WO2020067471A1 - 肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する方法、その定量用キット、腎疾患の検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬 - Google Patents

肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する方法、その定量用キット、腎疾患の検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬 Download PDF

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fatty acid
binding protein
oxidized
acid binding
liver
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敬一 大畑
健 菅谷
剛 及川
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シミックホールディングス株式会社
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantifying hepatic fatty acid binding protein in a sample, a kit for quantifying the same, a method for testing renal disease, a test kit therefor, and a companion diagnostic agent.
  • L-FABP Liver-type fatty acid binding protein
  • L-FABP Liver-type Fatty Acid Binding Protein
  • Non-Patent Document 1 a renal disease test based on detection of the total amount of L-FABP protein derived from kidney tissue in urine is possible (for example, Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 L-FABP is stabilized in such a manner that two ⁇ -helices cover a ⁇ -barrel structure in which two antiparallel ⁇ -sheets are orthogonal, and binds to two molecules of free fatty acids.
  • Non-Patent Document 3 ⁇ L-FABP undergoes a structural change by oxidative modification of a methionine residue, thereby exposing the internal region of the L-FABP molecule.
  • AAPH 2,2′-azobiz-2-amidinopropane
  • Patent Document 5 discloses that a urine sample contains, as a denaturant, a compound comprising a reducing agent (such as glutathione, cysteine, or penicillamine), a chaotropic reagent (such as urea or guanidine) and a surfactant (such as sodium n-dodecylbenzenesulfonate).
  • a reducing agent such as glutathione, cysteine, or penicillamine
  • a chaotropic reagent such as urea or guanidine
  • a surfactant such as sodium n-dodecylbenzenesulfonate
  • Patent Document 6 discloses a method of promoting aggregation based on a specific reaction without causing natural aggregation of carrier particles by using an organic amine compound.
  • the present invention has been made in view of such circumstances of the prior art, and a method for quantifying L-FABP or oxidized L-FABP in an arbitrary sample, a kit for quantifying the L-FABP, a kit for quantifying the L-FABP, and urine of a subject
  • An object of the present invention is to provide a method for examining a renal disease based on a quantitative result of L-FABP or oxidized L-FABP, a test kit thereof, and a companion diagnostic agent.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, by appropriately performing a treatment for promoting the antigen-antibody reaction, the L-FABP oxidized relative to the non-oxidized L-FABP It has been found that it is possible to realize a condition in which the measurement sensitivity is relatively high and the measurement sensitivity of oxidized L-FABP is absolutely high.
  • the present inventors have also found that the rate of oxidation of L-FABP in urine is different between patients with chronic kidney disease (CKD) and patients with acute kidney disease (AKI).
  • CKD chronic kidney disease
  • AKI acute kidney disease
  • a method for quantifying liver-type fatty acid binding protein comprising a step of quantifying the protein.
  • the condition is a condition formed by treatment with a chaotropic reagent or an organic amine compound.
  • the oxidized liver-type fatty acid binding protein and the non-oxidized liver are more than the condition in which the measurement sensitivity of the oxidized liver-type fatty acid binding protein is higher than the measurement sensitivity of the non-oxidized liver-type fatty acid binding protein.
  • the condition having a small difference in the measurement sensitivity is a condition formed by denaturing a liver-type fatty acid-binding protein in a sample with a surfactant.
  • ⁇ 5> Based on the measured value of the liver-type fatty acid binding protein under the condition where the difference in the measurement sensitivity is small and the measurement value under the condition where the measurement sensitivity of the oxidized liver-type fatty acid binding protein is high, The method according to ⁇ 3> or ⁇ 4>, further comprising a step of calculating an oxidation rate substantially corresponding to a ratio of the oxidized liver-type fatty acid binding protein in the binding protein.
  • a method for examining a renal disease comprising a step of quantifying the liver-type fatty acid binding protein of the present invention.
  • a method for examining a renal disease comprising a step of quantifying the amount of oxidized hepatic fatty acid binding protein in the urine of a subject or the value of a parameter correlated therewith after treatment for promoting an antigen-antibody reaction.
  • ⁇ 9> The method according to ⁇ 8>, wherein the quantification is quantification under conditions where the measurement sensitivity of the oxidized liver-type fatty acid binding protein is higher than the measurement sensitivity of non-oxidized liver-type fatty acid binding protein.
  • the condition is a condition formed by treatment with a chaotropic reagent or an organic amine compound.
  • the oxidized liver-type fatty acid binding protein and the non-oxidized liver are more than the condition in which the measurement sensitivity of the oxidized liver-type fatty acid binding protein is higher than the measurement sensitivity of the non-oxidized liver-type fatty acid binding protein.
  • the condition under which the difference in measurement sensitivity is small is a condition formed by denaturing the liver-type fatty acid binding protein in the urine with a surfactant.
  • the liver-type fatty acid in urine is determined.
  • the method according to ⁇ 11> or ⁇ 12> further comprising calculating an oxidation rate substantially corresponding to a ratio of the oxidized hepatic fatty acid binding protein in the binding protein.
  • Known normal range of the amount of the oxidized liver-type fatty acid binding protein or the value of the parameter correlated therewith, or known amount of the oxidized liver-type fatty acid binding protein in the renal disease or the value of the parameter correlated therewith The range is compared with the amount of oxidized liver-type fatty acid binding protein in the urine of the subject or the value of a parameter correlated therewith, and the value of the amount or the parameter correlated therewith in the subject falls under any of the above ranges.
  • a test kit for use in the method according to any one of ⁇ 7> to ⁇ 14> comprising a substance capable of quantifying liver-type fatty acid binding protein or oxidized liver-type fatty acid binding protein.
  • a companion diagnostic agent used in the method according to any one of ⁇ 7> to ⁇ 14> comprising a substance capable of quantifying liver-type fatty acid binding protein or oxidized liver-type fatty acid binding protein.
  • a kidney disease marker comprising a liver-type fatty acid binding protein or an oxidized liver-type fatty acid binding protein, which is used as a quantification target in the method according to any one of ⁇ 7> to ⁇ 14>.
  • ⁇ 18> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, including a step of collecting a specimen from a subject and a step of detecting a liver-type fatty acid binding protein in the specimen.
  • ⁇ 19> a step of collecting urine from a subject and a step of detecting liver-type fatty acid binding protein in the urine, and at least one selected from the group consisting of the following (A) and (B1) to (B4)
  • the amount or value of the oxidized hepatic fatty acid binding protein of a healthy person is the amount or value when the subject was previously healthy.
  • (B2) the amount of oxidized hepatic fatty acid binding protein of a healthy person or the value of a parameter correlated therewith, and the amount of oxidized hepatic fatty acid binding protein of a subject or a parameter correlated therewith Comparing with the value, when the latter value is detected to be significantly lower than the former value, a step of determining that suffering from acute kidney disease, oxidized healthy people
  • the amount or value of the liver-type fatty acid binding protein may be the amount or value when the subject was previously healthy.
  • Step (B3) Oxidation of an Acute Kidney Disease Patient Comparing the amount of the type fatty acid binding protein or the value of the parameter correlated therewith with the amount of the liver type fatty acid binding protein in the subject, and when it is detected that the latter value is significantly higher than the former value
  • the step of determining that the patient suffers from chronic kidney disease the amount or value of the oxidized hepatic fatty acid binding protein of the patient with acute kidney disease, when the subject had previously had acute kidney disease
  • B4 comparing the amount of oxidized hepatic fatty acid binding protein in a patient with chronic kidney disease or a parameter value correlated therewith with the amount of hepatic fatty acid binding protein in a subject
  • the above amount or value of the oxidized hepatic fatty acid binding protein of the patient may be the amount or value when the subject had previously had chronic kidney disease.
  • Treatment or prevention of a renal disease comprising the method according to any one of the above ⁇ 7> to ⁇ 14> and a step of administering to the subject a therapeutic or prophylactic agent for the renal disease determined by the method.
  • Method. ⁇ 22> The method according to ⁇ 21>, wherein the renal disease therapeutic or preventive drug comprises at least one drug selected from the group consisting of a chronic renal disease therapeutic or preventive drug and an acute renal disease therapeutic or preventive drug.
  • oxidized liver-type fatty acid binding protein is higher than the measurement sensitivity of non-oxidized liver-type fatty acid binding protein
  • a liver-type fatty acid binding protein oxidized by 2'-azobiz-2-amidinopropane, and the non-oxidized liver-type fatty acid binding protein is not oxidized by 2,2'-azobiz-2-amidinopropane
  • the oxidized liver-type fatty acid binding protein is a liver-type fatty acid binding protein oxidized by any oxidizing agent or air, and the unoxidized liver-type fatty acid binding protein is any oxidized liver-fatty acid binding protein.
  • liver-type fatty acid binding protein that has not been oxidized by an agent or air "or"
  • the liver-type fatty acid binding protein is an oxidized liver-type fatty acid-binding protein
  • the non-oxidized liver-type fatty acid-binding protein is a liver-type fatty acid-binding protein that is not oxidized arbitrarily.
  • the present invention it is possible to provide a method for quantifying L-FABP or oxidized L-FABP in an arbitrary sample, and a kit for quantifying the method. Further, according to the present invention, a test method and a test kit for testing renal diseases such as chronic renal disease and acute renal disease based on the quantitative results of L-FABP or oxidized L-FABP in urine of a subject And a companion diagnostic agent.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of Reference Example 1.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of Example 1.
  • L-FABP The amino acid sequence and gene sequence of L-FABP have already been reported (Veerkamp and Maatman, Prog. Lipid Res., 34: 17-52, 1995).
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of wild-type human L-FABP. Even if the mutant protein is a mutant protein resulting from substitution, insertion, deletion or the like in the amino acid sequence of the wild-type human liver-type fatty acid binding protein described in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, the mutation is 3% of the wild-type human liver-type fatty acid binding protein. If the mutations are highly conserved in the dimensional structure, they can all belong to the range of liver-type fatty acid binding protein.
  • the side chains of amino acids that are constituents of proteins are different in hydrophobicity, charge, size, and the like.
  • Several highly conserved relationships in the sense that they do not substantially affect the three-dimensional structure (also referred to as a three-dimensional structure) of the whole protein are known by empirical and physicochemical measurements.
  • glycine (Gly) and proline (Pro) For example, for substitution of amino acid residues, glycine (Gly) and proline (Pro), Gly and alanine (Ala) or valine (Val), leucine (Leu) and isoleucine (Ile), glutamic acid (Glu) and glutamine (Gln) ), Aspartic acid (Asp) and asparagine (Asn), cysteine (Cys) and threonine (Thr), Thr and serine (Ser) or Ala, lysine (Lys) and arginine (Arg), and the like.
