CN112805565A - 对肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的方法、其定量用试剂盒、肾疾病的检查方法、其检查试剂盒及伴随诊断药 - Google Patents
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Abstract
提供了对任意样本中的L‑FABP或经氧化的L‑FABP进行定量的方法、其定量用试剂盒、基于受试者的尿中的L‑FABP或经氧化的L‑FABP的定量结果的肾疾病的检查方法、其检查试剂盒和伴随诊断药。一种对肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的方法,所述方法包括在进行促进抗原抗体反应的处理并且经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件下对肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的工序。
Description
技术领域
本发明涉及对样本中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的方法、其定量用试剂盒、肾疾病的检查方法、其检查试剂盒和伴随诊断药(コンパニオン診断薬)。
背景技术
肝型脂肪酸结合蛋白质(L-type Fatty Acid Binding Protein;以下也简称为“L-FABP”)存在于肝脏、肾脏的近端肾小管细胞等的细胞质中。在肾脏中,它响应于肾小管损伤引起的缺血或氧化应激,向尿中的排泄量增加(例如非专利文献1)。因此,可以基于尿中的来自肾脏组织的L-FABP蛋白质的总量的检测来进行肾疾病检查(例如专利文献1)。已知L-FABP是在两个反平行β片彼此正交而成的β桶形结构中以两个α螺旋覆盖在β桶形结构上的形式而稳定化,且与两分子的游离脂肪酸结合(例如非专利文献2)。
L-FABP通过蛋氨酸残基的氧化修饰而发生结构变化,L-FABP分子的内部区域暴露(例如非专利文献3)。已知其结果是在通过使用与L-FABP分子的内部区域结合的抗体而使用ELISA等抗原抗体反应的测定中,抗体结合能力发生变化,测定值发生很大变化。此外,据报道,该L-FABP的蛋氨酸残基的氧化修饰是通过2,2'-偶氮二2-脒基丙烷(以下简称为“AAPH”)处理、空气氧化等产生的(专利文献2~专利文献4)。
在专利文献5中公开了如下方法:在尿试样中添加由还原剂(谷胱甘肽、半胱氨酸、青霉胺等)、离液试剂(尿素、胍等)和表面活性剂(正十二烷基苯磺酸钠等)组成的化合物中的一种或两种作为变性剂,使用这些化合物对尿试样进行预处理,由此提高免疫测定的灵敏度(即作为测定对象物的尿中的蛋白质的测定灵敏度)。在专利文献5中,作为尿中的蛋白质的一例,列举了L-FABP,但没有关于L-FABP的检测的具体记载。此外,在专利文献6中公开了通过使用有机胺化合物在不引起载体粒子自发凝聚的情况下促进基于特异性反应的凝聚的方法。在专利文献7中公开了通过使苯甲脒衍生物等分子内具有NH2-C=N-的部分结构和环状结构的化合物与试样中的L-FABP接触来提高测定灵敏度的方法。
然而,并没有作为使用与L-FABP分子的内部区域结合的抗体来评价L-FABP的氧化状态的方法的记载。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开平11-242026号公报
专利文献2:日本特许第6174778号公报
专利文献3:日本特许第6218983号公报
专利文献4:日本特许第6059388号公报
专利文献5:日本特开2014-85208号公报
专利文献6:国际公开WO2007/074860号
专利文献7:国际公开WO2016/136863号
非专利文献
非专利文献1:Kamijo,A.et al.:J Lab Clin Med,143:23-30,2004
非专利文献2:Cai,J.,et al.:Biophys J,102:2585-2594,2012
非专利文献3:Yan,J.,et al.:J Lipid Res,50:2445-2454,2009
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明是鉴于这样的现有技术的实际情况而完成的,其目的在于提供对任意样本中的L-FABP或经氧化的L-FABP进行定量的方法、其定量用试剂盒、基于受试者的尿中的L-FABP或经氧化的L-FABP的定量结果的肾疾病的检查方法、其检查试剂盒和伴随诊断药。
解决技术问题的技术手段
作为本发明人等为解决上述课题而反复进行深入研究的结果,发现通过适当地进行促进抗原抗体反应的处理,能够实现与未经氧化的L-FABP相比经氧化的L-FABP的测定灵敏度相对较高并且经氧化的L-FABP的测定灵敏度也绝对高的条件。此外,本发明人等发现,在慢性肾疾病(CKD)患者和急性肾疾病(AKI)患者中,尿中的L-FABP的氧化率有所不同。
本发明是基于上述发现而完成的。
即,本发明如下所述。
<1>一种对肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的方法,所述方法包括在进行促进抗原抗体反应的处理并且经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件下对肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的工序。
<2>如<1>所述的方法,所述条件是通过用离液试剂或有机胺化合物进行处理而形成的条件。
<3>如<1>或<2>所述的方法,所述方法还包括以下工序:与所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件相比,在经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质和未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度差小的条件下对所述肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量。
<4>如<3>所述的方法,所述测定灵敏度差小的条件是通过用表面活性剂对样本中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行变性处理而形成的条件。
<5>如<3>或<4>所述的方法,所述方法还包括以下工序:基于在所述测定灵敏度差小的条件下的所述肝型脂肪酸结合蛋白质的测定值以及在所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件下的测定值,计算出与样本中的肝型脂肪酸结合蛋白质中的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的比例大致对应的氧化率。
<6>用于如<1>~<5>中任一项所述的方法的定量用试剂盒,所述定量用试剂盒包含能够对肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的物质。
