WO2020067472A1 - 肝疾患の検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬 - Google Patents

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WO2020067472A1
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liver
fatty acid
binding protein
fabp
acid binding
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PCT/JP2019/038258
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暁子 江口
元雄 岩佐
謙之 竹井
敬一 大畑
健 菅谷
剛 及川
Original Assignee
シミックホールディングス株式会社
国立大学法人三重大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention can be consistently tested from patients with early liver disease to patients with end-stage cirrhosis based on the measured values of only the liver-type fatty acid binding protein, and have a high test ability even when compared with serum albumin used in conventional tests.
  • the present invention relates to a liver disease test method, a test kit thereof, and a companion diagnostic agent.
  • Chronic liver disease presents a wide range of pathologies including chronic hepatitis and cirrhosis, and advanced cirrhosis may be accompanied by complications such as hepatorenal syndrome and idiopathic bacterial peritonitis. It is also well known that hepatocellular carcinoma can develop at a high rate in chronic liver disease. As an index of the severity classification, liver reserve capacity or prognosis prediction of cirrhosis patients, the Child-Pugh classification is frequently used worldwide.
  • Serum albumin is a protein synthesized in the liver and accounts for about 50-70% of the serum protein. Clinical studies have shown that it is a significant predictor of prognosis in patients with cirrhosis and is included in the test items in scoring systems such as the Child-Pugh classification.
  • ⁇ ⁇ ⁇ As a scoring system including liver function and liver cancer, there is a Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) staging system, and a Child-Pugh classification that includes serum albumin in its test items.
  • BCLC Barcelona Clinic Liver Cancer
  • ⁇ -fetoprotein (AFP) and PIVKA-II are used as tumor markers for testing hepatocellular carcinoma, which accounts for 90% or more of primary liver cancer in the liver. It is known that the AFP-L3 fraction has higher specificity for hepatocellular carcinoma than AFP.
  • L-FABP Liver-type fatty acid binding protein
  • proximal tubules such as liver and kidney.
  • L-FABP Liver-type Fatty Acid Binding Protein
  • Non-patent Document 1 Liver-type Fatty Acid Binding Protein
  • Non-patent Document 2 It is known that L-FABP is stabilized in such a manner that two ⁇ -helices cover a ⁇ -barrel structure in which two antiparallel ⁇ -sheets are orthogonal, and binds to two molecules of free fatty acids.
  • Non-Patent Document 3 ⁇ L-FABP undergoes a structural change by oxidative modification of a methionine residue, thereby exposing the internal region of the L-FABP molecule.
  • AAPH 2,2′-azobiz-2-amidinopropane
  • Non-Alcoholic SteatoHepatitis NASH
  • Non-Alcoholic SteatoHepatitis NASH
  • liver function markers such as AST and ALT or NAS
  • Non-Patent Document 6 liver function markers
  • One of the mechanisms is that L-FABP in the hepatic cytoplasm is released into the blood with cytotoxicity.
  • One of the mechanisms is that L-FABP is released into the blood in drug-induced liver damage caused by acetaminophen or liver damage associated with acute rejection after liver transplantation. It has been reported that the concentration increases (Non-Patent Documents 7 and 8).
  • Patent Literature 4 discloses that a urine sample contains a denaturing agent containing a reducing agent (such as glutathione, cysteine, or penicillamine), a chaotropic reagent (such as urea or guanidine), and a surfactant (such as sodium n-dodecylbenzenesulfonate).
  • a denaturing agent such as glutathione, cysteine, or penicillamine
  • a chaotropic reagent such as urea or guanidine
  • a surfactant such as sodium n-dodecylbenzenesulfonate
  • Patent Document 5 discloses a method of promoting aggregation based on a specific reaction without causing spontaneous aggregation of carrier particles by using an organic amine compound.
  • Child-Pugh classification is frequently used worldwide as an index for liver reserve in liver disease, prediction of prognosis, and the like.
  • this scoring system includes subjective factors such as the degree of encephalopathy and ascites, and there is a problem that its application is limited to cirrhosis patients.
  • Serum albumin a test item used in the Child-Pugh classification, is not only applicable to end-stage hepatic failure such as cirrhosis, but also to cirrhosis to hepatocellular carcinoma, such as after hepatic failure progresses and serum albumin synthesizing ability in the liver is significantly reduced. Not available for many migrating patients. Serum albumin levels do not vary with the presence or absence of liver cancer.
  • BCLC includes a Child-Pugh classification as a patient factor.
  • ABI albumin-birubin
  • AFP and PIVKA-II are used as tumor markers for the examination of hepatocellular carcinoma, which accounts for 90% or more of primary liver cancer in the liver.
  • AFP-L3 fraction may be used for the purpose of increasing AFP disease specificity.
  • simultaneous measurement with AFP and PIVKA-II has not been recognized in insurance practice, and the possibility of malignant tumors is strongly suspected. It can only be calculated if
  • L-FABP in blood
  • L-FABP concentration in blood is significantly higher in the death group in acute liver injury caused by acetaminophen, prognostic factors in patients with liver diseases such as NASH and hepatitis C
  • NASH liver diseases
  • hepatitis C liver diseases
  • L-FABP expression level in hepatocellular carcinoma patients LEvaluation of L-FABP expression level in hepatocellular carcinoma patients is based on pathological tissue malignancy diagnosis, gene expression in the tissue, protein expression level, and the like. In addition, it has been reported that the prognosis is poor when the L-FABP expression level in the tissue is high. However, these methods involve complicated steps and the available facilities are limited. In addition, there is no report on whether blood L-FABP is high in liver cancer patients, and a blood L-FABP measurement technique capable of testing liver disease with high accuracy without requiring complicated steps is required.
  • the present invention has been made in view of the actual situation in such conventional tests for chronic liver disease, cirrhosis and hepatocellular carcinoma, and is based on the results of quantification of L-FABP alone, from patients with early liver disease to patients with terminal cirrhosis. It is an object of the present invention to provide a method for testing a liver disease, which can be tested consistently, a test kit thereof, and a companion diagnostic agent.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, (i) blood L-FABP concentration becomes significantly higher in a chronic liver disease patient having hepatocellular carcinoma; (ii) chaotropic That the measured value of L-FABP after treatment with a reagent or an organic amine compound becomes high in a chronic liver disease patient having hepatocellular carcinoma; (iii) the product of the total L-FABP concentration in blood and the L-FABP oxidation rate Found that they showed even higher diagnostic performance in patients with chronic liver disease having hepatocellular carcinoma, and showed better test performance than conventional serum albumin.
  • the present invention has been completed based on the above findings. That is, the present invention is as follows.
  • ⁇ 1> a step of quantifying hepatic fatty acid binding protein in blood collected from a subject, based on the result of the quantification, the degree of progression or seriousness of liver disease correlated with the amount of hepatic fatty acid binding protein in blood How to check the degree.
  • the test includes prediction of a risk of death from liver disease.
  • the prediction is a prediction of occurrence of a mortality risk including the number of days.
  • ⁇ 4> including a step of quantifying liver-type fatty acid binding protein in blood collected from the subject, A method for testing a liver disease that is a chronic liver disease including cirrhosis.
  • liver disease is a combination of chronic liver disease including cirrhosis and hepatocellular carcinoma.
  • ⁇ 6> including a step of quantifying the amount of oxidized liver-type fatty acid binding protein in blood collected from the subject or the value of a parameter correlated therewith, The quantifying step is a step of quantifying the oxidized hepatic fatty acid binding protein, or the quantifying is a treatment for promoting an antigen-antibody reaction, and the oxidized hepatic fatty acid binding protein is not oxidized.
  • a method for examining liver disease that correlates with the amount of liver-type fatty acid binding protein in blood.
  • ⁇ 7> a step of determining, as an oxidation rate, a ratio of the quantitative value of the oxidized liver-type fatty acid binding protein to the quantitative value of the liver-type fatty acid binding protein in blood,
  • the condition where the measurement sensitivity is high is a condition where the measurement sensitivity of the oxidized liver type fatty acid binding protein is 1.4 times or more the measurement sensitivity of the unoxidized liver type fatty acid binding protein, ⁇ 6> Inspection method described in 1.
  • ⁇ 8> The inspection method according to ⁇ 6>, wherein the condition is a condition formed by treatment with a chaotropic reagent or an organic amine compound.
  • the condition is a condition formed by treatment with a chaotropic reagent or an organic amine compound.
  • ⁇ 9> The above-described treatment for promoting the antigen-antibody reaction is performed, and the oxidized liver-type fatty acid binding protein is oxidized more than the measurement sensitivity of the oxidized liver-type fatty acid binding protein is higher than the measurement sensitivity of the unoxidized liver-type fatty acid binding protein.
  • ⁇ 11> The measurement value of the liver-type fatty acid binding protein under the condition where the measurement sensitivity difference is small and the measurement sensitivity of the liver-type fatty acid binding protein that has been subjected to the treatment for promoting the antigen-antibody reaction and has not been oxidized. Based on the measured value of the oxidized hepatic fatty acid binding protein under the condition where the measurement sensitivity is high, the oxidation rate approximately corresponding to the ratio of the oxidized hepatic fatty acid binding protein in the hepatic fatty acid binding protein in the blood is calculated.
  • liver disease is at least one disease selected from the group consisting of chronic liver disease, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Inspection methods.
  • the test includes prediction of a risk of death from liver disease.
  • the prediction is a prediction of occurrence of a mortality risk including the number of days.
  • the amount of hepatic fatty acid binding protein or the amount of oxidized hepatic fatty acid binding protein in a subject or a parameter correlated therewith comprising at least one step selected from the group consisting of the following (1) and (2): Of liver disease based on the value of (1) a known normal range of the amount of liver-type fatty acid binding protein, or a known range of the amount of liver-type fatty acid binding protein in at least one disease selected from the group consisting of chronic liver disease, cirrhosis and hepatocellular carcinoma; Or, the known range of the amount of liver-type fatty acid binding protein having a risk of death from liver disease, and comparing the amount of liver-type fatty acid binding protein in the subject, the amount in the subject, which of the above range corresponds to Determining (2) In at least one disease selected from the group consisting of a known normal range of the amount of oxidized hepatic fatty acid binding protein or a value of a parameter correlated therewith, chronic liver disease, cirrhos
  • a known range of the amount of oxidized liver-type fatty acid binding protein or the value of a parameter correlated therewith, or death from liver disease A known range of the amount of oxidized hepatic fatty acid-binding protein at risk is compared with the amount of oxidized hepatic fatty acid-binding protein of the subject or the value of a parameter correlated therewith, and is correlated with the amount or the amount in the subject.
  • the method according to ⁇ 15> which is based on a result of quantification of only the hepatic fatty acid binding protein.
  • ⁇ 17> The method according to ⁇ 15> or ⁇ 16>, which does not include the evaluation of the degree of encephalopathy and the degree of ascites.
  • a substance capable of quantifying liver-type fatty acid binding protein or oxidized liver-type fatty acid binding protein comprising a substance capable of quantifying liver-type fatty acid binding protein or oxidized liver-type fatty acid binding protein.
  • the liver disease test kit according to ⁇ 18> wherein at least one selected from the group consisting of the type, progress degree, and severity of liver disease is tested.
  • the substance capable of quantifying the liver-type fatty acid binding protein or the oxidized liver-type fatty acid binding protein is an anti-L-FABP antibody, and the denaturing agent is a surfactant or sodium dodecyl sulfate.
  • a diagnostic agent for liver disease companion using the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 17> comprising a substance capable of quantifying liver-type fatty acid binding protein or oxidized liver-type fatty acid binding protein.
  • a liver disease marker comprising a liver-type fatty acid binding protein or an oxidized liver-type fatty acid binding protein, which is used as a quantification target in the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 17>.
  • ⁇ 24> a step of collecting blood from the subject and a step of detecting liver-type fatty acid binding protein in the blood, and at least one selected from the group consisting of the following (A) and (B1) to (B4)
  • (A) a known normal range of the amount of liver-type fatty acid binding protein, or a known range of the amount of liver-type fatty acid binding protein in at least one disease selected from the group consisting of chronic liver disease, cirrhosis and hepatocellular carcinoma; Or, the known range of the amount of liver-type fatty acid binding protein having a risk of death from liver disease, and comparing the amount of liver-type fatty acid binding protein in the subject, the amount in the subject, which of the above range corresponds to Determining Step (B1) Comparing the amount of liver-type fatty acid binding protein in a healthy subject with the amount of liver-type fatty acid binding protein in a subject, and detecting that the amount of the latter is significantly higher than the amount of the former Has a risk of dying from at least one disease selected from the group consisting of chronic liver disease, cirrhosis and hepatocellular carcinoma, or liver disease Step (B2) Liver-type fatty acid binding of a patient with chronic liver disease, wherein the amount of liver-type
  • the amount of the protein is compared with the amount of L-FABP in the subject. If it is detected that the amount of the latter is significantly higher than the amount of the former, the amount is selected from the group consisting of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Determining that the subject has a risk of mortality due to at least one disease or liver disease, wherein the amount of liver-type fatty acid binding protein of the patient with chronic liver disease is determined when the subject has previously had chronic liver disease.
  • liver disease comprising the method according to any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 17> and a step of administering to a subject a therapeutic or prophylactic agent for liver disease determined by the method.
  • the above-mentioned therapeutic or preventive drug for liver disease is at least one drug selected from the group consisting of a therapeutic or preventive drug for chronic liver disease, a therapeutic or preventive drug for cirrhosis, and a therapeutic or preventive drug for hepatocellular carcinoma.
  • the method according to ⁇ 26> is at least one drug selected from the group consisting of a therapeutic or preventive drug for chronic liver disease, a therapeutic or preventive drug for cirrhosis, and a therapeutic or preventive drug for hepatocellular carcinoma.
  • oxidized liver-type fatty acid binding protein is higher than the measurement sensitivity of non-oxidized liver-type fatty acid binding protein
  • a liver-type fatty acid binding protein oxidized by 2'-azobiz-2-amidinopropane, and the non-oxidized liver-type fatty acid binding protein is not oxidized by 2,2'-azobiz-2-amidinopropane
  • the oxidized liver-type fatty acid binding protein is a liver-type fatty acid binding protein oxidized by any oxidizing agent or air, and the unoxidized liver-type fatty acid binding protein is any oxidized liver-fatty acid binding protein.
  • liver-type fatty acid binding protein that has not been oxidized by an agent or air "or"
  • the liver-type fatty acid binding protein is an oxidized liver-type fatty acid-binding protein
  • the non-oxidized liver-type fatty acid-binding protein is a liver-type fatty acid-binding protein that is not oxidized arbitrarily.
  • a patient with an early stage of liver disease for example, a patient with stage A in the Child-Pugh classification
  • a patient with terminal liver cirrhosis or a chronic liver disease with hepatocellular carcinoma
  • an examination can be performed without including subjective factors such as the degree of encephalopathy and ascites in the Child-Pugh classification.
  • L-FABP in blood does not decrease in synthetic ability in end-stage cirrhosis patients unlike serum albumin
  • L-FABP is a gold standard in liver disease tests used for Child-Pugh classification and the like. The test ability is higher than that of a certain serum albumin.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of Reference Example 1.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of Example 1.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of Example 2.
  • FIG. 3 shows the results of correlation analysis between blood L-FABP concentration and PIVKA-II, AFP, and AFP-L3 fractions.
  • FIG. 3 is a view showing the results of ROC analysis of the total concentration of L-FABP in blood, the oxidation rate, the blood concentration of oxidized L-FABP, and the serum albumin concentration. It is a figure which shows the survival curve in each reference value of an oxidation rate, the blood L-FABP total concentration, the blood concentration of oxidized L-FABP, and a serum albumin concentration. It is a figure which shows the ROC analysis result and the survival curve about the measured value of L-FABP after GU processing.