  • Glycine (Gly) and proline (Pro) Gly and alanine (Ala) or valine (Val), leucine (Leu) and isoleucine (Ile), glutamic acid (Glu) and glutamine (Gln) ), Aspartic acid (Asp) and asparagine (Asn), cysteine (Cys) and
  • the method for obtaining L-FABP is not particularly limited, and may be a protein synthesized by chemical synthesis or a recombinant protein produced by a genetic recombination technique.
  • the first aspect of the present invention provides a measurement sensitivity for a liver-type fatty acid binding protein (hereinafter, also simply referred to as “non-oxidized L-FABP”) that has been subjected to a treatment for promoting an antigen-antibody reaction and has not been oxidized.
  • a method for quantifying L-FABP including a step of quantifying L-FABP under a condition where measurement sensitivity of oxidized liver-type fatty acid binding protein (hereinafter, also simply referred to as “oxidized L-FABP”) is high. is there.
  • the method for quantifying L-FABP according to the first aspect may or may not include the step of collecting a specimen from a subject, and may or may not include the step of detecting liver-type fatty acid binding protein in the specimen. You may.
  • the specimen containing L-FABP may be any specimen, for example, urine, blood, sweat, etc., with urine being preferred.
  • the specimen may or may not contain non-oxidized L-FABP, and may contain a mixture of oxidized L-FABP and non-oxidized L-FABP. May be.
  • the sample preferably contains a mixture of oxidized L-FABP and non-oxidized L-FABP or oxidized L-FABP.
  • methionine at positions 19, 74 and 113 in SEQ ID NO: 1 can be oxidized, and in the oxidized L-FABP, at least one of methionine at positions 19, 74 and 113 is oxidized. It can be called L-FABP.
  • the oxidation of methionine at positions 19 and 113 is considered to be dominant, so that at least one of methionine at positions 19 and 113 is oxidized. L-FABP is preferred.
  • Measurement methods such as detection or quantification of L-FABP include enzyme immunoassay (EIA, ELISA), fluorescent enzyme immunoassay (FLEIA), chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA), and chemiluminescence immunoassay (CLIA). ), An electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA), a fluorescent antibody method (FA), a radioimmunoassay (RIA), a western blot method (WB), an immunoblot method, or the like.
  • EIA enzyme immunoassay
  • FLEIA fluorescent enzyme immunoassay
  • CLIA chemiluminescence enzyme immunoassay
  • CLIA chemiluminescence immunoassay
  • An electrochemiluminescence immunoassay ECLIA
  • a fluorescent antibody method FA
  • RIA radioimmunoassay
  • WB western blot method
  • an immunoblot method or the like.
  • the anti-L-FABP antibody used is not particularly limited as long as it can recognize L-FABP, and may be a known antibody or an antibody to be developed in the future. In the case of the measurement using an anti-L-FABP antibody, an antibody that recognizes a site exposed to the outside due to the oxidation of methionine is more preferable.
  • An antioxidant L-FABP antibody that does not recognize non-oxidized L-FABP but can specifically recognize oxidized L-FABP can be used. The above conditions in the method do not include such antibody-dependent conditions.
  • the oxidized L-FABP is L-FABP oxidized by AAPH, and Non-oxidized L-FABP is L-FABP not oxidized by AAPH ","
  • the oxidized L-FABP is L-FABP oxidized by any oxidizing agent or air, and the non-oxidized L-FABP is L-FABP.
  • -FABP is L-FABP not oxidized by any oxidizing agent or air "and" the oxidized L-FABP is arbitrarily oxidized L-FABP, and the non-oxidized L-FABP is optional L-FABP that has not been oxidized to any of the above "or at least one selected from the group consisting of: Specifically, as the quantification under the above conditions, for example, oxidized recombinant L-FABP treated with 50 mM AAPH at 37 ° C. for 60 minutes and untreated non-oxidized recombinant L-FABP are treated with “Lenapro L-FABP”.
  • the term “untreated non-oxidized recombinant L-FABP” refers to a product treated with at least one of 1000 mM benzamidine hydrochloride or 1500 mM guanidinium chloride at 25 ° C. for 10 minutes, and then treated with “Lenapro L-FABP test HS (high ELISA) using the antibody of “Sensitivity)” and measuring the coloring intensity (OD450 nm) of the labeled antibody, the oxidized L-FABP treated at 37 ° C. for 60 minutes with 50 mM AAPH at a concentration of 25 ng / ml was measured. On the other hand, L-FABP whose color intensity is 0.7 times or less.
  • the above-mentioned measuring method is preferably a sandwich ELISA method using a combination of two types of antibodies having different recognition sites for the antigen (L-FABP).
  • L-FABP antigen
  • the two kinds of antibodies having different recognition sites it is preferable to use one as an immobilized antibody bound to the surface of a well in a microplate and use the other as a labeled antibody for detection or quantification.
  • the label in the labeled antibody is not particularly limited, and examples thereof include an enzyme label such as a peroxidase label, a fluorescent label, an ultraviolet label, and a radiolabel.
  • Examples of the antibody having a different recognition site for the antigen include an antibody including an antibody selected from the group consisting of anti-L-FABP antibody clone 1, clone 2, clone L, and clone F (for example, see Patent Documents). 2 to 4), a combination containing the anti-L-FABP antibody clone L, or a combination containing the anti-L-FABP antibody clone 2 is preferable, and a combination containing the anti-L-FABP antibody clone L is more preferable. It is more preferable to use an anti-L-FABP antibody clone L as an immobilized antibody and to use any anti-L-FABP antibody as a labeling antibody.
  • L-FABP measurement kits using the sandwich ELISA method include “Lenapro L-FABP Test TMB” (manufactured by CMIC Holdings) and “Lenapro L-FABP Test HS (high sensitivity)” (manufactured by CMIC Holdings). And the like.
  • Such conditions can be formed by using various protein denaturants in combination with appropriate use conditions, and using a substance having a mild protein denaturing action increases the degree of freedom of use conditions. Is preferred. However, even when a substance having a strong protein denaturing action (for example, sodium dodecyl sulfate (SDS)) is used, the degree of freedom of use conditions is correspondingly low (subject to restrictions such as low concentration, low temperature, and short time). The above condition formation may be possible. From this viewpoint, a so-called immunoagglutination promoter is preferable, and specifically, a chaotropic reagent or an organic amine compound is more preferable.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the measurement sensitivity after treatment using an immunoagglutination promoter under appropriate conditions is significantly increased for oxidized L-FABP, and is higher than that for non-oxidized L-FABP. Relatively high. Therefore, the measurement value using the anti-L-FABP antibody after the treatment with the immunoagglutination promoter and the measurement value using the anti-L-FABP antibody without the treatment (preferably, oxidized L-FABP and non-oxidized L
  • the oxidized L-FABP in the sample can be quantified from the comparison with (a measurement value under the condition that the measurement sensitivity difference of FABP is small).
  • the immunoaggregation promoter examples include chaotropic reagents, organic amine compounds, reducing agents (such as glutathione, cysteine, and penicillamine), surfactants (such as sodium n-dodecylbenzenesulfonate), and substances having similar effects.
  • a chaotropic reagent or an organic amine compound is preferred.
  • the quantification is more preferably quantification of L-FABP after treatment with a chaotropic reagent or an organic amine compound.
  • the anti-L-FABP antibody used for the measurement is the same as described above.
  • chaotropic reagent or organic amine compound examples include urea, 2-amino-2-thiazoline hydrochloride, benzamidine hydrochloride, benzylamine hydrochloride, guanidine hydrochloride, aminopyrine, antipyrine, 4-aminoantipyrine, o-phenylene
  • benzamidine hydrochloride, benzylamine hydrochloride, and 2-amino-2-thiazoline hydrochloride are more preferable.
  • a compound represented by the following formula (A) or a salt or ester thereof, and a compound represented by the following formula (B) or a salt thereof can also be preferably used.
  • X a1 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or an alkyl group
  • X a2 to X a6 each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, a hydroxyl group, a carboxy group, an amino group or -SX a7
  • X a7 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or an alkyl group.
  • the alkyl group include a linear or branched alkyl group, and an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is preferable.
  • X b1 to X b4 each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, an amino group, a phenyl group optionally substituted with a halogen atom or —SX b6
  • X b6 represents , A hydrogen atom, a hydroxyl group or an alkyl group.
  • X b1 and X b2 are present.
  • both Xb3 and Xb4 are present, they may together form a carbonyl group, and when Xb3 and Xb4 are both present, Xb5 may be hydrogen.
  • E b1 is a nitrogen atom or a sulfur atom
  • E b2 and E b3 are each independently a carbon atom or a nitrogen atom
  • q, r, s, t and u are each independently 0 or 1
  • the double dashed line between E b1 and E b3 and the double dashed line between E b2 and E b3 are each independently a single bond or a double bond, and the above q, r, s, t and
  • the value of u and the bond between the double dashed line between E b1 and E b3 and the double dashed line between E b2 and E b3 are values and bonds appropriately determined depending on the valencies of E b1 to E b3.
  • Examples of the alkyl group include a linear or branched alkyl group, and an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is preferable.
  • each organic amine compound includes sulfate, nitrate, hydrobromide, hydrofluoride, hydrofluoroborate, oxalate, lactate, adipate, tartrate, and iodide.
  • Hydrochloride, toluene sulfonate, malonate, bicarbonate and the like are not particularly limited, but can be appropriately selected in consideration of ease of handling and availability as a reagent in addition to the effects of the present invention. .
  • the treatment with an immunoaggregation promoter such as the chaotropic reagent or organic amine compound may be performed at room temperature (for example, 25 ° C.) or at an appropriate concentration (for example, 10 mM to 3000 mM) at a heating condition (for example, 35 ° C. or lower).
  • a method of treating with an immunoagglutination promoter for an appropriate time (for example, 5 to 60 minutes) can be mentioned. Heating at room temperature or 35 ° C. or less from the viewpoint of achieving the condition that the measurement sensitivity of oxidized L-FABP is higher than that of non-oxidized L-FABP, and from the viewpoint of a small difference in measurement sensitivity in the range of 35 ° C.
  • a method of treating with an immunoaggregation promoter at an arbitrary concentration under conditions is preferable, and a method of treating with an immunoagglutination accelerator at an arbitrary concentration under room temperature or a heating condition of 33 ° C. or lower is more preferable.
  • a method of treating with an arbitrary concentration of an immunoagglutination promoter under heating conditions of not more than °C is more preferable, and a method of treating with an arbitrary concentration of an immunoaggregation promoter under heating conditions of room temperature or 28 ° C or less is more preferable.
  • Particularly preferred is a method in which treatment is performed at room temperature (for example, 25 ° C.) with an arbitrary concentration of an immunoagglutination promoter.
  • immunoaggregation promoters such as the chaotropic reagents and organic amine compounds may be used alone or in combination of two or more.