<7>一种肾疾病的检查方法,所述检查方法包括在进行促进抗原抗体反应的处理并且经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件下对受试者的尿中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的工序。
<8>一种肾疾病的检查方法,所述检查方法包括在促进抗原抗体反应的处理后对受试者的尿中的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值进行定量的工序。
<9>如<8>所述的方法,所述定量是在所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件下进行的定量。
<10>如<7>或<9>所述的检查方法,所述条件是通过用离液试剂或有机胺化合物进行处理而形成的条件。
<11>如<7>、<9>或<10>所述的方法,所述方法还包括以下工序:与所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件相比,在经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质和未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度差小的条件下对所述肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量。
<12>如<11>所述的方法,所述测定灵敏度差小的条件是通过用表面活性剂对所述尿中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行变性处理而形成的条件。
<13>如<11>或<12>所述的方法,所述方法还包括以下工序:基于在所述测定灵敏度差小的条件下的所述肝型脂肪酸结合蛋白质的测定值以及在所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件下的测定值,计算出与尿中的肝型脂肪酸结合蛋白质中的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的比例大致对应的氧化率。
<14>一种肾疾病的检查方法,所述检查方法基于受试者中经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值,并且包括以下工序:将经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值的已知正常范围,或肾疾病中经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值的已知范围与受试者的尿中的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值进行比较,决定受试者中的所述量或与其相关的参数的值是否属于所述范围中的任一个。
<15>用于如<7>~<14>中任一项所述的方法的检查试剂盒,所述检查试剂盒包含能够对肝型脂肪酸结合蛋白质或经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的物质。
<16>用于如<7>~<14>中任一项所述的方法的伴随诊断药,所述伴随诊断药包含能够对肝型脂肪酸结合蛋白质或经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的物质。
<17>在如<7>~<14>中任一项所述的方法中作为定量对象使用的肾疾病标志物,所述肾疾病标志物由肝型脂肪酸结合蛋白质或经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质构成。
<18>如<1>~<5>中任一项所述的方法,所述方法包括从受试者采集样本的工序以及对样本中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行检测的工序。
<19>如<1>~<5>和<7>~<14>中任一项所述的方法,所述方法包括从受试者采集尿的工序以及对尿中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行检测的工序,并且包括选自于由以下(A)和(B1)~(B4)组成的组中的至少一个工序:
(A)将经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值的已知正常范围,或肾疾病中经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值的已知范围与受试者的尿中的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值进行比较,决定受试者中的所述量或与其相关的参数的值是否属于所述范围中的任一个的工序;
(B1)将健康人的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值与受试者中经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值进行比较,在检测出后者的所述值显著高于前者的所述值的情况下,决定罹患慢性肾疾病的工序;所述工序中,健康人的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的所述量或值也可以是所述受试者以前健康时的量或值;
(B2)将健康人的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值与受试者中经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值进行比较,在检测出后者的所述值显著低于前者的所述值的情况下,决定罹患急性肾疾病的工序;所述工序中,健康人的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的所述量或值也可以是所述受试者以前健康时的量或值;
(B3)将急性肾疾病患者的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值与受试者中肝型脂肪酸结合蛋白质的量进行比较,在检测出后者的所述值显著高于前者的所述值的情况下,决定罹患慢性肾疾病的工序;所述工序中,急性肾疾病患者的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的所述量或值也可以是所述受试者以前患急性肾疾病时的量或值;
(B4)将慢性肾疾病患者的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值与受试者中肝型脂肪酸结合蛋白质的量进行比较,在检测出后者的所述值显著低于前者的所述值的情况下,决定罹患急性肾疾病的工序;所述工序中,慢性肾疾病患者的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的所述量或值也可以是所述受试者以前患慢性肾疾病时的量或值。
<20>如<7>~<14>中任一项所述的方法,所述方法包括肾疾病的诊断方法。
<21>一种肾疾病的治疗或预防方法,所述方法包括如上述<7>~<14>中任一项所述的方法以及将针对通过该方法决定的肾疾病的治疗药或预防药给予受试者的工序。
<22>如<21>所述的方法,所述肾疾病的治疗药或预防药包括选自于由慢性肾疾病治疗药或预防药以及急性肾疾病治疗药或预防药组成的组中的至少一种药。
