CN103018364A - 用于测定肝素及其盐相对分子量及分子量分布的对照品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于测定肝素及其盐相对分子量及分子量分布的对照品，由肝素钠及其分子量宽分布标样表构成，肝素钠为固体形式，其经HPSEC-MALLS测定的分子量范围是3000～40000。本发明还公开了一种测定肝素供试品的相对分子量及分子量分布的方法，步骤如下：（1）选择分子量在3000～40000的肝素样品作为对照品；（2）分子量宽分布标样表的制作；（3）对肝素供试品进行HPSEC测定，并计算相对分子量及分子量分布，以进行质量控制。本发明提供的对照品及利用该对照品测定肝素供试品的相对分子量及分子量分布的方法，为国内外首次，其具有较高的实用价值，方法严谨、科学，测定方法简单，测定结果准确、精确，具有良好的推广应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于高效凝胶排阻色谱（HPSEC）测定肝素及其盐相对分子量及分子量分布的对照品，以及其制备方法和应用。
背景技术
肝素是哺乳动物体内存在的一种糖胺聚糖，由己糖醛酸和葡萄糖胺通过1,4-糖苷键连接形成，其相对分子量主要分布在3000~30000之间，是一种混合物。自1937年起，肝素就被作为抗凝剂应用于临床治疗。
大量研究表明，肝素的多种生理活性及其体内过程都有分子量依赖性。首先，肝素的抗凝活性具有分子量依赖性。肝素分子内存在的一种五糖结构能特异性地催化ATⅢ与凝血因子FXa的结合，从而抑制FXa的活性。而ATⅢ对凝血因子FIIa的抑制，除上述五糖结构外，还需要至少13个单糖残基，即需要至少含18个单糖残基的肝素分子。因此，分子量较大的肝素的抗凝活性优于分子量较小的肝素，但同时前者引发出血的风险也高于后者。正是基于这一机制，低分子肝素被开发并应用于临床，其安全性得到显著提高。第二，肝素的体内清除机制也与其分子量密切相关。肝素进入血液后，可与多种血浆蛋白和血管内皮细胞及巨噬细胞表面受体结合，进而通过巨噬细胞及网状内皮系统清除，这一清除机制与肝素的分子量及剂量有关，一般来说，高分子量的肝素更容易被清除。因此，肝素的分子量和分子量分布也是影响其代谢的重要因素。第三，肝素在临床应用过程中可能会引发的重要副反应——血小板减少症（heparin-induced thrombocytopenia，HIT）也与肝素的分子量有关。肝素在人体内与血小板因子4（platelet factor4,PF4）形成复合物，会引发免疫反应，产生肝素依赖性抗体，进而导致血小板活化，引起强烈的血小板聚集，最终造成血小板减少和血栓形成。有研究证明，未分级肝素的免疫原性远大于低分子肝素。第四，肝素被硫酸鱼精蛋白中和的能力也具有分子量依赖性。在使用肝素过程中若发生出血，则需采用硫酸鱼精蛋白进行中和。随着肝素分子量减小，鱼精蛋白的中和能力也随之下降。综上所述，肝素的分子量和分子量分布是其重要的质控指标，有必要进行常规的监控。
现行的美国药典、英国药典、欧洲药典及中国药典主要对肝素的鉴别、效价、相关物质、残留溶剂、重金属含量等项目做出了规定，而对于肝素的分子量及分子量分布未作出规定，亦未给出检测方法。因此，制定肝素的分子量和分子量分布质量标准，探索肝素分子量及分子量分布的测定方法对于提高肝素的质量水平具有重要意义。
目前用于测定肝素类分子相对分子量及分子量分布的方法主要有以下几种：高效分子排阻色谱法（HPSEC）、多角度激光光散射仪法（SEC-MALLS）、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、质谱法及核磁共振法。其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳法耗时较长，操作繁琐，且小分子量的组分往往因难以着色而被忽略，因此测定结果偏大；质谱法由于离子化过程中容易导致硫酸根的中性化，因此难以得到准确的分子量信息；核磁共振法同样存在准确度差的问题；多角度激光光散射仪法无需分子量校正标准品，检测快速准确，但是仪器较为昂贵；高效分子排阻色谱法经济快速，重现性也较好，且能同时测出分子量分布信息，但是需要肝素相对分子量校正标准品，且该标准品的分子量范围必须涵盖供试品中各组分的分子量。
目前已上市的可用于肝素分子量测定的是heparin polysaccharideⅠ-Ⅵ，其分子量分别为5000Da、7000Da、9000Da、12000Da、15000Da和20000Da。但其分子量范围无法覆盖所有的肝素分子，因此测定结果并不准确。也有文献报道以普鲁兰作为标准品测定肝素的相对分子量，但是由于普露兰的结构与肝素存在本质的区别，因此测定的相对分子量并不准确。综上所述，制备可用于肝素相对分子量及分子量分布测定的标准品至关重要。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提出了一种宽分布的肝素相对分子量校正对照品，包括其制备、相对分子量和分子量分布测定方法。本发明具有较高的实用价值，相关方法严谨、科学，具有良好的推广应用前景。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于测定肝素及其盐相对分子量及分子量分布的对照品，由肝素钠及其分子量宽分布标样表构成，肝素钠为固体形式，其经HPSEC-MALLS测定的分子量范围是3000～40000。
所述对照品的平均分子量在15000～20000。
上述对照品的制备方法如下：
（1）根据文献报道，肝素的分子量范围一般在3000～30000，据此，选择若干批注射级肝素钠原料药，利用HPSEC-MALLS分别测定其分子量及分子量分布，从中选择分子量在3000～40000的肝素样品作为对照品。
（2）分子量宽分布标样表的制作：根据上述HPSEC-MALLS获得的肝素分子量累计分布图，制作肝素对照品宽分布标样表，即肝素分子量与其色谱峰累积面积百分比的对应表。
本发明的对照品，可以用于测定肝素供试品的相对分子量及分子量分布，以对肝素及其盐进行质量控制。
一种测定肝素供试品的相对分子量及分子量分布的方法，步骤如下：
（1）选择若干批注射级肝素钠原料药，利用HPSEC-MALLS分别测定其分子量及分子量分布，从中选择分子量在3000～40000、平均分子量在15000～20000的肝素样品作为对照品；
（2）分子量宽分布标样表的制作：根据上述HPSEC-MALLS获得的肝素分子量累计分布图，制作肝素对照品宽分布标样表，即肝素分子量与其色谱峰累积面积百分比的对应表；
（3）对肝素供试品进行HPSEC测定，并计算相对分子量及分子量分布，以进行质量控制：
①HPSEC分析：分别对上述对照品及肝素供试品进行HPSEC分析，得色谱图；
②分子量校正曲线的制备：根据步骤（2）制作的对照品的宽分布标样表，从HPSEC测定的肝素对照品的色谱图依次读出相应特征色谱峰累积峰面积百分比所对应的保留时间，并以这一系列保留时间对其在宽分布标样表中对应分子量的对数值进行常规3次曲线方程拟合（Empower2.0自动拟合），得到校正曲线；
③利用上述得到的校正曲线，将供试品的保留时间代入该校正曲线，对供试品的色谱图中的肝素色谱峰进行积分，即可获得供试品的相对分子量和分子量分布；质量是否合格的判断：根据测定的结果，判断肝素供试品的质量是否符合要求。
所述步骤（1）中，HPSEC-MALLS的色谱条件如表1所示：
表1
所述步骤（2）中，肝素对照品宽分布标样表的具体制作方法为：根据步骤（1）选定的肝素对照品的分子量范围，从MALLS测定的最小分子量开始，到分子量累积百分比为99%的分子量为止，根据分子量和分子量分布累积百分比选取5～20个点（优选的为10～18个点）（尽量按照累计百分比间隔相同选取），分别读出其对应的分子量，建立起肝素分子量-累积面积百分比的对应表，即肝素对照品宽分布标样表。
所述步骤（3）①中，HPSEC分析的色谱条件如表2所示：
表2
本发明提供了一种用于HPSEC测定肝素相对分子量及分子量分布的对照品，并提供了利用该对照品测定肝素供试品的相对分子量及分子量分布的方法，为国内外首次，其具有较高的实用价值，方法严谨、科学，测定方法简单，测定结果准确、精确，具有良好的推广应用前景。
附图说明
