CN1729399A - 因子ⅻa变体的检测与测定 - Google Patents
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Abstract
因子XIIa(活化因子XII)在血液中以多种形式存在。对其不同形式的测量结果可以为某些疾病或紊乱的感病性、过程或结果的诊断、监测或预测提供相关信息,或对患有或怀疑患有那些疾病或紊乱的人的治疗提供信息。
Description
技术领域
本发明涉及因子XIIa,所述因子XIIa是“接触激活系统”的一个组分。
背景技术
因子XIIa是存在于正常血液中的一种无活性的酶原。在体外,当存在激肽释放酶、高分子量激肽原和负电性表面时,它可以很容易地被转化成具有酶活性的形式,因子XIIa。以前报道了两种形式的体外活性因子XIIa。其中80Kd的是一种丝氨酸蛋白酶,通常称为因子αXIIa,由52Kd的重链和28Kd的轻链经二硫键连接组成。该因子经蛋白酶解从重链释放出一个肽,得到产物,即因子βXIIa,它保留了丝氨酸蛋白酶活性,是由因子αXIIa的28Kd链和源于其52Kd重链的一个小肽片段经二硫键连接而成。在许多情况下,该小肽的分子量约为1000d,但体外也观察到其不同大小的片段。
专利WO90/08835公开了一种因子XIIa的免疫测定方法,还公开了与因子XIIa结合的单克隆抗体2/215和201/9及其生产方法。产生单克隆抗体细胞株(mAb)2/215的杂交瘤2/215于1990年1月16日以存放号90011606存放于欧洲细胞培养物收藏中心(ECACC)(欧洲细胞培养物收藏中心,生物制品部,PHLS Centre for Applied Microbiology and Research,PortonDown,Salisbury SP4 OJG,England),产生单克隆抗体201/9的杂交瘤细胞株201/9于1990年1月18日以存放号90011893存放于ECACC。
很早就知道因子XIIa参与了体内血液凝结的接触系统。近期更多的工作表明XIIa也参与了其他的系统,如纤维蛋白溶解作用、激肽原生成、补体激活和血管发生。许多临床和实验数据表明接触系统的作用已超越了血液凝结,它在维持血管完整和血压上有作用,对内皮细胞的多种功能有影响,参与了纤维蛋白溶解的控制和血管内组成性抗凝因子的维持。深入的临床和实验研究表明接触系统参与了急性和慢性炎症、病原应激、糖尿病、变态反应、包括弥漫性血管内凝血在内的的凝血-出血紊乱和癌症疾病。还有脓毒病、自发性流产和血栓栓塞。另外,因子XIIa也可能参与了组织防御和修复。Yarovaya等最近的文章(Yarovaya,G.A.,Blokhina,T.B.,& Neshkova,E.A.Contact system.New concepts on activationmechanisms and bioregulatory functions.Biochemistry(Mosc).2002 Jan;67(1):13-24)综述了接触系统和有关激活机制及生物调控功能的新概念。
发明内容
本发明提供了一种从一个样品中检测或测定一种或几种形式的因子XIIa的方法,包括一个可以将所研究的因子XIIa形式优先于其他形式被检测或测定的过程。
在一个实施例中,本发明的一个方法能通过一个实验将所研究的一种或几种形式因子XIIa优先于其他形式的因子XIIa被检测或测定。
在另一个实施例中,本发明的一个方法能将所研究的一种或几种形式的因子XIIa从其他形式的因子XIIa分离出来,并检测或测定所分离的一种或几种因子XIIa。
检测或测定所分离的一种或几种因子XIIa可以用一种能将所研究的因子XIIa形式优先于其他形式被检测或测定的方法。
在另一个实施例中,本发明的一个方法包括将样品用一个能与所研究的因子XIIa或者可选择地,也能与其他形式的因子XIIa结合的标记抗体结合,使所研究的因子XIIa从其他形式的因子XIIa中分离,并检测或测定所研究的因子XIIa。
本发明也提供一种方法,对某些疾病或紊乱的感病性、过程或结果的诊断、检测或预测提供相关信息,或对患有或怀疑患有那些疾病或紊乱的人的治疗提供信息。这包括从病人样品中将一些因子XIIa形式优先于其他形式被检测或测定,并将该病人样本的测试结果与用相同方法测试如下至少一种到数种对象的样本的结果进行比较:
(i)患有这种疾病或紊乱的研究对象;
(ii)患有这种疾病或紊乱的研究对象,对其这种疾病或紊乱的过程或结果进行了监测;
(iii)患有这种疾病或紊乱并在接受治疗的研究对象;
(iv)患有这种疾病或紊乱并在接受治疗的研究对象,该研究对象针对对这种疾病或紊乱的治疗过程或结果被监测;
(v)未患这种疾病或紊乱的研究对象;
(vi)同一研究对象在这种疾病或紊乱发作之前或在对这种疾病或紊乱治疗开始之前,以及
(vii)同一研究对象在这种疾病或紊乱早期或晚期,或在对这种疾病或紊乱治疗的早期或晚期,或在这种疾病或紊乱开始之前。
本发明还提供一种方法包括对来源于患有疾病或紊乱或在接受治疗的对象的样品的因子XIIa进行一系列的测试,并选择一个测试方法提供与疾病或紊乱或其治疗相关的因子XIIa的水平的信息。
本发明也提供一种方法测试因子XIIa,适宜于对某些疾病或紊乱的易感性、进展或结果的诊断、检测或预测提供相关信息,或对患有或怀疑患有那些疾病或紊乱的人的治疗提供相关信息。这包括对来源于患有疾病或紊乱或在接受治疗的对象的样品的因子XIIa进行一系列的测试,并决定选择哪一个(几个)测试结果来为某些疾病或紊乱的易感性、进展或结果的诊断、检测或预测提供相关信息,或对那些疾病或紊乱的治疗提供相关信息。
这种方法最好包括对从来源于患有疾病或紊乱或在接受治疗的对象的样品的因子XIIa测试结果与同样方法测定的至少任何一种或几种源于如下对象的样品的因子XIIa测试结果进行比较:
(i)患有这种疾病或紊乱的研究对象;
(ii)患有这种疾病或紊乱的研究对象,对其这种疾病或紊乱的过程或结果进行了监测;
(iii)患有这种疾病或紊乱并在接受治疗的研究对象;
(iv)患有这种疾病或紊乱并在接受治疗的研究对象,该研究对象针对这种疾病或紊乱的治疗过程或结果被监测;
(v)未患这种疾病或紊乱的研究对象;
(vi)同一研究对象在这种疾病或紊乱发作之前或在对这种疾病或紊乱治疗开始之前,以及
(vii)同一研究对象在这种疾病或紊乱早期或晚期,或在这种对疾病或紊乱治疗的早期或晚期,或这种在疾病或紊乱开始之前。
附图说明
图1显示的是关于在体内存在的不同形式的因子XIIa的假说的图示。
图2a到2d显示的是用荧光检测的HPLC示踪:2a,血浆样品;2b,FITC标记的2/215抗体;2c,与FITC标记的2/215抗体孵育的血浆;2d,从2c示踪中减去2a和2b示踪得到的示踪结果。
图3显示的是用HPLC分离的与同位素标记2/215 Fab片段孵育的血浆各组分的放射性。峰1到峰5是单克隆抗体2/215 Fab片段与血浆组分结合的结果,峰6是剩余的未结合的克隆抗体2/215 Fab片段。
图4a和4b显示的是源于三种不同样品,即细胞丰富血浆、细胞稀少血浆和洗涤后的细胞对因子XIIa免疫测试的标准化的反应。在一微量滴定板上进行的免疫测试,用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用标记的多克隆抗体(多克隆抗体偶联物)(图4a中的菱形,4b中的带点条形)和标记的单克隆抗体2/215(2/215偶联物)(图4a中的正方形,4b中的黑色条形)来检测细胞的因子XIIa。
图5显示的是用Abbott Laboratories公司的IMx system系统来检测细胞的因子XIIa的免疫测试的操作流程。
图6a和图6b显示的是三个不同样品,即细胞丰富血浆、细胞稀少血浆和细胞悬液对因子XIIa免疫测试的反应。在一微量滴定板上进行免疫测试,用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用标记的多克隆抗体(多克隆抗体偶联物)(图6a中的菱形,6b中的带点条形)和标记的单克隆抗体2/215(2/215偶联物)(图6a中的正方形,6b中的黑色条形)来检测细胞的因子XIIa。
图7a和图7b显示的是三个不同样品,即细胞丰富血浆、细胞稀少血浆和细胞悬液对因子XIIa免疫测试的反应。用IMx因子XIIa免疫测试系统,用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用标记的单克隆抗体201/9(201/9偶联物)(图7a中的菱形,7b中的带点条形)和标记的单克隆抗体2/215(2/215偶联物)(图7a中的正方形,7b中的黑色条形)来检测细胞的因子XIIa。
图8a和图8b显示的是FITC标记的2/215单克隆抗体与血浆孵育后的的流式细胞计数结果。图8a显示的是无标记抗体的血浆的结果,图8b显示的是与标记抗体孵育的血浆的结果。分布的迁移表明标记的2/215抗体与血浆细胞组分结合。
图9显示的是用添加放射性标记的2/215单克隆抗体测定的8个个体的血浆细胞的因子XIIa。
图10a和图10b显示的是源于一个因子XIIa“完全缺失”的个体的三种不同样品,即细胞丰富血浆、细胞稀少血浆和细胞悬液对因子XIIa免疫测试的反应。用IMx因子XIIa免疫测试系统,用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用标记的单克隆抗体201/9(图10a中的菱形,10b中的带点条形)和2/215(图10a中的正方形,10b中的黑色条形)作偶联物。
图11a和11b显示的是源于一个因子XIIa“完全缺失”的个体的三种不同样品,即细胞丰富血浆、细胞稀少血浆和细胞悬液对因子XIIa免疫测试的标准化的反应。用IMx因子XIIa免疫测试系统,用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用标记的单克隆抗体201/9(图11a中的菱形,11b中的带点条形)和2/215(图11a中的正方形,11b中的黑色条形)作偶联物。
图12a和12b显示的是分别源于一个正常志愿者和一个因子XIIa“完全缺失”的个体的三种不同样品,即细胞丰富血浆、细胞稀少血浆和细胞悬液对因子XIIa免疫测试的标准化的反应。因子XIIa的分析在IMx分析仪上进行,用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用标记的单克隆抗体2/215作偶联物。(图12a中的菱形和12b中的带点条形表示源于正常个体的样品;图12a中的正方形和12b中的黑色条形表示源于因子XIIa“完全缺失”的个体的样品。)
图13a和13b显示的是分别源于一个正常志愿者和一个因子XIIa“完全缺失”的个体的三种不同样品,即细胞丰富血浆、细胞稀少血浆和细胞悬液对因子XIIa免疫测试的归一化的反应。因子XIIa的免疫分析在IMx分析仪上进行,用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用标记的单克隆抗体201/9作偶联物。(图13a中的菱形和13b中的带点条形表示源于正常个体的样品;图13a中的正方形和13b中的黑色条形表示源于因子XIIa“完全缺失”的个体的样品。)
图14显示的是从12个健康志愿者中得到的脂肪结合的因子XIIa的浓度。测试方法是通过添加放射性标记的2/215抗体片段于柠檬酸盐处理的血浆,去除细胞成分,用锰/肝素沉淀法沉淀脂蛋白,再测试沉淀组分中的放射性。
图15显示的是从64个因为胸部疼痛而住院的病人中得到的脂肪结合的因子XIIa的浓度。测试方法是先去除细胞成分,添加放射性标记的2/215抗体片段于全血,用磷钨酸盐沉淀法沉淀脂蛋白,再测试沉淀组分中的放射性。
图16显示的是用ELISA方法测定8个志愿者的脂肪结合的因子XIIa的浓度(以550nm处吸光值表示)。
图17a到17d显示的是用荧光检测的HPLC示踪:17a,尿液样品;17b,FITC标记的2/215单克隆抗体;17c,与FITC标记的2/215抗体孵育的尿液;17d,从17c示踪中减去17a和17b示踪得到的示踪结果。
图18显示的是经HPLC分离的与放射性标记的2/215单克隆抗体片段孵育的尿液组分的放射性。峰1是2/215单克隆抗体与尿液因子XIIa结合的结果,峰2是剩余的未结合的2/215单克隆抗体片段。
图19显示的是用两种不同的免疫测试方法测定的经皮冠状动脉血管成形术(PTCA)病人术前、术后和术后5天所取血浆样品中因子XIIa浓度值的典型模式。测试1是包含有样品孵育步骤的免疫测试。它用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用标记的单克隆抗体201/9作偶联物,在样品孵育步骤中添加三硝基甲苯((Triton))。测试2用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用抗因子XII的多克隆抗体作偶联物,在样品孵育步骤中不加三硝基甲苯((Triton))。菱形代表的数值表示从测试1得到的结果;正方形代表的数值表示从测试2得到的结果。
图20显示的是测定的从4个病人(病人S0216、S0794、S0811、S0909)在经皮冠状动脉血管成形术(PTCA)术前、术后和术后5天所取血浆样品中因子XIIa浓度值。因子XIIa由一个有样品孵育步骤的免疫测试法测定。用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用标记的抗因子XII的多克隆抗体作偶联物,在样品孵育步骤中不加三硝基甲苯((Triton))。带点条形表示PTCA术前的值,阴影条形表示PTCA术后的值,黑色条形表示PTCA术后5天的值。
图21显示的是经溶栓治疗前、治疗后以及治疗后5天的病人样品中的因子XIIa浓度。测试1包含样品孵育步骤。它用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用标记的单克隆抗体201/9作偶联物,在样品孵育步骤中添加三硝基甲苯((Triton))。测试2用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用抗因子XII的多克隆抗体作偶联物,在样品孵育步骤中不加三硝基甲苯((Triton))。菱形代表的数值表示从测试1得到的结果;正方形代表的数值表示从测试2得到的结果。所得结果是从一个个体得到数值的典型模式。
图22显示的是测定的从3个病人(病人S0684、S0685、S0693)在经溶栓治疗前、治疗后以及治疗后5天的样品中的因子XIIa浓度。因子XIIa由一个有样品孵育步骤的免疫测试法测定。用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用标记的抗因子XII的多克隆抗体作偶联物,在样品孵育步骤中不加三硝基甲苯((Triton))。带点条形表示PTCA术前的值,阴影条形表示PTCA术后的值,黑色条形表示PTCA术后5天的值。
图23显示的是被怀疑患有心肌梗塞或急性冠状动脉综合症的住院病人住院期间内重复肌钙蛋白阳性的频率。重复肌钙蛋白阳性的频率按因子XIIa的浓度分组。因子XIIa由一个含样品孵育步骤的免疫测试法测定。用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用碱性磷酸酶标记的同一抗体作偶联物,在样品孵育步骤中要加三硝基甲苯((Triton))。
图24显示的是用一些选择性测试不同形式因子XIIa的测试法测定的图23中病人的从一开始的住院期间内重复肌钙蛋白阳性的频率。这表明特定形式的因子XIIa具有临床用途而其他的形式则没有。采用含有样品孵育步骤的免疫测试法。方法a选择性测定的因子XIIa形式用带点的浅色条形代表。方法a用单克隆抗体2/215作为捕获抗体(以15μg/ml的重碳酸盐缓冲液包被),用碱性磷酸酶标记的同一抗体作偶联物,在样品孵育步骤中要加三硝基甲苯((Triton))(如图23)。方法b选择性测定的因子XIIa形式用黑色条形代表。方法b用单克隆抗体2/215作为捕获抗体(以2μg/ml的磷酸盐缓冲液包被),用碱性磷酸酶标记的单克隆抗体201/9作偶联物,在样品孵育步骤中不加三硝基甲苯(Triton)。方法c选择性测定的因子XIIa形式用带对角线的浅色条形代表。方法c用单克隆抗体2/215作为捕获抗体(以2μg/ml的磷酸盐缓冲液包被),用碱性磷酸酶标记的抗因子βXIIa的多克隆抗体作偶联物,在样品孵育步骤中不加三硝基甲苯(Triton)。
图25显示的是图23中的病人在住院30天内继发肌钙蛋白阳性的频率。重复肌钙蛋白阳性的频率按因子XIIa浓度分组。因子XIIa由一个有样品孵育步骤的免疫测试法测定。用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用标记的单克隆抗体201/9作偶联物,在样品孵育步骤中要加三硝基甲苯(Triton)。黑色条形表示非致命肌钙蛋白阳性事件,带对角线的浅色条形表示致命性的肌钙蛋白阳性事件。
图26显示的是用一些可以选择性测试不同形式因子XIIa的方法测定的图25中病人住院30天内继发肌钙蛋白阳性的频率。这表明特定形式的因子XIIa具有临床用途而其他的形式则没有。方法x选择性测定的形式的因子XIIa用带点的浅色条形代表。方法x用单克隆抗体2/215作为捕获抗体(以2μg/ml的磷酸盐缓冲液包被),用碱性磷酸酶标记的抗因子βXIIa的多克隆抗体作偶联物,在样品孵育步骤中不加三硝基甲苯(Triton)。方法y选择性测定的形式的因子XIIa用黑色条形代表。方法y用单克隆抗体2/215作为捕获抗体(以2μg/ml的磷酸盐缓冲液包被),用碱性磷酸酶标记的抗因子XIIa的多克隆抗体作偶联物,在样品孵育步骤中不加三硝基甲苯(Triton)。方法z选择性测定的因子XIIa形式用带对角线的浅色条形代表。方法z用单克隆抗体2/215作为捕获抗体(以15μg/ml的重碳酸盐缓冲液包被),用标记的单克隆抗体201/9作偶联物,在样品孵育步骤中要加三硝基甲苯(Triton)(如图25所示的数值)。
图27显示的是对图23和25中的病人作为治疗终点的死亡频率。死亡频率按因子XIIa浓度分组。因子XIIa由一个含有样品孵育步骤的免疫测试法测定。用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用抗因子XII的多克隆抗体作偶联物,在样品孵育步骤中不加三硝基甲苯(Triton)。黑色条形表示没有第二次肌钙蛋白阳性记录的心肌死亡,含对角线的浅色条形表示有第二次肌钙蛋白释放阳性的死亡。