  • a suitable low concentration for example, 0.12 mass / volume% or less
  • a low temperature for example, 25 ° C. or less
  • a suitable short time for example, Minutes
  • the method for quantifying L-FABP according to the first aspect is characterized in that the oxidized L-FABP and the non-oxidized L-FABP are more sensitive than the non-oxidized L-FABP in the measurement sensitivity of the oxidized L-FABP. It is preferable that the method further includes a step of quantifying the L-FABP under the condition that the difference in the measurement sensitivity of FABP is small. Conditions in which the measurement sensitivity difference between oxidized L-FABP and non-oxidized L-FABP is small include, for example, oxidized recombinant L-FABP treated with 50 mM AAPH at 37 ° C.
  • L-FABP Under the condition where the difference in measurement sensitivity is small, the three-dimensional structure of L-FABP is denatured by cleaving hydrogen bonds, disulfide bonds and the like while maintaining the primary structure. Thus, even when the antibody binds to the internal region of the L-FABP molecule, L-FABP can be detected or quantified with high sensitivity and specificity without being affected by the oxidation state of L-FABP. .
  • Such conditions can be formed by using various protein denaturants in combination with appropriate use conditions, and using a substance having a strong protein denaturing effect increases the degree of freedom of use conditions. preferable.
  • the degree of freedom of use conditions is correspondingly low (with restrictions such as high concentration, high temperature, and long time).
  • a surfactant is preferable, and specifically, sodium dodecyl sulfate (SDS) is preferable.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the denaturation treatment may be performed at room temperature (for example, 25 ° C.) or under warming conditions (for example, 37 ° C.) at an appropriate concentration (for example, 0.2% by mass / volume (w / v%) to 10% by mass / volume).
  • % Preferably at least 0.4 mass / vol% (w / v%), at least 0.5 mass / vol% (w / v%), or at least 0.7 mass / vol% (w / v%).
  • a surfactant for an appropriate time (eg, 5 to 60 minutes).
  • denaturation treatment with 1 w / v% SDS at 25 ° C. for 10 minutes can be mentioned.
  • the ratio of the oxidized L-FABP in the sample to the total concentration of L-FABP in the sample is referred to as “L”.
  • -Oxidation rate of FABP ".
  • the method for quantifying L-FABP according to the first embodiment is characterized in that the measurement value of L-FABP under the condition where the measurement sensitivity difference is small and the measurement value of the oxidized L-FABP under the condition where the measurement sensitivity of the oxidized L-FABP is high It is preferable that the method further includes a step of calculating an oxidation rate substantially corresponding to the ratio of the oxidized L-FABP in the L-FABP in the sample based on the measured value.
  • the “oxidation rate of L-FABP” refers to the oxidized L-FABP relative to the measured value (eg, label strength) of L-FABP under the condition that the measurement sensitivity difference between the oxidized L-FABP and the non-oxidized L-FABP is small. Can substantially correspond to the ratio of the measured values (for example, the absorbance ratio (OD ratio) represented by the following formula) under the condition that the measurement sensitivity is high.
  • the “oxidation rate of L-FABP” can be expressed, for example, by the following equation. (AX + bY) (OD value) / total concentration of L-FABP (OD value) (In the above formula, a and b represent coefficients, X represents the concentration of oxidized L-FABP, and Y represents the concentration of non-oxidized L-FABP.)
  • the coefficient a is preferably a coefficient representing the reactivity of the antibody to oxidized L-FABP
  • the coefficient b is preferably a coefficient representing the reactivity of the antibody to non-oxidized L-FABP.
  • the method for quantifying L-FABP includes the step of quantifying the amount of oxidized L-FABP in a sample or the value of a parameter correlated therewith, wherein the quantifying step comprises: Preferably, it is a step of quantifying FABP.
  • the parameter correlated with the amount of oxidized L-FABP include a parameter calculated by conversion from a measured value (eg, label strength), not the amount of oxidized L-FABP itself.
  • a measurement value under conditions where the measurement sensitivity of oxidized L-FABP is higher than the measurement sensitivity of non-oxidized L-FABP such as “oxidation rate of L-FABP”, etc.
  • the concentration of the oxidized L-FABP is determined by the measured value of the L-FABP under the condition where the difference between the oxidation rate and the measurement sensitivity of the oxidized L-FABP and the non-oxidized L-FABP is small (total L-FABP in the sample). Concentration).
  • the quantification is performed by measuring the intensity of the label to be measured (eg, absorbance, enzyme label intensity, fluorescence intensity, ultraviolet intensity, radiation intensity, etc.)
  • a calibration curve may be created based on the relationship with the amount (for example, concentration), and quantification may not be performed based on the calibration curve (for example, in comparison).
  • a second aspect of the present invention is a quantification kit for use in the method for quantifying L-FABP according to the first aspect, which comprises a substance capable of quantifying L-FABP.
  • the substances capable of quantifying L-FABP include enzyme immunoassay (EIA, ELISA), fluorescent enzyme immunoassay (FLEIA), and chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA). Based on chemiluminescence immunoassay (CLIA), electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA), fluorescent antibody method (FA), radioimmunoassay (RIA), western blot (WB), immunoblot, etc.
  • EIA enzyme immunoassay
  • FLEIA fluorescent enzyme immunoassay
  • CLIA chemiluminescence enzyme immunoassay
  • ELIA electrochemiluminescence immunoassay
  • FFA fluorescent antibody method
  • RIA radioimmunoassay
  • WB western blot
  • a substance for quantifying FABP is
  • the anti-L-FABP antibody used is not particularly limited as long as it can recognize L-FABP, and may be a known antibody or an antibody to be developed in the future.
  • an antibody that recognizes a site exposed to the outside due to the above-mentioned denaturation treatment, oxidation of the above-mentioned methionine, or the like can be used.
  • an assay system employing a sandwich ELISA method using a combination of two kinds of antibodies having different recognition sites for an antigen (L-FABP) is preferable.
  • the two types of antibodies having different recognition sites are as described above.
  • the quantification means preferably contains the anti-L-FABP antibody as a reagent, and more preferably further contains a labeled anti-L-FABP antibody.
  • an adsorption inhibitor bovine serum albumin (BSA), casein , Skim milk, polyethylene glycol, etc.
  • pretreatment liquid optionally surfactant, optional buffer, etc.
  • reaction buffer optionally buffer, etc.
  • chromogenic substrate 3,3 ', 5,5'-tetra Methylbenzidine, aqueous hydrogen peroxide, etc.
  • the content of the adsorption inhibitor in the above-mentioned quantification means is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, but is preferably 0.05 to 10% by mass.
  • the above-mentioned quantification means is preferably a kit using a sandwich ELISA method in which two kinds of antibodies having different recognition sites for antigens are combined, and an anti-L-FABP antibody clone L is used as a solid phase, and an anti-L-FABP is used as a labeled antibody. More preferably, the kit uses the antibody clone 2.
  • the quantification kit according to the second aspect preferably includes a means for denaturing L-FABP with a surfactant prior to quantification. More preferably, the kit for quantification according to the second aspect further comprises means for denaturing L-FABP in the sample with a surfactant, and means for quantifying L-FABP after the denaturation treatment.
  • the surfactant is as described above.
  • the kit for quantification according to the second aspect further comprises means for treating L-FABP or oxidized L-FABP in a sample with an immunoagglutination promoter (preferably a chaotropic reagent or an organic amine compound), and the quantification is performed.
  • an immunoagglutination promoter preferably a chaotropic reagent or an organic amine compound
  • the means is a means for quantifying L-FABP after the above treatment.
  • L-FABP antibody-immobilized microplate Anti-human L-FABP mouse monoclonal antibody binding well (for example, from a clone L-producing cell line) (2) Denaturing solution (for example, any surfactant) (3) Immune coagulation promoter treatment solution (eg, chaotropic reagent, organic amine compound) (4) Reaction buffer (5) Enzyme-labeled antibody peroxidase-labeled anti-human L-FABP mouse monoclonal antibody (for example, from clone 2 producing cell line) (6) Enzyme substrate solution (7) Detergent (optional buffer, surfactant, etc.) (8) Reaction stop solution (1N sulfuric acid, etc.) (9) Standard buffer (any buffer, etc.) (10) Liver-type fatty acid binding protein sample (10) The concentration of the liver-type fatty acid binding protein sample (10) The concentration of the liver-type fatty acid binding protein sample (10) The concentration of the liver-type fatty acid binding protein sample (10)
  • the quantification kit according to the second aspect preferably contains a protein storage buffer containing BSA for the purpose of preventing protein adsorption.
  • a protein storage buffer containing BSA for the purpose of preventing protein adsorption.
  • the following protein storage buffer may be mentioned.
  • a third aspect of the present invention provides a method for treating a subject (for example, a patient) under the condition that a treatment for promoting an antigen-antibody reaction is performed and the measurement sensitivity of oxidized L-FABP is higher than that of non-oxidized L-FABP.
  • This is a method for examining renal disease, which comprises a step of quantifying L-FABP in collected urine.
  • a fourth aspect of the present invention provides a method for treating renal disease, comprising the step of quantifying the amount of oxidized L-FABP in urine collected from a subject or the value of a parameter correlated therewith after treatment for promoting an antigen-antibody reaction.
  • the step of quantifying is a step of quantifying the amount of the oxidized L-FABP.
  • the parameter correlated with the amount of oxidized L-FABP include not the amount of oxidized L-FABP itself but a parameter calculated by conversion from a measured value (eg, label strength).
  • the measured value under the condition that the measurement sensitivity of the oxidized L-FABP is higher than the measurement sensitivity of the non-oxidized L-FABP, the above-described “oxidation rate of L-FABP”, and the like.
  • the method for examining kidney disease according to the third and fourth aspects may or may not include the step of collecting urine from the subject.
  • the method for testing a kidney disease according to the third and fourth aspects may or may not include the step of detecting L-FABP in urine. Further, the method for examining a renal disease according to the third and fourth aspects may or may not include at least one step selected from the group consisting of the following (A) and (B1) to (B4). Is also good.
  • Step (B2) of the oxidized L-FABP of a healthy person Comparing the amount or the value of the parameter correlated therewith with the amount of the oxidized L-FABP in the subject or the value of the parameter correlated therewith, and detecting that the latter value is significantly lower than the former value
  • Step (B3) the amount of oxidized L-FABP in an acute renal disease patient or the value of a parameter correlated therewith, and the amount of L-FABP in the subject Comparing with the above, when it is detected that the latter value is significantly higher than the former value, a step of determining that suffering from chronic kidney disease, the oxidation of acute kidney disease patients
  • the amount or value of the liver-type fatty acid binding protein obtained may be the amount or value when the subject had previously had acute kidney disease.
