在基底的顶表面经历全内反射的示意图。向棱镜右侧的两条虚线指示出反射的激发光的光路以及当非线性-活性物种拴系到基底表面时在该表面生成的非线性光信号。基底可选地连接到X-Y平移台上的的致动器以便在测量之间重新定位。棱镜的顶表面与基底的底表面之间的曲线指示出用于确保棱镜与基底之间的高光耦合效率的折射率匹配液薄层(未按比例绘制)的存在。
图8A-图8C示出了利用折射率匹配液的连续再循环流动来提供棱镜(在本示例中附接到光学仪器)与基底(在本示例中配置成微孔板的透明底部)之间的高光耦合效率的系统的一个示例性设计概念的不同视图。基底(微孔板)可相对于棱镜自由平移，而同时由指示的流体通道提供的折射率匹配液的连续流动确保激发光与基底的良好光耦合。图8A：顶-前轴侧视图。图8B：顶-后轴侧视图。图8C：底-前轴侧视图。
图9示出了描绘利用附接到或邻近于透明基底(在本示例中配置成微孔板形式)的下表面的折射率匹配弹性体材料层来确保棱镜与基底的上表面之间的高光耦合效率的示意图。在该方法的一些实施方式中，棱镜的上表面略微圆拱，以便在使微孔板与棱镜相接触时集中压力，从而减少或消除棱镜与弹性体材料之间的气隙形成。
图10A-图10B图示了具有用于提供激发光对基底的顶表面的良好光耦合的集成式棱镜阵列的微孔板。在该方法中，由附接到基底下面的棱镜阵列替代图4、图5、图7和图9的示意图中指示的棱镜。图10A：顶轴侧视图。图10B：底轴侧视图。
图10C-图10D示出了图10A-图10B中所示的微孔板装置的分解图。图10C：顶轴侧视图。图10D：底轴侧视图。
图11图示了利用图10A-图10B中图示的设计概念经由全内反射用于将激发光耦合到基底表面的入射光路和出射光路。
图12示出了图10A-图10B中图示的棱镜阵列设计概念的原型的照片。
图13A-图13C示出了根据本公开内容的棱镜阵列设计的一个示例。图13A：顶视图。图13B：正视图。图13C：右视图。
图14示出了利用最早的模具设计和最早的注射成型工艺制造的棱镜阵列的交叉偏振器图像。注意观察到的高水平的应力诱导双折射。
图15示出了在并入图13A-图13C和图14中图示的棱镜阵列设计的微孔板装置中的不同位置测量的SHG信号强度的数据。SHG信号强度作为孔列数的函数针对不同的行(不同的迹线)而测得。
图16A-图16C示出了根据本公开内容的改进的棱镜阵列设计的示例。图16A：顶视图。图16B：正视图。图16C右视图。
图17示出了利用改进的模具设计和优化的注射成型工艺制造的棱镜阵列的交叉偏振器图像。注意与图14中所示相比，观察到的应力诱导双折射水平显著降低。
图18示出了在并入图16A-图16C和图17中图示的棱镜阵列设计的微孔板装置中的不同位置测量的SHG信号强度的数据。SHG信号强度作为孔列数的函数针对不同的行(不同的迹线)而测得。注意与图15中所示相比，SHG信号强度水平在整个微孔板上更高并且更均匀。
图19示出了用于制造图16A-图16C中图示的棱镜阵列部件的模具工具的剖开形式。
图20图示了模具工具中采用的、用于在从模具中脱除棱镜阵列部件期间在其上提供均匀压力的刀刃状脱模特征。
图21图示了经配置用于控制本文公开的系统的操作的计算机系统。
图22是图示可结合本发明示例实施方式使用的计算机系统的第一示例架构的框图。
图23是示出具有多个计算机系统、多个蜂窝电话和个人数字助理以及网络附加存储(NAS)的网络的一个实施方式的视图。
图24是根据示例实施方式，利用共享虚拟地址存储器空间的多处理器计算机系统的框图。
具体实施方式
本文公开的系统和方法涉及对生物实体中的构象的高通量分析。此外，所描述的系统和方法同样适用于取向变化或构象变化的高通量分析。在本公开内容的一些方面，描述了响应于使生物实体与一种或多种测试实体相接触而确定该生物实体的取向、构象或者取向变化或构象变化的系统和方法。如本文所用，确定取向、构象或其变化可涉及与非线性-活性标签或标记物的平均取向相关和/或与之成比例的非线性光信号测量。如本文所使用，“高通量”是指针对可选地与一种或多种测试实体相接触的大量生物实体进行快速构象分析的能力，或者是指针对可选地与大量测试实体相接触的一种或多种生物实体进行快速构象分析的能力，或者这两种模式的任意组合。总体而言，所公开的系统和方法依靠采用二次谐波发生(SHG)或相关非线性光学技术来检测取向、构象或构象变化，例如先前在美国专利第6,953,694号和美国专利申请第13/838,491号中所描述。
采用二次谐波发生的构象检测
与更广泛使用的基于荧光的技术相比，二次谐波发生是一种非线性光学过程，其中同一激发波长或频率的两个光子与非线性材料相互作用并作为具有激发光子的两倍能量(即，其两倍的频率和一半的波长)的单个光子进行重新发射(图1)。二次谐波发生仅发生在缺乏反演对称性的非线性材料中(即，非中心对称材料中)，并且需要高强度激发光源。这是和频发生的一种特殊情况，并且与例如差频发生等其他非线性光学现象相关。
二次谐波发生和其他非线性光学技术可因其对非线性-活性物种的相关性而配置成表面选择性检测技术。例如，非线性-活性物种向表面的拴系可以缓慢形成在分子可在溶液中自由经历旋转扩散的情况下缺少的总体取向度。常用于对非线性-活性物种在界面处的取向相关性建模的公式为：
χ(2)＝Ns<α(2)>
其中χ(2)是非线性极化率，Ns是界面处每单位面积上非线性-活性分子的总数，而<α(2)>是这些分子的非线性超极化率(α(2))的平均取向。SHG的强度与非线性极化率的平方成比例，并且因此与界面处定向的非线性-活性物种的数目和其平均取向的变化二者均相关。
可以通过使用全内反射作为向非线性-活性物种固定于其上的光学界面递送激发光的模式来额外使得二次谐波发生和其他非线性光学技术成为表面选择性的。入射激发光的全内反射在界面处创造出“迅衰波”，其可以用于选择性地仅激发靠近表面(即，迅衰波的空间衰减距离内，其通常为几十纳米级别)的非线性-活性标签。全内反射还可以用于以表面选择性的方式来激发荧光，例如，激发附接到光学界面的荧光供体，该荧光供体继而经由荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)机制将能量转移到适宜的受体分子中。在本公开内容中，借助于激发光的全内反射生成的迅衰波优选用于激发非线性-活性标签或分子。对非线性活性物种的激发效率将会强烈依赖于其平均取向和其与界面的接近程度中的二者。
可以利用SHG和其他非线性光学技术的这种表面选择性质来检测固定于界面的生物分子中的构象变化。例如，由于配体的结合而造成的受体分子中的构象变化可采用非线性-活性标签或部分来检测，其中所述标签附接到或关联于所述受体，以便使构象变化引起标签相对于界面的取向或距离的变化(图2)，并从而导致非线性光信号的物理性质的变化。直到最近，由于相对少数的生物样品本身为非线性活性，因此对表面选择性非线性光学技术的使用还主要局限于物理和化学应用上。最近，已经介绍了对二次谐波活性标签(“SHG标签”)的使用，从而事实上使得几乎任何所提供的分子或粒子均具有高非线性活性。这方面的第一个例子由使用噁唑染料标记蛋白细胞色素c并利用二次谐波发生来检测空气-水界面处的蛋白缀合物所证实[Salafsky,J.,“`SHG-labels'for Detection of Molecules bySecond Harmonic Generation”,Chem.Phys.Lett.342(5-6):485-491(2001)]。在图3中示出了表示对α-突触核蛋白中的精胺诱导的或亚精胺诱导的构象变化进行检测的SHG数据的示例。
