JP2018516568A - バイオセーフティーのためのリガンド依存性必須遺伝子をもつ合成栄養要求体 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、参照によりその全文が本明細書に援用される、2015年5月28日出願の米国特許仮出願第62/167,854号に対する優先権およびその利益を主張する。
本発明は、米国国立科学財団に授与された1151220号の下、政府支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
該当なし
(a)生物において1または複数の必須遺伝子および必須遺伝子産物を特定することと、
(b)1または複数のリガンドを選択することと、
(c)少なくとも1つの必須遺伝子を修飾して必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を生じることと、
(d)1または複数の変異したリガンド依存性必須遺伝子をもつ生物を負に選択すること
を含み、
(e)必須遺伝子機能は前記リガンドの不在下では生じない
方法。
抗生物質を用いて1または複数の変異リガンド依存性必須遺伝子をもつ生物を負に選択することをさらに含む、前述したあらゆる態様の方法。
(a)生物において1または複数の必須遺伝子および必須遺伝子産物を特定することと、
(b)必須遺伝子変異体のライブラリーを調製することと、
(c)1または複数のリガンドを選択することと、
(d)選択されたリガンドおよび正の成長条件の存在下で必須遺伝子変異体の前記ライブラリーで正の選択を実施することと、
(e)負の成長条件で前記選択されたリガンドの不在下で必須遺伝子変異体の前記ライブラリーで負の選択を実施することと、
(f)負の選択の生存株を収集すること、
を含み、
(g)負の選択の前記負の成長条件が成長する生物を除去する
方法。
生物を望ましい表現型について選別すること
をさらに含む、前述したあらゆる態様の方法。
(a)1または複数の変異リガンド依存性必須遺伝子をもつ生物を含み、前記1または複数の変異リガンド依存性必須遺伝子が1または複数の遺伝的に誘導された表現型を生成し、
(b)1または複数の特異的リガンドの存在が前記1または複数の遺伝的に誘導された表現型を逆転させる、合成栄養要求体。
特許請求の範囲において、要素を単数の要素として参照しているものは、特段の記載がない限り「1つおよび1つのみ」を意味しているものではなく、「1つ以上」を意味することを意図している。当業者に知られている開示された実施形態の要素と構造的、化学的および機能的に等価のものはすべて、本明細書に参照により明確に援用されたものとされ、本特許請求の範囲に包含されるものとする。さらに、本開示にない要素、構成部品または方法ステップは、その要素、構成部品または方法ステップが特許請求の範囲に明確に記載されているか否かにかかわらず、公にされるためのものであることが意図される。本願の請求項の要素は、「〜するための手段」という表現を用いて明確に要素を記載していない限り、「ミーンズ・プラス・ファンクション」として解釈されるべきではない。本願の請求項の要素は、「〜するためのステップ」という表現を用いて明確に要素を記載していない限り、「ステップ・プラス・ファンクション」として解釈されるべきではない。
Claims (28)
- リガンド依存性必須遺伝子機能に基づいて合成栄養要求体を操作するための方法であって、前記方法が、
(a)生物において1または複数の必須遺伝子および必須遺伝子産物を特定することと、
(b)1または複数のリガンドを選択することと、
(c)少なくとも1つの必須遺伝子を修飾して必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を生じることと、
(d)1または複数の変異したリガンド依存性必須遺伝子をもつ生物を負に選択すること
を含み、
(e)必須遺伝子機能は前記リガンドの不在下では生じない
方法。 - 負の選択の生存生物を正に選択して、リガンド依存性必須遺伝子を有する生存生物の数を増やすことをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 化学的相補性を用いて1または複数の変異リガンド依存性必須遺伝子をもつ生物を正に選択すること;および
抗生物質を用いて1または複数の変異リガンド依存性必須遺伝子をもつ生物を負に選択することをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 必須遺伝子の前記組換えが、エラープローンPCR、UV突然変異誘発、化学突然変異誘発および突然変異誘発株からなる群から選択されるプロセスを用いて、必須遺伝子のオープンリーディングフレームのランダム突然変異誘発によって実施される、請求項1に記載の方法。
- 必須遺伝子の前記組換えが、リコンビニアリング、多重自動ゲノム工学法(MAGE)、酵素逆転ポリメラーゼ連鎖反応(EIPCR)および重複伸長による遺伝子スプライシング(SOEING)の群から選択されるプロセスを用いて、1または複数のアミノ酸についての必須遺伝子のオープンリーディングフレームの標的突然変異誘発によって実施される、請求項1に記載の方法。
- 必須遺伝子の前記組換えが、前記必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を付与するリガンド結合ドメインのNもしくはC末端融合である、請求項1に記載の方法。
