CN101548019A - 在含有细胞的复合生物基质中测量瞬时蛋白水解活性浓度的方法 - Google Patents

在含有细胞的复合生物基质中测量瞬时蛋白水解活性浓度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了实时测定凝血或血浆样本中的凝血酶活性从样本中出现和消失的过程的方法，包括向所述样本中加入信号底物，所述信号底物引起可检测的信号，所述信号与产生的蛋白水解活性经反应形成的转化产物的量相关，实时监测所述样本中该信号的发展，提供曲线，以及频繁混合所述样本，从而以致密的方式发生血块形成，致使样本的大部分保持流体，并抑制细胞沉淀，其中重复并以交替的方式进行所述监测和混合步骤。

Description

在含有细胞的复合生物基质中测量瞬时蛋白水解活性浓度的方法
发明领域
本发明属于诊断学领域，更具体涉及实时监测瞬时出现在血液或其他体液中的生物活性酶类浓度过程的方法，以及用于该方法的试剂盒。
发明背景
在体液中存在几种生理学上重要的生物化学系统，通过活化和随后灭活蛋白水解酶类起作用，例如在血液中的凝血系统、纤维蛋白溶解系统和补体系统，以及在胃肠液中的消化酶类。为了评价这些系统的生物学功能，实时追踪这些蛋白水解活性的过程是重要的。这类功能评价对于诊断至关重要，因为所述系统的紊乱可能导致致命的疾病，如冠脉梗塞、中风或致命的出血(凝血和纤维蛋白溶解)、全身感染和自体免疫疾病(补体系统)或食物吸收失常(胃肠液)。
在根据现有技术测定血浆或富含血小板的血浆中凝血酶产生的方法中，血浆在几分钟后就变为凝胶态。这源于纤维蛋白原转变成不溶性纤维蛋白。该纤维蛋白聚合，从而形成纤维蛋白网，其事实上成为真正的血块。该血块类似于含有流体(即血浆或血清)的海绵，其中产生凝血酶。在这种凝血酶产生过程中，信号底物转变为产生信号的离去基团。由于凝胶是相对透明的，可以实时记录凝固血浆中的荧光信号。然而，在用全血测量的情况下，信号量显著下降(通常低于在透明血浆中测得量的5％)，并且红细胞的任何活动都非常影响该信号。所形成的纤维蛋白网(凝胶)捕获红细胞，过一会儿出现“血块收缩”，导致凝胶的不均一性，从而将凝胶内部捕获的流体和纤维蛋白网外部存在的流体分离开。按照“海绵状网”的图像，血块收缩导致类似于部分海绵体被挤出的情况。这对于信号的这种影响，使得测量几乎是不可能的。
WO 03/093831描述了一种在血浆或富含血小板的血浆中实时测量凝血酶活性的适当技术。该技术包括向所述生物基质中加入信号底物。蛋白水解酶能够转化该底物，该底物的离去基团可通过适当的技术测量。这可以是荧光、光密度、NMR测量等，其选择主要取决于信号的性质。当使用荧光时，那么原则上可能在混浊的溶液中测量，例如富含血小板的血浆或含有纤维蛋白的血浆。同样，在全血，即含有血小板、血白细胞和红细胞的血浆中测量也是可能的。然而，血红细胞的存在对于信号有很大的干扰影响。
因此，仍然需要一种在全血中以可靠和简单的方式实时测量凝血酶产生的方法。本发明提供了这一方法。
发明概述
我们现在出乎意料地发现当在频繁混合的条件下，在凝血或血浆中基本上按照WO 03/093831中所述进行蛋白水解活性特别是凝血酶活性的测量时，血块不会形成为凝胶，而是形成致密得多的凝块，基本上将所有的流体都留在纤维蛋白网以外。
因此，本发明的一个方面提供了实时测定凝血或血浆或其他体液样本中的蛋白水解活性、尤其是凝血酶活性从样本中出现和消失的过程的方法，其包括以下步骤：
a)向所述样本中加入信号底物，所述信号底物引起可检测的信号，所述信号与产生的蛋白水解活性经反应形成的转化产物的量相关；