  • L-FABP The amino acid sequence and gene sequence of L-FABP have already been reported (Veerkamp and Maatman, Prog. Lipid Res., 34: 17-52, 1995).
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of wild-type human L-FABP. Even if the mutant protein is a mutant protein resulting from substitution, insertion, deletion or the like in the amino acid sequence of the wild-type human liver-type fatty acid binding protein described in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, the mutation is 3% of the wild-type human liver-type fatty acid binding protein. If the mutations are highly conserved in the dimensional structure, they can all belong to the range of liver-type fatty acid binding protein.
  • the side chains of amino acids that are constituents of proteins are different in hydrophobicity, charge, size, and the like.
  • Several highly conserved relationships in the sense that they do not substantially affect the three-dimensional structure (also referred to as a three-dimensional structure) of the whole protein are known by empirical and physicochemical measurements.
  • glycine (Gly) and proline (Pro) For example, for substitution of amino acid residues, glycine (Gly) and proline (Pro), Gly and alanine (Ala) or valine (Val), leucine (Leu) and isoleucine (Ile), glutamic acid (Glu) and glutamine (Gln) ), Aspartic acid (Asp) and asparagine (Asn), cysteine (Cys) and threonine (Thr), Thr and serine (Ser) or Ala, lysine (Lys) and arginine (Arg), and the like.
  • Glycine (Gly) and proline (Pro) Gly and alanine (Ala) or valine (Val), leucine (Leu) and isoleucine (Ile), glutamic acid (Glu) and glutamine (Gln) ), Aspartic acid (Asp) and asparagine (Asn), cysteine (Cys) and
  • the method for obtaining L-FABP is not particularly limited, and may be a protein synthesized by chemical synthesis or a recombinant protein produced by a genetic recombination technique.
  • a first aspect of the present invention is a method for testing a liver disease, which comprises a step of quantifying L-FABP in blood collected from a subject (eg, a patient).
  • a test method for determining at least one selected from the group consisting of progression degree and severity is included in the method for testing a liver disease according to the first aspect.
  • the type of the liver disease includes at least one disease selected from the group consisting of chronic liver disease, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. At least one disease selected from the group consisting of cancer is preferred, and hepatocellular carcinoma is more preferred.
  • chronic liver disease includes viral liver disease (eg, hepatitis B, hepatitis C), alcoholic liver disease, fatty liver, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), Primary bile cholangitis, drug-induced liver injury, autoimmune hepatitis and the like can be mentioned.
  • viral liver disease eg, hepatitis B, hepatitis C
  • alcoholic liver disease fatty liver
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • Primary bile cholangitis e.g., drug-induced liver injury, autoimmune hepatitis and the like can be mentioned.
  • Examples of the degree of progression of the liver disease include early, middle, and end stages.
  • the severity of the above-mentioned liver disease include mild, moderate, and severe. It is preferable that the determination includes prediction of a risk of death due to liver disease.
  • the blood L-FABP concentration is correlated with
  • the number of days that can predict the mortality risk is not particularly limited as long as the mortality risk due to liver disease can be predicted, and may or may not be the prediction of the mortality risk a predetermined day or more from the quantification, for example, From the viewpoint of predicting the risk of death 100 days or more from the above quantification and predicting the future, 500 days or more from the above quantification (more preferably 1100 days or more, even more preferably 1500 days) This is preferable in that the risk of mortality can be predicted more preferably 2,000 days or more, particularly preferably 2,500 days or more, and most preferably 3,000 days or more.
  • the upper limit of the degree of the prediction is not particularly limited, but is, for example, 6000 days or less, 5000 days or less, and 4000 days or less. Further, it is preferable that the prediction is a prognosis prediction.
  • a second aspect of the present invention is a method for testing a liver disease, comprising a step of quantifying L-FABP in blood collected from a subject, An examination method, wherein the liver disease is at least one disease selected from the group consisting of chronic liver disease, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. From the viewpoint of severity, it is preferable that the liver disease is at least one kind of disease selected from the group consisting of cirrhosis and hepatocellular carcinoma.
  • the method for testing a liver disease according to the first and second aspects may or may not include a step of collecting blood from a subject.
  • the method for testing liver disease according to the first and second aspects may or may not include the step of detecting L-FABP in blood.
  • the method for testing a liver disease according to the first and second aspects may or may not include at least one step selected from the group consisting of the following (A) and (B1) to (B4). .
  • (A) a known normal range of the amount of L-FABP, or a known range of the amount of L-FABP in at least one disease selected from the group consisting of chronic liver disease, cirrhosis and hepatocellular carcinoma, or liver disease.
  • a step of comparing a known range of the amount of L-FABP having a risk of mortality with the amount of L-FABP in the subject to determine which of the above ranges falls in the subject (B1) a healthy person Comparing the amount of L-FABP in the subject with the amount of L-FABP in the subject, and detecting that the amount of the latter is significantly higher than the amount of the former, indicates that chronic liver disease, cirrhosis and hepatocytes Determining at least one disease selected from the group consisting of cancer or the risk of death from liver disease, wherein the amount of L-FABP of a healthy subject is Step (B2): comparing the amount of L-FABP in a patient with chronic liver disease with the amount of L-FABP in a subject, and comparing the amount of the latter to the amount of the former
  • the amount of L-FABP in step (B3) may be the amount when the subject had previously had chronic liver disease, and the amount of L-FABP in the patient with cirrhosis and the amount of L-FABP in the subject
  • Step (B4) comparing the amount of L-FABP in a hepatocellular carcinoma patient with the amount of L-FABP in a subject, Determining that the risk of death in hepatocellular carcinoma is high when detecting that the amount is significantly higher than the amount of the former, wherein the amount of L-FABP in a hepatocellular carcinoma patient is
  • the amount may be the amount when the subject had previously had hepatocellular carcinoma.
  • EIA enzyme immunoassays
  • FLEIA fluorescent enzyme immunoassays
  • CLIA chemiluminescence enzyme immunoassays
  • CLIA chemiluminescence immunoassays
  • ELIA electrochemiluminescence immunoassays
  • FA Fluorescent anti Law
  • RIA radioimmunoassay
  • WB Western blot
  • the assay method may be used which employs the like immunoblotting.
  • a measurement method such as detection or quantification of L-FABP, measurement using an anti-L-FABP antibody is preferable.
  • the anti-L-FABP antibody used is not particularly limited as long as it can recognize L-FABP, and may be a known antibody or an antibody to be developed in the future. For example, an antibody that recognizes a site exposed to the outside by the following denaturation treatment may be mentioned.
  • L-FABP When performing quantification using an anti-L-FABP antibody, it is preferable to perform quantification on L-FABP in the blood under conditions formed by a denaturation treatment with a surfactant. This makes it possible to modify the three-dimensional structure of the L-FABP by cutting the hydrogen bond, disulfide bond, etc. while maintaining the primary structure of the L-FABP, which is the case when the antibody binds to the internal region of the L-FABP molecule.
  • L-FABP can be detected or quantified with high sensitivity and specificity without being affected by the oxidation state of L-FABP.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the denaturation treatment may be performed at room temperature (for example, 25 ° C.) or under warming conditions (for example, 37 ° C.) at an appropriate concentration (for example, 0.2% by mass / volume (w / v%) to 10% by mass / volume).
  • % Preferably at least 0.4 mass / vol% (w / v%), at least 0.5 mass / vol% (w / v%), or at least 0.7 mass / vol% (w / v%).
  • a surfactant for an appropriate time (eg, 5 to 60 minutes).
  • denaturation treatment with 1 w / v% SDS at 25 ° C. for 10 minutes can be mentioned.
  • the above-mentioned measuring method is preferably a sandwich ELISA method using a combination of two types of antibodies having different recognition sites for the antigen (L-FABP).
  • L-FABP antigen
  • the two kinds of antibodies having different recognition sites it is preferable to use one as an immobilized antibody bound to the surface of a well in a microplate and use the other as a labeled antibody for detection or quantification.
  • the label in the labeled antibody is not particularly limited, and examples thereof include an enzyme label such as a peroxidase label, a fluorescent label, an ultraviolet label, and a radiolabel.
  • Examples of the antibody having a different recognition site for the antigen include an antibody including an antibody selected from the group consisting of anti-L-FABP antibody clone 1, clone 2, clone L, and clone F (for example, see Patent Documents). 1-3), a combination containing the anti-L-FABP antibody clone L, or a combination containing the anti-L-FABP antibody clone 2 is preferable, and a combination containing the anti-L-FABP antibody clone L is more preferable. It is more preferable to use an anti-L-FABP antibody clone L as an immobilized antibody and to use any anti-L-FABP antibody as a labeling antibody.
  • L-FABP measurement kits using the sandwich ELISA method include “Lenapro L-FABP Test TMB” (manufactured by CMIC Holdings) and “Lenapro L-FABP Test HS (high sensitivity)” (manufactured by CMIC Holdings). And the like.
  • the L-FABP in the blood may be oxidized L-FABP (hereinafter, also simply referred to as “oxidized L-FABP”). It may be non-oxidized L-FABP (hereinafter, also simply referred to as “non-oxidized L-FABP”) or a mixture of oxidized L-FABP and non-oxidized L-FABP. A mixture of oxidized L-FABP and non-oxidized L-FABP or oxidized L-FABP is preferred.
  • methionine at positions 19, 74 and 113 in SEQ ID NO: 1 can be oxidized, and in the oxidized L-FABP, at least one of methionine at positions 19, 74 and 113 is oxidized. It can be called L-FABP.
  • the oxidation of methionine at positions 19 and 113 is considered to be dominant, so that at least one of methionine at positions 19 and 113 is oxidized.
  • L-FABP is preferred.
  • Examples of the method for measuring the detection or quantification of oxidized L-FABP include those similar to the specific examples and preferred examples described above as the “method for measuring or detecting or quantifying L-FABP”. In the case of measurement using an anti-L-FABP antibody, the same applies to the anti-L-FABP antibody used, but an antibody recognizing a site exposed to the outside due to the oxidation of methionine is more preferable.
  • a third aspect of the present invention is a method for examining a liver disease, comprising the step of quantifying the amount of oxidized L-FABP in blood collected from a subject or the value of a parameter correlated therewith.
  • the quantifying step is preferably a step of quantifying the amount of oxidized L-FABP or a parameter value correlated therewith after the treatment for promoting the antigen-antibody reaction.
  • the parameter correlated with the amount of oxidized L-FABP includes a parameter calculated by conversion from a measured value (eg, label strength) and not a parameter of the amount of oxidized L-FABP itself.
  • the step of quantifying is preferably a step of quantifying the amount of the oxidized L-FABP.
  • the test for the liver disease is performed by at least one determination selected from the group consisting of the type, progression, and severity of the liver disease, and death due to the liver disease. At least one test selected from the group consisting of predicting risk, predicting liver disease progression risk, and monitoring liver disease progression is included.
  • the liver disease test is performed by determining at least one selected from the group consisting of liver disease type, progression degree and severity, prognosis prediction of mortality risk due to liver disease, prognosis prediction of liver disease progression risk, and liver disease progression More preferably, it is at least one type of test selected from the group consisting of prognosis prediction by monitoring.
  • the above liver disease test can be used to predict the risk of death from liver disease, as well as to determine the progress of the disease and to guide treatment strategies. More preferably, it is used for prognosis prediction.
  • the liver disease is preferably at least one disease selected from the group consisting of chronic liver disease, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma, and a group consisting of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. At least one disease selected from the group consisting of hepatocellular carcinoma is more preferred.
  • the quantification includes performing an antigen-antibody reaction, and measuring the oxidized L-FABP with respect to the non-oxidized L-FABP.
  • the quantification under high conditions is preferred.
  • the above “conditions in which the measurement sensitivity of oxidized L-FABP is higher than the measurement sensitivity of non-oxidized L-FABP” is “the oxidized L-FABP is L-FABP oxidized by AAPH, and Non-oxidized L-FABP is L-FABP not oxidized by AAPH ",”
  • the oxidized L-FABP is L-FABP oxidized by any oxidizing agent or air, and the non-oxidized L-FABP is L-FABP.
  • -FABP is L-FABP not oxidized by any oxidizing agent or air "and" the oxidized L-FABP is arbitrarily oxidized L-FABP, and the non-oxidized L-FABP is optional L-FABP that has not been oxidized to any of the above "or at least one selected from the group consisting of: Specifically, as the quantification under the above conditions, for example, oxidized recombinant L-FABP treated with 50 mM AAPH at 37 ° C.
  • the measurement sensitivity of oxidized L-FABP is at least 1.4 times (preferably at least 1.5 times, more preferably at least 1.8 times, and still more preferably at least 2.0 times) the measurement sensitivity of L-FABP. More preferably, the quantification is performed under high conditions.
  • the upper limit of the magnification of the measurement sensitivity is not particularly limited, and may be, for example, 6 times or less or 4 times or less.
  • the term “untreated non-oxidized recombinant L-FABP” refers to a product treated with at least one of 1000 mM benzamidine hydrochloride or 1500 mM guanidinium chloride at 25 ° C. for 10 minutes, and then treated with “Lenapro L-FABP test HS (high ELISA) using the antibody of “Sensitivity)” and measuring the coloring intensity (OD450 nm) of the labeled antibody, the oxidized L-FABP treated at 37 ° C. for 60 minutes with 50 mM AAPH at a concentration of 25 ng / ml was measured. On the other hand, L-FABP whose color intensity is 0.7 times or less.
  • a treatment for promoting the antigen-antibody reaction is performed, and the measurement sensitivity of oxidized L-FABP is higher than that of non-oxidized L-FABP.
  • the physicochemical properties of L-FABP are slightly changed to promote the reaction between L-FABP and the antibody, but the L-FABP is not denatured enough to impair the three-dimensional structure. This makes it possible to increase the absolute measurement sensitivity while maintaining or enhancing the characteristics in which the measurement sensitivity of oxidized L-FABP is higher than the measurement sensitivity of non-oxidized L-FABP.
  • Such conditions can be formed by using various protein denaturants in combination with appropriate use conditions, and using a substance having a mild protein denaturing action increases the degree of freedom of use conditions. Is preferred. However, even when a substance having a strong protein denaturing action (for example, sodium dodecyl sulfate (SDS)) is used, the degree of freedom of use conditions is correspondingly low (subject to restrictions such as low concentration, low temperature, and short time). The above condition formation may be possible. From this viewpoint, a so-called immunoagglutination promoter is preferable, and specifically, a chaotropic reagent or an organic amine compound is more preferable.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the measurement sensitivity after treatment using an immunoagglutination promoter under appropriate conditions is significantly increased for oxidized L-FABP, and is higher than that for non-oxidized L-FABP. Relatively high. Therefore, the measurement value using the anti-L-FABP antibody after the treatment with the immunoagglutination promoter and the measurement value using the anti-L-FABP antibody without the treatment (preferably, oxidized L-FABP and non-oxidized L Oxidized L-FABP in the blood can be quantified by comparison with the measurement value under the condition that the measurement sensitivity difference of FABP is small.
  • the immunoaggregation promoter examples include chaotropic reagents, organic amine compounds, reducing agents (such as glutathione, cysteine, and penicillamine), surfactants (such as sodium n-dodecylbenzenesulfonate)), and substances having similar effects. And a chaotropic reagent or an organic amine compound is preferred.
  • the quantification is more preferably the quantification of L-FABP after treatment with a chaotropic reagent or an organic amine compound.
  • the anti-L-FABP antibody used for the measurement is the same as described above, but an antibody recognizing a site exposed to the outside due to the oxidation of methionine is more preferable.
