CN114002433A - 一种用于检测阿司匹林代谢能力的检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测阿司匹林代谢能力的检测试剂盒及其制备方法，其中，所述试剂盒包括11‑脱氢血栓烷B2的单克隆抗体包被的酶标板、11‑脱氢血栓烷B2竞争品、显色底物、终止液和11‑去氢血栓素B2标准溶液，所述11‑脱氢血栓烷B2的单克隆抗体为鼠单抗，鼠单抗轻链可变区序列如序列表SEQ ID NO.2所示，鼠单抗重链可变区序列如序列表SEQ ID NO.4所示。本发明采用酶联免疫检测试剂盒及其方法，对检测阿司匹林代谢从而判断患者是否具有阿司匹林耐药性或抵抗，具有准确、灵敏度高等特点，且不易被肌酐等生化指标影响，可大大降低临床患者由于出现阿司匹林抵抗导致抗血小板聚集治疗失败或效果不佳的问题。

Description

一种用于检测阿司匹林代谢能力的检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测阿司匹林代谢能力的检测试剂盒及其制备方法，属于生化检测领域。

背景技术

11-脱氢血栓素B2（11-dehydro-thromboxaneB2，11-DH-TXB2）是血栓烷素A2（TXA2）的终末代谢产物，主要经肾排出，在止血及心血管疾病的发生过程中均起到重要作用。花生四烯酸在前列腺素H合成酶1和2（COX-1和COX-2）的作用下生成前列腺素H。前列腺素H化学性质不稳定，可在异构酶的作用下转化为多种具有生物活性的前列腺素类物质，包括TXA2、前列环素I2、前列腺素D2、前列腺素E2及前列腺素F2α等。TXA2主要经COX-1途径在血小板中合成，新生的血小板同时表达COX-1和COX-2，而成熟血小板仅表达COX-1，COX-2则主要表达于单核细胞、内皮细胞等有核细胞中。TXA2有强烈的缩血管作用，还可通过结合血栓烷素血小板受体（TPR）激活血小板，促进其聚集，从而发挥促血栓形成作用。除TXA2外，凝血酶、胶原和腺苷二磷酸（ADP）亦能通过其他通路激活血小板。TXA2高度不稳定，会迅速被水解为较稳定的血栓烷素B2（thromboxaneB2，TXB2）。TXB2随后在肝中被转化为半衰期更长的11-DH-TXB2，并经尿液排出。TXA2则是花生四烯酸在环氧合酶（COX）作用下产生的具有促血小板聚集、收缩血管等生物活性作用的物质，在血栓形成过程中有重要作用。阿司匹林能通过不可逆地抑制COX-1活性，减少TXA2合成，从而抑制血小板聚集及其在冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）发展和急性冠状动脉综合征（ACS）发生中的作用。TXA2的代谢产物11-DH-TXB2水平能反映血小板活性及阿司匹林的抗血小板效果。

阿司匹林能通过抑制血小板COX-1活性有效抑制血小板功能，从而降低心血管事件风险。尿11-DH-TXB2浓度反映血栓烷素的整体合成水平，因而能直接反映阿司匹林对血栓烷素合成及对血小板功能的抑制效果。通过研究既往文献中冠心病及相关人群的尿11-DH-TXB2水平及阿司匹林反应性，得出以下结论：（1）冠心病危险人群及冠心病患者（尤其是ACS患者）基础（未应用阿司匹林时）尿11-DH-TXB2水平明显高于健康人群，且与危险因素水平有正相关趋势，提示血小板活性逐渐增加；性别、年龄、体重等因素也对血栓烷素代谢有一定影响；（2）应用阿司匹林能显著降低所有人群的尿11-DH-TXB2水平，抑制率为60％～80％；（3）高危人群及冠心病应用阿司匹林后的尿11-DH-TXB2水平亦明显高于健康人群，提示有更高的HAPR发生率及心血管不良事件发生风险；（4）PCI能显著提高尿11-DH-TXB2排泌，提示血小板大量激活，CABG术则没有这种效果；（5）多数预后研究支持应用阿司匹林后尿11-DH-TXB2高水平所提示的HAPR与心血管事件发生率增加有关。减少尿11-DH-TXB2排泌的措施可改善阿司匹林反应，或可降低心血管不良事件风险。

