JP7027169B2 - バイオセーフティーのためのリガンド依存性必須遺伝子をもつ合成栄養要求体 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本願は、参照によりその全文が本明細書に援用される、２０１５年５月２８日出願の米国特許仮出願第６２／１６７，８５４号に対する優先権およびその利益を主張する。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立科学財団に授与された１１５１２２０号の下、政府支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
コンピュータプログラム付録の参照による援用
該当なし
本技術は、一般に、制御された生物学的封じ込めのための遺伝子改変生物、より特に、リガンド依存性必須遺伝子をもつ合成栄養要求体および作製方法に関する。
バイオテクノロジーは、材料の基礎研究ならびに工業的規模の生産のための遺伝子改変生物の作製に大きく依存している。生物学の固有の力、無限のデザインの複雑さ、および自己複製もまた、操作された生物が逸出するかもしれないことを懸念する人々から精査される。これらの自己複製する再設計された細胞は、それらが逸出するかまたはその天然の生態系を圧倒する場合には、望ましくない結果を生じることがある。
生物学的封じ込めは、操作された生物が確実に完全に制御された状態のままであるようにするために、生物に対する物理的障壁と遺伝子組換えの両方を含む実験室に病原性の遺伝子組換え生物を入れるために使用される一連の戦略である。生物学的封じ込めは、遺伝子組換え生物の意図しない増殖を防ぐために幅広い種類の医療、農業、研究および合成生物学の活動において必要である。
遺伝子の生物学的封じ込め戦略は、一般に栄養要求性変異の形成または誘導性致死に集中する。従来のアプローチには、環境条件の変化で除去され得る、温度またはｐＨまたは浸透圧感受性変異体などの条件変異体の使用が挙げられる。同様に、代謝性の生物学的封じ込め戦略は、操作された微生物を生かしておくのにアミノ酸などの特定の栄養素の補充を頼る単一細胞代謝機構の変異に依存する。誘導性致死のその他のアプローチには、自殺遺伝子または毒素に基づく細菌のプラスミドの挿入が含まれる。
しかし、課せられた遺伝的障壁機構は自発的突然変異誘発、遺伝子水平伝播または代謝欠損を克服するための環境的に利用可能な化合物の捕集によって回避されることができるため、既存の遺伝子の生物学的封じ込め方法は、多くの場合効果的ではない。
その上、現在の遺伝子封じ込めアプローチは冗長性がないので、単一の変異からの逸出変異体の出現頻度が生物に遺伝的障壁を設けて生物が不十分な環境に入ることを防ぐ。さらに、毒素遺伝子は漏出性である可能性があり、生物の適応度を下げ、それらを産業上の利用または研究環境には不十分にする可能性がある。
そのため、天然の生態系でのそのような生物の意図されない増殖および改変された病原生物への公衆の曝露を防ぐためのより効果的なアプローチを開発する差し迫った必要性が残っている。本発明の技術は、これらの需要を満たし、一般に当技術分野の改善である。
本発明の技術は、少なくとも１つの特定のリガンド分子にその生存能力を頼るように操作された、リガンド依存性合成栄養要求生物を提供する。必須遺伝子にリガンド依存性を生じさせると、生き残るためにそのリガンドを必要とする生物となる。これは、合成栄養要求体を開発するための単純なアプローチである。これらの生物は、大きいＤＮＡライブラリーから新しい酵素活性を特定するためのバイオセンサとして使用されるかもしれない。それらはまた、遺伝子組換え生物を実験室または工業的規模の系に閉じ込めることによって生物学的封じ込め戦略で使用することもできる。生物学的封じ込めのこの固有の形態も、バイオレメディエーション、環境モニタリング、または細胞治療用途への操作された生物の配置を可能にすることがある。
従来の代謝栄養要求体は、一般に、アミノ酸が外因的に供給されなければならないように、遺伝子を欠失させるかまたはノックアウトして、アミノ酸またはその他の代謝産物を生成する生物の能力を除去することによって作製される。これは、生物の代謝の中に既に存在する化学物質の組に限定される遺伝子系レベルの改変である。
しかし、栄養要求体を作製するために遺伝子を欠失させるかまたはノックアウトする代わりに、本発明の技術は、タンパク質などの必須遺伝子産物を、必須遺伝子の機能のアロステリック制御を本質的にもたらすリガンド依存性に改変する。栄養要求性を遺伝子系レベルで改変する代わりに、本発明の技術は、生物の代謝の自然の部分でない、ベンゾチアゾールなどの一部の分子で必須遺伝子産物の機能依存を生じるタンパク質工学的アプローチをとる。
改変は、通常タンパク質レベルであるが、リガンド依存性は遺伝子系レベルで現れる。従って、この方法は代謝遺伝子に限定されず、ＤＮＡ複製または一部のその他の重要な細胞プロセスのようなはるかに多くの生命維持に必要なことを標的にすることができるので、合成栄養要求体の生成は、異なっていて優れている。
この方法は、生物によって回避され得る生物および系の自然の代謝の一部である分子の使用に限られない。むしろ、新しいリガンド依存性代謝または細胞機能要件が１または複数の必須遺伝子に課され得る。リガンドを除去すると、細胞死をもたらすか、あるいは成長またはその他の特定のリガンド依存性細胞活性を失うことになる。
必須遺伝子へのリガンド依存性制御の操作された合成栄養要求体を生成するために、必須遺伝子変異体ライブラリーが作製される。操作された生物の生存能力は、その必須遺伝子の適切な機能に左右される。必須遺伝子の変異体ライブラリーは、結果として、変異必須遺伝子の機能にその成長が結び付けられる一組の生物をもたらす。リガンド依存性タンパク質機能は必須遺伝子ライブラリーから特定することができるので、多くのリガンド依存性表現型を含む大きいコンビナトリアルライブラリーが作製される。必須遺伝子変異体のライブラリーは、好ましくは、以下のいずれかを個別にまたは組み合わせて使用して作製される：１）必須遺伝子のオープンリーディングフレーム上のランダムまたは標的突然変異誘発、例えば；２）Ｎ、Ｃ、またはリガンド結合ドメインと必須遺伝子の挿入融合体の使用；あるいは３）必須遺伝子機能を変更するためのリガンド依存性インテインスプライシングの使用／操作。
生成された未処理の必須遺伝子ライブラリーは、３つの基本的な表現型、つまり機能性必須遺伝子をもつ生存可能な変異株、非機能性必須遺伝子をもつ致死性変異株、およびリガンド依存性必須遺伝子をもつリガンド依存性変異株、をもつ生物を含む。
リガンド依存性株を分離するために、必須遺伝子ライブラリーは、化学的に補完される成長に基づく正の選択と負の選択からなる二重選択を通ることが好ましい。次に、二重選択の生存株を増殖させた後、所望の表現型について選別することができる。
関与する必須遺伝子の数だけ減少した例外的に低い逸出頻度を提示する、単一のリガンドに依存するいくつかの必須遺伝子をもつ合成栄養要求体を設計することができる。その上、２以上の異なるリガンドに依存するリガンド依存性合成栄養要求体も設計することができる。既存の代謝栄養要求体、例えば温度依存性またはアミノ酸依存性生物も、リガンド依存性に操作して生物全体の並行制御を得ることができる。
この技術の１態様によれば、必須遺伝子の機能または成長がリガンドの存在によって制御される、１または複数のリガンド依存性必須遺伝子をもつ合成栄養要求体が提供される。
この技術の別の態様は、必須遺伝子産物のリガンド依存性機能が、必須遺伝子のＯＲＦでの一連の変異の結果であり、結果として必須遺伝子産物の変異リガンド依存性機能をもたらす、合成栄養要求体を産生する方法を提供することである。
この技術の別の態様は、必須遺伝子産物のリガンド依存性機能が、Ｎ末端もしくはＣ末端で融合されるかまたは必須遺伝子産物に挿入される、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の結果であり、該リガンド結合ドメインが必須遺伝子産物の機能を制御することができる、合成栄養要求体を産生する方法を提供することである。
この技術のさらなる態様は、スプライシングされていない融合タンパク質は不活性であるが、リガンドに媒介されるインテインスプライシングによって機能性タンパク質が産生されるような、必須遺伝子産物のリガンド依存性機能が、必須遺伝子に挿入されたリガンド依存性インテインの結果である、合成栄養要求体を産生する方法を提供することである。
この技術の別の態様は、正および／または負の選択を使用して（利用できる場合）、合成栄養要求体を特定する、合成栄養要求体を産生する方法を提供することである。
この技術の別の態様は、偶発的に放出されても環境に危険でない遺伝子改変生物を提供することである。それは、必須遺伝子が、天然起源でないかまたは通常は環境で利用できないリガンドによって、生存または成長のために「オンにされる」必要があるためである。
本明細書に記載される技術のさらなる態様は、本明細書の以下の部分で明らかになり、該発明を実施するための形態は、本技術の好ましい実施形態を制限を置くことなく十分に開示するためのものである。
本明細書に記載される技術は、説明のためだけの以下の図面を参照することによりさらに十分に理解されるであろう。
本技術の一実施形態によるリガンド依存性合成栄養要求体を産生するための方法の機能流れ図を示す図である。 本技術の一実施形態による、正および負の選別を含むリガンド依存性合成栄養要求体を産生するための方法の機能流れ図を示す図である。 一作製方法に従ってリガンド依存性細菌を抗生物質で選別するための正および負の選択ステップを示すプロセス模式図を示す図である。 作製方法のもう一つの実施形態に従ってリガンド依存性細菌を選別するための正および負の選択ステップを示すプロセス模式図を示す図である。 動物における本技術のバイオセーフティー用途の略図を示す図である。