表面选择性非线性光学技术也为相干技术，这意味着基本光束和非线性光束具有以明确定义的空间关系和相位关系通过空间传播的波前。针对分析生物分子或其他生物实体的构象而采用表面选择性非线性光学检测技术相比于其他光学方法具有多种固有优势，包括：i)非线性信号对于非线性-活性物种的取向和/或一个或多个偶极矩的敏感且直接的相关性，赋予其对构象变化的敏感性；(ii)比基于荧光的检测更高的信噪比(较低的背景)，原因在于非线性光信号仅在创造出非中心对称系统的表面处生成，即，该技术本身具有非常窄的“景深”；(iii)作为窄“景深”的结果，该技术在必须在有覆盖溶液的情况下进行测量时(例如，在结合过程可能被分离或冲洗步骤所消除或扰乱的情况下)有用。该技术的这一方面对于进行需要大块物体存在的平衡结合测量或者在限定时间段内进行测量的动力学测量可能特别有用；(iv)该技术表现出比荧光中发生的光漂白和加热效应更低的光漂白和加热效应，原因在于对于给定分子，双光子吸收截面通常远小于单光子吸收截面，并且SHG(以及和频发生或差频发生)涉及散射而非吸收；(v)需要最少的收集光学器件并且预期信噪比较高，原因在于基本光束和非线性光束(例如，二次谐波光)相对于界面具有明确定义的传入和传出方向。这与基于荧光的检测相比特别有利，因为荧光发射是各向同性的，并且对于由焦平面外荧光物产生的所检测信号可能还存在较大的荧光背景成分。
高通量系统和方法
本文公开了基于利用二次谐波发生或相关非线性光学检测技术来实现对生物实体中的构象的高通量分析的系统和方法。如本文所使用，“高通量”是与利用诸如NMR或X射线晶体学等传统技术进行的结构测量相比的相对术语。如下文更详细描述，本文公开的基于SHG的方法和系统能够以至少比常规技术快一个数量级的速率进行结构测定。
在一个方面，本公开内容提供了一种用于一种或多种生物实体中的构象或构象变化的高通量检测的方法，该方法包括(i)用非线性-活性标签或标记物来标记一个或多个靶生物实体，例如，蛋白质分子；(ii)将所述一个或多个经标记的靶生物实体固定在平面基底表面的一个或多个非连续区域，其中所述基底表面进一步包括光学界面；(iii)通过改变基底相对于外部光源的位置，依次将每个非连续区域暴露于激发光下；(iv)在每个非连续区域暴露于激发光时收集从该非连续区域发射的非线性光信号；以及(v)处理所述非线性光信号以确定所述一种或多种生物实体中的每一种的取向、构象或构象变化。在另一方面，所述方法进一步包括(vi)继第一次暴露于激发光之后，使所述一种或多种生物实体中的每一种与一种或多种测试实体相接触；(vii)随后将每个非连续区域一次或多次重新暴露于激发光；(viii)在每个非连续区域暴露于激发光时收集来自该非连续区域的非线性光信号；以及(ix)处理所述非线性光信号以确定在所述一种或多种生物实体中是否由于与所述一种或多种测试实体相接触而发生取向或构象变化。在所述方法的一个方面，在所述一种或多种生物实体与一种或多种测试实体相接触之后仅检测一次非线性光信号，并继而将其用于确定是否发生构象变化。在另一方面，在所述一种或多种生物实体与一种或多种测试实体相接触之后以限定的时间间隔反复地收集非线性光信号(即，动力学模式)，并继而将其用于确定所述一种或多种生物实体中的构象变化的动力学。在所述方法的一个优选方面，基底的每个非连续区域包括支承的脂双层结构，并且生物实体通过拴系到或嵌入在脂双层内而固定于每个非连续区域中。在所述方法的另一优选方面，通过全内反射将激发光递送到基底表面(即，光学界面)，并且沿着与反射的激发光相同的光轴收集从所述基底表面的非连续区域中发射的非线性光信号。
为了实现使用非线性光学检测对构象或构象变化进行高通量分析，本文所述系统需要若干组件(图4中的示意图)，其包括(i)至少一个适宜的激发光源，以及用于将所述至少一束激发光束递送到光学界面的光学器件；(ii)可互换基底，其包括光学界面，一种或多种生物实体在所述基底的非连续区域中拴系或固定到该光学界面；(iii)高精度平移台，用于将所述基底相对于所述至少一个激发光源进行定位；以及(iv)光学器件，用于收集由于用激发光照射所述基底的每个所述非连续区域而生成的非线性光信号并将所述非线性信号递送到检测器；以及(v)处理器，用于分析从所述检测器接收的非线性光信号数据并确定固定在所述基底上的所述一种或多种生物实体的构象或构象变化。在一些方面，本文公开的系统和方法还包括使用(vi)可编程流体分配系统，用于向所述基底的所述非连续区域中的每一个递送测试实体；以及(vii)使用板装卸机器人，用于在与光学系统的界面处自动化定位和更换基底。
本文公开的方法和系统可被配置用于对于多种测试实体相接触的单个生物实体的分析，或者用于与单个测试实体相接触的多个生物实体的分析，或者其任意组合。当使一种或多种生物实体与多种测试实体相接触时，可以依次进行接触步骤，即，通过将固定的生物实体在指定时间段内暴露于单个测试实体，随后是可选的冲洗步骤以去除测试实体溶液并在将固定的生物实体引入到下一测试实体之前使所述固定的生物实体再生，或者接触步骤可以并行进行，即，通过让多个非连续区域包含相同的固定生物实体，并使所述多个非连续区域中的每一个中的生物实体暴露于不同的测试实体。本文公开的方法和系统可被配置用于进行针对至少1种生物实体、至少2种生物实体、至少4种生物实体、至少6种生物实体、至少8种生物实体、至少10种生物实体、至少15种生物实体或至少20种生物实体中的构象变化的分析。在一些方面，本文公开的方法和系统可被配置用于进行针对至多20种生物实体、至多15种生物实体、至多10种生物实体、至多8种生物实体、至多6种生物实体、至多4种生物实体、至多2种生物实体或至多1种生物实体中的构象变化的分析。类似地，本文公开的方法和系统可被配置用于在所述一种或多种生物实体暴露于至少1种测试实体、至少5种测试实体、至少10种测试实体、至少50种测试实体、至少100种测试实体、至少500种测试实体、至少1000种测试实体、至少5000种测试实体、至少10000种测试实体或至少100000种测试实体时进行对构象变化的分析。在一些方面，本文公开的方法和系统可被配置用于在所述一种或多种生物实体暴露于至多100000种测试实体、至多10000种测试实体、至多5000种测试实体、至多1000测试实体、至多500种测试实体、至多100种测试实体、至多50种测试实体、至多10种测试实体、至多5种测试实体或至多1种测试实体时进行对构象变化的分析。
生物实体和测试实体
如本文所使用，词组“生物实体”包括但不限于细胞、蛋白质、肽、受体、酶、抗体、DNA、RNA、生物分子、寡核苷酸、溶剂、小分子、合成分子、碳水化合物，或者其任意组合。类似地，词组“测试实体”也包括但不限于细胞、蛋白质、肽、受体、酶、抗体、DNA、RNA、生物分子、寡核苷酸、溶剂、小分子、合成分子、碳水化合物，或者其任意组合。在一些方面，生物实体可包括药物靶标或其部分，而测试实体可包括候选药物或其部分。
非线性-活性标签和标记技术
如上所述，大多数生物分子并非本来就是非线性-活性的。例外包括胶原蛋白，这是一种存在于大多数结构或承重组织中的结构蛋白质。SHG显微术已在例如角膜等含胶原蛋白结构的研究中得到广泛应用。其他生物分子或实体则必须通过引入诸如标记物或标签等非线性-活性部分才成为非线性-活性的。在本发明中采用的标签是指可以共价或非共价结合到分子、粒子或相(例如，脂双层)以便使得由此产生的系统更具非线性光学活性的非线性-活性部分、标记物、分子或粒子。在分子、粒子或相(例如，脂双层)不具非线性-活性的情况下采用标签以使得系统具有非线性-活性，或者在已经具有非线性-活性的系统中采用标签以向该系统中增加额外的表征参数。可以向分子、粒子或其他生物实体预附接外源性标签，并且在用于本文所述方法之前，任何未结合或未反应标签从经标记实体分离出来。在本文公开的方法的特定方面，在将靶分子或生物实体固定于基底表面的非连续区域中之前，在体外将非线性-活性部分附接到靶分子或生物实体。用非线性-活性标签标记生物分子或其他生物实体允许在经标记生物分子或实体与另一分子或实体(即，测试实体)之间的相互作用导致该生物分子或实体的取向或构象变化的情况下，利用表面选择性非线性光学技术以直接光学手段检测该相互作用。