b1)实时监测所述样本中该信号的发展，提供曲线；以及
c1)频繁混合所述样本，从而以致密的方式发生血块形成，致使样本的大部分保持流体，并抑制细胞沉淀，
其中重复并以交替的方式进行所述步骤b1)和c1)。
在一个特别和优选的实施方案中，所述方法包括以下额外和可选择的步骤：
d)在第二个没有触发蛋白水解活性的平行样本中，加入对步骤a)中所定义的信号底物具有常数已知(constant know)的稳定蛋白水解活性、但在其他方面惰性的物质；
e)在步骤d)中加入步骤a)所定义的同样信号底物，所述信号底物通过与已知具有稳定的蛋白水解活性的物质反应，引起可检测信号；
b2)测定所述第一样本和所述第二平行样本中信号发展的时间过程，以提供它们各自的曲线；
f)比较所述曲线，得出第一样本中实时蛋白水解活性过程，以及
c2)频繁混合第一和第二样本，使得在所述第一样本中以致密方式发生血块形成，致使所述第一样本的大部分保持为流体，并抑制每个样本中的细胞沉淀，
其中重复并以交替的方式进行所述步骤b2)和c2)。
在本发明的另一个方面，提供了实施本发明方法的试剂盒。
这些和其他方面将在下文中进行更详细的描述。
附图简述
图1是一张图片，摄自在血块形成过程中频繁混合的96孔板的选出部分(上图)，和另一块未混合的96孔板。在上图中可看出，每个孔中均形成了致密的血块。在下图中，透明的血浆已变为浑浊的凝胶。混合通过每20秒重复回转式振动(orbital shake)5秒而进行。该图显示了当使用全血时也将发生所设想的状况的例子：在振动条件下血块更致密。
图2是在全血中测量凝血酶产生的典型例子。反应混合物含有来自健康志愿者的全血、以及0.5pM组织因子、荧光底物(400μMZGGR-AMC)和氯化钙。荧光在96孔板荧光计上测量，从该信号计算实时凝血酶。
图3显示了凝血酶校准剂曲线的起始速率(荧光单位/分)与红细胞压积之间的关系。凝血酶校准剂是凝血酶与α2-巨球蛋白(α2-M)的复合物，其能够转化荧光底物(ZGGR-AMC)，但不被凝血酶的原浆抑制剂(例如抗纤维蛋白酶)所抑制，并且其不参与凝血过程。所述凝血酶校准剂转化底物，测定的荧光基团产生荧光信号，在荧光计中测量。尽管在所有样本中的活性量相同，但由于红细胞压积(细胞体积和全血总体积的比例)导致起始速率不同。由于供体和供体之间的红细胞压积差别很大，凝血酶校准剂的起始速率可用于校准这些差别。
发明详述
本文中所使用的“频繁混合条件”，我们的意思是移动发生反应的容器或容器内的流体，使得所述流体和流体中的非流体物质例如细胞变得更为均匀地分散。很明显，基本均匀分散将是优选的条件。例如，通过将发生凝血酶产生的容器进行回转式振动，血块不会形成为凝胶，而是形成为致密得多的血块，从而基本上将所有的流体留在在网状结构之外。这同样可通过旋转液体中的磁力搅拌器或本领域普通技术人员已知的其他类型搅拌器来达到。结果是，血块收缩对信号的破坏性影响不再存在。
发生凝血酶产生的容器，通常为比色皿，常规是透明的，放置于控温的仪器中，所述仪器能够记录底物转化产生的信号。当从容器或比色皿的顶部或底部进行荧光测量时，则血红细胞的沉淀将会对信号造成附加的干扰效应。从容器的侧面而不是从底部或顶部测量会降低沉淀的影响。或者，可通过重复混合防止沉淀，使得在血块形成之后或期间，流体内的沉淀性细胞再次悬上来。例如，在一秒内重复测量荧光信号，然后各自进行数秒回转式振动，足以进行全血中的凝血酶测定。信号量显著下降的缺点可通过选择荧光探针的最佳波长并结合接收所述荧光信号的光学系统的有利放置得以部分克服。