  • chaotropic reagent or organic amine compound examples include urea, 2-amino-2-thiazoline hydrochloride, benzamidine hydrochloride, benzylamine hydrochloride, guanidine hydrochloride, aminopyrine, antipyrine, 4-aminoantipyrine, o-phenylene
  • benzamidine hydrochloride, benzylamine hydrochloride, and 2-amino-2-thiazoline hydrochloride are more preferable.
  • a compound represented by the following formula (A) or a salt or ester thereof, and a compound represented by the following formula (A) or a salt thereof can also be preferably used.
  • X a1 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or an alkyl group
  • X a2 to X a6 each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, a hydroxyl group, a carboxy group, an amino group or -SX a7
  • X a7 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or an alkyl group.
  • the alkyl group include a linear or branched alkyl group, and an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is preferable.
  • X b1 to X b4 each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, an amino group, a phenyl group optionally substituted with a halogen atom or —SX b6
  • X b6 represents , A hydrogen atom, a hydroxyl group or an alkyl group.
  • X b1 and X b2 are present.
  • both Xb3 and Xb4 are present, they may together form a carbonyl group, and when Xb3 and Xb4 are both present, Xb5 may be hydrogen.
  • E b1 is a nitrogen atom or a sulfur atom
  • E b2 and E b3 are each independently a carbon atom or a nitrogen atom
  • q, r, s, t and u are each independently 0 or 1
  • the double dashed line between E b1 and E b3 and the double dashed line between E b2 and E b3 are each independently a single bond or a double bond, and the above q, r, s, t and
  • the value of u and the bond between the double dashed line between E b1 and E b3 and the double dashed line between E b2 and E b3 are values and bonds appropriately determined depending on the valencies of E b1 to E b3.
  • Examples of the alkyl group include a linear or branched alkyl group, and an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is preferable.
  • each organic amine compound includes sulfate, nitrate, hydrobromide, hydrofluoride, hydrofluoroborate, oxalate, lactate, adipate, tartrate, and iodide.
  • Hydrochloride, toluene sulfonate, malonate, bicarbonate and the like are not particularly limited, but can be appropriately selected in consideration of ease of handling and availability as a reagent in addition to the effects of the present invention. .
  • the treatment with an immunoaggregation promoter such as the chaotropic reagent or organic amine compound may be performed at room temperature (for example, 25 ° C.) or at an appropriate concentration (for example, 10 mM to 3000 mM) at a heating condition (for example, 37 ° C.).
  • a method of treating with an aggregation promoter for an appropriate time (for example, 5 to 60 minutes) may be mentioned.
  • a method of treating with an immunoagglutination promoter at an arbitrary concentration at room temperature (for example, 25 ° C.) is preferable.
  • the above treatment includes treatment with 1000 mM benzamidine hydrochloride or 1500 mM guanidinium chloride at 25 ° C. for 10 minutes.
  • the above-mentioned immunoaggregation promoters such as the chaotropic reagents and organic amine compounds may be used alone or in combination of two or more.
  • a suitable low concentration for example, less than 0.12 mass / vol% of a surfactant at a low temperature (for example, 25 ° C. or lower) for a suitable short time (for example, Minutes).
  • the method for examining a liver disease according to the third aspect is characterized in that the oxidized L-FABP and the non-oxidized L-FABP are more sensitive to the measurement of the oxidized L-FABP than the measurement sensitivity of the non-oxidized L-FABP. It is preferable that the method further comprises a step of quantifying the L-FABP under the condition that the difference in the measurement sensitivity of -FABP is small. Conditions in which the measurement sensitivity difference between oxidized L-FABP and non-oxidized L-FABP is small include, for example, oxidized recombinant L-FABP treated with 50 mM AAPH at 37 ° C.
  • untreated non-oxidized L-FABP -FABP was measured by ELISA using an antibody of "Lenapro L-FABP test HS (high sensitivity)" (manufactured by Simic Holdings Co., Ltd.), and when the color intensity (OD450 nm) of the labeled antibody was measured, the concentration was 25 ng. / Ml, the measurement sensitivity of oxidized L-FABP is 0.8 times or more and less than 1.4 times (preferably 0.9 times or more and 1.25 times) the measurement sensitivity of non-oxidized L-FABP. The following conditions are mentioned.
  • the “untreated non-oxidized recombinant L-FABP” here is as described above.
  • Such a condition with a small difference in measurement sensitivity can be formed by using various protein denaturants in combination with appropriate use conditions. Is preferred in that it increases. However, even if a substance having a mild protein denaturing action (for example, the above-mentioned immunoagglutination promoter) is used, the degree of freedom of use conditions is correspondingly low (with restrictions such as high concentration, high temperature, and long time). , The above conditions may be possible. In this respect, a surfactant is preferable, and specifically, sodium dodecyl sulfate (SDS) is preferable.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the denaturation treatment may be performed at room temperature (for example, 25 ° C.) or under warming conditions (for example, 37 ° C.) at an appropriate concentration (for example, 0.2% by mass / volume (w / v%) to 10% by mass / volume).
  • % Preferably at least 0.4 mass / vol% (w / v%), at least 0.5 mass / vol% (w / v%), or at least 0.7 mass / vol% (w / v%). May be treated with a surfactant for an appropriate time (eg, 5 to 60 minutes).
  • the denaturation treatment includes denaturation treatment with 1 w / v% SDS at 25 ° C. for 10 minutes.
  • the ratio of oxidized L-FABP in blood to the total concentration of L-FABP in blood is referred to as "blood Oxidation rate of L-FABP therein.
  • the test method for liver disease according to the third aspect is characterized in that the measurement value of L-FABP under the condition where the measurement sensitivity difference is small and the non-oxidized L Calculating an oxidation rate substantially corresponding to the ratio of the oxidized L-FABP in the L-FABP in the blood, based on the measurement value under conditions where the measurement sensitivity of the oxidized L-FABP is higher than the measurement sensitivity of the FABP;
  • the method further includes a step.
  • the “oxidation rate of L-FABP in blood” refers to the oxidized form relative to the measured value (eg, labeling intensity) of L-FABP under the condition where the measurement sensitivity difference between the oxidized L-FABP and the non-oxidized L-FABP is small. It can roughly correspond to the ratio of measured values (for example, the absorbance ratio (OD ratio) represented by the following formula) under the condition that the measurement sensitivity of L-FABP is high.
  • the OD value under the condition where the measurement sensitivity of the oxidized L-FABP is higher than the measurement sensitivity of the non-oxidized L-FABP / L under the condition where the measurement sensitivity difference between the oxidized L-FABP and the non-oxidized L-FABP is small.
  • the “oxidation rate of L-FABP in blood” can also be expressed, for example, by the following equation. (AX + bY) (OD value) / total concentration of L-FABP in blood (OD value) (In the above formula, a and b represent coefficients, X represents the concentration of oxidized L-FABP, and Y represents the concentration of non-oxidized L-FABP.)
  • the coefficient a is preferably a coefficient representing the reactivity of the antibody to oxidized L-FABP
  • the coefficient b is preferably a coefficient representing the reactivity of the antibody to non-oxidized L-FABP.
  • the method for testing a liver disease includes the step of quantifying the amount of oxidized L-FABP in the blood of the subject or the value of a parameter correlated therewith, wherein the quantifying step comprises:
  • the step is a step of quantifying the oxidized L-FABP.
  • the “quantity of oxidized L-FABP” is a single quantification of “oxidation rate of L-FABP in blood” and “total concentration of L-FABP in blood”. This is because the inspection can be performed with higher accuracy than the result.
  • the concentration of the oxidized L-FABP is determined by the measured value of L-FABP (the total amount of L-FABP in blood) under the condition that the difference between the oxidation rate and the measurement sensitivity of the oxidized L-FABP and the non-oxidized L-FABP is small. Concentration).
  • the oxidized L-FABP can be quantified using an antioxidant L-FABP antibody that does not recognize non-oxidized L-FABP but can specifically recognize oxidized L-FABP.
  • the quantification is performed by measuring the intensity of a label to be measured (for example, absorbance, enzyme label intensity, fluorescence intensity, ultraviolet intensity, radiation intensity, etc.) and L-FABP.
  • a calibration curve may be created based on the relationship with the amount (for example, concentration), and quantification may not be performed based on the calibration curve (for example, in comparison).
  • a fourth aspect of the present invention includes at least one step selected from the group consisting of the following (1) and (2), and correlates with the amount of L-FABP or the amount of oxidized L-FABP in a subject.
  • This is a liver disease inspection method based on parameter values.
  • (1) A known normal range of the amount of L-FABP, or a known range of the amount of L-FABP in at least one disease selected from the group consisting of chronic liver disease, cirrhosis and hepatocellular carcinoma, or liver disease.
  • a step of comparing a known range of the amount of L-FABP having a risk of mortality with the amount of L-FABP in a subject to determine which of the above ranges corresponds to the amount in the subject (2) oxidized form A known normal range of the amount of L-FABP or a parameter correlated therewith, or the amount of oxidized L-FABP or correlated therewith in at least one disease selected from the group consisting of chronic liver disease, cirrhosis and hepatocellular carcinoma A known range of parameter values, or a known range of the amount of oxidized L-FABP having a risk of death from liver disease, Comparing the amount or the value of the parameter correlated therewith to determine which of the above ranges the value of the amount or the parameter correlated therewith in the subject falls;
  • the area under the curve (AUC) can be tested as an ROC (recipient operating characteristic) analysis result of 0.650 or more, and 0.700 or more. More preferably, it can be inspected, and more preferably, it can be inspected at 0.710 or more.
  • the test methods for liver diseases according to the first to fourth aspects can be based on the quantification results of L-FABP alone, but other test methods (eg, Child-Pugh classification, BCLC staging, MELD (Model for An inspection method based on End-Stage Liver Disease) or the like may or may not be used.
  • the method for examining liver disease according to the first to fourth aspects may be a method for examining patients with early liver disease (eg, patients with stage A in the Child-Pugh classification) from patients with terminal cirrhosis (or patients with chronic liver disease having hepatocellular carcinoma). ) Can be consistently evaluated, but it is not necessary to consistently evaluate patients from early stage liver disease to end-stage cirrhosis.
  • the method for testing liver diseases according to the first to fourth aspects does not include the evaluation of the degree of encephalopathy and the degree of ascites in the Child-Pugh classification, and can be performed without any subjective factors.
  • the method for testing a liver disease according to the first to fourth aspects may or may not include a method for diagnosing a liver disease.
  • the present invention relates to a method for testing a liver disease according to the first to fourth aspects, and a method for treating or preventing a liver disease comprising a step of administering to a subject a therapeutic or prophylactic agent for the liver disease determined by the method. It does not have to be related to the above.
  • Examples of the therapeutic or preventive drug for liver disease include at least one drug selected from the group consisting of a therapeutic or preventive drug for chronic liver disease, a therapeutic or preventive drug for cirrhosis, and a therapeutic or preventive drug for hepatocellular carcinoma. .
  • a fifth aspect of the present invention is a liver disease test kit containing a substance capable of quantifying L-FABP or oxidized L-FABP, and a test kit used in the liver disease test method according to the first to third aspects.
  • a sixth aspect of the present invention is a liver disease companion diagnostic agent comprising a substance capable of quantifying the amount of hepatic fatty acid-binding protein or oxidized hepatic fatty acid-binding protein, and the hepatic disease according to the first to third aspects. It is preferably a companion diagnostic agent using the test method described above.
  • a seventh aspect of the present invention is a liver disease marker consisting of a hepatic fatty acid binding protein or an oxidized hepatic fatty acid binding protein and used as a quantification target in the method according to the first to third aspects.
  • a "companion diagnostic agent" is performed before actually starting drug administration in order to predict the effect of the drug on individual patients with liver disease, the risk of side effects, and the appropriate dosage. Refers to diagnostics used in testing.
  • the liver disease test is performed at least one judgment selected from the group consisting of liver disease type, progression, and severity, prediction of the risk of death from liver disease, At least one test selected from the group consisting of prediction of liver disease progression risk and monitoring of liver disease progression, and at least one determination selected from the group consisting of liver disease type, progression, and severity At least one test selected from the group consisting of prognosis prediction of mortality risk due to liver disease, prognosis prediction of liver disease progression risk and prognosis prediction by monitoring liver disease progression is more preferable.
  • the companion diagnostic agent in the companion diagnostic agent according to the sixth aspect, at least one judgment selected from the group consisting of liver disease type, progress degree and severity, prediction of death risk due to liver disease, prediction of liver disease onset risk, and At least one companion diagnostic agent selected from the group consisting of monitoring disease progression is preferred, and at least one determination selected from the group consisting of liver disease type, progression and severity, risk of death from liver disease More preferred is at least one companion diagnostic agent selected from the group consisting of prognosis prediction, liver disease progression risk and its prognosis, and prognosis prediction by monitoring liver disease progression. Further, the above-mentioned companion diagnostic agent for liver disease preferably predicts the risk of death from liver disease, and more preferably predicts the prognosis of the risk of death from liver disease.
  • the type of liver disease is preferably at least one disease selected from the group consisting of chronic liver disease, cirrhosis and hepatocellular carcinoma, and a group consisting of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. At least one disease selected from the group consisting of hepatocellular carcinoma is more preferred.
  • the substance capable of quantifying L-FABP or oxidized L-FABP includes enzyme immunoassay (EIA, ELISA) and fluorescent enzyme immunoassay.
  • FLEIA Chemiluminescent enzyme immunoassay
  • CLIA Chemiluminescence immunoassay
  • ELIA Electrochemiluminescence immunoassay
  • FLEIA Western Examples include a substance for quantifying L-FABP or oxidized L-FABP based on a blotting method (WB), an immunoblot method, or the like, and specifically, an anti-L-FABP antibody is preferable.
  • the anti-L-FABP antibody used is not particularly limited as long as it can recognize L-FABP, and may be a known antibody or an antibody to be developed in the future.
  • an antibody that recognizes a site exposed to the outside due to the above-mentioned denaturation treatment, oxidation of the above-mentioned methionine, or the like can be used.
  • an assay system employing a sandwich ELISA method using a combination of two kinds of antibodies having different recognition sites for an antigen (L-FABP) is preferable.
  • the two types of antibodies having different recognition sites are as described above in ⁇ Test Methods for Liver Disease ⁇ .
  • the quantification means preferably contains the anti-L-FABP antibody as a reagent, and more preferably further contains a labeled anti-L-FABP antibody.
  • an adsorption inhibitor bovine serum albumin (BSA), casein , Skim milk, polyethylene glycol, etc.
  • pretreatment liquid optionally surfactant, optional buffer, etc.
  • reaction buffer optionally buffer, etc.
  • chromogenic substrate 3,3 ', 5,5'-tetra Methylbenzidine, aqueous hydrogen peroxide, etc.
  • the content of the adsorption inhibitor in the above-mentioned quantification means is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, but is preferably 0.05 to 10% by mass.
  • the above-mentioned quantification means is preferably a kit using a sandwich ELISA method in which two kinds of antibodies having different recognition sites for antigens are combined, and an anti-L-FABP antibody clone L is used as a solid phase, and an anti-L-FABP is used as a labeled antibody. More preferably, the kit uses the antibody clone 2.
  • the test kit according to the fifth aspect and the companion diagnostic agent according to the sixth aspect when performing quantification with an anti-L-FABP antibody, may include means for denaturing L-FABP with a surfactant prior to quantification.
  • the kit for testing a liver disease according to the fifth aspect further comprises means for denaturing L-FABP in the blood with a surfactant, and means for quantifying L-FABP after the denaturation treatment.
  • the surfactant is as described above.
  • a surfactant having an arbitrary concentration for example, 0.2% by mass to 10% by mass
  • room temperature for example, 25 ° C.