<23>如<1>~<5>和<7>~<14>中任一项所述的方法,在所述“经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件”中,“所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质为被2,2'-偶氮二2-脒基丙烷氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质,且所述未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质为未被2,2'-偶氮二2-脒基丙烷氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质”;“所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质为被任意的氧化剂或空气氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质,且所述未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质为未被任意的氧化剂或空气氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质”;或者“所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质为被任意氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质,且所述未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质为未被任意氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质”。
有益效果
根据本发明,可以提供对任意样本中的L-FABP或经氧化的L-FABP进行定量的方法、其定量用试剂盒。
此外,根据本发明,可以提供基于受试者的尿中的L-FABP或经氧化的L-FABP的定量结果的能够对慢性肾疾病、急性肾疾病等肾疾病进行检查的检查方法、其检查试剂盒和伴随诊断药。
附图说明
[图1]是示出参考例1的结果的图。
[图2]是示出实施例1的结果的图。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行详细描述,但是本发明不限于以下实施方式,并且可以在本发明的目的范围内添加适当修改来实施。
(L-FABP)
已经报道了L-FABP的氨基酸序列和基因序列(Veerkamp和Maatman,Prog.LipidRes.,34:17-52,1995)。序列号1表示野生型人L-FABP的氨基酸序列。
即使是因序列表的序列号1中记载的野生型人肝型脂肪酸结合蛋白质的氨基酸序列上的置换、插入、缺失等而产生的突变蛋白质,如果该突变在野生型人肝型脂肪酸结合蛋白质的三维结构中是保守性高的突变,则它们全都可以属于肝型脂肪酸结合蛋白质的范围内。
作为蛋白质结构要素的氨基酸的侧链在疏水性、电荷、大小等方面各自不同。在实质上不影响整个蛋白质的三维结构(也称为立体结构)这样的意义上,通过经验或物理化学实测而已知保守性高的几种关系。例如,关于氨基酸残基的置换,举出甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)、Gly和丙氨酸(Ala)或缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)、谷氨酸(Glu)和谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)和苏氨酸(Thr)、Thr和丝氨酸(Ser)或Ala、赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)等。
关于所述L-FABP的获得方法不受到特别限制,既可以是通过化学合成来合成的蛋白质,也可以是利用基因重组技术制作的重组蛋白质。
《对L-FABP进行定量的方法》
本发明的第一方面是一种对L-FABP进行定量的方法,所述方法包括在进行促进抗原抗体反应的处理并且经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质(以下也简称为“氧化型L-FABP”)的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质(以下也简称为“非氧化型L-FABP”)的测定灵敏度高的条件下对L-FABP进行定量的工序。
第一方面所述的对L-FABP进行定量的方法可以包括也可以不包括从受试者采集样本的工序,可以包括也可以不包括对样本中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行检测的工序。
作为含有L-FABP的样本可以是任意的样本,例如举出尿、血液、汗等,优选为尿。
在第一方面所述的对L-FABP进行定量的方法中,样本可以包含也可以不包含非氧化型L-FABP,也可以包含氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的混合物。样本优选包含氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的混合物或氧化型L-FABP。
对于L-FABP,可以将序列号1中第19个、第74个和第113个蛋氨酸氧化;所述氧化型L-FABP可以是第19个、第74个和第113个蛋氨酸中的至少任一个被氧化的L-FABP。特别是,关于使用抗L-FABP抗体的测定值的变化,由于认为第19个和第113个蛋氨酸的氧化占主导地位,因此优选第19个和第113个蛋氨酸中的至少任一个被氧化的L-FABP。
作为L-FABP的检测或定量等的测定方法,举出采用酶免疫测定法(EIA,ELISA)、荧光酶免疫测定法(FLEIA)、化学发光酶免疫测定法(CLEIA)、化学发光免疫测定法(CLIA)、电化学发光免疫测定法(ECLIA)、荧光抗体法(FA)、放射免疫测定法(RIA)、蛋白质印迹法(WB)、免疫印迹法等的测定法。作为L-FABP的检测或定量等的测定方法,优选为使用抗L-FABP抗体的测定。
作为使用的抗L-FABP抗体,只要能识别L-FABP就不受到特别限制,既可以是已知的抗体,也可以是今后开发的抗体。在使用抗L-FABP抗体进行测定的情况下,进一步优选识别通过所述蛋氨酸的氧化而暴露在外部的位点的抗体。
此外,也可以使用虽然不识别非氧化型L-FABP、但能够特异性识别氧化型L-FABP的抗氧化型L-FABP抗体,但第一方面所述的对L-FABP进行定量的方法中的上述条件不包括这样的抗体依赖性条件。
所述“氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件”可以满足选自于由以下条件组成的组中的任一种或至少一种:“所述氧化型L-FABP为被AAPH氧化的L-FABP,且所述非氧化型L-FABP为未被AAPH氧化的L-FABP”;“所述氧化型L-FABP为被任意的氧化剂或空气氧化的L-FABP,且所述非氧化型L-FABP为未被任意的氧化剂或空气氧化的L-FABP”;以及“所述氧化型L-FABP为被任意氧化的L-FABP,且所述非氧化型L-FABP为未被任意氧化的L-FABP”,或者也可以满足其它条件。
作为所述条件下的定量,具体而言,例如较优选为以下条件下的定量:在使用“レナプロL-FABPテストHS(高灵敏度)”(シミックホールディングス株式会社制造)的抗体对用50mM AAPH在37℃下处理60分钟的氧化型重组L-FABP和未处理的非氧化型重组L-FABP进行ELISA测定,测定标记抗体的显色强度(OD450nm)的情况下,在浓度25ng/ml下,氧化型L-FABP的测定灵敏度相对于非氧化型L-FABP的测定灵敏度为1.4倍以上(优选1.5倍以上,较优选1.8倍以上,进一步优选2.0倍以上)高的条件下的定量。
作为测定灵敏度的倍率的上限值不受到特别限制,例如举出6倍以下或4倍以下。
这里所说的“未处理的非氧化型重组L-FABP”是指在用1000mM苯甲脒盐酸盐或1500mM氯化胍中的至少一种在25℃下处理10分钟后,在使用“レナプロL-FABPテストHS(高灵敏度)”的抗体进行ELISA测定,测定标记抗体的显色强度(OD450nm)的情况下,在浓度25ng/ml下,相对于用50mM AAPH在37℃下处理60分钟的氧化型L-FABP,显色强度为0.7倍以下的L-FABP。
作为所述测定方法,更详细地说,优选是将对抗原(L-FABP)的识别位点不同的两种抗体组合使用的夹心ELISA法。
作为识别位点不同的两种抗体,优选将一种用作结合在微孔板的孔表面上的固相化抗体,而将另一种用作用于检测或定量的标记抗体。作为所述标记抗体中的标记不受到特别限制,例如举出过氧化物酶标记等酶标记、荧光标记、紫外线标记、放射标记等。
作为对抗原(L-FABP)的识别位点不同的抗体,举出包含选自于由抗L-FABP抗体克隆1、克隆2、克隆L和克隆F组成的组中的抗体在内的抗体(例如专利文献2~专利文献4),优选包含抗L-FABP抗体克隆L的组合或包含抗L-FABP抗体克隆2的组合,较优选包含抗L-FABP抗体克隆L的组合,进一步优选将抗L-FABP抗体克隆L用作固相化抗体并将任意的抗L-FABP抗体用作标记抗体,特别优选将抗L-FABP抗体克隆L用作固相化抗体并将抗L-FABP抗体克隆2用作标记抗体。
作为利用夹心ELISA法的L-FABP测定试剂盒的市售品,举出“レナプロL-FABPテストTMB”(シミックホールディングス公司制造)、“レナプロL-FABPテストHS(高灵敏度)”(シミックホールディングス公司制造)等。
例如,在使用抗L-FABP抗体进行定量等情况下,在进行促进抗原抗体反应的处理并且所述氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件下,L-FABP的物理化学特性轻度改变而促进L-FABP与抗体的反应,但并未变性到破坏L-FABP的立体结构的程度。由此,能够在维持或增强氧化型L-FABP的测定灵敏度高于非氧化型L-FABP的测定灵敏度的特性的同时提高绝对测定灵敏度。
这样的条件可以通过将各种蛋白质变性剂与适当的使用条件组合使用而形成,从提高使用条件的自由度的观点来看,优选使用蛋白质变性作用温和的物质。然而,即使使用蛋白质变性作用强的物质(例如十二烷基硫酸钠(SDS)),使用条件的自由度相应降低(增加了低浓度、低温、短时间等制约因素),但也能够形成上述条件。
从该观点来看,优选所谓的免疫凝集促进剂,具体而言,较优选离液试剂或有机胺化合物。
如参考例1中在后文描述的,就在适当条件下使用免疫凝集促进剂处理后的测定灵敏度而言,对于氧化型L-FABP绝对地显著提高,同时与非氧化型L-FABP相比相对较高。
因此,可以由用免疫凝集促进剂处理后的使用抗L-FABP抗体的测定值和未进行上述处理的使用抗L-FABP抗体的测定值(优选为在后述的氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的测定灵敏度差小的条件下的测定值)之间的比较,对样本中的氧化型L-FABP进行定量。
作为免疫凝集促进剂,举出离液试剂、有机胺化合物、还原剂(谷胱甘肽、半胱氨酸、青霉胺等)、表面活性剂(正十二烷基苯磺酸钠等)或具有相同效果的物质等,优选离液试剂或有机胺化合物。
在第一方面所述的对氧化型L-FABP进行定量的方法中,所述定量较优选是利用离液试剂或有机胺化合物进行处理后的L-FABP的定量。
测定中使用的抗L-FABP抗体与上文所述的相同。
作为所述离液试剂或有机胺化合物的具体例,优选使用选自于尿素、2-氨基-2-噻唑啉盐酸盐、苯甲脒盐酸盐、苄胺盐酸盐、胍盐酸盐、氨基比林、安替比林、4-氨基安替比林、邻苯二胺二盐酸盐、对茴香胺盐酸盐、苯海拉明盐酸盐、2,4-二氨基茴香醚二盐酸盐、吡啶盐酸盐、盐酸1,4-苯二胺、氨基胍盐酸盐、甜菜碱盐酸盐中的至少一种。这些当中,进一步优选苯甲脒盐酸盐、苄胺盐酸盐、2-氨基-2-噻唑啉盐酸盐。
此外,还可以优选使用下述式(A)表示的化合物或其盐或酯,下述式(B)表示的化合物或其盐。
[化1]
(式(A)中,Xa1为氢原子、羟基或烷基,Xa2~Xa6各自独立地表示氢原子、卤素原子、烷基、羟基、羧基、氨基或-SXa7(Xa7表示氢原子、羟基或烷基;当存在多个Xa7时,各自可以为相同或不同的基团)。)
作为所述烷基,举出直链状或支链状烷基,优选碳原子数1~3的烷基。
[化2]
(式(B)中,Xb1~Xb4各自独立地为氢原子、卤素原子、烷基、氨基、任选被卤素原子取代的苯基或-SXb6(Xb6表示氢原子、羟基或烷基;当存在多个Xb6时,各自可以为相同或不同的基团);其中,当存在Xb1和Xb2两者时,可各自一起形成羰基,当存在Xb3和Xb4两者时,可各自一起形成羰基,Xb5为氢原子、卤素原子或烷基,
Eb1为氮原子或硫原子,
Eb2和Eb3各自独立地为碳原子或氮原子,
q、r、s、t和u各自独立地为0或1,
Eb1和Eb3之间的双点划线以及Eb2和Eb3之间的双点划线各自独立地为单键或双键,上述q、r、s、t和u的值与Eb1和Eb3之间的双点划线以及Eb2和Eb3之间的双点划线的键表示根据Eb1~Eb3的原子价而适当确定的值和键。)
作为所述烷基,举出直链状或支链状烷基,优选碳原子数1~3的烷基。
另外,作为各有机胺化合物的盐,硫酸盐、硝酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、氟硼酸盐、草酸盐、乳酸盐、己二酸盐、酒石酸盐、氢碘酸盐、甲苯磺酸盐、丙二酸盐、碳酸氢盐等不受到特别限制,除了本发明的效果以外,还可以考虑作为试剂的处理容易度、获得容易度等而适当选择。
作为利用所述离液试剂、有机胺化合物等免疫凝集促进剂进行的处理,举出在室温(例如25℃)或加温条件下(例如35℃以下)利用适当浓度(例如10mM~3000mM)的免疫凝集促进剂处理适当时间(例如5分钟~60分钟)的方法。从实现氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件的观点以及在35℃以下的范围内测定灵敏度的差异小的观点来看,优选在室温或35℃以下的加温条件下利用任意浓度的免疫凝集促进剂进行处理的方法,较优选在室温或33℃以下的加温条件下利用任意浓度的免疫凝集促进剂进行处理的方法,进一步优选在室温或30℃以下的加温条件下利用任意浓度的免疫凝集促进剂进行处理的方法,特别优选在室温或28℃以下的加温条件下利用任意浓度的免疫凝集促进剂进行处理的方法,最优选在室温(例如25℃)下用任意浓度的免疫凝集促进剂进行处理的方法。典型地,举出用1000mM苯甲脒盐酸盐或1500mM氯化胍在25℃下处理10分钟。
所述离液试剂、有机胺化合物等免疫凝集促进剂可以单独使用一种,也可以将多种混合使用。
作为利用SDS等表面活性剂进行的处理,举出在低温(例如25℃以下)下用适当低浓度(例如0.12质量/体积%以下)的表面活性剂处理适当的短时间(例如小于4分钟)的方法。
第一方面所述的对L-FABP进行定量的方法优选还包括以下工序:与所述氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件相比,在氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的测定灵敏度差小的条件下对所述L-FABP进行定量。
作为氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的测定灵敏度差小的条件,例如举出在使用“レナプロL-FABPテストHS(高灵敏度)”(シミックホールディングス株式会社制造)的抗体对用50mM AAPH在37℃下处理60分钟的氧化型重组L-FABP和未处理的非氧化型重组L-FABP进行ELISA测定,测定标记抗体的显色强度(OD450nm)的情况下,在浓度25ng/ml下,氧化型L-FABP的测定灵敏度相对于非氧化型L-FABP的测定灵敏度为0.8倍以上且小于1.4倍(优选0.9倍以上且1.25倍以下)的条件。
在上述测定灵敏度差小的条件下,在维持L-FABP的一级结构的状态下通过切断氢键、二硫键等而使其立体结构变性。由此,即使在抗体与L-FABP分子的内部区域结合的情况下也不会受到L-FABP的氧化状态的影响,可以高灵敏度且特异性地对L-FABP进行检测或定量。
这样的条件可以通过将各种蛋白质变性剂与适当的使用条件组合使用而形成,从提高使用条件的自由度的观点来看,优选使用蛋白质变性作用强的物质。然而,即使使用蛋白质变性作用温和的物质(例如所述免疫凝集促进剂),使用条件的自由度相应降低(增加了高浓度、高温、长时间等制约因素),但也能够形成上述条件。
从该观点来看,优选表面活性剂,具体而言,优选十二烷基硫酸钠(SDS)。
关于在此所说的“未处理的非氧化型重组L-FABP”,如上所述。
作为所述变性处理,举出在室温(例如25℃)或加温条件下(例如37℃)用适当浓度(例如0.2质量/体积%(w/v%)~10质量/体积%,优选0.4质量/体积%(w/v%)以上、0.5质量/体积%(w/v%)以上或0.7质量/体积%(w/v%)以上)的表面活性剂处理适当时间(例如5分钟~60分钟)的方法。典型地,举出用1w/v%SDS在25℃下变性处理10分钟。
作为利用免疫凝集促进剂进行的处理,举出在加温条件下(例如37℃以上)用适当高浓度(例如3500mM)的免疫凝集促进剂处理适当的长时间(例如80分钟)的方法。
在本说明书和权利要求的范围中,可以将样本中的氧化型L-FABP相对于样本中L-FABP的总浓度(氧化型L-FABP与非氧化型L-FABP的总和)的比例定义为“L-FABP的氧化率”。
从精度的观点来看,第一方面所述的对L-FABP进行定量的方法优选还包括以下工序:基于在所述测定灵敏度差小的条件下的所述L-FABP的测定值以及在所述氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件下的测定值,计算出与样本中的L-FABP中的氧化型L-FABP的比例大致对应的氧化率。
“L-FABP的氧化率”可以大致对应于在所述氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件下的测定值相对于在所述氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的测定灵敏度差小的条件下的L-FABP的测定值(例如标记强度)的比例(例如下式所示的吸光度比(OD比))。
所述氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件下的OD值/所述氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的测定灵敏度差小的条件下的L-FABP的OD值
此外,“L-FABP的氧化率”例如也可以由下式表示。
(aX+bY)(OD值)/L-FABP的总浓度(OD值)
(上述式中,a、b表示系数,X表示氧化型L-FABP的浓度,Y表示非氧化型L-FABP的浓度。)
系数a优选为表示抗体对氧化型L-FABP的反应性的系数,系数b优选为表示抗体对非氧化型L-FABP的反应性的系数。
第一方面所述的对L-FABP进行定量的方法包括对样本中的氧化型L-FABP的量或与其相关的参数的值进行定量的工序,所述进行定量的工序优选为对所述氧化型L-FABP进行定量的工序。这是因为,“氧化型L-FABP的量”这方面比“L-FABP的氧化率”和“样本中L-FABP的总浓度”各自单独的定量结果的精度更高。
作为与氧化型L-FABP的量相关的参数,举出由测定值(例如标记强度)换算而计算出的参数,而不是氧化型L-FABP的量本身的参数。具体而言,举出在氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件下的测定值、“L-FABP的氧化率”等。
所述氧化型L-FABP的浓度可以由所述氧化率与在所述氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的测定灵敏度差小的条件下的L-FABP的测定值(样本中L-FABP的总浓度)的乘积来定量。
在第一方面所述的对L-FABP进行定量的方法中,所述定量可以或也可以不根据所测定的标记的强度(例如吸光度、酶标记强度、荧光强度、紫外线强度、放射强度等)与L-FABP的量(例如浓度)之间的关系制作校准曲线,并基于所述校准曲线(例如进行比较)进行定量。
《定量用试剂盒》
本发明的第二方面是用于第一方面所述的对L-FABP进行定量的方法的定量用试剂盒,所述定量用试剂盒包含能够对L-FABP进行定量的物质。
在第二方面所述的定量用试剂盒中,作为能够对L-FABP进行定量的物质,举出基于酶免疫测定法(EIA,ELISA)、荧光酶免疫测定法(FLEIA)、化学发光酶免疫测定法(CLEIA)、化学发光免疫测定法(CLIA)、电化学发光免疫测定法(ECLIA)、荧光抗体法(FA)、放射免疫测定法(RIA)、蛋白质印迹法(WB)、免疫印迹法等对L-FABP进行定量的物质;具体而言,优选抗L-FABP抗体。
作为使用的抗L-FABP抗体,只要能识别L-FABP就不受到特别限制,既可以是已知的抗体,也可以是今后开发的抗体。例如,举出识别通过所述变性处理、所述蛋氨酸的氧化等而暴露在外部的位点的抗体。
作为所述定量手段,更详细地说,优选为采用将对抗原(L-FABP)的识别位点不同的两种抗体组合使用的夹心ELISA法的测定系统。
关于识别位点不同的两种抗体,如上所述。
作为所述定量手段,作为试剂优选含有所述抗L-FABP抗体,较优选还含有标记的抗L-FABP抗体;根据需要还可以含有抗吸附剂(牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、脱脂乳、聚乙二醇等)、预处理液(任意的表面活性剂、任意的缓冲液等)、反应缓冲液(任意的缓冲液等)、显色底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺、过氧化氢水溶液(過酸化水素水)等)等。