説明のために、図面をより詳しく参照すると、本方法の実施形態および結果として得られる構造が概ね示される。本技術のいくつかの実施形態は、合成栄養要求体および作製方法を説明するために図１Ａ～図５に概ね説明される。本方法は具体的なステップおよび配列に関して変動することがあり、装置は構造の細部に関して本明細書に開示される基本概念から逸脱することなく変動することが当然理解される。この方法ステップは、これらのステップが行われうる順番の単なる例である。ステップは、それがなお特許請求される技術の目的を遂行するように、望ましい任意の順序で行われることがある。
ここで図１を見ると、本技術による少なくとも１つのリガンド依存性必須遺伝子をもつ合成栄養要求体を操作するための方法１０の好ましい一実施形態が、一方法を説明するために示される。図１のブロック２０では、生物または生体系が選択される。本方法によって産生されることのできる合成栄養要求体は、本質的に任意の適した生物または生体系に基づき得る。例えば、放線菌門、バクテロイデス門、シアノバクテリア、ファーミキューテス門、プロテオバクテリアなどの細菌を使用することができる。これらの生物に合成栄養要求性を課すには複数の経路がある。
本方法はまた、ヒト共生微生物、植物共生微生物および動物共生微生物などの共生生物と使用することができる。単細胞真核生物（例えば、酵母、免疫細胞、幹細胞、原生生物）および多細胞真核生物（例えば、動物、植物、真菌類）も図１のブロック２０で選択され得る。非生存生体系（すなわち、ウイルス、診断用試薬）ならびに操作されたプロバイオティクス、およびその他の治療用生物も選択され得る。
ブロック２０で選択された生物の必須遺伝子または遺伝子産物は、図１のブロック３０での操作に関して特定される。この選択は、一般に細胞増殖、生命力または特定の細胞機能に必須の遺伝子を特定する。
制御スキームおよび適したリガンドは、ブロック３０で決定された標的必須遺伝子についてブロック４０で決定される。例えば、リガンド依存性必須遺伝子を作製するためにリガンド結合ドメインに必須遺伝子を挿入または融合させることは、選択できる１つのアプローチである。ここでは以前に特定された相同体を使用して新しい生物の新規な変異体の開発を導くことができる。
別の生成方法は、標的生物の必須遺伝子に挿入されるリガンド依存性インテインの生成である。このリガンドが存在すると、スプライシングが行われ、必須遺伝子は機能性である。このリガンドが存在しないと、スプライシングは行われず、必須遺伝子は機能性でない。高等生物には選択スキームがないため、リガンド結合ドメインの挿入／融合またはリガンド依存性インテインのスプライシングが、これらの生物においてリガンド依存性必須遺伝子を生成する最も効果的な手段であり得る。
リガンド依存性制御モジュールの機能は、他の真核生物の必須遺伝子の構造に導かれる改変の情報を生成するために酵母でも試験され得る（すなわち、酵母の必須遺伝子ｄｎａＮに融合されたＬＢＤによって合成栄養要求体を作製することができるのであれば、等生物間（および特に必須遺伝子間）の高度の構造的相同性を考慮すれば、同じＬＢＤとヒト免疫Ｔ細胞の必須遺伝子ｄｎａＮによる同様の融合が、合成栄養要求体を生じる可能性が高い）。
ブロック４０で特定されるリガンドは、生物、必須遺伝子および選択される制御スキームに影響される。しかし、ブロック４０で選択され得るリガンドには多くの種類がある。例えば、リガンド依存性必須遺伝子（上記の構造のいずれかに基づく）は、通常安全と認識されるか、または別の場合には人間の消費に安全であると考えられる分子（人工甘味料、香料、食品成分、防腐剤、安定剤など）などのリガンドによって制御されることがあり得る。
同様に、市販薬、処方薬、または不法麻薬分子（例えば、イブプロフェン、アセトアミノフェン、バリウム、オキシコンチン（ｏｘｙｃｏｔｉｎ）、モルヒネ、コカイン、ヘロイン）も候補であり得る。汎用化学製品または特殊化学品（プラスチック前駆体、駆除剤、爆薬、香料、芳香剤、染料、燃料、肥料など）が使用され得る。
その上、小型のペプチドまたはペプチド様分子、例えばホルモン、生物学的製剤ならびに大型のタンパク質（すなわち、抗体、疾患マーカー、アレルゲンなど）が使用可能である。
ブロック４０で選択される相補リガンドおよび制御スキームは、外因的に供給されることができる（すなわち、関連する生物が意図された課題を遂行することができるように、成長条件にリガンドを意図的に付加することによって生物を生かしておく場合）。もう一つの実施形態では、相補リガンドスキームは、リガンドは内因的に提供される。
図１のブロック５０で、必須遺伝子は合成栄養要求性を課すために選択された薬物適用スキームを使用して改変されてリガンド依存性必須遺伝子（すなわち、リガンド依存性インテインなど）となる。
ブロック５０で産生された栄養要求体は、ブロック６０で分離および分類されて、使用される。例えば、分離された生物は、相補リガンドを産生する酵素をコードする遺伝物質を擁する場合にだけ生き残るように設計されてよい。酵素変異体のライブラリーは、合成栄養要求体に形質転換されることができたが、相補リガンドを形成する酵素だけが生き残る。様々な有用な小分子を必要とするリガンド依存性必須遺伝子を作製することによって、合成栄養要求体は新規な酵素化学を生成するための強力なバイオセンシングおよび選択ツールであり得る。
もう一つの実施形態では、生物は、リガンド依存性必須遺伝子と特異的に相互作用してそれらを活性化する球状タンパク質をコードする遺伝物質を擁する場合だけ生き残るように設計されることができる。これには大概ドメインに基づくアプローチがリガンド依存性必須遺伝子に使用される。ここで特定されるタンパク質ドメインは、その後、異なる用途（すなわち、診断、生物学的製剤）に使用されることになる。
選択が利用可能で必要である場合（ライブラリーサイズに応じて）、ブロック６０で用いてライブラリーサイズを縮小することができる。そうでなければ、レプリカ平板法（相補リガンドをもつ変異体と相補リガンドをもたない変異体の個々の成長を調査すること）によってリガンド依存性の成長について個々の変異体を直接選別することができる。その他の選別には、自動コロニーピッキング、それに続いてレプリカスポッティングおよびディープシークエンシングが含まれる。この例ではライブラリーをリガンドとともに、そしてリガンドを含まずに成長させた後、ディープシークエンシングを使用して異なる成長条件の各ライブラリーメンバーの発生頻度を計数する。
単一の必須遺伝子の単一のリガンド依存が図１に示されるが、複数のリガンド依存性必須遺伝子を使用してリガンド依存性の強さを高めることができる。例えば、複数のリガンド依存性必須遺伝子を組み合わせると合成栄養要求性の進化安定性を劇的に改善することができることが示されている。複数のリガンド依存性は、逸出頻度の乗法的減少を有するように思われる。言い換えれば、リガンド依存性必須遺伝子ＡおよびＢがともに１Ｅ－６の個々の逸出頻度を有する場合、ＡおよびＢのリガンド依存型を擁する生物は、１Ｅ－６*１Ｅ－６＝１Ｅ－１２の逸出頻度を有するはずである。
複数のリガンドに依存する系も同様に設計することができる。同じ相補リガンドを必要とする数個のリガンド依存性必須遺伝子をもつ合成栄養要求体を設計することに加えて、「パスワード」アプリケーションが望ましい場合には異なる相補リガンドを必要とする異なるリガンド依存性必須遺伝子を使用することもでき得る。これらの操作された生物が生き残るかまたは何らかの細胞活性を生成するには２以上のリガンドが必要である。
ここで図２～図４を参照すると、１または複数のリガンド依存性必須遺伝子に基づいて合成栄養要求体を操作するための方法７０の一実施形態が概略的に示される。図２のブロック８０で、必須遺伝子変異体のライブラリーが構築される。必須遺伝子変異体ライブラリーは、多様な方法で調製することができる。例えば、ブロック９０でランダムまたは標的突然変異誘発を使用して必須遺伝子変異体ライブラリーを生成することができる。ランダム突然変異誘発は、エラープローンＰＣＲ、ＵＶ突然変異誘発、化学突然変異誘発、突然変異誘発株、または任意の種類のランダム変異を導入する任意のその他の方法を用いて生成することができる。同様に、標的化された突然変異誘発は、リコンビニアリング、多重自動ゲノム工学（ＭＡＧＥ）、酵素逆転ポリメラーゼ連鎖反応（ＥＩＰＣＲ）、重複伸長による遺伝子スプライシング（ＳＯＥＩＮＧ）および同類のものなどの任意の標的化突然変異誘発戦略を使用する、１または複数の特定のアミノ酸残基の完全または部分飽和突然変異誘発である。突然変異誘発の特異的アプローチは実施例１にも見出すことができる。一実施形態では、変異体は、必須遺伝子のＯＲＦに一連の変異を有し、結果として必須遺伝子産物の変異リガンド依存性機能をもたらす。もう一つの実施形態では、変異アミノ酸修飾はリガンド依存性機能を与える。
必須遺伝子変異体ライブラリーは、ブロック１００で必須遺伝子産物に挿入されるかまたはＮ末端もしくはＣ末端で融合されたリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を用いてブロック８０で生成することもでき、リガンド結合ドメインは必須遺伝子産物の機能を制御することができる。多様性は、リンカー、挿入部位の選択およびリガンド結合ドメインの選択に導入される。リガンド結合ドメインは、アロステリック制御剤などの単一の実体であり得るかまたは一実施形態では２－ハイブリッド再構成などの多量体の実体であり得る。
このことは、ブロック１００でリガンド結合ドメインと必須遺伝子を変異によって融合させることにより達成することもできる。そのようなリガンド結合ドメインの例は、ステロイドホルモン受容体（例えば、エストロゲン受容体）、糖結合タンパク質（例えば、マルトース結合タンパク質）、操作されたアロステリックドメイン（例えば、ＵｎｉＲａｐＲ、ＦＫＢＰ１２とＦＲＢの置換融合（ｐｅｒｍｕｔｅｄ ｆｕｓｉｏｎ））となる。