体外血小板激活会明显影响血清TXB2的测定结果，却对血清11-DH-TXB2水平无影响，同时尿液与血清中11-DH-TXB2的浓度有良好的相关性，因而测定尿液11dhTXB2的含量能更有效地反映体内TXA2的产生。11-DH-TXB2的检测方法包括放射免疫法（RIA）、酶联免疫吸附法（ELISA）及液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）。由于11-DH-TXB2的分子量较小，且在尿液中的浓度不高，目前多采用ELISA法进行测定。所使用的11-DH-TXB2抗体有单克隆抗体和多克隆抗体两种，测得的尿11-DH-TXB2浓度需用尿肌酸酐浓度进行校正，以排除尿液浓度和肾功能的影响，因此可用随机尿样本进行检测。虽然LC-MS/MS法应用时间较ELISA与RIA短，但能较为特异地检测11-DH-TXB2，检测结果变异率也更小。酶联免疫目前还是检测阿司匹林代谢情况的金标准，但目前的酶免存在假阳率高，准确率差的问题。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种用于检测阿司匹林代谢能力的检测试剂盒及其制备方法。

为实现上述发明目的之一，本发明采用的用于检测阿司匹林代谢能力的检测试剂盒的技术方案如下：

所述试剂盒包括11-脱氢血栓烷B2的单克隆抗体包被的酶标板、11-脱氢血栓烷B2竞争品、显色底物、终止液和系列浓度的11-去氢血栓素B2标准溶液，其中单克隆抗体为鼠单抗，鼠单抗轻链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，鼠单抗重链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述11-脱氢血栓烷B2竞争品为辣根过氧化物酶（HRP）标记的11-DH-TXB2。

优选的，所述试剂盒还包括质控品或校准品11-DH-TXB2。

优选的，所述酶标板为包被11-脱氢血栓烷B2的单克隆抗体包被的酶标板。

优选的，所述显色底物为酶促显色底物TMB。

优选的，所述系列浓度的11-去氢血栓素B2标准溶液为浓度范围在100 pg/ml~8000 pg/ml之间的梯度溶液。

优选的，所述终止液为3%体积百分比的盐酸溶液。

优选的，所述待测样品为尿液样品。

本发明还提供了用于评估阿司匹林代谢能力的方法，所述11-DH-TXB2浓度的判断方法包括如下步骤：

1)向酶标板中同时加入辣根过氧化物酶（HRP）结合的11-DH-TXB2竞争品和待测11-DH-TXB2样品，竞争反应；

2)于37℃孵育1h，用含0.5％吐温-20 PBS洗涤3次；

3)向酶标板中加入显色液，于37℃孵育20min，加入终止液于450nm测定其吸光度；吸光度和样品溶液中的11-DH-TXB2呈反相关；

4)以标准品浓度（pg/mL)的半对数为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线，通过标准曲线计算样品溶液的11-DH-TXB2浓度。

