CN104849464A - 一种检测阿司匹林疗效的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测阿司匹林疗效的试剂盒，属于生物技术领域，包括11-去氢血栓素B2抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶标记的11-去氢血栓素B2抗体、11-去氢血栓素B2标准溶液、底物显色液和去干扰剂。本发明提供的检测阿司匹林疗效的试剂盒包含去干扰剂，可有效避免检测样品中NaN3的干扰，减少了假阴性的产生，提高了阿司匹林疗效检测的灵敏度和准确性。

Description

一种检测阿司匹林疗效的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种检测阿司匹林疗效的试剂盒及其检测方法。
背景技术
阿司匹林可以抑制血栓素A2 (TXA2)的生成，被广泛应用于防治心血管疾病。阿司匹林抵抗通常是指阿司匹林治疗未能达到预期的生物学效应（如抑制血小板聚集，抑制血栓素的生物合成，使出血时间延长）或未能预防动脉硬化血栓事件的现象。阿司匹林抵抗的及时检测，对提高心脑血管疾病患者的疗效至关重要。
张利伟等发表在《诊断学理论与实践》上的题为“阿司匹林抵抗及其实验监测”的论文对阿司匹林抵抗及其相应的检测方法进行了介绍。中国专利申请201410473417.X公开了一种试剂盒，通过肌酸激酶抗原抗体反应进行阿司匹林和氯吡咯雷药物双重抵抗的检测，该专利申请中也披露了用于检测阿司匹林抵抗的光学法血小板聚集试验法，血小板功能分析法，全学法PAGT法及其相应的优缺点。
11去氢血栓烷B2（11-dh-TXB2）是TXA2稳定的降解产物，通过检测11-dh-TXB2可以反映体内TXA2的活性，阿司匹林有效者的尿11-dh-TXB2明显下降。目前，11-dh-TXB2检测法已成为检测阿司匹林抵抗的常用方法，已有11-dh-TXB2检测试剂盒上市。然而，现有的11-dh-TXB2检测试剂盒容易产生假阴性，从而难以准确检测阿司匹林的疗效，进而耽误患者的有效治疗。
发明内容
为解决现有技术中存在的11-dh-TXB2检测试剂盒容易产生假阴性的问题，发明人对检测试剂盒和检测样品进行了大量的试验分析，预料不到地发现：尿液样品的保存，通常情况下需加入防腐剂（如0.01%的NaN3），而NaN3会抑制辣根过氧化物酶（HRP）的活性，干扰了阿司匹林疗效的检测，现有的检测试剂盒无法准确检测含NaN3的样品，从而得出假阴性的检测分析结果。对此，本发明提供一种检测阿司匹林疗效的试剂盒，该试剂盒包含去干扰剂，可有效避免检测样品中NaN3的干扰，及时发现阿司匹林抵抗，减少了假阴性的产生，提高了阿司匹林疗效检测的灵敏度和准确性。
本发明提供一种检测阿司匹林疗效的试剂盒，包括11-去氢血栓素B2抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶标记的11-去氢血栓素B2抗体、11-去氢血栓素B2标准溶液、底物显色液和去干扰剂。
采用上述技术方案的检测阿司匹林疗效的试剂盒，可有效避免检测样品中NaN3的干扰，及时发现阿司匹林抵抗，减少了假阴性的产生，提高了阿司匹林疗效检测的灵敏度和准确性。
本发明提供的检测阿司匹林疗效的试剂盒检测原理是：对待测样品进行去干扰处理，采用双抗体夹心法测定样品溶液中的11-dh-TXB2水平。用人11-dh-TXB2单克隆抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入11-去氢血栓素B2标准溶液或样品溶液，再加入HRP标记的11-dh-TXB2抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过洗涤后加底物TMB显色；TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品溶液中的11-dh-TXB2呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），以标准品浓度（pg/mL)的半对数为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线，通过标准曲线计算样品溶液的11-dh-TXB2浓度。待测样品为血清样品或尿液样品。
优选地，所述去干扰剂选自0.1%~0.5%质量百分比的胰蛋白酶稀释液。胰蛋白酶稀释液是由胰蛋白酶用0.9%的生理盐水稀释而得。胰蛋白酶稀释液的最佳浓度是0.1%~0.5%，如果浓度小于0.1%或大于0.5%，则去干扰效果不好。每10mL尿液样品加100~200μL 0.1%~0.5%的胰蛋白酶稀释液。
优选地，所述底物显色液选自四甲基联苯胺。
优选地，所述11-去氢血栓素B2抗体选自11-去氢血栓素B2单克隆抗体或11-去氢血栓素B2多克隆抗体。
优选地，所述11-去氢血栓素B2单克隆抗体的制备包括如下步骤：A) 采用6~8周龄Balb/c小鼠作为免疫动物，11-去氢血栓素B2交联蛋白作为免疫原，免疫剂量为 50-80 μg/只，首次免疫时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，间隔2~3周后，取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，加强免疫完成1周后取脾细胞；B)将脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按照5：1混合，采用HAT培养基筛选杂交瘤细胞，然后将阳性细胞扩大培养，产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即得。当然，本发明中的11-去氢血栓素B2单克隆抗体可以采用市售产品，也可以采用现有常规技术进行制备。
