CN117949656A

CN117949656A - 一种细胞色素p4502d6代谢酶检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN117949656A
Application number: CN202410332714.6A
Authority: CN
Inventors: 刘宗明; 刘思妤; 付尧; 马芳艳
Original assignee: Jilin Jiming Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jilin Jiming Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-03-22
Filing date: 2024-03-22
Publication date: 2024-04-30
Anticipated expiration: 2044-03-22
Also published as: CN117949656B

Abstract

本申请涉及生物领域，且公开了一种细胞色素P4502D6代谢酶检测试剂盒及其应用。本发明以P4502D6作为免疫原制备并获得了特异性针对P4502D6的单克隆抗体，该单克隆抗体P4502D6‑3H5具有较好的特异性和亲和力，将其制备成为ELISA检测试剂盒后可以有效的用于P4502D6的检测，具有较好的应用前景。

Description

一种细胞色素P4502D6代谢酶检测试剂盒及其应用

技术领域

本申请涉及生物领域，具体的涉及一种细胞色素P4502D6代谢酶检测试剂盒及其应用。

背景技术

细胞色素P4502D6代谢酶是一种在人体内发挥着重要作用的酶，它参与了多种药物的代谢。细胞色素P4502D6代谢酶是一种单体蛋白质，其分子量约为58kDa。该酶由一个亚基组成，包含一个血红素结合域和一个疏水性膜锚定域。血红素结合域是酶的催化活性中心，负责与底物结合并催化其代谢反应。

细胞色素P4502D6代谢酶的主要功能是参与药物的代谢。许多药物需要经过代谢才能发挥药效，而细胞色素P4502D6代谢酶是其中一种重要的药物代谢酶。该酶可以催化多种药物的代谢反应，包括苯丙胺类药物、抗抑郁药、抗精神病药、抗组胺药等。细胞色素P4502D6基因存在多种基因型，其中一些基因型会导致酶的活性降低或丧失。因此，不同个体之间的酶活性存在差异，会影响药物的代谢效果。细胞色素P4502D6代谢酶是药物代谢的重要酶之一，其活性对药物的疗效和不良反应具有重要影响。对于一些需要经过代谢才能发挥药效的药物，如果患者的细胞色素P4502D6代谢酶活性降低或丧失，可能会导致药物代谢减慢，血药浓度升高，从而增加不良反应的风险。因此，在药物治疗过程中，需要考虑到患者的基因型、药物相互作用和病理状态等因素，以确保药物的有效性和安全性。

目前，针对P4502D6代谢酶进行有效的定量检测是疾病治疗之前的重要检测指标。目前，针对靶标蛋白检测的常用方法包括基因芯片、基因编辑、蛋白质组学、高通量筛选和分子影像学以及ELISA法等。ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种广泛用于检测蛋白质的灵敏技术。随着科学技术的不断发展，ELISA检测技术在多个方面取得了显著的进步。首先，针对不同蛋白质靶点的特异性检测是ELISA技术的重要发展方向。通过使用针对不同蛋白质结构和氨基酸序列的特异抗体，研究人员可以实现对特定蛋白质的高选择性识别。这种进步使得ELISA技术可以用于多种生物学和医学研究领域，如疾病诊断、药物研发和生物标记物发现等。其次，提高ELISA检测的灵敏度和特异性也是技术发展的重要方向。通过优化抗体和酶的组合，改进信号放大系统和检测方法的标准化，研究人员成功地提高了ELISA检测的灵敏度和特异性。这使得ELISA技术能够检测低浓度的蛋白质，并降低背景噪音，从而提高检测的准确性。此外，新型的ELISA技术不断涌现。例如，通过结合微流体技术和数字PCR技术，研究人员开发出一种高灵敏度的数字ELISA方法，可以实现对单分子水平的蛋白质检测。这种技术具有极高的灵敏度和精确度，为生物标志物研究和临床诊断提供了新的工具。总的来说，ELISA检测技术在针对不同蛋白质靶点的特异性检测、提高灵敏度和特异性以及新型技术的开发等方面取得了显著的进展。

但是ELISA检测P4502D6代谢酶最核心的单克隆抗体的研究还不够多，提供的可选择形式也不够丰富，特别是结合能力较强的单抗还没有，有待于技术进一步的提高。

发明内容

本发明提供了一种特异性针对P4502D6代谢酶的检测试剂盒。

具体的，所述的试剂盒中含有特异性针对P4502D6代谢酶的单克隆抗体。

进一步的，本发明提供一种特异性针对P4502D6代谢酶的单克隆抗体，所述单克隆抗体命名为P4502D6-3H5，其轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，其重链可变区序列如SEQID NO：2所示。