  • the amount of FABP or a value of a parameter correlated therewith is compared with the amount of L-FABP in the subject, and when it is detected that the latter value is significantly lower than the former value, acute kidney disease
  • the amount or value of the oxidized hepatic fatty acid binding protein of the patient with chronic kidney disease is the amount or value when the subject had previously had chronic kidney disease. May be , Process
  • non-oxidized L-FABP may or may not be contained, and a mixture of oxidized L-FABP and non-oxidized L-FABP may be used. However, a mixture of oxidized L-FABP and non-oxidized L-FABP or oxidized L-FABP is preferred.
  • the kidney disease is preferably at least one kind of kidney disease selected from the group consisting of CKD and AKI, and more preferably AKI.
  • the renal disease test is, of course, used to judge the progress of the disease and to refer to a treatment policy. Judgment, at least one test selected from the group consisting of predicting the risk of developing renal disease and monitoring the progress of renal disease is preferred, determining the severity of the prognosis of renal disease, predicting the prognosis of the risk of developing renal disease, and renal disease More preferred is at least one test selected from the group consisting of prognostic prediction by monitoring progress.
  • the quantification is preferably quantification under conditions where the measurement sensitivity of oxidized L-FABP is higher than the measurement sensitivity of non-oxidized L-FABP.
  • Specific examples and preferred examples of the conditions under which the measurement sensitivity of oxidized L-FABP is higher than the measurement sensitivity of non-oxidized L-FABP include the specific examples and preferred examples described above for ⁇ Method for quantifying L-FABP ⁇ . Similar ones can be mentioned.
  • the renal disease inspection methods according to the third and fourth aspects are characterized in that the oxidized L-FABP and the non-oxidized L-FABP are more sensitive to the measurement of the oxidized L-FABP than the measurement sensitivity of the oxidized L-FABP. It is preferable that the method further includes a step of quantifying the L-FABP under the condition that the difference in the measurement sensitivity of the type L-FABP is small. Specific examples and preferable examples of the conditions in which the measurement sensitivity difference between the oxidized L-FABP and the non-oxidized L-FABP is small are the same as the specific examples and preferable examples described above for the ⁇ method for quantifying L-FABP ⁇ . No.
  • the quantification is based on the intensity of the label to be measured (eg, absorbance, enzyme label intensity, fluorescence intensity, ultraviolet intensity, radiation intensity, etc.) and L-FABP.
  • a calibration curve may be created based on the relationship with the amount (for example, concentration), and quantification may not be performed based on the calibration curve (for example, in comparison).
  • the fifth aspect of the present invention relates to a method for detecting a known normal range of the amount of oxidized L-FABP or a parameter correlated therewith, or a known range of the amount of oxidized L-FABP or a parameter correlated therewith in renal disease.
  • the range is compared with the amount of oxidized L-FABP in the urine of the subject or the value of a parameter correlated therewith, and it is determined which of the above range the value of the amount or the parameter correlated with the amount in the subject falls into.
  • the area under the curve (AUC) can be examined as an ROC (recipient operating characteristic) analysis result of 0.650 or more, and 0.700 or more. More preferably, it can be inspected, and more preferably, it can be inspected at 0.710 or more.
  • the method for testing a renal disease according to the third to fifth aspects can be based on the quantification result of L-FABP alone, can evaluate CKD or AKI, and can also consistently evaluate CKD and AKI. .
  • the method for testing a kidney disease according to the third to fifth aspects may or may not include a method for diagnosing a kidney disease.
  • the present invention provides a method for treating or preventing renal disease, comprising the method for testing a renal disease according to the third to fifth aspects, and a step of administering to a subject a therapeutic or prophylactic agent for renal disease determined by the method. It may not be related to the above.
  • the renal disease therapeutic or prophylactic agent include at least one drug selected from the group consisting of a chronic renal disease therapeutic or preventive agent and an acute renal disease therapeutic or preventive agent.
  • a sixth aspect of the present invention is the test kit for use in the method for testing a renal disease according to the third or fourth aspect, comprising a substance capable of quantifying L-FABP or oxidized L-FABP.
  • a seventh aspect of the present invention is a companion diagnostic agent comprising the substance capable of quantifying L-FABP or oxidized L-FABP, using the method for testing a renal disease according to the third or fourth aspect.
  • An eighth aspect of the present invention is a kidney disease marker comprising a liver-type fatty acid binding protein or an oxidized liver-type fatty acid binding protein and used as a quantification target in the method for testing a kidney disease according to the third or fourth aspect. .
  • a “companion diagnostic agent” refers to a drug that is actually used to predict the efficacy of a drug, the risk of side effects, and the appropriate dosage for an individual patient with renal disease (eg, CKD, AKI).
  • the renal disease is preferably at least one disease selected from the group consisting of CKD and AKI.
  • specific examples and preferable examples of the substance capable of quantifying L-FABP or oxidized L-FABP are described above in ⁇ Quantitative Kit ⁇ . The same ones as mentioned above can be mentioned.
  • the quantification means preferably contains the anti-L-FABP antibody as a reagent, and more preferably further contains a labeled anti-L-FABP antibody.
  • an adsorption inhibitor bovine serum albumin (BSA), casein , Skim milk, polyethylene glycol, etc.
  • pretreatment liquid optionally surfactant, optional buffer, etc.
  • reaction buffer optionally buffer, etc.
  • chromogenic substrate 3,3 ', 5,5'-tetra Methylbenzidine, aqueous hydrogen peroxide, etc.
  • the content of the adsorption inhibitor in the above-mentioned quantification means is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, but is preferably 0.05 to 10% by mass.
  • test kit according to the sixth aspect and the companion diagnostic agent according to the seventh aspect when performing quantification with an anti-L-FABP antibody, may include means for denaturing L-FABP with a surfactant prior to quantification.
  • means for denaturing L-FABP with a surfactant include those similar to those described above for the ⁇ Kitting kit ⁇ .
  • test kit according to the sixth aspect and the companion diagnostic agent according to the seventh aspect further include a means for treating L-FABP in urine with an immunoagglutination promoter (preferably a chaotropic reagent or an organic amine compound), and
  • an immunoagglutination promoter preferably a chaotropic reagent or an organic amine compound
  • the means for quantifying is a means for quantifying L-FABP after the treatment.
  • test kit according to the sixth aspect and the companion diagnostic agent according to the seventh aspect are kits using a sandwich ELISA method, specific examples of the above-mentioned (1) to (Kit for quantification) A kit containing (10) is mentioned.
  • test kit according to the sixth aspect and the companion diagnostic agent according to the seventh aspect preferably include a protein storage buffer containing BSA for the purpose of preventing protein adsorption.
  • an ELISA measurement was carried out in the same manner except that a denaturation treatment with SDS was performed at 25 ° C. for 10 minutes with 1000 mM benzamidine hydrochloride (hereinafter, also referred to as “BA treatment”). The results are shown in FIG.
  • a denaturation treatment with SDS was performed at 25 ° C. for 10 minutes with 1000 mM benzamidine hydrochloride (hereinafter, also referred to as “BA treatment”).
  • BA treatment 1000 mM benzamidine hydrochloride
  • GU treatment a treatment with 1500 mM guanidinium chloride at 25 ° C. for 10 minutes
  • the concentration of oxidized L-FABP in urine in CKD patients and AKI patients can be quantified, respectively.

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Abstract

任意の検体中のＬ－ＦＡＢＰないし酸化されたＬ－ＦＡＢＰを定量する方法、その定量用キット、被験者の尿中のＬ－ＦＡＢＰ又は酸化されたＬ－ＦＡＢＰの定量結果に基づく腎疾患の検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬を提供すること。 抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件において、肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する方法。

Description

肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する方法、その定量用キット、腎疾患の検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬
　本発明は、検体中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する方法、その定量用キット、腎疾患の検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬に関する。
　肝型脂肪酸結合タンパク質（Ｌ－ｔｙｐｅ　Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、単に「Ｌ－ＦＡＢＰ」ともいう。）は肝臓、腎臓の近位尿細管細胞などの細胞質に存在している。腎臓では尿細管障害による虚血ないし酸化ストレスに応答して尿中への排泄量が増加する（例えば、非特許文献１）。そのため尿中の腎臓組織由来Ｌ－ＦＡＢＰ蛋白質の総量の検出に基づく腎疾患の検査が可能である（例えば、特許文献１）。Ｌ－ＦＡＢＰは逆平行βシートが２枚直行したβバレル構造に２本のαへリックスが蓋をするような形で安定化され、２分子の遊離脂肪酸と結合することが知られている（例えば、非特許文献２）。
　Ｌ－ＦＡＢＰはメチオニン残基の酸化修飾により構造変化が生じ、Ｌ－ＦＡＢＰ分子の内部領域が露わとなる（例えば、非特許文献３）。その結果、Ｌ－ＦＡＢＰ分子の内部領域と結合する抗体を用いることでＥＬＩＳＡなどの抗原抗体反応を用いた測定において抗体結合能が変化し、測定値が大きく変化することが知られている。またこのＬ－ＦＡＢＰのメチオニン残基の酸化修飾は２，２’－アゾビズ２－アミジノプロパン（以下、「ＡＡＰＨ」と略記する。）処理、空気酸化等によって生じることが報告されている（特許文献２～４）。
　特許文献５には、尿試料に変性剤として、還元剤（グルタチオン、システイン、ペニシラミン等）、カオトロピック試薬（尿素、グアニジン等）及び界面活性剤（ｎ－ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等）からなる化合物の１種又は２種を添加し、尿試料をこれらの化合物を用いて前処理することで免疫測定の感度、すなわち測定対象物である尿中のタンパク質の測定感度を向上させる方法が開示されている。特許文献５には、尿中のタンパク質の一例として、Ｌ－ＦＡＢＰが挙げられているがＬ－ＦＡＢＰの検出についての具体的な記載はない。また特許文献６には、有機アミン化合物を用いることによって、担体粒子の自然凝集を起こさせずに特異反応に基づく凝集を促進する方法が開示されている。特許文献７には、ベンズアミジン誘導体などの分子内にＮＨ２－Ｃ＝Ｎ－の部分構造と環状構造とを有する化合物を試料中のＬ－ＦＡＢＰと接触させることにより測定感度を向上させる方法が開示されている。
　しかしながら、Ｌ－ＦＡＢＰ分子の内部領域と結合する抗体を用いたＬ－ＦＡＢＰの酸化状態を評価する方法としての記載はない。
特開平１１－２４２０２６号公報 特許第６１７４７７８号公報 特許第６２１８９８３号公報 特許第６０５９３８８号公報 特開２０１４－８５２０８号公報 国際公開ＷＯ２００７／０７４８６０号 国際公開ＷＯ２０１６／１３６８６３号
Ｋａｍｉｊｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．：Ｊ　Ｌａｂ　Ｃｌｉｎ　Ｍｅｄ，１４３：２３－３０，２００４ Ｃａｉ，Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．：Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｊ，１０２：２５８５－２５９４，２０１２． Ｙａｎ，　Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．：Ｊ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ，５０：２４４５－２４５４，２００９．
　本発明は、このような従来技術の実情に鑑みてなされたものであり、任意の検体中のＬ－ＦＡＢＰないし酸化されたＬ－ＦＡＢＰを定量する方法、その定量用キット、被験者の尿中のＬ－ＦＡＢＰ又は酸化されたＬ－ＦＡＢＰの定量結果に基づく腎疾患の検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、抗原抗体反応を促進する処理を適切に行うことで、酸化されていないＬ－ＦＡＢＰに対して酸化されたＬ－ＦＡＢＰの測定感度が相対的に高く、かつ酸化されたＬ－ＦＡＢＰの測定感度が絶対的にも高い条件の実現が可能であることを見出した。また、本発明者らは、慢性腎疾患（ＣＫＤ）患者及び急性腎疾患（ＡＫＩ）患者とで尿中におけるＬ－ＦＡＢＰの酸化率が相違することを見出した。
　本発明は、上記知見に基づき完成されるに至ったものである。
　すなわち本発明は以下の通りである。
　＜１＞抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件において、肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する方法。
　＜２＞前記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、＜１＞に記載の方法。
　＜３＞前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて前記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
　＜４＞前記測定感度差が小さい条件が、検体中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、＜３＞に記載の方法。
　＜５＞前記測定感度差が小さい条件における前記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、検体中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、＜３＞又は＜４＞に記載の方法。
　＜６＞肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の方法に用いる定量用キット。
　＜７＞抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件において、被験者の尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む腎疾患の検査方法。
　＜８＞被験者の尿中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値を、抗原抗体反応を促進する処理後に定量する工程を含む、腎疾患の検査方法。
　＜９＞前記定量が、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における定量である、＜８＞に記載の方法。
　＜１０＞前記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、＜７＞又は＜９＞に記載の検査方法。
　＜１１＞前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて前記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、＜７＞、＜９＞又は＜１０＞に記載の方法。
　＜１２＞前記測定感度差が小さい条件が、前記尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、＜１１＞に記載の方法。
　＜１３＞前記測定感度差が小さい条件における前記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、＜１１＞又は＜１２＞に記載の方法。
　＜１４＞酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、又は腎疾患における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲と、被験者の尿中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における前記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、前記範囲のいずれに該当するかを決定する工程を含む、被験者における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値に基づく腎疾患の検査方法。
　＜１５＞肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、＜７＞～＜１４＞のいずれか１項に記載の方法に用いる検査キット。
　＜１６＞肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、＜７＞～＜１４＞のいずれか１項に記載の方法に用いるコンパニオン診断薬。
　＜１７＞肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質からなり、＜７＞～＜１４＞のいずれか１項に記載の方法における定量対象として用いられる腎疾患マーカー。
　＜１８＞被験者から検体を採取する工程及び検体中の肝型脂肪酸結合タンパク質を検出する工程を含む、＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の方法。
　＜１９＞被験者から尿を採取する工程及び尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質を検出する工程を含み、また、下記（Ａ）及び（Ｂ１）～（Ｂ４）よりなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む、＜１＞～＜５＞及び＜７＞～＜１４＞のいずれか１項に記載の方法。
　（Ａ）酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、又は腎疾患における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲と、被験者の尿中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における前記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、前記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
　（Ｂ１）健常人の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値と、被験者における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、後者の上記値が前者の上記値に比べて有意に高いことを検出した場合に、慢性腎疾患に罹患していることを決定する工程であって、健常人の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の上記量若しくは値は、上記被験者が従前、健常であったときの量若しくは値であってもよい、工程
　（Ｂ２）健常人の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値と、被験者における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、後者の上記値が前者の上記値に比べて有意に低いことを検出した場合に、急性腎疾患に罹患していることを決定する工程であって、健常人の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の上記量若しくは値は、上記被験者が従前、健常であったときの量若しくは値であってもよい、工程
　（Ｂ３）急性腎疾患患者の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値と、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量とを比較し、後者の上記値が前者の上記値に比べて有意に高いことを検出した場合に、慢性腎疾患に罹患していることを決定する工程であって、急性腎疾患患者の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の上記量若しくは値は、上記被験者が従前、急性腎疾患であったときの量若しくは値であってもよい、工程
　（Ｂ４）慢性腎疾患患者の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値と、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量とを比較し、後者の上記値が前者の上記値に比べて有意に低いことを検出した場合に、急性腎疾患に罹患していることを決定する工程であって、慢性腎疾患患者の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の上記量若しくは値は、上記被験者が従前、慢性腎疾患であったときの量若しくは値であってもよい、工程
　＜２０＞腎疾患の診断方法を含む、＜７＞～＜１４＞のいずれか１項に記載の方法。
　＜２１＞上記＜７＞～＜１４＞のいずれか１項に記載の方法と、当該方法で決定した腎疾患に対する治療薬又は予防薬を被験者に投与する工程を含む、腎疾患の治療又は予防方法。
　＜２２＞上記腎疾患治療薬又は予防薬が、慢性腎疾患治療又は予防薬、及び急性腎疾患治療又は予防薬よりなる群から選択される少なくとも１種の薬を含む、＜２１＞に記載の方法。
　＜２３＞上記「酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件」において、「上記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質が２，２’－アゾビズ２－アミジノプロパンにより酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質であり、かつ上記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質が２，２’－アゾビズ２－アミジノプロパンにより酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質である」、「上記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質が任意の酸化剤若しくは空気により酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質であり、かつ上記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質が任意の酸化剤若しくは空気により酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質である」又は「上記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質が任意に酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質であり、かつ上酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質が任意に酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質である」、＜１＞～＜５＞及び＜７＞～＜１４＞のいずれか１項に記載の方法。
　本発明によれば、任意の検体中のＬ－ＦＡＢＰ又は酸化されたＬ－ＦＡＢＰを定量する方法、その定量用キットを提供し得る。
　また、本発明によれば、被験者の尿中のＬ－ＦＡＢＰ又は酸化されたＬ－ＦＡＢＰの定量結果に基づき、慢性腎疾患、急性腎疾患等の腎疾患を検査し得る検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬を提供し得る。
参考例１の結果を示す図である。 実施例１の結果を示す図である。
　以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
（Ｌ－ＦＡＢＰ）
　Ｌ－ＦＡＢＰのアミノ酸配列や遺伝子配列は既に報告されている（Ｖｅｅｒｋａｍｐ　ａｎｄ　Ｍａａｔｍａｎ，　Ｐｒｏｇ．　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．，３４：１７－５２，１９９５）。配列番号１は、野生型ヒトＬ－ＦＡＢＰのアミノ酸配列を表す。
　配列表の配列番号１に記載した野生型ヒト肝型脂肪酸結合タンパク質のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異タンパク質であっても、その変異が野生型ヒト肝型脂肪酸結合タンパク質の３次元構造において保存性が高い変異であれば、これらは全て肝型脂肪酸結合タンパク質の範囲内に属し得る。
　タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものである。実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）又はバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）又はＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等が挙げられる。
