CN118169063A - 一种肝素生物测定中抗IIa因子效价的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肝素生物测定中抗Ⅱa因子效价的测定方法，属于生物分析领域。所述方法包括以下步骤：（1）准备试剂和标准品；（2）准备试验样品；（3）添加试剂与反应：（4）终止反应；（5）测定吸光度；（6）计算效价。本发明的方法将每次混匀操作后的处理方式由常规认知的平衡（静态）改为震荡并旋转式运行（动态），各组分在测定过程中反应完全，从而提高了测定结果的准确性及一致性，进而可有效控制本测定方法的可信限率。本发明方法可操作性强，重现性好，检测结果准确可靠，按生物检定统计法中的量反应平行4.4法计算，可信限率可实现≤4%，远远优于药典规定的测定方法的可信限率标准（可信限率＜10%）。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析领域，具体而言，涉及一种肝素生物测定中抗Ⅱa因子效价的测定方法。
背景技术
作为一种抗凝剂，肝素通过与抗凝血酶III(ATIII)结合来加速ATIII对凝血因子IIa的抑制而起到抗凝作用，其广泛用于防止和治疗血栓和栓塞性疾病。肝素抗IIa的活性值即抗IIa因子效价的准确测量对其临床使用至关重要。用于测定肝素抗IIa效价的常见方法有：酶联免疫吸附测定(ELISA)、凝血酶时间(TT)测定、色谱法、面板测试、生物分析法以及荧光或光度法等。总体来说，每种肝素抗IIa效价测定方法各自有其适用的场景和目标。其中，凝血酶时间(TT)测定法是最常用的肝素抗IIa效价测定方法之一。
凝血酶时间(TT)测定法的依据是凝血酶时间反映了凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白形成凝块的时间，而肝素可延长凝血酶时间，因此该测试可用于衡量肝素的抗IIa活性。现行2020版《中国药典》四部1208肝素生物测定法中抗Ⅱa因子效价的测定方法属于凝血酶时间(TT)测定法的一种。该方法对标准品溶液及样品的溶液制备做了以下描述：取不同浓度的标准品(S)系列溶液或供试液(T)系列溶液及缓冲液(B)(共18只)，按顺序依次分别精密加入20～100ul相同体积(V)的溶液；每管精密加入相同体积的抗凝血酶溶液，混匀，37℃平衡2分钟；再精密加入凝血酶溶液适量(2V)，混匀，37℃平衡2分钟；再精密加入发色底物溶液(2V)，混匀，37℃准确保温2分钟后，再精密加入50％的醋酸溶液(2V)，终止反应后，迅速冷却至室温，用适宜的设备在405mm波长测定各管的吸光度，按生物检定统计法中的量反应平行线原理4.4法实验设计，计算效价及实验误差。然而，该方法的可信限率较高，并不能很好的满足临床使用时对抗IIa因子效价测定的准确度和精密度要求。
可信限率表示测定结果与真实值之间的误差范围。某种测定方法的可信限率属于该测定方法的固有属性且直接反映该测定方法的可靠性。可信限率数值越小，测定结果与真实值之间的误差范围越小，精密度和稳定性越高，数值可信度也越高。中国药典现行版附录中的“肝素生物测定法”的可信限率高限值高达10％，这与实际应用中对肝素抗IIa因子效价的准确测量以正确把控临床应用的要求有一定差距。为了提高可信限率，众多研究者从不同角度进行了探索。中国专利CN 108508129 A公开了一种肝素类药物生物效价的测定方法，其通过构建体外抗凝血因子的效价体系，利用高效液相色谱-质谱联用分析系统对反应产物进行测定，测得的效价的可信限率小于3％，提高了测定的灵敏度和重现性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肝素生物测定中抗Ⅱa因子效价的测定方法，该方法可操作性强，重现性好，检测结果准确可靠，能够保证可信限率≤4％。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种肝素生物测定中抗Ⅱa因子效价的测定方法，包括以下步骤：
(1)准备试剂和标准品：
分别制备供试品溶液、缓冲溶液、抗凝血酶溶液、凝血酶溶液、发色底物溶液以及肝素标准溶液；
(2)准备试验样品：将肝素标准溶液、供试品溶液及缓冲溶液分别进行稀释；
(3)添加试剂与反应：
分别吸取稀释后的标准溶液、供试品溶液及缓冲溶液，使用“ChP20-转板”程序步骤整板移液至酶标板中；每管依次加入抗凝血酶溶液、凝血酶溶液和发色底物溶液，每管每次加入抗凝血酶溶液、凝血酶溶液或发色底物溶液后，选择移液工作站“ChP20”加液程序分别对标准溶液、供试品溶液和缓冲溶液进行吹吸式混匀操作30秒，混匀后将其转移至37℃恒温环境中，以600～950RPM/min的转速进行震荡并旋转式运行120±5秒；
(4)终止反应：
步骤(3)反应结束后，分别在标准溶液、供试品溶液及缓冲溶液中加入醋酸溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序分别对标准溶液、供试品溶液和缓冲溶液进行吹吸式混匀操作30秒，混匀后将各溶液转移至37℃恒温环境中，以600～950RPM/min的转速进行震荡并旋转式运行35～40秒，静置10min，迅速冷却至室温；
(5)测定吸光度；
(6)计算效价。
其中，步骤(1)、(2)、(5)与(6)可按现行2020版《中国药典》四部1208肝素生物测定法中抗Ⅱa因子效价的测定方法中的操作进行。
优选的，上述震荡并旋转式运行是在恒温旋涡混合器中完成。