图28显示的是用两种选择性测试不同形式因子XIIa的测试法测定的图27中病人的作为治疗终点的死亡频率。这表明特定形式的因子XIIa具有临床用途而其他的形式则没有。方法i选择性测定的形式的因子XIIa用带点的浅色条形代表。方法i用单克隆抗体2/215作为捕获抗体(以2μg/ml的磷酸缓冲液包被),用碱性磷酸酶标记的同一抗体作偶联物,在样品孵育步骤中不加三硝基甲苯(Triton)。方法ii选择性测定的形式的因子XIIa用黑条形代表。方法ii用单克隆抗体2/215作为捕获抗体(以2μg/ml的磷酸缓冲液包被),用抗因子XII的多克隆抗体作偶联物,在样品孵育步骤中不加三硝基甲苯(Triton)(如图27所示的数值)。
图29显示的是被怀疑患心肌梗塞病人最初6个月的住院期内发生重复非致命心肌梗塞(肌钙蛋白阳性)的频率。重复发作的频率按脂结合的因子XIIa的浓度分组。浅色条形表示非致命的心肌梗塞,黑色条形表示心脏死亡。
图30显示的是用放射性标记抗体孵育和HPLC分析测定的5个健康志愿者和5个肾病患者的尿液中因子βXIIa的浓度。
图31显示的是微量滴定板微量滴定板免疫测试的吸光值表示的5个健康志愿者和5个肾病患者的尿液中因子βXIIa的浓度。因子XIIa由一个有样品孵育步骤的免疫测试法测定。用单克隆抗体2/215作为捕获抗体,用标记的单克隆抗体201/9作偶联物,在样品孵育步骤中要加三硝基甲苯(Triton)。
术语定义
抗体,包括任何能与抗原结合的抗体片段,如Fab片段,F(ab’)2片段,以及重组、嵌合和人源化抗体。
抗体偶联物,也称检测抗体,表示标记了可以直接或间接用于分析的标记物的抗体。
捕获抗体表示用于免疫检测的固定于固相的抗体。
捕获测试是一种固定于固相的捕获抗体与样品接触的免疫测试。如果样品中含有能与固相的抗体结合的抗原且反应条件恰当,抗原会与固相的抗体形成抗原抗体复合物从而被捕获于固相,从而能被检测和测定。
细胞,如未特别作其他标注,表示完整细胞、细胞残留物和细胞组成物。
细胞性因子XIIa和细胞性因子XII分别指存在于细胞表面、与细胞、细胞残留物和细胞组成物结合的因子XIIa和因子XII。
检测指定性分析
测试和(或)测定指定量或半定量分析。
因子XIIa,也叫活化的因子XII,表示任何有酶活性的酶原因子XII的形式或片段。
高亲和性结合伴侣,表示一种可与因子XIIa形成复合物的分子,该分子与因子XIIa的结合不会因添加去垢剂或与另一种分子竞争等简单方法而解离。
脂结合因子XIIa,表示与脂类物质连接的因子XIIa,如,与脂肪尤其是脂蛋白及其残留物的连接。
低亲和性结合伴侣,表示一种与因子XIIa形成复合物的分子,该分子与因子XIIa的结合会因添加去垢剂或与另一种分子竞争等简单方法而解离。
单克隆抗体(mAb)2/215,也叫抗体2/215,是杂交瘤细胞株2/215产生的抗体,杂交瘤细胞株2/215于1990年1月16日以存放号90011606存放于ECACC(欧洲细胞培养物收藏中心,生物制品部,PHLS Centre for Applied Microbiology and Research,Porton Down,Salisbury SP4 OJG,England)。
单克隆抗体2/215类似物,表示与因子XIIa结合的特性与抗体2/215大致相同的抗体。
单克隆抗体201/9,也叫抗体201/9,是杂交瘤细胞株201/9产生的抗体,杂交瘤细胞株201/9于1990年1月18日以存放号90012512存放于ECACC。
单克隆抗体201/9类似物,表示与因子XIIa结合的特性与抗体2/215大致相同的抗体。
含细胞的样品,指含有细胞的体液样品和含有分离的细胞的样品。
种类和形式,在指代因子XIIa的相关种类和形式时可以互换。μg和μl分别指微克和微升。
尿液因子XIIa,指尿液中的因子XIIa。
具体实施方式
因子XIIa的形式
本发明基于我们的一个惊人的发现,即因子XIIa(活化的因子XII)在血液中以多种形式(或种类)存在,而且不同种类或形式的测定结果能为不同临床诊断治疗提供相关信息。
不限于以下所述,我们关于在体内因子XIIa以多种形式存在的假设如下,因子XIIa形式的变化可以指如下任何一种情况:
(i)因子XIIa在分子量和肽链长度方面的变化,这些变体包括αXIIa、βXIIa和γXIIa;
(ii)两个或多个因子XIIa或如(i)所述因子XIIa变体的复合体,例如在体液中不与细胞物质或脂类物质结合的因子XIIa分子;
(iii)与细胞物质包括细胞和细胞残留物、脂类尤其是脂蛋白及其残留物结合的因子XIIa或如(i)所述的因子XIIa变体;
(iv)因子XIIa或如(i)所述因子XIIa变体与其他分子形成的复合物,如高亲和性结合的蛋白质如抑制分子,或低亲和性结合的蛋白。
我们假设对某一特定的疾病情况并非所有因子XIIa的形式都能提供相同等量的信息,因此优先测定某一种形式的因子XIIa更有利于临床使用,如这种测定方法能与一种或几种疾病或紊乱的诊断、预测、检测及其治疗联系起来。
我们的假设如图1所示。因子XIIa形式的变化反映了酶原因子XII经逐步切割导致分子量和肽链序列变化。因子XII经切割产生一个80Kd的有活性的丝氨酸蛋白酶,叫做因子αXIIa,图1中以“αXIIa”表示,由一个二硫键连接的52Kd重链和28Kd轻链组成。这种形式的因子经蛋白酶解从重链释放出一个肽段得到的产物叫做因子βXIIa,图1以“βXIIa”表示,它保留了丝氨酸蛋白酶活性,由αXIIa的28Kd链以一个二硫键与源于αXIIa的52Kd链的一个小肽段连接而形成。因子βXIIa可以经进一步蛋白酶解得到一个分子量约为15Kd的片段,我们称之为因子γXIIa,图1以“γXIIa”表示。
因子XIIa的任何形式的变体如αXIIa、βXIIa和γXIIa都有可能与其它分子联合,包括高亲和性结合伴侣如1酯酶抑制剂,和其它结合蛋白如低亲和性结合伴侣。据推测因子XIIa与其他蛋白如低亲和性蛋白的结合是可逆的,它与抑制蛋白的结合也是可以阻止的,从而可以减少或排除对因子XIIa活性的抑制。
因子XIIa的任何形式的变体如αXIIa、βXIIa和γXIIa都有可能与脂质物如脂蛋白,可以是脂蛋白颗粒和(或)其残留物,结合或解离。因子XIIa的任何形式的变体如αXIIa、βXIIa和γXIIa都有可能与细胞或细胞碎片结合或解离。特别是在因子XIIa与细胞、细胞碎片、脂蛋白和脂蛋白残留物结合时,某一颗粒的表面可以结合多个某种形式的因子XIIa。并且,几个相同或不同形式的因子XIIa分子可能以复合物形式存在。为表达清晰起见,这些复合物没有在图1中标示出。
图1显示了对不同形式的因子XIIa的互相转变的推断。为表达清晰起见,因子βXIIa和γXIIa与细胞及其残留物和脂蛋白及其残留物的相互作用没有标示到图1中。
此处假设图1所示的系统是一个动态的体系。并且假设不同形式的因子XIIa在不同的病理和生理状态下起不同的作用。与测定其他未知的形式的因子XIIa相比,选择性地测定某一特定形式的因子XIIa有助于对疾病和紊乱及其治疗的诊断、预测和监测提供临床用途。细胞性因子XIIa
许多作者认为因子XII活化为因子XIIa可以发生在细胞表面,并且有数据证明。尤其是,一些作者认为因子XII的活化发生在细胞上尤其是内皮细胞上,可以通过构建同时包含高分子量的激肽原、激肽释放酶前体和因子XI的多分子聚集体达到。Yarovaya等(loc.cit.)研究的模型表明激活后的因子XIIa会从多分子体聚集解离,不再保留于细胞表面。本发明基于我们惊人的发现,即因子XIIa以多种形式存在,其中一种形式的因子XIIa存在于在血液中循环的细胞表面以及来源于细胞的残留物和细胞组成物质的表面。这种形式的因子XIIa被称为“细胞性因子XIIa”。这一发现与上述前人的发现,即在细胞表面多分子聚集体内活化的因子XIIa将从这些多分子聚集体解离而不再存在于细胞表面的结论相反。
另一个发现是,当因子XIIa为细胞性因子时并非其所有抗原表位都可用,这与非细胞性因子XIIa不同。例如单克隆抗体2/215可以与细胞性和非细胞性的因子XIIa有效结合,而单克隆抗体201/9和一个源于绵羊的抗βXIIa的多克隆抗体似乎并不能象结合非细胞性因子XIIa一样有效结合细胞性因子XIIa。
在血液中,因子XIIa似乎专一地存在于粒细胞上,尤其是一类在流式细胞实验中较其他粒细胞表现出稍高分散性(表明它们与其他亚群具有不同形态)的粒细胞上。这些发现具有临床参考意义,见下文。
脂结合因子XIIa
我们的惊人发现因子XIIa以多种形式存在的另一方面是因子XIIa与脂质物结合,如血液中的脂蛋白及其残留物,而且为这类脂结合因子XIIa的测定能对多种临床情况提供相关信息。
尿液因子XIIa
我们的惊人发现因子XIIa以多种形式存在的另一方面是因子XIIa存在于尿液,而且对这类尿液因子XIIa的测定能对多种临床情况提供相关信息。
分子复合体及因子XIIa与其他分子种类的联合体
我们的发现表明两个到几个因子XIIa自身或因子XIIa与一到几种其他种类的分子可以联合在一起形成复合体。例如与高亲和性结合蛋白如抑制剂分子或低亲和性结合蛋白结合。免疫测试时加与不加去垢剂(这会打断因子XIIa分子自身复合体和低亲和性结合伴侣的结合,但不能打断它与高亲和性结合伴侣的结合)的结果也表明因子XIIa存在自身分子复合体和与其他结合伴侣的联合体。
不同形式因子XIIa的检测和测定
本发明提供了从一个样品中检测或测定一或数种因子XIIa的方法,包括一个可以将所研究的因子XIIa形式优先于其他形式被检测或测定的过程。
在一个实施例中,本发明的一个方法能通过一种测试将所研究的因子XIIa形式优先于其他形式被检测或测定。
在另一个实施例中,本发明的一个方法能将所研究的因子XIIa形式从其他形式分离出来,并检测或测定所分离的因子XIIa。
检测或测定所分离的因子XIIa可以用一种能将所研究的因子XIIa形式优先于其他形式被检测或测定的方法。
在另一个实施例中,本发明的一个方法包括将样品用一个能与所研究的因子XIIa或者可选择地,也能与其他形式的因子XIIa结合的标记抗体接触,使所研究的因子XIIa从其他形式的因子XIIa中分离,并检测或测定所研究的因子XIIa。
因此根据本发明,可以首先将所研究的因子XIIa与其他形式的因子XIIa分离,再进行测定。可以用一个测试因子XIIa的通用方法,即不特别针对某种形式的方法;但用一种可以将所研究的因子XIIa形式优先于其他形式被测定的方法可能更有利。下面将给出这样的例子。这种方法可以用于检测或测定如细胞性因子XIIa、因子XIIa自身复合物和因子XIIa与其他分子的结合物。
可选择地,一个能将所研究的因子XIIa形式优先于其他形式被测定的方法可以用于直接测定一个样品而无需将不同形式的因子XIIa分离处来。下面将给出这样的例子。这样的测试可以在一个样品上直接进行。这种测试可以被用来检测或测定因子XIIa自身复合物和因子XIIa与其他分子的结合物。
还可选择地是,一个含有不同形式因子XIIa的样品可以与一个标记的抗体接触,然后可以将所研究的一或多种形式的因子XIIa分离出来,再对其进行检测或测试。这样的测试可以用来检测或测试如脂结合的因子XIIa。
各种形式因子XIIa的分离
各种形式的因子XIIa可以根据它们的物理、化学和免疫学特征而被分开。一般说来,进行任何这样的分离的条件应当是使所研究的各种因子XIIa的形式保持不变,如一般在这种条件任何复合物或分子联合体不会被打断,任何与其它物质如细胞性物质或脂质物结合的因子XIIa不会被释放出来。然而在某些情况下更希望能将因子XIIa从联合体或其它结合物上释放。
基于物理性质的分离
不同形式的因子XIIa可以根据分子量的不同被分离,如用层析的方法如高压液相层析(HPLC),流式细胞技术和超速离心技术分离,然后对所分离的物质进行测试。
测试可以通过几种方法进行,如对所分离的形式的因子XIIa进行免疫测试,或酶学测试如用生色物质如S203(Kabi Diagnostics,Uxbridge,England)。针对因子XIIa的抗体可以与HPLC连用,如用标记的抗体与样品反应,得到的混合物再经HPLC分离。然后抗体与特定形式的因子XIIa的复合物可以通过针对标记抗体的标记物的合适的系统来测定。根据物理性质分离因子XIIa自身复合物或因子XIIa与其他结合伴侣形成的联合体
这种方法,随同其他的技术一起,对从其他形式的因子XIIa中分离由两到多个因子XIIa组成的复合物和分离与高亲和性和低亲和性伴侣结合的因子XIIa,可能是有用的。
通常优先考虑采用那些因子XIIa复合物不会被打断、因子XIIa不会与结合伴侣解离的条件的分离。例如,通常应选择避免使用去垢剂,因为这会打断复合体和一些分子联合体。然而,在一些情况下可能希望这些打断发生。例如,当希望将因子XIIa从低亲和性结合伴侣释放,或将与低亲和性伴侣结合的因子XIIa与同高亲和性伴侣结合的因子XIIa分离时,恰当的条件如添加去垢剂就可以使用,以达到因子XIIa与低亲和性伴侣分离而不与高亲和性伴侣分离。
根据物理或化学性质分离细胞性因子XIIa和脂类结合的因子XIIa
可以通过物理或化学方法或结合两种方法将细胞性和脂类结合因子XIIa从其他形式的因子XIIa分离出来。例如,细胞性因子XIIa可以通过离心或流式细胞技术分离。脂结合因子XIIa可以通过如脂蛋白沉淀试剂和离心,或密度梯度超速离心进行分离。
通常优选采用那些因子XIIa不会从细胞性物质或脂类解离的条件进行分离。例如,通常应避免选择使用去垢剂。然而,在一些情况下可能希望这些打断发生。如果希望将因子XIIa从与其结合的物质释放,可以使用适当的条件。
免疫学分离
可以采用免疫学方法通过能优先结合这种或这些形式的因子XIIa的抗体将所研究的一到数种形式的因子XIIa与其他形式的因子XIIa分离。例如,可以将抗体固定在合适的固相支持物,用免疫亲和层析的方法分离。层析过后结合或未结合的部分都可以进行酶活性测定。这些用途所选用的抗体见如下免疫测试实验相关描述。
如上基于物理或化学性质分离的相关描述,免疫亲和层析分离所用条件通常应当是因子XIIa的形式能保持不变,如复合物和联合体不会被打断,结合的分子不会被释放。然而,可能也有希望打断的情况,若此,可以选用恰当的条件。
测试方法适应性的判定
已知测定因子XIIa的方法包括生色法如酰胺分解实验和如下面详细描述的各种免疫测试。
如果测试开始前所研究的因子XIIa形式已经从其他分子形式分离,可以用一个不分辨不同种类因子XIIa的测试方法如一个“通用”的因子XIIa测试法。然而即便是在分离步骤后进行的测试,用一个能够从其他形式因子XIIa中选择性检测或测定所研究一种或几种形式的因子XIIa可能更有利。
如果没有分离的步骤,所用测试法必须能够检测或测定所研究的因子XIIa。可以先验证一下一个已知适合用来检测或测定因子XIIa的方法能否从一个样品中检测或测试所希望的因子XIIa形式。
例如,对已知的一个包括细胞性因子XIIa的样品用所选的测试方法和一个已知适合于检测细胞性因子XIIa的方法同时测定并比较二者得到的结果。单克隆抗体2/215可以有效结合细胞性因子XIIa。一个包括单克隆抗体2/215或其类似物的免疫测试法可以用作对比测试。相同的策略也适用于对其他形式的因子XIIa的测试。
一个选择是用所研究的方法对已知包括所要的形式如细胞性的因子XIIa的样品的一部分进行测试。在这种情况下,样品不能包括非细胞性因子XIIa。该样品的另一部分经过处理使因子XIIa从细胞释放,收集处理后的细胞并重复实验然后比较两次实验得到的结果。如果测试原含有细胞性因子XIIa的部分样品得到的结果高于测试处理去除细胞性因子XIIa的部分样品,则表明此法适合于检测或测定细胞性因子XIIa。这样相同的策略也适用于对其他形式的因子XIIa的测试。
对一或几种形式的因子XIIa的专一性的测试
对一或几种形式的因子XIIa相对于其他形式的因子XIIa的专一性的测试可以通过对测试方法的合理设计来达到或改进。该测试法的各项参数应当调节到使所研究的形式的因子XIIa能优先于其他形式的因子XIIa被检测或测定。
对测试方法的这种优化在行内是标准做法,适用的技术也很多,例如参考书:Principlesand Practice of Immunoassays,Eds.Price CP & Newman DJ,Stockton Press,1991。
对于免疫测试的情况,为达到所需专一性可以调节的参数包括对所用抗体或抗体组合的一到数种选择;对去垢剂加、不加或所加种类的选择;在涉及将一抗体包被到固相的抗原捕获测试时包被条件的选择。
例如,在进行微量滴定板免疫测试时有许多参数可以改变以达到优先于其他形式测定某些形式的因子XIIa。
一个例子是捕获抗体的选择,比如可以用单克隆抗体2/215,或用单克隆抗体201/9或2/15,它们可以选择性地检测不同形式的因子XIIa。
将捕获抗体包被到固相所用包被液的配方也影响对不同形式因子XIIa测定的选择性,例如,配方中抗体的浓度、pH值以及缓冲液的组分都很重要。
另一个影响此类因子XIIa能否被优先测定的参数是在样品与抗体孵育时加或不加去垢剂,如(Triton)。此处推测加去垢剂可能打断复合物如因子XIIa分子之间形成的复合物,可能将先前结合于细胞或脂质的因子XIIa释放。所加去垢剂的性质或量也可能影响测试。
另一个可以改变以影响选择性测试某些特定因子XIIa形式的参数是用来检测抗原抗体复合物的被标记形成偶联物的抗体的选择。
应当注意的是测试方法的参数之间有复杂的相互作用,例如一个测试中添加去垢剂的效果取决于捕获抗体组合、包被抗体浓度、包被缓冲液和所使用的抗体偶联物。检测或测定所希望的因子XIIa的条件的适合性可以根据行内的一般实践通过对不同参数的适当调整来确定。
样品和样品制备
样品
对不同形式的因子XIIa的测定所用样品,可以用体液样品如全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液和泪液;也可用从体液中分离的细胞样品,即细胞基本上游离于其在体内时赖以存在的液体相;也可用包含来自于组织样品的细胞和组织的样品。
样品制备
样品可以用常用方法获得和制备,例如可参照如下参考文献:Young,D.S.& Bermes,E.W.“Specimen collection and processing”in Tiez Textbook of Clinical Chemistry 2ndEdition Eds.Burtis,C.A.& Ashwood,E.R.,Saunders(1994);Methods in Enzymologhy,H.Van Vunakis and J.J.Langone(Eds),1981,72(B);Practice and Theory of EnzymeImmunoassays,Ptijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,R.J.Burden and P.H.Van Knippenberg(Eds),Elservier,1985;Introduction toRadioimmuoassay and Related Techniques,T.Chard,ibid,3rf Edition,1987;Methods inEnzymology,H.Van Vunakis and J.J.Langone(Eds)1981,74(C).