　上記Ｌ－ＦＡＢＰの取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換えタンパク質でもよい。
≪Ｌ－ＦＡＢＰを定量する方法≫
　本発明の第１の態様は、抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質（以下、単に「非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ」ともいう。）の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質（以下、単に「酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ」ともいう。）の測定感度が高い条件において、Ｌ－ＦＡＢＰを定量する工程を含むＬ－ＦＡＢＰを定量する方法である。
　第１の態様に係るＬ－ＦＡＢＰを定量する方法は、被験者から検体を採取する工程を含んでいてもいなくてもよく、検体中の肝型脂肪酸結合タンパク質を検出する工程を含んでいてもいなくてもよい。
　Ｌ－ＦＡＢＰを含有する検体としては任意の検体でよく、例えば、尿、血液、汗等が挙げられ、尿が好ましい。
　第１の態様に係るＬ－ＦＡＢＰを定量する方法において、検体は非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを含んでいてもいなくてもよく、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの混合物を含んでいてもよい。検体は酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの混合物又は酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを含んでいることが好ましい。
　Ｌ－ＦＡＢＰは、配列番号１における１９番目、７４番目及び１１３番目のメチオニンが酸化され得、上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰは、１９番目、７４番目及び１１３番目のメチオニンの少なくともいずれかが酸化されたＬ－ＦＡＢＰということができる。特に、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を用いた測定値の変化に関しては、１９番目及び１１３番目のメチオニンの酸化が支配的であると考えられることから、１９番目及び１１３番目のメチオニンの少なくともいずれかが酸化されたＬ－ＦＡＢＰが好ましい。
　Ｌ－ＦＡＢＰの検出ないし定量等の測定方法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、電気化学発光測免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光抗体法（ＦＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット法（ＷＢ）、イムノブロット法などを採用したアッセイ法が挙げられる。Ｌ－ＦＡＢＰの検出ないし定量等の測定方法としては、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を用いた測定であることが好ましい。
　用いる抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体としては、Ｌ－ＦＡＢＰを認識し得る限り特に制限はなく、公知の抗体であってもよく、今後開発される抗体であってもよい。抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を用いる測定である場合、上記メチオニンの酸化により外部へ曝露される部位を認識する抗体が更に好ましい。
　また、非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰは認識しないが、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを特異的に認識し得る抗酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を用いることもできるが、第１の態様に係るＬ－ＦＡＢＰを定量する方法における上記条件は、そのような抗体依存的な条件を含むものではない。
　上記の「非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件」は、「上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰがＡＡＰＨにより酸化されたＬ－ＦＡＢＰであり、かつ上記非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰがＡＡＰＨにより酸化されていないＬ－ＦＡＢＰである」、「上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰが任意の酸化剤若しくは空気により酸化されたＬ－ＦＡＢＰであり、かつ上記非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰが任意の酸化剤若しくは空気により酸化されていないＬ－ＦＡＢＰである」及び「上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰが任意に酸化されたＬ－ＦＡＢＰであり、かつ上記非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰが任意に酸化されていないＬ－ＦＡＢＰである」よりなる群から選択されるいずれか１つまたは少なくとも１つを満たしてもよいし、他の条件で満たしてもよい。
　上記条件における定量としては、具体的には、例えば、５０ｍＭのＡＡＰＨにて３７℃６０分間処理した酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰと、未処理の非酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰとを、「レナプロ　Ｌ－ＦＡＢＰ　テストＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用してＥＬＩＳＡ測定し、標識抗体の発色強度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した場合に、濃度２５ｎｇ／ｍｌにおいて、非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰに対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が１．４倍以上（好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．８倍以上、更に好ましくは２．０倍以上）高い条件における定量であることがより好ましい。
　測定感度の倍率の上限値としては特に制限はないが、例えば、６倍以下又は４倍以下が挙げられる。
　ここでいう「未処理の非酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰ」とは、１０００ｍＭのベンズアミジン塩酸塩又は１５００ｍＭの塩化グアニジニウムの少なくとも一方にて２５℃１０分間処理した後、「レナプロ　Ｌ－ＦＡＢＰ　テストＨＳ（高感度）」の抗体を使用してＥＬＩＳＡ測定し、標識抗体の発色強度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した場合に、濃度２５ｎｇ／ｍｌにおいて、５０ｍＭのＡＡＰＨにて３７℃６０分間処理した酸化型Ｌ－ＦＡＢＰに対して発色強度が０．７倍以下となるＬ－ＦＡＢＰをいう。
　上記測定方法として、より詳細には、抗原（Ｌ－ＦＡＢＰ）に対する認識部位が異なる２種類の抗体を組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法であることが好ましい。
　認識部位が異なる２種類の抗体としては、一方を、マイクロプレートのウェル中の表面に結合させた固相化抗体として用い、他方を、検出ないし定量のための標識抗体として用いることが好ましい。上記標識抗体における標識としては特に制限はなく、例えば、パーオキシダーゼ標識等の酵素標識、蛍光標識、紫外線標識、放射線標識等が挙げられる。
　抗原（Ｌ－ＦＡＢＰ）に対する認識部位が異なる抗体としては、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローン１、クローン２、クローンＬ及びクローンＦよりなる群から選択される抗体を含む抗体が挙げられ（例えば、特許文献２～４）、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローンＬを含む組み合わせ、又は抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローン２を含む組み合わせであることが好ましく、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローンＬを含む組み合わせであることがより好ましく、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローンＬを固相化抗体として用い、任意の抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を標識抗体として用いることが更に好ましく、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローンＬを固相化抗体として用い、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローン２を標識抗体として用いることが特に好ましい。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法を利用したＬ－ＦＡＢＰ測定キットの市販品としては、「レナプロ　Ｌ－ＦＡＢＰ　テストＴＭＢ」（シミックホールディングス社製）、「レナプロ　Ｌ－ＦＡＢＰ　テストＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス社製）等が挙げられる。
　例えば、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を用いる定量等である場合、抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件では、Ｌ－ＦＡＢＰの物理化学的特性が軽度に変更してＬ－ＦＡＢＰと抗体との反応が促進されつつ、Ｌ－ＦＡＢＰの立体構造が損なわれる程には変性していない。これにより、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度よりも高い特性を維持または亢進しつつ、絶対的な測定感度を増加することができる。
　このような条件は、種々のタンパク質変性剤を適切な使用条件との組合せで使用することで形成可能であり、タンパク質変性作用の穏やかな物質を用いることは、使用条件の自由度が高くなる点で好ましい。ただし、タンパク質変性作用の強い物質（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））を用いても、使用条件の自由度が相応に低くはなる（低濃度、低温、短時間等の制約が加わる）が、上記条件形成が可能であり得る。
　この観点で、いわゆる免疫凝集促進剤が好ましく、具体的にはカオトロピック試薬又は有機アミン化合物がより好ましい。
　参考例１において後述するように、免疫凝集促進剤を適切な条件で使用する処理後の測定感度は、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰについて、絶対的に著しく増大しつつ、非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰに比べて相対的に高い。
　したがって、免疫凝集促進剤による処理後の抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を用いる測定値と、上記処理無しの抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を用いる測定値（好ましくは、後述する酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件における測定値）との対比から、検体中の酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを定量し得る。
　免疫凝集促進剤としては、カオトロピック試薬、有機アミン化合物、還元剤（グルタチオン、システイン、ペニシラミン等）、界面活性剤（ｎ－ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等）、又は同様の効果を有する物質等が挙げられ、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物が好ましい。
　第１の態様に係る酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを定量する方法において、上記定量が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理後のＬ－ＦＡＢＰの定量であることがより好ましい。
　測定に用いられる抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体は上記と同様である。
　上記カオトロピック試薬ないし有機アミン化合物の具体例としては、尿素、２－アミノ－２－チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、グアニジン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、４－アミノアンチピリン、ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩、ｐ－アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、２，４－ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸１，４－フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩、ベタイン塩酸塩から選ばれる少なくとも１種が好ましく用いられる。この中でも、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、２－アミノ－２－チアゾリン塩酸塩がさらに好ましい。
　また、下記式（Ａ）で表される化合物もしくはその塩又はエステル、下記式（Ｂ）で表される化合物又はその塩も好ましく用い得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 （式（Ａ）中、Ｘａ１は、水素原子、水酸基又はアルキル基であり、Ｘａ２～Ｘａ６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、水酸基、カルボキシ基、アミノ基又は－ＳＸａ７（Ｘａ７は、水素原子、水酸基又はアルキル基を表す。Ｘａ７が複数存在するときは、それぞれ同一であっても異なる基であってもよい。）を表す。）
　上記アルキル基としては、直鎖状又は分岐状のアルキル基が挙げられ、炭素原子数１～３のアルキル基が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式（Ｂ）中、Ｘｂ１～Ｘｂ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アミノ基、ハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は－ＳＸｂ６（Ｘｂ６は、水素原子、水酸基又はアルキル基を表す。Ｘｂ６が複数存在するときは、それぞれ同一であっても異なる基であってもよい。）であり、ここで、Ｘｂ１とＸｂ２の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、Ｘｂ３とＸｂ４の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、Ｘｂ５は、水素原子、ハロゲン原子又はアルキル基であり、
　Ｅｂ１は、窒素原子又は硫黄原子であり、
　Ｅｂ２及びＥｂ３は、それぞれ独立して、炭素原子又は窒素原子であり、
　ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕは、それぞれ独立して、０又は１であり、
　Ｅｂ１とＥｂ３との間の二重破線及びＥｂ２とＥｂ３との間の二重破線は、それぞれ独立して、単結合又は二重結合であり、上記ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕの値並びにＥｂ１とＥｂ３との間の二重破線及びＥｂ２とＥｂ３との間の二重破線の結合は、Ｅｂ１～Ｅｂ３の原子価に応じて適宜定まる値及び結合を示す。）
　上記アルキル基としては、直鎖状又は分岐状のアルキル基が挙げられ、炭素原子数１～３のアルキル基が好ましい。
　なお、各有機アミン化合物の塩としては、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素塩、ふっ化水素酸塩、ほうふっ化水素酸塩、しゅう酸塩、乳酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、よう化水素酸塩、トルエンスルホン酸塩、マロン酸塩、重炭酸塩など特に制限は無いが、本発明の効果以外に試薬としての取扱い易さや入手のしやすさ等を勘案して適宜選ぶことができる。
　上記カオトロピック試薬、有機アミン化合物等の免疫凝集促進剤による処理としては、室温（例えば、２５℃）もしくは加温条件下（例えば、３５℃以下）にて適切な濃度（例えば、１０ｍＭ～３０００ｍＭ）の免疫凝集促進剤により適切な時間（例えば、５～６０分間）処理する方法が挙げられる。非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰに対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件を達成する観点、及び３５℃以下の範囲では、測定感度の差異が小さい観点から、室温もしくは３５℃以下の加温条件下にて任意の濃度の免疫凝集促進剤により処理する方法が好ましく、室温もしくは３３℃以下の加温条件下にて任意の濃度の免疫凝集促進剤により処理する方法がより好ましく、室温もしくは３０℃以下の加温条件下にて任意の濃度の免疫凝集促進剤により処理する方法が更に好ましく、室温もしくは２８℃以下の加温条件下にて任意の濃度の免疫凝集促進剤により処理する方法が特に好ましく、室温（例えば、２５℃）にて任意の濃度の免疫凝集促進剤により処理する方法が最も好ましい。典型的には、１０００ｍＭのベンズアミジン塩酸塩又は１５００ｍＭの塩化グアニジニウムにて２５℃１０分間処理することが挙げられる。