具体的，本发明的单克隆抗体序列还可以被保守氨基酸取代，但是仍然保持相应的抗体结合活性。

具体的，术语“保守氨基酸取代”表示对于给定的氨基酸残基的任何氨基酸取代，其中取代残基在化学上与给定的残基如此相似，以致于不会导致多肽功能(例如，酶活性)的显著降低。保守氨基酸取代在本领域中是公知的。在优选的实施例中，保守氨基酸取代将是发生在以下中的任何一个：小的脂肪族的基本上非极性的残基：Ala、Gly、Pro、Ser和Thr；大的脂肪族的非极性残基：Iie、Leu和Val；Met；极性的带负电荷的残基及其酰胺：Asp和Glu；极性的带负电荷的残基的酰胺：Asn和Gin；His；极性的带正电荷的残基：Arg和Lys；His；和大的芳香残基：Trp和Tyr；Phe。在一个优选的实施例中，保守氨基酸取代将是下列中的任一种，其作为天然残基(保守取代)对列出：Ala(Ser)；Arg(Lys)；Asn(Gin；His)；Asp(Glu)；Gin(Asn)；Glu(Asp)；Gly(Pro)；His(Asn；Gln)；Ile(Leu；Val)；Leu(Ile；Val)；Lys(Arg；Gin；Glu)；Met(Leu；Ile)；Phe(Met；Leu；Tyr)；Ser(Thr)；Thr(Ser)；Trp(Tyr)；Tyr(Trp；Phe)；和Val(Ile；Leu)。

进一步的，在一个或多个实施例中，本发明提供了一种分离的P4502D6-3H5单克隆抗体，其中可变重链包括与SEQ ID NO.2的氨基酸序列(VH)具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，与包括SEQ ID NO.1的轻链氨基酸序列(VL)具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。

进一步的，本发明的单克隆抗体本可被用于任何已知的免疫测定方法，比如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定、侧向流测定(例如浸量尺格式)和免疫沉淀测定。

具体的，在本发明的一个优选测定模式中，抗体被固定在固相底物上。现有技术中已知有各种固相支持物适合于本发明的使用.例如，固相支持物可以是珠子、膜(比如，硝酸纤维素膜)，微量滴定孔(例如，PVC或聚苯乙烯)，带、塑胶、条或任何抗体可以在其上固定或沉淀的固体表面.此外，多种有机或无机聚合体，天然的或合成的也可以用作固体表面材料使用.例证性的聚合体包括聚乙烯、聚丙烯，聚(4丁烯甲酯)，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯、聚(乙烯对苯二酸酯)，人造纤维，尼龙，聚(乙烯丁酸盐)，聚偏二乙烯二氟化物(PVDF)，硅树脂，聚甲醛、纤维素，醋酸纤维素，硝酸纤维素等等。其他可以使用的材料包括纸，玻璃，陶器，金属，非金属，半导体材料，接合剂等。此外，形成凝胶的基质比如蛋白质(例如明胶)，脂多糖，硅酸盐，琼脂糖和聚丙烯酰胺能够被使用。形成几种水相的聚合物比如右旋糖酐和聚烷二醇或表面活性剂，比如磷脂或长链(12-24碳原子)烷基铵盐等等也适于使用。更进一步的，公知的支持物或载体包含玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯(PVDF)、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。为了本发明的目的，载体的性质可以是某种程度上可溶的或不可溶的。支持物材料实际上可以具有任何可能的结构构型，只要偶联的分子能够结合至本发明的抗体。因此，支持物构型可以是球形的，例如珠状，或圆柱形的，例如试管的内表面，或杆的外表面。可替代地，表面可以是平的，例如片材、培养皿、测试条等。例如，支持物可以包含聚苯乙烯珠。本领域技术人员将了解许多其他合适的用于结合抗体、肽或抗原的载体，或者可以通过常规实验确定该载体。公知的方法步骤可以确定给定批次的抗NGF肽和/或抗体或抗原结合蛋白的结合活性。本领域技术人员可以通过常规实验来确定操作和最佳测定条件。