只要不损害本发明的效果,作为所述定量手段中的抗吸附剂的含量就不受到特别限制,优选为0.05质量%~10质量%。
作为所述定量手段,优选为使用将对抗原的识别位点不同的两种抗体组合使用的夹心ELISA法的试剂盒;较优选为将抗L-FABP抗体克隆L用作固相抗体并将抗L-FABP抗体克隆2用作标记抗体的试剂盒。
对于第二方面所述的定量用试剂盒,当使用抗L-FABP抗体进行定量时,优选具备在定量之前通过表面活性剂对L-FABP进行变性的手段。
第二方面所述的定量用试剂盒较优选还具备:通过表面活性剂对所述样本中的L-FABP进行变性处理的手段;以及
对上述变性处理后的L-FABP进行定量的手段。
作为所述表面活性剂,如上所述。
第二方面所述的定量用试剂盒优选还具备通过免疫凝集促进剂(优选离液试剂或有机胺化合物)对样本中的L-FABP或氧化型L-FABP进行处理的手段,并且所述进行定量的手段优选为对上述处理后的L-FABP进行定量的手段。
对于第二方面所述的定量用试剂盒,作为其是使用夹心ELISA法的试剂盒时的具体方式,例如举出包含以下(1)~(10)的试剂盒:
(1)L-FABP抗体固相化微孔板……抗人L-FABP小鼠单克隆抗体结合孔(例如来自克隆L产生细胞株)
(2)变性处理液(例如任意的表面活性剂)
(3)免疫凝集促进剂处理液(例如离液试剂、有机胺化合物)
(4)反应缓冲液
(5)酶标记抗体……过氧化物酶标记抗人L-FABP小鼠单克隆抗体(例如来自克隆2产生细胞株)
(6)酶底物液
(7)洗涤剂(任意的缓冲液、表面活性剂等)
(8)反应停止液(1N硫酸等)
(9)标准缓冲液(任意的缓冲液等)
(10)肝型脂肪酸结合蛋白质标准品
作为(10)肝型脂肪酸结合蛋白质标准品的浓度不受到特别限制,例如举出10ng/mL~10000ng/mL,优选50ng/mL~5000ng/mL,较优选100ng/mL~1000ng/mL,进一步优选200ng/mL~800ng/mL,特别优选300ng/mL~600ng/mL。
第二方面所述的定量用试剂盒优选出于防止蛋白吸附的目的而包含含有BSA的蛋白质保存缓冲液。例如,举出下述蛋白质保存缓冲液。
(蛋白质保存缓冲液)
10mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)、150mM NaCl、1.0%BSA、0.1%NaN3
《肾疾病的检查方法》
本发明的第三方面是一种肾疾病的检查方法,所述检查方法包括在进行促进抗原抗体反应的处理并且氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件下对从受试者(例如患者)采集的尿中的L-FABP进行定量的工序。
此外,本发明的第四方面是一种肾疾病的检查方法,所述检查方法包括在促进抗原抗体反应的处理后对从受试者采集的尿中的氧化型L-FABP的量或与其相关的参数的值进行定量的工序,所述进行定量的工序优选为对所述氧化型L-FABP的量进行定量的工序。
作为与氧化型L-FABP的量相关的参数,举出由测定值(例如标记强度)换算而计算出的参数,而不是氧化型L-FABP的量本身的参数;具体而言,举出在上述氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件下的测定值、上述“L-FABP的氧化率”等。
在第三方面和第四方面所述的肾疾病的检查方法中,可以包括也可以不包括从受试者采集尿的工序。在第三方面和第四方面所述的肾疾病的检查方法中,可以包括也可以不包括对尿中的L-FABP进行检测的工序。
此外,在第三方面和第四方面所述的肾疾病的检查方法中,可以包括也可以不包括选自于由以下(A)和(B1)~(B4)组成的组中的至少一个工序:
(A)将经氧化的L-FABP的量或与其相关的参数的值的已知正常范围,或肾疾病中经氧化的L-FABP的量或与其相关的参数的值的已知范围与受试者的尿中的经氧化的L-FABP的量或与其相关的参数的值进行比较,决定受试者中的所述量或与其相关的参数的值是否属于所述范围中的任一个的工序;
(B1)将健康人的经氧化的L-FABP的量或与其相关的参数的值与受试者中经氧化的L-FABP的量或与其相关的参数的值进行比较,在检测出后者的所述值显著高于前者的所述值的情况下,决定罹患慢性肾疾病的工序;所述工序中,健康人的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的所述量或值也可以是所述受试者以前健康时的量或值;
(B2)将健康人的经氧化的L-FABP的量或与其相关的参数的值与受试者中经氧化的L-FABP的量或与其相关的参数的值进行比较,在检测出后者的所述值显著低于前者的所述值的情况下,决定罹患急性肾疾病的工序;所述工序中,健康人的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的所述量或值也可以是所述受试者以前健康时的量或值;
(B3)将急性肾疾病患者的经氧化的L-FABP的量或与其相关的参数的值与受试者中L-FABP的量进行比较,在检测出后者的所述值显著高于前者的所述值的情况下,决定罹患慢性肾疾病的工序;所述工序中,急性肾疾病患者的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的所述量或值也可以是所述受试者以前患急性肾疾病时的量或值;
(B4)将慢性肾疾病患者的经氧化的L-FABP的量或与其相关的参数的值与受试者中L-FABP的量进行比较,在检测出后者的所述值显著低于前者的所述值的情况下,决定罹患急性肾疾病的工序;所述工序中,慢性肾疾病患者的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的所述量或值也可以是所述受试者以前患慢性肾疾病时的量或值。
在第三方面和第四方面所述的肾疾病的检查方法中,可以包含也可以不包含非氧化型L-FABP,也可以为氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的混合物,优选为氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的混合物或氧化型L-FABP。
在第三方面和第四方面所述的肾疾病的检查方法中,所述肾疾病优选为选自于由CKD和AKI组成的组中的至少一种肾疾病,较优选为AKI。
作为L-FABP或氧化型L-FABP的检测或定量等的测定方法,举出与关于《对L-FABP进行定量的方法》在上文描述的具体例和优选例相同的实例。
在第三方面和第四方面所述的肾疾病的检查方法中,所述肾疾病的检查当然可以作为疾病发展状况的判断、治疗方针的参考,但优选为选自于由肾疾病的严重程度(重篤度)的判定、肾疾病发病风险的预测和肾疾病发展(進行)的监测组成的组中的至少一种检查,较优选为选自于由肾疾病的预后的严重程度的判定、肾疾病发病风险的预后预测和基于肾疾病发展的监测的预后预测组成的组中的至少一种检查。
在第四方面所述的肾疾病的检查方法中,优选所述定量是在氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件下进行的定量。