优选的，所述准备试验样品的步骤为：使用“ChP20预铺板-1-9”程序步骤进行试剂板的预铺；分别精密量取肝素标准溶液、供试品溶液及缓冲溶液至96孔V底板中，选择使用“ChP20梯度稀释-2—9”程序步骤进行梯度稀释。
优选的，所述测定吸光度的步骤为：在APRICOT-DESIGNS移液工作站操作界面选择“肝素钠读数1—9列”方法，添加样品ID列表“肝素钠读数1—9列”，在检测波长405nm处，使用酶标仪测定每个孔的吸光度值。
优选的，所述步骤(6)是按生物检定统计法中的量反应平行线原理4.4法实验设计，计算效价及可信限率。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种肝素生物测定中抗Ⅱa因子效价的测定方法，本发明的方法将每次混匀操作后的处理方式由常规认知的平衡(静态)改为震荡并旋转式运行(动态)，各组分在测定过程中反应完全，从而提高了测定结果的准确性及一致性，进而可有效控制本测定方法的可信限率。本发明方法可操作性强，重现性好，检测结果准确可靠，按生物检定统计法中的量反应平行4.4法计算，可信限率可实现≤4％，远远优于药典规定的测定方法的可信限率标准(可信限率＜10％)。
附图说明
图1为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，转速950RPM，第一次可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。其中，S为标准溶液吸光度，T为供试品溶液吸光度；S1对应的供试品溶液浓度为0.012IU/ml，S2对应的供试品溶液浓度为0.01715IU/ml，S3对应的供试品溶液浓度为0.0245IU/ml，S4对应的供试品溶液浓度为0.035IU/ml，T1对应的供试品溶液浓度为0.012IU/ml，T2对应的供试品溶液浓度为0.01715IU/ml，T3对应的供试品溶液浓度为0.0245IU/ml，T4对应的供试品溶液浓度为0.035IU/ml，下同。
图2为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，转速950RPM，第二次可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图3为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，转速950RPM，第三次可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图4为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，转速950RPM，第四次可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图5为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，转速950RPM，第五次可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图6为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，转速950RPM，第六次可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图7为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，1#溶液放置0min时，稳定性试验测定结果，其中，图(a)为第一组稳定性测定结果，图(b)为第二组稳定性测定结果。
图8为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，2#溶液放置0min时，稳定性试验测定结果，其中，图(a)为第一组稳定性测定结果，图(b)为第二组稳定性测定结果。
图9为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，3#溶液放置0min时，稳定性试验测定结果，其中，图(a)为第一组稳定性测定结果，图(b)为第二组稳定性测定结果。
图10为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，1#溶液放置20min时，稳定性试验测定结果，其中，图(a)为第一组稳定性测定结果，图(b)为第二组稳定性测定结果。
图11为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，2#溶液放置20min时，稳定性试验测定结果，其中，图(a)为第一组稳定性测定结果，图(b)为第二组稳定性测定结果。
图12为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，3#溶液放置20min时，稳定性试验测定结果，其中，图(a)为第一组稳定性测定结果，图(b)为第二组稳定性测定结果。
图13为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，1#溶液放置40min时，稳定性试验测定结果，其中，图(a)为第一组稳定性测定结果，图(b)为第二组稳定性测定结果。
图14为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，2#溶液放置40min时，稳定性试验测定结果，其中，图(a)为第一组稳定性测定结果，图(b)为第二组稳定性测定结果。