本发明还提供了上述检测试剂盒的制备方法，所述制备方法中酶标板的制备包括如下步骤：

i.用0.5mol/L的PBS缓冲液将11-去氢血栓素B2单克隆抗体稀释为0.04μg/ml浓度的抗体稀释液；

ii.向酶标板中加入100μL抗体稀释液，包被3h后，用含4%吐温-20的去离子水洗涤，拍干；

iii.向酶标板中加入含有10%脱脂奶粉的封闭液，封闭2h后，倾去孔内液体，真空干燥。

优选的，所述标准曲线是通过酶标仪检测11-去氢血栓素B2标准溶液不同浓度的实际吸光度值，经两点定标而得到的一条工作曲线。

优选的，所述样品11-DH-TXB2溶液浓度通过改良的四参数Logistic方程拟合可计算出样本中11-DH-TXB2浓度。

优选的，11-去氢血栓素B2单克隆抗体制备，包括如下步骤：

A)对分泌11-去氢血栓素B2抗体已知杂交瘤细胞的重链可变区和轻链可变区进行基因编辑；

B)细胞的培养筛选；

C)从该杂交瘤细胞株中提取RNA，并使用RT-PCR技术，将获得的RNA反转录为cDNA；

D)利用特定设计的上下游引物PCR扩增该杂交瘤细胞的重链可变区和轻链可变区进行序列确认。

上述方法也可以用于阿司匹林代谢检测检测，或样本中11-DH-TXB2浓度的检测。所述检测方法通过待测11-DH-TXB2与酶标11-DH-TXB2竞争品竞争结合鼠单克隆抗体，以检测待测11-DH-TXB2的含量，进而获得待测者的阿司匹林药物代谢能力。

与现有抗体相比，本发明采用酶联免疫检测试剂盒及其制备方法，对检测阿司匹林代谢从而判断患者是否具有阿司匹林耐药性或抵抗，所述的单克隆抗体对自有知识产权抗体进行了基因编辑，经编辑后较原抗体提高了捕获效率和检测灵敏度，且不易被肌酐等生化指标影响，为临床给药提供了科学的参考依据。通过临床实验发现，本试剂盒可以大大降低临床患者由于出现阿司匹林抵抗导致抗血小板聚集治疗失败或效果不佳的问题。

附图说明

图1是本发明提供的线性试验图；

图2是本发明提供的Western blot电泳图结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的用于检测阿司匹林代谢能力的检测试剂盒及其制备方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

本实施例公开的阿司匹林疗效的酶联免疫检测方法，是采用酶联免疫法检测人体尿液中的11-DH-TXB2含量。本实施例中的酶联免疫法采用竞争法原理，以酶标板作为免疫反应的固相，利用酶联免疫分析方法与酶标仪配合，检测11-DH-TXB2含量。本发明提供了阿司匹林代谢的酶联免疫检测试剂盒的检测原理是：对待测样品采用竞争法测定样品溶液中的11-DH-TXB2水平。用11- DH -TXB2单克隆抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入11-去氢血栓素B2标准溶液或样品溶液，再加入HRP标记的11-脱氢血栓烷B2竞争品结合，形成抗体-抗原酶标复合物，经过洗涤后加底物TMB显色；TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），以标准品浓度（pg/mL)的半对数为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线，通过标准曲线计算样品溶液的11- DH -TXB2浓度。

一、鼠单抗的基因编辑

为了获得更加优异的检测效果，本实施例采用一种环状RNA过表达框架转入小鼠体内，表达11-DH-TXB2获得11-DH-TXB2的鼠单抗，鼠单克隆抗体轻链可变区基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；鼠单克隆抗体重链可变区基因序列如序列表SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

鼠单克隆抗体轻链可变区基因序列（SEQ ID NO.1）及氨基酸序列（SEQ ID NO.2）具体如下：

1 ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG TTA TGG GTA CTG CTG CTC TGG GTT 45