在本文所述方法和系统的备选方面，采用至少两种可区分的非线性-活性标签。继而将会选择附接的两种或更多种可区分的标签的取向以便有助于发出的相干非线性光束的明确定义的方向。所述两种或更多种可区分的标签能够在如下的测定中使用，在该测定中，采用了相对于光学界面以一个或多个偏振方向入射的、处于一个或多个频率的多个基本光束，得到至少两个非线性光束的发射。
非线性-活性标记物或标签的示例包括但不限于表1中所列的化合物及其衍生物。
表1.非线性-活性标记物的示例
Figure GDA0003152374590000151
Figure GDA0003152374590000161
在评价某一物质是否具有非线性-活性时，以下特性可以表明出非线性活性的潜力：大偶极矩差(分子的基态与激发态之间的偶极矩差)、荧光中的大斯托克斯位移，或者芳族或共轭结合特性。在进一步评价该物质时，实验者可以利用本领域技术人员已知的简单技术来确认非线性活性，例如，通过检测来自非线性-活性物种所分布于的空气-水界面的SHG检测来进行确认。一旦已针对所进行的实验选择合适的非线性-活性物种，如果需要，可以将该物质缀合到生物分子或实体用于本文公开的表面选择性非线性光学方法。
以下参考文献和其中的参考资料描述了用于由合成染料和许多其他分子产生经标记的生物实体的可行技术：Greg T.Hermanson,Bioconjugate Techniques,AcademicPress,New York,1996。
在所公开的方法和系统的一个特定方面，对金属纳米颗粒和组件进行改性，以获得生物非线性-活性标记物。以下参考文献描述了金属纳米颗粒和组件的改性：J.P.Novak和D.L.Feldheim,"Assembly of Phenylacetylene-Bridged Silver and GoldNanoparticle Arrays",J.Am.Chem.Soc.122:3979-3980(2000)；J.P.Novak等"NonlinearOptical Properties of Molecularly Bridged Gold Nanoparticle Arrays",J.Am.Chem.Soc.122:12029-12030(2000)；Vance,F.W.,Lemon,B.I.和Hupp,J.T.,“Enormous Hyper-Rayleigh Scattering from Nanocrystalline Gold ParticleSuspensions",J.Phys.Chem.B 102:10091-93(1999)。
在本文公开的方法和系统的另一方面，还可以通过向分子信标也就是已被改性以并入非线性-活性标签(或其调节剂)而非荧光团或猝灭剂的分子信标探针引入非线性类似物来操控系统的非线性活性。分子信标的这些非线性光学相似物在本文中称为分子信标类似物(MB类似物或MBA)。要在所描述的方法和系统中采用的MB类似物可以根据本领域普通技术人员已知的规程予以合成。
所检测的生物相互作用类型
本文公开的方法和系统提供了根据生物实体、测试实体以及所采用的非线性活性标记技术的选择，对生物实体之间或者生物实体与测试实体之间的多种相互作用的检测。在一个方面，本公开内容提供了对结合事件的定性检测，所述结合事件例如为如受体中诱导的所产生的构象变化所指出的、配体到受体的结合。在另一方面，本公开内容提供了通过使用不同浓度的配体分子进行重复测量并使用所观察到的最大构象变化中的百分比变化生成剂量响应曲线对结合事件(例如，配体到受体的结合)的定量检测。类似地，本公开内容的其他方面可以提供用于对酶-抑制剂相互作用、抗体-抗原相互作用、生物大分子复合物的形成或者受体与变构调节剂的相互作用进行定性或定量测量的方法。
在其他特定实施方式中，可以根据本文公开的方法，将MB类似物用作杂交探针，该杂交探针能够检测互补核酸靶标的存在，而不必像在溶液-相杂交测定中那样从过量探针中分离出探针-靶标杂交体，并且无需标记靶标寡核苷酸。MB类似物探针还可以用于对活细胞内RNA的检测，用于监测从生物反应器提取的样品等分试样中的特定核酸的合成，以及用于构建自报告寡核苷酸阵列。它们可以用于进行均匀一孔测定(one-well assay)，用于鉴别DNA中的单核苷酸变异，以及用于检测固定到用于界面检测的表面的病原体或细胞。
通过当前公开的方法，可以将生物实体之间或者生物实体与测试实体之间的相互作用(例如，结合反应、构象变化等)关联到以下可测量非线性信号参数：(i)非线性光的强度；(ii)非线性光的波长或光谱；(iii)非线性光的偏振；(iv)(i)、(ii)或(iii)中的时间进程，以及/或者vi)(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的一种或多种组合。
激光光源和激发光学系统
图5图示了本文公开的方法和系统的一个方面，其中通过反射来自包括样品界面(或光学界面)的基底表面上的入射基本激发光来生成二次谐波光。图6示出了适宜的光学设施的一个示例的照片。激光器提供在样品界面处生成二次谐波光所必需的基本光。这通常将会是皮秒或飞秒激光器，其为波长可调式或不可调式，并且可从市场购得(例如，Ti:蓝宝石分秒激光器或光纤激光器系统)。处于基频(w)的光射出激光器，并且例如使用适合于该光的频率和强度的半波片来选择其偏振(例如，可从Melles Griot,Oriel或NewportCorp.购得)。光束继而穿过被设计用于让基本光通过但阻断非线性光(例如，二次谐波光)的谐波分离器。该滤光器用于防止二次谐波光束向激光腔中的背反射——这可能对激光性能造成干扰。继而使用反射镜与透镜的组合，在光束从最终反射镜反射之前对该光束进行转向和塑形，所述最终反射镜经由棱镜引导光束在特定位置并以特定角度θ照射在基底表面上，使得其在该基底表面经历全内反射。如果需要，可以使用电流计控制镜扫描器、旋转多面镜扫描器、布拉格衍射仪、声光偏转器或本领域已知的其它手段来扫描光路中的反射镜中之一，以允许对反射镜位置的控制。包括光学界面和非线性-活性样品表面的基底可以安装在(计算机控制的)x-y平移台上，以选择基底表面上的特定位置用于二次谐波光束的生成。在当前描述的方法和系统的一些方面，期望扫描或旋转一个反射镜以便为了全内反射而略微改变入射角，并从而在无需大幅改变照射的激发光斑的位置的情况下使得从基底表面的非连续区域发射的非线性光信号达到最大。在一些方面，可以使用具有不同基频的两个(或更多个)激光器在非线性活性样品所固定于的光学界面处生成和频光或差频光。
基底形式、光学界面和全内反射
如上所述，本公开内容的系统和方法利用平面基底来将一种或多种生物实体固定在该基底的顶表面上，其中顶部基底表面还包括用于激发非线性光信号的光学界面(或样品界面)。基底可以是玻璃、二氧化硅、熔融石英、塑料，或者任何对基本光束和二次谐波光束透明并且当激发光以适当角度入射时支持基底/样品界面处的全内反射的其他固体材料。在本发明的一些方面，在其内部容纳有生物实体的非连续区域被配置成一维或二维阵列，并且通过疏水涂层或薄金属层彼此隔开。在其他方面，非连续区域可以包括基底表面中的凹坑。在其他方面，非连续区域可以通过孔形成组件而彼此分离，从而使基底形成微孔板(或微板)的底部，并且每个单独的非连续区域形成微孔板中的一个孔的底部。在本公开内容的一个方面，孔形成组件将基底的顶表面分成96个单独的孔。在另一方面，孔形成组件将基底的顶表面分成384个孔。在又一方面，孔形成组件将基底的顶表面分成1536个孔。在所有这些方面中，基底无论配置成平面阵列、凹陷阵列或微孔板形式，都可以包括与高通量系统的其他光学和机械组件相接合的一次性或消耗性装置或盒。