体液
根据本发明,一或多种形式的因子XIIa可以从体液样品中检测或测定。体液样品的例子有全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液和泪液。体液样品可以通过传统的方式得到和制备,例如上面参考文献描述的方法。
优先于其他形式的因子XIIa对特定形式的XIIa进行选择性测定可以通过如下部分的测试达到。
细胞性因子XIIa
在一个实施例中,本发明提供一种包括检测或测定哺乳动物对象(通常是人)的血液或其他体液中循环的细胞组成样品中的因子XIIa的方法。测定细胞性因子XIIa可以对体液样品进行,也可用测试前先从体液如全血或血浆中分离的细胞样品,即基本没有其体内存在时的液相的分离细胞。也可用从组织样品而来的细胞样品。
如果所用方法既能检测或测定细胞性因子XIIa,又能检测或测定非细胞性因子XIIa,这样对一个包含细胞的样品测试时就既测了细胞性因子XIIa又测了非细胞性因子XIIa。然而,如果是用一个分离的细胞样品进行测试,结果就仅为细胞性因子的测试结果。名称“包含细胞的样品”此处既表示含细胞的体液也表示分离的细胞。
细胞,包括细胞残留物和细胞组成物,可以用上述“分离不同形式的因子XIIa”的方法分离。例如,细胞可以用离心和洗脱分离。优选细胞至少离心和洗涤一次,最好两到多次。离心时的离心力通常应当高到足以使细胞形成一清晰的团块以使之能与上清液分离。细胞团块可以用不影响细胞性因子XIIa的合适的介质洗涤,如不会使细胞性因子XIIa从细胞解离的介质。比如pH7.4的磷酸缓冲液是可以用来洗涤和悬浮那些用来测试和(或)测定细胞性因子XIIa的缓冲液介质。也可以用流式细胞技术分离细胞。
如果测试开始前细胞性因子XIIa已从其他形式的因子XIIa分离,就可以用一个不能区分细胞性和其他形式的因子XIIa的测试方法,即“通用”测试法来进行测试。然而,即使测试前已经分离了细胞,可能用一个相对于其他形式的因子XIIa能选择性地检测或测定细胞性因子XIIa的方法更有利。
如果没有进行分离步骤,所用方法应当能够检测或测定所研究的细胞性因子XIIa。针对因子XIIa的多种测试方法见下所述。
一个组织样品中存在的细胞性因子XIIa可以用免疫组织学的技术检测。例如,可以像如下所述,使用一个有恰当标记物如荧光标记的单克隆抗体。
在一些情况下,可能测定的是因子XII而非因子XIIa。
脂结合因子XIIa
本发明提供一种包括从组织样品或特别是从哺乳动物尤其是人体获得的体液样品中检测或测定脂结合因子XIIa的方法。
脂结合因子XIIa的测定可以用体液样品如全血或血浆。可选择的是,脂质部分可以先从体液或组织分离,然后再测定脂质部分因子XIIa的含量。脂质部分的分离可以参照上边“不同形式因子XIIa的分离”部分的描述进行。例如,脂蛋白可以通过沉淀法从组织或体液如血浆分离。已知适于沉淀脂蛋白的试剂包括,如氯化钠、氯化锰和肝素组成的试剂,磷钨酸试剂。多种试剂和方法描述于参考文献:Demacker,P.N.M et al.Clinical Chemistry Vol.43,No.4,1997,p663-668;Sharma,A.et al.Clinical Chemistry,Vol.36,No.3,1990,p529-532。
一个样品,如血浆,可以通过离心去除细胞组分。例如用像12000g到16000g的中到高速离心。脂蛋白可以通过脂蛋白沉淀试剂如含有氯化钠、氯化锰和肝素的试剂沉淀,如约500mM氯化钠,215mM氯化锰和500U/ml肝素,或者用磷钨酸沉淀试剂如50mM磷钨酸盐和通常所用的氯化锰。
沉淀物可以通过离心分离。如需要,沉淀物可以重新悬浮于沉淀剂再分离。如需要,这种操作可以重复,如两到三次。沉淀步骤之间可以进行洗涤。
如果测试开始前脂蛋白结合因子XIIa已和其他形式的因子XIIa分离,就可以用一个不能区分不同形式的因子XIIa的测试方法,即“通用”测试法来进行测试。然而,即便测试前已经有了分离步骤,还是用能优先于其他形式的因子XIIa进行检测或测定脂蛋白结合因子XIIa的方法更有利。
如果没有进行分离步骤,所用方法应当能够检测或测定脂蛋白结合因子XIIa。
在用免疫测试时,脂蛋白部分可以在样品与一种抗体结合之前或之后分离出来。可能与抗体结合之后再分离更有利。
因子XIIa自身分子复合物和因子XIIa与其他分子的联合体
一个测试所用的由因子XIIa自身分子复合物和因子XIIa与其他分子的联合体组成的样品,通常为体液,可以用如前所述的一般操作制备。
如需要,由两到多个分子或两到多种形式的因子XIIa组成的分子复合物与高亲和性或低亲和性结合伴侣联结的因子XIIa可用如上“不同形式因子XIIa的分离”部分所述的方法在对因子XIIa测试之前进行分离。例如,结合于低亲和性结合伴侣的αXIIa、结合于低亲和性结合伴侣的βXIIa,结合于低亲和性结合伴侣的βXIIa片段,结合于高亲和性结合伴侣的αXIIa,结合于高亲和性结合伴侣的βXIIa,结合于高亲和性结合伴侣的βXIIa片段,可以被分离。
如果由两到多个分子或两到多种形式的因子XIIa组成的分子复合物与高亲和性或低亲和性结合伴侣联结的因子XIIa在测试之前已和其他形式的因子XIIa分离,就可以用一个不能区分这些形式与其他形式的因子XIIa的测试方法,即“通用”测试法来进行测试。然而,即便测试前已经有了分离步骤,还是用能优先于其他形式的因子XIIa进行检测或测定脂蛋白结合因子XIIa的方法更有利。
如果没有对所研究因子XIIa进行分离步骤,可以用一个相对于其他形式的因子XIIa能优先选择性地检测或测定所研究的因子XIIa的方法进行测试。
合适的测试法,特别是免疫测试,见如下描述。
免疫测试
根据本发明,可以用一种能优先于其他形式的因子XIIa而选择性地检测或测定所研究的因子XIIa的免疫测试法进行测试。根据本发明,任一相关样品都能用一种免疫测试法测试。
通用免疫测试技术
免疫测试的方法是广为人知的。例如参考文献:Tiez Textbook of Clinical Chemistry2nd Edition Eds.Burtis,C.A.& Ashwood,E.R.,Saunders(1994);Methods in Enzymologhy,H.Van Vunakis and J.J.Langone(Eds),1981,72(B);Practice and Theory of EnzymeImmunoassays,Ptijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,R.J.Burden and P.H.Van Knippenberg(Eds),Elservier,1985;Introduction toRadioimmuoassay and Related Techniques,T.Chard,ibid,3rf Edition,1987;Methods inEnzymology,H.Van Vunakis and J.J.Langone(Eds)1981,74(C).
定量和定性的免疫测试技术包括酶联免疫吸附测试(ELISA),蛋白质印迹法,液相沉淀实验,包被颗粒实验,竞争实验,夹心法测试包括正向、反向和同时进行的夹心法实验,和固相放射免疫测试(SPRIA)。
一种抗原抗体复合物可以直接检测如用下面描述的技术或标记抗体的方法。
双抗体夹心法测试
根据本发明,一种可以使用的ELISA的形式的例子是所谓“双抗体夹心法测试”。该方法中,一种可以与一至多种形式因子XIIa结合的抗体,尤其是单克隆抗体,被固定在一种固相支持物上。例如塑料或其他的聚合材料,如微量滴定板的孔中,珠形物或颗粒物等,像在一些专利系统如IMx系统(Abbott Laboratories,Abbott Park,Illinois,USA.)所用。这一抗体称为“捕获抗体”。一种样品与固定的捕获抗体接触孵育。任何能与固定的抗体结合的形式的因子XIIa将会被固定的抗体“捕获”,从而使其自身也固定于固相。捕获于固相的各形式的因子XIIa用能与其中一或多种形式的因子结合的标记抗体检测。这种标记抗体常称为抗体“偶联物”。通过仔细选择抗体和(或)其他测试条件,就可能优化测试使其能优先于其他形式而测量、检测和/或测定一或多种特定形式的因子XIIa。
标记抗体
一种用来检测和/或测定目标抗原的标记抗体可以是多克隆的或单克隆的。针对人体的抗体如针对人体的多克隆抗体,通常能方便地用作临床使用的标记抗体。可选择地,也可用能与所研究形式的因子XIIa结合的抗体。这样的抗体可以结合像因子αXIIa重链、因子βXIIa或因子βXIIa的一个片段。
标记物可以被直接检测或间接检测。任何合适的放射性同位素可以用作直接检测标记物,如β放射性同位素或γ放射性同位素,像125I,131I,3H和14C。商业用途中,优先考虑非放射性标记物,通常是酶标记物。酶标记物是间接检测的。酶标记物有碱性磷酸酶,过氧化物酶如辣根过氧化物酶。针对所选酶要用合适的底物,如能产生可检测的光学或荧光变化的如酚酞一磷酸盐或荧光底物,如4-甲基伞形酮酰磷酸盐。可选择地,也可以用一种能用电化学方法显示结果的酶学反应。
一种标记抗体可以用来检测如ELISA中的抗原抗体复合物,或者也可以用来与抗原形成复合物,然后再检测该复合物。检测时可能用到流式细胞技术。
竞争实验
一或多种形式的标记的因子XIIa,如放射性标记或酶标记,可以用于竞争实验中测量一或多种形式的因子XIIa。
因子XIIa的免疫测试
因子XIIa免疫测试的一个例子见描述于专利WO90/08835中的捕获测试。为优先检测或测定一到多种形式的因子XIIa,推荐使用单克隆抗体2/215或其类似物,特别是用作捕获抗体。另一种不同的抗体如多抗或不同的单抗可以用作检测或(和)测定所研究的因子XIIa,或者也可用同种抗体。选择和(或)调整抗体和(或)测试条件可以做到相对于其他形式的因子XIIa优先检测和(或)测定某一或多种形式的因子XIIa。
其他免疫测试技术
其他用来检测或测定抗原的免疫测试方法用的是直接检测所形成的抗原-抗体复合物。这样的技术例如表面等离子体共振技术,表面声波和石英晶体微量天平方法(Suzuki M,OzawaF,Sugimoto W,Aso S.Anal Bioanal Chem 372:301-4,2002;Pearson JE,Kane JW,Petraki-Kallioti I,Gill A,Vadgama P.J Immunol Methods,221:87-94,1998;WeischW,Klein C,von Schickfus M,Hunklinger S.Anal Chem 199668:2000-4;Chou SF,HsuWL,Hwang JM,Chen CY.Clin Chem 48:913-8,2002)。
如果一个标记抗体与抗原形成了复合物,复合物可以通过流式细胞技术测试或测定。
标准和对照
免疫测试通常用“标准物”作参考点。
一个检测或检测和/或测定一或多种形式因子XIIa的测试实验的合适的标准物,典型的是由一种含有已知量的一或多种恰当形式的因子XIIa的溶液组成。可选择地,标准物也可以是恰当的一到多种形式的结合于支持物如固相上的因子XIIa组成。
根据所用测试方法的不同,用作标准和对照的物质可以采用不同的形式。在一些测试方案中,合适的物质可以在水溶液中。因子XII或其片段,包括各种形式的因子XIIa。在其他方案中,如ELISA中当同一抗体既作捕获抗体又作检测(偶联)抗体时,可能偏好制作能包含许多因子XII分子及其片段的载体,例如将因子βXIIa结合于珠形物表面,如直径为3μM的聚碳酸脂珠。
一个检测或检测和/或测定脂蛋白结合的因子XIIa的测试实验的合适的标准物,典型的是由一种含有已知量脂蛋白结合的因子XIIa的溶液组成。可选择地,标准物也可以是结合于非脂类支持物如固相上的因子XIIa组成,或者因子XIIa的水溶液也可用作标准。
一个检测或检测和(或)测定尿液因子XIIa的测试实验的合适的标准物,典型的是由一种含有已知量因子XIIa的溶液组成。
免疫组织学
存在于组织样品中的一或多种形式的因子XIIa可用免疫组织学方法检测。例如,用一个如上所述的标有合适标记物如可以是荧光标记物的单克隆抗体。典型地,先用标记抗体与组织样品接触孵育,然后用不会打断所形成的抗原抗体复合物的条件洗脱孵育试剂,再检测所形成的那些复合物。
生色实验
检测或测定一或多种形式的因子XIIa可以通过用一种生色底物测量其酶活性而进行,描述见参考文献:Vinazzer H.,Thromb Res.,14,155-156,1979。
这种测试可能包含一个将一或多种形式的因子XIIa和其他形式分离的步骤,见上文。对细胞性因子XIIa的免疫测试
细胞可以从体液如血或血浆分离,例如通过离心和洗涤。洗涤时最好包括至少一次特别是一到多次的合适的介质洗涤。洗涤的条件应不影响细胞性因子XIIa,比如不会使细胞性因子XIIa从细胞解离。合适的液体一般为缓冲液,如pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)。
一个包含细胞的体液样品可以被洗涤,即先高速离心再用合适液体悬浮得到“经过洗涤的细胞”。一个高速离心的例子是16000g离心10分钟。一种合适的洗涤和悬浮用液体是pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)。可以进行一或多轮,如两或三或更多轮的离心。
细胞丰富血浆可以通过对血液低速离心得到,例如对柠檬酸盐血1000g离心10分钟。对所得细胞丰富血浆进一步高速离心,如16000g离心10分钟所得到的上清即称为细胞贫瘠血浆。
用单克隆抗体2/215或其类似物同时作捕获抗体和检测抗体对细胞丰富血浆、细胞贫瘠血浆以及洗涤后的细胞样品用双抗体夹心法测试,结果是洗涤后细胞反应最强,细胞贫瘠血浆反应最弱。相反,当用一个多克隆抗体作为检测抗体,用单克隆抗体2/215或其类似物同时作捕获抗体时,细胞丰富血浆和细胞贫瘠血浆有显著的反应而洗涤细胞只有微弱的反应。进一步的免疫测试和流式细胞实验证实了这些结果。这些结果表明单克隆抗体2/215所结合的因子XIIa的抗原表位在它为细胞性因子时也可用,而当因子XIIa存在于细胞表面时它的供单克隆抗体201/9结合的抗原表位则不大能用。
脂结合因子的XIIa的免疫测试
一个免疫测试可以用单克隆抗体2/215或其类似物,或其片段如Fab片段,来进行。在捕获测试的情况下优先考虑用单克隆抗体2/215或其类似物作捕获抗体。一个不同的抗体如多克隆抗体或一个不同的单克隆抗体,或者相同的抗体可以用作检测抗体。
可以用一个直接的免疫测试如放射免疫测试。在这种情况下优先考虑用单克隆抗体2/215或其类似物,或其片段如Fab片段。合适的标记物的例子上文已经给出。
脂蛋白部分可以在样品与一种抗体结合之前或之后分离出来。可能与抗体结合之后再分离更有利。脂蛋白部分可以像上文“样品制备”部分所述来分离。
作为免疫测试的另一种选择,对脂蛋白结合因子XIIa的检测和(或)测定可以通过用生色底物量度其酶活性的方法来进行,见参考文献:Vinazzer H.,Thromb Res.,14,155-66,1979.这可能要一个将一到多种形式的因子从其他形式分离出来的步骤,如上文所述。对因子XIIa的分子复合物及其与其它种类分子的联合体的免疫测试
免疫测试可以用与其他形式分离的因子XIIa的复合物和因子XIIa与其他分子的联合体样品,也可以用未做这样的分离的样品。例如,如果希望,由两到多种形式的因子XIIa组成的分子复合物或与高亲和性或低亲和性结合伴侣联结的因子XIIa可用如上“不同形式因子XIIa的分离”部分所述的方法在对因子XIIa测试之前进行分离。例如,结合于低亲和性结合伴侣的αXIIa、结合于低亲和性结合伴侣的βXIIa,结合于低亲和性结合伴侣的βXIIa片段,结合于高亲和性结合伴侣的αXIIa,结合于高亲和性结合伴侣的βXIIa,结合于高亲和性结合伴侣的βXIIa片段,可以被分离。
任何上文所述免疫测试法都可以用来测定因子XIIa的复合物和因子XIIa与其他分子的联合体。如上所述,通常优先考虑用单克隆抗体2/215或其类似物作为抗体特别是捕获免疫测试中的捕获抗体。用来检测的标记抗体应当能够与被捕获的形式的因子XIIa结合。例如,标记抗体可以结合于因子αXIIa重链,因子βXIIa,或因子βXIIa的片段。
对尿液中因子XIIa的免疫测试和其他测试
任何上文所述免疫测试法都可能相对于其他形式选择性地测定尿液中的一到多种形式的因子XIIa。如上所述,通常优先考虑用单克隆抗体2/215或其类似物作为抗体特别是捕获免疫测试中的捕获抗体。
试剂盒
本发明还提供进行本发明的免疫测试的试剂盒,所述试剂盒包括装于单独的容器中或分区放置的如下产品:(i)一个可以结合一到多种形式的因子XIIa的单克隆抗体,如单克隆抗体2/215或其类似物或其他具有与单克隆抗体2/215或其类似物相同或相似的因子XIIa结合特性的单克隆抗体,和(ii)一个能与已经结合上(i)中的单克隆抗体的一到多种形式的因子XIIa结合的标记抗体。
试剂盒还可以包括进行如上所述的免疫测试所需的其他组分。单克隆抗体可以固定于固相支持物上。
一个根据本发明的试剂盒可以包括,例如,
a)一个可以结合一到多种形式的因子XIIa的单克隆抗体,如单克隆抗体2/215或其类似物或其他具有与单克隆抗体2/215或其类似物相同或相似的因子XIIa结合特性的单克隆抗体,
b)一个标准物,典型的是由一种含有已知量的一或多种形式的因子XIIa溶液组成,
c)一个能与已经结合上(i)中的单克隆抗体的一到多种形式的因子XIIa结合的标记抗体。
根据所用测试方法的不同,用作标准物和对照的材料可以有不同的形式。在一些测试方案中,合适的材料可以在水溶液中。因子XIIa及其片段,包括各种形式的因子XIIa。在其他方案中,比如在捕获抗体和检测抗体(偶联物)为同一种抗体的ELISA测试中,可能更好的是制作能包含许多因子XII分子及其片段的载体,例如将因子βXIIa结合于珠形物表面,如直径为3μM的聚碳酸脂珠。
更多的标准物的例子已在上文给出。可选择地,一个试剂盒也可包括标记的各种形式的因子XIIa用来进行竞争实验。