作为氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件的具体例和优选例,举出与关于《对L-FABP进行定量的方法》在上文描述的具体例和优选例相同的实例。
第三方面和第四方面所述的肾疾病的检查方法优选还包括以下工序:与所述氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件相比,在氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的测定灵敏度差小的条件下对所述L-FABP进行定量。
作为氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的测定灵敏度差小的条件的具体例和优选例,举出与关于《对L-FABP进行定量的方法》在上文描述的具体例和优选例相同的实例。
在第三方面和第四方面所述的肾疾病的检查方法中,所述定量可以或也可以不根据所测定的标记的强度(例如吸光度、酶标记强度、荧光强度、紫外线强度、放射强度等)与L-FABP的量(例如浓度)之间的关系制作校准曲线,并基于所述校准曲线(例如进行比较)进行定量。
本发明的第五方面是一种肾疾病的检查方法,所述检查方法基于受试者中氧化型L-FABP的量或与其相关的参数的值,并且包括以下工序:将氧化型L-FABP的量或与其相关的参数的值的已知正常范围,或肾疾病中氧化型L-FABP的量或与其相关的参数的值的已知范围与受试者的尿中的氧化型L-FABP的量或与其相关的参数的值进行比较,决定受试者中的所述量或与其相关的参数的值是否属于所述范围中的任一个。
对于第三方面~第五方面所述的肾疾病的检查方法,作为ROC(受试者工作特征)分析结果,优选可以在曲线下面积(AUC)为0.650以上的情况下进行检查,较优选可以在0.700以上的情况下进行检查,进一步优选可以在0.710以上的情况下进行检查。
第三方面~第五方面所述的肾疾病的检查方法可以基于仅L-FABP的定量结果,可以对CKD或AKI进行评价,还可以对CKD和AKI进行一致评价。
第三方面~第五方面所述的肾疾病的检查方法可以包括也可以不包括肾疾病的诊断方法。
此外,本发明可以涉及肾疾病的治疗或预防方法,所述肾疾病的治疗或预防方法包括第三方面~第五方面所述的肾疾病的检查方法以及将针对通过该方法决定的肾疾病的治疗药或预防药给予受试者的工序,也可以不涉及上述方法。
作为所述肾疾病的治疗药或预防药,举出选自于由慢性肾疾病治疗药或预防药以及急性肾疾病治疗药或预防药组成的组中的至少一种药。
《检查试剂盒、伴随诊断药和肾疾病标志物》
本发明的第六方面是用于第三方面或第四方面所述的肾疾病的检查方法的检查试剂盒,所述检查试剂盒包含能够对L-FABP或氧化型L-FABP进行定量的物质。
本发明的第七方面是使用第三方面或第四方面所述的肾疾病的检查方法的伴随诊断药,所述伴随诊断药包含能够对L-FABP或氧化型L-FABP进行定量的物质。
本发明的第八方面是在第三方面或第四方面所述的肾疾病的检查方法中作为定量对象使用的肾疾病标志物,所述肾疾病标志物由肝型脂肪酸结合蛋白质或经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质构成。
在本说明书和权利要求的范围中,“伴随诊断药”是指在实际开始给药之前进行的检查中使用的诊断药,用于预测对于个体肾疾病(例如CKD、AKI)患者的医药品的效果、副作用的风险、适当的给药量。
在第七方面所述的伴随诊断药中,肾疾病优选为选自于由CKD和AKI组成的组中的至少一种疾病。
在第六方面所述的检查试剂盒和第七方面所述的伴随诊断药中,作为能够对L-FABP或氧化型L-FABP进行定量的物质的具体例和优选例,举出与关于《定量用试剂盒》在上文描述的具体例和优选例相同的实例。
作为所述定量手段,作为试剂优选含有所述抗L-FABP抗体,较优选还含有标记的抗L-FABP抗体;根据需要还可以含有抗吸附剂(牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、脱脂乳、聚乙二醇等)、预处理液(任意的表面活性剂、任意的缓冲液等)、反应缓冲液(任意的缓冲液等)、显色底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺、过氧化氢水溶液等)等。
只要不损害本发明的效果,作为所述定量手段中的抗吸附剂的含量就不受到特别限制,优选为0.05质量%~10质量%。
对于第六方面所述的检查试剂盒和第七方面所述的伴随诊断药,当使用抗L-FABP抗体进行定量时,优选具备在定量之前通过表面活性剂对L-FABP进行变性的手段。
作为通过表面活性剂对L-FABP进行变性的手段的具体例和优选例,举出与关于《定量用试剂盒》在上文描述的具体例和优选例相同的实例。
第六方面所述的检查试剂盒和第七方面所述的伴随诊断药优选还具备通过免疫凝集促进剂(优选离液试剂或有机胺化合物)对尿中的L-FABP进行处理的手段,并且所述进行定量的手段优选为对上述处理后的L-FABP进行定量的手段。
对于第六方面所述的检查试剂盒和第七方面所述的伴随诊断药,作为它们是使用夹心ELISA法的试剂盒时的具体方式,例如举出包含关于《定量用试剂盒》在上文描述的(1)~(10)的试剂盒。
第六方面所述的检查试剂盒和第七方面所述的伴随诊断药优选出于防止蛋白吸附的目的而包含含有BSA的蛋白质保存缓冲液。
实施例
以下示出本发明的实施例来更具体地说明本发明,但本发明并不限定于此,可以在不脱离本发明的技术构思的范围内进行各种应用。
<参考例1>
将用50mM AAPH在37℃下处理60分钟的各种浓度的氧化型重组L-FABP和未处理的各种浓度的非氧化型重组L-FABP分别用1w/v%SDS在25℃下变性处理10分钟后,使用“レナプロL-FABPテストHS(高灵敏度)”(シミックホールディングス株式会社制造)的抗体实施ELISA测定,测定标记抗体的显色强度(OD450nm)。所述检查用试剂盒的使用方法按照通常所附的说明书根据测定方法来进行。
结果示于图1(a)中。
另一方面,除了用1000mM苯甲脒盐酸盐在25℃下处理10分钟(以下也称为“BA处理”)来代替用SDS进行的变性处理之外,以同样的方式实施ELISA测定。结果示于图1(b)中。
此外,除了用1500mM氯化胍在25℃下处理10分钟(以下也称为“GU处理”)来代替用SDS进行的变性处理之外,以同样的方式实施ELISA测定。结果示于图1(c)中。
由图1(a)所示的结果可以清楚地看出,在重组L-FABP的各浓度下,氧化型重组L-FABP的OD值与非氧化型重组L-FABP的OD值差不多是相同的。
另一方面,由图1(b)和图1(c)所示的结果可以清楚地看出,进行BA处理或GU处理来代替用SDS进行的变性处理时,在重组L-FABP的任意一个浓度下,氧化型重组L-FABP的OD测定灵敏度都比非氧化型重组L-FABP的OD测定灵敏度高。
认为该测定灵敏度的提高是由抗体识别的L-FABP内部区域在氧化型L-FABP中暴露在外部而引起的。
另一方面,在非氧化型重组L-FABP中,认为即使在测定中使用识别L-FABP内部区域的抗L-FABP抗体,由于没有发生使得所述抗体识别的L-FABP内部区域暴露在外部的结构变化,因此测定强度不会提高。
<实施例1>
使用慢性肾疾病(CKD)患者以及急性肾疾病(AKI)患者的各尿样本,用1w/v%SDS在25℃下变性处理10分钟后,使用“レナプロL-FABPテストHS(高灵敏度)”(シミックホールディングス株式会社制造)的抗体测定尿中L-FABP总浓度(ng/ml)。结果示于图2(a)中。