本文公开的方法和系统进一步包括对将基底表面划分成的非连续区域或孔的数目加以规定，不论非连续区域或孔之间是如何保持分离的。在基底上具有较大数目的非连续区域或孔在提高所述方法或系统的样品分析通量方面可能是有利的。在本公开内容的一个方面，每基底的非连续区域或孔的数目为10个到1600个之间。在其他方面，非连续区域或孔的数目为至少10个、至少20个、至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少750个、至少1000个、至少1250个、至少1500个或至少1600个。在所公开的方法和系统的其他方面，非连续区域或孔的数目为至多1600个、至多1500个、至多1000个、至多750个、至多500个、至多400个、至多300个、至多200个、至多100个、至多50个、至多20个或至多10个。在一个优选方面，非连续区域或孔的数目为96个。在另一优选方面，非连续区域或孔的数目为384个。在又一优选方面，非连续区域或孔的数目为1536个。本领域技术人员将会明白，非连续区域或孔的数目可以在以这些值中的任何一个为界的任何范围内(例如，从约12个到约1400个)。
本文公开的方法和装置还包括对将基底表面划分成的非连续区域或孔的表面积加以规定，不论非连续区域或孔之间是如何保持分离的。具有较大面积的非连续区域或孔可有助于在一些情况下对关联的生物实体的方便进入和操控，而具有较小面积的非连续区域或孔在降低测定试剂量要求和提高所述方法或系统的样品分析通量方面可能有利。在本公开内容的一个方面，非连续区域或孔的表面积为1mm2与100mm2之间。在其他方面，非连续区域或孔的面积为至少1mm2、至少2.5mm2、至少5mm2、至少10mm2、至少20mm2、至少30mm2、至少40mm2、至少50mm2、至少75mm2或至少100mm2。在所公开的方法和系统的其他方面，非连续区域或孔的面积为至多100mm2、至多75mm2、至多50mm2、至多40mm2、至多30mm2、至多20mm2、至多10mm2、至多5mm2、至多2.5mm2或至多1mm2。在一个优选方面，非连续区域或孔的面积约为35mm2。在另一优选方面，非连续区域或孔的面积约为8.6mm2。本领域技术人员将会明白，非连续区域或孔的面积可以在以这些值中的任何一个为界的任何范围内(例如，从约2mm2到约95mm2)。
通过相对于激发光源重新定位基底而将基底表面的非连续区域依次暴露于激发光(用激发光对其进行照射)。入射激发光的全内反射在样品界面产生“迅衰波”，其激发非线性活性标签并导致二次谐波光(或者在一些方面，和频光或差频光)的生成。由于迅衰波的强度并且由此所生成的非线性光信号的强度依赖于激发光束的入射角，因此基底平面相对于激发光束的光轴的精确取向和光束到基底的有效光耦合对于实现整个非连续区域阵列上的最佳SHG信号至关重要。在本公开内容的一些方面，通过激发光从基底表面的单一反射来实现全内反射。在其他方面，基底可被配置成波导，使得激发光在其沿着该波导传播时经历多次全内反射。在其他方面，基底可被配置成零模式波导，其中通过纳米工艺结构来创造消逝场。
诸如图5和图7中所示的光学设施中激发光束与基底之间的有效光耦合通常将会通过使用折射率匹配液诸如矿物油、矿物油与氢化三联苯的混合物、全氟化碳液、甘油、丙三醇或具有接近1.5的折射率的类似的流体来实现，其中折射率匹配液被芯吸在棱镜与基底的下表面之间。由于在基底的快速重新定位期间有可能破坏折射率匹配液的静态无气泡膜，因此本文公开的系统和方法包括产生高通量系统中激发光束到基底的有效光耦合的备选方法。
图8图示了本公开内容的高通量系统的一个方面，其中使用折射率匹配液的连续再循环流动来保持棱镜与基底之间的有效光耦合，该棱镜是作为光学系统的部件架设的，而基底则配置成微孔板形式(例如，玻璃底微板形式)并可相对于棱镜自由平移。在这种情况下，折射率匹配液的连续流动确保了棱镜与基底之间的流体薄膜在这两个组件彼此相对移动时从不会被破坏，即，流体薄膜中的任何气泡或间断都会通过流体流动而从棱镜与基底之间的间隙消除或排出。折射率匹配液经由图中指示的两个流体通道引入到间隙中，并且可被收集在适宜的储器或储槽中，从该储器或储槽可以使用小型泵来对折射率匹配液进行再循环。在同一概念的备选实现方案中，将会采用单个非连续区域与圆柱形全内反射(TIR)探针之间的点接触，而非图8中所指示的基底与棱镜之间的线接触，其中折射率匹配液将会向上流过中心流体通道，并继而向下流过圆柱形TIR探针的侧面，从而被收集于适宜的储器或储槽中。
图9图示了本公开内容的高通量系统的另一方面，其中使用折射率匹配弹性体材料薄层代替折射率匹配液来保持棱镜与基底之间的有效光耦合。在这种情况下，基底再次封装成微孔板形式(例如，玻璃底微板形式)，但具有附接到或相邻于基底的下表面的折射率匹配弹性体材料薄层，以便当置于与棱镜的上表面相接触时，弹性体填充棱镜与基底之间的间隙并提供有效光耦合。可以使用的弹性体材料的示例包括但不限于具有约1.4的折射率的硅氧烷。在本公开内容的一个方面，弹性体材料的折射率为约1.35与约1.6之间。在其他方面，折射率为约1.6或更低、约1.55或更低、约1.5或更低、约1.45或更低、约1.4或更低或者约1.35或更低。在其他方面，折射率为至少约1.35、至少约1.4、至少约1.45、至少约1.5、至少约1.55或者至少约1.6。本领域技术人员将会明白，弹性体层的折射率可以在以这些值中的任何一个为界的任何范围内(例如，从约1.4到约1.6)。在该方法的一个方面，弹性体材料层的厚度为约0.1mm与2mm之间。在其他方面，弹性层的厚度为至少0.1mm、至少0.2mm、至少0.4mm、至少0.6mm、至少0.8mm、至少1.0mm、至少1.2mm、至少1.4mm、至少1.6mm、至少1.8mm或至少2.0mm。在该方法的其他方面，弹性层的厚度为至多2.0mm、至多1.8mm、至多1.6mm、至多1.4mm、至多1.2mm、至多1.0mm、至多0.8mm、至多0.6mm、至多0.4mm、至多0.2mm或至多0.1mm。本领域技术人员将会明白，弹性层的厚度可以在以这些值中的任何一个为界的任何范围内(例如，从约0.1mm到约1.5mm)。在该方法的另一方面，棱镜的上表面具有部分地为圆柱形的凸脊或者呈圆拱形(图9)，以集中压力并在基底、弹性体层和棱镜表面之间提供更好的接触。该方法还可需要使用第三平移轴来定位基底，即，在激发步骤与检测步骤之间，将会使基底(微孔板)略微上升，以在将基底重新定位到所要分析的下一非连续区域的位置之前消除弹性体层与棱镜之间的接触。
图10A-图10D图示了本公开内容的高通量系统的优选方面，其中棱镜或光栅阵列与基底(封装成微孔板形式)的下表面进行集成并且用于替代固定式棱镜，从而完全消除对于折射率匹配液或弹性体层的需求。棱镜(或光栅)阵列以这样的方式与基底的上表面上的非连续区域或孔阵列对准：使得入射激发光被“入口棱镜”(“入口光栅”)以实现激发光束从样品界面全内反射的入射角引导至与入口棱镜(入口光栅)相邻但不位于其正上方的非连续区域或孔(见图11)，并且使得反射的激发光束以及在照射的非连续区域生成的非线性光信号被从所探查的非连续区域再度偏移(与之相邻但不位于其正下方)的“出口棱镜”(“出口光栅”)所收集，并且其中针对每个非连续区域的入口棱镜和出口棱镜(入口光栅和出口光栅)是阵列中不同的、非唯一元件。
