CN107091814A - 一种液体即用型血液肝素浓度的检测试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液体即用型血液肝素浓度的检测试剂，包括试剂1和试剂2，试剂1包括FXa、缓冲液和稳定剂1，所述稳定剂1包括牛血清白蛋白、聚乙二醇6000、甘露醇和丙氨酸；所述试剂2包括Xa因子的发色底物、缓冲液和稳定剂2，所述稳定剂2包括牛血清白蛋白、蔗糖和赖氨酸。本发明的液体即用型血液肝素浓度的检测试剂，开瓶即用，无需复溶，具有良好的稳定性，可用来测定普通肝素和低分子量肝素的浓度。

Description

一种液体即用型血液肝素浓度的检测试剂

技术领域

本发明属于生物学检测技术领域，具体涉及一种液体即用型血液肝素浓度的检测试剂及相应的试剂盒。

背景技术

肝素是硫酸化的葡萄糖胺多糖混合物，由D-葡萄糖胺和艾杜糖醛酸残基交替构成的链状分子。肝素的组成具有很大的异质性，包括长链肝素和低分子量肝素。长链肝素分子量在50000-30000Da之间(平均接近15000Da)的不同分子组成；低分子量肝素分子量在4000-6500Da之间。肝素可从牛和猪的肺脏及肠组织提取出来的，肝素是使用最广泛，作用迅速的非口服抗凝治疗剂。在使用肝素进行抗凝治疗时，要严格控制肝素的用量，避免出现用量过少达不到抗凝效果，用量过多又会引起自发性出血的状况。因此在治疗过程中要对血液中肝素浓度进行准确监测。临床上常用的肝素浓度监测方法是活化部分凝血活酶时间(APTT)法，根据APTT时间的长短来进行调整肝素的用量，从而找到最佳剂量范围。APTT操作简单、快速。但是通过活化部分凝血活酶时间(APTT)监测肝素的含量准确度低，特异性差。抗干扰能力小。因为引起凝血时间变长的因素很多，比如凝血因子的缺失，凝血因子抑制物的存在都能引起APTT时间变长。患者需要多次检测来调整肝素剂量。由于低分子量肝素对APTT时间影响不大，因此在临床实践中APTT法不能用来对低分子量肝素含量的测定。肝素可以和细胞及其它血浆蛋白质结合，准确测定其浓度非常困难，并且肝素治疗的可导致许多副作用，最常见的是非出血性副作用，例如肝素诱导的血小板减少症(HIT)和骨质疏松症。和普通肝素相比低分子量肝素对细胞和蛋白质的结合较少。因此其药代动力学和药效学性质可更好的预测，具有比肝素更长的半衰期，并且具有较低的非出血性副作用的风险。低分子量肝素已经替代普通肝素用于许多临床适应症。低分子量肝素的制备主要通过化学方法或酶处理肝素，缩短其多糖链的长度，并且控制其平均分子量在4000-5000Da。低分子量肝素能够和抗凝血酶III结合形成复合物，低分子量肝素和抗凝血酶III复合物可以抑制Fxa的活性。其对Fxa的抑制活性和普通肝素相似，但由于低分子量肝素较短，低分子量肝素和抗凝血酶III复合物对凝血酶的抑制活性很低。然而在低分子量肝素临床应用过程中，由于病人的体质，性别，年龄，体重，用药等的不同，也会出现药量不足或过量的情况。因此，为了避免引起出血或疗效不足的情况发生，血液低分子量肝素浓度的监测必不可少。现有的对低分子量肝素含量的测定主要是底物发色法，和凝固法相比，底物发色法具有准确，快速，灵敏度高，特异性高，重复性好等特点。底物发色法测定肝素浓度是基于在过量的Fxa存在的条件下，血液中肝素和抗凝血酶III的复合物可以抑制Fxa的活性，将发色底物加入后，剩余的Fxa可将发色底物分解产生pNA，pNA在405nm有最大吸收峰，通过测定光吸收强度可推算出肝素的含量中国专利CN 103323416A公开了一种利用底物发色法测定肝素含量方法，取用肝素治疗的病人的血浆作为样品，将过量的FXa溶液与所述样品混合1min～15min，然后加入一定量的发色底物，混合均匀，作用一定时间后，用所述专用仪器测定上述样品并于所述一定波长处读取吸光度，根据标准曲线计算所述样品中肝素浓度。中国专利CN1104048931A公开了一种FXa活性检测试剂，包括试剂1和试剂2，其中试剂1为活化因子X(FXa)的发色底物，试剂2为活化因子X(FXa)。由于Fxa是蛋白质，在溶液中很容易失去活性，难以长期保存。因此，市场上现有的试剂盒一般采用冻干粉剂。冻干粉制剂虽然具有稳定性好，保质期长，便于运输等优点，但冻干粉试剂需要冷冻干燥工序，生产起来比较复杂，而且在使用时需要复溶。冰冻干燥首先将试剂分装到各小瓶的试剂瓶里，然后再将装有试剂的瓶子放到冰冻干燥机进行冰冻干燥。由于在分装时会产生差异，且冰冻干燥过程中，各瓶冰冻干燥效果的差异，以及复溶过程中，加复溶剂量的不同引起的浓度差异，所有这些差异使得冻干粉制剂瓶间差，批间差变化很大。