一个试剂盒还可以包括更多的组成,例如分别装于不同容器中的稀释液、洗涤试剂液(wash reagent solutions)和底物溶液。
测试装置
本发明还提供一套适合于进行本发明的测试的装置。此处“装置”是指进行免疫测试的办法,由一固相组成,通常是薄片形固相,如膜、一纸张形物、条形物、涂层、胶片或其他薄片形物体,在它们上面固定了适当的捕获抗体。所固定的捕获抗体最好在一固定区域,此处叫“抗原捕获区”。
一套测试装置可以是将固相整合于一刚性支持物或容器,容器中也可以包括一些或所有进行测试所需要的试剂。样品一般加于测试装置的一个预定的上样区,如将样品倾倒或滴于这个区域或将装置的相应部分浸泡于样品中。如果加样区与抗原捕获区在不同位置,通常是调整装置使样品中的抗原移到抗体捕获区。然后将所需试剂按恰当的顺序加于指定的区域,该区可能与上样区相同,也可能不同。同样,如果这个或任何其他试剂添加的位置与抗体捕获区不同,通常是调整装置使试剂移到检测所形成的抗原抗体复合物的抗体捕获区。一个免疫测试所需要的所有或部分试剂可以以液体或干的形式包括在装置内。如果这样,装置的安排需要做到装置不同部分之间在进行自动发生的或者操作者控制的反应中,各种试剂以正确的顺序相互接触发生反应,以使免疫测试得以进行。
免疫测试文献中介绍了很多种类的测试装置。膜类装置的例子见专利:U.S.Patents Nos.4,623,461和4,693,984。根据它们的设计和操作速度,一些装置被称为“浸泡棒”,一些被称为“快速测试”装置。“快速测试”装置通常在加样10分钟内给出结果。(一个典型的微量滴定板或珠形物上进行的反应需要一个孵育步骤,要得到结果通常要至少1小时。)因此,虽然用测试装置通常比微量滴定板或珠形物方案昂贵,它们在医疗检测中还是有特别用途,例如当需要快速知道结果时,如急诊的情况。
用测试装置的特别的优势在于它们可以无需复杂的实验室设备而得以进行,甚至可以不需要任何实验室设施。因此它们可以用作“及时照顾”的测试,例如在急诊室、手术中、配药时,或者某些情况下,家庭检测。它们在实验设施稀少的地区特别适用。
单克隆抗体
本发明涉及到使用优先于其他形式能选择性地与一到多种形式的活化的因子XII结合的单克隆抗体,例如单克隆抗体2/215或在与结合因子XIIa结合方面与单克隆抗体2/215具有相同或相似特性的单克隆抗体。
如上述,似乎当因子XIIa为细胞性因子,即与细胞或细胞组成物结合时,其抗原表位不像非细胞性因子XIIa那样全部可用。例如,单克隆抗体2/215既能与细胞性因子XIIa也能与非细胞性因子XIIa有效结合,而单克隆抗体201/9和一个针对因子βXIIa的绵羊多抗体似乎不能像结合非细胞性因子一样有效结合细胞性因子XIIa。
不局限于以下假设,看来单克隆抗体2/215能有效结合形成复合物或联合体后的因子XIIa所暴露的抗原表位。例如,当因子XIIa与细胞物质、脂质、一或多个其他的因子XIIa、或者高或低亲和性结合伴侣等形成复合物或联合体时。
在结合特定因子XIIa方面与单克隆抗体2/215和单克隆抗体201/9具有相同或相似结合特性的单克隆抗体可以用传统的方法制造,对所希望的结合特性也可以用传统的方法筛选。例如,能与一到多种特定因子XIIa结合的单克隆抗体,像在结合因子XIIa方面与单克隆抗体2/215有相同或相似结合特性的单克隆抗体,可以用此处已知的方法产生。可以从所得到的抗体筛选具有所需特征的抗体。
通常希望本发明所用单克隆抗体对因子XII酶原没有显著结合特性。对因子XII的校正交叉反应性是,比如0.1%或更低。本发明中评估一个抗体对因子XII的交叉反应性所要考虑的因素,是即便“纯”的因子XII制备物也几乎不可避免地被小量因子XIIa污染(Silverbergand Kaplan,Blood 60,1982,64-70)。专利WO90/08835给出了测定校正交叉反应性详细的方法。如未特别说明,此处“交叉反应性”是指校正的交叉反应性。
产生单克隆抗体的方法已广为人知,如参考文献:Methods in Enzymology,H.VanVunakis and J.J.Longone(Eds)1981,72(B);ibid,1983 92(E).单克隆抗体可以通过修改自Kohler和Milstein的方法产生(G.Kohler and C.Milstein,Nature,1975,256,495)。
专利WO90/08835收入此处用作参考,它以介绍了如何产生结合因子αXIIa和因子βXIIa且与因子XII校正交叉反应性为0.1%或更低的一般的方法。也给出了产生单克隆抗体2/215和201/9的特别细节。其中介绍的一般和特别的方法可以用来生产适合本专利用的单克隆抗体,比如在结合特定因子XIIa方面与单克隆抗体2/215和单克隆抗体201/9具有相同或相似结合特性的单克隆抗体。一个基于专利WO90/08835所公开的产生适合本专利用的单克隆抗体的操作流程,在下文实施例22给出。
产生单克隆抗体广为人知的方法,如参考文献:Methods in Enzymology,H.Van Vunakisand J.J.Longone(Eds)1981,72(B);ibid,1983 92(E).单克隆抗体可以通过修改自Kohler和Milstein的方法产生(G.Kohler and C.Milstein,Nature,1975,256,495)。用来产生单克隆抗体的免疫原可以是因子βXIIa,见专利WO90/08835。可以从所得到的单克隆抗体筛选那些与因子XII酶原没有显著结合特性,如与因子XII校正交叉反应性为0.1%或更低的单克隆抗体。
可以从得到的单克隆抗体筛选偏好与不同形式因子XIIa结合者,如偏好结合细胞性因子XIIa,脂质结合因子XIIa,或者是因子XIIa与其他因子XIIa、或与高或低亲和性结合伴侣所形成的复合物或联合体。
在筛选与特定形式的因子XIIa结合的抗体时,用单克隆抗体2/215或单克隆抗体201/9做参照是有利的。所选择的抗体可能与单克隆抗体2/215或单克隆抗体201/9有相同或相似的对所选择的形式的因子XIIa的结合特性。
虽然用于产生单克隆抗体2/215的杂交瘤来源于小鼠脾细胞,本专利不限于用鼠源或半鼠源杂交瘤。所用融合伴侣(脾细胞和骨髓瘤细胞)可以从任何合适的动物获得。也可以作重组抗体。如需要,抗体可以采用嵌合或人源化的形式。杂交瘤最好体外培养。
多克隆抗体
本发明还提供能与一到多种形式的因子XIIa选择性结合的多克隆抗体,也叫抗血清。这种抗体可以标记后用作检测ELISA中捕获的一到多种形式的因子XIIa。
本发明还提供一种生产这种多克隆抗血清的方法,包括向一动物免疫因子XIIa如βXIIa,从该动物收获血清,筛选到能与对一到多种形式的因子XIIa结合的血清。在一些情况下,因子XII可以用作免疫原。
本发明还包括一种从一研究对象尿液样品中检测或测定因子XIIa的方法。在这种情况下不必相对于其他形式而选择性地检测某一到多种形式的因子XIIa。可以用一个不区分不同形式的因子XIIa的测试方法。这种测试法可以是,比如生色测试和免疫测试。一个免疫测试的例子见WO90/08835介绍。
测试尿液样品中的因子XIIa,无论是“通用”方法还是能区分不同形式的因子XIIa的方法,都可以提供有关肾功能、肾脏疾病以及肾损伤的信息。因为尿液中因子XIIa的浓度是肾功能、肾脏疾病以及肾损伤的灵敏标记,特别是没有大量蛋白尿出现的情况下。相对于健康对象,尿液因子XIIa浓度升高意味着肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤。尿液因子XIIa浓度的变化可能是临床病情变化的指示,如治疗后状况恶化或是改善。
临床和其他用途
本发明,尤其是上文所述免疫测试方法,提供了一种可以容易地在自动化设备上大规模开展的检测和(或)测定不同形式的因子XIIa的方法。
因子XII及其活化形式因子XIIa,被认为参与了血液凝结和其他接触系统,也叫接触相系统,例如纤维蛋白溶解作用、补体级联系统、炎症和血管扩张,见参考文献:Jacobsen S.and Kriz M.,Br J Pharmaco1.,29,25-36,1967;Kurachi K et al,Biochemistry,19,1330-8 1980;Radcliffe R et al,Blood,50,611-7,1977;Ghebrehiwer B et al,J ClinInvest,71,1450-6.1983;Z Toossi et al,Proc Natl Acad Sci USA,89,11969-72,1992;Wachtfogel YT et al,Blood 67,1731-7,1986;Wachtfogel YT ea al,Thromb Haemost,80,686-91,1998;and Shreiber et al AD,J Clin Invest.,52,1402-9,1973.
因为因子XII和它的活化形式的因子XIIa参与了凝血,而且在维持血管完整和血压,在影响内皮细胞的多种功能,在控制纤维蛋白溶解和维持血管内组成性的抗凝因子等方面有发挥了功能,对特定形式因子XIIa的测定在包括纤维蛋白溶解系统、补体级联系统、血管扩张系统等系统在内的一些系统的研究中很有用。在与血栓形成和血管狭窄有关的研究中也是有用的。
临床和实验研究表明,包括因子XIIa在内的接触系统参与了急性和慢性炎症,包括脓毒性休克在内的病原不同的病原性休克,糖尿病,过敏,包括弥漫性血管内凝血在内的凝血一出血紊乱(thrombo-haemorrhagic disorder),癌症,心血管疾病如心肌梗塞、咽峡炎,急性冠状动脉综合症,血管发生,脓毒,自发性流产和血栓栓塞。
因子XIIa参与凝血,维持血管完整和血压,控制纤维蛋白溶解和维持血管内组成性的抗凝因子等支持了因子XIIa参与了凝血-出血(thrombo-haemorrhagic)紊乱包括弥漫性血管内凝血,癌症疾病,心血管问题如心肌梗塞、咽峡炎,急性冠状动脉综合症,血管发生和血栓栓塞的临床和实验观察。
我们的关于因子XIIa存在于激活/参与炎症过程的粒细胞上的惊人发现,支持临床和实验研究中关于因子XIIa参与了包括炎症如急性和慢性炎症,包括脓毒性休克在内的病原不同的病原性休克,过敏,肿瘤疾病和脓毒症的暗示。
因此检测和/或测定特定形式的因子XIIa对有接触系统参与的疾病和紊乱的临床和科学研究是有用的。研究包括对某些疾病或紊乱的易感性、进展或结果的诊断、监测或预测提供相关信息,或对患有或怀疑患有那些疾病或紊乱的人的治疗提供信息。这些疾病和紊乱包括急性和慢性炎症,包括脓毒性休克在内的病原不同的病原性休克,糖尿病,过敏,包括弥漫性血管内凝血在内的凝血一出血(thrombo-haemorrhagic)紊乱,血栓形成和血管狭窄,癌症,心血管疾病如心肌梗塞、咽峡炎,急性冠状动脉综合症,血管发生,脓毒症和自发性流产。
因此对一到多种形式的因子XIIa的检测或测定在对某些疾病或紊乱的感病性、过程或结果的诊断、检测或预测,对患有或怀疑患有那些与健康研究对象相比有一到多种形式的因子XIIa含量不同的疾病或紊乱的研究对象的治疗等目的上是有用的。一到多种形式的因子XIIa浓度的变化可能就是上面提到的那些疾病或紊乱的指示。一个研究对象体内因子XIIa浓度随时间的变化可能就是状况变化的指示,如对应于治疗的状况的恶化或改善。这种对那些疾病或紊乱的感病性、过程或结果的诊断、检测或预测,或者对那些疾病或紊乱的治疗的方法,称为“诊断、预测和监测”,是本发明的一部分。
另外,尿液中因子XIIa的浓度是肾功能、肾脏疾病以及肾损伤的灵敏标记,对尿液中因子XIIa的检测或测定可以为肾功能、肾脏疾病以及肾损伤提供有用信息。
诊断、预测和监测
本发明提供一套对某种疾病或紊乱的感病性、过程或结果的诊断、监测或预测,或对患有或怀疑患有那些疾病或紊乱的研究对象的治疗的方法。包括从研究对象样品中将一种或多种因子XIIa优先于其他形式的因子XIIa被检测或测定,并将该病人样本的测试结果与用相同方法测试从如下至少一种到多种获取的样本的结果进行比较:
(i)患有这种疾病或紊乱的研究对象;
(ii)患有这种疾病或紊乱的研究对象,该研究对象针对这种疾病或紊乱的过程和/或结果被监测;
(iii)患有这种疾病或紊乱并在接受治疗的研究对象;
(iv)患有这种疾病或紊乱并在接受治疗的研究对象,该研究对象针对这种的疾病或紊乱的过程或结果的治疗被监测;
(v)未患这种疾病或紊乱的研究对象;
(vi)同一研究对象在这种疾病或紊乱发作之前或在对这种疾病或紊乱治疗开始之前,以及
(vii)同一研究对象在这种疾病或紊乱早期或晚期,或在对这种疾病或紊乱治疗的早期或晚期,或在这种疾病或紊乱开始之前。
样品可以是上面描述的任一种。例如,样品可以是一种体液样品如全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液和泪液。
测试可以是针对一到多种形式的因子XIIa的检测和(或)测定。例如,选择任意一到多个形式的因子XIIa作为检测和/或测定对象,如任意一到多种形式的细胞性因子XIIa、脂结合因子XIIa和尿液因子XIIa的检测和/或测定。
相对于其他形式的因子XIIa,一个测试针对一种或几种形式的因子XIIa的高度专一性可以通过如上文所述的对测试方法的合理设计来达到或改进。对于免疫测试,这些设计包括:对所用抗体或抗体组合的一到数种选择,对去垢剂的加或不加以及所加去垢剂种类的选择,在需要将一种抗体包被到固相的介质上的抗原捕获测试时包被条件的选择,见上文描述。
对因子XIIa的测试可以是一种免疫测试。测试中使用一种能够结合所研究的一种或多种形式的因子XIIa相结合的抗体。在这种测试中,这种抗体被固定于一种固相介质上作为捕获抗体。
另外,可选择地,能结合所研究的一种或几种形式的因子XIIa的抗体用可以直接检测或间接检测的标记物标记。
在免疫测试中,所得到的抗原-抗体复合物可以被直接测定,如上文“免疫测试”部分所述。
免疫测试中能结合所研究的一种或几种形式的因子XIIa的抗体可以是单克隆抗体2/215或其类似物,单克隆抗体201/9或其类似物,或能结合因子XIIa和可选择地,也能结合因子XII的多克隆抗体。
在免疫测试中所用的单克隆抗体2/215或其类似物,单克隆抗体201/9或其类似物,或能结合因子XIIa的多克隆抗体,可以用能直接或间接检测的标记物标记和/或固定于一种固相介质上作为捕获抗体。
任何被一种明确的抗体所捕获的因子XIIa可以用一种标记的抗体来检测或测定,如上文所述。
所研究的疾病或紊乱可以是上文“临床用途”部分介绍的任何一种,例如凝血系统的疾病或紊乱;包括涉及血液凝结、纤维蛋白溶解作用、激肽原生成、补体激活和血管发生、维持血管完整和血压、维持血管内组成型抗凝因子、组织防御和修复等过程的疾病;包括急性和慢性炎症、病原休克、糖尿病、过敏、凝血-出血(thrombo-haemorrhagic)紊乱、脓毒症、自发性流产或肿瘤疾病等的情况;还有血管内凝血或血栓栓塞、血栓形成和血管狭窄、心肌梗塞、急性冠状动脉综合症或咽峡炎等疾病。
临床或病理情况的治疗可以包括施用药剂和/或外科手术。如对血栓栓塞和血管狭窄的治疗可能包括冠状动脉血管生成术和/或溶栓。
可能测试从一个研究对象得到的一系列样品更有利,如疾病或紊乱过程中所取样品,和/或这种疾病和紊乱治疗中和/或治疗开始前所取样品。
疾病或紊乱可能包括血栓栓塞和血管狭窄,治疗方法可能包括冠状动脉血管生成术和/或溶栓。在本发明的一个实施例中,为对这些疾病的发病状况和治疗的进展或结果进行诊断、监测或预测,所用的免疫测试可能是捕获测试,其中捕获抗体为单克隆抗体2/215或其类似物,标记抗体为抗因子XIIa的多克隆抗体,样品孵育步骤中不加去垢剂(三硝基甲苯(Triton))。测试结果(见实施例16)表明:当进行血管生成术或溶栓治疗之前和之后分别对因子XIIa的浓度进行测试时发现治疗因子XIIa的浓度增高,进而说明治疗是有效的。本测试可能是测定由两个或多个因子XIIa分子组成的分子复合物和/或由多个因子XIIa分子组成的颗粒。
疾病或紊乱也可以是未确诊的心肌梗塞或急性冠状动脉综合症。在预测这些疾病的过程或结果时,对不同形式的因子XIIa进行测试会得到不同的信息。
在本发明的另一个实施例中,免疫测试采用的是一种捕获测试方法,其中捕获抗体为单克隆抗体2/215或其类似物,标记抗体为标记的单克隆抗体2/215或其类似物,样品孵育(第一个)步骤中样品添加去垢剂(三硝基甲苯(Triton))。以住院开始取的样品作为测试样品,用2/215捕获抗体和2/215标记抗体进行测试。结果表明:低浓度的因子XIIa与首次住院期间次级肌钙蛋白阳性的风险加大是相互关连的(见实施例17)。
在本发明的第三个实施例中,免疫测试采用的是一种捕获测试方法,其中捕获抗体为单克隆抗体2/215或其类似物,标记抗体为标记的单克隆抗体201/9或其类似物,样品孵育(第一个)步骤中样品添加去垢剂(三硝基甲苯(Triton))。相对于其他形式的因子XIIa,该测试优先检测一些特定形式的因子XIIa。结果表明:以从住院开始取的样品作为测试样品,用2/215捕获抗体和201/9标记抗体进行测试,发现因子XIIa浓度的增高是住院期间30天内次级肌钙蛋白阳性风险加大的指示(见实施例17)。
在本发明的另一个实施例中,免疫测试采用的是一种捕获测试方法,其中捕获抗体为单克隆抗体2/215或其类似物,标记抗体为标记的抗因子XIIa的多克隆抗体,样品孵育(第一个)步骤中样品不添加去垢剂(三硝基甲苯(Triton))。相对于其他形式的因子XIIa该测试优先检测特定形式的因子XIIa。结果表明:以住院开始取的样品作为测试样品,用2/215捕获抗体和标记的抗因子XIIa的多克隆抗体进行测试,发现因子XIIa浓度相对于中间浓度的增高或降低是高死亡风险的指示(见实施例17)。本测试可能是测定由两个或多个分子的因子XIIa组成的分子复合物和/或由多个因子XIIa分子组成的颗粒。
疾病或紊乱也可以是脓毒症。在本发明的一个实施例中,样品用包括单克隆抗体2/215或其类似物进行免疫测试,测试结果表明:某些细胞性因子XIIa浓度的增加是脓毒症的指示。该结果与我们的在炎症过程中被激活的粒细胞或者参与炎症过程的粒细胞上有因子XIIa存在这一发现相吻合。这也支持了我们关于因子XIIa的假设一因子XIIa参与了涉及炎症的多种疾病。