1 M E T D T L L L W V L L L W V 15

46 CCA GGT TCC ACT GGT GAC ATT GTG CTG ACA CAG TCT CCT GCT TCC 90

16 P G S T G D I V L T Q S P A S 30

91 TTA GCT GTA TCT CTG GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCG TGC AGG GCC 135

31 L A V S L G Q R A T I S C R A 45

136 ACC CCC AAC ACA CTG TGC GAC GAA TTC AAA GCC ATG CAC TGG TAC 180

46 T P N T L C D E F K A M H W Y 60

181 CAA CAG AAA CCA GGA CAG TCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT GAC GAG 225

61 Q Q K P G Q S P K L L I Y D E 75

226 TCC AAC CTA GAA TCT GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG 270

76 S N L E S G V P A R F S G S G 90

271 TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT CCT GTG GAG GAG GAG 315

91 S G T D F T L N I H P V E E E 105

316 GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT AAA GGC GCT TGC CTG TCC CCT AAA 360

106 D A A T Y Y C K G A C L S P K 120

361 ATC TTC GGA GGG GGG GAC CAA GCT GGA AAT AAA 393

121 I F G G G D Q A G N K 131

鼠单克隆抗体重链可变区基因序列（SEQ ID NO.3）及氨基酸序列（SEQ ID NO.4）具体如下：

1 ATG CTG TTG GGG CTG TCT CAG CCA CTC GTT TCT ACA GGA TAT CAA 45

1 M L L G L S Q P L V S T G Y Q 15

46 GGT GTG CAT TGT GAG GTG CTG CTT GTT GAG TCT GGT GGA GGA TTG 90

16 G V H C E V L L V E S G G G L 30

91 GTG CAG CCT CTC TCT GTG GCT CTC TCT GCT CCT TCT TAT CTT CTC 135

31 V Q P L S V A L S A P S Y L L 45

136 GTC TGC TCA GCT TAT CAA AAG ATG AAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA 180

46 V C S A Y Q K M N W V R Q A P 60

181 GGA AAG GGT TTG GAA TGG GTT GCT CGC GCT AAA AGA GTA ACA GGC 225

61 G K G L E W V A R A K R V T G 75

226 ATG AGG GTC GTC ATT ATG CCG ATT CAG GGA AAG ACA GGT TCA CCA 270

76 M R V V I M P I Q G K T G S P 90

271 TCT CCA GAG ATG ATG TCA CAT AGC ATG CTC TCT CTG CAG TTG TCT 315

91 S P E M M S H S M L S L Q L S 105

316 TCT CCA CCA CTC TCT GGA GCT AGG GAA TCA TGG GTC ATG TGG TTT 360

106 S P P L S G A R E S W V M W F 120

361 CTC CAA CAA AGG CTT GTC ACA ACA CTC CTT TGG GGT ATG GCT ATT 405

121 L Q Q R L V T T L L W G M A I 135

406 TCA AAC AAC AAG CTC TAT 423

136 S N N K L Y 140

11-去氢血栓素B2单克隆抗体制备，包括如下步骤：

A)对分泌11-去氢血栓素B2抗体已知杂交瘤细胞的重链可变区和轻链可变区进行基因编辑；

B)细胞的培养筛选；

C)从该杂交瘤细胞株中提取RNA，并使用RT-PCR技术，将获得的RNA反转录为cDNA；

D)利用特定设计的上下游引物PCR扩增该杂交瘤细胞的重链可变区和轻链可变区进行序列确认。11-DH-TXB2的单抗电泳图如图2所示，泳道1为小鼠IgG全长，泳道2为Fc片段，泳道3为Fab片段。

二、试剂盒组成及制备

本实施例采用上述序列的单克隆抗制备了检测试剂盒，所述试剂盒采用竞争法原理，以酶标板子作为免疫反应的固相，利用酶联免疫免疫分析方法与酶联免疫类测定仪配合，用于测定人体尿液中的11-DH-TXB2含量。

2.1. 试剂盒包括如下组分组成：

a.包被11-DH-TXB2鼠单克隆抗体的酶标板；

b.辣根过氧化物酶（HRP）标记的11-DH-TXB2竞争品，含防腐剂的50mM PBS缓冲液；

c.校准品：校准品1~6各1瓶，分别添加不同量的11-DH-TXB2抗原，含防腐剂的50mMTris缓冲液；校准品可溯源至Corgenix 酶联免疫分析系统；

d.显色底物：底物显色液选自TMB（四甲基联苯胺）,可以被11-DH-TXB2竞争品的标记HRP酶催化转化成蓝色，在终止液的作用下转化成最终的黄色；

e.终止液：3%体积百分比的盐酸溶液。

2.2. 11-去氢血栓素B2抗体包被的酶标板的制备，包括如下步骤：

A)用0.5mol/L的PBS缓冲液将11-去氢血栓素B2单克隆抗体稀释为0.04μg/ml浓度的抗体稀释液；

B)向酶标板中加入100μL抗体稀释液，包被3h后，用含4%吐温-20的去离子水洗涤，拍干；

C)向酶标板中加入含有10%脱脂奶粉的封闭液，封闭2h后，倾去孔内液体，真空干燥。

三、检测方法

3.1 试剂盒标准曲线制作

使用重组11-DH-TXB2蛋白分别溶于0.02mol/L的PBS缓冲液(PH＝7.4)中，制成200pg/ml、400pg/ml、800pg/ml、1600pg/ml、3200pg/ml、6400pg/ml的6个浓度，使用0.02mol/L的PBS 缓冲液(PH＝7.4)为0点空白校准。每个浓度测定3次，取其平均值。对测定值进行相关分析，如图1所示，图中X轴表示理论值(pg/ml)，Y轴表示实测值(pg/ml)，y =1.0183x + 9.5489，R²＝0.9987。