图15为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，3#溶液放置40min时，稳定性试验测定结果，其中，图(a)为第一组稳定性测定结果，图(b)为第二组稳定性测定结果。
图16为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，1#溶液放置60min时，稳定性试验测定结果，其中，图(a)为第一组稳定性测定结果，图(b)为第二组稳定性测定结果。图20为
图17为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，2#溶液放置60min时，稳定性试验测定结果，其中，图(a)为第一组稳定性测定结果，图(b)为第二组稳定性测定结果。
图18为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，3#溶液放置60min时，稳定性试验测定结果，其中，图(a)为第一组稳定性测定结果，图(b)为第二组稳定性测定结果。
图19为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，1#溶液放置90min时，稳定性试验测定结果，其中，图(a)为第一组稳定性测定结果，图(b)为第二组稳定性测定结果。
图20为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，2#溶液放置90min时，稳定性试验测定结果，其中，图(a)为第一组稳定性测定结果，图(b)为第二组稳定性测定结果。
图21为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，3#溶液放置90min时，稳定性试验测定结果，其中，图(a)为第一组稳定性测定结果，图(b)为第二组稳定性测定结果。
图22为以肝素钠注射液为供试品溶液，第一次重复性试验测定结果，其中，图(a)为第一组重复性测定结果，图(b)为第二组重复性测定结果。
图23为以肝素钠注射液为供试品溶液，第二次重复性试验测定结果，其中，图(a)为第一组重复性测定结果，图(b)为第二组重复性测定结果。
图24为以肝素钠注射液为供试品溶液，第三次重复性试验测定结果，其中，图(a)为第一组重复性测定结果，图(b)为第二组重复性测定结果。
图25为以肝素钠注射液为供试品溶液，第四次重复性试验测定结果，其中，图(a)为第一组重复性测定结果，图(b)为第二组重复性测定结果。
图26为以肝素钠注射液为供试品溶液，第五次重复性试验测定结果，其中，图(a)为第一组重复性测定结果，图(b)为第二组重复性测定结果。
图27以肝素钠注射液为供试品溶液，第六次重复性试验测定结果，其中，图(a)为第一组重复性测定结果，图(b)为第二组重复性测定结果。
图28为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，转速600RPM时，可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图29以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，转速700RPM时，可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图30为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，转速800RPM时，可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图31为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，转速900RPM时，可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图32为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，转速950RPM时，可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图33为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，转速550RPM时，第一次可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图34为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，转速550RPM时，第二次可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图35为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，对比例1第一次可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图36为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，对比例1第二次可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图37为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，对比例2第一次可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图38为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，对比例2第二次可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图39为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，对比例3第一次可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