总体而言，对于包含M行×N列单个特征的非连续区域阵列，对应的棱镜或光栅阵列将具有M+2行x N列或者N+2列×M行单个棱镜或光栅。在一些实施方式中，M的值可以是至少2、至少4、至少6、至少8、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50行。在一些实施方式中，M的值可以是至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多18、至多16、至多14、至多12、至多10、至多8、至多6、至多4或至多2行。类似地，在一些实施方式中，N的值可以是至少2、至少4、至少6、至少8、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50列。在一些实施方式中，N的值可以是至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多18、至多16、至多14、至多12、至多10、至多8、至多6、至多4或至多2列。对于本领域技术人员显而易见，M和N可以具有相同的值或不同的值，并且可以具有上述指定范围内的任何值，例如，M＝15而N＝45。
单个棱镜或光栅的几何形状和尺寸，包括棱镜或光栅阵列层的厚度，被优化以确保入射光在基底的选定非连续区域经历全内反射，并且与基底(微孔板)相对于激发光束的位置无关地以高光耦合效率收集在所述选定非连续区域处生成的非线性光信号。图12示出了棱镜阵列原型的照片。棱镜或光栅阵列可以通过本领域技术人员已知的多种技术来制造，例如，在一个优选方面，它们可以由诸如环烯烃共聚物(COC)或环烯烃聚合物(COP)、丙烯酸、聚酯或类似的聚合物等平滑流动的低双折射材料注射成型。在一些方面，棱镜或光栅阵列可以制造成单独的组件，并于随后与基底的下表面进行集成。在其他方面，棱镜和光栅阵列可以基底自身一体化特征予以制造。
固定化学
如本文所公开，上述任何形式的基底被进一步配置用于生物实体在指定非连续区域内的固定。生物分子或细胞的固定可以通过本领域技术人员已知的多种技术来实现，例如，通过采用氨丙基硅烷化学以胺官能团使玻璃或熔融石英表面功能化，随后使用胺反应性共轭化学来直接与感兴趣的生物分子共价耦合或者经由中间间隔基或连接体分子来共价耦合。还可以直接或间接地例如通过利用BSA-NHS(BSA-N-羟基琥珀酰亚胺)来利用非特异性吸附，具体是首先将BSA分子层附接到表面并继而用N，N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯将其活化。BSA上的活化赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸残基与蛋白质上的表面胺类反应。
在本公开内容的一个优选方面，生物分子可以通过拴系到或嵌入于“支承的脂双层”中而固定在表面上，后者包含通过疏水或静电相互作用约束于硅或玻璃表面的脂双层小片，其中所述双层“浮”在含水缓冲液薄层上的基底表面上方。还可以使用或不使用膜蛋白或其他膜相关成分来制备支承磷脂双层，例如在以下文献中所描述：Salafsky等“Architecture and Function of Membrane Proteins in Planar Supported Bilayers:A Study with Photosynthetic Reaction Centers",Biochemistry 35(47):14773-14781(1996)；Gennis,R.,Biomembranes,Springer-Verlag,1989；Kalb等“Formation ofSupported Planar Bilayers by Fusion of Vesicles to Supported PhospholipidMonolayers”,Biochimica Biophysica Acta.1103:307–316(1992)；以及Brian等"Allogeneic Stimulation of Cytotoxic T-cells by Supported Planar Membranes",PNAS-Biological Sciences 81(19):6159-6163(1984)；上述文献的相关部分通过引用而并入于此。支承磷脂双层是本领域中公知的，并且有多种技术可以用于其制造。支承双层通常应当浸没在水溶液中以防止其在暴露于空气时受损。
收集光学器件和检测器
图5进一步图示了用于检测在依次照射基底的非连续区域时生成的非线性光信号的收集光学器件和检测器。由于表面选择性非线性光学技术是相干技术，意味着基本光束和非线性光学光束具有以明确定义的空间关系和相位关系通过空间传播的波前，因此需要最少的收集光学器件。通过棱镜(或者上述微板装置的集成式棱镜或光栅阵列)收集发射的非线性光信号，并经由分色反射器或反射镜将其引导至检测器。可选地采用附加的光学组件，例如，透镜、光学带通滤光器、反射镜等，在光束到达检测器之前进一步对该光束进行塑形、转向和/或过滤。可以采用多种不同的光检测器，包括但不限于光电二极管、雪崩光电二极管、光电倍增管、CMOS传感器或CCD器件。
X-Y平移台
如图4中所示，本文公开的高通量系统的实现方案理想情况下利用高精度X-Y(或者在一些情况下，X-Y-Z)平移台来相对于激发光束重新定位基底(上述任何形式的基底)。适宜的平移台可从多个供应商处商购获得，例如，从Parker Hannifin购得。精确平移台系统通常包括若干组件的组合，包括但不限于：线性驱动器、光学编码器、伺服和/或步进马达，以及马达控制器或驱动单元。本文所公开的系统和方法要求平台移动的高精度和可重复性，以便确保当布置进行反复的光学检测和/或液体分配步骤时对非线性光信号的准确测量。另外，由于激发光的焦斑的大小[在直径或边长方面为20-200微米]显著小于基底的非连续区域的大小，因此在本公开内容的一些方面，可能还期望在进行重复测量时返回到给定非连续区域内的略微不同的位置，或者在单次测量的过程中跨非连续区域的一部分缓慢扫描激发光束，从而消除关于长时暴露或预先暴露的光漂白效应的潜在担忧。
因此，本文公开的方法和系统进一步包括指定平移台所能够相对于激发光束定位基底的精度。在本公开内容的一个方面，平移台的精度为约1um与约10um之间。在其他方面，平移台的精度为约10um或更低、约9um或更低、约8um或更低、约7um或更低、约6um或更低、约5um或更低、约4um或更低、约3um或更低、约2um或更低或者约1um或更低。本领域技术人员将会明白，平移台的精度可以在以这些值中的任何一个为界的任何范围内(例如，从约1.5um到约7.5um)。
流体分配系统
如图4中所示，本文所公开的高通量系统的一些实施方式还包括用于使固定在基底表面上的生物实体或靶实体与测试实体(或测试化合物)相接触的自动化可编程流体分配(或液体分配)系统，后者通常分配于包含添加或未添加例如二甲基亚砜(DMSO)等少量有机溶剂成分的含水缓冲液的溶液中。适宜的自动化可编程流体分配系统可从多个供应商处商购获得，例如，从Beckman Coulter、Perkin Elmer、Tecan、Velocity 11以及许多其他供应商购得。在本文所公开的系统和方法的优选方面，流体分配系统还包括多通道分配头，例如，4通道、8通道、16通道、96通道或384通道分配头，用于将可编程体积的液体(例如，范围从约1微升到若干微升)同时递送到基底上的多个孔或位置。
板装卸机器人
在本文公开的高通量系统的其他方面，该系统进一步包括微板装卸(或板装卸)机器人系统(图4)，用于相对于光学激发和检测光学器件更换和定位基底(上述任何形式的基底)，或者用于可选地在光学仪器与流体分配系统之间移动基底。合适的自动化可编程微板装卸机器人系统可从多个供应商处商购获得，包括Beckman Coulter、Perkin Elemer、Tecan、Velocity 11以及许多其他供应商。在本文公开的系统和方法的一个优选方面，自动化微板装卸机器人系统被配置用于从和向冷藏存储单元移动包含固定的生物实体和/或测试化合物的等分试样的多个微孔板。