必須遺伝子とリガンド結合ドメインとの間のリンカーライブラリーは、通常、リガンド結合ドメインのリガンド結合活性を必須遺伝子産物の機能の制御と効果的に結び付けるために必要である。
必須遺伝子ライブラリーは、標的必須遺伝子のＷＴコピーの置換によってゲノムに直接組み込むことができ、あるいはそれは標的必須遺伝子のゲノムコピーの活性を除去する方法（例えば、制限的な温度で成長した温度感受性変異体、ＣＲＩＳＰＲ－Ｄｃａｓ９に媒介される発現ノックダウン、ｃｒｅ－ｌｏｘ除去）とともに宿主細胞に形質転換することができる。
ライブラリーは、許容条件で（ＬＢＤの標的リガンドの存在下で）成長させなければならない。選択が利用可能で必要である場合（ライブラリーサイズに応じて）、選択を用いてライブラリーサイズを縮小することができる。そうでなければ、レプリカ平板法（相補リガンドをもつ変異体と相補リガンドをもたない変異体の個々の成長を調査すること）によってリガンド依存性の成長について個々の変異体を直接選別することができる。
また、必須遺伝子変異体のライブラリーは、ブロック１１０での必須遺伝子機能を変えるためのリガンド依存性インテインスプライシングによってブロック８０で生成することもできる。一実施形態では、ランダムまたは標的化突然変異誘発を使用することによってインテインと必須遺伝子との間のリンカー接合部、必須遺伝子中のインテインの挿入部位、またはインテイン配列自体に多様性が導入される。インテインは、全インテイン、分割インテイン、またはその他のドメインとの融合（すなわち、リガンド結合ドメイン）として使用することができる。
例えば、野生型インテインは、必須遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に挿入することができる。インテインが自動的にそれ自体を切り出すので、この挿入は生物の表現型に影響を及ぼさない。しかし、挿入部位を特定するために、インテインの活性型と不活性型の両方を必須遺伝子の候補スプライシング部位に挿入しなければならない。活性インテインが成長を許容し、不活性インテインが（必須遺伝子機能を消失することにより）成長を妨げる挿入部位を、結果として合成栄養要求性をもたらすであろうリガンド依存性インテインの挿入部位として使用することができる。それらはリガンド依存性インテインを新規に操作するためにも使用することができる。
次に、構成的スプライシングインテイン（必須遺伝子に含まれる）は、標的化突然変異誘発、ランダム突然変異誘発またはリガンド結合ドメインの挿入によって、突然変異誘発のために調製される。結果として得られるインテインライブラリーは、生物のゲノムに直接組み込まれる（必須遺伝子のＷＴコピーを置換する）か、あるいは、必須遺伝子インテインライブラリーがプラスミド上にある場合は、それは、関連する必須遺伝子のゲノムコピーが条件変異体（すなわち、温度感受性）であり、形質転換細胞が制限的な温度で成長したために生存能力がプラスミドにコードされる表現型に依存する株に形質転換される。結果として得られる、変異インテインを擁する必須遺伝子のライブラリーは、ライブラリーに存在するどんなリガンド依存性インテインの成長も許容する標的相補リガンドの存在下で成長する。
選択が利用できる場合、それを使用してライブラリーの多様性を必要に応じて減少させることができる。選別は、前述の通り実施される。要するに、個々のライブラリーメンバーの成長を、相補リガンドの存在下または相補リガンドの不在下で検定する。
ひとたび強いリガンド依存性インテインが生成されれば、それはそれらの状況非依存性のためにどんな生物においても合成栄養要求性を生成するための理想的なモジュールである。細菌で生成されるリガンド依存性インテインは、性能の改善のためにそれらの生物の必須遺伝子または複数の必須遺伝子にリガンド依存性インテインを挿入することのほかはほとんど改変せずに、植物、動物、または真菌類に基づく合成栄養要求体を生成するために使用することができる。
これはおそらく新興感染症の新しい生ワクチンを作製する最も簡単で、最も速く最も安価な方法である。新しい病原体のいくつかの分離菌を獲得し、複数のリガンド依存性インテインを複数の必須遺伝子（微生物の場合）または全遺伝子（ウイルスの場合）に挿入し、病原体の合成栄養要求体型を使用して患者に接種する。リガンドを抑えることにより、インテインスプライシングが阻止され、免疫応答が生じた後に病原体が迅速に除去される。
診断標的に応答するように操作されたリガンド依存性インテインは、比色出力を媒介する酵素に非常に容易に挿入して、化学検出試薬を作製することができる（すなわち、１０ｎＭグルコースの存在下でスプライシングするインテインをアルカリホスファターゼ酵素に挿入して、グルコースの存在に依存する比色活性を生成することができる）。
生物の生存能力は、その必須遺伝子の適切な機能に左右される。必須遺伝子の変異体ライブラリーは、結果として、変異必須遺伝子の機能にその成長が結び付けられる一組の生物をもたらす。
図２のブロック８０で調製された必須遺伝子ライブラリーは、次に選択および選別に付される。ブロック８０で調製された未処理の必須遺伝子ライブラリーは、３つの基本的な表現型、つまり機能性必須遺伝子をもつ生存可能な変異株、非機能性必須遺伝子をもつ致死性変異株、およびリガンド依存性必須遺伝子をもつリガンド依存性変異株をもつ生物を含む。望ましいリガンド依存性株を分離するために、必須遺伝子ライブラリーは、ブロック１２０での化学的に補完される成長に基づく正の選択とブロック１３０での負の選択からなる二重選択を通ることが好ましい。二重選択の生存株をブロック１４０での２回目の正の選択によって増やした後、ブロック１５０で望ましい表現型について選別する。
正および／または負の選択ステップを使用して（利用できる場合）、合成栄養要求体を特定する。最初の正の選択１２０のステップと随意の２回目の正の選択１４０のステップは、標的リガンドが存在するように成長／生存能力が変異誘発された必須遺伝子の機能に依存する条件で変異体ライブラリーを成長させることによって実施される。致死性の必須遺伝子変異体は増殖することができないので、ブロック１２０で成長する能力により、ライブラリー由来の致死性変異体が除去される。生存可能な必須遺伝子変異体およびリガンド依存性必須遺伝子変異体は、標的リガンドに補完されて、ブロック１２０の正の選択段階で増殖することができる。
生物は、ブロック１２０で変異必須遺伝子に成長／生存能力を様々な方法で頼ることを強いられ得る。例えば、変異誘発された必須遺伝子のプラスミド媒介性のライブラリーは、関連する必須遺伝子の温度感受性型を擁する細胞に形質転換されることができる。必須遺伝子のどんなその他の条件変異体でも十分であろう（転写調節、組換え、リガンド依存性など）。次に、形質転換細胞をゲノム変異体に制限的な条件（すなわち、高温）およびリガンド依存性必須遺伝子に望ましい許容条件（すなわち、相補性を媒介する標的小分子）で成長させる。
ブロック１３０で負の選択を実施して、成長にリガンドを必要としない構成的な成長細胞を除去する。ブロック１３０での負の選択は、好ましくは相補リガンドの不在下で、かつ成長細胞が除去される条件（すなわち、成長依存性の溶解／死滅が起こる条件）下で生存株のライブラリーを成長させる。例えば、これには、βラクタム抗生物質（すなわち、ペニシリン技術）または一部の類似する負の選択系の追加が含まれてよい。
ブロック１２０および１３０での正および負の選択は、望ましい表現型を特定し濃縮するために必要に応じて循環させることができる。ブロック１５０で選別を用いて合成栄養要求体を特定する。
図２の方法は、異なる正および負の選択スキームに適合させることができる。これは図３および図４に例示され得る。図３に概略的に示される実施形態１６０は、βラクタム抗生物質（すなわち、ペニシリン）に基づいて活発に分裂する細胞を選択的に死滅させる、負の選択成長に基づく作用機序を用いる。調製された未処理の必須遺伝子ライブラリー１７０は、機能性必須遺伝子をもつ生存可能な変異株（白色）、非機能性必須遺伝子をもつ致死性変異株（黒色）、およびリガンド依存性必須遺伝子をもつリガンド依存性変異株（網掛け）の生物を含む。最初の正の選択１８０では、標的リガンドが増殖培地に存在する。
致死性変異体（黒色）は、非機能性必須遺伝子のために、または相補性を媒介するかもしれない分子が標的リガンドプールに含まれなかったために増殖することができない。
次に、２種類の生存株１９０に、標的リガンドの不在下で、かつ活発に分裂する細胞を選択的に死滅させるペニシリンの存在下で負の選択２００を受けさせる。相補標的リガンドの不在下で、リガンド依存性株は成長せず、ペニシリンの存在によっても無傷である。制限的条件２００で成長することのできる生存可能な変異体は、ペニシリンの抗生物質活性によって死滅する。
随意の２回目の正の選択２２０が実施される。負の選択２００の生存株２１０は、生物の数を増やすために相補標的リガンドを含む非制限的成長条件に移される。合成栄養要求体２３０が次に選別される。
図４に概略的に示される代わりとなる実施形態２４０では、調製された未処理の必須遺伝子ライブラリー２５０は、機能性必須遺伝子をもつ生存可能な変異株（白色）、非機能性必須遺伝子をもつ致死性変異株（黒色）、およびリガンド依存性必須遺伝子をもつリガンド依存性変異株（網掛け）のｄａｐＤ ＫＯ生物を含む。この例では、ＤＡＰはＤＡＰ ＫＯ生物を救う。
この初期ライブラリーを、正の選択２６０で相補リガンドおよびＤＡＰの存在下で成長させる。致死性変異体は除去され、生存可能な変異体の生存株２７０および合成栄養要求体が収集される。次に、生存株２７０に、標的リガンドまたはＤＡＰを含まない負の選択２８０条件を受けさせる。負の選択２８０の制限的な成長条件では、ＤＡＰを含まない成長は、結果として生存可能な変異体を除去するｄａｐＤ遺伝子を欠く成長細胞の溶解をもたらす。リガンド依存性合成栄養要求体は、相補リガンドの不在下で成長しない。