3.2 样本检测方法

本实施例采用上述试剂盒进行的检测方法是将待测样本、校准品的11-DH-TXB2与辣根过氧化物酶（HRP）标记的11-DH-TXB2竞争结合鼠单克隆抗体标记的酶标板，清洗复合物后，加入酶促酶联免疫底物。底物在酶作用下形成颜色反应，即可使用酶标仪检测反应的OD值。在检测范围内，OD值与样本中的11-DH-TXB2的含量成反比，使用改良的四参数Logistic方程拟合可计算出样本中11-DH-TXB2浓度。具体方法如下：

向11-去氢血栓素B2抗体包被的酶标板的相应微孔中加入50μL系列梯度浓度的11-去氢血栓素B2标准溶液或样品溶液，标准液均需做2个平行试验，加入50μL辣根过氧化物酶标记的11-去氢血栓素B2抗体，避光孵育1h，加入200μL1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液作为洗涤液洗涤3次，将微孔中剩余残液在吸水纸上拍干，加入50μL底物显色液，振荡混匀，避光孵育15min后，加入50μL终止液，用酶标仪于450nm波长下测定OD值。标准溶液或样品溶液测得的吸光度值减去空白对照吸光度值为实际吸光度值。酶标仪借助于由标准曲线经两点定标而得到的一条工作曲线，自动地计算每一个样本的11-DH-TXB2浓度，结果以pg/mL表示。

四、检测结果

4.1 试剂盒检测性能对比

取60例的尿液样品，分别使用市售试剂盒（购自Elabscience）和本发明提供的试剂盒、改造前抗体（根据CN201911224745.5）制备的试剂盒进行检测。与现有技术相比，本发明方法的灵敏度提高了4.8%，检测结果如下：

4.2 试剂盒样本检测结果：

采用上述实施例中所述的方法，取样检测后结果如下：

其中，线性线性范围（200.0～6400.0）pg/mL，相关系数r≥0.99。准确度相对偏差在±10.0%范围内。空白限应不大于100.0 pg/mL。重复性变异系数CV应不大于5.0%。批间差变异系数CV应不大于10.0%。

由于方法学或抗体特异性等原因，使用不同生产商的试剂对同一份样本进行检测可能会得到不同的检测结果，因此，用不同试剂检测所得结果不应直接相互比较，以免造成错误的医学解释。超出试剂盒测定范围的测定结果是通过校准品曲线外延得出的计算结果，报告此类结果时，请务必加以注意。如果欲得到确切测值，请将样本进行适当稀释后再进行检测。质控品可作为当次实验结果可信度的参考依据，其测定值应在本批产品的质控单允许的范围之内。检验结果应根据参考值范围与其他临床因素和结果综合进行判定，当检测结果靠近参考值范围的上限值时，可考虑对样本进行确认试验。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 湖南菲思特精准医疗科技有限公司

<120> 一种用于检测阿司匹林代谢能力的检测试剂盒及其制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(393)

<400> 1

atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120

atctcgtgca gggccacccc caacacactg tgcgacgaat tcaaagccat gcactggtac 180

caacagaaac caggacagtc acccaaactc ctcatctatg acgagtccaa cctagaatct 240

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtaaag gcgcttgcct gtcccctaaa 360

atcttcggag ggggggacca agctggaaat aaa 393

<210> 3

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(131)

<400> 3

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Thr Pro Asn

35 40 45

Thr Leu Cys Asp Glu Phe Lys Ala Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Glu Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Lys Gly Ala Cys Leu Ser Pro Lys Ile Phe Gly Gly Gly Asp Gln Ala