图40为以肝素钠标准品储备溶液为供试品溶液，对比例3第二次可靠性试验测定结果，其中，图(a)为第一组可靠性测定结果，图(b)为第二组可靠性测定结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施方式提供一种肝素生物测定中抗Ⅱa因子效价的测定方法，其包括以下步骤：
1、仪器
APRICOT-DESIGNS移液工作站，型号：SP2-096；OHAUS恒温混匀器，型号：ISTHBLHTS；TECAN酶标仪，型号：sunrise；赛多利斯电子天平，型号：CPA225D；METTLERTOLEDOPH计，型号：S220。
2、实验用具：酶标板(costar42592或其它满足使用的厂家、板型)、8道125ul单列锁头、96道125ul锁头、8道125ul单列吸头、96道125ul吸头、96孔V底板、12道微底槽、储液槽。
3、肝素钠标准品来源
中国食品药品检定研究院；批号：140817-201501；效价：2011IU/支。
4、实验试剂
(1)冰乙酸：成都市科隆化学品有限公司；(2)三羟甲基氨基甲烷：麦克林；(3)聚乙二醇6000：默克；(4)氯化钠：天津市永大化学试剂有限公司；(5)乙二胺四醋酸二钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；(6)盐酸：天津市永大化学试剂有限公司；(7)S-2238发色底物：上海喜恩医药科技有限公司；(8)抗凝血酶凝血酶：上海喜恩医药科技有限公司；(9)凝血酶：上海喜恩医药科技有限公司；(10)50％醋酸溶液：冰乙酸：纯化水＝50:50；
(11)三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液(以下简称缓冲溶液)：取三羟甲基氨基甲烷6.06g，氯化钠10.23g，乙二胺四醋酸二钠2.8g，聚乙二醇60001.0g，加水800ml使溶解，用10％盐酸溶液调节pH值至8.4，用水稀释至1000ml；
(12)抗凝血酶溶液：取抗凝血酶(ATⅢ)，加三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液(pH8.4)溶解并稀释制成每lml中含抗凝血酶0.25IU的溶液；
(13)凝血酶溶液：取凝血酶(FⅡa)加三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液(pH8.4)溶解并稀释制成每lml中约含5IU的溶液；
(14)发色底物溶液：取发色底物S-2238，加水制成0.003mol/L的溶液，临用前用水稀释至0.625mmol/L；
(15)肝素标准溶液制备：
取肝素标准品1支，加水稀释成201.1IU/ml的溶液，加缓冲溶液稀释制成每1ml中含0.035IU浓度的标准溶液，平行制备2份。
6、测定
(1)本试验剂距(r)为1：0.7，S(标准溶液)大剂量0.035IU/ml，T(供试品溶液)大剂量0.035IU/ml，T估计效价201.1IU/ml，试验条件为室温。使用“ChP20预铺板-1-9”程序步骤进行试剂板的预铺。分别取0.035IU/ml浓度的标准溶液、供试品溶液及缓冲溶液(空白)各310ul，至96孔V底板中选择使用“ChP20梯度稀释-2—9”程序步骤进行梯度稀释。梯度稀释后标准溶液和供试品溶液均具有以下四个浓度：0.012IU/ml、0.01715IU/ml、0.0245IU/ml、0.035IU/ml；
(2)分别精密吸取上述溶液及缓冲溶液各30ul(每个浓度2支共计18管)，使用移液工作站“ChP20-转板”程序步骤整板移液至酶标板中。每管精密加入30ul的抗凝血酶溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序分别对标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液进行吹吸式混匀操作，混匀后将以上溶液转移至37℃恒温环境中，以转速600～950RPM/min进行震荡并旋转式运行120±5秒(此操作可借助旋涡混合器完成，下同)；
(3)旋转运行后，分别在上述溶液中精密加入60ul凝血酶溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序分别对标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液进行吹吸式混匀操作30秒，混匀操作后将以上溶液转移至37℃恒温环境中，以转速600～950RPM/min进行震荡并旋转式运行120±5秒；
(4)旋转运行后，分别在各溶液中精密加入60ul发色底物溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序分别对标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液进行吹吸式混匀操作30秒，混匀后将各溶液转移至37℃恒温环境中，以转速为600～950RPM/min进行震荡并旋转式运行120±5秒；