負の選択２８０の生存株２９０は、正の成長条件を含む２回目の正の選択３００によって随意に増やすことができ、生存株３１０はその後収集され、選別される。正および負の選択は、繰り返すこともできる。
選別されたリガンド依存性合成栄養要求体は、いくつかの異なる用途のために設計され、組み込まれることができる。例えば、合成栄養要求体を標的小分子に応答するように開発する代謝工学ツールとして収集した株を使用することができる。一実施形態では、このツールは、大きい酵素ライブラリーから標的リガンド（すなわち、合成栄養要求体を補完するリガンド）を生成する新規な酵素変異体を特定するための生死選択株を利用することができる。
同様に、本方法は、標的小分子のための所与代謝経路の生成を最適化する選択株を産生することができる。
もう一つの実施形態では、新規な転写因子、操作された代謝経路のフィードバック回路または試験管内診断試薬を作出するために、本方法を用いて、標的小分子に応答するように操作されたリガンド結合ドメインによって必須遺伝子が制御され、操作されたリガンド結合ドメインがその他のタンパク質に融合されて小分子制御を課すタンパク質スイッチ工学ツールを得ることができる。
リガンド依存性必須遺伝子をもつ合成栄養要求体のおそらく最も重要な使用は、バイオセーフティー戦略および技術としての使用である。例えば、合成栄養要求生物は、相補リガンドを抑えることによって除去され得る。
リガンド依存性合成栄養要求体の成長、生存能力、および機能は、相補リガンドが供給される時間および空間に制限され得る。この制御は、治療用生物／生体系、例えば操作された免疫細胞、腫瘍溶解性ウイルス、ファージ療法、操作されたプロバイオティクス（すなわち、腸共生生物）、遺伝子治療、生ワクチンおよび遺伝子送達ベクターなどのように、どんな使用をも目的とする操作された生物／生体系への制御および封じ込めを改善するためのバイオセーフティー戦略として使用することができる。
例えば、リガンド依存性必須遺伝子による治療は、図５に示される治療または研究系に含まれることができるように組み立てることができる。図５に示される系３２０は、リガンド依存性必須遺伝子を含む、生きている治療薬（ｌｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）３３０を提供する。
生きている治療薬３３０および活性化リガンド３４０を被験体マウス３５０に与える。治療３６０は有効であり、生きている治療薬は、活性化リガンド３４０が被験体に供給される場合だけマウスにおいて機能する。被験体３５０において確立される活性化リガンド３４０の濃度は、治療用生物３３０の効力を等しく制御することができる。
これらの方法は、農業用生物および生体系、例えば生きている駆除剤（殺生物剤）、作物／家畜のマイクロビオーム産物、操作された植物または動物、作物／家畜の遺伝子送達ベクターなどでの使用ならびに産業用生物および生体系、例えば化学製品、バイオレメディエーションおよび操作された発酵物の生物学的生産などでの使用にも適合させることができる。
活性化リガンドの除去は、治療薬３７０の活性の終了をもたらすか、または治療薬３７０の死滅をもたらす。マウス３８０の内部または外部にある生きている治療薬が活性化リガンドを含まないと、治療用生物３７０の活性終了または死滅となる。死滅したかまたは不活性の治療用生物とは、マウス３９０の内部の生物のどんな治療活性または増殖も生成されないことを意味する。
本開示の技術は、説明だけを目的とし、本明細書に添付される特許請求の範囲に定義される本発明の技術の範囲をいかなる意味においても制限すると解釈されるべきではない添付の実施例を参照してよりよく理解されることができる。
合成栄養要求体の概念および操作方法を証明するために、大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）のバイオセーフティー株を、図２に概説される本発明の技術の方法を使用して生成し、試験した。５つの必須遺伝子をテストケースとして使用して、リガンド依存性必須遺伝子に基づく合成栄養要求体：ｐｈｅＳ、ｄｎａＮ、ｔｙｒＳ、ｍｅｔＧ、およびａｄｋを生成した。
リガンド依存性株を特定するために、大腸菌の生存能力に必要な必須遺伝子の候補リストを構築した。突然変異誘発のための残基を選択することができるように、このリストを解決された結晶構造をもつものに狭めた。変異を表面に近い領域に標的化したが、それでも疎水性コアの内部にあった。大きい疎水性残基の群を含む結晶構造の部分（例えばＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ｌｉｅ、Ｌｅｕ）を、次のように３つの異なる方法で標的突然変異誘発に付した。
第１のアプローチ（ｐｈｅＳおよびｄｎａＮに関する）では、中心の大きい疎水性残基がグリシンに変異し、一方周囲の残基が縮重コドンＮＮＫを用いて無作為化されるように突然変異誘発を標的化した。最初に、これらのライブラリーはプラスミドに基づき、許容温度でｐｈｅＳtsまたはｄｎａＮts温度感受性株に形質転換させた。選択、選別、および表現型分析のために、ライブラリーを制限的な温度で成長させた。この手法は、問題の条件的なゲノム必須遺伝子の機能を消失させ、プラスミド媒介性のライブラリーメンバーにコードされる表現型を明らかにする。その後、標的必須遺伝子のゲノムコピーのライブラリーを直接生成した。これにより、実験の複雑さが減り、温度感受性変異体を欠く必須遺伝子の操作が可能になった。
ｔｙｒＳおよびｍｅｔＧに適用される第２のアプローチでは、ライブラリーをゲノムについて生成し、同様の疎水性ドメインに標的化したが、７つのアミノ酸残基ウィンドウの中に当てはめるために、突然変異誘発は一次配列に限定した。これにより、単一の６０ｂｐのリコンビニアリングオリゴにゲノムを標的とする相同領域および変異原性ＮＮＫコドンを含めることができる。突然変異誘発の好ましい標的は、疎水性コアを通過するβ鎖であった。そのようなβ鎖では、あらゆるその他のアミノ酸は、通常、そのタンパク質の二次構造の中で同じ方向を示す。これらのβ鎖を、一組の４つのアミノ酸をβシートの片面または両面に無作為化することによって標的化した。
例えば、隣接するアミノ酸ストリップを無作為化することによって設計したゲノムライブラリーを、リコンビニアリングによってゲノムに直接統合した。縮重ライブラリーオリゴを用いて変異をゲノムに導入した。野生型ＤＮＡ配列に標的化された、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９に媒介される二重鎖切断を用いて、所望の遺伝子座で変異誘発された生物を濃縮した。形質転換させ、結果として得られる株のライブラリーをその後に選択および選別に付した。
ライブラリーは、６０ｂｐリコンビニアリングオリゴ（ライブラリーオリゴ）でコード化された。ライブラリーオリゴ（ｍｅｔＧライブラリーの４７８＿ＧＬＵ４５．１およびｔｙｒＳライブラリーの４７５＿ＬＥＵ３６．１）は、２１ｂｐの５’相同領域、２１ｂｐの縮重用ウィンドウ、および１８ｂｐの３’相同アームを含んだ。ライブラリーオリゴは、ライブラリーオリゴが相同である野生型配列に標的化されたｓｇＲＮＡをコードする、ヘルパープラスミド（ｂｇｇ４７２）を伴った。イブラリーオリゴおよびそのパートナーｓｇＲＮＡプラスミドを、λ－ｒｅｄ遺伝子をコードするｐＳＩＭ５とＣａｓ９をコードするＤＳ－ＳＰｃａｓを擁する、新しく調製した電気コンピテントＭＣ１０６１細胞に同時形質転換した。細胞を、２ＹＴで１時間回収した後、目的のリガンドまたはプールと、ＤＳ－ＳＰｃａｓを選択するための抗生物質（スペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌ最終濃度）およびｓｇＲＮＡプラスミド（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ最終濃度）を選択するための抗生物質を含有するＬＢ寒天プレートに広げた。このインキュベーションの間、相補化学物質の添加は随意であることが見出された。
第３のアプローチ（ａｄｋに関する）は、第２のアプローチに類似し、追加の設計パラメータは、操作される必須遺伝子の５’末端の６０ｂｐ内に突然変異誘発を強いる。単一のＰＣＲは（選択マーカー鋳型を使用して）ゲノム組込み断片を生成することができたので、このことがライブラリー作製を単純化にした。組込みカセットは、抗生物質マーカー、標的遺伝子の記録された５’配列（未熟な乗換えを防ぐため）、およびアミノ酸縮重からなった。３つの標的突然変異誘発方法論に加えて、ランダム突然変異誘発も、弱い初期のリガンド依存性表現型を改善する手段として調査された。エラープローンＰＣＲを使用して、定向進化実験に入ったリガンド依存性対立遺伝子のライブラリーを生成した。
一つの例示では、λ－ｒｅｄ組換えを用いてゲノムライブラリーを作製した。野生型対立遺伝子を変異体ライブラリーの対応する５’変異対立遺伝子に置き換えるため、組込み産物を生成した。組込み産物は、（５’から３’に向かって）５’ゲノムを標的とする相同領域、構成的プロモーターによって駆動する選択マーカー、基準ＲＢＳ、必須遺伝子の記録されたＤＮＡ（未熟な乗換えを介するライブラリー除去を防ぐため）、望ましい縮重、および最後に３’ゲノムを標的とする相同領域からなる（ノックイン断片用のｂｇｇ５２４を参照）。このＰＣＲ断片を、新しく調製した、ｐＳＩＭ５を擁する電気コンピテントＭＣ１０６１細胞に形質転換した。細胞を２ＹＴで１時間回収し（前のように、相補化学物質の添加は随意であることが見出された）、その後、目的の（１または複数の）化学物質と、ライブラリー組込みＰＣＲ断片の抗生物質マーカーを選択するためのスペクチノマイシンを含有するＬＢ寒天プレートで平板培養した。