处理器/控制器和基于约束的调度算法
在本公开内容的另一方面，所公开的高通量系统还包括处理器(或控制器，或者计算机系统)(图4)，该处理器被配置用于运行系统软件，该系统软件控制所描述的各个子系统(激发和检测光学系统、X-Y(或X-Y-Z)平移台、流体分配系统，以及板装卸机器人)以及对进行高通量构象分析所涉及的不同操作步骤进行同步。除了处置数据采集过程(即，从检测器收集对应于与构象变化相关联的非线性光信号的输出电子信号)之外，处理器或控制器通常还被配置用于储存数据、执行数据处理和显示功能(包括确定所测试的生物实体或者生物实体与测试实体的组合是否发生了取向或构象变化)，以及操作图形用户界面以供操作者进行交互控制。处理器或控制器还可以与其他处理器连网，或者连接到因特网以便与远程位置上的其他仪器和计算机通信。
处理器/控制器的典型输入参数可以包括设置参数，诸如所要分析的微孔板总数；每板的孔数；要针对基底的每个非连续区域或微孔板的孔执行激发和检测步骤的次数(例如，以便指定终点测定或动力学测定模式)；应当针对每个非连续区域或孔收集动力学数据的总时间过程；要向每个非连续区域或孔递送的测试化合物溶液的顺序、定时和体积；收集和整合非线性光信号的驻留时间；输出数据文件的一个或多个名称；以及本领域技术人员已知的多种系统设置和控制参数中的任何参数。
在本公开内容的一个优选方面，处理器或控制器进一步被配置用于通过执行基于约束的调度算法来进行系统通量优化。该算法利用上述系统设置参数来确定针对可能彼此相邻或者可能彼此不相邻的非连续区域的穿插激发/检测和液体分配步骤的最佳顺序，从而在每小时分析的生物实体和/或测试实体数目方面使系统的总通量达到最大。系统操作步骤的优化是实现高通量分析的重要方面。在所公开的方法和系统的一些方面，分析系统的平均通量范围可以是从每小时测试约10个测试实体到每小时测试约1000个测试实体。在一些方面，分析系统的平均通量可以是每小时测试至少10个测试实体、每小时测试至少25个测试实体、每小时测试至少50个测试实体、每小时测试至少75个测试实体、每小时测试至少100个测试实体、每小时测试至少200个测试实体、每小时测试至少400个测试实体、每小时测试至少600个测试实体、每小时测试至少800个测试实体或者每小时测试至少1000个测试实体。在其他方面，分析系统的平均通向可以是每小时测试至多1000个测试实体、每小时测试至多800个测试实体、每小时测试至多600个测试实体、每小时测试至多400个测试实体、每小时测试至多200个测试实体、每小时测试至多100个测试实体、每小时测试至多75个测试实体、每小时测试至多50个测试实体、每小时测试至多25个测试实体或者每小时测试至多10个测试实体。
计算机系统和网络
在各个实施方式中，本发明的方法和系统可以进一步包括安装在计算机系统上的软件程序及其用途。相应地，如上文所述，对各个子系统的计算机控制和对进行高通量构象分析所涉及的包括数据分析和显示在内的不同操作步骤的同步都在本发明的范围内。
图21中所示的计算机系统500可以理解为能够从介质511和/或网络端口505读取指令的逻辑装置，所述网络端口505能够可选地连接到具有固定介质512的服务器509上。诸如图21中所示的系统可以包括CPU 501、磁盘驱动器503、可选的输入设备诸如键盘515和/或鼠标516以及可选的监视器507。通过图中所示通向本地或远程位置上的服务器的通信介质可以实现数据通信。所述通信介质可以包括任何传输和/或接收数据的手段。例如，通信介质可以是网络连接、无线连接或者因特网连接。这样的连接可以提供通过万维网的通信。可以想到，与本公开内容相关的数据可以通过这样的网络或连接来传输，以供如图21中所示的一方522来接收和/或审核。
图22是图示能够与本发明的示例实施方式相结合使用的计算机系统100的第一示例架构的框图。如图22中所描绘，示例计算机系统可以包括用于处理指令的处理器102。处理器的非限制性示例包括：Intel XeonTM处理器、AMD OpteronTM处理器、Samsung 32位RISCARM 1176JZ(F)-S v1.0TM处理器、ARM Cortex-A8 Samsung S5PC100TM处理器、ARM Cortex-A8 Apple A4TM处理器、Marvell PXA 930TM处理器，或者功能上等同的处理器。可以利用多线程执行来进行并行处理。在一些实施方式中，还可以使用多个处理器或者具有多个核的处理器，无论是在单一计算机系统中、集群中，还是分布在包括多个计算机、蜂窝电话和/或个人数字助理装置的网路上的系统之间。
如图22中所示，高速缓存104可以连接到或者并入在处理器102中，以便为处理器102最近使用或频繁使用的指令或数据提供高速存储器。处理器102通过处理器总线108连接到北桥106。北桥106通过存储器总线112连接到随机存取存储器(RAM)110，并管理处理器102对RAM 110的访问。北桥106还通过芯片组总线116连接到南桥114。南桥114转而连接到外围总线118。外围总线例如可以是PCI、PCI-X、PCI Express或其他外围总线。北桥和南桥通常称为处理器芯片组并且管理处理器、RAM和外围总线118上的外围组件之间的数据传输。在一些备选架构中，北桥的功能可以并入到处理器中，而不是采用单独的北桥芯片。
在一些实施方式中，系统100可以包括附接到外围总线118的加速器卡122。加速器可以包括现场可编程门阵列(FPGA)或其他用于加速某种处理的硬件。例如，加速器可以用于自适应数据重组，或者用于评价扩展集处理中的代数表达式。
外部存储124中的软件和数据可以加载到RAM 110和/或缓存104中以供处理器使用。系统100包括用于管理系统资源的操作系统；操作系统的非限制性示例包括：Linux、WindowsTM、MacOSTM、BlackBerry OSTM、iOSTM和其他功能上等同的操作系统，以及运行于操作系统之上的应用软件用于管理数据存储和根据本发明的示例实施方式的优化。
在本示例中，系统100还包括网络接口卡(NIC)120和121，所述NIC 120和121连接到外围总线，用于提供通向诸如网络附加存储(NAS)等外部存储和其他可用于分布式并行处理的计算机系统的网络接口。
图23为示出网络200的视图，该网络200具有多个计算机系统202a和202b、多个蜂窝电话和个人数据助理202c，以及网络附加存储(NAS)204a和204b。在示例实施方式中，系统202a、202b和202c可以管理数据存储和优化对储存在网络附加存储(NAS)204a和204b中的数据的数据访问。可以针对数据采用数学模型，并且利用跨计算机系统202a和202b以及蜂窝电话和个人数字助理系统202c的分布式并行处理来对其进行评价。计算机系统202a和202b以及蜂窝电话和个人数字助理系统202c还可以提供用于对储存在网络附加存储(NAS)204a和204b中的数据进行自适应数据重组的并行处理。图23仅图示了一个示例，而各种各样的其他计算机架构和系统均可结合本发明的各个实施方式使用。例如，可以使用刀片服务器来提供并行处理。处理器刀片可以通过背板连接，以提供并行处理。存储也可以连接到背板，或者通过单独的网络接口作为网络附加存储(NAS)而连接。
在一些示例实施方式中，处理器可以保持单独的存储器空间，并通过网络接口、背板或其他连接器传输数据，以供由其他处理器进行并行处理。在其他实施方式中，一些或所有处理器可以使用共享虚拟地址存储器空间。