图1：肝素样品批次9的HPSEC-MALLS色谱图，其中红色信号（左侧的曲线）为MALLS，蓝色信号（右侧的曲线）为RI。
图2：肝素分子量对照品（批次9）的HPSEC色谱图，检测器为RI。
图3：肝素供试品批次4的HPSEC色谱图，检测器为RI。
图4：肝素供试品批次7的HPSEC色谱图，检测器为RI。
图2～4中红线标出部分（左侧曲线包围的部分）为积分区间。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1 肝素分子量对照品的制备过程
材料和试剂：选择肝素钠样品10批，均为国产肝素钠注射级原料药；硝酸钠，叠氮化钠，国产分析纯；三蒸水。
流动相的配制：精密称取硝酸钠34g，叠氮化钠0.4g，溶于2L三蒸水。用双层0.22μm水相微孔滤膜抽滤2次。
样品溶液的配制：分别精密称取肝素钠原料药样品6mg，溶于4mL流动相。双层0.22μm水相微孔滤膜过滤1次。
色谱系统：Waters515HPLC泵，Wyatt Optilab rEX视差折光检测器，Wyatt DAWNHELEOS II多角度激光散射仪。
利用HPSEC-MALLS分别测定上述批次的分子量及分子量分布。
色谱条件如表3所示：
表3
分子量及分子量分布如表4、表5所示：
表4
表5
根据文献报道的肝素钠分子量范围的报道，选择批次9作为分子量宽分布对照品，图1为批次9的HPSEC-MALLS色谱图，其中红色信号为MALLS，蓝色信号为RI。
肝素对照品宽分布标样表的制作：根据HPSEC-MALLS获得的批次9肝素的分子量分布，制作肝素对照品宽分布标样表，具体如表6所示：
表6
实施例2 利用肝素分子量对照品测定肝素钠供试品的相对分子量和分子量分布
（1）肝素分子量对照品及肝素供试品的HPSEC分析
材料和试剂：选择肝素钠样品10批，均为国产肝素钠注射级原料药；硝酸钠，叠氮化钠，国产分析纯；三蒸水。
色谱系统：Waters2695，2414。
色谱条件如表7所示：
表7
流动相的配制：精密称取硝酸钠34g，叠氮化钠0.4g，溶于2L三蒸水。用双层0.22μm水相微孔滤膜抽滤2次。
对照品和供试品溶液的配制：分别精密称取样品10mg，溶于10mL流动相。双层0.22μm水相微孔滤膜过滤1次。
系统平衡好后，先分析对照品，然后分别分析其他10个样品。
（2）相对分子量校正曲线的计算：图2为肝素分子量对照品的HPSEC色谱图。利用GPC软件计算对照品的色谱图中肝素色谱峰的峰面积，然后按照宽分布标样表（表6），读出相应累积面积百分比所对应的保留时间及其对应的分子量，见表8：
表8
将保留时间与表中对应分子量的对数值进行3次曲线方程拟合，得到校正曲线：
lgMt=4.87e－8.11·T＋4.87e-1·T2-9.66e-3·T3，R=0.999159；
（3）肝素供试品分子量和分子量分布的测定和计算：用上述校正曲线测定供试品的分子量及分子量分布，结果见表9和表10。图3、4为批次4和批次7肝素样品的HPSEC色谱图。
表9
表10
实施例3 精密度实验
取5批肝素钠样品，均为国产注射级肝素钠原料药，采用实施例2的实验条件及方法，对每批样品分别连续进样5次，测定其相对分子量，结果如表11～20所示：
表11批次1分子量测定精密度实验结果
表12批次1分子量分布精密度实验结果
表13批次2分子量测定精密度实验结果
表14批次2分子量分布精密度实验结果
表15批次3分子量测定精密度实验结果
表16批次3分子量分布精密度实验结果
表17批次4分子量测定精密度实验结果
表18批次4分子量分布精密度实验结果
表19批次5分子量测定精密度实验结果
表20批次5分子量分布精密度实验结果
由以上结果可知，利用该肝素分子量宽分布对照品测定肝素相对分子量的方法精密度良好。
实施例4 重现性实验
取5批肝素样品，均为国产注射级肝素钠原料药，采用实施例2的实验条件及方法，对每批样品分别进样5次，每两次之间间隔2小时，测定其相对分子量，结果如表21～表30：
表21批次1分子量测定重现性实验结果
表22批次1分子量分布测定重现性实验结果
表23批次2分子量测定重现性实验结果
表24批次2分子量分布测定重现性实验结果
表25批次3分子量测定重现性实验结果