  • heating conditions for example, 37 ° C.
  • a denaturing solution containing the above-described surfactant, an optional buffer, etc. for example, a denaturing solution containing the above-described surfactant, an optional buffer, etc.
  • test kit according to the fifth aspect and the companion diagnostic agent according to the sixth aspect further include a means for treating L-FABP in blood with an immunoagglutination promoter (preferably a chaotropic reagent or an organic amine compound), and
  • an immunoagglutination promoter preferably a chaotropic reagent or an organic amine compound
  • the means for quantifying is a means for quantifying L-FABP after the treatment.
  • kits using a sandwich ELISA method specific examples include kits containing the following (1) to (10). Is mentioned.
  • Denaturing solution for example, any surfactant
  • Immune coagulation promoter treatment solution eg, chaotropic reagent, organic amine compound
  • Reaction buffer (5) Enzyme-labeled antibody peroxidase-labeled anti-human L-FABP mouse monoclonal antibody (for example, from clone 2 producing cell line) (6) Enzyme substrate solution (7) Detergent (optional buffer, surfactant, etc.) (8) Reaction stop solution (1N sulfuric acid, etc.) (9) Standard buffer (any buffer, etc.) (10) Liver-type fatty acid binding protein sample (10) The concentration of the liver-type fatty acid binding protein sample (10) The concentration of the liver-type fatty acid binding protein sample (
  • the test kit according to the fifth aspect and the companion diagnostic agent according to the sixth aspect preferably include a protein storage buffer containing BSA for the purpose of preventing protein adsorption.
  • a protein storage buffer containing BSA for the purpose of preventing protein adsorption.
  • the following protein storage buffer may be mentioned.
  • an ELISA measurement was carried out in the same manner except that a denaturation treatment with SDS was performed at 25 ° C. for 10 minutes with 1000 mM benzamidine hydrochloride (hereinafter, also referred to as “BA treatment”). The results are shown in FIG.
  • a denaturation treatment with SDS was performed at 25 ° C. for 10 minutes with 1000 mM benzamidine hydrochloride (hereinafter, also referred to as “BA treatment”).
  • BA treatment 1000 mM benzamidine hydrochloride
  • GU treatment a treatment with 1500 mM guanidinium chloride at 25 ° C. for 10 minutes
  • the OD measurement value (intensity) of the oxidized recombinant L-FABP and the OD measurement value of the non-oxidized recombinant L-FABP are different. It can be seen that they are almost the same.
  • Example 1 Chronic hepatitis (CH) patients, cirrhosis (LC) patients, stage A (hereinafter simply referred to as “CP A”) patients in the Child-Pugh classification, and stage B (hereinafter simply referred to as “CP B”) patients.
  • CH hepatitis
  • LC cirrhosis
  • CP B stage B
  • Each blood sample of a patient and a patient of stage C was denatured with 1 w / v% SDS at 25 ° C. for 10 minutes, and then subjected to the “Lenapro L-FABP test”.
  • the concentration of L-FABP in blood was measured using an antibody of "HS (high sensitivity)" (manufactured by Simic Holdings Co., Ltd.).
  • FIGS. 2 (a) and (b) In the figure, ** indicates the significance level p ⁇ 0.01, and *** indicates p ⁇ 0.001.
  • the L-FABP concentration in the blood of the LC patient is significantly higher than that of the CH patient.
  • the L-FABP concentration in the blood significantly increases as the disease state progresses from stage A patients to stage B and stage C in the Child-Pugh classification. The value becomes high, and it can be seen that by measuring the L-FABP concentration in the blood, it is possible to test from chronic hepatitis patients to end-stage cirrhosis patients.
  • L-FABP levels are increased in each stage of the Child-Pugh classification, which is frequently used worldwide, and various liver diseases are not limited to HCV, NASH and other limited liver diseases.
  • High test ability of L-FABP was obtained in a sample composed of a patient group having a background.
  • Example 2 1 w / v% SDS using blood samples of a chronic liver disease patient with hepatocellular carcinoma (HCC) (HCC (+)) and a chronic liver disease patient without HCC (HCC ( ⁇ )) After denaturing at 25 ° C. for 10 minutes, blood L-FABP concentration (ng / ml) was measured using an antibody of “Lenapro L-FABP test HS (high sensitivity)” (manufactured by Simic Holdings Co., Ltd.). . The results are shown in FIG. In the figure, *** indicates p ⁇ 0.001. As is clear from the results shown in FIG.
  • the L-FABP concentration in the blood of the chronic liver disease patient having HCC becomes significantly higher than that of the chronic liver disease patient having no HCC. It is clear that by measuring the L-FABP concentration in the blood, it is possible to further examine the presence or absence of HCC in patients with chronic liver disease.
  • the L-FABP concentration (ng / ml) in the blood was measured after denaturation treatment in the same manner for patients at stages A to D in the BCLC classification. The results are shown in FIG. In addition, as is clear from the results shown in FIG. 3D, it is found that patients with stages B to D tend to have higher values than patients with stage A in the BCLC classification.
  • Comparative Example 1 As Comparative Example 1, the blood albumin (Alb) concentration (U / U) was determined using blood samples of an LC patient with HCC (HCC (+)) and an LC patient without HCC (HCC ( ⁇ )). L) was measured. The results are shown in FIG. As is clear from the results shown in FIG. 3 (c), there is no significant difference in blood Alb concentration between HCC (+) and HCC ( ⁇ ). Among the chronic liver diseases, it can be seen that in an LC patient whose disease state has progressed further, the ability to synthesize Alb is reduced, and it is not possible to examine the presence or absence of HCC.
  • Example 3 Using each blood sample of a chronic liver disease patient with HCC (HCC (+)) and a chronic liver disease patient without HCC (HCC (-)), 1 w / v% SDS at 25 ° C. 10 After denaturation for one minute, the blood L-FABP total concentration (ng / ml) was measured using an antibody of "Lenapro L-FABP test HS (high sensitivity)" (manufactured by Simic Holdings Co., Ltd.).
  • the total L-FABP concentration in the blood was determined using the blood samples of patients with chronic liver disease in a group that died from liver disease (dead group) and a group that did not die from liver disease (surviving group).
  • the strength after the GU treatment was measured in the same manner, and the oxidation rate of L-FABP and the blood concentration of oxidized L-FABP were calculated.
  • the results are shown in Table 2 below.
  • Comparative Example 2 the serum albumin concentration (U / L) was measured in each of the blood samples of HCC (+), HCC ( ⁇ ), the dead group, and the surviving group. The results are shown in Tables 1 and 2 below.
  • the total concentration of L-FABP was significantly higher in HCC (+) than in HCC ( ⁇ ), and the total concentration of L-FABP was higher in the dead group than in the surviving group. It can be seen that the concentration becomes significantly higher.
  • the oxidation rate of L-FABP tends to be higher in HCC (+) than in HCC ( ⁇ ), and the oxidation rate of L-FABP is significantly higher in the dead group than in the surviving group.
  • the blood concentration of oxidized L-FABP obtained from the product of the oxidation rate and the total blood L-FABP concentration was significantly higher in HCC (+) than in HCC ( ⁇ ). It can be seen that the value is significantly higher in the death group than in the case of.
  • the blood concentration of oxidized L-FABP was smaller than the total L-FABP concentration and oxidation rate in both HCC (+) compared to HCC (-) and in the dead group compared to the surviving group. Indicates that the liver disease can be tested with the highest accuracy.
  • the serum albumin concentration of Comparative Example 2 did not show a significant difference between HCC ( ⁇ ) and HCC (+), and did not show a significant difference between the surviving group and the dead group, indicating that the test ability for liver disease was inferior.
  • the blood L-FABP total concentration, the L-FABP oxidation rate, and the product of the oxidation rate and the blood L-FABP total concentration are used.
  • ROC analysis was performed for each of the resulting oxidized L-FABP blood concentrations.
  • the ROC analysis was also performed on the serum albumin concentration of Comparative Example 2.
  • FIG. 5 shows the results.
  • the AUC of the oxidation rate of L-FABP is 0.658 and p is 0.009
  • the AUC of the total concentration of L-FABP in blood is 0.701
  • p is 0. 0.0008
  • the AUC of the blood concentration of oxidized L-FABP obtained from the product of the oxidation rate and the total concentration of L-FABP in blood is 0.729
  • p is 0.0001
  • Rate the blood L-FABP total concentration and the oxidized L-FABP blood concentration were found to improve the accuracy of the test ability for liver disease.
  • the blood concentration of the oxidized L-FABP is most excellent in the accuracy of the test ability for liver disease.
  • the serum albumin concentration of Comparative Example 2 the AUC was as low as 0.568, and the p-value was as large as 0.29, which was not significant, indicating that the test ability for liver disease was poor.
  • a value of 1.9 and a reference value of 3.1 for serum albumin concentration were obtained.
  • the survival curve divided by the reference value of the total concentration of L-FABP in blood and the reference value of the blood concentration of oxidized L-FABP obtained from the product of the oxidation rate and the total concentration of L-FABP in blood 6 (a) and 6 (b) show the divided survival curves and the survival curves divided by the above-mentioned reference value of the serum albumin concentration.
  • the p-values of the survival curves obtained when the total L-FABP concentration in the blood was higher than the reference value 7.7 and lower than the reference value 7.7 were ⁇ It is 0.003, which is a significant difference, indicating that the risk of mortality due to liver disease (preferably, the risk of mortality 1100 days or more from the quantification) can be predicted.
  • the blood concentration of oxidized L-FABP obtained from the product of the above oxidation rate and the total blood L-FABP concentration is 1.9.
  • the p value of the survival curve between the case where the value is larger and the case where the reference value is less than or equal to 1.9 is ⁇ 0.0001, which is a significant difference, and is particularly excellent in liver disease testability and can predict the risk of death from liver disease. I understand.
  • the p value of the survival curve in the case where the serum albumin intensity was greater than 3.1 and the case where the serum albumin concentration was 3.1 or less was ⁇ 0.02. It can be seen that the significance is small and the test ability for liver disease is inferior.
  • the AUC of the measured value of L-FABP after the GU treatment was 0.717
  • the p value was 0.0009
  • the blood concentration of the oxidized L-FABP was 0.0009.
  • AUC and p values close to the above were obtained, and it can be seen that liver disease can be examined with high accuracy to a degree similar to the blood concentration of oxidized L-FABP.
  • FIG. 7 (b) shows a survival curve obtained by dividing the measured value of L-FABP after the GU treatment by the reference value of 4.5.