发明内容

本发明针对现有技术不足，提供了一种液体即用型血液肝素浓度的检测试剂，包括试剂1含FXa，试剂2含发色底物，试剂1和试剂2均为液体，开瓶即用，无需复溶，具有良好的稳定性，可用来测定普通肝素和低分子量肝素的浓度。

本发明所述液体即用型血液肝素浓度的检测试剂检测原理如图1所示：病人在使用肝素进行抗血栓治疗后，抽取血样进行检测。血浆中含有肝素，肝素和血液中抗凝血酶III结合形成复合物，在加入试剂1后，与试剂1中的FXa和肝素-抗凝血酶III复合物形成肝素-抗凝血酶III-FXa三元复合物。Fxa的酶活性被抑制，过量的FXa水解试剂2中的发色底物，并产生黄色生成物(pNA)。pNA在405nm有最高吸收峰，OD405的吸光度与FXa因子的活性成正比，与肝素的浓度成反比。根据标准曲线，可得出病人血样中肝素的浓度。

本发明具体技术方案如下：

一种液体即用型血液肝素浓度的检测试剂，包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括牛FXa、缓冲液和稳定剂1，所述稳定剂1包括牛血清白蛋白、聚乙二醇6000、甘露醇和丙氨酸；所述试剂2包括FXa的发色底物、缓冲液和稳定剂2，所述稳定剂2包括牛血清白蛋白、蔗糖和赖氨酸。

优选的，所述稳定剂1为质量体积百分比为0.5％-2％的牛血清白蛋白，0.05-0.3％聚乙二醇6000、1-10％甘露醇和1-10％丙氨酸。更优选1％的牛血清白蛋白，1％聚乙二醇6000、5％甘露醇和5％丙氨酸。所述稳定剂2质量体积百分比为0.5％-2％牛血清白蛋白、1-10％蔗糖和1-10％赖氨酸。更优选为1％牛血清白蛋白、5％蔗糖和1％赖氨酸。

本发明所述缓冲液优选pH为6.5-9.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，三羟甲基氨基甲烷-咪唑缓冲液或者咪唑-盐酸缓冲液。优选缓冲液的选工作浓度为0.01-0.3mol/L。

本发明所述FXa的发色底物选自Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA、Suc-Ile-Glu(gamma-pip)-Gly-Arg-pNA·HCl、N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl、Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl中的一种或几种。优选N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl。优选工作浓度为0.6mmol/L-2.5mmol/L。

为了保证试剂1缓冲溶液中的离子强度，可以选择添加无机盐如氯化钙、氯化钾或氯化钠中的一种或几种，优选工作浓度为0.01-0.25mol/L。

本发明所述FXa选自人、牛、猪FXa中的任意一种，优选牛FXa。优选工作浓度为0.1-5U/mL。

本发明所述试剂1和试剂2还可以含有防腐剂，如叠氮钠或者Proclin300，优选工作浓度为0.02-0.5％。

本发明所述液体即用型血液肝素浓度的检测试剂可作为检测试剂用于制备检测肝素含量的检测试剂。

本发明所述液体即用型血液肝素浓度的检测试剂可制备相应的检测试剂盒，包括盒体和装有上述试剂的试剂瓶，试剂瓶放置于所述盒体内。试剂盒包含试剂1和试剂2。该试剂盒检测待测样品中肝素含量时，将待测样品与试剂1混合并孵育后，再加入试剂2混合并孵育后，然后读取待测样品中发色底物的信号强度；最后通过计算信号强度并和已知浓度标准品的标准曲线比对得到血液中肝素含量。