　上記カオトロピック試薬、有機アミン化合物等の免疫凝集促進剤は１種単独で用いても、複数種を混合して用いてもよい。
　ＳＤＳ等の界面活性剤による処理としては、低温（例えば、２５℃以下）にて適切な低濃度（例えば、０．１２質量／体積％以下）の界面活性剤により適切な短時間（例えば、４分未満）処理する方法が挙げられる。
　第１の態様に係るＬ－ＦＡＢＰを定量する方法は、上記非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰに対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件よりも、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件にて上記Ｌ－ＦＡＢＰを定量する工程を更に含むことが好ましい。
　酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件として、例えば、５０ｍＭのＡＡＰＨにて３７℃６０分間処理した酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰと、未処理の非酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰとを、「レナプロ　Ｌ－ＦＡＢＰ　テストＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用してＥＬＩＳＡ測定し、標識抗体の発色強度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した場合に、濃度２５ｎｇ／ｍｌにおいて、非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰに対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が０．８倍以上１．４倍未満（好ましくは０．９倍以上１．２５倍以下）の条件が挙げられる。
　上記測定感度差が小さい条件では、Ｌ－ＦＡＢＰの一次構造を維持した状態で水素結合、ジスルフィド結合等を切断することによりその立体構造が変性している。これにより、抗体がＬ－ＦＡＢＰ分子の内部領域と結合する場合であってもＬ－ＦＡＢＰの酸化状態に影響されることなく、高感度かつ特異的にＬ－ＦＡＢＰを検出ないし定量することができる。
　このような条件は、種々のタンパク質変性剤を適切な使用条件との組合せで使用することで形成可能であり、タンパク質変性作用の強い物質を用いることは、使用条件の自由度が高くなる点で好ましい。ただし、タンパク質変性作用の穏やかな物質（例えば、上記の免疫凝集促進剤）を用いても、使用条件の自由度が相応に低くはなる（高濃度、高温、長時間等の制約が加わる）が、上記条件形成が可能であり得る。
　この観点で、界面活性剤が好ましく、具体的にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が好ましい。
　ここでいう「未処理の非酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰ」については前述の通りである。
　上記変性処理としては、室温（例えば、２５℃）もしくは加温条件下（例えば、３７℃）にて適切な濃度（例えば、０．２質量／体積％（ｗ／ｖ％）～１０質量／体積％、好ましくは０．４質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上、０．５質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上、又は０．７質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上であってよい。）の界面活性剤により適切な時間（例えば、５～６０分間）処理する方法が挙げられる。典型的には、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理することが挙げられる。
　免疫凝集促進剤による処理としては、加温条件下（例えば、３７℃以上）にて適切な高濃度（例えば、３５００ｍＭ）の免疫凝集促進剤により適切な長時間（例えば、８０分間）処理する方法が挙げられる。
　本明細書及び特許請求の範囲において、検体中Ｌ－ＦＡＢＰの全濃度（酸化型Ｌ－ＦＡＢＰと、非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰとの総和）に対する検体中の酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの比率を「Ｌ－ＦＡＢＰの酸化率」と定義することができる。
　精度の観点から、第１の態様に係るＬ－ＦＡＢＰを定量する方法は、上記測定感度差が小さい条件における上記Ｌ－ＦＡＢＰの測定値と、上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における測定値とに基づき、検体中のＬ－ＦＡＢＰ中の酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含むことが好ましい。
　「Ｌ－ＦＡＢＰの酸化率」は、上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件におけるＬ－ＦＡＢＰの測定値（例えば、標識強度）に対する上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における測定値の比（例えば、下記式で表される吸光度比（ＯＤ比））に略対応し得る。
 
　上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件におけるＯＤ値／上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件におけるＬ－ＦＡＢＰのＯＤ値
　また、「Ｌ－ＦＡＢＰの酸化率」は、例えば、下記式のように表すこともできる。
　（ａＸ+ｂＹ）（ＯＤ値）／Ｌ－ＦＡＢＰの全濃度（ＯＤ値）
　（上記式中、ａ、ｂは係数を表し、Ｘは酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの濃度を表し、Ｙは非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの濃度を表す。）
　係数ａは酸化型Ｌ－ＦＡＢＰに対する抗体の反応性を表す係数であることが好ましく、係数ｂは非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰに対する抗体の反応性を表す係数であることが好ましい。
　第１の態様に係るＬ－ＦＡＢＰを定量する方法は、検体中の酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値を定量する工程を含み、上記定量する工程が、上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを定量する工程であることが好ましい。「酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量」の方が、「Ｌ－ＦＡＢＰの酸化率」及び「検体中Ｌ－ＦＡＢＰの全濃度」のそれぞれ単独の定量結果よりも精度が高いからである。
　酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量と相関するパラメータとしては、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量そのものではなく、測定値（例えば、標識強度）から換算して算出されるパラメータが挙げられる。具体的には、非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における測定値、「Ｌ－ＦＡＢＰの酸化率」等が挙げられる。
　上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの濃度は、上記酸化率と、上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件におけるＬ－ＦＡＢＰの測定値（検体中Ｌ－ＦＡＢＰの全濃度）との積から定量し得る。
　第１の態様に係るＬ－ＦＡＢＰを定量する方法において、上記定量は、測定される標識の強度（例えば、吸光度、酵素標識強度、蛍光強度、紫外線強度、放射線強度等）と、Ｌ－ＦＡＢＰの量（例えば、濃度）との関係に基づき検量線を作成し、上記検量線に基づき（例えば、対比して）定量してもしなくてもよい。
≪定量用キット≫
　本発明の第２の態様は、Ｌ－ＦＡＢＰを定量し得る物質を含む、第１の態様に係るＬ－ＦＡＢＰを定量する方法に用いる定量用キットである。
　第２の態様に係る定量用キットにおいて、Ｌ－ＦＡＢＰを定量し得る物質としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、電気化学発光測免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光抗体法（ＦＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット法（ＷＢ）、イムノブロット法などに基づいてＬ－ＦＡＢＰを定量する物質が挙げられ、具体的には、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体が好ましい。
　用いる抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体としては、Ｌ－ＦＡＢＰを認識し得る限り特に制限はなく、公知の抗体であってもよく、今後開発される抗体であってもよい。例えば、上記変性処理、上記メチオニンの酸化等により外部へ曝露される部位を認識する抗体が挙げられる。
　上記定量手段として、より詳細には、抗原（Ｌ－ＦＡＢＰ）に対する認識部位が異なる２種類の抗体を組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を採用したアッセイ系が好ましい。
　認識部位が異なる２種類の抗体については上述した通りである。
　上記定量手段としては、試薬として上記抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を含むことが好ましく、標識抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を更に含むことがより好ましく、必要に応じて吸着防止剤（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、スキムミルク、ポリエチレングリコール等）、前処理液（任意の界面活性剤、任意の緩衝液等）、反応緩衝液（任意の緩衝液等）、発色基質（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、過酸化水素水等）等を含んでいてもよい。
　上記定量手段における吸着防止剤の含有量としては本発明の効果を損なわない限りにおいて特に制限はないが、０．０５～１０質量％であることが好ましい。
　上記定量手段として、抗原に対する認識部位が異なる２種類の抗体を組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いたキットであることが好ましく、固相に抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローンＬ、標識抗体に抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体クローン２を使用しているキットであることがより好ましい。
　第２の態様に係る定量用キットは、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体により定量を行なう場合、定量に先だって、界面活性剤によりＬ－ＦＡＢＰを変性する手段を備えることが好ましい。
　第２の態様に係る定量用キットは、上記検体中のＬ－ＦＡＢＰを界面活性剤により変性処理する手段、及び
　上記変性処理後のＬ－ＦＡＢＰを定量する手段を更に備えることがより好ましい。
　上記界面活性剤としては、上述の通りである。
　第２の態様に係る定量用キットは、検体中のＬ－ＦＡＢＰないし酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを免疫凝集促進剤（好ましくはカオトロピック試薬又は有機アミン化合物）により処理する手段を更に備え、かつ上記定量する手段が上記処理後のＬ－ＦＡＢＰを定量する手段であることが好ましい。
　第２の態様に係る定量用キットが、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いたキットである場合の具体的態様としては、例えば、下記（１）～（１０）を含むキットが挙げられる。
（１）Ｌ－ＦＡＢＰ抗体固相化マイクロプレート……抗ヒトＬ－ＦＡＢＰマウスモノクローナル抗体結合ウェル（例えば、クローンＬ産生細胞株由来）
（２）変性処理液（例えば、任意の界面活性剤）
（３）免疫凝集促進剤処理液（例えば、カオトロピック試薬、有機アミン化合物）
（４）反応緩衝液
（５）酵素標識抗体……パーオキシダーゼ標識抗ヒトＬ－ＦＡＢＰマウスモノクローナル抗体（例えば、クローン２産生細胞株由来）
（６）酵素基質液
（７）洗浄剤（任意の緩衝液、界面活性剤等）
（８）反応停止液（１Ｎ硫酸等）
（９）標準緩衝液（任意の緩衝液等）
（１０）肝型脂肪酸結合タンパク質標品
　（１０）肝型脂肪酸結合タンパク質標品の濃度としては特に制限はなく、例えば、１０～１００００ｎｇ／ｍＬが挙げられ、５０～５０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１００～１０００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２００～８００ｎｇ／ｍＬが更に好ましく、３００～６００ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。
　第２の態様に係る定量用キットは、タンパク吸着防止を目的としてＢＳＡを含有するタンパク質保存緩衝液を含むことが好ましい。例えば、下記タンパク質保存緩衝液が挙げられる。
（タンパク質保存緩衝液）
１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１．０％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３
≪腎疾患の検査方法≫
　本発明の第３の態様は、抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰに対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件において、被験者（例えば、患者）から採取した尿中のＬ－ＦＡＢＰを定量する工程を含む腎疾患の検査方法である。
　また、本発明の第４の態様は、被験者から採取した尿中の酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値を、抗原抗体反応を促進する処理後に定量する工程を含む腎疾患の検査方法であり、上記定量する工程が、上記酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量を定量する工程であることが好ましい。
　酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量と相関するパラメータとしては、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量そのものではなく、測定値（例えば、標識強度）から換算して算出されるパラメータが挙げられ、具体的には、上述した非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における測定値、上述した「Ｌ－ＦＡＢＰの酸化率」等が挙げられる。
　第３及び４の態様に係る腎疾患の検査方法において、被験者から尿を採取する工程を含んでいても含んでいなくてもよい。第３及び４の態様に係る腎疾患の検査方法において、尿中のＬ－ＦＡＢＰを検出する工程を含んでいても含んでいなくてもよい。
　また、第３及び４の態様に係る腎疾患の検査方法において、下記（Ａ）及び（Ｂ１）～（Ｂ４）よりなる群から選択される少なくとも１つの工程を含んでいても含んでいなくてもよい。
　（Ａ）酸化されたＬ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、又は腎疾患における酸化されたＬ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲と、被験者の尿中の酸化されたＬ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における前記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、前記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
　（Ｂ１）健常人の酸化されたＬ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値と、被験者における酸化されたＬ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、後者の上記値が前者の上記値に比べて有意に高いことを検出した場合に、慢性腎疾患に罹患していることを決定する工程であって、健常人の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の上記量若しくは値は、上記被験者が従前、健常であったときの量若しくは値であってもよい、工程
　（Ｂ２）健常人の酸化されたＬ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値と、被験者における酸化されたＬ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、後者の上記値が前者の上記値に比べて有意に低いことを検出した場合に、急性腎疾患に罹患していることを決定する工程であって、健常人の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の上記量若しくは値は、上記被験者が従前、健常であったときの量若しくは値であってもよい、工程
　（Ｂ３）急性腎疾患患者の酸化されたＬ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値と、被験者におけるＬ－ＦＡＢＰの量とを比較し、後者の上記値が前者の上記値に比べて有意に高いことを検出した場合に、慢性腎疾患に罹患していることを決定する工程であって、急性腎疾患患者の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の上記量若しくは値は、上記被験者が従前、急性腎疾患であったときの量若しくは値であってもよい、工程
　（Ｂ４）慢性腎疾患患者の酸化されたＬ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値と、被験者におけるＬ－ＦＡＢＰの量とを比較し、後者の上記値が前者の上記値に比べて有意に低いことを検出した場合に、急性腎疾患に罹患していることを決定する工程であって、慢性腎疾患患者の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の上記量若しくは値は、上記被験者が従前、慢性腎疾患であったときの量若しくは値であってもよい、工程
　第３及び４の態様に係る腎疾患の検査方法において、非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを含んでいてもいなくてもよく、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの混合物であってもよいが、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの混合物又は酸化型Ｌ－ＦＡＢＰが好ましい。
　第３及び４の態様に係る腎疾患の検査方法において、上記腎疾患は、ＣＫＤ及びＡＫＩよりなる群から選択される少なくとも１種の腎疾患が好ましく、ＡＫＩがより好ましい。
　Ｌ－ＦＡＢＰないし酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの検出ないし定量等の測定方法としては、≪Ｌ－ＦＡＢＰを定量する方法≫について上述した具体例及び好ましい例と同様のものが挙げられる。
　第３及び４の態様に係る腎疾患の検査方法において、上記腎疾患の検査が、疾患の進行状況の判断、治療方針の参考にされることはもちろんであるが、腎疾患の重篤度の判定、腎疾患発症リスクの予測及び腎疾患進行のモニタリングよりなる群から選択される少なくとも１種の検査が好ましく、腎疾患の予後の重篤度の判定、腎疾患発症リスクの予後予測及び腎疾患進行のモニタリングによる予後予測よりなる群から選択される少なくとも１種の検査がより好ましい。
　第４の態様に係る腎疾患の検査方法において、上記定量が、非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における定量であることが好ましい。
　非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件の具体例及び好ましい例としては、≪Ｌ－ＦＡＢＰを定量する方法≫について上述した具体例及び好ましい例と同様のものが挙げられる。
　第３及び４の態様に係る腎疾患の検査方法は、上記非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度が高い条件よりも、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件にて上記Ｌ－ＦＡＢＰを定量する工程を更に含むことが好ましい。
　酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件の具体例及び好ましい例としては、≪Ｌ－ＦＡＢＰを定量する方法≫について上述した具体例及び好ましい例と同様のものが挙げられる。
　第３及び４の態様に係る腎疾患の検査方法において、上記定量は、測定される標識の強度（例えば、吸光度、酵素標識強度、蛍光強度、紫外線強度、放射線強度等）と、Ｌ－ＦＡＢＰの量（例えば、濃度）との関係に基づき検量線を作成し、上記検量線に基づき（例えば、対比して）定量してもしなくてもよい。
　本発明の第５の態様は、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、又は腎疾患における酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲と、被験者の尿中の酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における上記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、上記範囲のいずれに該当するかを決定する工程を含む、被験者における酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値に基づく腎疾患の検査方法である。
　第３～５の態様に係る腎疾患の検査方法は、ＲＯＣ（受信者動作特性）解析結果として、曲線下面積（ＡＵＣ）が０．６５０以上で検査し得ることが好ましく、０．７００以上で検査し得ることがより好ましく、０．７１０以上で検査し得ることが更に好ましい。
　第３～５の態様に係る腎疾患の検査方法は、Ｌ－ＦＡＢＰのみの定量結果に基づくことができ、ＣＫＤ又はＡＫＩを評価することができ、ＣＫＤ及びＡＫＩを一貫して評価することもできる。
　第３～５の態様に係る腎疾患の検査方法は、腎疾患の診断方法を含んでいてもいなくてもよい。
　また、本発明は、第３～５の態様に係る腎疾患の検査方法と、当該方法で決定した腎疾患に対する治療薬又は予防薬を被験者に投与する工程を含む、腎疾患の治療又は予防方法に関するものであっても、上記に関するものでなくてもよい。
　上記腎疾患治療薬又は予防薬としては、慢性腎疾患治療又は予防薬、及び急性腎疾患治療又は予防薬よりなる群から選択される少なくとも１種の薬が挙げられる。
≪検査キット、コンパニオン診断薬、及び腎疾患マーカー≫
　本発明の第６の態様は、Ｌ－ＦＡＢＰないし酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを定量し得る物質を含む、第３又は４の態様に係る腎疾患の検査方法に用いる検査キットである。
　本発明の第７の態様は、Ｌ－ＦＡＢＰないし酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを定量し得る物質を含む、第３又は４の態様に係る腎疾患の検査方法を用いるコンパニオン診断薬である。
　本発明の第８の態様は、肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質からなり、第３又は４の態様に係る腎疾患の検査方法における定量対象として用いられる腎疾患マーカーである。
　本明細書及び特許請求の範囲において、「コンパニオン診断薬」は、個々の腎疾患（例えば、ＣＫＤ、ＡＫＩ）患者に対する医薬品の効果、副作用のリスク、適切な投薬量を予測するために、実際に投薬を開始する前に行う検査で使用される診断薬をいう。
　第７の態様に係るコンパニオン診断薬において、腎疾患は、ＣＫＤ及びＡＫＩよりなる群から選択される少なくとも１種の疾患が好ましい。
　第６の態様に係る検査キット及び第７の態様に係るコンパニオン診断薬において、Ｌ－ＦＡＢＰ又は酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを定量し得る物質の具体例及び好ましい例としては、≪定量用キット≫について上述したものと同様のものが挙げられる。
　上記定量手段としては、試薬として上記抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を含むことが好ましく、標識抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を更に含むことがより好ましく、必要に応じて吸着防止剤（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、スキムミルク、ポリエチレングリコール等）、前処理液（任意の界面活性剤、任意の緩衝液等）、反応緩衝液（任意の緩衝液等）、発色基質（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、過酸化水素水等）等を含んでいてもよい。
　上記定量手段における吸着防止剤の含有量としては本発明の効果を損なわない限りにおいて特に制限はないが、０．０５～１０質量％であることが好ましい。
　第６の態様に係る検査キット及び第７の態様に係るコンパニオン診断薬は、抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体により定量を行なう場合、定量に先だって、界面活性剤によりＬ－ＦＡＢＰを変性する手段を備えることが好ましい。
　界面活性剤によりＬ－ＦＡＢＰを変性する手段の具体例及び好ましい例としては、≪定量用キット≫について上述したものと同様のものが挙げられる。
　第６の態様に係る検査キット及び第７の態様に係るコンパニオン診断薬は、尿中のＬ－ＦＡＢＰを免疫凝集促進剤（好ましくはカオトロピック試薬又は有機アミン化合物）により処理する手段を更に備え、かつ上記定量する手段が上記処理後のＬ－ＦＡＢＰを定量する手段であることが好ましい。
　第６の態様に係る検査キット及び第７の態様に係るコンパニオン診断薬が、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いたキットである場合の具体的態様としては、例えば、≪定量用キット≫について上記（１）～（１０）を含むキットが挙げられる。
　第６の態様に係る検査キット及び第７の態様に係るコンパニオン診断薬は、タンパク吸着防止を目的としてＢＳＡを含有するタンパク質保存緩衝液を含むことが好ましい。
　以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
＜参考例１＞
　５０ｍＭのＡＡＰＨにて３７℃６０分間処理した様々な濃度の酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰと、未処理の様々な濃度の非酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰとを、それぞれ、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理した後、「レナプロ　Ｌ－ＦＡＢＰ　テストＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用してＥＬＩＳＡ測定を実施し、標識抗体の発色強度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した。上記検査用キットの使用方法は通常添付されている添付文書に従った測定方法に準じて行った。
　結果を図１（ａ）に示す。
　一方、ＳＤＳによる変性処理の代わりに１０００ｍＭのベンズアミジン塩酸塩にて２５℃１０分間処理（以下、「ＢＡ処理」ともいう。）すること以外は同様にしてＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果を図１（ｂ）に示す。
　また、ＳＤＳによる変性処理の代わりに１５００ｍＭの塩化グアニジニウムにて２５℃１０分間処理（以下、「ＧＵ処理」ともいう。）すること以外は同様にしてＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果を図１（ｃ）に示す。
　図１（ａ）に示した結果から明らかなように、リコンビナントＬ－ＦＡＢＰの各濃度において、酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰのＯＤ値と、非酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰのＯＤ値とはほぼ同一になることが分かる。
　一方、図１（ｂ）及び（ｃ）に示した結果から明らかなように、ＳＤＳによる変性処理の代わりにＢＡ処理又はＧＵ処理した場合は、リコンビナントＬ－ＦＡＢＰの任意の１つの濃度において、非酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰのＯＤ測定感度に対する酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰのＯＤ測定感度が大きいことが分かる。
　この測定感度の増大は、抗体が認識するＬ－ＦＡＢＰ内部領域が、酸化型Ｌ－ＦＡＢＰでは外部へ曝露されることに起因するものと考えられる。
　一方、非酸化型リコンビナントＬ－ＦＡＢＰでは、Ｌ－ＦＡＢＰ内部領域を認識する抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体を測定に用いても上記抗体が認識するＬ－ＦＡＢＰ内部領域が外部へ曝露される構造変化を起こしていないことから測定強度が増大していないものと考えられる。
＜実施例１＞
　慢性腎疾患（ＣＫＤ）患者及び急性腎疾患（ＡＫＩ）患者の各々の尿検体を用いて、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理した後、「レナプロ　Ｌ－ＦＡＢＰ　テストＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用して尿中Ｌ－ＦＡＢＰ全濃度（ｎｇ／ｍｌ）を測定した。結果を図２（ａ）に示す。
　また、ＣＫＤ患者（ｎ＝６）及びＡＫＩ患者（ｎ＝１６）の各々の尿検体を、ＳＤＳによる変性処理の代わりにＢＡ処理すること以外は同様にしてＥＬＩＳＡ測定を実施した。
　ＢＡ処理後ＯＤ値／ＳＤＳによる変性処理後ＯＤ値から尿中Ｌ－ＦＡＢＰの酸化率を算出した。結果を図２（ｂ）に示す。
　図２（ａ）に示した結果から明らかなように、ＣＫＤ患者及びＡＫＩ患者の尿中Ｌ－ＦＡＢＰの全濃度（ｎｇ／ｍｌ）（酸化型Ｌ－ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰを含む。）はほぼ同一であることが分かる。
　一方、図２（ｂ）に示した結果から明らかなように、Ｌ－ＦＡＢＰの酸化率は、ＣＫＤ患者に対してＡＫＩ患者では著しく低いことが分かる。この結果は、また、急性腎障害（ＡＫＩ）により細胞内Ｌ－ＦＡＢＰが生理的な条件によらずに尿中に出てきた場合には非酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの割合が高く、逆に生理的条件下で尿中に排泄されたＬ－ＦＡＢＰは酸化率が高いことを示しているといえる。
　また、図２（ｂ）に示したＣＫＤ患者、ＡＫＩ患者におけるＬ－ＦＡＢＰの酸化率と、図２（ａ）に示したＣＫＤ患者、ＡＫＩ患者における尿中Ｌ－ＦＡＢＰの全濃度との積から、それぞれ、ＣＫＤ患者、ＡＫＩ患者における尿中酸化型Ｌ－ＦＡＢＰの濃度を定量することができる。

Claims (17)

  1. 　抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件において、肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する方法。
  2. 　前記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて前記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記測定感度差が小さい条件が、検体中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記測定感度差が小さい条件における前記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、検体中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、請求項３又は４に記載の方法。
  6. 　肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法に用いる定量用キット。
  7. 　抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件において、被験者の尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む腎疾患の検査方法。
  8. 　被験者の尿中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値を、抗原抗体反応を促進する処理後に定量する工程を含む、腎疾患の検査方法。
  9. 　前記定量が、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における定量である、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、請求項７又は９に記載の検査方法。
  11. 　前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて前記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、請求項７、９又は１０に記載の方法。
  12. 　前記測定感度差が小さい条件が、前記尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記測定感度差が小さい条件における前記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
  14. 　酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、又は腎疾患における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲と、被験者の尿中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における前記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、前記範囲のいずれに該当するかを決定する工程を含む、被験者における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値に基づく腎疾患の検査方法。
  15. 　肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項７～１４のいずれか１項に記載の方法に用いる検査キット。
  16. 　肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項７～１４のいずれか１項に記載の方法に用いるコンパニオン診断薬。
  17. 　肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質からなり、請求項７～１４のいずれか１項に記載の方法における定量対象として用いられる腎疾患マーカー。
     
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