优选地，本发明提供的检测阿司匹林疗效的试剂盒还包括洗涤液、浓缩复溶液和终止液。上述试剂均以工作液的形式提供，可方便地进行现场检测和大量样本的筛查，也利于提高检测结果的准确性。
优选地，所述洗涤液选自去离子水或pH7.4 的PBST，所述浓缩复溶液选自含0.1%~5%（质量百分比）牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，所述终止液选自盐酸或硫酸。
优选地，所述浓缩复溶液选自含1%~2%质量百分比的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液，所述终止液选自2%~4%体积百分比的盐酸溶液或硫酸溶液。
相应地，本发明还提供一种检测阿司匹林疗效的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：A) 样品前处理：取待测样品，加入去干扰剂，混匀，得到样品溶液；B) 往11-去氢血栓素B2抗体包被的酶标板的相应微孔中加入系列梯度浓度的11-去氢血栓素B2标准溶液或样品溶液，加入辣根过氧化物酶标记的11-去氢血栓素B2抗体，避光孵育后洗涤、拍干，加入底物显色液，避光孵育后加入终止液，用酶标仪测定OD值；C) 建立标准曲线，对样品溶液的检测结果进行分析。
优选地，所述待测样品为全血样品、血清样品或尿液样品；所述去干扰剂选自0.1%~0.5%的胰蛋白酶稀释液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种检测阿司匹林疗效的试剂盒，该试剂盒包含去干扰剂，可有效避免检测样品中NaN3的干扰，减少了假阴性的产生，提高了阿司匹林疗效检测的灵敏度和准确性。本发明提供的检测方法简单，快速，且重复性好。
附图说明
图 1 检测阿司匹林疗效的试剂盒的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例一 11-去氢血栓素B2单克隆抗体的制备
11-去氢血栓素B2单克隆抗体的制备，包括如下步骤：A) 采用7周龄Balb/c小鼠作为免疫动物，经纯化的11-去氢血栓素B2交联蛋白作为免疫原，免疫剂量为 60 μg/只，首次免疫时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，间隔2周后，取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，加强免疫完成1周后取脾细胞；B) 将脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按照5：1混合，采用HAT培养基筛选杂交瘤细胞，然后将阳性细胞扩大培养，产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即得。
制得的11-去氢血栓素B2单克隆抗体在37℃下做冻干处理，放入-20℃冷藏保存。
实施例二 11-去氢血栓素B2抗体包被的酶标板的制备
11-去氢血栓素B2抗体包被的酶标板的制备，包括如下步骤：A) 用0. 5mol/L的PBS缓冲液将11-去氢血栓素B2单克隆抗体稀释为0. 04μg/ml浓度的抗体稀释液；B)向酶标板中加入I00μL抗体稀释液，包被3h后，用含4%吐温-20的去离子水洗涤，拍干；C)向酶标板中加入含有10%脱脂奶粉的封闭液，封闭2h后，倾去孔内液体，真空干燥。
实施例三  检测阿司匹林疗效的试剂盒
检测阿司匹林疗效的试剂盒，包括11-去氢血栓素B2抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶标记的11-去氢血栓素B2抗体、系列浓度的11-去氢血栓素B2标准溶液、底物显色液和0.3%的胰蛋白酶稀释液。
本发明提供的检测阿司匹林疗效的试剂盒在4℃冷藏保存，可保质1年以上，使用前从冷藏环境中取出，在室温下平衡15min以上，各种试剂使用前均须摇匀。
实施例四  检测阿司匹林疗效的试剂盒
检测阿司匹林疗效的试剂盒，包括11-去氢血栓素B2抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶标记的11-去氢血栓素B2抗体、系列浓度的11-去氢血栓素B2标准溶液、底物显色液、0.1%的胰蛋白酶稀释液、pH7.4 的PBST、1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液和盐酸。
本发明提供的检测阿司匹林疗效的试剂盒在4℃冷藏保存，可保质1年以上，使用前从冷藏环境中取出，在室温下平衡15min以上，各种试剂使用前均须摇匀。
实施例五  检测阿司匹林疗效的试剂盒
检测阿司匹林疗效的试剂盒，包括11-去氢血栓素B2抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶标记的11-去氢血栓素B2抗体、系列浓度的11-去氢血栓素B2标准溶液、底物显色液、0.5%的胰蛋白酶稀释液、去离子水、0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液和硫酸。
本发明提供的检测阿司匹林疗效的试剂盒在4℃冷藏保存，可保质1年以上，使用前从冷藏环境中取出，在室温下平衡15min以上，各种试剂使用前均须摇匀。