本发明所述液体即用型血液肝素浓度的检测试剂在使用时，先根据不同肝素浓度的标准品及其相应的信号强度绘制标准曲线；将待测样品的血浆与试剂1混合并孵育后，再加入试剂2混合并孵育，之后检测待测样品中发色底物的信号强度，通过计算待测样品中信号强度并和标准曲线比对获得待测样品中肝素含量。

本发明优点

本发明所述的液体即用型血液肝素浓度的检测试剂，试剂1和试剂2均为液体，开瓶即用，无需复溶，使用方便，具有良好的稳定性，便于存储和运输。

本发明所述的液体即用型血液肝素浓度的检测试剂相较于冻干粉剂制备过程简便，成本相对较低，且不存在干粉制剂瓶间差，批间差的问题。具有很高的临床应用价值。

附图说明

图1为本发明检测原理图。

图2为本发明实施例3的标准曲线。

图3为本发明实施例4的线性回归曲线。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

实施例1试剂1制备

(1)使用pH 8.0的20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，配制不同组分的稳定剂1，各组分在溶液中的质量体积百分比如照表1所示，向稳定剂1中加入防腐剂叠氮钠，叠氮钠终浓度为0.05％(质量体积百分比)。

表1不同组分的稳定剂1

BSA

PEG6000

PEG8000

蔗糖

氯化镁

甘露醇

丙氨酸

海藻糖

稳定剂1a

2％

2％

10％

1％

10％

10％

10％

稳定剂1b

2％

2％

1％

10％

10％

稳定剂1c

2％

2％

10％

10％

稳定剂1d

2％

2％

10％

10％

稳定剂1e

2％

2％

10％

10％

稳定剂1f

2％

2％

1％

10％

10％

稳定剂1g

2％

2％

10％

10％

稳定剂1h

2％

2％

10％

10％

(2)试剂1的制备

配制浓度为20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，加入氯化钠(终浓度为0.1mol/L)，用稀盐酸调整pH值为8.0，加入FXa(购自SIGMA公司)，缓慢混匀，使FXa最终浓度为0.8U/ml，加入等体积步骤(1)配制的稳定剂1，混匀。

(3)试剂1稳定性测定

将步骤(2)配制的试剂1分别放置于4℃和37℃孵育7天后检测活性。取100μl的试剂1，加入25μl的1.25mg/ml的发色底物Suc-Ile-Glu(gamma-pip)-Gly-Arg-pNA·HCl，反应2分钟后，测定405nmOD值，测定结果如表2所示。

表2稳定剂筛选结果

结果显示，稳定剂1a-1b和1d-1h在4℃和37℃放置7天，均不同程度上失去稳定作用。稳定剂1c在4℃和37℃放置7天具有较好的稳定性，更能保护试剂1的活性。

实施例2试剂2的制备

(1)使用pH 8.0的20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，配制不同组分的稳定剂2，，各组分在溶液中的质量体积百分比如照表3所示，向稳定剂2中加入防腐剂叠氮钠，叠氮钠终浓度为0.05％(质量体积百分比)。

表3不同组分的稳定剂2

稳定剂

BSA

甘氨酸

赖氨酸

蔗糖

氯化镁

甘露醇

丙氨酸

海藻糖

稳定剂2a

1％

5％

5％

5％

1％

5％

5％

5％

稳定剂2b

1％

5％

5％

1％

5％

5％

5％

稳定剂2c

5％

5％

1％

5％

5％

5％

稳定剂2d

5％

1％

5％

5％

5％

稳定剂2e

5％

5％

5％

稳定剂2f

5％

稳定剂2g

1％

1％

5％

稳定剂2h

1％

1％

1％

5％

稳定剂2i

1％

1％

1％

5％

稳定剂2j

1％

1％

5％

(2)试剂2的配制

称取适量的Suc-Ile-Glu(gamma-pip)-Gly-Arg-pNA·HCl发色底物溶于步骤1配制好的稳定剂2溶液中，使终浓度为1.25mg/ml.