  • the p-values of the survival curves when the measured value of L-FABP after the GU treatment was larger than the reference value 4.5 and when it was less than the reference value 4.5 were ⁇ 0.0002, indicating a significant difference and excellent liver disease test ability, indicating that the risk of death due to liver disease (preferably, the risk of death 1100 days or more ahead from quantitative analysis) can be predicted.

Abstract

Ｌ－ＦＡＢＰのみの定量結果に基づき肝疾患早期の患者から末期肝硬変患者までを一貫して検査し得る肝疾患検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬を提供すること。　被験者から採取した血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含み、前記定量の結果に基づき、血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質の量と相関する肝疾患の進行度又は重篤度を検査する方法。

Description

肝疾患の検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬
　本発明は、肝型脂肪酸結合タンパク質のみの測定値に基づき肝疾患早期の患者から末期肝硬変患者までを一貫して検査し得、従来の検査に用いられる血清アルブミンと比較しても検査能が高い肝疾患の検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬に関する。
　慢性肝疾患は慢性肝炎、肝硬変と幅広い病態を呈し、進行した肝硬変では肝腎症候群、特発性細菌性腹膜炎といった合併症をも併発し得る。また、慢性肝疾患には高率に肝細胞癌が発症し得ることも周知である。肝硬変患者の重症度分類、肝予備能ないし予後予測の指標としては、世界的にＣｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類が頻用されている。
　血清アルブミンは肝臓において合成される蛋白であり、血清中タンパク質の約５０～７０％ほどを占める。肝硬変患者における有意な予後予測因子であることが複数の臨床研究から示され、上記Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類などのスコアリングシステムにおける検査項目に含まれる。
　肝機能及び肝癌を含めたスコアリングシステムとしてはＢａｒｃｅｌｏｎａ　Ｃｌｉｎｉｃ　Ｌｉｖｅｒ　Ｃａｎｃｅｒ（ＢＣＬＣ）病期分類が存在するが、血清アルブミンをその検査項目に含むＣｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類が含まれる。
　肝臓における原発性肝癌のうち９０％以上を占める肝細胞癌の検査にはα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びＰＩＶＫＡ－ＩＩが腫瘍マーカーとして用いられる。ＡＦＰ－Ｌ３分画はＡＦＰよりも肝細胞癌に対する特異性が高いことが知られている。
　肝型脂肪酸結合タンパク質（Ｌ－ｔｙｐｅ　Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、単に「Ｌ－ＦＡＢＰ」ともいう。）は肝臓、腎臓等の近位尿細管の細胞質等に存在している。特に健常人において肝細胞の細胞質内蛋白の７～１１％を占めるとされる（例えば、非特許文献１）。Ｌ－ＦＡＢＰは逆平行βシートが２枚直行したβバレル構造に２本のαへリックスが蓋をするような形で安定化され、２分子の遊離脂肪酸と結合することが知られている（例えば、非特許文献２）。
　Ｌ－ＦＡＢＰはメチオニン残基の酸化修飾により構造変化が生じ、Ｌ－ＦＡＢＰ分子の内部領域が露わとなる（例えば、非特許文献３）。その結果、Ｌ－ＦＡＢＰ分子の内部領域と結合する抗体を用いることでＥＬＩＳＡなどの抗原抗体反応を用いた測定において抗体結合能が変化し、測定値が大きく変化することが知られている。またこのＬ－ＦＡＢＰのメチオニン残基の酸化修飾は２，２’－アゾビズ２－アミジノプロパン（以下、「ＡＡＰＨ」と略記する。）処理、空気酸化等によって生じることが報告されている（特許文献１～３）。
　血液中Ｌ－ＦＡＢＰが非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ：Ｎｏｎ－Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ＳｔｅａｔｏＨｅｐａｔｉｔｉｓ）及び慢性Ｃ型肝炎の検査に有用との報告がなされている（非特許文献４、５）。ＮＡＳＨにおいては血液中Ｌ－ＦＡＢＰがＡＳＴ、ＡＬＴなどといった肝機能マーカーないしＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｓｃｏｒｅ）と相関することが知られている（非特許文献６）。また肝細胞質内Ｌ－ＦＡＢＰが細胞傷害とともに血液中に放出されることを機序の１つとして、アセトアミノフェンなどによる薬剤性肝障害や肝移植後の急性拒絶反応に伴う肝障害において血液中濃度が上昇することが報告されている（非特許文献７、８）。
　特許文献４には、尿試料に変性剤として、還元剤（グルタチオン、システイン、ペニシラミン等）、カオトロピック試薬（尿素、グアニジン等）及び界面活性剤（ｎ－ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等）からなる化合物の１種又は２種を添加し、尿試料をこれらの化合物を用いて前処理することで免疫測定の感度、すなわち測定対象物である尿中のタンパク質の測定感度を向上させる方法が開示されている。特許文献４には、尿中のタンパク質の一例として、Ｌ－ＦＡＢＰが挙げられているが、Ｌ－ＦＡＢＰの検出についての具体的な記載はない。また特許文献５には、有機アミン化合物を用いることによって、担体粒子の自然凝集を起こさせずに特異反応に基づく凝集を促進する方法が開示されている。特許文献６には、ベンズアミジン誘導体などの分子内にＮＨ２－Ｃ＝Ｎ－の部分構造と環状構造とを有する化合物を試料中のＬ－ＦＡＢＰと接触させることにより測定感度を向上させる方法が開示されている。
　しかしながら、Ｌ－ＦＡＢＰ分子の内部領域と結合する抗体を用いたＬ－ＦＡＢＰの酸化状態を評価する方法としての記載はない。
特許第６１７４７７８号公報 特許第６２１８９８３号公報 特許第６０５９３８８号公報 特開２０１４－８５２０８号公報 国際公開ＷＯ２００７／０７４８６０号 国際公開ＷＯ２０１６／１３６８６３号
Ｖｅｒｇａｎｉ，Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．：Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，９８（１－２），１９９０． Ｃａｉ，Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．：Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｊ，１０２：２５８５－２５９４，２０１２． Ｙａｎ，　Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．：Ｊ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ，５０：２４４５－２４５４，２００９． Ａｋｂａｌ，　Ｅ．，ｅｔ　ａｌ．：Ｗｉｅｎ　Ｋｌｉｎ　Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ，１２８（１－２）：４８－５２，２０１６ Ａｋｂａｌ，Ｅ．，ｅｔ　ａｌ．：Ａｒｃｈ　Ｍｅｄ　Ｒｅｓ，４４（１）：３４－３８，２０１３ Ｏｚｅｎｉｒｌｅｒ，Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．：Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，６０（１２５）：１０９５－１１００，２０１３ Ｋａｒｖｅｌｌａｓ，ＣＪ．，ｅｔ　ａｌ．：Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，６５（３）：９３８－９４９，２０１７ Ｐｅｌｓｅｒｓ，ＭＭ．ｅｔ　ａｌ．：Ｃｌｉｎ　Ｃｈｅｍ，４８（１）：２０５５－２０５７，２００２
　肝疾患における肝予備能、予後予測等の指標としては、世界的にＣｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類が頻用されている。
　しかしながらこのスコアリングシステムには脳症、腹水等の程度といった主観的な要素を含むことが指摘されており、また適用が肝硬変患者に限られることなどに問題がある。
　Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類に用いられる検査項目である血清アルブミンは適用が肝硬変などの末期肝不全に限られる他、肝不全が進行し肝臓における血清アルブミン合成能が大幅に低下した後など、肝硬変から肝癌に移行する多くの患者には使用できない。また肝癌の有無で血清アルブミン値は変動しない。
　肝癌合併例においてはＢＣＬＣ病期分類を用いた治療選択がなされているが、ＢＣＬＣには患者因子としてＣｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類が含まれている。近年、ａｌｂｕｍｉｎ－ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ（ＡＬＢＩ）ｇｒａｄｅの有用性が報告されているが、未だ十分検討されているとは言えない。また、腫瘍因子が加味されていないことから、進行肝癌の予後は予測し得ない。このような背景から肝癌を含む全ての慢性肝疾患の予後予測が可能となる検査項目が求められている。
　肝臓における原発性肝癌のうち９０％以上を占める肝細胞癌の検査にはＡＦＰ及びＰＩＶＫＡ－ＩＩが腫瘍マーカーとして用いられるが、肝細胞癌においてＰＩＶＫＡ－ＩＩ陽性例は５７％程度とされ、全ての肝細胞癌を検出できるわけではない。またＡＦＰの疾患特異性を高める目的でＡＦＰ－Ｌ３分画が用いられることもあるが、保険診療上ＡＦＰ及びＰＩＶＫＡ－ＩＩとの同時測定は認められておらず、悪性腫瘍の可能性が強く疑われる場合のみ算定可能である。
　慢性肝疾患の早期から肝癌を有する患者まで一貫して予後を評価できる疾患マーカー、病期分類等に用いられる臨床上の有用性が担保されたスコアリングシステムなどは存在しない。
　血液中Ｌ－ＦＡＢＰに関して、アセトアミノフェンによる急性肝障害においては死亡群において血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度が有意に高値となるとされているものの、ＮＡＳＨ、Ｃ型肝炎などの肝疾患患者における予後予測因子としての血液中Ｌ－ＦＡＢＰの有用性についての報告はない。また簡便かつ高精度で評価できる血液中Ｌ－ＦＡＢＰ測定系が求められている。さらにこれまでＬ－ＦＡＢＰの生体内における酸化状態を判別する方法はない。
　肝細胞癌患者におけるＬ－ＦＡＢＰ発現量の評価は、病理組織による悪性診断、組織中の遺伝子発現、タンパク質発現量等に基づき評価されている。また組織中のＬ－ＦＡＢＰ発現量が高値であると予後不良であることが報告されている。しかしながらこれらの方法は煩雑な工程を含み実施可能な施設が限られる。また血液中Ｌ－ＦＡＢＰが肝癌患者で高値となるかどうかの報告はなく、煩雑な工程を要することなく、高精度で肝疾患を検査できる血液中Ｌ－ＦＡＢＰ測定手法が求められる。
　本発明は、このような従来の慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌の検査における実情に鑑みてなされたものであり、Ｌ－ＦＡＢＰのみの定量結果に基づき肝疾患早期の患者から末期肝硬変患者までを一貫して検査し得る肝疾患の検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、（ｉ）血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度が肝細胞癌を有する慢性肝疾患患者において有意に高値となること、（ｉｉ）カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理後のＬ－ＦＡＢＰの測定値が肝細胞癌を有する慢性肝疾患患者において高値となること、（ｉｉｉ）血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度とＬ－ＦＡＢＰ酸化率との積が肝細胞癌を有する慢性肝疾患患者においてさらに高い診断性能を示すことを見出し、従来の血清アルブミンと比べて優れた検査能を示すことを見出した。
　本発明は、上記知見に基づき完成されるに至ったものである。
　すなわち本発明は以下の通りである。
　＜１＞被験者から採取した血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含み、前記定量の結果に基づき、血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質の量と相関する肝疾患の進行度又は重篤度を検査する方法。
　＜２＞上記検査は、肝疾患による死亡リスクの予測を含む、＜１＞に記載の方法。
　＜３＞上記予測が、日数を含めた死亡リスク発生の予測である、＜２＞に記載の方法。
　＜４＞被験者から採取した血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含み、
　肝硬変を含む慢性肝疾患である肝疾患の検査方法。
　＜５＞上記肝疾患が、肝硬変を含む慢性肝疾患及び肝細胞癌の併発である、＜４＞に記載の方法。
　＜６＞被験者から採取した血液中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値を定量する工程を含み、
　前記定量する工程が、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程であるか、又は
　前記定量が、抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における定量である、
　血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質の量と相関する肝疾患の検査方法。
　＜７＞血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質の定量値に対する上記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の定量値の比率を酸化率として求める工程を含み、
　上記測定感度が高い条件が、前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して上記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が１．４倍以上の条件である、＜６＞に記載の検査方法。
　＜８＞上記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、＜６＞に記載の検査方法。
　＜９＞上記抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて上記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、＜６＞～＜８＞のいずれか１項に記載の検査方法。
　＜１０＞上記測定感度差が小さい条件が、上記血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、＜９＞に記載の検査方法。
　＜１１＞上記測定感度差が小さい条件における上記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、上記抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、＜９＞又は＜１０＞に記載の検査方法。
　＜１２＞上記肝疾患が、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患である、＜１＞、＜２＞、＜３＞又は＜６＞に記載の検査方法。
　＜１３＞上記検査が、肝疾患による死亡リスクの予測を含む、＜４＞～＜６＞のいずれか１項に記載の方法。
　＜１４＞上記予測が、日数を含めた死亡リスク発生の予測である、＜１４＞に記載の方法。
　＜１５＞下記（１）及び（２）よりなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値に基づく肝疾患の検査方法。
　（１）肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の正常範囲、又は慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患における肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有する肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲と、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量とを比較し、被験者における上記量が、上記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
　（２）酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有する酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲と、被験者の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における上記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、上記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
　＜１６＞肝型脂肪酸結合タンパク質のみの定量結果に基づく、＜１５＞に記載の方法。
　＜１７＞脳症の程度及び腹水の程度の評価を含まない、＜１５＞又は＜１６＞に記載の方法。
　＜１８＞肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、＜１＞～＜１７＞のいずれか１項に記載の方法に用いる検査キット。
　＜１９＞肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つを検査する＜１８＞に記載の肝疾患検査キット。
　＜２０＞さらに変性処理剤を含む＜１８＞に記載の肝疾患検査キット。
　＜２１＞前記肝型脂肪酸結合タンパク質又は、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質は抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体であり、前記変性処理剤は界面活性剤またはドデシル硫酸ナトリウムである＜２０＞に記載の肝疾患検査キット。
　＜２２＞肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、＜１＞～＜１７＞のいずれか１項に記載の方法を用いる肝疾患コンパニオン診断薬。
　＜２３＞肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質からなり、＜１＞～＜１７＞のいずれか１項に記載の方法における定量対象として用いられる肝疾患マーカー。
　＜２４＞被験者から血液を採取する工程及び血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を検出する工程を含み、また、下記（Ａ）及び（Ｂ１）～（Ｂ４）よりなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む、＜１＞～＜１７＞のいずれか１項に記載の方法。
　（Ａ）肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の正常範囲、又は慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患における肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有する肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲と、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量とを比較し、被験者における上記量が、上記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
　（Ｂ１）健常人の肝型脂肪酸結合タンパク質の量と、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量とを比較し、後者の上記量が前者の上記量に比べて有意に高いことを検出した場合に、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患、又は肝疾患による死亡リスクを有することを決定する工程であって、健常人の肝型脂肪酸結合タンパク質の上記量は、上記被験者が従前、健常であったときの量であってもよい、工程
　（Ｂ２）慢性肝疾患患者の肝型脂肪酸結合タンパク質の量と、被験者におけるＬ－ＦＡＢＰの量とを比較し、後者の上記量が前者の上記量に比べて有意に高いことを検出した場合に、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患、又は肝疾患による死亡リスクを有することを決定する工程であって、慢性肝疾患患者の肝型脂肪酸結合タンパク質の上記量は、上記被験者が従前、慢性肝疾患であったときの量であってもよい、工程
　（Ｂ３）肝硬変患者の肝型脂肪酸結合タンパク質の量と、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量とを比較し、後者の上記量が前者の上記量に比べて有意に高いことを検出した場合に、肝細胞癌又は肝疾患による死亡リスクを有することを決定する工程であって、肝硬変患者の肝型脂肪酸結合タンパク質の上記量は、上記被験者が従前、肝硬変であったときの量であってもよい、工程
　（Ｂ４）肝細胞癌患者の肝型脂肪酸結合タンパク質の量と、被験者におけるＬ－ＦＡＢＰの量とを比較し、後者の上記量が前者の上記量に比べて有意に高いことを検出した場合に、肝細胞癌における死亡リスクが高いことを決定する工程であって、肝細胞癌患者の肝型脂肪酸結合タンパク質の上記量は、上記被験者が従前、肝細胞癌であったときの量であってもよい、工程
　＜２５＞肝疾患の診断方法を含む、＜１＞～＜１７＞のいずれか１項に記載の方法。
　＜２６＞上記＜１＞～＜１７＞のいずれか１項に記載の方法と、当該方法で決定した肝疾患に対する治療薬又は予防薬を被験者に投与する工程を含む、肝疾患の治療又は予防方法。
　＜２７＞上記肝疾患治療薬又は予防薬が、慢性肝疾患治療薬又は予防薬、肝硬変治療薬又は予防薬及び肝細胞癌治療薬又は予防薬よりなる群から選択される少なくとも１種の薬を含む、＜２６＞に記載の方法。
　＜２８＞上記「酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件」において、「上記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質が２，２’－アゾビズ２－アミジノプロパンにより酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質であり、かつ上記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質が２，２’－アゾビズ２－アミジノプロパンにより酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質である」、「上記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質が任意の酸化剤若しくは空気により酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質であり、かつ上記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質が任意の酸化剤若しくは空気により酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質である」又は「上記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質が任意に酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質であり、かつ上酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質が任意に酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質である」、＜６＞～＜１４＞のいずれか１項に記載の方法。
　本発明によれば、単一のタンパク質Ｌ－ＦＡＢＰの測定値に基づき肝疾患早期の患者（例えば、Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類におけるステージＡの患者）から末期肝硬変患者（ないしは肝細胞癌を有する慢性肝疾患患者）までを一貫して評価することができる。また、本発明によれば、Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類における脳症、腹水等の程度といった主観的な要素を含むことなく検査することができる。
　また、血液中Ｌ－ＦＡＢＰは血清アルブミンのように末期肝硬変患者において合成能が低下することがないことから、本発明によれば、Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類などにも用いられる肝疾患検査におけるゴールドスタンダードである血清アルブミンと比較しても検査能が高い。
参考例１の結果を示す図である。 実施例１の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図である。 血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度と、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ及びＡＦＰ－Ｌ３分画との相関分析結果を示す図である。 血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度、酸化率、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの血中濃度、及び血清アルブミン濃度各々についてのＲＯＣ解析結果を示す図である。 酸化率、血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの血中濃度及び血清アルブミン濃度の各々の基準値における生存曲線を示す図である。 ＧＵ処理後Ｌ－ＦＡＢＰの測定値についてのＲＯＣ解析結果及び生存曲線を示す図である。
　以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
（Ｌ－ＦＡＢＰ）
　Ｌ－ＦＡＢＰのアミノ酸配列や遺伝子配列は既に報告されている（Ｖｅｅｒｋａｍｐ　ａｎｄ　Ｍａａｔｍａｎ，　Ｐｒｏｇ．　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．，３４：１７－５２，１９９５）。配列番号１は、野生型ヒトＬ－ＦＡＢＰのアミノ酸配列を表す。
　配列表の配列番号１に記載した野生型ヒト肝型脂肪酸結合タンパク質のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異タンパク質であっても、その変異が野生型ヒト肝型脂肪酸結合タンパク質の３次元構造において保存性が高い変異であれば、これらは全て肝型脂肪酸結合タンパク質の範囲内に属し得る。
　タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものである。実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）又はバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）又はＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等が挙げられる。
　上記Ｌ－ＦＡＢＰの取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換えタンパク質でもよい。
≪肝疾患の検査方法≫
　本発明の第１の態様は、被験者（例えば、患者）から採取した血液中のＬ－ＦＡＢＰを定量する工程を含む肝疾患の検査方法であって、上記定量の結果に基づき、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つを判定する検査方法である。
　第１の態様に係る肝疾患の検査方法において、上記肝疾患の種類としては、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患が挙げられ、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患が好ましく、肝細胞癌がより好ましい。
　本明細書及び特許請求の範囲において、慢性肝疾患としては、ウイルス性肝疾患（例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎）、アルコール性肝疾患、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性胆汁性胆管炎、薬物性肝障害、自己免疫性肝炎等が挙げられる。
　上記肝疾患の進行度としては、早期、中期、末期等が挙げられる。
　上記肝疾患の重篤度としては、軽度、中度、重度等が挙げられる。
　上記判定は、肝疾患による死亡リスクの予測を含むことが好ましい。
　後述の実施例に示すように、血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度は肝疾患マーカーとの相関が得られ、Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類及びＢＣＬＣ病期分類における重症度が上がるとともに高値となり得る。また血清アルブミンと比較して高い予後予測能を示し、肝細胞癌患者における血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度が有意に高値となるとともに肝細胞癌における腫瘍マーカーであるＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＡＦＰ－Ｌ３分画等との相関が得られる。
　上記死亡リスクの予測し得る日数程度としては、肝疾患による死亡リスクを予測し得る限り特に制限はなく、上記定量から所定日以上先の死亡リスクの予測であってもなくてもよいが、例えば、上記定量から１００日以上先の死亡リスクを予測することができ、より先の将来を予測し得る観点から、上記定量から５００日以上先（より好ましくは１１００日以上先、更に好ましくは１５００日以上先、特に好ましくは２０００日以上先、とりわけ好ましくは２５００日以上先、最も好ましくは３０００日以上先）の死亡リスクを予測し得る点で好ましい。
　上記予測の程度の上限としては特に制限はないが、例えば、６０００日以下、５０００日以下、４０００日以下である。
　また、上記予測が、予後の予測であることが好ましい。
　本発明の第２の態様は、被験者から採取した血液中のＬ－ＦＡＢＰを定量する工程を含む肝疾患の検査方法であって、
　上記肝疾患が、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患である、検査方法である。重篤度の観点から、上記肝疾患が、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患であることが好ましい。
　第１及び第２の態様に係る肝疾患の検査方法は、被験者から血液を採取する工程を含んでいても含んでいなくてもよい。第１及び第２の態様に係る肝疾患の検査方法は、血液中のＬ－ＦＡＢＰを検出する工程を含んでいても含んでいなくてもよい。
　また、第１及び第２の態様に係る肝疾患の検査方法は、下記（Ａ）及び（Ｂ１）～（Ｂ４）よりなる群から選択される少なくとも１つの工程を含んでいてもいなくてもよい。
　（Ａ）Ｌ－ＦＡＢＰの量の既知の正常範囲、又は慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患におけるＬ－ＦＡＢＰの量の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有するＬ－ＦＡＢＰの量の既知の範囲と、被験者におけるＬ－ＦＡＢＰの量とを比較し、被験者における上記量が、上記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
　（Ｂ１）健常人のＬ－ＦＡＢＰの量と、被験者におけるＬ－ＦＡＢＰの量とを比較し、後者の上記量が前者の上記量に比べて有意に高いことを検出した場合に、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患、又は肝疾患による死亡リスクを有することを決定する工程であって、健常人のＬ－ＦＡＢＰの上記量は、上記被験者が従前、健常であったときの量であってもよい、工程
　（Ｂ２）慢性肝疾患患者のＬ－ＦＡＢＰの量と、被験者におけるＬ－ＦＡＢＰの量とを比較し、後者の上記量が前者の上記量に比べて有意に高いことを検出した場合に、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患、又は肝疾患による死亡リスクを有することを決定する工程であって、慢性肝疾患患者のＬ－ＦＡＢＰの上記量は、上記被験者が従前、慢性肝疾患であったときの量であってもよい、工程
　（Ｂ３）肝硬変患者のＬ－ＦＡＢＰの量と、被験者におけるＬ－ＦＡＢＰの量とを比較し、後者の上記量が前者の上記量に比べて有意に高いことを検出した場合に、肝細胞癌又は肝疾患による死亡リスクを有することを決定する工程であって、肝硬変患者のＬ－ＦＡＢＰの上記量は、上記被験者が従前、肝硬変であったときの量であってもよい、工程
　（Ｂ４）肝細胞癌患者のＬ－ＦＡＢＰの量と、被験者におけるＬ－ＦＡＢＰの量とを比較し、後者の上記量が前者の上記量に比べて有意に高いことを検出した場合に、肝細胞癌における死亡リスクが高いことを決定する工程であって、肝細胞癌患者のＬ－ＦＡＢＰの上記量は、上記被験者が従前、肝細胞癌であったときの量であってもよい、工程
　第１及び第２の態様に係る肝疾患の検査方法において、Ｌ－ＦＡＢＰの検出ないし定量等の測定方法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、電気化学発光測免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光抗体法（ＦＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット法（ＷＢ）、イムノブロット法などを採用したアッセイ法が挙げられる。Ｌ－ＦＡＢＰの検出ないし定量等の測定方法としては、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を用いた測定であることが好ましい。
　用いる抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体としては、Ｌ－ＦＡＢＰを認識し得る限り特に制限はなく、公知の抗体であってもよく、今後開発される抗体であってもよい。例えば、下記変性処理により外部へ曝露される部位を認識する抗体が挙げられる。
　抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体により定量を行なう場合、上記血液中のＬ－ＦＡＢＰを界面活性剤による変性処理により形成された条件にて定量を行なうことが好ましい。これにより、Ｌ－ＦＡＢＰの一次構造を維持した状態で水素結合、ジスルフィド結合等を切断することによりその立体構造を変性させることができ、抗体がＬ－ＦＡＢＰ分子の内部領域と結合する場合であってもＬ－ＦＡＢＰの酸化状態に影響されることなく、高感度かつ特異的にＬ－ＦＡＢＰを検出ないし定量することができる。
　上記界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が好ましい。
　上記変性処理としては、室温（例えば、２５℃）もしくは加温条件下（例えば、３７℃）にて適切な濃度（例えば、０．２質量／体積％（ｗ／ｖ％）～１０質量／体積％、好ましくは０．４質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上、０．５質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上、又は０．７質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上であってよい。）の界面活性剤により適切な時間（例えば、５～６０分間）処理する方法が挙げられる。
　典型的には、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理することが挙げられる。
　上記測定方法として、より詳細には、抗原（Ｌ－ＦＡＢＰ）に対する認識部位が異なる２種類の抗体を組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法であることが好ましい。
　認識部位が異なる２種類の抗体としては、一方を、マイクロプレートのウェル中の表面に結合させた固相化抗体として用い、他方を、検出ないし定量のための標識抗体として用いることが好ましい。上記標識抗体における標識としては特に制限はなく、例えば、パーオキシダーゼ標識等の酵素標識、蛍光標識、紫外線標識、放射線標識等が挙げられる。
　抗原（Ｌ－ＦＡＢＰ）に対する認識部位が異なる抗体としては、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローン１、クローン２、クローンＬ及びクローンＦよりなる群から選択される抗体を含む抗体が挙げられ（例えば、特許文献１～３）、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローンＬを含む組み合わせ、又は抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローン２を含む組み合わせであることが好ましく、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローンＬを含む組み合わせであることがより好ましく、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローンＬを固相化抗体として用い、任意の抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を標識抗体として用いることが更に好ましく、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローンＬを固相化抗体として用い、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローン２を標識抗体として用いることが特に好ましい。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法を利用したＬ－ＦＡＢＰ測定キットの市販品としては、「レナプロ　Ｌ－ＦＡＢＰ　テストＴＭＢ」（シミックホールディングス社製）、「レナプロ　Ｌ－ＦＡＢＰ　テストＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス社製）等が挙げられる。
　第１及び第２の態様に係る肝疾患の検査方法において、上記血液中のＬ－ＦＡＢＰは、酸化されたＬ－ＦＡＢＰ（以下、単に「酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ」ともいう。）であっても、酸化されていないＬ－ＦＡＢＰ（以下、単に「非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ」ともいう。）であっても、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの混合物であってもよいが、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの混合物又は酸化型Ｌ－ＦＡＢＰが好ましい。
　Ｌ－ＦＡＢＰは、配列番号１における１９番目、７４番目及び１１３番目のメチオニンが酸化され得、上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰは、１９番目、７４番目及び１１３番目のメチオニンの少なくともいずれかが酸化されたＬ－ＦＡＢＰということができる。特に、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を用いた測定値の変化に関しては、１９番目及び１１３番目のメチオニンの酸化が支配的であると考えられることから、１９番目及び１１３番目のメチオニンの少なくともいずれかが酸化されたＬ－ＦＡＢＰが好ましい。
　酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの検出ないし定量等の測定方法としては、「Ｌ－ＦＡＢＰの検出ないし定量等の測定方法」として上述した具体例及び好ましい例と同様のものが挙げられる。抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を用いる測定である場合、用いられる抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体も同様であるが、上記メチオニンの酸化により外部へ曝露される部位を認識する抗体が更に好ましい。
　本発明の第３の態様は、被験者から採取した血液中の酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値を定量する工程を含む肝疾患の検査方法である。
　上記定量する工程が、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値を、抗原抗体反応を促進する処理後に定量する工程であることが好ましい。
　酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量と相関するパラメータとしては、測定値（例えば、標識強度）から換算して算出されるパラメータであって、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量そのものではないパラメータが挙げられる。上記パラメータとして、具体的には、後述する非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における測定値、後述する「血液中のＬ－ＦＡＢＰの酸化率」等が挙げられる。
　第３の態様に係る肝疾患の検査方法において、上記定量する工程が、上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量を定量する工程であることが好ましい。
　第２及び第３の態様に係る肝疾患の検査方法において、上記肝疾患の検査が、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つの判定、肝疾患による死亡リスクの予測、肝疾患進行リスクの予測及び肝疾患進行のモニタリングよりなる群から選択される少なくとも１種の検査が挙げられる。上記肝疾患の検査が、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つの判定、肝疾患による死亡リスクの予後予測、肝疾患進行リスクの予後予測及び肝疾患進行のモニタリングによる予後予測よりなる群から選択される少なくとも１種の検査であることがより好ましい。
　また、上記肝疾患の検査が、疾患の進行状況の判断、治療方針の参考にされることはもちろんであるが、肝疾患による死亡リスクの予測にも用いることができ、肝疾患による死亡リスクの予後の予測に用いられることがより好ましい。
　第３の態様に係る肝疾患の検査方法において、上記肝疾患は、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患が好ましく、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患がより好ましく、肝細胞癌が更に好ましい。
　第３の態様に係る肝疾患の検査方法において、上記定量が、抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における定量であることが好ましい。
　上記の「非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件」は、「上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰがＡＡＰＨにより酸化されたＬ－ＦＡＢＰであり、かつ上記非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰがＡＡＰＨにより酸化されていないＬ－ＦＡＢＰである」、「上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰが任意の酸化剤若しくは空気により酸化されたＬ－ＦＡＢＰであり、かつ上記非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰが任意の酸化剤若しくは空気により酸化されていないＬ－ＦＡＢＰである」及び「上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰが任意に酸化されたＬ－ＦＡＢＰであり、かつ上記非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰが任意に酸化されていないＬ－ＦＡＢＰである」よりなる群から選択されるいずれか１つまたは少なくとも１つを満たしてもよいし、他の条件で満たしてもよい。
　上記条件における定量としては、具体的には、例えば、５０ｍＭのＡＡＰＨにて３７℃６０分間処理した酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰと、未処理の非酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰとを、それぞれ、「レナプロ　Ｌ－ＦＡＢＰ　テスト　ＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用してＥＬＩＳＡ測定し、標識抗体の発色強度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した場合に、濃度２５ｎｇ／ｍｌにおいて、非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が１．４倍以上（好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．８倍以上、更に好ましくは２．０倍以上）高い条件における定量であることがより好ましい。
　測定感度の倍率の上限値としては特に制限はないが、例えば、６倍以下又は４倍以下が挙げられる。
　ここでいう「未処理の非酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰ」とは、１０００ｍＭのベンズアミジン塩酸塩又は１５００ｍＭの塩化グアニジニウムの少なくとも一方にて２５℃１０分間処理した後、「レナプロ　Ｌ－ＦＡＢＰ　テストＨＳ（高感度）」の抗体を使用してＥＬＩＳＡ測定し、標識抗体の発色強度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した場合に、濃度２５ｎｇ／ｍｌにおいて、５０ｍＭのＡＡＰＨにて３７℃６０分間処理した酸化型Ｌ－ＦＡＢＰに対して発色強度が０．７倍以下となるＬ－ＦＡＢＰをいう。
　例えば、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を用いる定量等である場合、上記抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件では、Ｌ－ＦＡＢＰの物理化学的特性が軽度に変更してＬ－ＦＡＢＰと抗体との反応が促進されつつ、Ｌ－ＦＡＢＰの立体構造が損なわれる程には変性していない。これにより、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度よりも高い特性を維持または亢進しつつ、絶対的な測定感度を増加することができる。
　このような条件は、種々のタンパク質変性剤を適切な使用条件との組合せで使用することで形成可能であり、タンパク質変性作用の穏やかな物質を用いることは、使用条件の自由度が高くなる点で好ましい。ただし、タンパク質変性作用の強い物質（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））を用いても、使用条件の自由度が相応に低くはなる（低濃度、低温、短時間等の制約が加わる）が、上記条件形成が可能であり得る。
　この観点で、いわゆる免疫凝集促進剤が好ましく、具体的にはカオトロピック試薬又は有機アミン化合物がより好ましい。
　参考例１において後述するように、免疫凝集促進剤を適切な条件で使用する処理後の測定感度は、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰについて、絶対的に著しく増大しつつ、非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰに比べて相対的に高い。
　したがって、免疫凝集促進剤による処理後の抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を用いる測定値と、上記処理無しの抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を用いる測定値（好ましくは、後述する酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件における測定値）との対比から、血液中の酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを定量し得る。
　免疫凝集促進剤としては、カオトロピック試薬、有機アミン化合物、還元剤（グルタチオン、システイン、ペニシラミン等）、界面活性剤（ｎ－ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等））、又は同様の効果を有する物質等が挙げられ、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物が好ましい。
　第１の態様に係る肝疾患の検査方法において、上記定量が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理後のＬ－ＦＡＢＰの定量であることがより好ましい。
　測定に用いられる抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体は上記と同様であるが、上記メチオニンの酸化により外部へ曝露される部位を認識する抗体が更に好ましい。