重复并以交替的方式监测待测样本中实时信号发展和混合样本，直到测定完成。整个测量通常需要约10-90分钟。交替执行混合与测量的频率通常达到约每分钟3-8次。每次混合通常需花约3-5秒。每次测量通常为10-80毫秒。所述方法在本领域技术人员阅读本说明书后将是完全清楚的。更多的细节可来源于尤其是WO 03/093831，其引入本文用作参考。
尽管本发明的方法尤其适用于在凝血或富含血小板的血浆、贫血小板或无血小板血浆中实时测定蛋白水解活性、尤其是凝血酶活性的过程，但其同样可用于其他可能显示凝固活性的体液中，例如唾液、血清、尿液、脑脊液、精液和粪便。
本发明还提供了一种用于实施前述方法的试剂盒，所述试剂盒在适当的容器或其他常规包装工具中便利地包括下列成分：
-已知浓度的α2M-凝血酶复合物；
-已知浓度的凝血酶；；
-含有所用信号底物的离去基团的溶液，所述离去基团能够产生信号，该信号可由已知的技术测量，例如荧光、光密度、NMR等；
-触发试剂，其含有促凝血酶原激酶、组织因子、鞣花酸或高岭土，以启动凝固反应；
-有助于说明凝血酶浓度过程的添加剂，特别是当止血-血栓形成系统出现或预计出现特定异常时。适当的添加剂有，例如，血栓调节蛋白或活化的蛋白C，其尤其适用于诊断因子V Leiden，或者是特异性抗血栓或抗血小板药物；
-含有信号底物的试剂；
-可直接装载到计算机内存中的软件程序，所述程序在计算机上运行，用于计算由上述定义的方法测量的凝血酶活性曲线；
-指导手册。
所述试剂盒可以适当包含冷冻干燥的试剂。
本发明通过以下实施例进一步说明，但是，并不表示在任何方面限制本发明的范围。
试验
a.无内校准试验的典型建立
通常，试验按如下进行。将触发试剂(20μL)加入96孔板的孔中。所述触发试剂含有低浓度的组织因子(通常终浓度在0.5-20pM之间)。加入柠檬酸化的全血，通常为50-150μL，在本实施例中为80μL，最后在添加荧光底物(例如Z-GGR-AMC)和氯化钙的混合物(通常分别为200-600μM，终浓度为14-17mM，本例中分别为400μM和16.7mM)后开始反应。几分钟后(滞后时间)开始产生凝血酶，浓度上升直至达到峰值，然后再次下降。典型的曲线见图2。尽管推荐对信号进行额外的校正，以正确计算凝血酶的实时浓度，但实时跟踪的荧光的一阶导数(例如在355nm激发波长和460nm发射波长处测量)是合理测量的实时凝血酶量。这些校正的性质是本领域技术人员公知的，因此校正的方法不需要在这里详述。
b.有内校准试验的典型建立
将全血样本分成两份，样本A和样本B。将样本A加入到含触发剂(稀释的组织因子)的96孔板的孔中，样本B加入到含有校准量的α2-巨球蛋白-凝血酶复合物的孔中。该复合物具有酰胺水解活性，但不能被血浆抑制剂所抑制。在两个孔中均加入荧光底物，样本A将产生凝血酶而样本B则不会(凝血酶产生被抑制，或柠檬酸化的样本未被再次钙化)。根据样本B中通过校准量的α2-巨球蛋白-凝血酶转化底物产生的荧光，可计算样本A中凝血酶的实时浓度。

Claims (17)

1.一种实时测定凝血或血浆样本中的蛋白水解活性、尤其是凝血酶活性从样本中出现和消失的过程的方法，包括以下步骤：
a)向所述样本中加入信号底物，所述信号底物引起可检测的信号，所述信号与产生的蛋白水解活性经反应形成的转化产物的量相关，
b1)实时监测所述样本中该信号的发展，提供曲线，以及
c1)频繁混合所述样本，从而以致密的方式发生血块形成，致使样本的大部分保持流体，并抑制细胞沉淀，其中重复并以交替的方式进行所述步骤b1)和c1)。
2.权利要求1的方法，包括下列额外和可选择的步骤：