可检测地标记抗体可以通过连接至用于酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的酶来实现。连接的酶与暴露的底物反应以生成化学部分，该化学部分可以通过例如分光光度法、荧光分析法或通过视觉手段来检测。可以用于可检测地标记本发明的特异性抗体的酶包含但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。通过放射性地标记P4502D6-3H5抗体，可以通过使用放射免疫测定法(RIA)来检测P4502D6酶。

优选的，放射性同位素可以通过例如使用γ计数器或闪烁计数器的手段或者通过放射自显影术来检测。对本发明的目的特别有用的同位素包含：3H、125I、131I、35S和14C。

还可以用荧光化合物标记P4502D6-3H5特异性抗体。当荧光标记的抗体暴露于适当波长的光时，由于荧光，于是可以检测到它的存在。最常用的荧光标记化合物有异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。P4502D6-3H5特异性抗体或抗原结合蛋白也可以用发射荧光的金属例如125Eu或其他镧系元素可检测地标记。这些金属可以使用金属螯合基团例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)附着至P4502D6-3H5特异性抗体。P4502D6-3H5特异性抗体也可以通过偶联至化学发光化合物被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光的存在来确定化学发光标记的抗体的存在。有用的化学发光标记化合物的示例是鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

同样，生物发光化合物可以用于标记本发明的P4502D6-3H5特异性抗体。生物发光是在生物系统中发现的一种化学发光，其中催化蛋白提高了化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在通过检测发光的存在来确定。用于标记的目的的重要生物发光化合物是荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。P4502D6-3H5特异性抗体的检测可以通过闪烁计数器来完成(例如，如果可检测的标记是放射性γ发射器)，或者通过荧光计来完成(例如，如果标记是荧光材料)。在酶标记的情况下，检测可以通过使用用于酶的底物的比色方法来完成。检测也可以通过将底物的酶促反应的程度与类似制备的标准品进行视觉比较来完成。

为了本发明的目的，通过上述测定检测的P4502D6-3H5单克隆抗体可以存在于生物样品中。可以使用任何含有的样品。例如，样品是生物流体，诸如例如肝脏、血液、血清、淋巴、尿液、粪便、炎性渗出物、脑脊液、羊水、组织提取物或匀浆等。本发明不限于仅使用这些样品的测定，然而，根据本说明书，本领域普通技术人员可以确定允许使用其他样品的合适条件。

本发明的抗体、片段或衍生物可以适用于免疫测定，也被称为“双位点”或“夹心”测定。在典型的免疫测定法中，一定量的未标记的抗体(或抗体的片段)被结合至不溶于接受测试的流体的固体支持物上，并加入一定量的可检测地标记的可溶性抗体，以允许检测和/或定量在固相抗体、抗原和标记的抗体之间形成的三元复合物。

抗体可以用于定量地或定性地检测样品中的P4502D6，或者检测表达P4502D6的细胞的存在。这可以通过免疫荧光技术(采用荧光标记的抗体(参见下文))并结合荧光显微检查、流式细胞术或荧光检测来实现。出于诊断目的，抗体可以被标记或未标记。未标记的抗体可以与其他标记的抗体(第二抗体)结合使用，所述标记的抗体与抗体反应，例如对犬免疫球蛋白恒定区特异性的抗体。可替代地，可以直接标记抗体。可以使用多种标记，例如放射性核素、荧石、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、配体(特别是半抗原)等。许多类型的免疫测定法(例如前面讨论的那些)是可获得的，并且是本领域技术人员熟知的。重要的是，本发明的抗体可能有助于诊断P4502D6相关的病症。更具体地，本发明的抗体可以识别P4502D6的过表达。因此，本发明的抗体可以提供一种重要的免疫组织化学工具。本发明的抗体可以用于抗体阵列，非常适合于测量基因表达概况。

本发明还提供了一种P4502D6捕获ELISA试剂盒，其组成包括已包被P4502D6多克隆抗体的固相载体即酶标板，辣根过氧化物酶标记的P4502D6-3H5单克隆抗体、酶的底物反应液、阳性和阴性对照、洗涤液和反应终止液。

有益效果

本发明以P4502D6作为免疫原制备并获得了特异性针对P4502D6的单克隆抗体，该单克隆抗体P4502D6-3H5具有较好的特异性和亲和力，将其制备成为ELISA检测试剂盒后可以有效的用于P4502D6的含量测定，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为本发明P4502D6-3H5单克隆抗体的特异性鉴定结果图；