次に、結果として得られるライブラリーを選択および選別に付した。ＯＲＦの記録がないことおよびＯＲＦの全部がノックイン断片に含められたことを除いて、この方法をノックインエラープローンＰＣＲライブラリーに使用した。エラープローンＰＣＲライブラリーは、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を製造業者の推奨に従って用いて生成した。
タンパク質工学は必要であったが、リガンド依存性株を生成するには十分ではなかった。相補分子も特定されなければならない。ライブラリーアプローチを、リガンド候補溶液のより大きい探索空間の調査を可能にするために使用した。化学物質のプールを使用してリガンド依存性株を見出す可能性を高めた。これは、２つの理由で行われた。第１に、どの化学物質が化学的相補性を媒介するかは事前に分からなかった。第２に、化学的相補性の可能な複数の分子が存在し、ライブラリーアプローチが異なるリガンドに応答する株の特定を可能にするという可能性があった。可能性のある相補化学物質の選択は、３つの実際的な判定基準：低コスト、低リスク（非爆発性、非燃焼性、および非発癌性）、および媒体溶解性、に基づいた。
大腸菌の約３００の必須遺伝子の中から、８個の必須遺伝子を合計１０ライブラリーで突然変異誘発について標的化した。これから、５個の必須遺伝子がリガンド依存性株を生じ、その各々１個の変異体を特徴づけた。リガンド依存性表現型がまれではなく、古典的な微生物遺伝学技術を用いて容易に生成することができることが結論付けられた。
図２および図３に概説される方法をさらに実証するために、調製した必須遺伝子ライブラリーを選択および選別に付した。ブロック８０で調製した未処理の必須遺伝子ライブラリーは、３つの基本的な表現型、つまり機能性必須遺伝子をもつ生存可能な変異株、非機能性必須遺伝子をもつ致死性変異株、およびリガンド依存性必須遺伝子をもつリガンド依存性変異株をもつ生物を含む。望ましいリガンド依存性株を分離するために、必須遺伝子ライブラリーは、化学的に補完される成長に基づく正の選択とペニシリン技術に基づく負の選択からなる二重選択に通された。二重選択の生存株は、所望の表現型について選別された。
正の選択１２０のために、変異誘発された必須遺伝子から得られる株のライブラリーを、４つの化学物質の存在下で成長させた。正の選択は、許容条件での生存能力に基づいた。許容条件は、１０００Ｘで（ｐｈｅＳ．ＧＬ２を生成するために）使用されるＤＭＳＯ中１Ｍベンゾチアゾールか、または、１００Ｘとして（全てのその他のＳＬｉＤＥ株を生成するために）ＤＭＳＯに溶解した５０ｍＭベンゾチアゾール、５０ｍＭインドール－３－酪酸、２５ｍＭインドール、および２５ｍＭ２－アミノベンゾチアゾールからなる小分子の混合物（化学物質プール）からなった。これらのリガンドをプールすることにより、エンジニアリングプロセスの効率が増加し、そのために一回の正の選択は複数の化学物質について実行することができた。
４つの化学物質プールの許容条件では、必須遺伝子ライブラリーの３つの基本的な表現型をそれらの成長の能力に基づいて選択することができた。致死性変異体は、壊れた必須遺伝子のために、または相補性を媒介したかもしれない分子が化学物質プールに含まれなかったために成長できなかった。生存可能な変異体は、化学物質の存在に関わらず成長した。リガンド依存性株は、図２のブロック１２０で化学物質プール中の分子の少なくとも１つによって化学的に補完されたので、許容条件で成長した。致死性変異体は生存可能でなかったので、必須遺伝子ライブラリーの表現型の構成は、３から２、つまり生存可能な株とリガンド依存性株に減少した。正の選択を生き残るライブラリーメンバーを、図２のブロック１３０の負の選択に付した。
この例でブロック１３０の負の選択は、ペニシリン技術に基づいた。この技法は、活発に分裂する細胞を選択的に死滅させるペニシリンの成長に基づく機構に頼る。この方法は、生存可能な変異体を除去するための負の選択として使用される。ペニシリン技術の適合において、１２０の正の選択を生き残ったライブラリーメンバーを、相補化学物質を含まない制限的な成長条件に移した。
手短に言えば、ライブラリーを培地に再懸濁し、１回洗浄して相補化学物質を除去し、相補化学物質を含まない１００ｍｌの単純２ＹＴ（制限的条件）に、１～５のＯＤ６００で再び植え付けた。表現型のずれを説明するために、細胞を１～２時間通気して３７℃で成長させた。ペニシリンを１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。細胞を５～４８時間の間成長させた。細胞を遠心分離によって回収し、２回洗浄し、選別のための望ましい相補化学物質を含有する大きいＬＢ寒天プレートに広げた。
相補リガンドの不在下で、リガンド依存性株は成長せず、ペニシリンによって傷を受けなかった。制限的条件で成長した生存可能な変異ライブラリーメンバーは、ペニシリンの抗生物質活性によって死滅した。
望ましいリガンド依存性株を濃縮するためにブロック１４０の２回目の正の選択を実施した。負の選択を生き残ったライブラリーメンバーを収集し、残留ペニシリンを洗い流し、相補化学物質を含有するＬＢ寒天プレートに細胞を広げた。得られるコロニーを、相補化学物質を含むおよび含まないＬＢ寒天プレートの上にレプリカスポッティングすることによって、ブロック１５０でリガンド依存性成長について選別した。化学物質の存在下でのみ成長した株をさらなる特徴づけに選んだ。
この例では、リガンド依存性株は、５つの必須遺伝子について生成した（ｐｈｅＳ、ｄｎａＮ、ｔｙｒＳ、ｍｅｔＧ、およびａｄｋ）。各々のリガンド依存性株は、標的必須遺伝子に３～７個の間の変異を有した（表１）。４つの小分子の混合物を用いてリガンド依存性株を生成した。結果として得られる各々の株を、各々の小分子について個別に試験した。最も乱雑な株、ｍｅｔＧ．ＧＬ１５は、４つ全てのリガンドによって補完された。その他の変異体は、２または３つのリガンドに応答した。その上、４つのリガンドのいずれかを欠く培地で逸出頻度を測定した。最大逸出頻度は、ａｄｋ．ＧＬ１の８×１０-4であり、一方、最小逸出頻度はｐｈｅＳ．ＧＬ２の３×１０-9であった。
リガンド依存性株ｐｈｅＳ．ＧＬ２を、標的化突然変異誘発とランダム突然変異誘発の両方を使用して定向進化手法から誘導した。リガンド依存性株ｐｈｅＳ．ＧＬ２は、リガンドを含まないＬＢ寒天プレートで成長せず、逸出頻度は３×１０-9であった。リガンド依存性株ｐｈｅＳ．ＧＬ２は、１ｍＭベンゾチアゾールおよび０．５ｍＭインドールによって強く補完された。２ラウンドのエラープローンＰＣＲを経たにもかかわらず、ｐｈｅＳ．ＧＬ２の変異は全て、野生型タンパク質（ＰＤＢ ３ＰＣ０）の結晶構造によれば約１５オングストロームの単一のストレッチの中に含まれた。全ての変異は、活性部位のＡＭＰ基質から１５～２５オングストローム内に位置した。
ｐｈｅＳ．ＧＬ２逸出変異体の配列解析は、第２部位抑制変異（ｓｅｃｏｎｄ－ｓｉｔｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を逸出の主なモードとして示唆した。配列決定した６つの逸出変異体のうち、５つの変異体がＱ１６９Ｈ、（基質から約１０オングストローム離れた活性部位残基）を含み、１つの変異体がＴ１６２Ｎ（ＡＭＰ残基から約２０オングストローム離れた近い活性部位残基）を含んだ（表２）。
リガンド依存性株ｔｙｒＳ．ＧＬ７およびｍｅｔＧ．ＧＬ１５を、１サイクルのタンパク質工学で２週間で生成した。これは、４つの疎水性コアアミノ酸の無作為化、二重選択、および選別からなった。リガンド依存性株ｔｙｒＳ．ＧＬ７は、ｐｈｅＳ．ＧＬ２と同等の逸出頻度を示した。この変異体は、２５０～１０００μΜの間のベンゾチアゾールで用量依存性の成長を示し、インドールによっても補完された。ｔｙｒＳおよびｍｅｔＧの野生型結晶構造の調査は、変異と酵素残基との間が近く接近していることを示す（ｔｙｒＳ．ＧＬ７について４～１０オングストローム、ｍｅｔＧ．ＧＬ１５について７～２０オングストローム）。単純化されたライブラリー設計アプローチは、リガンド依存性株を容易に生じることができ、４つの変異が適したリガンド依存性株を生成するのに十分であることが示された。
生成されたリガンド依存性株のリガンドに対する特異性を特徴づけるために、３０のさらなるリガンドのパネルによって全ての株を相補性がないか調査した。２つのリガンド（インドール－３－酢酸およびＬ－ヒスチジンメチルエステル）だけが、ｍｅｔＧ．ＧＬ１５を補完することが見出された。残りの２８のリガンドは、その他の分離されたリガンド依存性株において成長を生じなかった。
遺伝子改変生物の封じ込めのためのリガンド依存性表現型の有用性を実証するため、リガンド依存性（ＳＬｉＤＥ対立遺伝子）を２つ、その後に３つ、ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌に結合させた。複数のリガンド依存性対立遺伝子は、抑制変異のために逸出頻度を低下させるはずである。その上、これらの修飾のいくつかを単一の株に結合させることも、遺伝子水平伝播によって逸出を低下させるはずである。
２つのＳＬｉＤＥ対立遺伝子を、大腸菌の産業適関連株ＢＬ２１（ＤＥ３）に結合させることにより、逸出頻度が５×１０-10のバイオセーフティー株が作製され、３つのＳＬｉＤＥ対立遺伝子をＢＬ２１（ＤＥ３）に結合させた結果として、３×１０-11の検出限界を下回る逸出頻度がもたらされた。