(5)旋转运行后，分别在各溶液中精密加入60ul 50％的醋酸溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序分别对标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液进行吹吸式混匀操作30秒，操作后将各溶液转移至37℃恒温环境中，以转速600～950RPM/min进行震荡并旋转式运行35～40秒，静置10min，迅速冷却至室温；
(6)在APRICOT-DESIGNS移液工作站操作界面选择“肝素钠读数1—9列”方法，添加样品ID列表“肝素钠读数1—9列”，在检测波长405nm处测定；
(7)按生物检定统计法中的量反应平行线原理4.4法实验设计，计算效价及可信限率。
实施例2可靠性试验
仪器、实验用具与试剂溶液配制以及测定方法同实施例1，以肝素钠标准溶液为供试品溶液，转速950RPM，按实施例1方式连续测定6次，测定结果如图1-图6。可见其回归项非常显著(P＜0.01)；偏离平行、二次曲线、反向二次曲线各项均不显著(P＞0.05)，表明本发明方法具有可靠性。
对图1-6所示结果进行汇总，如表1所示，在试验所用的剂量范围内，对数剂量与吸光度呈直线关系，供试品和标准品的直线满足平行性要求，表明本方法适用于生物检定统计法中的量反应平行线原理4.4法实验设计及计算方法。6次测定结果的可信限率最大值4％，相对误差＜1％，RSD值＜1％，表明本方法准确性高。
表1
实施例3稳定性试验
仪器、实验用具与试剂溶液配制同实施例1，取肝素钠标准溶液3份(1#、2#、3#)，分别放置0min、20min、40min、60min、90min后，在检测波长405nm处每份连续测定2次，按生物检定统计法中的量反应平行线原理4.4法实验设计，计算效价及可信限率，检测数据如图7-图21所示，将结果汇总，如表2所示。
表2
可见本发明方法中，溶液分别放置20min、40min、60min、90min后，按生物检定统计法中的量反应平行线原理4.4法进行计算，所得各阶段检验数据无变化，可信限率最大值4％，RSD值＜1％，溶液稳定，表明本方法操作后各组分已充分反应彻底。
实施例4重复性试验
选择2ml：12500单位肝素注射液作为供试品进行制备，标准溶液、供试品溶液均平行制备6份。用pH8.4缓冲溶液稀释制成每1ml中含0.035IU的样品溶液，每个浓度平行制备2份。
按照实施例1的方法进行测定，在检测波长405nm处，对同1份标准溶液、样品溶液连续测定6次，按生物检定统计法中的量反应平行线原理4.4法实验设计，计算效价及可信限率，检测结果如图22-27所示。将检测结果进行汇总，如表3所示。
表3
以上试验数据表明：平行测试6份样品，按生物检定统计法中的量反应平行线原理4.4法计算，可信限率最高值4％，RSD＜1.0％，表明本方法重复性好。
实施例5
仪器、实验用具、试剂溶液配制以及测定方法同实施例1，调整震荡并旋转式运行时的转速为600RPM/min时，在检测波长405nm处测定，按生物检定统计法中的量反应平行线原理4.4法，计算效价及可信限率，结果如图28；调整震荡并旋转式运行时的转速为700RPM/min时，测定结果如图29；调整震荡并旋转式运行时的转速为800RPM/min时，测定结果如图30；调整震荡并旋转式运行时的转速为900RPM/min时，结果如图31；调整震荡并旋转式运行时的转速为950RPM/min时，测定结果如图32。调整震荡并旋转式运行时的转速为550RPM/min时，测定结果如图33-34。
以上实验数据结果表明：当震荡并旋转式运行时的转速为550RPM/min时，平行样的可信限率存在较大差异。震荡并旋转式运行时的转速为600～950RPM/min时为最佳试验条件，按生物检定统计法中的量反应平行线原理4.4法实验设计，在试验所用的剂量范围内，对数剂量与吸光度呈直线关系，供试品和标准品的直线满足平行性要求。回归项非常显著，偏离平行、二次曲线、反向二次曲线各项不显著，且可信限率≤4％。
对比例1
仪器、实验用具与试剂溶液配制同实施例1，以肝素钠标准溶液为供试品溶液。测定方法如下：
(1)本试验剂距(r)为1：0.7，S(标准溶液)大剂量0.035IU/ml，T(供试品溶液)大剂量0.035IU/ml，T估计效价201.1IU/ml，试验条件为室温。使用“ChP20预铺板-1-9”程序步骤进行试剂板的预铺。分别取0.035IU/ml浓度的标准溶液、供试品溶液及缓冲溶液(空白)各310ul，至96孔V底板中选择使用“ChP20梯度稀释-2—9”程序步骤进行梯度稀释。梯度稀释后，标准溶液和供试品溶液均具有以下四个浓度：0.012IU/ml、0.01715IU/ml、0.0245IU/ml和0.035IU/ml；
(2)分别精密吸取上述标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液各30ul(每个浓度2支共计18管)，使用“ChP20-转板”程序步骤整板移液至酶标板中。每管精密加入30ul的抗凝血酶溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序分别对标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液进行吹吸式混匀操作30秒，静置30秒，重复上述混匀操作30秒，混匀操作后将以上溶液转移至37℃恒温水浴锅中，静置120±5秒；