　上記カオトロピック試薬ないし有機アミン化合物の具体例としては、尿素、２－アミノ－２－チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、グアニジン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、４－アミノアンチピリン、ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩、ｐ－アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、２，４－ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸１，４－フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩、ベタイン塩酸塩から選ばれる少なくとも１種が好ましく用いられる。この中でも、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、２－アミノ－２－チアゾリン塩酸塩がさらに好ましい。
　また、下記式（Ａ）で表される化合物もしくはその塩又はエステル、下記式（Ａ）で表される化合物又はその塩も好ましく用い得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 （式（Ａ）中、Ｘａ１は、水素原子、水酸基又はアルキル基であり、Ｘａ２～Ｘａ６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、水酸基、カルボキシ基、アミノ基又は－ＳＸａ７（Ｘａ７は、水素原子、水酸基又はアルキル基を表す。Ｘａ７が複数存在するときは、それぞれ同一であっても異なる基であってもよい。）を表す。）
　上記アルキル基としては、直鎖状又は分岐状のアルキル基が挙げられ、炭素原子数１～３のアルキル基が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式（Ｂ）中、Ｘｂ１～Ｘｂ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アミノ基、ハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は－ＳＸｂ６（Ｘｂ６は、水素原子、水酸基又はアルキル基を表す。Ｘｂ６が複数存在するときは、それぞれ同一であっても異なる基であってもよい。）であり、ここで、Ｘｂ１とＸｂ２の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、Ｘｂ３とＸｂ４の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、Ｘｂ５は、水素原子、ハロゲン原子又はアルキル基であり、
　Ｅｂ１は、窒素原子又は硫黄原子であり、
　Ｅｂ２及びＥｂ３は、それぞれ独立して、炭素原子又は窒素原子であり、
　ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕは、それぞれ独立して、０又は１であり、
　Ｅｂ１とＥｂ３との間の二重破線及びＥｂ２とＥｂ３との間の二重破線は、それぞれ独立して、単結合又は二重結合であり、上記ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕの値並びにＥｂ１とＥｂ３との間の二重破線及びＥｂ２とＥｂ３との間の二重破線の結合は、Ｅｂ１～Ｅｂ３の原子価に応じて適宜定まる値及び結合を示す。）
　上記アルキル基としては、直鎖状又は分岐状のアルキル基が挙げられ、炭素原子数１～３のアルキル基が好ましい。
　なお、各有機アミン化合物の塩としては、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素塩、ふっ化水素酸塩、ほうふっ化水素酸塩、しゅう酸塩、乳酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、よう化水素酸塩、トルエンスルホン酸塩、マロン酸塩、重炭酸塩など特に制限は無いが、本発明の効果以外に試薬としての取扱い易さや入手のしやすさ等を勘案して適宜選ぶことができる。
　上記カオトロピック試薬、有機アミン化合物等の免疫凝集促進剤による処理としては、室温（例えば、２５℃）もしくは加温条件下（例えば、３７℃）にて適切な濃度（例えば、１０ｍＭ～３０００ｍＭ）の免疫凝集促進剤により適切な時間（例えば、５～６０分間）処理する方法が挙げられる。上記処理としては、室温（例えば、２５℃）にて任意の濃度の免疫凝集促進剤により処理する方法が好ましい。上記処理として典型的には、１０００ｍＭのベンズアミジン塩酸塩又は１５００ｍＭの塩化グアニジニウムにて２５℃１０分間処理することが挙げられる。
　上記カオトロピック試薬、有機アミン化合物等の免疫凝集促進剤は１種単独で用いても、複数種を混合して用いてもよい。
　ＳＤＳ等の界面活性剤による処理としては、低温（例えば、２５℃以下）にて適切な低濃度（例えば、０．１２質量／体積％未満）の界面活性剤により適切な短時間（例えば、４分未満）処理する方法が挙げられる。
　第３の態様に係る肝疾患の検査方法は、上記非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件よりも、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件にて上記Ｌ－ＦＡＢＰを定量する工程を更に含むことが好ましい。
　酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件として、例えば、５０ｍＭのＡＡＰＨにて３７℃６０分間処理した酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰと、未処理の非酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰとを、「レナプロ　Ｌ－ＦＡＢＰ　テスト　ＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用してＥＬＩＳＡ測定し、標識抗体の発色強度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した場合に、濃度２５ｎｇ／ｍｌにおいて、濃度において、非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が０．８倍以上１．４倍未満（好ましくは０．９倍以上１．２５倍以下）の条件が挙げられる。
　ここでいう「未処理の非酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰ」については前述の通りである。
　このような測定感度差が小さい条件は、種々のタンパク質変性剤を適切な使用条件との組合せで使用することで形成可能であり、タンパク質変性作用の強い物質を用いることは、使用条件の自由度が高くなる点で好ましい。ただし、タンパク質変性作用の穏やかな物質（例えば、上記の免疫凝集促進剤）を用いても、使用条件の自由度が相応に低くはなる（高濃度、高温、長時間等の制約が加わる）が、上記条件形成が可能であり得る。
　この観点で、界面活性剤が好ましく、具体的にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が好ましい。
　上記変性処理としては、室温（例えば、２５℃）もしくは加温条件下（例えば、３７℃）にて適切な濃度（例えば、０．２質量／体積％（ｗ／ｖ％）～１０質量／体積％、好ましくは０．４質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上、０．５質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上、又は０．７質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上であってよい。）の界面活性剤により適切な時間（例えば、５～６０分間）処理する方法が挙げられる。
　上記変性処理として典型的には、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理することが挙げられる。
　免疫凝集促進剤による処理としては、加温条件下（例えば、３７℃以上）にて適切な高濃度（例えば、３５００ｍＭ）の免疫凝集促進剤により適切な長時間（例えば、８０分間）処理する方法が挙げられる。
　本明細書及び特許請求の範囲において、血液中Ｌ－ＦＡＢＰの全濃度（酸化型Ｌ－ＦＡＢＰと、非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰとの総和）に対する血液中の酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの比率を「血液中のＬ－ＦＡＢＰの酸化率」と定義することができる。
　実施例の項において後述するように検査能の観点から、第３の態様に係る肝疾患の検査方法は、上記測定感度差が小さい条件における上記Ｌ－ＦＡＢＰの測定値と、上記非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における測定値とに基づき、血液中のＬ－ＦＡＢＰ中の酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含むことが好ましい。
　「血液中のＬ－ＦＡＢＰの酸化率」は、上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件におけるＬ－ＦＡＢＰの測定値（例えば、標識強度）に対する上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における測定値の比（例えば、下記式で表される吸光度比（ＯＤ比））に略対応し得る。
 
　上記非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件におけるＯＤ値／上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件におけるＬ－ＦＡＢＰのＯＤ値
　また、「血液中のＬ－ＦＡＢＰの酸化率」は、例えば、下記式のように表すこともできる。
　（ａＸ+ｂＹ）（ＯＤ値）／血液中Ｌ－ＦＡＢＰの全濃度（ＯＤ値）
　（上記式中、ａ、ｂは係数を表し、Ｘは酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの濃度を表し、Ｙは非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの濃度を表す。）
　係数ａは酸化型Ｌ－ＦＡＢＰに対する抗体の反応性を表す係数であることが好ましく、係数ｂは非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰに対する抗体の反応性を表す係数であることが好ましい。
　上述のように、第３の態様に係る肝疾患の検査方法は、被験者の血液中の酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値を定量する工程を含み、上記定量する工程が、上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを定量する工程であることが好ましい。
　実施例の項において後述するように、「酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量」の方が、「血液中のＬ－ＦＡＢＰの酸化率」及び「血液中Ｌ－ＦＡＢＰの全濃度」のそれぞれ単独の定量結果よりも高精度に検査し得るからである。
　上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの濃度は、上記酸化率と、上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件におけるＬ－ＦＡＢＰの測定値（血液中Ｌ－ＦＡＢＰの全濃度）との積から定量し得る。
　また、非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰは認識しないが、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを特異的に認識し得る抗酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を用いて上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを定量することもできる。
　第１～３の態様に係る肝疾患の検査方法において、上記定量は、測定される標識の強度（例えば、吸光度、酵素標識強度、蛍光強度、紫外線強度、放射線強度等）と、Ｌ－ＦＡＢＰの量（例えば、濃度）との関係に基づき検量線を作成し、上記検量線に基づき（例えば、対比して）定量してもしなくてもよい。
　本発明の第４の態様は、下記（１）及び（２）よりなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む、被験者におけるＬ－ＦＡＢＰの量又は酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値に基づく肝疾患の検査方法である。
　（１）Ｌ－ＦＡＢＰの量の既知の正常範囲、又は慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患におけるＬ－ＦＡＢＰの量の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有するＬ－ＦＡＢＰの量の既知の範囲と、被験者におけるＬ－ＦＡＢＰの量とを比較し、被験者における上記量が、上記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
　（２）酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患における酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有する酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量の既知の範囲と、被験者の酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における上記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、上記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
　第１～４の態様に係る肝疾患の検査方法は、ＲＯＣ（受信者動作特性）解析結果として、曲線下面積（ＡＵＣ）が０．６５０以上で検査し得ることが好ましく、０．７００以上で検査し得ることがより好ましく、０．７１０以上で検査し得ることが更に好ましい。
　第１～４の態様に係る肝疾患の検査方法は、Ｌ－ＦＡＢＰのみの定量結果に基づくことができるが、他の検査方法（例えば、Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類、ＢＣＬＣ病期分類、ＭＥＬＤ（Ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　Ｅｎｄ－Ｓｔａｇｅ　Ｌｉｖｅｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ）等に基づく検査方法）と併用して用いても用いなくてもよい。
　また、第１～４の態様に係る肝疾患の検査方法は、肝疾患早期の患者（例えば、Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類におけるステージＡの患者）から末期肝硬変患者（ないしは肝細胞癌を有する慢性肝疾患患者）までを一貫して評価することができるが、肝疾患早期の患者から末期肝硬変患者までを一貫して評価しなくてもよい。
　第１～４の態様に係る肝疾患の検査方法は、Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類における脳症の程度及び腹水の程度の評価を含まず、主観的な要素を含むことなく検査することができる。
　第１～４の態様に係る肝疾患の検査方法は、肝疾患の診断方法を含んでいてもいなくてもよい。
　また、本発明は、第１～４の態様に係る肝疾患の検査方法と、当該方法で決定した肝疾患に対する治療薬又は予防薬を被験者に投与する工程を含む肝疾患の治療又は予防方法に関するものであっても、上記に関するものでなくてもよい。
　上記肝疾患治療薬又は予防薬としては、慢性肝疾患治療薬又は予防薬、肝硬変治療薬又は予防薬及び肝細胞癌治療薬又は予防薬よりなる群から選択される少なくとも１種の薬が挙げられる。
≪検査キット、コンパニオン診断薬≫
　本発明の第５の態様は、Ｌ－ＦＡＢＰ又は酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを定量し得る物質を含む肝疾患検査キットであり、第１～３の態様に係る肝疾患の検査方法に用いる検査キットであることが好ましい。
　本発明の第６の態様は、肝型脂肪酸結合タンパク質の量又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む肝疾患コンパニオン診断薬であり、第１～３の態様に係る肝疾患の検査方法を用いるコンパニオン診断薬であることが好ましい。
　本発明の第７の態様は、肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質からなり、第１～３の態様に係る方法における定量対象として用いられる肝疾患マーカーである。
　本明細書及び特許請求の範囲において、「コンパニオン診断薬」は、個々の肝疾患患者に対する医薬品の効果、副作用のリスク、適切な投薬量を予測するために、実際に投薬を開始する前に行う検査で使用される診断薬をいう。
　第５の態様に係る肝疾患検査キットにおいて、上記肝疾患の検査が、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つの判定、肝疾患による死亡リスクの予測、肝疾患進行リスクの予測及び肝疾患進行のモニタリングよりなる群から選択される少なくとも１種の検査が挙げられ、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つの判定、肝疾患による死亡リスクの予後予測、肝疾患進行リスクの予後予測及び肝疾患進行のモニタリングによる予後予測よりなる群から選択される少なくとも１種の検査がより好ましい。
　第６の態様に係るコンパニオン診断薬において、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つの判定、肝疾患による死亡リスクの予測、肝疾患発症リスクの予測及び肝疾患進行のモニタリングよりなる群から選択される少なくとも１種のコンパニオン診断薬が好ましく、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つの判定、肝疾患による死亡リスクの予後予測、肝疾患進行リスクとその予後予測及び肝疾患進行のモニタリングによる予後予測よりなる群から選択される少なくとも１種のコンパニオン診断薬がより好ましい。
　また、上記肝疾患のコンパニオン診断薬が、肝疾患による死亡リスクの予測が好ましく、肝疾患による死亡リスクの予後の予測がより好ましい。
　第６の態様に係るコンパニオン診断薬において、肝疾患の種類としては、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患が好ましく、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患がより好ましく、肝細胞癌が更に好ましい。
　第５の態様に係る検査キット及び第６の態様に係るコンパニオン診断薬において、Ｌ－ＦＡＢＰ又は酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを定量し得る物質としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、電気化学発光測免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光抗体法（ＦＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット法（ＷＢ）、イムノブロット法などに基づいてＬ－ＦＡＢＰ又は酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを定量する物質が挙げられ、具体的には、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体が好ましい。
　用いる抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体としては、Ｌ－ＦＡＢＰを認識し得る限り特に制限はなく、公知の抗体であってもよく、今後開発される抗体であってもよい。例えば、上記変性処理、上記メチオニンの酸化等により外部へ曝露される部位を認識する抗体が挙げられる。
　上記定量手段として、より詳細には、抗原（Ｌ－ＦＡＢＰ）に対する認識部位が異なる２種類の抗体を組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を採用したアッセイ系が好ましい。
　認識部位が異なる２種類の抗体については≪肝疾患の検査方法≫において上述した通りである。
　上記定量手段としては、試薬として上記抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を含むことが好ましく、標識抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を更に含むことがより好ましく、必要に応じて吸着防止剤（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、スキムミルク、ポリエチレングリコール等）、前処理液（任意の界面活性剤、任意の緩衝液等）、反応緩衝液（任意の緩衝液等）、発色基質（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、過酸化水素水等）等を含んでいてもよい。
　上記定量手段における吸着防止剤の含有量としては本発明の効果を損なわない限りにおいて特に制限はないが、０．０５～１０質量％であることが好ましい。
　上記定量手段として、抗原に対する認識部位が異なる２種類の抗体を組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いたキットであることが好ましく、固相に抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローンＬ、標識抗体に抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローン２を使用しているキットであることがより好ましい。
　第５の態様に係る検査キット及び第６の態様に係るコンパニオン診断薬は、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体により定量を行なう場合、定量に先だって、界面活性剤によりＬ－ＦＡＢＰを変性する手段を備えることが好ましい。
　第５の態様に係る肝疾患検査用キットは、上記血液中のＬ－ＦＡＢＰを界面活性剤により変性処理する手段、及び
　上記変性処理後のＬ－ＦＡＢＰを定量する手段を更に備えることがより好ましい。
　上記界面活性剤としては、上述の通りである。
　上記変性手段としては、室温（例えば、２５℃）もしくは加温条件下（例えば、３７℃）にて任意の濃度（例えば、０．２質量／体積％～１０質量／体積％）の界面活性剤により処理する手段（例えば、上記界面活性剤、任意の緩衝液等を含む変性処理液）が挙げられる。
　第５の態様に係る検査キット及び第６の態様に係るコンパニオン診断薬は、血液中のＬ－ＦＡＢＰを免疫凝集促進剤（好ましくはカオトロピック試薬又は有機アミン化合物）により処理する手段を更に備え、かつ上記定量する手段が上記処理後のＬ－ＦＡＢＰを定量する手段であることが好ましい。
　第５の態様に係る検査キット及び第６の態様に係るコンパニオン診断薬が、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いたキットである場合の具体的態様としては、例えば、下記（１）～（１０）を含むキットが挙げられる。
（１）Ｌ－ＦＡＢＰ抗体固相化マイクロプレート……抗ヒトＬ－ＦＡＢＰマウスモノクローナル抗体結合ウェル例えば、クローンＬ産生細胞株由来）
（２）変性処理液（例えば、任意の界面活性剤）
（３）免疫凝集促進剤処理液（例えば、カオトロピック試薬、有機アミン化合物）
（４）反応緩衝液
（５）酵素標識抗体……パーオキシダーゼ標識抗ヒトＬ－ＦＡＢＰマウスモノクローナル抗体（例えば、クローン２産生細胞株由来）
（６）酵素基質液
（７）洗浄剤（任意の緩衝液、界面活性剤等）
（８）反応停止液（１Ｎ硫酸等）
（９）標準緩衝液（任意の緩衝液等）
（１０）肝型脂肪酸結合タンパク質標品
　（１０）肝型脂肪酸結合タンパク質標品の濃度としては特に制限はなく、例えば、１０～１００００ｎｇ／ｍＬが挙げられ、５０～５０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１００～１０００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２００～８００ｎｇ／ｍＬが更に好ましく、３００～６００ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。
　第５の態様に係る検査キット及び第６の態様に係るコンパニオン診断薬は、タンパク吸着防止を目的としてＢＳＡを含有するタンパク質保存緩衝液を含むことが好ましい。例えば、下記タンパク質保存緩衝液が挙げられる。
（タンパク質保存緩衝液）
１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１．０％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３
　以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
＜参考例１＞
　５０ｍＭのＡＡＰＨにて３７℃６０分間処理した様々な濃度の酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰと、未処理の様々な濃度の非酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰとを、それぞれ、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理した後、「レナプロ　Ｌ－ＦＡＢＰ　テスト　ＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用してＥＬＩＳＡ測定を実施し、標識抗体の発色強度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した。上記検査用キットの使用方法は通常添付されている添付文書に従った測定方法に準じて行った。