如上文所述,尿液中因子XIIa是肾功能、肾脏疾病以及肾损伤的灵敏标记。本发明涉及到一种诊断或监测疾病或紊乱的方法。患有这些疾病或紊乱的研究对象与健康研究对象相比,其尿液中的因子XIIa,尤其是因子XIIa的浓度是不同的。本发明提供一种诊断或监测疾病或紊乱,或者对疾病和紊乱的治疗进行监测的方法。方法包括在患有或怀疑患有这些疾病或紊乱的研究对象的尿液中检测或测定因子XIIa,特别是因子XIIa的浓度。
例如,本发明提供一种对患有或怀疑患有肾功能问题、肾脏疾病以及肾损伤的研究对象的肾功能、肾脏疾病以及肾损伤情况或其治疗进行诊断或监测的方法。方法是监测或测定从这些研究对象所取样品的因子XIIa。
一般来讲从这些对象得到的结果要与同样方法测定的至少任何一种或几种源于如下对象的样品的结果进行比较:
(i)患有疾病的研究对象,如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤;
(ii)患有疾病的研究对象,如肾功题受损、肾脏疾病以及肾损伤。这些研究对象的疾病或紊乱如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤的进展或后果受到监测;
(iii)患有疾病的研究对象,如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤,并在进行治疗;
(iv)患有疾病或紊乱,如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤,并在进行治疗的研究对象,
这些研究对象的疾病或紊乱如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤的治疗情况的过程或后果受到监测;
(v)没有患有疾病或紊乱,如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤的研究对象;
(vi)同一研究对象,在紊乱或疾病如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤发作前,或在紊乱或疾病如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤的治疗开始前;
(vii)同一研究对象,在紊乱或疾病如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤本身或对它们的治疗的早期或晚期,或者在紊乱或疾病如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤开始前。
因子XIIa的检测或测定可以用相对于其他形式能选择性地检测或测定一种或几种形式的因子XIIa的检测或测定方法,也可以用不区分不同形式因子XIIa的检测或测定方法。
能提供有用临床信息的测试方法的确定
本发明的实践中,鉴定哪种特定形式的因子XIIa与特定的疾病或紊乱相联系并非必须。用简单的方法得知或确定一种特定形式的因子XIIa确实与一种疾病或紊乱有关联就够了,如与疾病或紊乱的产生、过程或结果有关联,或与对疾病或紊乱的治疗的效率或治疗结果有关联。
如上文所公开,早已知道因子XIIa参与了体内血液凝结的接触系统。更多的近期研究表明,因子XIIa还参与了其他血液凝结和补体激活相关的系统;还有进一步的临床和实验研究结果表明接触系统还参与了许多其他的情况。这些情况在上文“临床用途”部分有介绍。如下文将要介绍的,可以通过简单的方法弄清楚某种形式的因子XIIa是否在临床上与某种疾病或紊乱或者与一疾病或紊乱的治疗相关联。
因此,本发明不限于那些现在已经知道的与因子XIIa相关联的疾病或紊乱。可以通过简单的方法确定是否有一个关于因子XIIa与某疾病和紊乱的临床关联存在。
本发明提供一种方法,包括对从一个患有某疾病或紊乱,或者在对某疾病或紊乱进行治疗的研究对象得来的样品的因子XIIa进行一系列的测试;还包括选择一个能对有关疾病或紊乱或其治疗与因子XIIa水平之间的关系提供信息的测试。
本发明还提供一种对因子XIIa进行测试的一种方法,它适合对某些疾病或紊乱的易感性、进展或结果的诊断、监测或预测提供相关信息,或对患有或怀疑患有那些疾病或紊乱的人的治疗提供相关信息。这包括对来源于患有疾病或紊乱或在接受治疗的研究对象的样品的因子XIIa进行一系列的测试,并决定选择哪一个(几个)测试结果来为某些疾病或紊乱的易感性、进展或结果的诊断、检测或预测提供相关信息,或对那些疾病或紊乱的治疗提供相关信息。
这种方法最好包括对来源于患有疾病或紊乱或正在接受治疗的研究对象的样品的因子XIIa进行测试,测试结果与采用同样方法测定的至少任何一种或几种源于如下研究对象的样品的因子XIIa进行测试所得的结果进行比较:
(i)患有这种疾病或紊乱的研究对象;
(ii)患有这种疾病或紊乱的研究对象,同时对其这种疾病或紊乱的过程或结果进行了监测;
(iii)患有这种疾病或紊乱并在接受治疗的研究对象;
(iv)患有这种疾病或紊乱并在接受治疗的研究对象,同时对治疗对其这种疾病或紊乱的过程或结果进行了监测;
(v)未患这种疾病或紊乱的研究对象;
(vi)在这种疾病或紊乱发作之前或在对这种疾病或紊乱治疗开始之前的同一研究对象,以及
(vii)在疾病或紊乱早期或晚期,或在对这种疾病或紊乱治疗的早期或晚期,或在这种疾病或紊乱发作之前的同一研究对象。
所分析的样品最好是从各种研究对象如处于这种疾病或紊乱发病过程中或治疗过程中的各种的研究对象所获得的一系列的样品。
所用测试可以是上文所描述的与本发明实践相关的测试中的任意一种,包括免疫测试和其他测试方法。根据本发明,如果用某一特定的测试方法发现某一或某些形式的因子XIIa与一种疾病或紊乱或与对它们的治疗在临床上有关联,那么这种测试方法就可以用作对某些疾病或紊乱的易感性、进展或结果的诊断、检测或预测提供相关信息,或对那些疾病或紊乱的治疗提供相关信息。见上文描述。
按照各种测试与各种病情状况的关系将所得结果收集并组织起来形成一个数据库可能是有用的。该数据库能够用来对对从所研究的特定研究对象上得到的结果进行辅助解释。这样一个收集并组织结果建立的数据库的方法也是本发明的一部分。
可见,存在不同形式因子XIIa的发现,不同形式因子XIIa水平与不同的疾病或紊乱以及它们的治疗具有临床关联的发现,具有更加广泛的实际用途。超越了传统的与因子XIIa有关联的血液凝结系统,也超越了迄今为止已经证实的与因子XIIa有关联的疾病和紊乱的实际用途。
本发明通过下面的实施例(不只局限于这些实施例)进行描述。
实施例
实施例1
本实施例用荧光标记抗体结合的方式显示了血清出中存在多种因子XIIa,并根据分子量的不同用高效液相色谱(HPLC)分离了抗原抗体结合复合物。
抗体2/215按照试剂使用说明用异硫氰酸荧光素(FITC)(Pierce,3747 N Meridian Road,PO Box 117,Rickford,IL 61105)标记。
HPLC系统包括:Waters 1525双泵,Waters 2487双波长吸收检测器,和一个Jasco FP1520荧光检测器组成。
HPLC的流动相为0.1M NaCl、0.05M Tris HCl,0.4%(W/V)Tris-柠檬酸钠pH 7.5。固定相为一系列2×30cm BioSep-SEC-S 3000层析柱(Phenomenex,Queens Avenue,HurdsfieldIndustrial Estate,Macclesfield,Cheshire SK10 2BN,United Kingdom)。流速为1ml/分钟,进样体积为100μl。Jasco荧光检测器的设置为:激发波长494nm,发射波长520nm,放大倍数为1000,衰减为1。
在HPLC系统上分离的样品有:FITC标记的抗体2/215,血清样品,与FITC标记的抗体2/215孵育4小时的血清样品(250μl血清加1μl FITC标记的抗体)。
荧光对时间的曲线的例子见图2a到2d。
图2a中,从血清样品的示踪可见血清样品有自发荧光。图2b显示的是FITC标记的抗体的荧光。图2c显示的是与FITC标记的抗体孵育的血清样品的荧光,可见比2a和2b多出了一些峰,从而表明FITC标记的抗体能与血清样品中的几个组分相结合。这在图2d的示踪图中得到进一步显示,此图中血清自发荧光和FITC标记抗体自身的荧光被减除,从而所得荧光示踪结果就只反映了抗体与血清物质之间的结合。
实施例2
本实施例用与放射性(I125)标记的抗体片段结合的方式显示了血清中存在多种活化因子XII,并根据分子量的不同用高效液相色谱(HPLC)分离了结合复合物。
抗体2/215Fab片段用试剂盒“免疫纯Fab制备试剂盒”(Pierce,3747 N Meridian Road,PO Box 117,Riekford,IL 61105,U.S.A),按其操作手册制备。所得2/215Fab片段由AmershamPharmacia Biotech公司(Pollards Wood,Nightingales Lane,Chalfont St Giles,HP8 4SPUnited Kingdom)进行碘125放射标记。
从健康志愿者的1ml血清中加1μl放射性标记抗体片段。孵育4小时后,用高效液相色谱(HPLC)分离血清组分。HPLC系统为Agilent 1100系统。
HPLC的流动相为0.1M NaCl,0.05M Tris HCl,0.4%(W/V)Tris-柠檬酸钠pH 7.5。固定相为一组2×30cm BioSep-SEC-S 3000层析柱(Phenomenex,Queens Avenue,HurdsfieldIndustrial Estate,Macclesfield,Cheshire SK10 2BN,United Kingdom)。流速为0.7ml/分钟,进样体积为100μl。
HPLC洗脱组分用自动组分收集仪收集,设置为20秒收集一个部分。每个收集部分的放射性用多孔液闪计数仪测定。
图3给出了一个放射性对时间的曲线图例,可以看到其中有多个峰,表明放射性标记的抗体片段已经与血清中的不同组分结合。
实施例3
微量滴定板测定细胞性因子XIIa
向板上预先包被有单克隆抗体2/215的孔中各加100μl等分的样品。孵育60分钟后,以硼酸缓冲液(pH7.4)洗板。然后向每孔加入100μl的相应的偶联物(碱性磷酸酶标记的抗体),再孵育60分钟。再次进行洗板后,加入100μl的酚酞磷酸盐底物。孵育合适时间后,加入碱性终止液抑制进一步的底物转换发应,于550nm测定吸光值。
方法
从志愿者收集的血液分置于两个用柠檬酸盐处理过的离心管中,以1000g离心10分钟分离血红细胞。分离的血浆并到一块以消除不同管之间的差异。一部分血浆以1ml等分分装于离心管,并标明“细胞丰富血浆”。
剩下的血浆等分后在小型离心机中以16000g高速离心10分钟。收集分离到的上清液,并标明为“细胞稀少血浆”。沉淀通过100mM pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)悬浮洗涤,于16000g离心10分钟,弃去上清液。沉淀再以同样的方法洗两次,然后用PBS重新悬浮,并标明“洗后细胞”。
所得的3种样品(细胞丰富血浆,细胞稀少血浆和洗涤后细胞)用上述微量滴定板测试的方法测试。用单克隆抗体2/215捕获细胞性因子XIIa,用标记的单克隆抗体2/215(2/215偶联物)或多克隆抗体(多克隆抗体偶联物)检测捕获的细胞性因子XIIa。
结果
测试结果见表1。由于没有可用的双2/215抗体(捕获抗体和检测抗体)测试的标准对照,以2/215偶联物得到的结果以吸光值表示。对吸光值进行归一化数据处理,结果的图示见图4a和4b。
表1.对不同样品用多克隆抗体偶联物和2/215偶联物的微量滴定板测试结果
样品 | XIIaMTP多克隆抗体偶联物 | A550MTP2/215偶联物 |
细胞稀少血浆 | 3.5 | 0.209 |
洗涤后细胞 | <0.1 | 1.442 |
细胞丰富血浆 | 3.6 | 0.753 |
从表1和图4a及图4b可见,用多克隆抗体偶联物进行测试时,细胞丰富血浆和细胞稀少血浆中都得到了显著的应答,而洗涤后细胞中只有微弱的应答。相反,当用2/215偶联物进行测试时,从洗涤后细胞中得到最大应答,而从细胞稀少血浆中得到最低应答。
实施例4
对细胞性因子XIIa的IMx测试
Abbott IMx系统是一种用酶免疫测试和荧光极化免疫测试技术来进行测试的自动免疫测试分析仪。
在这些实施例中所用的技术是微粒酶免疫测试(MEIA,microparticle enzymeimmunoassay).MEIA技术采用了一种能特异的捕获所测试分子的捕获分子(此处为抗体)包被的微粒。微粒表面的有效表面和分析物与固相间的扩散距离的有效性等方面的优势使测试动力学得以改进,进而使MEIA测试能比其他免疫测试更快速地完成。微粒及结合其上的分析物通过与MEIA反应孔中的玻璃纤维基质的不可逆结合而从反应体系混合物中得到分离。MEIA测试所需的反应物如下:
●包被有捕获分子(此处为单克隆抗体2/215)的微粒
●碱性磷酸酶标记的偶联物(此处为针对活化因子XII的抗体——多克隆抗体或单克隆抗体2/215)
●荧光发生底物,4-甲基伞形酮酰磷酸盐(4-methylumbelliferyl phosphate)(MUP)
●含有能结合免疫反应复合物的玻璃基质的反应孔。
还有其他试剂如稀释溶液和/或洗涤溶液。
下面是MEIA反应过程的描述:
1.IMx系统将样品和微粒(包被有捕获分子)转移到反应室的孵育孔。通过一段孵育时间,分析物与微粒相结合,得到免疫反应复合物。
2.IMx系统将一等份免疫反应复合物转移到反应室内部的玻璃纤维基质上。免疫反应复合物不可逆地结合于玻璃纤维基质。IMx系统洗涤基质以除去未结合物质,免疫反应复合物被保留于玻璃纤维而多余的反应混合物从基质里的大孔中快速流出。
3.IMx系统向基质添加碱性磷酸酶标记的偶联物。偶联物结合于免疫反应复合物,形成抗体-分析物-偶联物的“三明治”状。IMx系统再次洗涤基质。
4.IMx系统向基质中加入荧光发生底物4-甲基伞形酮酰磷酸盐(4-methylumbelliferylphosphate)(MUP)。偶合物催化4-甲基伞形酮酰磷酸盐(4-methylumbelliferyl phosphate)(MUP)水解为4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone)(MU)
5.IMx仪器中的光学系统测量玻璃纤维基质上荧光产物(MU)产生的速率。玻璃纤维基质上荧光产物(MU)产生的速率与测试样品中的分析物的浓度成正比。
下面描述的IMx实验所用的操作步骤展开于附图5。
方法和结果
将从一个志愿者收集来的血液置于6个柠檬酸盐处理过的离心管,1000g离心10分钟分离血红细胞。所用管中分离的血浆并到一起以消除不同收集管间的差异。其中一部分血浆以1ml的等分分装于离心管中,并标明“细胞丰富血浆”。
其余血浆等分并高速离心(16000g离心10分钟)。收集分离得到上清并标明“细胞稀少血浆”。沉淀通过100mM pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)悬浮洗涤,于16000g离心10分钟,弃上清。沉淀再以同样的方法洗两次,然后用PBS重新悬浮,并标明“洗后细胞”。所得的3种样品(细胞丰富血浆,细胞稀少血浆和洗涤后细胞)像实施例3一样采用微量滴定板测试的方法测试。测试既用2/215偶联物也用多克隆抗体偶联物。样品同时也用AbbottIMx自动免疫测试仪测定活化的因子XII。与实施例3不同,测试中采用碱性磷酸酶标记的单克隆抗体201/9和2/215来检测细胞性因子XIIa偶联物。所得微量滴定板测试结果见图6a和6b,用IMx测试所得结果见图7a和7b。
如图6a和6b所示,用多克隆抗体偶联物进行的微量滴定板测试中,细胞丰富血浆和细胞稀少血浆都得到强应答,而细胞悬浮物中应答微弱。而当用2/215偶联物进行测试时,有最强应答的是细胞悬浮物,细胞丰富和细胞稀少血浆的应答低了很多,以细胞稀少血浆的应答最弱。
如图7a和7b所示,用201/9偶联物进行IMx系统测试时,应答强烈的为细胞丰富和细胞稀少血浆而应答最弱的是细胞悬浮物。当用2/215偶联物进行IMx系统测试时,应答强烈的为细胞悬浮物和细胞丰富血浆,而细胞稀少血浆的应答降低了很多。
实施例5
细胞性因子XIIa的流式细胞技术分析
用流式细胞技术来测试单克隆抗体2/215是否结合血浆细胞上的因子XIIa是另外一种可选择的方法。
单克隆抗体2/215用FITC标记。FITC标记的2/215与细胞丰富血浆孵育,同时将一个对照组(未加标记抗体)以流式细胞技术测试。所得结果见图8a和图8b。图8a显示的是从没有加标记抗体的血浆得到的结果,图8b显示的是从与标记抗体孵育的血浆得到的结果。
对比图8a和图8b,添加FITC标记抗体后峰的右移表明抗体已经与血浆中的细胞结合。
实施例6
用与放射性标记的抗体孵育的方法测定细胞性因子XIIa
另一个定性和定量测定细胞性因子XIIa的方法是将放射性标记的2/215抗体加到全血或血浆样品中,通过离心分离细胞,然后测定结合于这一部分的放射性的量。
单克隆抗体2/215用碘125标记。全血样品来自8个志愿者,样品与放射性标记的抗体一起孵育。然后用低离心力(1000g)离心去除血红细胞,其他细胞(包括血小板和白细胞)用高离心力(16000g)离心分离。离心得到的细胞团块用100mM pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)悬浮洗涤,于16000g离心10分钟,弃去上清液。沉淀再以同样的方法洗两次,然后用PBS重新悬浮,并标明“悬浮细胞”。
测定结合在这一细胞物质上的放射性的量以及与因子XIIa结合的抗体上放射性的总量(相对于于自由抗体),据此计算细胞性因子XIIa在细胞组分中的因子XIIa的比例。
表2给出了所加抗体中结合于细胞性因子XIIa的抗体的百分率和与细胞内所有因子XIIa结合的抗体的比例。由表2可见,有大量且种类较多的细胞性因子XIIa。图9以图示的方式表明了8个个体的细胞性因子XIIa的相对浓度。