实施例六  试剂盒进行阿司匹林疗效的检测
样品前处理：取待测样品，加入0.3%的胰蛋白酶稀释液，混匀，得到样品溶液。所述待测样品为全血样品、血清样品或尿液样品。如果待测样品是全血样品，将全血样品与抗凝剂（4%的枸橼酸钠）以10：1的体积比混匀，2000g离心5min，吸取上层血清，得到血清样品溶液。
往11-去氢血栓素B2抗体包被的酶标板的相应微孔中加入50μL系列梯度浓度的11-去氢血栓素B2标准溶液或样品溶液，标准液均需做2个平行试验，加入50μL辣根过氧化物酶标记的11-去氢血栓素B2抗体，避光孵育1h，加入200μL 1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液作为洗涤液洗涤3次，将微孔中剩余残液在吸水纸上拍干，加入50μL底物显色液，振荡混匀，避光孵育15min后，加入50μL终止液，用酶标仪于450nm波长下测定OD值。标准溶液或样品溶液测得的吸光度值减去空白对照吸光度值为实际吸光度值。
根据标准溶液的检测结果建立标准曲线，结果如图1所示。将样品溶液的实际吸光度值代入标准曲线中，可得出样品溶液的浓度，再乘以稀释倍数即得样品溶液中11-去氢血栓素B2的实际浓度。
实施例七  试剂盒进行样品的检测
取100例不含有NaN3的尿液样品，分别使用市售试剂盒（购自美国Elabscience）和本实施例三提供的试剂盒进行检测。市售试剂盒的检测结果：11-去氢血栓素B2平均浓度是 75pg/mL；而本实施例三提供的试剂盒的检测结果为11-去氢血栓素B2（ 11dhTxB2) 平均浓度是 79pg/mL，与现有技术相比，本发明方法的灵敏度提高了5.3%。
取100例含有NaN3的尿液样品，分别使用市售试剂盒和本实施例三提供的试剂盒进行检测，与现有技术相比，本发明方法的灵敏度提高了67.2%，减少了假阴性的产生，提高了准确性。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测阿司匹林疗效的试剂盒，其特征在于：包括11-去氢血栓素B2抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶标记的11-去氢血栓素B2抗体、11-去氢血栓素B2标准溶液、底物显色液和去干扰剂。
2.根据权利要求1所述的检测阿司匹林疗效的试剂盒，其特征在于：所述去干扰剂选自0.1%~0.5%的胰蛋白酶稀释液。
3.根据权利要求1所述的检测阿司匹林疗效的试剂盒，其特征在于：所述底物显色液选自四甲基联苯胺。
4.根据权利要求1所述的检测阿司匹林疗效的试剂盒，其特征在于：所述11-去氢血栓素B2抗体选自11-去氢血栓素B2单克隆抗体或11-去氢血栓素B2多克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的检测阿司匹林疗效的试剂盒，其特征在于：所述11-去氢血栓素B2单克隆抗体的制备包括如下步骤：A) 采用6~8周龄Balb/c小鼠作为免疫动物，11-去氢血栓素B2交联蛋白作为免疫原，免疫剂量为 50-80 μg/只，首次免疫时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，间隔2~3周后，取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，加强免疫完成1周后取脾细胞；B)将脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按照5：1混合，采用HAT培养基筛选杂交瘤细胞，然后将阳性细胞扩大培养，产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即得。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的检测阿司匹林疗效的试剂盒，其特征在于：还包括洗涤液、浓缩复溶液和终止液。
7.根据权利要求6所述的检测阿司匹林疗效的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液选自去离子水或pH7.4 的PBST，所述浓缩复溶液选自含0.1%~5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，所述终止液选自盐酸或硫酸。
8.根据权利要求7所述的检测阿司匹林疗效的试剂盒，其特征在于：所述浓缩复溶液选自含1%~2%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，所述终止液选自2%~4%的盐酸溶液或硫酸溶液。
9.一种权利要求1所述的检测阿司匹林疗效的试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
A) 样品前处理：取待测样品，加入去干扰剂，混匀，得到样品溶液；
B) 往11-去氢血栓素B2抗体包被的酶标板的相应微孔中加入系列梯度浓度的11-去氢血栓素B2标准溶液或样品溶液，加入辣根过氧化物酶标记的11-去氢血栓素B2抗体，避光孵育后洗涤、拍干，加入底物显色液，孵育后加入终止液，用酶标仪测定OD值；
C) 建立标准曲线，对样品溶液的检测结果进行分析。
10.根据权利要求9所述的检测阿司匹林疗效的试剂盒的检测方法，其特征在于：所述待测样品为全血样品、血清样品或尿液样品；所述去干扰剂选自0.1%~0.5%的胰蛋白酶稀释液。
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