(3)试剂2稳定性的测定

将步骤(2)配制的试剂2分别放置于4℃和37℃孵育7天后检测活性。取100μl按实施例1新鲜配制好的试剂1，加入25μl的试剂2，反应2分钟后，测定405nmOD值，测定结果如表4所示。

表4试剂2稳定剂筛选结果

结果显示，稳定剂2a-2f和2h-2j在4℃和37℃放置7天，均不同程度上失去稳定作用。稳定剂2g在4℃和37℃放置7天具有较好的稳定性，更能保护试剂2的活性。

实施例3标准曲线制作

选择稳定剂1c，按照实施例1配制试剂1，选择稳定剂2g，按照实施例2配制试剂2。将已知浓度的含低分子量肝素(LMWH)或长链肝素的人血浆标准品稀释成浓度分别为：0.1IU/ml，0.5IU/ml，1IU/ml，1.5IU/ml和2IU/ml的标准液，在血凝仪设置测定程序，样本为5μl，试剂1为100μl，孵育2分钟，然后加入试剂2为75μl，混合后2分钟，在405nm波长测量吸光度。根据肝素标准液梯度浓度与所对应的吸光度变化速率，采取对数线性方程做出标准曲线，如图2所示。

实施例4线形范围检测

分别配制浓度为0IU/ml，0.8IU/ml，1.6IU/ml，2.2IU/ml的样本，重复检测三次，取平均值，如表5所示，做线性回归曲线，如图3所示。

表5

实施例5稳定性检测

将实施例3配制好的试剂1和试剂2分别放置4℃和37℃孵育每隔7天取样，作标准曲线，测定0.8IU/ml质控品，结果如表6所示。

表6稳定性检测结果

天	4℃	37℃
			0	0.81	0.81
7	0.79	0.78
			14	0.80	0.81
21	0.81	0.84
			28	0.83	0.92
35	0.82	1.20

结果表明本发明所述的液体即用型血液肝素浓度的检测试剂具有良好的稳定性。

Claims (10)

1.一种液体即用型血液肝素浓度的检测试剂，其特征在于包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括FXa、缓冲液和稳定剂1，所述稳定剂1包括牛血清白蛋白、聚乙二醇6000、甘露醇和丙氨酸；所述试剂2包括FXa的发色底物、缓冲液和稳定剂2，所述稳定剂2包括牛血清白蛋白、蔗糖和赖氨酸。

2.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述稳定剂是质量体积百分比为0.5%-2%的牛血清白蛋白，0.05-0.3%聚乙二醇6000、1%-10%甘露醇和1%-10%丙氨酸。

3.如权利要求2所述的检测试剂，其特征在于稳定剂1是质量体积百分比为1%的牛血清白蛋白，1%聚乙二醇6000、5%甘露醇和5%丙氨酸。

4.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述稳定剂2是质量体积百分比为0.5%-2%牛血清白蛋白、1%-10%蔗糖和1%-10%赖氨酸。

5.如权利要求4所述的检测试剂，其特征在于所述稳定剂2是质量体积百分比为1%牛血清白蛋白、5%蔗糖和1%赖氨酸。

6.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述缓冲液选自pH为6.5-9.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，三羟甲基氨基甲烷-咪唑缓冲液或者咪唑-盐酸缓冲液。

7.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述FXa的发色底物选自Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA、Suc-Ile-Glu(gamma-pip)-Gly-Arg-pNA·HCl、N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl、Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl中的一种或几种。

8.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述缓冲液中还含有无机盐。

9.如权利要求8所述的检测试剂，其特征在于所述所述无机盐为氯化钙、氯化钾或者氯化钠中的一种或几种。

10.如权利要求1-9任一项所述的检测试剂，其特征在于所述试剂1和试剂2还含有防腐剂。