(3)静置后分别在标准溶液、供试品溶液、pH8.4缓冲溶液精密加入60ul凝血酶溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序分别对标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液进行吹吸式混匀操作30秒，静置30秒，重复上述混匀操作30秒，混匀操作后将以上溶液转移至37℃恒温水浴锅中静置120±5秒；
(4)静置后分别在标准溶液、供试品溶液、pH8.4缓冲溶液精密加入60ul发色底物溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序分别对标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液进行吹吸式混匀操作30秒，静置30秒，重复上述混匀操作30秒，混匀操作后将以上溶液转移至37℃恒温水浴锅中静置120±5秒；
(5)静置后在标准溶液、供试品溶液、pH8.4缓冲溶液中精密加入60ul 50％的醋酸溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序分别对标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液进行吹吸式混匀操作30秒，静置30秒，重复上述混匀操作30秒，静置30秒，重复上述混匀操作30秒，静置10分钟，迅速冷却至室温；
(6)在APRICOT-DESIGNS移液工作站操作界面选择“肝素钠读数1—9列”方法，添加样品ID列表“肝素钠读数1—9列”，在检测波长405nm处测定；1份样本连续测定2次；
(7)按生物检定统计法中的量反应平行线原理4.4法实验设计，计算效价及可信限率，结果如图35-36。
以上试验数据结果表明：当将每次混匀操作后的处理方式选择静置操作时，在试验所用的剂量范围内，虽可信限率能够＜10％，但检验数据精确度很低。
对比例2
仪器、实验用具与试剂溶液配制同实施例1，以肝素钠标准溶液为供试品溶液。测定方法如下：
(1)本试验剂距(r)为1：0.7，S(标准溶液)大剂量0.035IU/ml，T(供试品溶液)大剂量0.035IU/ml，T估计效价201.1IU/ml，试验条件为室温。使用“ChP20预铺板-1-9”程序步骤进行试剂板的预铺。分别取0.035IU/ml浓度的标准溶液、供试品溶液及缓冲溶液(空白)各310ul，至96孔V底板中选择使用“ChP20梯度稀释-2—9”程序步骤进行梯度稀释。梯度稀释后，标准溶液和供试品溶液均具有以下四个浓度：0.012IU/ml、0.01715IU/ml、0.0245IU/ml和0.035IU/ml；
(2)每管分别精密加入30ul的抗凝血酶溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序对标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液进行吹吸式混匀操作60秒，混匀操作后将以上溶液转移至酶标仪，37℃保温状态下左右晃动120±5秒；
(3)左右晃动120±5秒后，分别在标准溶液、供试品溶液、pH8.4缓冲溶液精密加入60ul凝血酶溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序对标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液进行吹吸式混匀操作60秒，混匀操作后将以上溶液转移至酶标仪，37℃保温状态下左右晃动120±5秒；
(4)左右晃动120±5秒后，分别在标准溶液、供试品溶液、PH8.4缓冲溶液精密加入60ul发色底物溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序对标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液进行吹吸式混匀操作60秒，混匀操作后将以上溶液转移至酶标仪，37℃保温状态下，左右晃动120±5秒；
(5)左右晃动120±5秒后，分别在标准溶液、供试品溶液、PH8.4缓冲溶液中精密加入60ul 50％的醋酸溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序对标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液进行吹吸式混匀操作60秒，左右晃动40±5秒，静置10分钟，迅速冷却至室温；
(6)在APRICOT-DESIGNS移液工作站操作界面选择“肝素钠读数1—9列”方法，添加样品ID列表“肝素钠读数1—9列”，在检测波长405nm处测定；2份样本连续测定2次；
(7)按生物检定统计法中的量反应平行线原理4.4法实验设计，计算效价及可信限率，结果如图37-38。
以上实验数据结果表明，当将每次混匀操作后的处理方式选择左右方向运动时，按生物检定统计法中的量反应平行线原理4.4法实验设计，计算可信限率＞10％。
对比例3
仪器、实验用具与试剂溶液配制同实施例1，以肝素钠标准溶液为供试品溶液。测定方法如下：