115 120 125

Gly Asn Lys

130

<210> 3

<211> 423

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(423)

<400> 3

atgctgttgg ggctgtctca gccactcgtt tctacaggat atcaaggtgt gcattgtgag 60

gtgctgcttg ttgagtctgg tggaggattg gtgcagcctc tctctgtggc tctctctgct 120

ccttcttatc ttctcgtctg ctcagcttat caaaagatga actgggtccg ccaggctcca 180

ggaaagggtt tggaatgggt tgctcgcgct aaaagagtaa caggcatgag ggtcgtcatt 240

atgccgattc agggaaagac aggttcacca tctccagaga tgatgtcaca tagcatgctc 300

tctctgcagt tgtcttctcc accactctct ggagctaggg aatcatgggt catgtggttt 360

ctccaacaaa ggcttgtcac aacactcctt tggggtatgg ctatttcaaa caacaagctc 420

tat 423

<210> 4

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(141)

<400> 4

Met Leu Leu Gly Leu Ser Gln Pro Leu Val Ser Thr Gly Tyr Gln Gly

1 5 10 15

Val His Cys Glu Val Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Leu Ser Val Ala Leu Ser Ala Pro Ser Tyr Leu Leu Val Cys Ser

35 40 45

Ala Tyr Gln Lys Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Arg Ala Lys Arg Val Thr Gly Met Arg Val Val Ile

65 70 75 80

Met Pro Ile Gln Gly Lys Thr Gly Ser Pro Ser Pro Glu Met Met Ser

85 90 95

His Ser Met Leu Ser Leu Gln Leu Ser Ser Pro Pro Leu Ser Gly Ala

100 105 110

Arg Glu Ser Trp Val Met Trp Phe Leu Gln Gln Arg Leu Val Thr Thr

115 120 125

Leu Leu Trp Gly Met Ala Ile Ser Asn Asn Lys Leu Tyr

130 135 140

Claims (9)

1.一种用于检测阿司匹林代谢能力的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括11-脱氢血栓烷B2的单克隆抗体包被的酶标板、11-脱氢血栓烷B2竞争品、显色底物、终止液和11-去氢血栓素B2标准溶液，所述11-脱氢血栓烷B2的单克隆抗体为鼠单抗，鼠单抗轻链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，鼠单抗重链可变区氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.4所示。

2.根据权利要求1所述的用于检测阿司匹林代谢能力的检测试剂盒，其特征在于，所述11-脱氢血栓烷B2竞争品为辣根过氧化物酶标记的11-DH-TXB2。

3.根据权利要求1所述的用于检测阿司匹林代谢能力的检测试剂盒，其特征在于，所述酶标板为包被11-脱氢血栓烷B2的单克隆抗体包被的酶标板。

4.根据权利要求1所述的用于检测阿司匹林代谢能力的检测试剂盒，其特征在于，所述显色底物为酶促显色底物TMB。

5.根据权利要求1所述的用于检测阿司匹林代谢能力的检测试剂盒，其特征在于，所述11-去氢血栓素B2标准溶液为浓度范围在100 pg/ml~8000 pg/ml之间的梯度溶液。

6.根据权利要求1所述的用于检测阿司匹林代谢能力的检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为3%体积百分比的盐酸溶液。

7.一种如权利要求1~6任一项所述的用于检测阿司匹林代谢能力的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述酶标板的制备包括如下步骤：

i.用0.5mol/L的PBS缓冲液将11-去氢血栓素B2单克隆抗体稀释为0.04μg/ml浓度的抗体稀释液；

ii.向酶标板中加入100μL抗体稀释液，包被3h后，用含4%吐温-20的去离子水洗涤，拍干；

iii.向酶标板中加入含有10%脱脂奶粉的封闭液，封闭2h后，倾去孔内液体，真空干燥。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述标准溶液用于制备标准曲线，标准曲线是通过酶标仪检测11-去氢血栓素B2标准溶液不同浓度的实际吸光度值，经两点定标而得到的一条工作曲线。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述待测样品11-DH-TXB2溶液浓度通过改良的四参数Logistic方程拟合可计算出样本中11-DH-TXB2浓度。

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