特に、これまでに特定されたリガンド依存性株は、形質導入のためのＰ１ファージ溶菌液を生成するドナー細胞として使用された。あるいは、特定された変異を、Ｃａｓ９－リコンビニアリング方法論を用いて新しい宿主に再び組み込んだ。ＢＬ２１（ＤＥ３）は最初にＰＫＤ４６－ｃａｓ９（２５）で形質転換された後、ｔｙｒＳ．ＧＬ７変異をコードする変異原性オリゴならびにゲノムの野生型配列を標的化するｓｇＲＮＡ（ｂｇｇ５３９）を発現するヘルパープラスミドで形質転換された。ヘルパープラスミドを排除した後、ｔｎａＡをノックアウトするために、結果として得られる株をΔｔｎａＡ：ＦＲＴ－ｋａｎＲ－ＦＲＴカセットでＰ１形質導入した。
この株は、その後ｍｅｔＧ．ＧＬ１５のＦＲＴ－ＤＨＦＲ－ＦＲＴ上流を含有するＰ１溶菌液によって形質導入された。結果として得られる株をｐＦＬＰ２（ｍｅｔＧ．ＧＬ１５およびΔｔｎａＡに関連する抗生物質マーカーを除去するために）で形質転換し、カルベニシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）中で４時間増殖させ、その後１ｍＭベンゾチアゾールを含有し抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートに広げた。生存可能なコロニーを抗生物質マーカーのクリアランスで選別し、配列を関連する遺伝子座で確認した。この株を二重リガンド依存性株として使用した。
その後、二重リガンド依存性株を、ｋａｎＲタグの付いたｐｈｅＳ．ＧＬ２でＰ１－形質導入した。結果として得られるコロニーを、それらが３つ全てのリガンド依存性変異を擁しているか確かめるために配列決定した。これらの細胞は三重リガンド依存性株として使用された。
逸出頻度は、制限的条件（リガンド無しからなる）および許容条件（ベンゾチアゾール）のＬＢ寒天プレートに目的の株の（ｌｏｇ１０の増分の）段階希釈をスポットすることによって求めた。ＤＭＳＯを含有するプレートもスポットして、相補性がないことを溶媒によって確かめた。リガンド依存性株の逸出頻度は、タンパク質工学プロセスの間に連続的にモニターされた。得られたリガンド依存性株の逸出頻度を、再懸濁したコロニーに由来する４つの生物学的複製物を使用して、別々に２回または３回検定した。逸出頻度は、制限的条件での生存ＣＦＵを１ｍＭベンゾチアゾールでの生存ＣＦＵで除算することによって計算した。対数逸出頻度を使用して平均および標準偏差を計算した。
二重および三重リガンド依存性株に関して、一晩培養物を１ｍＭベンゾチアゾールを含有する２ＹＴ ３ｍｌに植え付けた。培養物を３０℃の２４ウェルブロックで軌道速度７５０ｒｐｍで成長させた。翌朝、培養物を１０％グリセロールで３回洗浄し、１．５ｍｌ １０％グリセロールに再懸濁した。これから、１ｍｌを相補ベンゾチアゾールを含まない２２０ｍｍ ＬＢ寒天選別プレートに広げた。次に、制限的条件で蒔いたＣＦＵを滴定するために、８桁に及ぶ各々の１０倍段階希釈から１０μｌを許容プレートにスポットした。全てのプレートを３７℃で一晩成長させた。二重および三重リガンド依存性株の株逸出頻度は、逸出変異体（制限的条件で生じるコロニー）を、許容条件の上にスポットされた段階希釈から計算される、蒔いた全ＣＦＵで除算することによって計算された。
この例では、２つのリガンド依存性対立遺伝子、ｔｙｒＳ．ＧＬ７（逸出頻度７×１０-8）およびｍｅｔＧ．ＧＬ１５（逸出頻度３×１０-4）を組み合わせて、１×１０8細胞あたり１逸出変異体というバイオセーフティー閾値を超える、逸出頻度が５×１０-10の二重リガンド依存性株を生成した。逸出頻度は最初の４日間で着実に増加することが観察され、ほぼ１０００倍増加して４×１０-7となった。４日目から１０日目まで、逸出頻度は１０倍増加して１×１０-6となった。二重リガンド依存性株は、マイクロプレートに基づく成長曲線実験で用量依存性成長を提示した。
逸出頻度をさらに低下させるために、ｐｈｅＳ．ＧＬ２をＰ１形質導入によって二重リガンド依存性株に移して、三重リガンド依存性株を生成した。三重リガンド依存性株の逸出頻度は、１日目および２日目に３×１０-11の検出限界よりも低下した。二重変異体と同様に、逸出頻度は実験期間にわたって増加し、１０日後に２×１０-7で安定した。三重リガンド依存性株も、液体培養で用量依存性成長を提示した。
必須遺伝子産物形成のリガンド依存性機能の代替実施形態を例示するため、リガンド結合ドメインが必須遺伝子産物の機能を制御することのできる必須遺伝子産物にリガンド結合ドメインを挿入し、融合させた。この例では、ｕｎｉＲａｐＲと呼ばれるリガンドに制御されるタンパク質立体構造スイッチを選択し、挿入した。
ｕｎｉＲａｐＲスイッチは、リガンドの周囲でラパマイシンをヘテロ二量体化するｆｋｂＰ１２とＦＲＢタンパク質ドメインの融合物である。ラパマイシンが存在しないと、ｕｎｉＲａｐＲは不安定である（熱容量がより高く、ｒｍｓｄ値がより高く、温度の関数としてのＣα原子間の距離がより大きく、リガンドに対するサブドメインの位置が異なる）。
ラパマイシンが存在すると、ｕｎｉＲａｐＲははるかに安定している（例えば、熱容量がより低く、ｒｍｓｄ値がより低く、温度の関数としてのＣα原子間の距離がより小さく、リガンドに対するサブドメインの位置がはるかに異なる）。ｕｎｉＲａｐＲスイッチドメインはタンパク質を制御するために使用することができる。
このｕｎｉＲａｐＲをこの例のリガンド依存性必須遺伝子を作製する手段として必須遺伝子に挿入した。ｕｎｉＲａｐＲスイッチは、それが標的遺伝子へのドメインの挿入を容易にするのに適した構造を有するという理由で選択された。ほかに選択されたものには、エストロゲン受容体およびマルトース結合タンパク質が含まれた。
この例では、ｕｎｉＲａｐＲスイッチを必須遺伝子ｄｎａＮに挿入した。ｄｎａＮ分子は、ＤＮＡの周囲に環または「クランプ」を形成するホモ二量体であり、全てのＤＮＡプロセシング酵素がはるかに高い処理能力を有することを可能にする。これはｕｎｉＲａｐＲに適した挿入部位を形成するループがいくつかあるという理由で選択され、４つの挿入部位が選択された。
構成的発現下で、野生型ｄｎａＮのプラスミド媒介性のコピーで出発し、ｕｎｉＲａｐＲドメインの上流および下流の３アミノ酸リンカーライブラリーによって４つの候補挿入部位にｕｎｉＲａｐＲドメインを挿入した。結果として得られるライブラリー（４つ全ての挿入部位とそれらのリンカーライブラリー）をプールし、タンパク質を温度感受性にするｄｎａＮのゲノムコピーの変異によって大腸菌株に形質転換させた（ゲノム由来のｄｎａＮタンパク質は、４２℃で非機能性であり、殺菌致死性である）。
形質転換細胞を４２℃（細菌がｕｎｉＲａｐＲ挿入を含むプラスミドコピーを頼るようにするためにゲノムコピーの致死性温度）で、ならびに（どんなラパマイシン依存性挿入融合ｄｎａＮ変異体の機能も相補するために）１０ｕＭラパマイシンを添加して成長させ、一晩成長させた。
翌日、生存株を収集し、残留するラパマイシンを一連の遠心分離およびＰＢＳで再懸濁のサイクルで除去した。残留するラパマイシンを除去すると、変異体ライブラリーを用いて２ＹＴ培地（１００ｍｌ）を含有するフラスコに植え付けてほぼＯＤ＝１とした。次に、培養物を制限的な温度の４２℃で１時間深層子ながら成長させた。ラパマイシンの不在下４２℃での成長は、どんなラパマイシン依存性変異体（望ましい株）もその成長を（ペニシリンＧ塩の添加の前に）止めるために死滅させることを意図した。
ペニシリンＧ塩を少なくとも１時間後にフラスコに添加した。ラパマイシンなしで４２℃で成長を続けている株を溶解したが、望ましい変異体は既に死滅しており（ｄｎａＮ変異体は殺菌性である）、無傷のままであった。
次に、負の選択を約７時間実施し、その後に培養物を遠心し、溶解した細胞残屑および死細胞（しかし無傷の細胞）を収集した。３サイクルのＰＢＳによる再懸濁および遠心分離を用いて、非リガンド依存性ｄｎａＮ変異体を擁していた溶解細胞からプラスミドＤＮＡを濾し取った。次に、死滅したが無傷の細胞からプラスミドＤＮＡを抽出するために、残りの材料をミニプレップした。
抽出したプラスミドＤＮＡを新鮮なｄｎａＮ温度感受性株に再び形質転換させ、ラパマイシンを添加したＬＢ寒天で４２℃で成長させた。翌日、コロニーを選び、ラパマイシンを含むまたは含まないＬＢ寒天プレートの上に再びスポットし、４２℃で成長させた。３日目、ラパマイシン依存性成長を示す変異体を特定した。ラパマイシンを含まずに成長したラパマイシン依存性変異体（透明なカラム）または２．５マイクロモルのラパマイシンとともに成長したラパマイシン依存性変異体（成長したカラム）の１０倍段階希釈の生物学的複製物を調製した。全ての成長は４２℃で行われた。
表現型を検証した、それは４２℃で１～１０ｕＭの間のラパマイシンで最大の活性をもつ用量依存性ラパマイシンの成長を提示した。その逸出頻度は約１Ｅ－５であった（これは実際には検出限界であり、性能はおそらく良好である）。変異体は、非特異的化学的相補性を試験するためにラパマイシンの代わりにインドールおよびベンゾチアゾールを含むプレートでも成長させた、適切なリガンドなしでは成長は検出されなかった。
その後、リガンド依存性スイッチＤＮＡを分離し、配列決定した。ｄｎａＮの１８５位に（ＧＬＹ１８５を置き換えて）ｕｎｉＲａｐＲ挿入を含むことが見出された。
必須遺伝子産物形成のリガンド依存性機能の代替実施形態を例示するために、スプライシングされていない融合タンパク質は不活性であるが、リガンドに媒介されるインテインスプライシングによって機能性タンパク質が産生されるように、リガンド依存性インテインを必須遺伝子に挿入した。
ＧＰ４１と呼ばれる分割インテインを選択し、入手した。次に、ＧＰ４１インテインを２つのインテインの半分をＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳリンカーで融合することによって大幅に改変した。ｉＦＫＢＰドメインを、下流の操作のための可能性のあるリガンド結合ドメインの選択肢としてそのＧＳリンカーの中央に挿入した。ｉＦＫＢＰ挿入のない野生型（ＷＴ）インテインも調製した。
Ｃ末端の触媒残基、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ（それらは全てインテインの機能に必須である）がＧｌｙに変異した、ＧＰ４１インテインの変異型も生成した。
ＷＴインテインとＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ変異体の両方が、ｐｈｅＳおよびｄｎａＮの様々な位置に挿入され、セリン残基を置き換えた。ＷＴＧＰ４１インテインはＣ末端セリンを後に残すので、結果として得られるスプライシングされたタンパク質はＷＴ型と区別がつかない。
機能性インテインがｐｈｅＳおよびｄｎａＮの挿入を伴う成長を許容する挿入部位の選別を実行した。三重Ｇｌｙ変異型は結果として死滅した。これは、必須遺伝子の中央の非スプライシングインテインが構造および機能を劇的に崩壊させたために観察された。
必須遺伝子は適切なインテインスプライシングのために機能性であったので、ｐｈｅＳおよびｄｎａＮの挿入部位は、機能性インテインが生存細胞となる場所に見出されたが、三重Ｇｌｙ変異体では結果として死滅した。インテインは３７℃および４２℃でよくスプライシングされると思われた。
次のステップは、リガンド依存性インテイン機能を操作することであった。これは、スプライシングがないとｄｎａＮ機能を除去することが分かっている挿入部位でｄｎａＮに変異して挿入されるｉＦＫＢＰドメインと融合したＧＰ４１（ＷＴのように分割されていない）とともに、ｄｎａＮをコードするプラスミドを使用することによって達成された。この変異体はよくスプライシングされるので、このｄｎａＮ－インテインプラスミドは、４２℃の制限的条件で成長させた場合にｄｎａＮ変異体の温度感受性ゲノムコピーの遺伝子機能を相補することができた。
次に、インテイン構造の露出表面と半分埋められた残基の組合せを標的化する多様な飽和突然変異誘発ライブラリーを、ｉＦＫＢＰドメインならびにｄｎａＮ配列を無視して設計した。結果として得られるプラスミドライブラリーを、次にｄｎａＮ温度感受性株（ゲノム上でのｄｎａＮ温度感受性）に形質転換した。結果として得られる形質転換体を、５つの化学物質：ラパマイシン、サッカリン、アセトアミノフェン、ラズベリーケトン、およびベンゾチアゾールを含有するＬＢ寒天プレート上で成長させた。これらの化学物質は、商業的に有用であるか、または望ましい表現型をもたらす可能性が高いかに基づいて選択された。前と同様に、ライブラリーを４２℃で成長させたので、株はｄｎａＮ－インテイン－ｉＦＫＢＰ融合タンパク質のプラスミド媒介性の変異誘発されたコピーに頼らなければならなくなった。
翌日、ライブラリーをこすり落とし、前に図２および図３で説明したように正確に実施したペニシリン技術対抗選択のための新鮮な培地に移した。負の選択の後、無傷の細胞をミニプレップし、ＤＮＡを新鮮な細胞に再び形質転換し、形質転換細胞を上に示したものと同じ化学物質で４２℃で成長させた。
翌日、コロニーを選び、１０倍段階希釈し、単純ＬＢ寒天プレートと、候補相補リガンドのプールを含有するＬＢ寒天プレートにスポットし、４２℃で成長させた（ｄｎａＮのプラスミド媒介性のコピーの表現型を明らかにするため）。
３日目に、表現型を調査し、相補リガンドの存在下で成長したものが、成長の利点をもたらすことが見出された。ベンゾチアゾールとともに成長したコロニーは、約２～５倍大きいことが（目視により）見出された。１０の分離変異体を配列決定し、これから、４つの変異体配列を特定した。全ての変異体が、ＬＹＳ７９ＬＥＵをインテインに（インテインＡＡ配列に関して）を有した。
特定された最初の４つのヒットを、エラープローンＰＣＲと、活性部位の近くのＣ末端のインテインドメインを標的化する、もう一巡の飽和突然変異誘発とによって突然変異誘発した。次に、同じライブラリーの作製、選択、および選別方法論を、リガンド依存性変異体のその他の例と同様に使用した。
本明細書に記載される説明から、本開示が、限定されるものではないが以下を含む複数の実施形態を包含することは理解される。
１．リガンド依存性必須遺伝子機能に基づいて合成栄養要求体を操作するための方法であって、前記方法が、
（ａ）生物において１または複数の必須遺伝子および必須遺伝子産物を特定することと、
（ｂ）１または複数のリガンドを選択することと、
（ｃ）少なくとも１つの必須遺伝子を修飾して必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を生じることと、
（ｄ）１または複数の変異したリガンド依存性必須遺伝子をもつ生物を負に選択すること
を含み、
（ｅ）必須遺伝子機能は前記リガンドの不在下では生じない
方法。
２．負の選択の生存生物を正に選択して、リガンド依存性必須遺伝子を有する生存生物の数を増やすことをさらに含む、前述したあらゆる態様の方法。
３．化学的相補性を用いて１または複数の変異リガンド依存性必須遺伝子をもつ生物を正に選択すること；および
抗生物質を用いて１または複数の変異リガンド依存性必須遺伝子をもつ生物を負に選択することをさらに含む、前述したあらゆる態様の方法。
４．必須遺伝子の前記組換えが、エラープローンＰＣＲ、ＵＶ突然変異誘発、化学突然変異誘発および突然変異誘発株からなる群から選択されるプロセスを用いて、必須遺伝子のオープンリーディングフレームのランダム突然変異誘発によって実施される、前述したあらゆる態様の方法。
５．必須遺伝子の前記組換えが、リコンビニアリング、多重自動ゲノム工学法（ＭＡＧＥ）、酵素逆転ポリメラーゼ連鎖反応（ＥＩＰＣＲ）および重複伸長による遺伝子スプライシング（ＳＯＥＩＮＧ）の群から選択されるプロセスを用いて、１または複数のアミノ酸についての必須遺伝子のオープンリーディングフレームの標的突然変異誘発によって実施される、前述したあらゆる態様の方法。
６．必須遺伝子の前記組換えが、前記必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を付与するリガンド結合ドメインのＮもしくはＣ末端融合である、前述したあらゆる態様の方法。
７．必須遺伝子の前記組換えが、前記必須遺伝子を機能化するためにリガンド依存性スプライシングを付与するリガンド依存性インテインドメインである、前述したあらゆる態様の方法。
８．第２の必須遺伝子を修飾して、第２のリガンドに応答して第２の必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を生じることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
９．前記２つのリガンド依存性必須遺伝子が、構造遺伝子、調節遺伝子およびシグナル伝達遺伝子の群から選択される遺伝子である、請求項８に記載の方法。
１０．リガンド依存性必須遺伝子機能に基づいて合成栄養要求体を操作するための方法であって、前記方法が
（ａ）生物において１または複数の必須遺伝子および必須遺伝子産物を特定することと、
（ｂ）必須遺伝子変異体のライブラリーを調製することと、
（ｃ）１または複数のリガンドを選択することと、
（ｄ）選択されたリガンドおよび正の成長条件の存在下で必須遺伝子変異体の前記ライブラリーで正の選択を実施することと、
（ｅ）負の成長条件で前記選択されたリガンドの不在下で必須遺伝子変異体の前記ライブラリーで負の選択を実施することと、
（ｆ）負の選択の生存株を収集すること、
を含み、
（ｇ）負の選択の前記負の成長条件が成長する生物を除去する
方法。
１１．負の選択の収集した生存株の正の選択を実施してリガンド依存性必須遺伝子を有する生存生物の数を増やすことと、
生物を望ましい表現型について選別すること
をさらに含む、前述したあらゆる態様の方法。
１２．必須遺伝子変異体の前記ライブラリーが、エラープローンＰＣＲ、ＵＶ突然変異誘発、化学突然変異誘発および突然変異誘発株からなる群から選択されるプロセスを用いて、必須遺伝子のオープンリーディングフレームのランダム突然変異誘発を使用して生成される、前述したあらゆる態様の方法。
１３．必須遺伝子変異体の前記ライブラリーが、リコンビニアリング、多重自動ゲノム工学法（ＭＡＧＥ）、酵素逆転ポリメラーゼ連鎖反応（ＥＩＰＣＲ）および重複伸長による遺伝子スプライシング（ＳＯＥＩＮＧ）の群から選択されるプロセスを用いて、１または複数のアミノ酸についての必須遺伝子のオープンリーディングフレームの標的突然変異誘発を使用して生成される、前述したあらゆる態様の方法。
１４．必須遺伝子変異体の前記ライブラリーが、前記必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を付与するリガンド結合ドメインのＮもしくはＣ末端融合を使用して生成される、前述したあらゆる態様の方法。
１５．前記融合リガンド結合ドメインが、リンカーをさらに含む、前述したあらゆる態様の方法。
１６．前記融合リガンド結合ドメインが、ホルモン受容体、糖結合タンパク質およびアロステリック制御剤の群から選択される、前述したあらゆる態様の方法。
１７．前記融合リガンド結合ドメインが、２－ハイブリッド再構成多量体実体である、前述したあらゆる態様の方法。
１８．必須遺伝子変異体の前記ライブラリーが、前記必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を付与するリガンド結合ドメインの挿入融合を使用して生成される、前述したあらゆる態様の方法。
１９．必須遺伝子変異体の前記ライブラリーが、前記必須遺伝子を機能化するためにリガンド依存性スプライシングを付与するリガンド依存性インテインドメインの挿入融合を使用して生成される、前述したあらゆる態様の方法。
２０．前記負の選択が抗生物質を含む、前述したあらゆる態様の方法。
２１．合成栄養要求体であって