- 必須遺伝子の前記組換えが、前記必須遺伝子を機能化するためにリガンド依存性スプライシングを付与するリガンド依存性インテインドメインである、請求項1に記載の方法。
- 第2の必須遺伝子を修飾して、第2のリガンドに応答して第2の必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を生じることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記2つのリガンド依存性必須遺伝子が、構造遺伝子、調節遺伝子およびシグナル伝達遺伝子の群から選択される遺伝子である、請求項8に記載の方法。
- リガンド依存性必須遺伝子機能に基づいて合成栄養要求体を操作するための方法であって、前記方法が
(a)生物において1または複数の必須遺伝子および必須遺伝子産物を特定することと、
(b)必須遺伝子変異体のライブラリーを調製することと、
(c)1または複数のリガンドを選択することと、
(d)選択されたリガンドおよび正の成長条件の存在下で必須遺伝子変異体の前記ライブラリーで正の選択を実施することと、
(e)負の成長条件で前記選択されたリガンドの不在下で必須遺伝子変異体の前記ライブラリーで負の選択を実施することと、
(f)負の選択の生存株を収集すること、
を含み、
(g)負の選択の前記負の成長条件が成長する生物を除去する
方法。 - 負の選択の収集した生存株の正の選択を実施してリガンド依存性必須遺伝子を有する生存生物の数を増やすことと、
生物を望ましい表現型について選別すること
をさらに含む、請求項10に記載の方法。 - 必須遺伝子変異体の前記ライブラリーが、エラープローンPCR、UV突然変異誘発、化学突然変異誘発および突然変異誘発株からなる群から選択されるプロセスを用いて、必須遺伝子のオープンリーディングフレームのランダム突然変異誘発を使用して生成される、請求項10に記載の方法。
- 必須遺伝子変異体の前記ライブラリーが、リコンビニアリング、多重自動ゲノム工学法(MAGE)、酵素逆転ポリメラーゼ連鎖反応(EIPCR)および重複伸長による遺伝子スプライシング(SOEING)の群から選択されるプロセスを用いて、1または複数のアミノ酸についての必須遺伝子のオープンリーディングフレームの標的突然変異誘発を使用して生成される、請求項10に記載の方法。
- 必須遺伝子変異体の前記ライブラリーが、前記必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を付与するリガンド結合ドメインのNもしくはC末端融合を使用して生成される、請求項10に記載の方法。
- 前記融合リガンド結合ドメインが、リンカーをさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 前記融合リガンド結合ドメインが、ホルモン受容体、糖結合タンパク質およびアロステリック制御剤の群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記融合リガンド結合ドメインが、2−ハイブリッド再構成多量体実体である、請求項14に記載の方法。
- 必須遺伝子変異体の前記ライブラリーが、前記必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を付与するリガンド結合ドメインの挿入融合を使用して生成される、請求項10に記載の方法。
- 必須遺伝子変異体の前記ライブラリーが、前記必須遺伝子を機能化するためにリガンド依存性スプライシングを付与するリガンド依存性インテインドメインの挿入融合を使用して生成される、請求項10に記載の方法。
- 前記負の選択が抗生物質を含む、請求項10に記載の方法。
- 合成栄養要求体であって
(a)1または複数の変異リガンド依存性必須遺伝子をもつ生物を含み、前記1または複数の変異リガンド依存性必須遺伝子が1または複数の遺伝的に誘導された表現型を生成し、
(b)1または複数の特異的リガンドの存在が前記1または複数の遺伝的に誘導された表現型を逆転させる、合成栄養要求体。 - 前記合成栄養要求生物が、単細胞真核生物、多細胞真核生物、共生生物およびウイルスの群から選択された生物である、請求項21に記載の合成栄養要求体。
- 前記合成栄養要求生物が、放線菌門、バクテロイデス門、シアノバクテリア、ファーミキューテス門およびプロテオバクテリアからなる細菌の群から選択された細菌である、請求項21に記載の合成栄養要求体。
- 前記生物が大腸菌株BL21(DE3)を含む、請求項23に記載の合成栄養要求体。
- 前記生物が、逸出頻度が約3×10-11未満のバイオセーフティー株を含む、請求項24に記載の合成栄養要求体。
- 前記変異が、必須遺伝子産物にリガンド依存性機能を付与するリガンド結合ドメインのNまたはC末端融合を含む、請求項21に記載の合成栄養要求体。
- 前記変異が、前記必須遺伝子を機能化するためにリガンド依存性スプライシングを付与するリガンド依存性インテインドメインを含む、請求項21に記載の合成栄養要求体。
- 前記リガンド依存性必須遺伝子が、構造遺伝子、調節遺伝子およびシグナル伝達遺伝子の群から選択される遺伝子である、請求項21に記載の合成栄養要求体。
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