图2为本发明试剂盒使用结果图。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。

实施例1 P4502D6的表达及鉴定

根据美国NCBI基因库中核酸数据库的CYP2D6基因序列和借助计算机辅助分析,分别在CYP2D6的免疫显性表位(编码CYP2D6蛋白质的第257-351之间氨基酸)的两侧自行设计引物：

上游引物:5' gcatcaccatcaccatcaccgtggt ggtgagcacaggatgacctggg3'；

下游引物:5' aggcagatcgtcagtcagtcacgataga agcctggtcacccatctctg3'(带下划线的斜体为通用引物。

PCR条件:94℃预变性4min,94℃30s,58℃30s,72℃2min,35个循环,72℃延伸10min.PCR结束后,离心片刻.然后取PCR产物5μL进行10g/L琼脂糖凝胶电泳检测.用乙醇沉淀法纯化PCR产物和被XbalⅠ、HindⅢ双酶切的pEGH载体共同转化感受态酿酒酵母Y258,转化阳性克隆30℃培养48h,可在营养缺陷型SC-Ura-/glucose固体培养基上得到直径2mm的单克隆菌落。将鉴定为阳性的菌落在Yeast平板划线培养48h,得到2mm左右的单克隆菌落。挑2mm左右的单克隆菌落加到SC-ura/raffinose液体培养基,30℃振荡培养至A600nm=0.6-0.8后,加入半乳糖至终浓度为2g/L,30℃振荡培养过夜，收集菌液应用Glutathione-Sepharose4B进行亲和纯化，采用SDS-PAGE进行纯化蛋白鉴定，在37000Mr有明显单一条带，表明CYP2D6和GST融合表达成功。使用人细胞色素P4502D6CYP2D6 elisa试剂盒（ZY5125514卓渝生物）检测该蛋白阳性显示，表明具有P4502D6酶活性。将蛋白浓度调整为1mg/mL备用。

实施例2 P4502D6单克隆抗体的制备

将实施例1表达纯化的P4502D6蛋白与佐剂乳化后免疫6周龄Balb/c雌性小鼠2只(100μg/只)，背部皮下分点注射，其中弗氏完全佐剂用于首免，弗氏不完全佐剂用于此后的加强免疫,每次免疫间隔3周，共免疫4次，4免后的第21天断尾釆血。以纯化的P4502D6蛋白包被酶标板(10mg/L),分别利用间接酶联免疫吸附试验(iELISA)来检测免疫小鼠血清效价。结果如表1所示。

表1 免疫小鼠血清iELISA效价

小鼠编号	1：6400	1:12800	1:25600	1:32000	1:51200	1:102400
							1	2.105	1.563	0.836	0.452	0.262	0.137
2	2.899	2.103	1.597	0.732	0.368	0.236
							阴性对照	0.200	0.183	0.132	0.115	0.109	0.112

从表1可以看出，效价最高的是2号小鼠，以2倍免疫剂量且不加佐剂的抗原腹腔注射小鼠进行超免，5d后无菌取小鼠脾脏用于细胞融合。取2号小鼠的多克隆抗体备用。细胞融合的方法为，SP2/0细胞与超免后Balb/c小鼠脾细胞按1：10的比例混合后，加PEG1500融合剂1mL,用RPMI-1640/HAT/10%FBS培养液将融合后的细胞分散接种于6块96孔细胞板中，200μl/孔，置37℃,5%CO₂培养箱中培养10d后取杂交瘤细胞上清进行检测。按照iELISA方法，以纯化的P4502D6蛋白包被酶标板,以GST作为反筛，检测杂交瘤细胞上清，将结果为阳性的杂交瘤细胞转至24孔细胞板扩大培养4d,选择iELISA复测强阳性孔进行有限稀释3次,最后选出状态良好的单克隆杂交瘤细胞P4502D6-3H5，扩大培养后离心收集细胞,用无血清细胞冻存液重悬后冻存于液氮中备用。

采用体内腹水诱生法生产单克隆抗体。将灭菌液体石蜡腹腔注射经产的Balb/c母鼠进行致敏预处理,0.5mL/只。收集5xl0⁶个单克隆抗体杂交瘤细胞P4502D6-3H5，无菌PBS洗2遍，最后重悬于0.5mL无菌PBS中，腹腔接种已致敏至少14d的Balb/c经产母鼠。观察14d左右,待小鼠腹部明显膨胀时无菌采集腹水，在5000r/min条件下离心15min,收集上清,采用Protein A/G 亲和层析法纯化单克隆抗体，-20℃保存备用。

实施例3 P4502D6-3H5单克隆抗体的特异性鉴定

将P4502D6蛋白、GST蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将凝胶电泳分离的蛋白质转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉通过室温封闭PVDF膜2h。PBST洗涤3遍；加待检的P4502D6-3H5单克隆抗体，置4℃冰箱孵育过夜,PBST充分振摇洗涤;加1%脱脂奶粉稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(1:1000),37℃孵育lh，PBST充分振摇洗涤。将NcmECLUltra(NCM)显影液A、B(1：1)混合后滴在膜上孵育3min,置凝胶成像仪中观察结果，如图1所示。

从图1的Western blot鉴定结果显示，单克隆抗体P4502D6-3H5特异性识别P4502D6蛋白，出现1条特异性反应条带，与GST不识别，无条带产生，表现了较好的特异性。

实施例4 P4502D6-3H5单克隆抗体的亲和力鉴定

SPR技术检测P4502D6-3H5抗体亲和力：将抗鼠IgG二抗固定于CM5芯片上，利用BiacoreT200捕获P4502D6-3H5抗体，将P4502D6蛋白作为分析物，用缓冲液分别稀释到0、7.5、15和30nM浓度梯度，利用单循环动力学检测不同抗体与MB抗原的结合。最终数据用biacore evaluation software 3.0按1:1模型进行kinetics拟合分析，计算效价结果如表2所示。

表2 单抗效价测定结果

P4502D6-3H5抗体	效价
		KD (mol/L)	3.84E-11
Ka[1/(mol*s/L)]	2.23E+05
		Kd(1/s)	8.57E-06

从表2可以看出，本发明的P4502D6-3H5抗体具有较强的亲和力。

实施例4 P4502D6-3H5单克隆抗体的可变区序列鉴定

用RPMI1640完全培养基在37℃、5%二氧化碳培养杂交瘤细胞P4502D6-3H5，培养细胞总RNA提取试剂盒（购自天根）提取细胞总RNA。cDNA第一链的合成根据Takara翻转录试剂盒（日本）的操作说明合成cDNA。将cDNA寄送北京百泰派克生物科技有限公司进行可变区序列测定。经测定，获得该P4502D6-3H5单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例5 P4502D6抗原捕获ELISA试剂盒的制备及使用

用PBS缓冲液将P4502D6多克隆抗体（如实施例2制备得到）稀释至浓度为10μg/mL，包被96孔酶标板，100μL/孔，4℃过夜。取出后用PBST洗板3次，甩干。2%的BSA溶于PBS溶液中作为封闭液，100μL/孔加入酶标板，37℃封闭1h。取出后用PBST洗板3次，每次3min，甩干，干燥后真空密封保存。

将P4502D6-3H5单克隆抗体与辣根过氧化物酶（HRP）采用过碘酸盐氧化法进行偶联。采用3,3,5,5-四甲基联苯胺TMB（SIGMA）作为辣根过氧化物酶的底物。醋酸钠溶液（pH=4.3）4mL，加入30%的H₂O₂ 5mL，TMB 1mL，即成10mL底物反应液（现用现配）。阳性对照：重组人细胞色素P4502D6（Biovision，货号： 7870-5），50μg/mL（A组）。阴性对照：正常小鼠血清100倍稀释液（B组）。洗涤液为PBST洗涤液，反应终止液用三蒸水配制的2M H₂SO₄溶液。

利用本发明所述的试剂盒，将正常人血清（C组），以及添加了50μg/mL的P4502D6重组蛋白的人血清（D组）、添加了100μg/mL的P4502D6重组蛋白的人血清（E组）进行检测。检测结果见图2，实验结果表明添加了P4502D6蛋白的血清中的OD450值相对于正常人血清的OD450值含量显著升高。说明本发明试剂盒能够用于临床检测。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种细胞色素P4502D6代谢酶检测试剂盒，其特征在于，含有特异性针对P4502D6代谢酶的单克隆抗体P4502D6-3H5，其轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，其重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。

3.一种P4502D6代谢酶的单克隆抗体P4502D6-3H5，其特征在于，所述抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，其重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

4.权利要求3所述的P4502D6代谢酶的单克隆抗体P4502D6-3H5在制备用于检测P4502D6代谢酶的试剂盒中的用途。