图24是根据示例实施方式，利用共享虚拟地址存储器空间的多处理器计算机系统300的框图。该系统包括可以访问共享存储器子系统304的多个处理器302a-f。系统在存储器子系统304中并入了多个可编程硬件存储器算法处理器(MAP)306a-f。每个MAP306a-f可以包括存储器308a-f以及一个或多个现场可编程门阵列(FPGA)310a-f。MAP提供了可配置的功能单元，并且特定算法或算法部分可被提供给FPGA 310a-f用于密切协同相应的处理器进行处理。例如，在示例实施方式中，MAP可以用于评价关于数据模型的代数表达式，以及进行自适应数据重组。在该示例中，每个MAP可由所有处理器出于这些目的而全局访问。在一种配置下，每个MAP可以使用直接存储器存取(DMA)来访问关联的存储器308a-f，从而允许其与相应的微处理器302a-f独立地和异步地执行任务。在该配置下，MAP可以直接将结果馈送到另一MAP以供算法的流水线操作和并行执行。
上述计算机架构和系统仅为示例，并且各种各样的其他计算机、蜂窝电话和个人数字助理架构和系统均可结合示例实施方式来使用，包括采用通用处理器、协处理器、FPGA和其他可编程逻辑器件、片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)以及其他处理和逻辑元件的任意组合的系统。在一些实施方式中，整个计算机系统或其部分能够以软件或硬件来实现。可以结合示例实施方式使用任何种类的数据存储，包括随机存取存储器、硬盘驱动器、闪速存储器、磁带驱动器、磁盘阵列、网络附加存储(NAS)以及其他本地式或分布式数据存储设备和系统。
在示例实施方式中，计算机系统可以利用执行于任何上述或其他计算机架构和系统上的软件模块来实现。在其他实施方式中，系统的功能可以部分地或全部地实现于固件、可编程逻辑器件诸如参照图24的现场可编程门阵列(FPGA)、片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)或者其他处理和逻辑元件中。例如，可以通过利用硬件加速器卡，诸如图22中所示的加速器卡122，利用硬件加速来实现集处理器和优化器。
实施例1(说明性)
G蛋白偶联受体(例如，血清素、多巴胺、谷氨酸、趋化因子和组胺受体)是一类在由配体活化时经历构象变化的蛋白质，并且因此适合利用本发明进行研究。可以使用非线性活性标签来标记无固有非线性-活性的GPCR，并且经由非线性活性标签的取向变化来检测构象变化。一种或多种标记的GPCR蛋白质可以通过例如将蛋白质分子嵌入在玻璃基底上的支撑磷脂双层膜结构阵列中而附接到表面，其中阵列中的每个双层结构包含单一种类的GPCR分子。在本发明的优选实施方式中，每个支撑磷脂双层膜结构被约束在微板的单个孔内。当配体的结合活化GPCR受体时产生的构象变化导致标签相对于分子所固定于的光学界面的取向变化，并且因此导致非线性光束(例如，二次谐波光)的性质变化，诸如强度、波长或偏振的变化。
在筛选实验中，将包含固定的GPCR的微孔板定位在高通量分析系统的平移台机构上，并将其移动到用于测量第一孔中的信号的位置。通过测量来自第一孔的非线性光信号，将微孔板重新定位到第二孔以重复背景测量并以此类推，可以在固定的GPCR分子暴露于测试化合物之前针对一个或多个GPCR样品测量背景信号。继而在添加测试化合物之后，在一个(终点测定模式)或多个(动力学测量模式)限定的时间点，针对每个孔进行对非线性光信号的重复测量，并对其进行分析以确定测试化合物是否诱导了所述一个或多个GPCR种类中的构象变化。
在一些情况下，即使GPCR未被测试化合物活化，但测试化合物到GPCR分子的结合仍可导致测得的非线性光学性质的变化。例如，这可能是由于结合复合物中测试化合物与GPCR分子之间的相互作用，该相互作用改变附接的标签相对于受体分子的取向而不是改变受体分子的构象。如果需要，可以例如通过采用已知会结合到给定的GPCR受体但不会产生构象变化的化合物来进行对照，以将测得的非线性光学性质的变化归因于受体的结合或活化。如果必要，可以通过改变标签的共轭化学和/或对受体进行基因修饰以引入新的标记位点来改变GPCR上的标签的位置，以便确保观察到的非线性光信号中的变化与受体活化或构象变化相关联。
在上述实施例中，借助于通过使用精确X-Y平移台相对于激发光束重新定位玻璃基底(微板)，同时通过上文公开的再循环折射率匹配液、折射率匹配弹性体或棱镜光栅设计保持有效光耦合，对固定在玻璃基底上的脂双层结构阵列中(并进一步通过其所位于的孔而分离)的每个GPCR分子进行测量。
通常，测试化合物溶液向微板的孔中的分配将会由与光学仪器系统相集成的可编程自动化液体分配单元来进行。固定在微板的孔中的每个GPCR种类可以暴露于相同的测试化合物，或者可以各自暴露于不同的测试化合物。在本发明的一些方面，高通量分析系统将进一步包括机器人，其用于将包含待分析的GPCR样品的微孔板从外部存储系统移动到平移台的原位，或者其利用新的样品板来替换已完成分析的包含GPCR的微板。在本发明的其他方面，高通量分析系统将进一步包括附加的机器人，用于将包含多种测试化合物的标准微板移入和移出液体分配单元的原位。
在本发明的一个优选方面，计算机系统(即，处理器或控制器)被配置用于运行软件以便：(i)控制高通量分析系统的所有可编程组件；(ii)对将微孔板移入和移出位置、进行背景光学测量、分配测试化合物溶液以及重复用于终点或动力学模式测定的光学测量的操作步骤进行同步；(iii)储存和处理从检测器接收的非线性光信号数据；以及(iv)通过利用输入系统设置参数(例如，待分析的微孔板数目、每板孔数、待测试的测试化合物数目、终点或动力学测量模式等)计算针对每个微板上的不同孔的穿插背景测量、测试化合物分配和重复测量步骤的最佳次序，来优化分析的总通量(例如，在每小时分析的GPCR样品/测试化合物组合数目方面)。
实施例2(用于制造棱镜阵列的模具设计与工艺)
图13中示出了创建用于制造原始“跃阶棱镜”设计的模具，以及由特种光学成型工厂进行的注射成型工艺(Apollo Optical,Rochester,NY)。所得到的部件显示出应力双折射(见图14中的交叉偏振器图像)，并且测得的SHG信号受到这种双折射的不利影响(图15)，其中信号沿着棱镜阵列的长度削弱。
为了减少或消除对SHG信号的双折射作用，发明人对所使用的塑料类型(COP、COC、丙烯酸等)、不同的成型加工条件(温度、压力、流速、循环时间等)以及成型后退火进行了实验。发明人能够找到适度减少双折射的材料和工艺参数，但这些条件也倾向于造成塑料部件紧贴模具并且在从模具中脱除时破裂。(注意：该模具包含仅在部件的出口端和浇口端推动的脱模器件)。对部件进行退火显著减少了应力双折射，但却导致部件的过度机械翘曲，从而使其报废。
注射成型流仿真显示，应力主要是在从平面浇口到棱镜结构部件(结果未示出)的过渡中产生的。仿真结果还预测可以将部件制作得比所需更长，并于随后修剪成合适长度，从而机械去除成型部件的应力区域并产生具有与原始设计相同的最终长度的棱镜阵列。
模流仿真的结果用于设计包括以下多种显著改变的新模具：
1.增加部件的总长度，以允许修剪掉双折射过渡区。
2.将浇口特征和出口特征制作得更长，以降低塑料中的剪切应力。
3.沿着部件的长度和宽度添加脱模特征，以帮助从模具中脱除并降低在脱除过程中造成部件破裂的可能性。
4.向阵列的平面侧添加“胶凸点”，以控制在将棱镜阵列层压到玻璃底微板时的胶层厚度，并改善温度变化期间的胶粘。