　結果を図１（ａ）に示す。
　一方、ＳＤＳによる変性処理の代わりに１０００ｍＭのベンズアミジン塩酸塩にて２５℃１０分間処理（以下、「ＢＡ処理」ともいう。）すること以外は同様にしてＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果を図１（ｂ）に示す。
　また、ＳＤＳによる変性処理の代わりに１５００ｍＭの塩化グアニジニウムにて２５℃１０分間処理（以下、「ＧＵ処理」ともいう。）すること以外は同様にしてＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果を図１（ｃ）に示す。
　図１ａ）に示した結果から明らかなように、リコンビナントＬ－ＦＡＢＰの各濃度において、酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰのＯＤ測定値（強度）と、非酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰのＯＤ測定値とはほぼ同一になることが分かる。
　一方、図１（ｂ）及び（ｃ）に示した結果から明らかなように、ＳＤＳによる変性処理の代わりにＢＡ処理又はＧＵ処理した場合は、リコンビナントＬ－ＦＡＢＰの任意の１つの濃度において、非酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰのＯＤ測定感度に対する酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰのＯＤ測定感度が大きいことが分かる。
　この測定感度の増大は、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰは抗体が認識するＬ－ＦＡＢＰ内部領域が外部へ曝露される構造変化を起こすことに起因するものと考えられる。
　一方、非酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰでは、Ｌ－ＦＡＢＰ内部領域を認識する抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を測定に用いても上記抗体が認識するＬ－ＦＡＢＰ内部領域が外部へ曝露される構造変化を起こしていないことから測定強度が増大していないものと考えられる。
＜実施例１＞
　慢性肝炎（ＣＨ）患者、肝硬変（ＬＣ）患者、Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類におけるステージＡ（以下、単に「ＣＰ　Ａ」ともいう。）の患者、ステージＢ（以下、単に「ＣＰ　Ｂ」ともいう。）の患者及びステージＣ（以下、単に「ＣＰ　Ｃ」ともいう。）の患者の各々の血液検体を用いて、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理した後、「レナプロ　Ｌ－ＦＡＢＰ　テスト　ＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用して血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を測定した。結果を図２（ａ）及び（ｂ）に示す。図中＊＊は有意水準ｐ＜０．０１を、＊＊＊はｐ＜０．００１をそれぞれ示す。
　図２（ａ）に示した結果から明らかなように、ＣＨ患者よりもＬＣ患者の血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度が有意に高いことが分かる。
　また、図２（ｂ）に示した結果から明らかなように、Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類におけるステージＡの患者からステージＢ、ステージＣというように病態ステージが進むごとに血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度が有意に高値となり、血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度を測定することにより、慢性肝炎患者から末期肝硬変患者までを検査し得ることが分かる。
　また、世界的に頻用されるＣｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類の病態ステージごとにＬ－ＦＡＢＰ値が高くなることはこれまで報告されておらず、またＨＣＶ、ＮＡＳＨといった限定された肝疾患ではなく様々な肝疾患背景をもつ患者群からなる検体においてＬ－ＦＡＢＰの高い検査能が得られた。
＜実施例２＞
　肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する慢性肝疾患患者（ＨＣＣ（＋））、及びＨＣＣを有さない慢性肝疾患患者（ＨＣＣ（－））の各々の血液検体を用いて、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理した後、「レナプロ　Ｌ－ＦＡＢＰ　テスト　ＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用して血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を測定した。結果を図３（ａ）に示す。図中＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
　図３（ａ）に示した結果から明らかなように、ＨＣＣを有さない慢性肝疾患患者に比べて、ＨＣＣを有する慢性肝疾患患者において血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度が有意に高値となることが分かり、血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度を測定することにより、慢性肝疾患患者において、更に、ＨＣＣの有無をも検査し得ることが分かる。
　慢性肝疾患のなかでも、病態が更に進行した肝硬変（ＬＣ）患者について、肝細胞癌（ＨＣＣ）を有するＬＣ患者（ＨＣＣ（＋））、及びＨＣＣを有さないＬＣ患者（ＨＣＣ（－））の各々の血液検体を用いて、同様に変性処理後、血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を測定した。結果を図３（ｂ）に示す。図中＊＊はｐ＜０．０１を示す。
　図３（ｂ）に示した結果から明らかなように、ＨＣＣを有さないＬＣ患者に比べて、ＨＣＣを有するＬＣ患者において血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度が有意に高値となることが分かり、血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度を測定することにより、ＬＣ患者において、更に、ＨＣＣの有無をも検査し得ることが分かる。
　ＢＣＬＣ分類のステージＡ～Ｄの患者についても同様に変性処理後、血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を測定した。結果を図３（ｄ）に示す。
　また、図３（ｄ）に示した結果から明らかなように、ＢＣＬＣ分類のステージＡの患者よりもステージＢ～Ｄの患者において高値となる傾向が認められることが分かる。
（比較例１）
　比較例１として、ＨＣＣを有するＬＣ患者（ＨＣＣ（＋））、及びＨＣＣを有さないＬＣ患者（ＨＣＣ（－））の各々の血液検体を用いて、血液中アルブミン（Ａｌｂ）濃度（Ｕ／Ｌ）を測定した。結果を図３（ｃ）に示す。
　図３（ｃ）に示した結果から明らかなように、ＨＣＣ（＋）とＨＣＣ（－）との間に血液中Ａｌｂ濃度の有意差がないことが分かる。
　慢性肝疾患のなかでも、病態が更に進行したＬＣ患者においては、Ａｌｂ合成能が低下しており、ＨＣＣの有無を検査し得ないことが分かる。
　血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度と、肝細胞癌の検査マーカーであるＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ及びＡＦＰ－Ｌ３分画との相関分析を行なった。なお、ＡＦＰ－Ｌ３分画はＡＦＰよりも肝細胞癌に対する特異性が高いことが知られている。結果を図４（ａ）～（ｃ）に示す。
　図４（ａ）～（ｃ）に示した結果から明らかなように、血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度は、ＰＩＶＫＡ－ＩＩと有意（ｐ＜０．０００１）に相関係数ｒ＝０．５１８の高い相関が見られ、ＡＦＰと有意（ｐ＝０．００２）に相関係数ｒ＝０．２７１の低い相関が見られ、ＡＦＰ－Ｌ３分画と有意（ｐ＝０．００４）に相関係数ｒ＝０．４１５の高い相関が見られた。
　以上、実施例２に示した結果から、血液中Ｌ－ＦＡＢＰ濃度を測定することにより、Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類におけるステージＡの患者から末期肝硬変患者、また肝細胞癌を有する慢性肝疾患患者までを一貫して評価することができ、かつＣｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分類における脳症や腹水の程度といった主観的な要素を含むことなく肝疾患進行リスクの予測ないし肝疾患進行のモニタリングを検査することができるといえる。
＜実施例３＞
　ＨＣＣを有する慢性肝疾患患者（ＨＣＣ（＋））、及びＨＣＣを有さない慢性肝疾患患者（ＨＣＣ（－））の各々の血液検体を用いて、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理した後、「レナプロ　Ｌ－ＦＡＢＰ　テスト　ＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用して血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度（ｎｇ／ｍｌ）を測定した。
　また、ＨＣＣ（＋）、及びＨＣＣ（－）の各々の血液検体を、ＳＤＳによる変性処理の代わりにＧＵ処理すること以外は同様にしてＥＬＩＳＡ測定を実施し、ＧＵ処理後ＯＤ値／ＳＤＳによる変性処理後ＯＤ値からＬ－ＦＡＢＰの酸化率を算出した。
　また、上記得られた酸化率と、上記血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度（ｎｇ／ｍｌ）との積から酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの血中濃度（ｎｇ／ｍｌ）を算出した。結果を下記表１に示す。
　また、肝疾患により死亡した群（死亡群）と、肝疾患により死亡しなかった群（生存群）との慢性肝疾患患者の各々の血液検体を用いて血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度、また、ＧＵ処理後強度を同様に測定し、Ｌ－ＦＡＢＰの酸化率、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの血中濃度を各々算出した。結果を下記表２に示す。
（比較例２）
　また、比較例２として、ＨＣＣ（＋）、ＨＣＣ（－）、死亡群、及び生存群の各々の血液検体において血清アルブミン濃度（Ｕ／Ｌ）も測定した。結果を下記表１及び２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記表１及び２に示した結果から明らかなように、ＨＣＣ（－）と比べＨＣＣ（＋）においてＬ－ＦＡＢＰ全濃度が有意に高値となること、生存群と比べ死亡群においてＬ－ＦＡＢＰ全濃度が有意に高値となることが分かる。
　また、ＨＣＣ（－）と比べＨＣＣ（＋）においてＬ－ＦＡＢＰの酸化率が高値となる傾向があること、生存群と比べ死亡群においてＬ－ＦＡＢＰの酸化率が有意に高値となることが分かる。
　また、酸化率と血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度との積から得られた酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの血中濃度が、ＨＣＣ（－）と比べＨＣＣ（＋）において有意に高値となること、生存群と比べ死亡群において有意に高値となることが分かる。
　Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度、酸化率よりも、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの血中濃度の方が、ＨＣＣ（－）と比べたＨＣＣ（＋）及び生存群と比べた死亡群のいずれにおいても小さなｐ値で有意に高値となることが示されていることから、最も高精度に肝疾患を検査し得るといえる。
　一方、比較例２の血清アルブミン濃度はＨＣＣ（－）及びＨＣＣ（＋）間において有意差がなく、生存群及び死亡群間において有意差がなく肝疾患の検査能に劣っていることが分かる。
　肝疾患の検査能の精度をより詳細に評価する観点から、上記血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度、Ｌ－ＦＡＢＰの上記酸化率、並びに上記酸化率と上記血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度との積から得られる酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの血中濃度各々についてＲＯＣ解析を行なった。また、比較例２の血清アルブミン濃度についてもＲＯＣ解析を行なった。結果を図５に示す。
　図５に示した結果から明らかなように、Ｌ－ＦＡＢＰの酸化率のＡＵＣが０．６５８、ｐが０．００９であり、血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度のＡＵＣが０．７０１、ｐが０．０００８であり、及び上記酸化率と上記血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度との積から得られる酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの血中濃度のＡＵＣが０．７２９、ｐが０．０００１であり、上記酸化率、上記血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度及び上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの血中濃度の順に、肝疾患の検査能の精度が向上していることが分かり、いずれも高精度に肝疾患を検査し得ることが分かり、特に、上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの血中濃度は肝疾患の検査能の精度に最も優れることが分かる。
　一方、比較例２の血清アルブミン濃度についてはＡＵＣが０．５６８と小さく、ｐ値も０．２９と大きく有意性がなく、肝疾患の検査能に劣っていることが分かる。
　上記ＲＯＣ解析結果から、血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度の基準値（カットオフ値）７．７、上記血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度との積から得られる酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの血中濃度の基準値１．９、血清アルブミン濃度の基準値３．１が得られた。
　上記血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度の上記基準値で分けた生存曲線及び上記酸化率と上記血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度との積から得られる酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの血中濃度の上記基準値で分けた生存曲線、及び血清アルブミン濃度の上記基準値で分けた生存曲線を図６（ａ）～（ｂ）に示す。
　図６（ａ）に示した結果から明らかなように、上記血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度が基準値７．７より大きい場合と基準値７．７以下の場合との生存曲線のｐ値は＜０．００３であり有意差があり、肝疾患による死亡リスク（好ましくは、定量から１１００日以上先の死亡リスク）を予測し得ることが分かる。
　図６（ｂ）に示した結果から明らかなように、更に、上記酸化率と上記血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度との積から得られる酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの血中濃度が基準値１．９より大きい場合と基準値１．９以下の場合との生存曲線のｐ値は＜０．０００１であり有意差が大きく、特に肝疾患の検査能に優れ、肝疾患による死亡リスクを予測し得ることが分かる。
　一方、図６（ｃ）に示した結果から明らかなように、血清アルブミン強度３．１より大きい場合と血清アルブミン濃度３．１以下の場合との生存曲線のｐ値は＜０．０２であり有意性が小さく、肝疾患の検査能に劣っていることが分かる。
　ＧＵ処理後のＬ－ＦＡＢＰの測定値についてもＲＯＣ解析を行なった。結果を図７（ａ）に示す。
　また、比較のため、上記血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度、上記酸化率と上記血液中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度との積から得られる酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの血中濃度、及び比較例２の血清アルブミン濃度各々についてのＲＯＣ解析結果を図５から転記する。
　図７（ａ）に示した結果から明らかなように、ＧＵ処理後Ｌ－ＦＡＢＰの測定値のＡＵＣは０．７１７、ｐ値が０．０００９であり、上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの血中濃度のＡＵＣ及びｐ値に近い値が得られ、上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの血中濃度に準じる程度に高精度に肝疾患を検査し得ることが分かる。
　上記ＲＯＣ解析結果から、ＧＵ処理後のＬ－ＦＡＢＰの測定値の基準値４．５が得られた。
　ＧＵ処理後Ｌ－ＦＡＢＰの測定値の基準値４．５で分けた生存曲線を図７（ｂ）に示す。
　図７（ｂ）に示した結果から明らかなように、ＧＵ処理後Ｌ－ＦＡＢＰの測定値が基準値４．５より大きい場合と基準値４．５以下の場合との生存曲線のｐ値は＜０．０００２であり有意差が大きく肝疾患の検査能に優れ、肝疾患による死亡リスク（好ましくは、定量から１１００日以上先の死亡リスク）を予測し得ることが分かる。

Claims (23)

  1. 　被験者から採取した血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含み、
    　前記定量の結果に基づき、血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質の量と相関する肝疾患の進行度又は重篤度を検査する方法。
  2. 　前記検査は、肝疾患による死亡リスクの予測を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記予測が、日数を含めた死亡リスク発生の予測である、請求項２に記載の方法。
  4. 　被験者から採取した血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含み、
    　肝硬変を含む慢性肝疾患である肝疾患の検査方法。
  5. 　前記肝疾患が、肝硬変を含む慢性肝疾患及び肝細胞癌の併発である、請求項４に記載の方法。
  6. 　被験者から採取した血液中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値を定量する工程を含み、
    　前記定量する工程が、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程であるか、又は
    　前記定量が、抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における定量である、
    　血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質の量と相関する肝疾患の検査方法。
  7. 　血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質の定量値に対する前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の定量値の比率を酸化率として求める工程を含み、
    　前記測定感度が高い条件が、前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が１．４倍以上の条件である、請求項６に記載の検査方法。
  8. 　前記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、請求項６に記載の検査方法。
  9. 　前記抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて前記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、請求項６～８のいずれか１項に記載の検査方法。
  10. 　前記測定感度差が小さい条件が、前記血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、請求項９に記載の検査方法。
  11. 　前記測定感度差が小さい条件における前記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、前記抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、請求項９又は１０に記載の検査方法。
  12. 　前記肝疾患が、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患である、請求項１、２、３又は６に記載の検査方法。
  13. 　前記検査が、肝疾患による死亡リスクの予測を含む、請求項４～６のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記予測が、日数を含めた死亡リスク発生の予測である、請求項１３に記載の方法。
  15. 　下記（１）及び（２）よりなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値に基づく肝疾患の検査方法。
    　（１）肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の正常範囲、又は慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患における肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有する肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲と、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量とを比較し、被験者における前記量が、前記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
    　（２）酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有する酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲と、被験者の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における前記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、前記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
  16. 　肝型脂肪酸結合タンパク質のみの定量結果に基づく、請求項１５に記載の方法。
  17. 　脳症の程度及び腹水の程度の評価を含まない、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 　肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法に用いる肝疾患検査キット。
  19. 　肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つを検査する請求項１８に記載の肝疾患検査キット。
  20. 　さらに変性処理剤を含む請求項１８に記載の肝疾患検査キット。
  21. 　前記肝型脂肪酸結合タンパク質又は前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質は抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体であり、前記変性処理剤は界面活性剤またはドデシル硫酸ナトリウムである請求項２０に記載の肝疾患検査キット。
  22. 　肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法を用いる肝疾患コンパニオン診断薬。
  23. 　肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質からなり、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法における定量対象として用いられる肝疾患マーカー。
     
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