（ａ）１または複数の変異リガンド依存性必須遺伝子をもつ生物を含み、前記１または複数の変異リガンド依存性必須遺伝子が１または複数の遺伝的に誘導された表現型を生成し、
（ｂ）１または複数の特異的リガンドの存在が前記１または複数の遺伝的に誘導された表現型を逆転させる、合成栄養要求体。
２２．前記合成栄養要求生物が、単細胞真核生物、多細胞真核生物、共生生物およびウイルスの群から選択された生物である、前述したあらゆる態様の合成栄養要求体。
２３．前記合成栄養要求生物が、放線菌門、バクテロイデス門、シアノバクテリア、ファーミキューテス門およびプロテオバクテリアからなる細菌の群から選択された細菌である、前述したあらゆる態様の合成栄養要求体。
２４．前記生物が大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を含む、前述したあらゆる態様の合成栄養要求体。
２５．前記生物が、逸出頻度が約３×１０-11未満のバイオセーフティー株を含む、前述したあらゆる態様の合成栄養要求体。
２６．前記変異が、必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を付与するリガンド結合ドメインのＮまたはＣ末端融合を含む、前述したあらゆる態様の合成栄養要求体。
２７．前記変異が、前記必須遺伝子を機能化するためにリガンド依存性スプライシングを付与するリガンド依存性インテインドメインを含む、前述したあらゆる態様の合成栄養要求体。
２８．前記リガンド依存性必須遺伝子が、構造遺伝子、調節遺伝子およびシグナル伝達遺伝子の群から選択される遺伝子である、前述したあらゆる態様の合成栄養要求体。
本明細書の記載には多くの詳細が含まれるが、これらは、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきものではなく、現時点で好ましい実施形態のいくつかの例を提供したものにすぎない。したがって、本開示の範囲は、当業者に明らかになりうる他の実施形態をすべて包含することを認識されたい。
特許請求の範囲において、要素を単数の要素として参照しているものは、特段の記載がない限り「１つおよび１つのみ」を意味しているものではなく、「１つ以上」を意味することを意図している。当業者に知られている開示された実施形態の要素と構造的、化学的および機能的に等価のものはすべて、本明細書に参照により明確に援用されたものとされ、本特許請求の範囲に包含されるものとする。さらに、本開示にない要素、構成部品または方法ステップは、その要素、構成部品または方法ステップが特許請求の範囲に明確に記載されているか否かにかかわらず、公にされるためのものであることが意図される。本願の請求項の要素は、「～するための手段」という表現を用いて明確に要素を記載していない限り、「ミーンズ・プラス・ファンクション」として解釈されるべきではない。本願の請求項の要素は、「～するためのステップ」という表現を用いて明確に要素を記載していない限り、「ステップ・プラス・ファンクション」として解釈されるべきではない。

Figure 0007027169000001
Figure 0007027169000002

Claims (19)

  1. リガンド依存性必須遺伝子機能に基づいて人工的な栄養要求体を生成するための方法であって、前記方法が、
    （ａ）生物において、ｐｈｅＳ、ｄｎａＮ、ｔｙｒＳ、ｍｅｔＧ又はａｄｋである、１または複数の必須遺伝子および必須遺伝子産物を特定することと、
    （ｂ）ベンゾチアゾール、インドール、インドール－３－酪酸もしくは２－アミノベンゾチアゾール又はｕｎｉＲａｐＲに対するリガンドとして用いられるラパマシンである、１または複数のリガンドを選択することと、
    （ｃ）少なくとも１つの必須遺伝子を修飾して必須遺伝子産物に変異リガンド依存性機能を生じさせることと、
    （ｄ）１または複数の変異したリガンド依存性必須遺伝子をもつ生物に対して負の選択をすること
    を含み、
    （ｅ）必須遺伝子機能は前記リガンドの不在下では生じない
    方法。
  2. 負の選択の生存生物に正の選択をして、リガンド依存性必須遺伝子を有する生存生物の数を増やすことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 負の選択の後に１または複数の変異リガンド依存性必須遺伝子をもつ生物に正の選択をすること；および
    抗生物質を用いて１または複数の変異リガンド依存性必須遺伝子をもつ生物を負の選択をすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. 必須遺伝子の前記修飾が、エラープローンＰＣＲ、ＵＶ突然変異誘発、化学突然変異誘発および突然変異誘発株からなる群から選択されるプロセスを用いて、必須遺伝子のオープンリーディングフレームのランダム突然変異誘発によって実施される、請求項１に記載の方法。
  5. 必須遺伝子の前記修飾が、リコンビニアリング、多重自動ゲノム工学法（ＭＡＧＥ）、酵素逆転ポリメラーゼ連鎖反応（ＥＩＰＣＲ）および重複伸長による遺伝子スプライシング（ＳＯＥＩＮＧ）の群から選択されるプロセスを用いて、１または複数のアミノ酸についての必須遺伝子のオープンリーディングフレームの標的突然変異誘発によって実施される、請求項１に記載の方法。
  6. 必須遺伝子の前記修飾が、前記必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を付与するリガンド結合ドメインのＮもしくはＣ末端融合である、請求項１に記載の方法。
  7. 必須遺伝子の前記修飾が、前記必須遺伝子を機能化するためにリガンド依存性スプライシングを付与するリガンド依存性インテインドメインである、請求項１に記載の方法。
  8. 第２の必須遺伝子を修飾して、第２のリガンドに応答して第２の必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を生じることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記２つのリガンド依存性必須遺伝子が、構造遺伝子、調節遺伝子およびシグナル伝達遺伝子の群から選択される遺伝子である、請求項８に記載の方法。
  10. リガンド依存性必須遺伝子機能に基づいて人工的な栄養要求体を生成するための方法であって、前記方法が
    （ａ）生物において、ｐｈｅＳ、ｄｎａＮ、ｔｙｒＳ、ｍｅｔＧ又はａｄｋである、１または複数の必須遺伝子および必須遺伝子産物を特定することと、
    （ｂ）必須遺伝子変異体のライブラリーを調製することと、
    （ｃ）ベンゾチアゾール、インドール、インドール－３－酪酸もしくは２－アミノベンゾチアゾール又はｕｎｉＲａｐＲに対するリガンドとして用いられるラパマシンである、１または複数のリガンドを選択することと、
    （ｄ）選択されたリガンドおよび正の成長条件の存在下で必須遺伝子変異体の前記ライブラリーで正の選択を実施することと、
    （ｅ）負の成長条件で前記選択されたリガンドの不在下で必須遺伝子変異体の前記ライブラリーで負の選択を実施することと、
    （ｆ）負の選択の生存株を収集すること、
    を含み、
    （ｇ）負の選択の前記負の成長条件が成長する生物を除去する
    方法。
  11. 負の選択の収集した生存株の正の選択を実施してリガンド依存性必須遺伝子を有する生存生物の数を増やすことと、
    生物を望ましい表現型について選別すること
    をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 必須遺伝子変異体の前記ライブラリーが、エラープローンＰＣＲ、ＵＶ突然変異誘発、化学突然変異誘発および突然変異誘発株からなる群から選択されるプロセスを用いて、必須遺伝子のオープンリーディングフレームのランダム突然変異誘発を使用して生成される、請求項１０に記載の方法。
  13. 必須遺伝子変異体の前記ライブラリーが、リコンビニアリング、多重自動ゲノム工学法（ＭＡＧＥ）、酵素逆転ポリメラーゼ連鎖反応（ＥＩＰＣＲ）および重複伸長による遺伝子スプライシング（ＳＯＥＩＮＧ）の群から選択されるプロセスを用いて、１または複数のアミノ酸についての必須遺伝子のオープンリーディングフレームの標的突然変異誘発を使用して生成される、請求項１０に記載の方法。
  14. 必須遺伝子変異体の前記ライブラリーが、前記必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を付与するリガンド結合ドメインのＮもしくはＣ末端融合を使用して生成される、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記融合リガンド結合ドメインが、リンカーをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記融合リガンド結合ドメインが、ホルモン受容体、糖結合タンパク質およびアロステリック制御剤の群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  17. 必須遺伝子変異体の前記ライブラリーが、前記必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を付与するリガンド結合ドメインの挿入融合を使用して生成される、請求項１０に記載の方法。
  18. 必須遺伝子変異体の前記ライブラリーが、前記必須遺伝子を機能化するためにリガンド依存性スプライシングを付与するリガンド依存性インテインドメインの挿入融合を使用して生成される、請求項１０に記載の方法。
  19. 前記負の選択が抗生物質を含む、請求項１０に記載の方法。
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