图16中示出了新的部件设计，包括浇口(左)和出口(右)特征。图19示出了模具工具的剖开形式。注意，存在6×3的“脱模器刀刃”器件(即，“脱模器件”)，其在模具脱除期间用于对脱除过程中的部件施加更均匀的压力(图20)。还在浇口区域和出口区域中使用了附加的脱模特征(未示出)。总体而言，光学质量模制部件根本不使用脱模器，原因在于脱模器会碰触部件的表面并可能产生瑕疵。由于发明人的棱镜阵列设计具有一些并非光学重要的区域，因此发明人能够布置脱模器刀刃用于仅在其中部件的光学性能不关键的这些区域中碰触部件。
总体而言，m×n的脱模器件阵列中刀刃状脱模器特征的数目越大，模具脱除期间施加在部件上的压力就越均匀。在一些实施方式中，m和/或n将具有的值为至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或者至少20。在一些实施方式中，m和/或n将具有的值为至多20、至多19、至多18、至多17、至多16、至多15、至多14、至多13、至多12、至多11、至多10、至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4、至多3或者至多2。m和n的值可以相同或者可以不同，并且可以包括上述指定范围内的值的任意组合。
新的模具设计，特别是脱模特征允许注射成型供应商对可能在原始模具中造成释放破裂的不同压力和温度特性进行实验。这些条件有效地解除了塑料在成型加工期间的应力，但会造成部件更紧地贴附到光学模具表面。分布在部件的整个长度和宽度上的脱模器特征允许部件从模具脱出而不造成破裂。利用新模具制作的棱镜部件具有可忽略不计的应力双折射，如图17中的交叉偏振器图像所示。SHG数据还显示出沿着棱镜阵列的长度的均匀得多的信号响应(图18)。残余双折射仍可检测到，但部件的额外长度允许优化局部修剪，以切除其中存在最大双折射的过渡区域(数据未示出)。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方式，但对于本领域技术人员显而易见的是这些实施方式仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替代。应当理解本文中所述的本发明实施方式的各种替代方案均可用于实施本发明。所附述权利要求旨在限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (32)

1.一种用于检测生物实体与测试实体之间相互作用的装置，包括：
a)基底，所述基底包括：
i)在所述基底的顶表面上的非连续区域的M×N阵列，其中M是所述阵列中非连续区域的行数而N是非连续区域的列数，以及
ii)与所述基底的底表面相集成并且光耦合到所述非连续区域的棱镜的R×S阵列，其中R是所述阵列中棱镜的行数而S是棱镜的列数；
其中每个所述非连续区域位于与所述棱镜的阵列中的单个棱镜的正上方，其中每个所述非连续区域光耦合至一入口棱镜和一空间位置不同的出口棱镜，所述入口棱镜和所述出口棱镜邻近所述非连续区域但不位于其正下方，并且
其中R＝M+2并且S＝N，或者R＝M并且S＝N+2。
2.根据权利要求1所述的装置，其中M＝8并且N＝12。
3.根据权利要求1所述的装置，其中M＝16并且N＝24。
4.根据权利要求1所述的装置，其中M＝32并且N＝48。
5.根据权利要求1所述的装置，其中M大于4并且N大于4。
6.根据权利要求1所述的装置，其中每个非连续区域包含支撑磷脂双层膜，或者被配置用于促进支撑磷脂双层膜的形成。
7.根据权利要求1所述的装置，其进一步包括结合到所述基底的顶表面的孔形成组件，以便将每个非连续区域隔离在单独的孔中。
8.根据权利要求1所述的装置，其中所述非连续区域中的每一个具有最大100mm2的面积。
9.根据权利要求1所述的装置，其中所述基底包含玻璃、熔融石英或塑料。
10.一种用于检测生物实体与测试实体之间相互作用的方法，其包括：
a)使至少4种生物实体中的每一种与至少一种测试实体相接触，其中所述至少4种生物实体中的每一种位于一基底上的不同非连续区域中，并且其中每个所述非连续区域光耦合到一入口棱镜和一不同的出口棱镜，所述入口棱镜和所述出口棱镜均与所述基底的底表面相集成；
b)相对于一个或多个激发光束的位置移动所述基底；
c)利用表面选择性光学技术，以所述一个或多个激发光束来照射所述至少4种生物实体中的每一种，其中该照射步骤包括将入射激发光引导至定位成邻近所述非连续区域中的每一个但不位于其正下方的一入口棱镜上；以及
d)利用一出口棱镜收集当照射时在所述非连续区域中的每一处生成的非线性光信号，并将所述非线性光信号引导至检测器，所述出口棱镜定位成邻近所述非连续区域中的每一个但不位于其正下方；
e)通过检测所述非线性光信号的物理性质的变化，测定在所述至少4种生物实体中的每一种中是否通过与所述至少一种测试实体相接触而诱导出构象变化；
其中以每小时至少10种测试实体的平均速率进行构象变化测定。
11.根据权利要求10所述的方法，其中以每小时至少100种测试实体的平均速率进行构象变化测定。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少4种生物实体相同。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少4种生物实体不相同。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物实体选自细胞、蛋白质、肽、受体、酶、DNA、RNA、小分子和碳水化合物，或者其任意组合。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物实体是药物靶标或其部分。
16.根据权利要求10所述的方法，其中每个非连续区域包含基底表面上最大100mm2的面积。
17.根据权利要求10所述的方法，其中每个非连续区域包含支撑磷脂双层膜。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述生物实体拴系到或嵌入在所述支撑磷脂双层膜内。
19.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少一种测试实体选自细胞、蛋白质、肽、受体、酶、DNA、RNA、小分子和碳水化合物，或者其任意组合。
20.根据权利要求10所述的方法，其中所述测试实体为候选药物。
21.根据权利要求10所述的方法，其中所述接触步骤发生在溶液中，并且包括利用预编程流体分配单元来分配所述至少一种测试实体。
22.根据权利要求10所述的方法，其中所述接触步骤包括使所述至少4种生物实体中的每一种与不同的测试实体相接触。
23.根据权利要求10所述的方法，其中所述接触步骤包括使所述至少4种生物实体中的每一种依序与至少100种不同测试实体相接触。
24.根据权利要求10所述的方法，其中所述接触步骤包括使所述至少4种生物实体中的每一种依序与至少10000种不同测试实体相接触。
25.根据权利要求10所述的方法，其中由一个或多个激光器提供所述一个或多个激发光束。
26.根据权利要求10所述的方法，其中表面选择性光学检测技术包括利用至少一个激发光束从所述基底的平面表面的全内反射。
27.根据权利要求10所述的方法，其中所述非线性光信号选自二次谐波光、和频光以及差频光。
28.根据权利要求10所述的方法，其进一步包括在所述接触步骤之后多次重复所述照射步骤和测定步骤，从而确定作为时间函数的所述至少4种生物实体中的每一个中的构象变化。
29.根据权利要求14所述的方法，其中所述蛋白质包括抗体。
30.根据权利要求14所述的方法，其中所述小分子包括寡核苷酸。
31.根据权利要求19所述的方法，其中所述蛋白质包括抗体。
32.根据权利要求19所述的方法，其中所述小分子包括寡核苷酸。
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