此外,除了对CKD患者(n=6)和AKI患者(n=16)的各尿样本进行BA处理来代替用SDS进行的变性处理以外,以同样的方式实施ELISA测定。
根据BA处理后的OD值/用SDS进行变性处理后的OD值计算出尿中L-FABP的氧化率。结果示于图2(b)中。
由图2(a)所示的结果可以清楚地看出,CKD患者和AKI患者的尿中L-FABP的总浓度(ng/ml)(包括氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP)差不多是相同的。
另一方面,由图2(b)所示的结果可以清楚地看出,与CKD患者相比,AKI患者中的L-FABP的氧化率显著地低。可以说该结果还表明了,在由急性肾损伤(AKI)所导致的细胞内L-FABP无论生理状况如何而出现在尿中的情况下,非氧化型L-FABP的比例高;与之相反,在生理条件下排泄到尿中的L-FABP的氧化率高。
此外,可以由图2(b)所示的CKD患者、AKI患者中的L-FABP的氧化率与图2(a)所示的CKD患者、AKI患者中的尿中L-FABP的总浓度的乘积来分别对CKD患者、AKI患者中的尿中氧化型L-FABP的浓度进行定量。
Claims (17)
1.一种对肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的方法,所述方法包括在进行促进抗原抗体反应的处理并且经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件下对肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的工序。
2.如权利要求1所述的方法,所述条件是通过用离液试剂或有机胺化合物进行处理而形成的条件。
3.如权利要求1或2所述的方法,所述方法还包括以下工序:与所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件相比,在经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质和未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度差小的条件下对所述肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量。
4.如权利要求3所述的方法,所述测定灵敏度差小的条件是通过用表面活性剂对样本中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行变性处理而形成的条件。
5.如权利要求3或4所述的方法,所述方法还包括以下工序:基于在所述测定灵敏度差小的条件下的所述肝型脂肪酸结合蛋白质的测定值以及在所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件下的测定值,计算出与样本中的肝型脂肪酸结合蛋白质中的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的比例大致对应的氧化率。
6.用于如权利要求1~5中任一项所述的方法的定量用试剂盒,所述定量用试剂盒包含能够对肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的物质。
7.一种肾疾病的检查方法,所述检查方法包括在进行促进抗原抗体反应的处理并且经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件下对受试者的尿中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的工序。
8.一种肾疾病的检查方法,所述检查方法包括在促进抗原抗体反应的处理后对受试者的尿中的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值进行定量的工序。
9.如权利要求8所述的方法,所述定量是在所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件下进行的定量。
10.如权利要求7或9所述的检查方法,所述条件是通过用离液试剂或有机胺化合物进行处理而形成的条件。
11.如权利要求7、9或10所述的方法,所述方法还包括以下工序:与所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件相比,在经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质和未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度差小的条件下对所述肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量。
12.如权利要求11所述的方法,所述测定灵敏度差小的条件是通过用表面活性剂对所述尿中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行变性处理而形成的条件。
13.如权利要求11或12所述的方法,所述方法还包括以下工序:基于在所述测定灵敏度差小的条件下的所述肝型脂肪酸结合蛋白质的测定值以及在所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件下的测定值,计算出与尿中的肝型脂肪酸结合蛋白质中的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的比例大致对应的氧化率。
14.一种肾疾病的检查方法,所述检查方法基于受试者中经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值,并且包括以下工序:将经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值的已知正常范围,或肾疾病中经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值的已知范围与受试者的尿中的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值进行比较,决定受试者中的所述量或与其相关的参数的值是否属于所述范围中的任一个。
15.用于如权利要求7~14中任一项所述的方法的检查试剂盒,所述检查试剂盒包含能够对肝型脂肪酸结合蛋白质或经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的物质。
16.用于如权利要求7~14中任一项所述的方法的伴随诊断药,所述伴随诊断药包含能够对肝型脂肪酸结合蛋白质或经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的物质。
17.在如权利要求7~14中任一项所述的方法中作为定量对象使用的肾疾病标志物,所述肾疾病标志物由肝型脂肪酸结合蛋白质或经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质构成。
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