d)在没有触发蛋白水解活性的第二个平行样本中，加入对步骤a)中所定义的信号底物具有常数已知的稳定蛋白水解活性、但在其他方面惰性的物质；
e)在步骤d)中加入步骤a)所定义的同样信号底物，所述信号底物通过与已知具有稳定的蛋白水解活性的物质反应，引起可检测信号；
b2)测定所述第一样本和所述第二平行样本中信号发展的时间过程，以提供它们各自的曲线；
f)比较所述曲线，得出第一样本中实时蛋白水解活性的过程，以及
c2)频繁混合第一和第二样本，从而在所述第一样本中以致密方式发生血块形成，致使所述第一样本的大部分保持为流体，并抑制每个样本中的细胞沉淀，
其中重复并以交替的方式进行所述步骤b2)和c2)。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述蛋白水解活性选自活化的凝血因子活性包括凝血酶，活化的纤维蛋白溶解因子活性以及补体系统活性的活化成分。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述信号底物选自包含离去基团的化合物，所述离去基团通过形成的蛋白水解酶反应，给出可检测的转化产物。
5.权利要求4的方法，其中所述信号底物为Z-Gly-Gly-Arg-AMC。
6.权利要求4的方法，其中可检测的转化产物通过光谱学尤其是荧光、光密度或NMR测定。
7.权利要求4-6任一项的方法，其中所述离去基团是荧光基团、发色基团或释放氢离子的基团。
8.前述权利要求任一项的方法，其中可检测的转化产物为对硝基苯胺或7-氨基-4-甲基-香豆素。
9.前述权利要求任一项的方法，其中具有常数已知的稳定蛋白水解活性的物质选自α2-巨球蛋白-凝血酶复合物、葡萄球菌凝固酶-凝血酶原复合物以及γ凝血酶。
10.前述权利要求任一项的方法，其中在加入信号底物之前向所述第一样本中加入蛋白酶活化剂。
11.权利要求10的方法，其中所述蛋白酶活化剂选自钙离子、磷脂、组织因子、可溶性组织因子、促凝血酶原激酶、高岭土和鞣花酸。
12.前述权利要求任一项的方法，其中所述第一生物样本还包括在研究中要检验其对蛋白水解系统的影响的药剂。
13.权利要求12的方法，其中所述蛋白水解系统是止血-血栓形成系统。
14.权利要求12或13的方法，其中所述药剂为抗血栓形成剂，例如抗血小板剂或抗凝血剂。
15.权利要求14的方法，其中抗血栓形成剂选自肝素，硫酸皮肤素，直接的凝血酶抑制剂例如水蛭素、阿戈托班或美拉加群，以及因子Xa抑制剂例如蜱抗凝蛋白，蛋白C途径活化剂例如血栓调节蛋白或激活的蛋白C。
16.实施权利要求1-15任一项所述方法的试剂盒，其包含以下成分：
-已知浓度的α2M-凝血酶复合物；
-已知浓度的凝血酶；；
-含有所用信号底物的离去基团的溶液，所述离去基团能够产生信号，该信号可由已知的技术例如荧光、光密度、NMR等测量；
-触发试剂，其含有促凝血酶原激酶、组织因子、鞣花酸或高岭土，以启动凝固反应；
-有助于说明凝血酶浓度过程的添加剂，特别是当止血-血栓形成系统出现或预计出现特定异常时。适当的添加剂是，例如，血栓调节蛋白或活化的蛋白C，其尤其适用于诊断因子V Leiden，或者是特异性抗血栓或抗血小板药物；
-含有信号底物的试剂；
-可直接装载到计算机内存中的软件程序，所述程序在计算机上运行时，用于计算由上述定义的方法测量的凝血酶活性曲线；
-指导手册。
17.权利要求16的试剂盒，其含有冷冻干燥的试剂。
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