表26批次3分子量分布测定重现性实验结果
表27批次4分子量测定重现性实验结果
表28批次4分子量分布测定重现性实验结果
表29批次5分子量测定重现性实验结果
表30批次5分子量分布测定重现性实验结果
由以上结果可知，利用该肝素分子量宽分布对照品测定肝素相对分子量的方法重现性良好。
Claims (10)
1.一种用于测定肝素及其盐相对分子量及分子量分布的对照品，其特征在于：由肝素钠及其分子量宽分布标样表构成，肝素钠为固体形式，其经HPSEC-MALLS测定的分子量范围是3000～40000。
2.根据权利要求1所述的用于测定肝素及其盐相对分子量及分子量分布的对照品，其特征在于：所述对照品的平均分子量在15000～20000。
3.权利要求1或2所述的用于测定肝素及其盐相对分子量及分子量分布的对照品的制备方法，其特征在于：步骤如下：
（1）选择若干批注射级肝素钠原料药，利用HPSEC-MALLS分别测定其分子量及分子量分布，从中选择分子量在3000～40000的肝素样品作为对照品；
（2）分子量宽分布标样表的制作：根据上述HPSEC-MALLS获得的肝素分子量累计分布图，制作肝素对照品宽分布标样表。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，HPSEC-MALLS的色谱条件如表1所示：
表1
。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，肝素对照品宽分布标样表的具体制作方法为：根据步骤（1）选定的肝素对照品的分子量范围，从MALLS测定的最小分子量开始，到分子量累积百分比为99%的分子量为止，根据分子量分布累积百分比取5～20个点，分别读出其对应的分子量，建立起肝素分子量-累积面积百分比的对应表，即肝素对照品宽分布标样表。
6.权利要求1或2所述的用于测定肝素及其盐相对分子量及分子量分布的对照品在测定肝素供试品的相对分子量及分子量分布中的应用。
7.一种测定肝素供试品的相对分子量及分子量分布的方法，其特征在于：步骤如下：
（1）选择若干批注射级肝素钠原料药，利用HPSEC-MALLS分别测定其分子量及分子量分布，从中选择分子量在3000～40000、平均分子量在15000～20000的肝素样品作为对照品；
（2）分子量宽分布标样表的制作：根据上述HPSEC-MALLS获得的肝素分子量累计分布图，制作肝素对照品宽分布标样表，即肝素分子量与其色谱峰累积面积百分比的对应表；
（3）对肝素供试品进行HPSEC测定，并计算相对分子量及分子量分布，以进行质量控制：
①HPSEC分析：分别对上述对照品及肝素供试品进行HPSEC分析，得色谱图；
②分子量校正曲线的制备：根据步骤（2）制作的对照品的宽分布标样表，从HPSEC测定的肝素对照品的色谱图依次读出相应特征色谱峰累积峰面积百分比所对应的保留时间，并以这一系列保留时间对其在宽分布标样表中对应分子量的对数值进行3次曲线方程拟合，得到校正曲线；
③利用上述得到的校正曲线，将供试品的保留时间代入该校正曲线，对供试品的色谱图中的肝素色谱峰进行积分，即可获得供试品的相对分子量和分子量分布。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于：所述步骤（1）中，HPSEC-MALLS的色谱条件如表1所示：
表1
。
9.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于：所述步骤（2）中，肝素对照品宽分布标样表的具体制作方法为：根据步骤（1）选定的肝素对照品的分子量范围，从MALLS测定的最小分子量开始，到分子量累积百分比为99%的分子量为止，根据分子量分布累积百分比取5～20个点，分别读出其对应的分子量，建立起肝素分子量-累积面积百分比的对应表，即肝素对照品宽分布标样表。
10.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于：所述步骤（3）①中，HPSEC分析的色谱条件如表2所示：
表2
。
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