表2结合于细胞性因子XIIa的抗体百分率和与细胞部分因子XIIa结合的抗体的比例
献血者 | 所加抗体中结合于细胞性因子XIIa的百分率(%) | 与细胞内所有因子XIIa结合的抗体的比例(%) |
5 | 2.99 | 23 |
6 | 3.96 | 32 |
7 | 2.30 | 28 |
8 | 3.77 | 34 |
9 | 1.81 | 20 |
10 | 0.68 | 11 |
11 | 0.86 | 12 |
12 | 1.20 | 14 |
实施例7
“因子XII缺陷”个体的细胞性因子XIIa
收集“健康”志愿者和被视为因子XII完全缺失的志愿者(以检测因子XII抗原的ELISA测试测定因子XII,抗体来自公司ERL,15 Skelty Rd,Swansea,UK;也用凝结实验来测定因子XII(见参考文献:Griffin,J.H.& Cochrane,C.G.,in Methods in Enzymology,Academic Press(New York)45,56-65,1976))的柠檬酸盐处理的血样。以1000g离心10分钟分离细胞。各个体不同管的血浆汇集一处消除管间差异。一部分血浆以1ml等分分装于离心管,并标明“细胞丰富血浆”。
剩余血浆进行等分,在一小型离心机高速离心(16000g离心10分钟)。收集上清并标明“细胞稀少血浆”。沉淀通过100mM pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)悬浮洗涤,于16000g离心10分钟,弃上清。沉淀再以同样的方法洗两次,然后用PBS重新悬浮,并标明“悬浮细胞”。
所得样品(细胞丰富血浆,细胞稀少血浆,悬浮细胞)用2/215偶联物和多克隆抗体偶联物进行微量滴定板免疫测试,同实施例1一样。样品用Abbott IMx自动免疫测试仪来测定活化的因子XII,同实施例4一样。此处用来检测细胞性因子XIIa的偶联物为过氧化物酶标记的单克隆抗体201/9和2/215,与实施例3不同。
惊人的发现:在“因子XII完全缺失”的个体中检测到细胞性因子XIIa应答,结果见图10a,10b,11a,11b,12a,12b,13a和13b。
循环的因子XIIa源自肝脏。因为“因子XIIa完全缺失”个体在其体液中没有循环的因子XIIa,与细胞结合的因子XIIa就不可能是通过吸收体液中的因子XII或因子XIIa而形成的,所以其细胞性因子XII和因子XIIa一定由其它来源产生。据认为有可能一些其他的细胞系也可能产生因子XII,如淋巴细胞或巨核细胞。
实施例8
本实施例通过向血浆中添加放射性示踪剂(碘125)标记的单克隆抗体2/215抗体片段,沉淀脂蛋白,进而测定与沉淀的脂蛋白结合的放射性的量来显示与脂质结合的因子XIIa的存在。
抗体2/215Fab片段用“免疫纯Fab制备试剂盒”(Pierce,3747 N Meridian Road,POBox 117,Rockford,IL 61105)按操作手册制备。所得Fab片段由公司Amersham PharmaciaBiotech(Pollards Wood,Nightingales Lane,Chalfont St Giles,HP8 4SP United Kingdom)进行碘125标记。
柠檬酸盐血浆样品来自于12个健康志愿者(6男6女)。
向取自各志愿者的1ml血浆加入1μl放射性标记抗体。4小时孵育后,血浆以12000g离心10分钟去除细胞成分。通过向上清中加入沉淀剂(含500mM NaCl,215mM MnCl2和500U/ml肝素)来沉淀脂蛋白,每400μl上清加300μl沉淀剂。加入沉淀剂后混匀,孵育10分钟,于12000g离心10分钟。移除上清,将沉淀悬浮于1ml沉淀剂、12000g离心10分钟并除去上清的以洗涤脂蛋白沉淀并除去液相残留因子XIIa。洗涤过程重复3次后,用多孔液闪计数仪测定沉淀物质的放射性。
图14显示的是从1取自2个志愿者的样品中脂质结合因子XIIa的水平。从图14可见,尽管所有测试样品中都有脂质结合因子XIIa的存在,但不同个体之间脂质结合因子XIIa的浓度还是有明显的差异的。
实施例9
本实施例通过向血浆添加放射性示踪剂(碘125)标记的2/215抗体片段,沉淀脂蛋白,测定与沉淀的脂蛋白联结的放射性强弱来显示脂质结合的因子XIIa的存在。
抗体2/215Fab片段用“免疫纯Fab制备试剂盒”(Pierce,3747 N Meridian Road,PO Box117,Rockford,IL 61105)按操作手册制备。所得Fab片段由Amersham Pharmacia Biotech公司(Pollards Wood,Nightingales Lane,Chalfont St Giles,HP8 4SP United Kingdom)进行碘125标记。
柠檬酸盐血浆从64个因胸痛住院的病人获得。
向来自各志愿者的1ml血浆加入5μl放射性标记抗体。孵育3小时后,血浆以16000g离心10分钟去除血浆中的细胞成分。通过向每200μl血浆加500μl含51.54mM磷钨酸、0.07M MgCl2,并以NaOH调至pH6.15的沉淀剂沉淀脂蛋白。加入沉淀剂混匀,孵育10分钟,于16000g离心10分钟。移除上清,通过将沉淀悬浮于1ml沉淀试剂、16000g离心10分钟并除去上清的方式洗涤脂蛋白沉淀以除去液相残留因子XIIa。洗涤过程重复3次后,用单孔液闪计数仪(Lab Logic,St John’s House,131 Psalter Lane,Sheffield,England S118UX)测定沉淀物质的放射性。
图15显示的是从64个病人获得的脂质结合因子XIIa的水平。从图15可见,尽管所有测试样品中都有脂质结合因子XIIa的存在,在不同个体间还是有明显的差异。
实施例10
本实施例用微量滴定板ELISA免疫测试的方法来显示脂质结合因子XIIa的存在。血浆样品的脂蛋白通过针对一个存在于脂蛋白颗粒表面的蛋白的抗体而被捕获。然后通过添加碱性磷酸酶标记的单克隆抗体2/215的方法来显示因子XIIa的存在。
柠檬酸盐血采自8位健康志愿者。
向预先包被有抗β-脂蛋白的山羊多抗(Sigma,The Old Brickyard,New Road,Gillingham,Dorset,UK)的微量滴定板孔加入等分的100μl柠檬酸盐血浆。孵育60分钟后,以硼酸盐洗涤缓冲液(pH7.4)洗板。向每孔加入100μl含碱性磷酸酶标记的2/215抗体的偶联物,再孵育60分钟。再洗板,然后加入100μl酚酞磷酸盐底物。孵育30分钟后,加入碱终止液抑制进一步的底物转换,于550nm测定光吸收。
图16显示的是用上述方法测定8个志愿者的脂质结合因子XIIa的浓度。由图可见,尽管所有样品中都存在脂质结合因子XIIa,但是不同个体间的浓度有明显的差异。
实施例11
尿液因子XIIa的微量滴定板测试
从5个健康男性志愿者采集5个正常随机尿样。用如下描述的微量滴定板测试方法测试样品中因子XIIa的存在。
向预先包被有单克隆抗体2/215的微量滴定板孔加入等分的100μl尿样。孵育60分钟后,以硼酸盐洗涤缓冲液(pH7.4)洗板。向每孔加入100μl偶联物(碱性磷酸酶标记的绵羊抗人βXIIa多抗),再孵育60分钟,洗板,然后加入100μl酚酞磷酸盐底物。孵育合适时间后,加入碱终止液抑制进一步的底物转换,于550nm测定光吸收。通过与从含有已知量的因子βXIIa的标准溶液所得到的光吸收值的比较来计算样品因子XIIa的浓度。尿液因子XIIa的浓度结果见表3。
表3.从健康男性随机采集的尿样因子XIIa浓度的微量滴定板测试
志愿者 | XIIa(ng/ml) |
1 | 0.9 |
2 | 1.6 |
3 | 1.8 |
4 | 1.8 |
5 | 1.0 |
实施例12
尿液因子XIIa的IMx测试
从5个随机的健康男性志愿者采集尿样。用多克隆抗体偶联物和如上述实施例4描述的IMx测试法测定这些样品中的因子XIIa。所得尿液因子XIIa浓度见表4。
表4.IMx法测定的源于健康男性志愿者的随机尿样因子XIIa浓度
志愿者 | XIIa(ng/ml) |
A | 0.5 |
B | 3.3 |
C | 2.8 |
D | 2.3 |
E | 0.9 |
实施例13
本实施例通过与荧光标记的抗体结合并根据结合因子XIIa的抗体与未结合的抗体分子量大小差异用高效液相色谱(HPLC)分离的方法来显示尿液因子XIIa的存在。
抗体2/215按照试剂使用说明用FITC(异硫氰酸荧光素,Pierce,3747 N Meridian Road,PO Box 117,Rickford,IL 61105)标记。
HPLC系统由一个Waters 1525双泵,一个Waters 2487双波长吸收检测器)),和一个Jasco FP1520整体荧光检测器组成。
HPLC的流动相为0.1M NaCl,0.05M Tris HCl,0.4%(W/V)Tris-柠檬酸钠pH 7.5。固定相为一组2×30cm BioSep-SEC-S 3000层析柱(Phenomenex,Queens Avenue,HurdsfieldIndustrial Estate,Macclesfield,Cheshire SK10 2BN,United Kingdom)。流速为1ml/分钟,进样体积为100μl。Jasco荧光检测器的设置为:激发波长494nm,发射波长520nm,放大倍数为1000,衰减为1。
在HPLC系统上分离的样品有:单独的FITC标记的抗体2/215,单独的尿液样品,单独的与FITC标记的抗体2/215孵育4小时的尿液样品(250μl加1μl FITC)。
荧光对时间的曲线的例子见图17a到17d。
图17a中,从尿液样品的示踪可见尿液样品有自发荧光。图17b显示的是FITC标记的抗体的荧光。图17c是与FITC标记的抗体孵育的尿液样品的荧光,可见比17a和17b多出了一些峰。这表明FITC标记的抗体与尿液样品中的几个组分结合。这在图17d的示踪图中得到进一步显示,此图中与内源荧光素相关的信号和单独FITC标记的抗体的信号被衰减,所得荧光示踪结果就反应了尿液物质与抗体的结合。
实施例14
本实施例用与放射性(I125)标记抗体片段结合的方式显示了尿液中存在多种活化因子XII,并根据分子量的不同用高效液相色谱(HPLC)分离了结合复合物。
所用HPLC系统为Agilent 1100 HPLC系统。
抗体2/215Fab片段用试剂盒“免疫纯Fab制备试剂盒”(Pierce,3747 N Meridian Road,PO Box 117,Rickford,IL 61105,U.S.A),按其操作手册制备。所得2/215Fab片段由AmershamPharmacia Biotech公司(Pollards Wood,Nightingales Lane,Chalfont St Giles,HP8 4SPUnited Kingdom)进行碘125标记。
向健康志愿者的1ml尿液中加1μl放射性标记抗体片段。孵育4小时后,用高效液相色谱(HPLC)分离尿液组分。
HPLC的流动相为0.1M NaCl,0.05M Tris HCl,0.4%(W/V)Tris-柠檬酸钠pH 7.5。固定相为一组2×30cm BioSep-SEC-S 3000层析柱(Phenomenex,Queens Avenue,HurdsfieldIndustrial Estate,Macclesfield,Cheshire SK10 2BN,United Kingdom)。流速为0.7ml/分钟,进样体积为100μl。
HPLC洗脱组分用自动组分收集仪收集,每20秒收集一个部分。每个收集部分的放射性用多孔液闪计数仪测定。
图18给出了一个放射性对时间的曲线图例,可以看到除未结合抗体峰外的另一个峰,表明放射性标记的抗体片段已经与尿液中的不同组分结合。
实施例15
本实施例显示了进行经皮腔内冠状动脉成型术的病人的各种形式因子XIIa的不同反应。样品取自于进行冠状动脉成型术病人在术前、术后和术后5天时。样品用两种偏好测定特定形式的因子XIIa的方法测试。
在测试1中,单克隆抗体2/215以15μg/ml的碳酸氢钠包被缓冲液(pH.9.6)包被于Nunc(Nunc A/S,Karustrupuej 90,P O Box 280,4000Roskilde,Denmark)Maxisorbmicroplate(每孔包被100μl抗体)。75μl含0.5%(v/v)(三硝基甲苯(Triton))X-100(Sigma,Fancy Road,Poole,Dorset,England)的血浆加入微量滴定板孔,室温孵育60分钟。洗涤微量滴定板孔后,加入100μl偶联物。该偶联物为碱性磷酸酶标记的单克隆抗体201/9。孵育60分钟后再次洗涤微量滴定板孔,然后加入100μl含酚酞磷酸盐的底物溶液。室温孵育60分钟后用强碱性溶液(50g/l碳酸氢钠,pH 10.5)终止反应,然后在550nm测定光吸收。
在测试2中,抗体2/215以2μg/ml的磷酸盐包被缓冲液(pH.7.4)包被于NuncMaxisorbmicroplate(每孔包被100μl抗体)。75μl不含(三硝基甲苯(Triton))X-100的血浆加入微量滴定板孔,室温孵育60分钟。洗涤微量滴定板孔后,加入100μl偶联物。该偶联物包含碱性磷酸酶标记的抗因子XII的多克隆抗体(Enzyme Research Laboratories,SkeltyRoad,Swansea,UK)。孵育60分钟后再次洗涤微量滴定板孔,然后加入100μl含酚酞磷酸盐的底物溶液。室温孵育60分钟后用强碱性溶液(50g/l碳酸氢钠,pH 10.5)终止反应,然后在550nm测定光吸收。
图19显示的是从-个个体得到的数值的典型模式。可见,测试1所选择性测定的各种形式的因子XIIa的浓度在内冠状动脉成型术病人术前、术后和术后5天所取样品中的变化很小。这与测试2选择性测定的各形式的因子XIIa的浓度的变化明显对立。测试2中手术刚完时测得数值明显大幅增加,在术后5天回复到术前水平。
图20显示测试2所测试的不同的进行冠状动脉成型术病人中,特定形式的因子XIIa的反应不同。病人S0216在术后因子XIIa表现出增加,在术后5天增加更多。病人S0974的因子XIIa仅表现出小量增加,而病人S0811和病人S0909的因子XIIa在手术以后表现出增加,在5天后回复到与术前类似甚至更低。这些应答的不同反映了对涉及因子XIIa的生理系统的激活程度的不同,从而能够指示冠状动脉成型术手术过程的效率。
实施例16
本实施例显示了进行溶栓治疗的病人各形式的因子XIIa的不同反应。
样品取自于进行溶栓治疗病人在治疗前、治疗后和治疗后5天时。样品用两种偏好测定特别形式的因子XIIa的方法测试。所用测试,即测试1和测试2,如实施例15所描述。
图21显示的是从一个个体得到的数值的典型模式。可见,测试1所选择性测定的各种形式的因子XIIa的浓度在溶栓治疗病人疗前、疗后和疗后5天所取样品中的变化很小。这与测试2选择性测定的各形式的因子XIIa的浓度的变化明显对立。测试2中溶栓治疗刚结束时立即测得数值明显大幅增加,在疗后5天回复到疗前水平。
图22显示测试2所测试的不同的溶栓治疗病人中,特定形式的因子XIIa的反应不同。病人S0684的溶栓治疗对因子XIIa水平变化影响不大。病人S0685在治疗后和治疗5天后因子XIIa水平逐渐降低,而病人S0693溶栓治疗后因子XIIa水平大幅增加,治疗5天后回复到辽前水平。这些反应性的不同反映了对涉及因子XIIa的生理系统的激活程度的不同,从而能够指示溶栓治疗的效果。治疗前后所测得数值无明显变化的两个病人在几天内死去的事实证实了这一结论,而溶栓治疗后测得数值表现明显增加的病人在至少30天内没有出现事故。
实施例17
本实施例显示的是通过对因怀疑为心肌梗塞和急性冠状动脉综合症的住院病人的特定形式的因子XIIa的测定来为其复发心肌梗塞或心死亡提供预测。
数据来自于820名住院病人。每个病人的因子XIIa水平用几个不同测试法测定,因此也测定了不同形式的因子XIIa。研究每个测试结果,看在住院初期或入院30天后,它是否能为出现继发肌钙蛋白阳性事件(心肌梗塞)或心死亡的基本治疗终点提供预测。
通过对选择性测定不同种形式因子XIIa的各个测试方法得到的因子XIIa测量值结果排列(从最低到最高)来确定测试方法的诊断作用。将测试的人群分为4部分,即具有最低因子XIIa浓度值的205个个体为四部分中的第一部分,而具有最高因子XIIa浓度值的205个个体为四部分中的第四部分。
结果发现不同形式的因子XIIa为不同临床结果的风险因子。因此,检测不同形式的因子XIIa的不同方法,为各种不同结果的临床使用提供了最好的方法。。
当以初始入院后的住院期内出现继发肌钙蛋白阳性事件(心肌梗塞)或心死亡的基本治疗终点来评估时,发现最好的诊断指示是一个据信能测含有多个因子XIIa分子的复合物和/或颗粒的测试。因为除了其它因素,样品未与能打断样品中因子XIIa复合物或与颗粒结合的因子XIIa的去垢剂接触。
所用测试是一个微量滴定板形式的免疫测试,其中单克隆抗体2/215包被于NuncMaxisorb微量板上。单克隆抗体2/215以2μg/ml的磷酸盐包被缓冲液(pH.7.4)包被于NuncMaxisorb microplate(每孔包被100μl抗体)。75μl不含(Triton)X-100的血浆加入微量滴定板孔,室温孵育60分钟。洗涤微量滴定板孔后,加入100μl偶联物。该偶联物为碱性磷酸酶标记的同一抗体。孵育60分钟后再次洗涤微量滴定板孔,然后加入100μl含酚酞磷酸盐的底物溶液。室温孵育60分钟后用强碱性溶液(50g/l碳酸氢钠,pH10.5)终止反应,然后在550nm测定光吸收。
从图23可见,测试含多个分子的因子XIIa组成的形式的方法,比如测多个因子XIIa分子联系在一起组成的分子复合物和/或在颗粒如细胞或细胞残留物或脂蛋白颗粒或脂蛋白颗粒残留物的表面的因子XIIa,这样的测试得到的因子XIIa浓度低的个体,在初始住院期间继发肌钙蛋白阳性事件风险要高得多。由图24可见选择性测试其他形式的因子XIIa的测试方法未能提供这样的临床用途。
然而,当所用的基本临床终点被用做住院期后但在入院30天内的继发肌钙蛋白阳性事件时,我们发现高浓度的不同形式的因子XIIa,即不同于上述测试方法测定的形式的因子XIIa,具有高度的指示作用。
如图25,其中第4部分的病人的事件发生量比第1或第2部分高出8倍。图25的微量滴定板测试的条件为:单克隆抗体2/215以15μg/ml的碳酸氢钠包被缓冲液(pH.9.6)包被于Nunc Maxisorb microplate(每孔包被100μl抗体)。75μl含0.5%(v/v)(Triton)X-100(Sigma,Fancy Road,Poole,Dorset,England)的血浆加入微量滴定板孔,室温孵育60分钟。洗涤微量滴定板孔后,加入100μl偶联物。该偶联物为碱性磷酸酶标记的单克隆抗体201/9。孵育60分钟后再次洗涤微量滴定板孔,然后加入100μl含酚酞磷酸盐的底物溶液。室温孵育60分钟后用强碱性溶液(50g/l碳酸氢钠,pH 10.5)终止反应,然后在550nm测定光吸收。从图26可见选择性测定其他形式的因子XIIa的测试方法不能提供这样的临床用途。
当将死亡作为临床终点时,我们发现第3个测试提供了最好的临床用途。这一方法看来是测试与病人的死亡风险相关的形式的因子XIIa,不管病人有无继发肌钙蛋白阳性事件。图27是一个U形曲线,具有更低浓度或更高浓度的某种形式的因子XIIa的病人与那些这种形式的因子XIIa接近平均值的病人相比,都有显著的高死亡风险。
得到图27所示事件的分布形式的微量滴定板测试法的条件为:抗体2/215以2μg/ml的磷酸盐包被缓冲液(pH.7.4)包被于NuncMaxisorb microplate(每孔包被100μl抗体)。75μl不含(Triton)X-100的血浆加入微量滴定板孔,室温孵育60分钟。洗涤微量滴定板孔后,加入100μl偶联物。该偶联物为碱性磷酸酶标记的抗因子XIIa的多抗(酶研究实验室,Skelty Road,Swansea,UK)。孵育60分钟后再次洗涤微量滴定板孔,然后加入100μl含酚酞磷酸盐的底物溶液。室温孵育60分钟后用强碱性溶液(50g/l碳酸氢钠,pH 10.5)终止反应,然后在550nm测定光吸收。从图28可见选择性测定其他形式的因子XIIa的测试法不能提供这种临床用途。
实施例18
测定一个患严重脓毒症的住院病人的因子XIIa水平。
测定细胞性因子XIIa,条件为:1ml柠檬酸盐处理的全血与5μl碘125标记的单克隆抗体2/215 Fab片段室温孵育3小时。期间测定样品放射性总量。用16000g离心分离细胞,去除血浆。离心得到的细胞用1ml pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)悬浮,16000g离心去除上清的方式洗涤6次。6次洗涤之后,测定连接在这一细胞物质上的放射性和结合于因子XIIa的抗体并表示为占起始样品放射性总量的百分比。这样做就校正了向血液样品加放射性抗体时的任何细小差异。用这种方法测试来自于脓毒病人的样品的同时,还测试了相应的来自于100个不患脓毒的病人的样品。脓毒病人的细胞性因子XIIa的值为8.2%,而100个不患脓毒的病人的细胞性因子XIIa的值的范围为0.51%到4.10%(平均值为1.50,标准偏差为0.75)。因此,脓毒病人的细胞性因子XIIa的浓度值远远高于对照组。
实施例19
本实施例显示的是脂质结合的因子XIIa的测定为怀疑为心肌梗塞和急性冠状动脉综合症而住院的病人的心肌梗塞和心死亡的复发风险提供预测。
资料来源于160名被怀疑为心肌梗塞的住院病人。测定了每个病人的脂质结合形式的因子XIIa。研究所得结果看它们是否为住院6个月内以继发肌钙蛋白阳性事件或心死亡为基本临床终点的情况提供预测。
通过对选择性测定不同种形式因子XIIa的各个测试方法得到的因子XIIa测量值结果排级(从低到高)来确定测试方法的诊断作用。将测试的人群分为4部分,即具有最低因子XIIa浓度值的40个个体为四部分中的第一部分,而具有最高因子XIIa浓度值的40个个体为四部分中的第四部分。统计各部分中出现继发事件的病人数量。
抗体2/215 Fab片段用试剂盒“免疫纯Fab制备试剂盒”(Pierce,3747 N MeridianRoad,PO Box 117,Rickford,IL 61105,U.S.A),按其操作手册制备。所得2/215Fab片段由Amersham Pharmacia Biotech公司(Pollards Wood,Nightingales Lane,Chalfont StGiles,HP8 4SP United Kingdom)进行碘125标记。
柠檬酸盐血采自160名因胸痛住院的病人。
1ml柠檬酸盐血与5μl放射性标记抗体室温孵育3小时。用16000g离心分离去除细胞,得到血浆。通过向每200μl血浆加500μl含51.54mM磷钨酸、0.07MMgCl2,并以NaOH调至pH6.15的沉淀剂沉淀脂蛋白。加入沉淀剂混匀,孵育10分钟,于16000g离心10分钟。移除上清,通过将沉淀悬浮于1ml沉淀试剂、16000g离心10分钟并除去上清的方式洗涤脂蛋白沉淀以除去液相残留因子XIIa。洗涤过程重复3次后,用单孔液闪计数仪(Lab Logic,StJohn’s House,131 Psalter Lane,Sheffield,England S11 8UX)测定沉淀物质的放射性。将所得结果如上述进行分类,并统计四个部分中遭受继发事件的个体的数量。
从图29可见入院6个月内,脂质结合的因子XIIa浓度的增加与非致死性肌钙蛋白阳性事件或心死亡继发事件的风险增加相关联。
实施例20
本实施例显示的是通过与放射性标记抗体孵育并继以HPLC的方法测定到肾病病人尿液中特定形式的因子XIIa浓度增加。
从5个肾功能不全病人和5个健康志愿者中采集24小时尿样。每个个体的全部样本混合起来,分别取30ml的等份进行分析。
抗体2/215 Fab片段用“免疫纯Fab制备试剂盒”(Pierce,3747 N Meridian Road,POBox 117,Rockford,IL 61105)按操作手册制备。所得Fab片段由公司Amersham PharmaciaBiotech(Pollards Wood,Nightingales Lane,Chalfont St Giles,HP8 4SP United Kingdom)进行碘125标记。
向来自各病人和志愿者的1ml尿液加入1μl放射性标记抗体。4小时孵育后,用高效液相色谱(HPLC)分离尿液组分。HPLC系统为Agilent 1100系统。
HPLC的流动相为0.1M NaCl,0.05M Tris HCl,0.4%(W/V)Tris-柠檬酸钠pH 7.5。固定相为一个1×30cm BioSep-SEC-S 3000层析柱和一个1×30cm BioSep-SEC-S 2000层析柱(Phenomenex,Queens Avenue,Hurdsfield Industrial Estate,Macclesfield,CheshireSK10 2BN,United Kingdom)。流速为0.5ml/分钟,进样体积为100μl。
洗脱物的放射性用带有碘125高灵敏度检测系统的在线单孔液闪计数仪(Lab Logic,StJohn’s House,131 Psalter Lane,Sheffield,England S11 8UX)测定。
各个尿液样品的对应于因子βXIIa的峰(通过它与和放射性标记抗体孵育的纯βXIIa的滞留时间相同来确定)的面积通过积分得到。所得结果出示于表5,如图30所示。可见来自肾功能不全的病人的数值明显高于来自健康志愿者的测定值。
表5.通过与放射性标记抗体孵育和HPLC分离测定到的10个尿样中的因子βXIIa的值
个体 | 对应于βXIIa峰的每秒累计读数 |
志愿者1 | 423 |
志愿者2 | 121 |
志愿者3 | 348 |
志愿者4 | 196 |
志愿者5 | 205 |
肾功能不全病人1 | 3756 |
肾功能不全病人2 | 4127 |
肾功能不全病人3 | 1876 |
肾功能不全病人4 | 849 |
肾功能不全病人5 | 7801 |
实施例21
本实施例显示的通过微量滴定板测到的肾功能不全病人尿液特定形式的因子XIIa的浓度升高。
从5个肾功能不全病人和5个健康志愿者中采集24小时尿样。每个个体的全部样本混合起来,分别取30ml的等份进行分析。
单克隆抗体2/215以15μg/ml的碳酸氢钠包被缓冲液(pH.9.6)包被于Nunc(Nunc A/S,Karustrupuej 90,P O Box 280,4000 Roskilde,Denmark)Maxisorb microplate(每孔包被100μl抗体)。75μl含0.5%(v/v)(Triton)X-100的尿液加入微量滴定板孔,室温孵育60分钟。洗涤微量滴定板孔后,加入100μl偶联物。该偶联物为碱性磷酸酶标记的单克隆抗体201/9。孵育60分钟后再次洗涤微量滴定板孔,然后加入100μl含酚酞磷酸盐的底物溶液。室温孵育60分钟后用强碱性溶液(50g/l碳酸氢钠,pH 10.5)终止反应,然后在550nm测定吸光度值。
吸光度值见表6,图示于图31。可见肾功能不全的病人的测定结果显著高出健康志愿者的测定结果。
表6.以微量滴定板免疫测试的光吸收值表示的5个肾功能不全病人和5个健康志愿者的尿液因子βXIIa的值
个体 | A550 |
志愿者1 | 0.37 |
志愿者2 | 0.09 |
志愿者3 | 0.25 |
志愿者4 | 0.12 |
志愿者5 | 0.19 |
肾功能不全病人1 | 1.76 |
肾功能不全病人2 | 2.20 |
肾功能不全病人3 | 1.81 |
肾功能不全病人4 | 0.56 |
肾功能不全病人5 | 3.42 |
实施例22:
本实施例给出了一个产生适用于本发明的单克隆抗体的通用操作方法。
用来产生抗体的抗原是因子XII或源于它的片段。一个因子XII的片段自身可能已具有免疫原性。也可能太小而不具有免疫原性,这时它可以通过与如下要描述的其他肽连接而转化为免疫原。此处“一个因子XIIa的抗原性片段”包既包括一个片段如肽段,也包括这种片段如其自身不具有免疫原性时被转化成的具有免疫原性的形式。
一个因子XII的抗原性片段可以是因子XIIa,如αXIIa和βXIIa或源于它们的片段,像一个包括至少一个能识别因子βXIIa抗体的抗原决定簇的因子βXIIa片段的肽。制备免疫原的方法业内人士已熟知。任何这些方法可以用来免疫,或者改进因子XII或其抗原性片段的免疫原性。也可见专利WO90/08835。
例如,因子βXIIa可以用作抗因子XIIa的单克隆抗体或多克隆抗体的免疫原。因子βXIIa可以通过如下方法产生。首先是从新鲜或新鲜的冻存血浆分离因子XII,例如用结合硫酸铵沉淀和阳离子交换树脂层析的方法如K.Fujikawa和E.W.Davie描述的方法(Methodsin Enzymol,1981,80,198-211)。将因子XII转化为因子βXIIa并将因子βXIIa从所得混合物中分离的方法见K.Fujikawa和B.A.McMullen(Journal of Biol.Chem.,1983,258,10924-10933)以及B.A.McMullen和K.Fujikawa(Journal of Biol.Chem.,1985,260,5328)描述。为得到因子βXIIa,通常将因子XII进行有限的切割。例如通常以摩尔比1∶500或质量比1∶75的高度稀释形式的胰蛋白酶或类胰蛋白酶的酶切消化或化学方法来切割。切割产物通常以层析法分离。
因子βXIIa的抗原性片段可以用酶学或化学方法降解因子βXIIa的方式产生。例如因子βXIIa的二硫键连接的轻链可以通过对因子βXIIa还原和羧端甲基化处理并以层析法分离片段(K.Fujikawa & B.A.McMullen Journal of Biol.Chem.,1983,258,10924)的方法得到。可选择地,如果序列已知,一个因子βXIIa的抗原性片段甚至因子βXIIa自身都可以通过合成的方法得到。任何已知的多肽合成的化学方法都可以使用,尤其是用自动仪器合成的方法。一个因子βXIIa的抗原性片段或因子βXIIa自身也可以用重组DNA技术获得。Cool等(1985和1987,loc.cit.)鉴定了一个人凝血因子XII的cDNA和基因。可以用已知的方法得到重组产物,例如可参照专利WO90/08835。
除非特别标明,此处所用“因子βXIIa”和“βXIIa”包括因子βXIIa分子的抗原性片段。
根据本发明,虽然不是必须,但所用单克隆抗体最好,因为它与因子XII原酶没有显著的结合。在后一种情况下,与因子XII原酶的校正交叉反应性为0.1%或更低。在评价本发明中一个抗体与因子XII校正交叉反应性时要考虑的一个因素是即便“纯”的因子XII制备物也几乎不可避免地会污染有小量的因子XIIa(Silverberg and Kaplan,Blood 60,1982,64-70)。专利WO90/08835给出了详细的评估与因子XII校正交叉反应性的方法。除非特别说明,此处“交叉反应性”是指校正交叉反应性。
用来制备多克隆抗体的方法已为人所熟知,比如可见Methods in Enzymology,H.Van Vunakisand J.J.Longone(Eds)1981,72(B)and ibid,1983 92(E)。
例如,单克隆抗体也可以通过修改自Kohler和Milstein(G.Kohler and C.Milstein,Nature,1975,256,495)的方法生产。
例如,向雌性小鼠Balb/C和C57/BIO腹膜内注射因子XII或其抗原性片段来免疫。比如用10到30μg,通常是20μg的因子βXIIa或相当量的其他抗原。因子βXIIa或其它抗原最好偶联于其他蛋白分子,例如纯化的结核菌素或者更好地,牛甲状球蛋白衍生物。偶联可以通过像碳化二亚胺的方法或用异质-双功能试剂。免疫原通常加于佐剂最好是弗氏完全佐剂。免疫过程通常定期重复几次,一般是用同样剂量的同样免疫原,如小鼠每隔3周以混合于弗氏完全佐剂的20μg因子βXIIa加强免疫直到观察到合适的反应水平。最好在宰杀前进行一次pre-fusion增强,比如宰杀前3天进行一次静脉内抗原注射。
抗体反应性通过像抗血清的放射免疫曲线测试分析的方法进行监测。用恰当标记物如碘125标记所需形式的因子XIIa,像细胞性因子XIIa、脂质结合因子XIIa、分子间形成复合物形式或形成联合体的因子XIIa、与高或低亲和性结合伴侣形成联合体的因子XIIa中的一至数种。在一些情况下可能用125I放射性标记的因子XII或其片段为宜,例如在这一阶段用氯胺-T方法(P.J.McConahey and F.J.Dixon,Int.Arch.Allergy Appl.Immunol,1966,29,185)制备的放射性标记的βXIIa或另一种βXIIa抗原。纯度的确定,可以用像对在还原性条件下跑的SDS-PAGE胶进行放射自显影的方法。
然后将免疫鼠的脾细胞与脊髓瘤细胞融合,如与NSO脊髓瘤细胞在40-50%PEG 4000或50%PEG 1500存在的情况下的融合。处理后的细胞植于培养板孔,用选择性培养基培养。检测培养液上清对所关注的形式的因子XIIa的反应性。这些因子XIIa形式如细胞性因子XIIa、脂质结合因子XIIa、分子间形成复合物形式或形成联合体的因子XIIa、与高或低亲和性结合伴侣形成联合体的因子XIIa。检测方式如用过氧化物酶标记的抗鼠IgG检测的固相酶免疫测试。一般对所有对所用抗原显示特异性的孔进行再次筛选。再次筛选包括,比如看溶液中恰当的抗原对所有特异性抗体的结合特性。恰当的抗原是像细胞性因子XIIa、脂质结合因子XIIa、分子间形成复合物形式或形成联合体的因子XIIa、与高或低亲和性结合伴侣形成联合体的因子XIIa等。较好的是,对这些进行滴定以确定达到50%最大结合(50% B max)所需的抗体稀释程度。对冷抗原,即未标记的抗原的剂量反应曲线进行测定。较好的是对因子XII的剂量反应曲线也进行测定(如果不希望有与因子XII的交叉反应性)。也可以用血浆酶(plasmin)和纤溶酶(fibronectin)。交叉反应的程度可以根据如下公式计算:
那些对目标抗原表现出恰当水平的结合的抗体,比如具有至少1010M-1的亲和常数的那些,被用于进一步的克隆化。
所形成的克隆通常是异型的。为了产生结合于目标形式的因子XIIa的目标抗体,通常较好的是对这些细胞进行有限稀释的亚克隆,然后再进行筛选。比如用酶免疫测试或放射免疫测试。目标形式的因子XIIa可以是细胞性因子XIIa、脂质结合因子XIIa、分子间形成复合物形式或形成联合体的因子XIIa、与高或低亲和性结合伴侣形成联合体的因子XIIa等。从各个克隆中选择的亚克隆也可用放射免疫测试或ELISA进行特异性和剂量反应的评测。如需要,也可以筛选那些事先测定好的对因子XII具有明显交叉反应性的抗体。交叉反应性最好是1.5%或更小,如1%或更小,如0.5%或更小,如0.1%或更小。
如上所示,通常首先针对目标形式的因子XIIa进行筛选,但这两种或者,可选择地,3种筛选可以用任何顺序进行。在一个筛选步骤中,如恰当,单克隆抗体2/215或单克隆抗体201/9可以用作参照抗体。这在希望得到与单克隆抗体2/215或201/9有相同或类似的结合特定形式因子XIIa的特征的抗体时特别有用。
可以对剂量反应结果进行斯卡查德分析(Scatchard analysis)以得到每个抗体的亲和常数值。
可以将亚克隆或克隆的杂交瘤细胞注射进Balb/C小鼠腹腔内以产生腹水。免疫球蛋白可以从腹水中沉淀出来,如在4℃以等体积饱和硫酸铵沉淀。沉淀最好进行纯化,比如先离心,然后以pH7.5的与原腹水等体积的50mM Tris-HCl缓冲液溶解,再对同样的缓冲液透析。免疫球蛋白部分可以进一步用阳离子交换层析纯化。例如将蛋白溶液上样于Mono-Q阳离子交换柱(Pharmacia),按产家推荐条件用溶于同样缓冲液的盐梯度洗脱。通常将含有免疫球蛋白的组分汇集起来于-20℃贮存。可选择地,杂交瘤细胞也可以培养于培养基来产生抗体,所得抗体用基本与上述从腹水分离抗体相同的方法分离。可选择地,杂交瘤也可以体外培养。虽然此处描写的杂交瘤源于鼠脾细胞,本发明不限于鼠源或半鼠源的杂交瘤。融合的两方(脾细胞和骨髓瘤细胞)可以获自合适的动物。也可以生产重组抗体。如需要,抗体可以做成嵌合的形式或人源的形式。杂交瘤最好体外培养。
杂交瘤的存放
单克隆抗体2/215由杂交瘤2/215(BFxlla)产生,于1990年1月16日以存放号90011606存放于欧洲细胞培养物收藏中心,生物制品部,PHLS Centre for Applied Microbiology andResearch,Porton Down,Salisbury SP4 0JG,England(即ECACC),产生单克隆抗体201/9的杂交瘤201/9(ESBT41.1)于1990年1月18日以存放号90011893存放于ECACC。
Claims (93)
1.一种从一个样品中检测或测定一种形式或多种形式的因子XIIa的方法,所述方法包括实施一个程序,该程序能使所研究的一种或多种形式的因子XIIa优先于其他形式的因子XIIa被检测或测定。
2.一种如权利要求1所述的方法,包括通过一个测试来使得所研究的这一种形式或多种形式的因子XIIa能够优先于其他形式的因子XIIa被检测和测定。
3.一种如权利要求1所述的方法,包括将所研究的这一种或这多种形式的因子XIIa从其他形式的因子XIIa分离出来,并检测或测定所分离出来一种或者多种形式的因子XIIa。
4.一种如权利要求3所述的方法,其中所分离出来的一种或多种形式的因子XIIa的检测或测定采用权利要求2所定义的分析方法。
5.一种如权利要求1所述的方法,包括将样品与一种可以结合所研究的这一种或几种形式的因子XIIa并且可以选择性地结合其他形式因子XIIa的抗体相接触,将所研究的这一种或几种形式的因子XIIa与其他形式的因子XIIa分离,以及检测和测定这一种或几种形式的因子XIIa。
6.一种如权利要3~5中任何一项所述的方法,所述方法依据所研究的一种或多种形式的因子XIIa的物理、化学或免疫特性,将所研究的一种或多种形式的因子XIIa与其他形式的因子XIIa分离。
7.一种如权利要求6所述的方法,所述方法将所研究的一种或多种形式的因子XIIa通过色谱法、流式细胞技术和超离心过程与其他形式的因子XIIa分离,还可选择性地继续进行所分离物质的酶活性或免疫学特性的测评。
8.一种如权利要求6所述的方法,其中所研究的一种或多种形式的因子XIIa用一个能与所研究的一种或多种因子XIIa结合的抗体的免疫亲和色谱方法分离,可选择性地继续进行所分离物质的酶活性或免疫学特性的测评。
9.一种如权利要求7或权利要求8所述的方法,其中分离步骤是在不会破坏这一种或多种形式的因子XIIa的条件下进行。
10.一种如权利要求1~9中任何一项所述的方法,其中实验样品为体液或身体组织。
11.一种如权利要求10所述的方法,其中体液为血液、血浆或血清。
12.一种如权利要求10所述的方法,其中体液为尿液、脑脊液、唾液或泪液。
13.一种如权利要求1~12中任何一项所述的方法,其中所研究因子XIIa的形式为细胞因子XIIa。
14.一种如权利要求3~12中任何一项所述的方法,其中所研究因子XIIa的形式为细胞因子XIIa,所述细胞因子XIIa通过将细胞、细胞残留物和/或细胞物质从体液液相或组织分离而与其他形式的因子XIIa分开。
15.一种如权利要求14所述的方法,其中细胞、细胞残留物和/或细胞物质通过离心分离。
16.一种如权利要求13~15中任何一项所述的方法,其中细胞因子XIIa在检测或测定前先与与其它形式的因子XIIa分离。
17.一种如权利要求1~12中任何一项所述的方法,其中所研究因子XIIa的形式为脂质结合因子XIIa。
18.一种如权利要求17所述的方法,其中所研究因子XIIa的形式为脂质结合因子XIIa,这些脂质结合因子XIIa通过将脂质部分从体液液相或组织分开而与其他形式的因子XIIa分开。
19.一种如权利要求18所述的方法,其中脂质部分包括脂蛋白和/或其残留物。
20.一种如权利要求19所述的方法,其中脂质部分用脂蛋白沉淀试剂沉淀。
21.一种如权利要求17~20中任何一项所述的方法,其中脂质结合因子XIIa在与其他形式的因子XIIa分离前与一标记抗体相接触。
22.一种如权利要求1~12中任何一项所述的方法,其中所研究一种或多种形式的因子XIIa为任意一种或多种包括由两个或多个因子XIIa、与低亲和性伴侣结合的因子XIIa和与高亲和性伴侣结合的因子XIIa在内的复合物。
23.一种如权利要求1~22中任何一项所述的方法,其中检测或测定是在不会破坏所研究一种或多种形式的因子XIIa的条件下进行。
24.一种如权利要求1~23中任何一项所述的方法,其中分离步骤在所研究的一种或多种形式的因子XIIa不会被破坏的条件下进行。
25.一种如权利要求1~24中任何一项所述的方法,其中一种或多种形式的因子XIIa用免疫测试的方法检测或测定。
26.一种如权利要求25所述的方法,其中所用免疫测试方法是相对于其他形式的因子XIIa能优先检测或测定所研究的一种或多种形式的因子XIIa的方法。
27.一种如权利要求26所述的方法,其中的测试方法包括用一个能与所研究的一种或多种形式的因子XIIa结合的抗体。
28.一种如权利要求27所述的方法,其中抗体为单克隆抗体2/215或其类似物,单克隆抗体201/9或其类似物,或者能与因子XIIa结合的多克隆抗体。
29.一种如权利要求27或权利要求28所述的方法,其中的抗体用一个可以直接或间接检测的标记物标记。
30.一种如权利要求29所述的方法,其中的抗体被放射性标记。
31.一种如权利要求25~30中任何一项所述的方法,其中所得抗原—抗体复合物是被直接检测或测定的。
32.一种如权利要求25~31中任何一项所述的方法,其中所得抗原—抗体复合物用流动血细胞计数法、表面等离子体共振法、表面光波法或石英晶体微平衡法检测。
33.一种如权利要求25~32中任何一项所述的方法,其中样品为组织样品,所研究的一种或多种形式的因子XIIa用免疫组织学的方法检测或测定。
34.一种包括权利要求5的如权利要求27所述的方法,其中抗体固定于一个固相作为捕获抗体。
35.一种如权利要求34所述的方法,其中作为捕获抗体固定于固定相上的抗体为单克隆抗体2/215或其类似物,单克隆抗体201/9或其类似物,或者能与因子XIIa结合的多克隆抗体。
36.一种如权利要求35所述的方法,其中捕获抗体的抗体为单克隆抗体2/215或其类似物。
37.一种如权利要求35所述的方法,其中捕获抗体的抗体为单克隆抗体201/9或其类似物。
38.一种如权利要求34~37中任何一项所述的方法,其中固定相与样品结合,任何所产生的抗原—抗体复合物用权利要求28或权利要求29中所讲的标记抗体检测或测定。
39.一种如权利要求38所述的方法,其中标记的抗体为单克隆抗体2/215或其类似物,单克隆抗体201/9或其类似物,或者能与因子XIIa结合的多克隆抗体。
40.一种如权利要求1~39中任何一项所述的方法,其中检测或测定过程中的参数要进行调整,以使所研究的一种或多种形式因子XIIa相对于其他形式的因子XIIa能被优先检测或测定。
41.一种如权利要求40所述的方法,其中检测或测定过程中不加去垢剂。
42.一种如权利要求40所述的方法,其中检测或测定过程中要加去垢剂。
43.一种如权利要求1~42中任何一项所述的方法,其中的操作可以做到优先检测或测定因子αXIIa。
44.一种如权利要求1~42中任何一项所述的方法,其中的操作可以做到优先检测或测定因子βXIIa。
45.一种如权利要求1~42中任何一项所述的方法,其中的操作可以做到优先检测或测定因子βXIIa。
46.一种如权利要求1~42中任何一项所述的方法,其中的操作可以做到优先检测或测定结合于低亲和性结合伴侣的因子αXIIa。
47.一种如权利要求1~42中任何一项所述的方法,其中的操作可以做到优先检测或测定结合于低亲和性结合伴侣的因子βXIIa。
48.一种如权利要求1~42中任何一项所述的方法,其中的操作可以做到优先检测或测定结合于低亲和性结合伴侣的因子βXIIa。
49.一种如权利要求1~42中任何一项所述的方法,其中的操作可以做到优先检测或测定结合于高亲和性结合伴侣的因子αXIIa。
50.一种如权利要求1~42中任何一项所述的方法,其中的操作可以做到优先检测或测定结合于高亲和性结合伴侣的因子βXIIa。
51.一种如权利要求1~42中任何一项所述的方法,其中的操作可以做到优先检测或测定结合于高亲和性结合伴侣的因子βXIIa。
52.一种如权利要求1~42中任何一项所述的方法,其中的操作可以做到优先检测或测定结合有两个或更多因子XIIa分子的复合体。
53.一种如权利要求1~42中任何一项所述的方法,其中的操作可以做到优先检测或测定结合于细胞或细胞衍生物上的因子XIIa。
54.一种如权利要求1~42中任何一项所述的方法,其中的操作可以做到优先检测或测定结合于脂质、脂蛋白及其残留物上的因子XIIa。
55.一种如权利要求43~53中任何一项所述的方法,所述方法中的免疫测试是捕获测试,其中,捕获抗体为单克隆抗体2/215或其类似物,标记抗体为单克隆抗体2/215或其类似物。
56.,一种包括权利要求5的如权利要求1~24中任何一项的方法,,其中因子XIIa以生色测试的方法检测或测定。
57.一种如权利要求1~56中任何一项所述的方法,其中提供样品的个体为有某种疾病或紊乱、正患某种疾病或紊乱、患完某种疾病或紊乱之后或者治疗了某种疾病或紊乱之后。
58.一种如权利要求57所述的方法,其中疾病或紊乱涉及到凝血系统。
59.一种如权利要求57所述的方法,其中疾病或紊乱涉及到凝血、纤维蛋白溶解作用、激肽原产生、补体激活或血管发生、血管完整性维持和血压、血管内组成性抗凝因子的维持、组织防御或修复。
60.一种如权利要求57所述的方法,其中疾病或紊乱是/或涉及到急性或慢性炎症、包括脓毒休克的病原性休克、糖尿病、过敏、凝血-出血紊乱(a thrombo-haemorrhagic disorder)、脓毒、自发性流产或肿瘤疾病。
61.一种如权利要求57所述的方法,其中疾病或紊乱是/或涉及到静脉血凝结或血栓栓塞、心肌梗塞、急性冠状动脉综合症或咽峡炎。
62.一种如权利要求57所述的方法,其中疾病或紊乱是/或涉及到血栓形成和血管狭窄。
63.一种如权利要求57所述的方法,其中疾病或紊乱是/或涉及到疑似心肌梗塞或急性冠状动脉综合症。
64.一种如权利要求57所述的方法,其中疾病或紊乱是/或涉及到脓毒。
65.一种如权利要求57所述的方法,其中治疗涉及到服用治疗剂和/或手术。
66.一种如权利要求65所述的方法,其中治疗是冠状动脉血管成型术或溶栓。
67.一种如权利要求1~66中任何一项所述的方法,其中测试了从一个个体获得的一系列样品。
68.一种如权利要求67所述的方法,其中样品是在患疾病或紊乱期间采集。
69.一种如权利要求66或权利要求67所述的方法,其中样品在对疾病或紊乱的治疗期间、治疗前和/或治疗结束后采集。
70.一种对某些疾病或紊乱的感病性、过程或结果,或对患有或怀疑患有这种疾病或紊乱的研究对象的治疗的诊断、监测或预测的方法;所述方法包括将从被研究对象获取的一个样品中的一种或多种形式的因子XIIa优先于其他形式的因子XIIa的检测或测定,并将从该研究对象获取的结果与用相同实验获得的如下至少一种或多种样本的结果进行比较:
(i)患有这种疾病或紊乱的研究对象;
(ii)患有这种疾病或紊乱的研究对象,该研究对象的这种疾病或紊乱的过程或结果被监测;
(iii)患有这种疾病或紊乱并在接受治疗的研究对象;
(iv)患有这种疾病或紊乱并在接受治疗的研究对象,所述研究对象的针对这种疾病或紊乱的过程或结果的治疗被监测;
(v)未患这种疾病或紊乱的研究对象;
(vi)同一研究对象在疾病或紊乱发作之前或在对疾病或紊乱治疗开始之前,以及
(vii)同一研究对象在疾病或紊乱早期或晚期,或在对疾病或紊乱治疗的早期或晚期,或在疾病或紊乱发作之前。
71.一种如权利要求70所述的方法,其中所研究的一种或多种形式的因子XIIa采用权利要求1~56中任何一项所述的方法检测或测定。
72.一种如权利要求70或权利要求71所述的方法,其中这种疾病或紊乱是权利要求58~64中任何一项所定义的疾病或紊乱。
73.一种如权利要求62或权利要求63所述的方法,其中的治疗为权利要求65~66中所定义的治疗。
74.一种如权利要求70~73所述的方法,其中的样品是权利要求67~69中任何一项所定义的样品。
75.一种如权利要求70或权利要求71所述的方法,其中样品获自某因怀疑为心肌梗塞而入院的刚住院或住院后的个体,并且其中低水平的特定形式的因子XIIa与继发肌钙蛋白阳性事件风险增高有关。
76.一种如权利要求70或权利要求71所述的方法,其中样品获自某因怀疑为心肌梗塞而入院的刚住院或住院后的个体,并且其中高水平的特定形式的因子XIIa与继发肌钙蛋白阳性事件风险增高有关。
77.一种如权利要求70或权利要求71所述的方法,其中样品获自因某怀疑为心肌梗塞而入院的刚住院或住院后的个体,并且其中低水平的特定形式的因子XIIa与死亡风险增高有关。
78.一种如权利要求70或权利要求71所述的方法,其中样品获自因某怀疑为心肌梗塞而入院的刚住院或住院后的个体,并且其中高水平的特定形式的因子XIIa与死亡风险增高有关。
79.一种如权利要求70或权利要求71所述的方法,其中高水平的特定形式的因子XIIa与脓毒有关。
80.一种方法,所述方法包括对从患有某种疾病或紊乱或对某种疾病或紊乱进行治疗的个体获得的样品开展一系列测试,并选择一个能提供与疾病或紊乱或其治疗有关联的因子XIIa水平信息的测试。
81.一种方法,所述方法提供一个使因子XIIa可以为某些疾病或紊乱的感病性、过程或结果的诊断、监测或预测,或对患有或怀疑患有那些疾病或紊乱的人的治疗提供相关信息的实验;包括对从患有某疾病或紊乱或在治疗的研究对象获得的样品开展一系列实验,并确定哪个(些)实验提供的因子XIIa水平与这种疾病或紊乱的感病性、过程或结果的诊断、监测或预测,或这种疾病或紊乱的治疗有关联。
82.一种如权利要求81所述的方法,包括将从患有某疾病或紊乱或在治疗的研究对象获得的样品中测得的结果与同样方法测得的如下一或多个样品的结果进行比较:
(i)患有这种疾病或紊乱的研究对象;
(ii)患有这种疾病或紊乱的研究对象,该研究对象的疾病或紊乱的过程或结果被监测;
(iii)患有这种疾病或紊乱并在接受治疗的研究对象;
(iv)患有这种疾病或紊乱并在接受治疗的研究对象,该研究对象的针对这种疾病或紊乱的过程或结果的治疗被监测;
(v)未患这种疾病或紊乱的研究对象;
(vi)同一研究对象在这种疾病或紊乱发作之前或在对这种疾病或紊乱治疗开始之前,以及
(vii)同一研究对象在这种疾病或紊乱早期或晚期,或在对这种疾病或紊乱治疗的早期或晚期,或在这种疾病或紊乱发作之前。
83.一种如权利要求80~82所述的方法,其中的测试是权利要求1~56中任何一项所定义的方法。
84.一种如权利要求80~83中任何一项所述的方法,其中这种疾病或紊乱是权利要求58~64中任何一项所定义的疾病或紊乱。
85.一种如权利要求80~83中任何一项所述的方法,其中的治疗是如权利要求65或权利66所定义的治疗。
86.一种如权利要求80~85中任何一项所述的方法,其中的样品是权利要求67~69中任何一项所定义的样品。
87.一种如权利要求80~86中任何一项所述的方法,其所得结果整理到一个数据库中。
88.一个包含用从一种如权利要求80~86中任何一项所述的方法得到的结果的数据库。
89.一种包括从一个研究对象的样品检测或测定因子XIIa的方法,其特征在于:该样品为尿样。
90.一种诊断或监测一种疾病或紊乱的方法,或监测这种疾病或紊乱的治疗的方法,所述方法包括从患有或怀疑患有这种疾病或紊乱的研究对象的尿液中检测或测定因子XIIa。
91.一种如权利要求90所述的方法,其中疾病是/或涉及肾功能、肾脏疾病或肾损伤,或者对这些疾病的治疗。
92.一种如权利要求89~91中任何一项所述的方法,其中从这个研究对象得到的结果与用同样实验得到的来源于一种或者多种如下样品的结果相比较:
(i)患有这种疾病的研究对象,如肾功能不全、肾脏疾病或肾损伤;
(ii)患有这种疾病的研究对象,如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤,所述研究对象的这种疾病或紊乱如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤的过程或结果被监测;
(iii)患有这种疾病的研究对象,如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤,并在进行治疗;
(iv)患有这种疾病或紊乱,如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤,并在进行治疗的对象,其这种疾病或紊乱如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤的治疗情况的过程或结果被监测;
(v)没有患有如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤之类疾病或紊乱的研究对象;
(vi)同一研究对象,在这种疾病或紊乱如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤发作前,或在这种疾病或紊乱如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤的治疗开始前;
(vii)同一研究对象,在这种疾病或紊乱如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤或对它们的治疗的早期或晚期,或者在这种疾病或紊乱如肾功能不全、肾脏疾病以及肾损伤开始前。
93.一种如权利要求90~92中任何一项所述的方法,其中测试的方法是权利要求1~56中任何一项所定义的方法,样品为尿液。
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