(1)本试验剂距(r)为1：0.7，S(标准溶液)大剂量0.035IU/ml，T(供试品溶液)大剂量0.035IU/ml，T估计效价201.1IU/ml，试验条件为室温。使用“ChP20预铺板-1-9”程序步骤进行试剂板的预铺。分别取0.035IU/ml浓度的标准溶液、供试品溶液及缓冲溶液(空白)各310ul，至96孔V底板中选择使用“ChP20梯度稀释-2—9”程序步骤进行梯度稀释。梯度稀释后，标准溶液和供试品溶液均具有以下四个浓度：0.012IU/ml、0.01715IU/ml、0.0245IU/ml和0.035IU/ml；
(2)梯度稀释后分别吸取浓度为0.01200IU、0.01715IU、0.02450IU、0.035IU的标准溶液(S)、供试品溶液(T)每个浓度各2支，pH8.4缓冲溶液(B)2支各30ul(共计18管)，使用“ChP20-转板”程序步骤整板移液至酶标板中；每管精密加入30ul的抗凝血酶溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序对标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液进行吹吸式混匀操作60秒，混匀操作后将以上溶液转移至酶标仪，37℃保温状态下进行吹吸式混匀120±5秒；
(3)步骤(2)反应结束之后，分别在标准溶液、供试品溶液、pH8.4缓冲溶液精密加入60ul凝血酶溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序对标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液进行吹吸式混匀操作60秒，混匀操作后将以上溶液转移至酶标仪，37℃保温状态下进行吹吸式混匀120±5秒；
(4)步骤(3)反应结束之后，分别在标准溶液、供试品溶液、pH8.4缓冲溶液精密加入60ul发色底物溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序对标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液进行吹吸式混匀操作60秒，混匀操作后将以上溶液转移至酶标仪，37℃保温状态下，进行吹吸式混匀120±5秒；
(5)步骤(4)反应结束之后，分别在标准溶液、供试品溶液、pH8.4缓冲溶液中精密加入60ul 50％的醋酸溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序对标准溶液、供试品溶液、缓冲溶液进行吹吸式混匀操作60秒，混匀操作后将以上溶液转移至酶标仪，37℃保温状态下进行吹吸式混匀40±5秒，静置10分钟，迅速冷却至室温；
(6)在APRICOT-DESIGNS移液工作站操作界面选择“肝素钠读数1—9列”方法，添加样品ID列表“肝素钠读数1—9列”，在检测波长405nm处检测；
(7)按生物检定统计法中的量反应平行线原理4.4法实验设计，计算效价及实验误差。测定结果如图39-40。
以上实验数据结果表明：当将每次混匀操作后的处理方式仍按吹吸式方式进一步加强混匀时，按生物检定统计法中的量反应平行线原理4.4法实验设计，计算可信限率＞10％。
Claims (5)
1.一种肝素生物测定中抗Ⅱa因子效价的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）准备试剂和标准品：
分别制备供试品溶液、缓冲溶液、抗凝血酶溶液、凝血酶溶液、发色底物溶液以及肝素标准溶液；
（2）准备试验样品：将肝素标准溶液、供试品溶液及缓冲溶液分别进行稀释；
（3）添加试剂与反应：
分别吸取稀释后的肝素标准溶液、供试品溶液及缓冲溶液，使用移液工作站“ChP20-转板”程序步骤整板移液至酶标板中；每管依次加入抗凝血酶溶液、凝血酶溶液和发色底物溶液，每管每次加入抗凝血酶溶液、凝血酶溶液或发色底物溶液后，选择移液工作站“ChP20”加液程序分别对标准溶液、供试品溶液和缓冲溶液进行吹吸式混匀操作30秒，混匀后将其转移至37℃恒温环境中，以600~950RPM/min的转速进行震荡并旋转式运行120±5秒；
（4）终止反应：
步骤（3）反应结束后，分别在标准溶液、供试品溶液及缓冲溶液中加入醋酸溶液，选择移液工作站“ChP20”加液程序分别对标准溶液、供试品溶液和缓冲溶液进行吹吸式混匀操作30秒，混匀后将各溶液转移至37℃恒温环境中，以600~950RPM/min的转速进行震荡并旋转式运行35~40秒，静置10min，冷却至室温；
（5）测定吸光度；
（6）计算效价。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述震荡并旋转式运行是在恒温旋涡混合器中完成。
3.根据权利要求1所述的测定方法，所述准备试验样品的步骤为：使用“ChP20预铺板-1-9”程序步骤进行试剂板的预铺；分别量取肝素标准溶液、供试品溶液及缓冲溶液至96孔V底板中，选择使用“ChP20梯度稀释-2—9”程序步骤进行梯度稀释。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述测定吸光度的步骤为：在APRICOT-DESIGNS移液工作站操作界面选择“肝素钠读数1—9列”方法，添加样品ID列表“肝素钠读数1—9列”，在检测波长405nm处，使用酶标仪测定每个孔的吸光度值。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤（6）是按生物检定统计法中的量反应平行线原理4.4法实验设计，计算效价及可信限率。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication |